Marcello Mastroianni urodził się 28 września 1924 w miejscowości Fontana Liri. Rodzice aktora, Ida Irolle i Ottorino Mastroianni, poznali się wRzymie, gdzie Ida pracowała w oddziale Banca d’Italia, natomiast Otterino przyjechał delegowany z prochowni w Fontana Liri, gdzie pracował najpierw jako majster, a potem jako laborant. Ślub odbył się w 1923 w Rzymie, jednak młoda para zamieszkała w Fontana Liri, gdzie żyła większość licznej rodziny Mastroiannich. Dziadek aktora Vincenzo miał dziesięcioro dzieci i pracował tak jak Ottorino w prochowni. W 1926 rodzina Mastroiannich przeniosła się doTurynu. Vincenzo Mastroianni został oddelegowany do tutejszego arsenału z prochowni w Fontana Liri. Natomiast Ottorino Mastroianni stracił pracę w tejże prochowni, ponieważ odmówił wstąpienia dopartii faszystowskiej. 7 listopada 1929 Ida Irolle urodziła drugiego syna Ruggiero. W tym czasie cała rodzina Mastroiannich (14 osób) mieszkała w czteropokojowym mieszkaniu.
W 1933 Ida i Ottorino z dziećmi przenieśli się do Rzymu. Początkowo mieszkali u brata Idy Domenico. Był on kolejarzem i mieszkał w małym domku w dzielnicy San Giovanni. Miał pięcioro dzieci i z powodu ciasnoty nie był w stanie długo gościć siostry i jej rodziny. Dlatego Ida i Otterino z dziećmi przeprowadzili się do pokoju z kuchnią na dziesiątym piętrze w budynku przy via Gela w dzielnicy San Giovanni. Ottorino pracował dorywczo jako pomocnik malarski i nie zarabiał dużo. W dodatku zachorował na cukrzycę, czego konsekwencją była postępująca ślepota. W tym czasie Marcello skończył szkołę podstawową Armando Diaz i zapisał się do zawodówki Duca d’Aosta.
W 1936 do Rzymu przeniósł się Vincenzo Mastroianni z żoną i ośmiorgiem dzieci. W garażu przy ulicy San Remo Vincenzo i Ottorino otworzyli zakład stolarski. Natomiast Marcello po trzech latach szkoły zawodowej zapisał się do Instituto Carlo Grella, gdzie mógł zdobyć zawód geometry i technika budowlanego. W wolnych chwilach pomagał dziadkowi i ojcu w zakładzie stolarskim. Marcello Mastroianni zaczął interesować się aktorstwem ok. 1934. Występował w przedstawieniach organizowanych przez proboszcza parafii Santi Fabriano e Venanzio przy via Taranto. W 1938 udało mu się wystąpić w filmie Carmine GalloneMarionetki. Był tam jednym z chłopców oklaskujących śpiewających aktorów. Dopiero w dwa lata później dostał następną rolę w filmie. Zagrał wtedy w dwóch produkcjach: uAlessandra Blasettiego wŻelaznej koronie i uMaria Cameriniego wHistorii miłosnej.
W 1942 Marcello Mastroianni poznałVittorio De Sicę. Było to możliwe, bo matka Marcella znała Marię De Sica, siostrę już wówczas znanego reżysera i aktora. W 1943 Mastroianni skończył naukę w Istituto Tecnico-Industriale "Carlo Grella" i otrzymał dyplom geometry i technika budowlanego. Następnie zapisał się na Uniwersytet w Rzymie (Studium Urbis), na wydział ekonomii i handlu. Musiał równocześnie podjąć pracę zarobkową. Zatrudnił się w rzymskim magistracie jako geodeta. Bardzo chciał dostać się do teatru uniwersyteckiego, w którym w latach czterdziestych pracowało wielu znanych reżyserów i aktorów. Latem 1943 został powołany do wojska. Udało mu się uniknąć wysłania na front, bo zdał odpowiedni egzamin i znalazł się w Wojskowym Instytucie Geograficznym weFlorencji. Po podpisaniu rozejmu 8 września 1943 wyżej wymieniony instytut został włączony doOrganizacji Todt i przeniesiony doDobbiaco wGórnej Adydze. W 1944, bojąc się deportowania doNiemiec, Marcello z kolegą sfałszowali przepustki i uciekli doWenecji. Tam zarabiali malowaniem pocztówek, które sprzedawali turystom. Po wyzwoleniu Wenecji obaj wrócili do Rzymu. Brat aktora Ruggero pracował jako kelner w hotelu „Ludovisi”, gdzie mieszkali alianccy oficerowie. Dzięki temu w tych trudnych czasach rodzinie Mastroiannich powodziło się lepiej niż przed wojną. Natomiast Marcello po powrocie do Rzymu zatrudnił się jako księgowy w angielskiej spółce filmowej Eagle Lion Film.
12 sierpnia 1950 zawarł związek małżeński z włoską aktorką Florą Carabellą, z którą miał córkę Barbarę (ur. 2 grudnia 1951, zm. 11 października 2018)[1]. W 1964 doszło do separacji. Był związany zFaye Dunaway (1968–1970) iCatherine Deneuve (1970–1974), z którą miał córkęChiarę (ur. 28 maja 1972)[1]. Od 1976 aż do śmierci jego partnerką była włoska reżyserka Anna Maria Tatò[1].