Invigningen av domkyrkan ägde rum 1435, efter en tid av pengabrist, kallt klimat och pestutbrott. Domkyrkan uppfördes i tegel som tillverkades nära byggarbetsplatsen. Pelarna längst fram i kyrkan är däremot av kalksten från Gotland. Först byggdes den östra delen av kyrkan med stora kapell runt omkring högkoret. På många ställen fick väggar, tak och valvribbor målningar.

Hur den nyinvigda domkyrkan såg ut vet ingen – det finns inga bevarade avbildningar. Men inventarieförteckningar, gåvobrev och andra dokument ger ledtrådar. I varje kapell och i högkoret fanns ett eller flera altare tillägnade det heliga korset, Maria eller andra helgon.

Långhuset, den västra delen av kyrkan där bänkarna står, byggdes senare under 1300-talet och i början av 1400-talet. Tornen byggdes flera årtionden efter invigningen.

Sedd ovanifrån är domkyrkan byggd som ett kors med mittskepp, sidoskepp och tvärskepp. Som de flesta andra kyrkor har domkyrkan ingång i väster och högkor i öster. Innan den västra portalen blev färdig på 1430-talet användes södra porten som huvudingång.

Flera ärkebiskopar gjorde insatser inte bara för domkyrkan utan för Uppsala och hela riket. Redan i slutet av 1200-talet fanns en katedralskola vid domkyrkan och 1477 grundades Uppsala universitet av ärkebiskop Jakob Ulvsson.

Under Gustav Vasas regeringstid 1523–1560 lämnade kyrkan i Sverige den romersk-katolska kyrkan. Vid Uppsala möte 1593 slogs det fast att Svenska kyrkan skulle vara evangelisk-luthersk. Utsmyckning med anknytning till den katolska tiden och kapellen förvandlades till renodlade gravrum. Gustav Vasa och hans drottningar begravdes i det tidigare Mariakoret. 

Flera bränder har drabbat domkyrkan. Störst skada orsakade den stora stadsbranden 1702. Restaureringen efter branden var inte färdig förrän vid 1700-talets mitt. I och med den fick Uppsala domkyrka ett delvis nytt utseende. Det präglades av att Sverige lämnat den romersk-katolska kyrkan på 1500-talet och av stilmodets växlingar: väggarna var nu vitkalkade, fönstren hade vanligt glas istället för glasmålningar. De nya tornen var väsentligt lägre.

Vid sidan av kungligheter och andra stormän fick flera kända vetenskapsmän sin grav i domkyrkan. Olof Rudbeck och Carl von Linné är två av dem. Begravningar inne i kyrkor upphörde i slutet av 1700-talet.  År 1931 gjordes ett undantag när ärkebiskopen och fredspristagaren Nathan Söderblom begravdes i domkyrkans högkor.

I slutet av 1800-talet ändrades renoveringsidealen. Arkitekterna strävade efter att ge tillbaka äldre byggnader sin ursprungliga stil. 1885–1893 restaurerades Uppsala domkyrka i nygotisk stil under ledning av arkitekt Helgo Zettervall. Det var då domkyrkan fick sina nuvarande väggmålningar, fönsterglas och höga spetsiga tornspiror. Uppsala domkyrka är idag lika hög som den är lång: 118,7 meter.

1971–1976 pågick ännu en stor restaurering där konstruktioner förbättrades och väggar och fönster rengjordes. Fem kapell fick moderna väggtextilier för att förstärka kapellens roll som gudstjänstrum.

Uppsala domkyrka har ända sedan medeltiden varit plats för såväl dagliga gudstjänster som högtidliga festgudstjänster och kyrkliga möten. Sveriges alla biskopar och Uppsala stifts präster och diakoner vigs till sina ämbeten här och Sveriges kungar och drottningar kröntes i Uppsala domkyrka fram till 1719.

2010 påbörjades en mindre spektakulär renovering: brandskyddet förstärktes med nytt sprinklersystem och byte av el-, vatten- och värmeledningar. Fönsterkonservering påbörjades 2012 och det gjordes även förbättringar av belysning och ljudförstärkning.

Varje år kommer omkring 100 000 personer till domkyrkans gudstjänster och konserter och ytterligare en halv miljon människor besöker Uppsala domkyrka som turister eller för en stunds stillhet.