WO2023163541A1 - Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles comprising same - Google Patents

Abstract

The present invention relates to novel ionized lipids and lipid nanoparticle comprising the ionized lipids. A therapeutic agent using the lipid nanoparticles comprising novel-type ionized lipids according to the present invention can minimize in vivo side effects due to components of the nanoparticles, effectively transfer the nanoparticles to target cells, and escapes edosomes in target cells, thereby efficiently transferring a pharmaceutically effective substance, such as a nucleic acid, to the cytoplasm.

Description

Translated fromKorean

신규 이온화 지질 및 이를 포함하는 지질 나노입자Novel ionized lipids and lipid nanoparticles containing them

본 발명은 신규 이온화 지질과 상기 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체내 부작용을 최소화하고, 타겟 세포로 약리 효능 물질을 효과적으로 전달할 수 있는 새로운 형태의 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자에 관한 것이다.The present invention relates to novel ionized lipids and lipid nanoparticles containing the ionized lipids, and more particularly, to minimize side effects in vivo and to effectively deliver pharmacologically effective substances to target cells. It relates to lipid nanoparticles.

동일한 약물이라도 전달하는 방법에 따라 효능은 천차만별 달라진다. 이처럼 의약품의 부작용을 최소화하면서 효능 및 효과를 극대화 시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달하는 투여경로와 약의 형태를 약물전달시스템(Drug Delivery System; DDS)이라 한다. 의약 제제 산업에 있어 약물전달시스템은 신약개발과 맞먹는 경제적 이익을 창출할 수 있으면서 성공 가능성이 큰 고부가가치 핵심기술이라고 할 수 있다.Even for the same drug, the efficacy varies greatly depending on the delivery method. As such, an administration route and a form of a drug that efficiently delivers a required amount of a drug by maximizing the efficacy and effect while minimizing the side effects of the drug is called a Drug Delivery System (DDS). In the pharmaceutical formulation industry, drug delivery systems can create economic benefits equivalent to new drug development and can be said to be a high value-added core technology with a high possibility of success.

최근, 다양한 약물전달시스템 중에서 유전자 약물전달시스템을 이용한 유전자 치료법 개발이 점차 확대되고 있는 추세이다. 유전자 치료법을 성공적이고 안전하게 수행하기 위해서는, 유전자 또는 유전자 조절 인자를 원하는 조직으로 전달하는 것이 중요하다. 이러한 유전자 또는 유전자 조절 인자로 대표적인 것이 mRNA, siRNA, miRNA 등이 있다. mRNA 등의 핵산은 특정 단백질을 발현시키는 기능을 수행하기 때문에 유전적 요인에 의하여 결핍된 단백질을 보완하는 역할이 가능하다. 뿐만 아니라, 암 표지자, 바이러스의 표면 단백질을 발현시키는 mRNA를 사용하게 되면 생체내의 면역 반응을 활성화하는 방식의 항암제 및 백신 등의 개발이 가능하다. 또한, siRNA와 miRNA 등의 핵산은 생체 내에서 특정 단백질의 발현을 억제할 수 있는 물질로, 암, 유전병, 감염질병, 자가면역 질환 등의 치료에 중요한 도구로 각광받고 있다. 그러나 이와 같은 핵산은 세포 내로 직접 전달하는 것이 어렵고, 혈액 내에서 효소에 의해 쉽게 분해되므로 이를 극복하기 위한 연구들이 많이 진행되고 있다.Recently, among various drug delivery systems, the development of gene therapy using a gene drug delivery system is gradually expanding. In order to successfully and safely perform gene therapy, it is important to deliver genes or gene regulators to the desired tissue. Representative examples of such genes or gene regulators include mRNA, siRNA, and miRNA. Since nucleic acids such as mRNA perform a function of expressing a specific protein, it is possible to play a role of supplementing a protein lacking due to genetic factors. In addition, when cancer markers and mRNA expressing viral surface proteins are used, it is possible to develop anticancer drugs and vaccines that activate an immune response in vivo. In addition, nucleic acids such as siRNA and miRNA are materials capable of suppressing the expression of specific proteins in vivo, and are in the spotlight as important tools for the treatment of cancer, genetic diseases, infectious diseases, and autoimmune diseases. However, since such nucleic acids are difficult to directly deliver into cells and are easily degraded by enzymes in the blood, many studies are being conducted to overcome this problem.

이러한 물질들을 효과적으로 전달하기 위하여 양이온성 리포좀 및 중합체와 같은 비-바이러스성 유전자 담체가 주목 받고 있으며, 향상된 안정성 프로파일 및 중합체 전달체의 제조와 조작의 용이성으로 인하여 효과적이고 안전한 유전자 전달용 비독성 및 생분해성 중합체 담체의 디자인 및 합성에 대한 연구를 가속화시켰다. 폴리(L-라이신), 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 스타버스트(starburst), 폴리아미도아민(polyamidoamine) 덴드리머, 및 양이온성 리포좀 등이 자발적으로 자가 조립가능하고 플라스미드 DNA(pDNA)를 엔도사이토시스를 통해 세포로 진입시키기에 충분히 작은 구조로 압축할 수 있기 때문에 비-바이러스성 유전자 전달체로서 널리 연구되어 왔다.Non-viral gene carriers such as cationic liposomes and polymers are attracting attention for the effective delivery of these substances, and non-toxic and biodegradable for effective and safe gene delivery due to the improved stability profile and ease of fabrication and manipulation of polymer carriers. Accelerated research into the design and synthesis of polymeric carriers. Poly(L-lysine), polyethylenimine, starburst, polyamidoamine dendrimers, and cationic liposomes can spontaneously self-assemble and convert plasmid DNA (pDNA) through endocytosis. It has been widely studied as a non-viral gene delivery vehicle because it can be compressed into structures small enough to enter cells.

