Elektroforeza –zjawisko elektrokinetyczne polegające na ruchu cząstek fazy rozproszonej w nieruchomej fazie rozpraszającej, pod wpływempola elektrycznego. Ruch w kierunkuanody nazywany jestanaforezą, a w kierunkukatody –kataforezą[1].
Opisana po raz pierwszy w 1807 przez Aleksandra Reussa zMoskiewskiego Uniwersytetu Państwowego, który zaobserwował ruch cząstekgliny w wodzie po przyłożeniu do niejnapięcia elektrycznego. Umieścił on na dnie szklanej tuby wypełnionej wodą, warstwę mokrej gliny, oddzielonej od wody warstwą piasku. Po przyłożeniu napięcia, woda zaczęła mętnieć od przedostających się przez piasek cząstek gliny[2][3].
W 1870równanie elektroforezy podałHerman von Helmholtz. W 1900William Hardy opisał ruchliwość cząstek rozproszonych (koloidu) w ośrodku wzorem[1][3]:
gdzie: –stała dielektryczna, –potencjał elektrokinetyczny, –lepkość ośrodka, – współczynnik charakteryzujący rozmiarcząstek koloidalnych.
Elektroforeza jest szeroko wykorzystywana jakotechnika analityczna, rzadziejpreparatywna, wchemii ibiologii molekularnej, zwłaszcza wgenetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaninyzwiązków chemicznych na możliwie jednorodnefrakcje przez wymuszanie wędrówki ichcząsteczek wpolu elektrycznym. Jako pierwszy wbiochemii, do oddzielenia białek zsurowicy krwi, użył jej w 1908Karl Landsteiner.
Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniuwprost proporcjonalny doładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.
Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział, wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie niestosowaną), żelową i kapilarną.
W elektroforezieżelowej ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane substancje, jest żel elektroforetyczny sporządzony zagarozy,poliakrylamidu[a],agaru lubskrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę o długości od kilkunastu do kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (w rzadszej elektroforezie dyskowej jest to słupek). Analizowaną mieszaninę nanosi się do tak zwanej studzienki, czyli zagłębienia w żelu na skraju płytki. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (na przykład w stężonym roztworzeformamidu), dzięki czemu opada na dno studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prądroztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegnąelektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne o wartości od 50 do 3000 woltów. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować, nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tak zwane markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.
Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie lub obserwację absorpcji światła (zwyklenadfioletowego) przez żel. Wizualizację elektroforegramów preparatów znakowanychizotopowo uzyskuje się przez zaczernieniekliszy fotograficznej (autoradiogram). W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowielucji.
Elektroforezę najczęściej stosuje się do rozdzielaniaDNA,RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek lubsyntetycznych. Ma ona też zastosowanie jako jedna z technik pomiarumasy cząsteczkowej i badaniapolidyspersji polimerów syntetycznych.
Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich migracji elektroforetycznej i ściślejszym powiązaniu ichruchliwości z masą cząsteczkową, może badane substancje poddać denaturacji, na przykład detergentemdodecylosiarczanem sodu[b] (w przypadkudenaturacji białek), albomocznikiem (w przypadkudenaturacji DNA lub białek).
Z poziomu molekularnego elektroforeza polega na ukierunkowanym przesuwaniu analizowanych cząsteczek przez prąd i ich interakcji z fazą stałą żelu, która w tej cząsteczkowej skali wygląda jak sieć przestrzenna. Bardziej ruchliwe są mniejsze cząsteczki, bo łatwiej się przeciskają przez tę sieć, natomiast większe się opóźniają. Prąd impulsowy uruchamia te, które „utknęły” po drodze, i daje lepszej jakości rozdział.
Przykładowe barwniki do monitorowania przebiegu elektroforezy:
Przykładowe substancje wybarwiające DNA:
Elektroforeza kapilarna (CE, od ang.capillary electrophoresis), zwana też elektroforezą w wolnymbuforze, służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jakwysokosprawna chromatografia cieczowa). Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych; jest także często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziałupeptydów.
Rozdział mieszanin prowadzi się w cienkiej (średnica wewnętrzna 25–100 µm) i długiej (0,5–1 m)kapilarze kwarcowej, przypominającej wyglądemświatłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem rozdzielającym (inaczej separacyjnym). Próbkę wprowadza się do wlotu kapilary, po czym przykłada do niej wysokie napięcie elektryczne (do 30 kilowoltów). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor rejestrujący wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod (dla układu wodnego jest to zwykle katoda).
Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna chromatografia elektrokinetyczna (MEKC, od ang.micellar electrokinetic chromatography). Przy technice tej w buforze znajduje się rozpuszczonydetergent jonowy (na przykładdodecylosiarczan sodu) w takim stężeniu, aby powstała trwałaemulsja. W skład tej emulsji wchodząmicele, które sąhydrofobowe wewnątrz i naładowane elektrycznie na swojej powierzchni.
Micele te, wraz z zamkniętymi wewnątrz nich cząsteczkami związków chemicznych tworzących analizowaną mieszaninę, dzięki swemu ładunkowi poruszają się z inną prędkością niż reszta buforu. Pozwala to rozdzielać związki chemiczne nieprzyjmujące ładunku elektrycznego nawet po przyłożeniu dużego napięcia. Metoda ta umożliwia rozdział i analizę niemal wszystkich substancji rozpuszczalnych w wodzie.
 | Zobacz hasłoelektroforeza w Wikisłowniku |
