Mastroianni nasceu na pequena Fontana Liri, na província deFrosinone, filho de Ottone e Ida Irolle. Era sobrinho do célebreescultor Umberto Mastroianni, irmão de Ottone. A família era originaria deArpino.[2] Mastroianni passou ainfância na cidade natal, e depois seguiu com a família paraTurim eRoma.
Em 1943, conseguiu o diploma de empreiteiro no Instituto Técnico-industrial Carlo Grella (atualmente Galileo Galilei).[3]
Em 1945, começou a trabalhar para uma empresa de cinema, como figurante emMarionette de Carmine Gallone, emLa corona di ferro deAlessandro Blasetti, emUna storia d'amore deMario Camerini, e emI bambini ci guardano deVittorio De Sica. Também começou a ter as primeiras aulas deteatro e, novamente, bateu nas portas do cinema. Nesta época, partilhou as suas aspirações como ator com uma jovem então desconhecida,Silvana Mangano, e os dois vivem um breve romance.
A verdadeira estreia no cinema veio em 1948, comI miserabili, filme de Riccardo Freda, uma adaptação cinematográfica do livro homónimoOs Miseráveis, deVictor Hugo. Nesta mesma época começou a fazer pequenas participações no teatro, primeiro em companhias amadoras. Foi notado porLuchino Visconti, que lhe ofereceu o seu primeiro personagem como ator profissional, emAs You Like It, deWilliam Shakespeare (em 1948, no Teatro Eliseo -Roma) e, depois, emUm Bonde Chamado Desejo, deTennessee Williams (1949, Teatro Eliseo - Roma), onde interpreta Mitch. Nesta ocasião conheceu Flora Carabella, sua futura esposa, que interpreta um papel menor. Os dois se casaram em 1950 e tiveram uma filha, Barbara.
Depois de ter interpretado sob a direção deLuciano Emmer diversos papéis em comédias neorealistas (Domenica d'agosto,Parigi è sempre Parigi,Le ragazze di Piazza di Spagna), chegaram os primeiros papéis dramáticos emFebbre di vivere de Claudio Gora,Cronache di poveri amanti de Carlo Lizzani,Le notti bianche de Luchino Visconti ePeccato che sia una canaglia, filme de 1954, com direção do cineastaAlessandro Blasetti.
A afirmação definitiva chegou em 1958, comI soliti ignoti,Adua e le compagne (1960) eIl bell'Antonio (1961).
As duasobras-primas deFederico Fellini,A Doce Vida (1960) e8½ (1963), proporcionaram-lhe o sucesso internacional e a fama delatin lover, da qual iria defender-se, mais ou menos inutilmente, quando se tornou mais velho. Esta foi a razão pela qual, logo após o sucesso deA Doce Vida e para se afastar do mito desex symbol, aceitou interpretar o papel de um impotente no filmeIl bell'Antonio, adaptação cinematográfica do livro homônimo deVitaliano Brancati.
Em 1962, a revista norte-americanaTIME dedicou-lhe uma matéria, designando-o o ator estrangeiro mais admirado nosEstados Unidos.
O seu fascínio como ator não vinha apenas da sua beleza e da interpretação sempre de altíssimo nível, mas também de um certo descaso, às vezes escondido, em que parecia revelar umamelancolia e, por vezes, mesmo uma certatimidez.[carece de fontes?]
Em 1963, interpretou emOs Companheiros, deMario Monicelli, o personagem de um intelectualcomunista que fomenta a revolta da fábrica.
Sob a direção deVittorio De Sica, comSophia Loren como protagonista femminina, atuou emOntem, Hoje e Amanhã (1963),Matrimonio all'italiana (1964) eI girasoli (1969). O casal que formou com Sophia Loren foi uma das parcerias artísticas mais bem sucedidas docinema italiano, que se desdobrou com episódios memoráveis ao longo da carreira de ambos.
Em 1966 estreou na comédia musical, interpretando por cerca de três meses o papel deRodolfo Valentino emCiao Rudy de Garinei e Giovannini, cantando e dançando todas as noites e tentando desbancar outra reputação que tinha sido criada, da preguiça eterna. A crítica não foi terna com ele, e mesmo com os ingressos constantemente esgotados, Mastroianni saiu de cena e pagou uma multa de 100 milhões de liras para filmarIl viaggio di G. Mastorna, detto Fernet de Federico Fellini, projeto que o diretor nunca conseguiu realizar porque não conseguiu levantar dinheiro suficiente.
Em 1968 filmouUm Lugar para os Amantes sob a direção de Vittorio De Sica. A protagonista feminina eraFaye Dunaway, com quem teve um breve, mas muito comentado, romance. Neste mesma época fez alguns filmes emlíngua inglesa, mas diferente de Sophia Loren, que fala um inglês perfeito, ele tinha dificuldades com a língua.
Em 1971 trabalhou comMarco Ferreri emLiza, e no set conheceuCatherine Deneuve, com a qual teve um longo relacionamento, e do qual nasceuChiara. No ano seguinte se transferiu paraParis e teve a oportunidade, entre 1972 e 1974, de trabalhar em muitos filmes franceses.
Retornando à Itália, voltou a interpretar papéis em comédias leves (Culastrisce, nobile veneziano,La pupa del gangster),filmes de autor (Juízo Final,Una giornata particolare), dramas fortes (Esposamante,Per le antiche scale) e filmes grotescos (Ciao maschio,Fatto di sangue fra due uomini per causa di una vedova, si sospettano moventi politici).
Em 1978 estreou em um filme de drama para atelevisão:Le mani sporche, deElio Petri, baseado emJean Paul Sartre. Antes disso, Mastroianni nunca havia trabalhado na televisão, com exceção de algumas aparições como anfitrião emStudio Uno, ao lado deMina Mazzini e deSandra Milo.
Em 1980 foi chamado por Federico Fellini, que dezoito anos após8½, o trouxe novamente como protagonista emCidade das Mulheres. Colaboraram novamente em 1985, emGinger e Fred, ao lado deGiulietta Masina e, em 1987, emIntervista.
Em 1988 foi protagonista, junto aMassimo Troisi, emSplendor eChe ora è?, ambos dirigidos porEttore Scola. Por este último filme os dois protagonistas recebem aCoppa Volpi na Mostra de Veneza.
Nos anos 1990, Marcello Mastroianni filmou sobretudo noexterior, com grandes diretores do cinema internacional.
Em 1996, descobriu ocâncer depâncreas, mas mesmo assim continuou trabalhando no qual seria seu último filme,Viagem ao Princípio do Mundo, deManoel de Oliveira, e nos intervalos deste filme gravou uma longa conversa sobre sua vida (Mi ricordo, sì… mi ricordo, direção de Annamaria Tatò, a sua última companheira) que é considerada por muitos o seu testamento espiritual.
O ator morreu aos 72 anos no dia 19 de dezembro, em seu apartamento em Paris. Catherine Deneuve estava ao seu lado, junto com sua filha Chiara. Ele tinha feito mais de 140 filmes em 49 anos de carreira.[4]
Mastroianni,Dean Stockwell eJack Lemmon são os únicos atores a ganhar duas vezes o prêmio de melhor ator noFestival de Cannes. Mastroianni ganhou em 1970, porCiúme à Italiana e, em 1987, porOlhos Negros.