특히, 비-바이러스성 유전자 전달체로서 최근 지질 나노입자의 연구가 활발히 진행중이다(Keith Henry Moss, et al., Mol Pharm. 2019 Jun 3;16(6):2265-2277; Aaron D. Springer and Steven F. Dowdy, Nucleic Acid Ther. 2018 Jun;28(3):109-118; Stephanie Rietwyk, and Dan Peer, ACS Nano. 2017 Aug 22;11(8):7572-7586 등). 지질 나노입자(lipid nanoparticle; LNP)는 생체 내에 존재하는 물질인 인지질과 콜레스테롤 등을 사용하기 때문에 생체 이용률 및 친화도가 높으며 약물의 방출 및 제어가 가능하며 효소 등에 의한 분해에 대해서 높은 안정성을 가지는 입자성 약물전달체이다.In particular, studies on lipid nanoparticles as non-viral gene carriers are currently actively underway (Keith Henry Moss, et al., Mol Pharm. 2019 Jun 3;16(6):2265-2277; Aaron D. Springer and Steven F. Dowdy, Nucleic Acid Ther. 2018 Jun;28(3):109-118; Stephanie Rietwyk, and Dan Peer, ACS Nano. 2017 Aug 22;11(8):7572-7586 et al.). Lipid nanoparticle (LNP) is a particle that has high bioavailability and affinity because it uses phospholipid and cholesterol, which are substances that exist in the body, and can release and control drugs, and has high stability against degradation by enzymes. It is a sex drug delivery system.

한편, mRNA 기반 백신 및 치료제는 특정 항원(antigen) 또는 치료 효과를 나타내는 단백질을 코딩하는 mRNA를 체내에 투여하여, 해당 항원이나 단백질로 발현되도록 함으로써 백신 및 치료 효과를 나타낸다. mRNA 백신은 암 항원을 코딩하는 mRNA를 이용한 암 백신에 대한 연구가 많이 진행되었으며, 2020년부터 COVID-19 백신 효과가 입증되면서 더욱 주목을 받고 있다. mRNA 백신 및 치료제를 체내로 전달하기 위한 전달체로는 리포좀(liposome)이나 LNP 형태가 일반적으로 사용되고 있다(미국공개특허 2020-0405844 A).On the other hand, mRNA-based vaccines and therapeutics show vaccine and therapeutic effects by administering mRNA encoding a protein representing a specific antigen or therapeutic effect into the body and expressing the antigen or protein. A lot of research on cancer vaccines using mRNA encoding cancer antigens has been conducted for mRNA vaccines, and since 2020, as the effectiveness of the COVID-19 vaccine has been proven, it has received more attention. A liposome or LNP form is generally used as a delivery vehicle for delivering mRNA vaccines and therapeutics into the body (US Patent Publication 2020-0405844 A).

mRNA, siRNA, miRNA 등의 올리고를 전달하기 위한 목적으로 사용하는 지질 나노입자의 효능은 해당 입자를 구성하는 성분의 하나인 이온화 지질의 특성에 의해 크게 좌우된다. 지질 나노입자 개발 초기 단계에는 이온화 지질보다는 양전하 지질이 널리 사용되었다. 양전하 지질은 상시적으로 양전하를 띠고 있기 때문에 음전하 상태의 올리고와 정전기적 인력으로 결합을 용이하게 하여 나노입자를 형성하는 특징이 있다. 또한, 세포막 및 엔도좀을 구성하는 지질막이 음전하를 띠기 때문에 양전하 상태인 지질 나노입자와 세포막의 융합 현상을 촉진하여 나노입자가 올리고를 세포 안으로 전달하는 효율이 좋은 것으로 알려져 있었기 때문이다(미국공개특허 2018-0221510 A, 2018-0369384 A). 하지만, 양전하를 띠는 지질을 사용하여 제조한 지질 나노입자 역시 양전하를 가지기 때문에 혈류를 타고 체내를 순환하는 동안 불특정 세포와의 불필요한 상호 작용으로 다양한 부작용을 발생시키는 단점이 크게 부각되었다. 이러한 양전하 지질의 단점을 개선하기 위하여 사용된 것이 이온화 지질이다.The efficacy of lipid nanoparticles used for the purpose of delivering oligos such as mRNA, siRNA, and miRNA is greatly influenced by the characteristics of ionized lipids, one of the components constituting the particles. In the early stages of development of lipid nanoparticles, positively charged lipids were widely used rather than ionized lipids. Positively charged lipids are characterized by forming nanoparticles by facilitating bonding with negatively charged oligos by electrostatic attraction because they are always positively charged. In addition, since the lipid membrane constituting the cell membrane and the endosome is negatively charged, it is known that the fusion between the positively charged lipid nanoparticle and the cell membrane is promoted, so that the nanoparticle has good efficiency in delivering oligos into the cell (US Patent Publication). 2018-0221510 A, 2018-0369384 A). However, since lipid nanoparticles prepared using positively charged lipids also have positive charges, the disadvantage of causing various side effects due to unnecessary interactions with unspecific cells while circulating in the body through the bloodstream has been highlighted. Ionized lipids are used to improve the disadvantages of these positively charged lipids.

