Fra 1472 var Leonardo registrert som selvstendig kunstmaler. Han arbeidet i ti år i Firenze, men det er bare noen få verker fra denne tiden som er kjent.Marias bebudelse (mulig fullført i 1472) antas å være et ungdomsverk fra tiden hos Verrocchio. Leonardo skal ha studert anatomien til levende fugler for å kunne tegne livaktigeenglevinger. Landskapet i bakgrunnen er også svært forseggjort. Verket ble i 1867 flyttet fra kirken San Bartolomeo a Monteoliveto tilGalleria Uffizi, Firenze.

I verketKristi dåp (1475/1478), fra kirken San Salvi i Firenze, har den unge Leonardo samarbeidet med Verrocchio, og står bak engelen som er malt i profil. Verket henger i dag i Leonardo-rommet i Uffizi-galleriet. Fra disse årene er også bevartMadonna Benois (også kaltMadonna med barn) fra 1478–1480. I dette verket bruker Leonardosfumato-teknikken, som tilskrives ham. Teknikken myker opp konturene og legger et slør over madonnaens ansiktstrekk og underlige halvsmil (Eremitasjen,St. Petersburg iRussland).

I den ufullførteHieronymus med løven fra 1481–1482 (Vatikanmuseet, Roma) hadde Leonardo allerede lagt ungrenessansensnaturalisme bak seg. Hieronymus har en oldings ansikt, fremstilt med intens psykologisk livaktighet, mens kroppens kraftfulle muskulatur vitner om Leonardos interesse for anatomiske studier.

Det regnes som sikkert at Leonardo malteDe hellige tre kongers tilbedelse under oppholdet i Firenze. Det ble bestilt til augustinerkirken San Donato a Scopeto i 1481, og henger i dag i Uffizi. Dette er en av denne tidens mest kompleksekomposisjoner, der Leonardos interesse forperspektiv og figurgruppering kommer fullt til syne.

I 1482 eller 1483 dro Leonardo tilMilano hvor han var i tjeneste hos hertugenLudovico Sforza. Leonardo skulle egentlig jobbe med konstruksjon av festninger ogarkitektur, men det er også flere malerier og skulpturer fra denne perioden. Her malte han mesterverketMadonna i grotten rundt 1482–1483 (Louvre, Paris), hvor skikkelsene i bildet grupperes i pyramideform. Gruppens harmoniske forhold til fantasilandskapet ble en inspirasjonskilde for senere kunstnere.

Videre skapte han modellen tilFrancesco Sforzas rytterstatue, som ble ødelagt i 1499, og det berømteNattverden fra 1495–1497 i spisesalen i klosteret Santa Maria delle Grazie.Nattverden er malt medoljetempera på tørr puss og er derfor i dårlig stand. Verket har fått utført et omfattende restaureringsarbeid i løpet av 1980- og 90-tallet (ferdigstilt 1999).

I 1489 skal Leonardo ha fått i oppdrag å male etportrett av Cecilia Gallerani (1473–1536), en begavetdonna docta, altså en lærd kvinne, ved hoffet til Ludovico Sforza. Hun hadde et forhold til hertugen og fikk en sønn med ham. Maleriet er kaltDamen med røyskatten,og henger i dag i Czartoryski-museet,Kravków. Man antar at røyskatten er en referanse til Sforza selv og deres kjærlighetsforhold. Han ble kalt «den hvite hermelinen» etter å ha blitt opptatt i Hermelin-ordenen.

Leonardo forlot Milano i 1499 etter franskmennenes overfall. Han var igjen i Firenze fra 1501 til 1506, men en del av året 1502 var han iRomagna som festningsingeniør forCesare Borgia. På denne tiden lagde han ogsåAnna selv tredje (Louvre, Paris) ogkartongen til den (Burlington House, London), en gjennomarbeidet og dybdeskapende triangelkomposisjon. Den noe underlige betegnelsen er en oversettelse fra tysk,Anna selbdritt, og viser til en fremstilling av Anna, som er mor til Maria, Maria selv og Jesusbarnet. Hovedverket fra denne tiden er imidlertidMona Lisa fra omkring 1503 (Louvre, Paris), som aldri ble fullført. Bildet fremstiller Lisa Gherardini som var gift med kjøpmannen Francesco del Giocondo. På italiensk kalles maleriet av Mona Lisa derforLaGioconda.

I konkurranse medMichelangelo utførte han ogsåkartongen tilAnghiarislaget for rådssalen iPalazzo Vecchio i Firenze. Kartongen er forsvunnet, men kjent somKampen om fanen gjennom en tegning avPeter Paul Rubens,kobberstukket avGérard Edelinck.

I 1506–1513 var Leonardo mest i Milano, og fra denne tiden stammerJomfru Maria med Jesusbarnet ogJohannes døperen (Louvre, Paris). I 1514–1515 var han iRoma. I 1516 trådte tjenestegjorde Leonardo hos den franske kongenFrans 1. og tilbrakte sine siste år som hans hoffmaler på slottet Cloux vedAmboise.