| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNK ligaza je tip enzima, (EC6.5.1.1), koji u ćeliji popravlja diskontinuitete uDNK molekulima.[1][2]
DNK ligaze imaju primenu upopravci ireplikaciji DNK. Prečišćene DNK ligaze se koriste ukloniranjugena za spajanjeDNK molekula. DNK ligaze se ekstenzivno koriste u molekularno biološkim laboratorijama ugenetičko rekombinacionim eksperimentima (pogledajtePrimena u molekularno biološkim istraživanjima).
Mehanizam dejstva DNK ligaza je formiranje dvekovalentnefosfodiestarske veze između3' hidroksil kraja jednognukleotida sa5' fosfat krajom drugog.ATP je neophodan za reakciju ligacije. Grafička ilustracija načina rada ligaze (salepljivim krajevima):
Ligaza takođe može da radi satupim krajevima, mada su povišene koncentracije enzima i drugačiji reakcioni uslovi neophodni.
Kod sisara, postoje četiri tipa ligaza.
U nekim formama DNK ligaze koje su prisutne ubakterijama je potrebanNADkofaktor, dok je za neke druge forme DNK ligaza (obično prisutne uE. coli) neophodnaATP reakcija. Takođe, više drugih struktura je prisutno u DNA ligazama kao što suAMP ilizin, obe od kojih su važne u procesu ligacije.
DNK ligaze su postale nezamenjiv alat u modernim molekularno-biološkim istraživanjima za generisanjerekombinantnih DNK sekvenci. Na primer, DNK ligaze se koriste sarestrikcionim enzimima za umetanjeDNK fragmenata, čestogena, uplazmide.
Jedan vitalan, i često problematičan, aspekt izvođenja uspešnih rekombinacionih eksperimenata vezan za ligaciju fragmenata je kontrola optimalne temperature. Većina eksperimenata koristi T4 DNK ligazu (izolovanu izbakteriofaga T4), koja je najaktivnija na 25 °C. Međutim, da bi se izvela uspešna ligacija sa kohezivno-završenim fragmentima ("lepljivim krajevima"), optimalna enzimska temperatura treba da bude balansirana satemperaturom topljenja Tm DNK fragmenata koji se spajaju.[3] Ako temperatura ambijenta previsi Tm, ne dolazi dohomolognog uparivanje lepljivih krajeva zato što visoka temperatura narušavavodonično vezivanje.[3] Što suDNK fragmenti kraći, to je niži Tm nivo.
Pošto tupo-završeniDNK fragmenti nemaju kohezivne krajeve, i kontrola optimalne temperature postaje manje važna. Najefikasnija temperatura ligacije je temperatura na kojojT4 DNK ligaza optimalno funkcioniše (T4 DNA ligaza je jedina komercijalno dostupna DNK ligaza koja spaja tupe krajeve).[3] Iz ovih razloga, većina tupo-završenih ligacija se izvodi na 20-25 °C.
Uobičajene kupovno dostupne DNK ligaze su originalno otkrivene ubakteriofagi T4,E. coli i drugimbakterijama.
Prva DNK ligaza je bila prečišćena i karakterisana1967. godine.[4]