이온화 지질(ionizable lipid)은 중성 pH에서는 전하를 띠지 않지만 산성 조건에서는 양전하를 띠는 것을 특징으로 한다. 생체 안에서 순환하는 동안에는 전기적 중성 상태를 유지하기 때문에 양전하 지질 나노입자의 단점을 극복할 수 있다. 반면, 지질 나노입자가 세포의 엔도좀 안으로 진입하는 경우에는, 엔도좀 내부의 산성 pH 환경에 의하여 이온화 지질이 양전하 상태로 전이되고, 이로 인하여 나노입자와 엔도좀을 구성하는 지질막과의 상호 작용이 증진되어 입자와 지질막의 융합이 촉진된다. 이를 달성하기 위하여 이온화 지질은 중성 pH에서는 전하를 띠지 않고 산성 pH에서는 양전하를 띨 수 있는 pKa 값을 갖는 화학 구조로 설계되는 것이 바람직하다. 따라서, 이온화 지질에 적합한 pKa는 5 내지 7로 알려져 있으나, 이 범위의 pKa는 효율적인 이온화 지질 개발을 위한 필요 조건일 뿐, 충분 조건이 아니다. 궁극적으로는 세포 실험 및 동물 실험에서 우수한 효율을 보이는지를 확인하는 것이 필요하다.Ionizable lipids are characterized by being uncharged at neutral pH, but positively charged under acidic conditions. Since it maintains an electrically neutral state while circulating in the living body, it can overcome the disadvantages of positively charged lipid nanoparticles. On the other hand, when the lipid nanoparticles enter the endosome of the cell, the ionized lipid is transferred to a positively charged state by the acidic pH environment inside the endosome, resulting in an interaction between the nanoparticle and the lipid membrane constituting the endosome. It promotes fusion between the particle and the lipid membrane. To achieve this, the ionized lipid is preferably designed with a chemical structure having a pKa value that is uncharged at neutral pH and positively charged at acidic pH. Therefore, it is known that a pKa suitable for ionized lipids is 5 to 7, but a pKa in this range is only a necessary condition for the development of efficient ionized lipids, but not a sufficient condition. Ultimately, it is necessary to confirm whether excellent efficiency is shown in cell experiments and animal experiments.

이에, 본 발명자들은 올리고 등의 약리 효능 물질을 전달하는 지질 나노입자를 제조하는 데 최적의 이온화 지질을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, RAmin1, RAmin2, RAmin3 또는 RAmin6로 명명된 신규 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자가 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to develop ionized lipids that are optimal for producing lipid nanoparticles that deliver pharmacologically effective substances such as oligos. It was confirmed that the nanoparticles exhibited excellent effects, and the present invention was completed.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.The above information described in this background section is only for improving the understanding of the background of the present invention, and therefore does not include information that forms prior art known to those skilled in the art to which the present invention belongs. may not be

발명의 요약Summary of Invention

본 발명의 목적은 핵산 등의 약리 효능 물질을 세포질로 전달하여 효능을 발생시키는 새로운 형태의 이온화 지질과 이를 포함하는 지질 나노입자를 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a new type of ionized lipid and lipid nanoparticles containing the same, which generate efficacy by delivering pharmacologically effective substances such as nucleic acids into the cytoplasm.

본 발명의 다른 목적은 상기 지질 나노입자의 약물 전달 용도를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a drug delivery use of the lipid nanoparticle.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이온화 지질(ionizable lipid) 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an ionizable lipid represented by Formula 1 below or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Formula 1]

상기 화학식 1에서,In Formula 1,

R₁, R₂및 R₃는 H, C_1-30알킬 또는 C_2-30알케닐이며,R₁ , R₂ and R₃ are H, C_1-30 alkyl or C_2-30 alkenyl;

n은 1, 2, 3 또는 4이고,n is 1, 2, 3 or 4;

m은 1, 2 또는 3이며,m is 1, 2 or 3;

X 및 Y는 N 또는 CH이되, X, Y 중 적어도 하나는 N이다.X and Y are N or CH, and at least one of X and Y is N.

본 발명은 또한, 상기 이온화 지질 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다.The present invention also provides a lipid nanoparticle comprising the ionized lipid or pharmaceutically acceptable salt.

본 발명은 또한, 상기 지질 나노입자; 및 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.The present invention also, the lipid nanoparticle; and an anionic drug, a nucleic acid, or a drug delivery composition comprising a combination thereof.

본 발명은 또한, 상기 지질 나노입자를 이용하여 약물을 전달하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for delivering a drug using the lipid nanoparticle.

도 1은 본 발명에 따른 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자의 크기를 동적 광산란 방법으로 측정한 그래프이다.1 is a graph measuring the size of lipid nanoparticles containing ionized lipids according to the present invention by a dynamic light scattering method.

도 2는 본 발명에 따른 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자의 pKa를 TNS를 사용하여 다양한 pH의 완충용액에서 측정한 형광량을 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing the fluorescence amount measured in buffer solutions of various pH using TNS pKa of lipid nanoparticles containing ionized lipids according to the present invention.

도 3은 루시퍼라제의 발현을 억제하는 siRNA를 포함한 지질 나노입자를 제조하고 이를 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포주에 처리하여 루시퍼라제 활성도를 측정한 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the measurement of luciferase activity by preparing lipid nanoparticles containing siRNA that inhibits the expression of luciferase and treating them in a cell line constitutively expressing luciferase.

도 4는 다양한 지질 조성을 가지는 지질 나노입자를 사용하여 루시퍼라제 발현 억제 효능을 측정한 그래프이다.Figure 4 is a graph measuring the efficacy of inhibiting luciferase expression using lipid nanoparticles having various lipid compositions.

도 5는 지질 성분 중 다양한 인지질을 사용하여 지질 나노입자를 제조하고, 이를 사용하여 루시퍼라제 발현 억제 효능을 측정한 그래프이다.5 is a graph showing the preparation of lipid nanoparticles using various phospholipids among lipid components and measuring the efficacy of inhibiting luciferase expression using them.

도 6은 비교예의 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자의 크기를 동적 광산란 방법으로 측정한 그래프이다.Figure 6 is a graph measuring the size of lipid nanoparticles containing ionized lipids of Comparative Example by a dynamic light scattering method.

도 7은 비교예의 지질 나노입자의 pKa를 TNS를 사용하여 다양한 pH의 완충용액에서 측정한 형광량을 나타낸 그래프이다.Figure 7 is a graph showing the amount of fluorescence measured in buffer solutions of various pH using TNS pKa of the lipid nanoparticles of Comparative Example.

도 8은 루시퍼라제의 발현을 억제하는 siRNA를 포함한 비교예의 지질 나노입자를 제조하고 이를 루시퍼라제를 상시적으로 발현하는 세포주에 처리하여 루시퍼라제 활성도를 측정한 그래프이다.Figure 8 is a graph showing the measurement of luciferase activity by preparing a lipid nanoparticle of a comparative example containing siRNA that inhibits the expression of luciferase and treating it in a cell line constitutively expressing luciferase.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION AND PREFERRED EMBODIMENTS

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is one well known and commonly used in the art.

본 발명에 따른 신규 화합물인 이온화 지질을 구성 성분으로 포함하는 지질 나노입자를 약물전달체로 사용하는 경우, 나노입자의 구성 성분으로 인한 생체내 부작용을 최소화하고, 나노입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하며, 타겟 세포내의 엔도좀을 효율적으로 탈피하여 핵산 등의 약리 효능 물질을 세포질로 운반하기에 적합한 것을 확인하였다.When lipid nanoparticles containing ionized lipids, which are novel compounds according to the present invention, are used as a drug delivery system, side effects in vivo caused by the constituents of nanoparticles are minimized, nanoparticles are effectively delivered to target cells, It was confirmed that it was suitable for transporting pharmacologically effective substances such as nucleic acids into the cytoplasm by efficiently escaping the endosomes in the target cells.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 이온화 지질(ionizable lipid) 또는 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.Accordingly, in one aspect, the present invention relates to an ionizable lipid represented byFormula 1 below or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Formula 1]

상기 화학식 1에서,InFormula 1,

R₁, R₂및 R₃는 H, C_1-30알킬 또는 C_2-30알케닐이며,R₁ , R₂ and R₃ are H, C_1-30 alkyl or C_2-30 alkenyl;

n은 1, 2, 3 또는 4이고,n is 1, 2, 3 or 4;

m은 1, 2 또는 3이며,m is 1, 2 or 3;

X 및 Y는 N 또는 CH이되, X, Y 중 적어도 하나는 N이다.X and Y are N or CH, and at least one of X and Y is N.

본 명세서에서, 용어 "C_1-30알킬" 은 1 내지 30개의 탄소 원자를 갖는, 오직 탄소와 수소 원자로만 이루어진 1가 선형 또는 분지형 포화된 탄화수소 잔기를 의미한다. 이러한 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. “분지형 알킬”의 예는 이소프로필, 이소부틸, 3급-부틸 등이 있다.As used herein, the term “C_1-30 alkyl” refers to a monovalent linear or branched saturated hydrocarbon residue having 1 to 30 carbon atoms and consisting only of carbon and hydrogen atoms. Examples of such alkyl groups include, but are not limited to, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, and the like. Examples of “branched alkyl” include isopropyl, isobutyl, tert-butyl, and the like.

본 명세서에서, 용어 "C_2-10 알케닐" 은 하나 이상의 이중 결합을 함유하고 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄형 또는 분지쇄형 탄화 수소 라디칼, 예를 들면, 에테닐, 2-프로페닐, 3-부테닐, 2-부테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 3-메틸-2-부테닐 또는 3-헥세닐 등을 의미한다.As used herein, the term “C_2-10 alkenyl” refers to a straight-chain or branched-chain hydrocarbon radical containing at least one double bond and having 2 to 10 carbon atoms, such as ethenyl, 2-propenyl, 3-butenyl, 2-butenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 3-methyl-2-butenyl or 3-hexenyl; and the like.

본 발명에 있어서, 상기 알킬은 C_1-30, 바람직하게는 C_5-20, 더욱 바람직하게는 C_10-18인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 알케닐은 C_2-30,바람직하게는 C_5-20, 더욱 바람직하게는 C_10-18인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the alkyl may be C_1-30 , preferably C_5-20 , more preferably C_10-18 , and the alkenyl is C_2-30, preferably C_5-20 , more preferably C_10-18 , but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 이온화 지질은 하기 화학식 2 내지 화학식 5 중 어느 하나로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the ionized lipid represented byFormula 1 may be characterized in that it is represented by any one of Formulas 2 to 5 below, but is not limited thereto.

[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3][Formula 3]

[화학식 4][Formula 4]

[화학식 5][Formula 5]

본 명세서에서, “이온화 지질(ionizable lipid)”은 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질을 의미하고, 예를 들면, 주변 pH에 따라 전하상태가 변하는 지질일 수 있다.As used herein, “ionizable lipid” refers to an amine-containing lipid that can be readily protonated, and may be, for example, a lipid whose charge state changes with ambient pH.

상기 이온화 지질은 양이온성 지질의 pKa 미만의 pH에서 양성자화(양으로 하전)될 수 있고, pKa 초과의 pH에서는 실질적으로 중성일 수 있다.The ionized lipid may be protonated (positively charged) at a pH below the pKa of the cationic lipid and substantially neutral at a pH above the pKa.

본 발명에 있어서, 상기 이온화 지질은 지질과 유사한 특성을 갖는 이온화 가능한 화합물로서 약물(예를 들면, 음이온성 약물 및/또는 핵산)과의 정전기적 상호작용을 통하여 상기 약물이 지질 나노입자 내에 높은 효율로 봉입되도록 하는 역할을 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the ionized lipid is an ionizable compound having properties similar to lipids, and through electrostatic interaction with a drug (eg, anionic drug and/or nucleic acid), the drug is introduced into lipid nanoparticles with high efficiency. It may be characterized in that it plays a role in encapsulation.

본 발명에 따른 상기 이온화 지질은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.The ionized lipid according to the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful as the salt. Inorganic acids and organic acids can be used as free acids, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc. can be used as inorganic acids, and citric acid, acetic acid, lactic acid, maleic acid, fumaric acid, gluconic acid, methanesul Ponic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, aspartic acid and the like can be used.

본 발명에 따른 상기 이온화 지질은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 포함한다.The ionized lipid according to the present invention includes not only pharmaceutically acceptable salts, but also all salts, isomers, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 이온화 지질 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 나노입자(lipid nanoparticle; LNP)에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a lipid nanoparticle (LNP) containing the ionized lipid or pharmaceutically acceptable salt.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 지질 나노입자는 양성자화된 이온화 지질 및/또는 중성을 나타내는 이온화 지질을 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the lipid nanoparticle may include a protonated ionized lipid and/or a neutral ionized lipid.

본 발명에 있어서, 상기 지질 나노입자의 크기는 20~200nm, 바람직하게는 50~150nm, 더욱 바람직하게는 60~120nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the size of the lipid nanoparticles may be characterized in that the size of 20 ~ 200nm, preferably 50 ~ 150nm, more preferably 60 ~ 120nm, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 지질 나노입자에서 상기 이온화 지질의 함량은 20~70 몰%, 바람직하게는 25~65 몰%, 더욱 바람직하게는 30~60 몰%인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the content of the ionized lipid in the lipid nanoparticles may be characterized in that the content of the ionized lipid is 20 to 70 mol%, preferably 25 to 65 mol%, more preferably 30 to 60 mol%, but is limited thereto it is not going to be

상기 이온화 지질의 함량이 20 몰% 미만일 경우에는 효능이 저하되는 문제점이 있고, 70 몰%를 초과할 경우에는 효능의 저하 및 균일한 입자의 형성이 어려운 문제점이 있다.When the content of the ionized lipid is less than 20 mol%, there is a problem in that the efficacy is lowered, and when it exceeds 70 mol%, there is a problem in that the efficiency is lowered and uniform particle formation is difficult.

본 명세서에서, “몰%(mol%, 몰퍼센트)”는 특정 구성성분의 몰수를 전체 구성성분의 몰수의 합으로 나눈 후 100을 곱하여 퍼센트로 나타낸 것을 의미한다.In the present specification, "mol% (mol%, mole percent)" means that the number of moles of a specific component is divided by the sum of the number of moles of all components and then multiplied by 100 to express it as a percentage.

본 발명에 있어서, 상기 지질 나노입자는 인지질, 콜레스테롤 또는 PEG 결합 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the lipid nanoparticle may be characterized in that it further comprises a phospholipid, cholesterol or PEG-linked lipid.

상기 지질 나노입자에서 인지질, 콜레스테롤 또는 PEG 결합 지질의 함량은 인지질 5~20 몰%, 콜레스테롤 20~60 몰%, PEG 결합 지질 0.5~2 몰%인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The content of phospholipids, cholesterol or PEG-linked lipids in the lipid nanoparticles may be characterized in that 5-20 mol% of phospholipids, 20-60 mol% of cholesterol, and 0.5-2 mol% of PEG-linked lipids, but are not limited thereto .

본 발명에 있어서, “인지질”은 지질 나노입자 내에서 이온화 지질 및 약물이 상호작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행하며, 타겟 세포의 지질 이중층과 결합하여 약물의 세포내 전달시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출(endosomal escape)을 용이하게 한다.In the present invention, "phospholipid" serves to protect the core formed by the interaction of ionized lipids and drugs in lipid nanoparticles, and binds to the lipid bilayer of the target cell to pass through the cell membrane during intracellular delivery of the drug and Facilitates endosomal escape.

상기 인지질은 본 발명에 따른 지질 나노입자의 융합을 촉진할 수 있는 인지질이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면, DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC(distearoylphosphatidylcholine), POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), EPC(egg phosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol), DSPE(distearoylphosphatidylethanolamine), PE(phosphatidylethanolamine,), DPPE(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]), 스핑고마이엘린(sphingomyelin) 등일 수 있다. 상기 인지질은 바람직하게는, DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine), DSPE(distearoylphosphatidylethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidyethanolamine), egg SM(sphingomyelin) 및 brain SM(sphingomyelin)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The phospholipid can be used without limitation as long as it can promote the fusion of the lipid nanoparticles according to the present invention, for example, DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC ( Distearoylphosphatidylcholine), POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), EPC (egg phosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG (dioleoylphosphatidylcholine) idylglycerol), DPPG (dipalmitoylphosphatidylglycerol), DSPE (distearoylphosphatidylethanolamine), PE (phosphatidylethanolamine, DPPE (dipalmitoylphosphatidylethanolamine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[ phospho-L-serine]), sphingomyelin, and the like. The phospholipid is preferably, DSPC (distearoylphosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DSPE (distearoylphosphatidylethanolamine), DOPE (dioleoylphosphatidyethanolamine), egg SM (sphingomyelin) and brain SM (sphingomyelin) characterized in that any one or more selected from the group consisting of It can be done, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, “콜레스테롤”은 지질 나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 한다.In the present invention, "cholesterol" imparts rigidity in terms of shape to the lipid filling in the lipid nanoparticles, and serves to improve the stability of the nanoparticles by being dispersed in the core and surface of the nanoparticles.

본 명세서에서, “PEG 결합 지질”은 PEG(polyethyleneglycol; 폴리에틸렌글리콜)와 지질이 컨쥬게이트된 형태를 지칭하는 것으로, “지질-PEG”, “PEG-lipid” 또는 “lipid-PEG”와 상호교환적으로 사용되며, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 지질을 의미한다. 상기 PEG 결합 지질은 지질 나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 나노입자 간 응집을 막는 역할을 수행한다. 또한, PEG 결합 지질은 핵산의 생체 내 전달시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 나노입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다.In the present specification, "PEG-linked lipid" refers to a conjugated form of PEG (polyethylene glycol) and lipid, and is interchangeable with "lipid-PEG", "PEG-lipid" or "lipid-PEG" It is used as, and refers to a lipid having a hydrophilic polymer, polyethylene glycol (PEG) attached to one end. The PEG-linked lipid contributes to particle stability in serum of the nanoparticles within the lipid nanoparticles and serves to prevent aggregation between nanoparticles. In addition, PEG-linked lipids can protect nucleic acids from degrading enzymes during in vivo delivery of nucleic acids, enhance the stability of nucleic acids in vivo, and increase the half-life of drugs encapsulated in nanoparticles.

상기 PEG 결합 지질에서 PEG는 지질에 직접 접합될 수 있거나 또는 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 에스테르-비함유 링커 모이어티 및 에스테르-함유 링커 모이어티가 포함된다. 상기 에스테르-비함유 링커 모이어티는 아미도(-C(O)NH-), 아미노(-NR-), 카르보닐(-C(O)-), 카르바메이트(-NHC(O)O-), 우레아(-NHC(O)NH-), 다이설파이드(-S-S-), 에테르(-O-), 석시닐(-(O)CCH2CH2C(O)-), 석신아미딜(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-), 에테르, 다이설파이드뿐만아니라 이들의 조합(예컨대, 카르바메이트 링커 모이어티 및아미도 링커 모이어티 둘 모두를 함유하는 링커)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 에스테르-함유 링커 모이어티는, 예를 들면 카르보네이트(-OC(O)O-), 석시노일, 포스페이트 에스테르(-O-(O)POH-O-), 설포네이트 에스테르 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.In the PEG-linked lipid, the PEG can be conjugated directly to the lipid or linked to the lipid through a linker moiety. Any linker moiety suitable for linking PEG to a lipid may be used, including, for example, ester-free linker moieties and ester-containing linker moieties. The ester-free linker moiety is an amido (-C(O)NH-), amino (-NR-), carbonyl (-C(O)-), carbamate (-NHC(O)O- ), urea (-NHC (O) NH-), disulfide (-S-S-), ether (-O-), succinyl (- (O) CCH CH C (O)-), succinimidyl (-NHC (O )CH2CH2C(O)NH-), ethers, disulfides as well as combinations thereof (e.g. linkers containing both carbamate linker moieties and amido linker moieties). The ester-containing linker moiety may be, for example, carbonate (-OC(O)O-), succinoyl, phosphate ester (-O-(O)POH-O-), sulfonate ester and Combinations include, but are not limited to.

본 발명에 있어서, 상기 PEG 결합 지질 내 지질은 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있는 지질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 지질 나노입자의 다른 구성요소인 인지질 및/또는 콜레스테롤 또한 사용할 수 있다. 구체적으로, PEG 결합 지질 내 지질은 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol, DMG), 세라마이드(ceramide), 석시노일디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol, s-DAG), 디스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE) 또는 콜레스테롤일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the lipid in the PEG-binding lipid can be used without limitation as long as it can bind to polyethylene glycol, and phospholipid and / or cholesterol, which are other components of the lipid nanoparticle, can also be used. Specifically, lipids in PEG-linked lipids include dimyristoylglycerol (DMG), ceramide, succinoyl-diacylglycerol (s-DAG), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), It may be distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE) or cholesterol, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 PEG 결합 지질은 PEG-DMG인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the PEG-linked lipid may be characterized in that PEG-DMG, but is not limited thereto.

상기 PEG 결합 지질 내 PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 지질 나노입자의 체내 순환시간을 증가시키며, 나노입자 간의 응집현상을 막는 역할을 한다. 또한, PEG 결합 지질은 생체 내에서 스텔스(stealth) 기능을 나타내어 나노입자의 분해를 방지할 수 있다.PEG in the PEG-conjugated lipid is a hydrophilic polymer and has the ability to inhibit the adsorption of plasma proteins, thereby increasing the circulation time of lipid nanoparticles in the body and preventing aggregation between nanoparticles. In addition, PEG-linked lipids exhibit a stealth function in vivo to prevent degradation of nanoparticles.

상기 PEG는 지질과 결합하지 않은 쪽에 관능기가 결합된 것(functionalized PEG)일 수 있다. 이 때 사용 가능한 관능기는 숙시닐기(succinyl), 카르복시산(carboxylic acid), 말레이미드(maleimide), 아민기, 바이오틴, 시아누르기(cyanur) 및 폴레이트(folate) 등으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The PEG may be one in which a functional group is bound to a side not bound to a lipid (functionalized PEG). At this time, the usable functional group is at least one selected from the group consisting of succinyl, carboxylic acid, maleimide, amine, biotin, cyanur, and folate. can

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 지질 나노입자; 및 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.In another aspect of the present invention, the lipid nanoparticle; and an anionic drug, a nucleic acid, or a composition for drug delivery comprising a combination thereof.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 지질 나노입자를 이용하여 약물을 전달하는 방법에 관한 것이다. 여기서, 약물은 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.In another aspect, the present invention relates to a method for delivering a drug using the lipid nanoparticle. Here, the drug includes, but is not limited to, anionic drugs, nucleic acids, or combinations thereof.

본 발명에 있어서, 상기 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합은 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the anionic drug, nucleic acid or a combination thereof may be characterized in that it is encapsulated inside the lipid nanoparticle.

본 발명에 있어서, “약물 전달용 조성물” 또는 “약물전달체”는 상기 지질 나노입자 내부에 음이온성 약물 및/또는 핵산 등의 생리활성물질이 봉입되어 있는 것일 수 있으며, 음이온성 약물 및/또는 핵산 등의 생리활성물질이 안정적이고 높은 효율로 봉입되어 상기 전달용 조성물에 의해 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되는 약물의 종류를 치료 목적에 따라 다양하게 조절할 수 있는 장점이 있다.In the present invention, the "drug delivery composition" or "drug delivery system" may be one in which physiologically active substances such as anionic drugs and/or nucleic acids are encapsulated inside the lipid nanoparticles, and anionic drugs and/or nucleic acids A physiologically active substance such as a bioactive substance can be encapsulated stably and with high efficiency, and an excellent therapeutic effect can be exhibited by the delivery composition. In addition, there is an advantage in that the type of drug encapsulated inside the lipid nanoparticles can be variously adjusted according to the purpose of treatment.

본 명세서에서, “봉입(encapsulation)”은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입시키기 위해 캡슐화하는 것을 의미한다.In the present specification, "encapsulation" means encapsulation in order to enclose and efficiently incorporate a delivery material into a living body.

본 발명에 있어서, 상기 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the anionic drug may be at least one selected from the group consisting of peptides, protein drugs, protein-nucleic acid structures, and anionic biopolymer-drug conjugates, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥(single-stranded) siRNA, 이중 가닥(double-stranded) siRNA, rRNA, RNA, DNA, cDNA, plasmid, 앱타머(aptamer), mRNA, tRNA, lncRNA, piRNA, circRNA, saRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the nucleic acid is single-stranded siRNA, double-stranded siRNA, rRNA, RNA, DNA, cDNA, plasmid, aptamer, mRNA, tRNA, lncRNA, piRNA, It may be characterized in that at least one selected from the group consisting of circRNA, saRNA, antisense oligonucleotide, shRNA, miRNA, ribozyme, PNA, and DNAzyme, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 지질 나노입자의 약물전달체로서의 효능을 확인하기 위해 전달 대상으로서 siRNA를 포함하도록 제조하였으며, siRNA의 타겟의 활성 또는 발현이 효과적으로 저해됨을 확인하였다. KR 10-2021-0135494 A 등 공지된 방법에 의해 siRNA 외의 DNA, mRNA 등의 핵산 또는 음이온성 약물 및 지질 나노입자를 포함하는 약물전달체를 제조할 수 있고, 핵산 또는 음이온성 약물을 효과적으로 전달할 수 있음은 당업자에게 명백하다.In one embodiment of the present invention, in order to confirm the efficacy of the lipid nanoparticles according to the present invention as a drug delivery system, it was prepared to include siRNA as a delivery target, and it was confirmed that the activity or expression of the target of siRNA was effectively inhibited. KR 10-2021-0135494 A drug delivery system including nucleic acids other than siRNA, such as DNA or mRNA, or anionic drugs and lipid nanoparticles can be prepared by known methods such as KR 10-2021-0135494 A, and nucleic acids or anionic drugs can be effectively delivered is clear to those skilled in the art.

본 발명에 있어서, 상기 약물 전달용 조성물은 질병 치료를 위한 약학적 조성물로서 사용될 수 있으며, 질병 치료 방법, 용도 및 질병 치료를 위한 약제 제조에 사용될 수 있다.In the present invention, the composition for drug delivery can be used as a pharmaceutical composition for treating diseases, and can be used for methods and uses for treating diseases, and for preparing drugs for treating diseases.

상기 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 비경구 투여를 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered to mammals, including humans, by various routes, including parenteral administration. and body weight, disease severity, drug form, route of administration and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.In the present invention, when formulating the pharmaceutical composition, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspension solutions, emulsions, freeze-dried formulations, suppositories, and the like. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents. As a base for suppositories, witepsol, macrogol,tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol, gelatin, and the like may be used.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is based on the type, severity, and activity of the drug in the patient. , sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.Specifically, the effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, and body weight, and may be administered daily or every other day, or divided into 1 to 3 times a day. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, severity of obesity, gender, weight, age, etc., the dosage is not limited to the scope of the present invention in any way.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for exemplifying the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1: 이온화 지질의 합성Example 1: Synthesis of Ionized Lipids

이온화 지질을 다음과 같이 합성하였다.Ionized lipids were synthesized as follows.

실시예 1-1: (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에날의 제조Example 1-1: Preparation of (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienal

아르곤 대기하에서 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-올(2g, 7.506mmol)을 DCM(HPLC용) 90ml에 넣고 0°C로 냉각시킨 후에 Dess-martin periodinane(3.82g, 1.2eq)을 고체상으로 첨가하였다. 상온에서 2시간 교반하고 Dess-martin periodinane(3.82g, 1.2eq)을 새로이 첨가하였고 1시간 후에 다시 한번 Dess-martin periodinane(3.82g, 1.2eq)을 추가로 넣어주었다. 상온에서 1시간을 교반하여 총 4시간 후 반응을 종료하였다. Ice bath로 냉각시킨 후에 sat.Na₂S₂O₃:sat.NaHCO₃=1:1 수용액을 첨가하여 상온에서 충분히 교반 후 celite pad로 여과하였다. 유기층을 MgSO₄로 처리 후 여과하여 농축하였다. 컬럼정제(Hexane:EA=20:1)하여 1.74g의 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에날(yellow oil, Y=87%)을 획득하였다.In an argon atmosphere, (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-ol (2 g, 7.506 mmol) was added to 90 ml of DCM (for HPLC), cooled to 0 °C, and Dess-martin periodinane (3.82 g, 1.2eq) was added as a solid phase. After stirring at room temperature for 2 hours, Dess-martin periodinane (3.82g, 1.2eq) was newly added, and after 1 hour, Dess-martin periodinane (3.82g, 1.2eq) was additionally added. The reaction was terminated after a total of 4 hours by stirring for 1 hour at room temperature. After cooling with an ice bath, an aqueous solution of sat.Na₂ S₂ O₃ :sat.NaHCO₃ = 1:1 was added, sufficiently stirred at room temperature, and filtered through a celite pad. The organic layer was treated with MgSO_{4 ,} filtered, and concentrated. Column purification (Hexane:EA=20:1) gave 1.74 g of (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienal (yellow oil, Y=87%).

1H NMR(400 MHz, CDCl₃) ppm 9.75(s, 1H), 5.38-5.29(m, 4H), 2.75(m, 2H), 2.40(t, 2H), 2.02(m, 4H), 1.61(m, 2H), 1.37-1.25(m, 14H), 0.87(t, 3H)1H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) ppm 9.75 (s, 1H), 5.38-5.29 (m, 4H), 2.75 (m, 2H), 2.40 (t, 2H), 2.02 (m, 4H), 1.61 (m , 2H), 1.37-1.25 (m, 14H), 0.87 (t, 3H)

실시예 1-2: [2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸]비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아민(RAmin1)의 제조Example 1-2: Preparation of [2-(4-methylpiperazin-1-yl)ethyl]bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl]amine (RAmin1)

아르곤 대기 하에서 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에날(200mg, 2eq), 2-(4-메틸피레라진-1-일)에탄-1-아민(54mg, 0.378mmol), NaBH(OAc)₃(240mg, 3eq)을 DCM(HPLC용) 3ml에 넣고 교반한다. 상온에서 12시간 교반하고 Ice bath로 온도를 내린 후 sat.NaHCO₃을 조심스럽게 첨가하여 반응을 종료시킨다. 유기층을 MgSO₄처리 후 여과하여 농축시킨다. 컬럼정제(DCM:MeOH=20:1, 0.2% 암모니아수)하였으며 25mg의 [2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸]비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아민(brown oil, Y=10%)을 획득하였다.Under argon atmosphere, (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienal (200mg, 2eq), 2-(4-methylpyrerazin-1-yl)ethan-1-amine (54mg, 0.378mmol), NaBH(OAc)₃ (240mg, 3eq) was added to 3ml of DCM (for HPLC) and stirred. After stirring at room temperature for 12 hours, lowering the temperature with an ice bath, sat.NaHCO₃ was carefully added to terminate the reaction. The organic layer was treated with MgSO₄ , filtered, and concentrated. Column purification (DCM:MeOH=20:1, 0.2% aqueous ammonia) and 25 mg of [2-(4-methylpiperazin-1-yl)ethyl]bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-di En-1-yl] amine (brown oil, Y = 10%) was obtained.

1H NMR(400 MHz, CDCl₃) ppm 5.49-5.29(m, 8H), 2.74(t, 4H), 2.74-2.33(m,8H), 2.27(s, 3H), 2.02(q, 8H), 1.49(m, 6H), 1.43-1.17(m, 38H), 0.86(t,6H). 예상분자량 640.1g/mol, 측정분자량 640.7g/mol.1H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) ppm 5.49-5.29 (m, 8H), 2.74 (t, 4H), 2.74-2.33 (m, 8H), 2.27 (s, 3H), 2.02 (q, 8H), 1.49 (m, 6H), 1.43-1.17 (m, 38H), 0.86 (t, 6H). Expected molecular weight 640.1 g/mol, measured molecular weight 640.7 g/mol.

실시예 1-3: 비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일][3-(피페리딘-1-일)프로필]아민(RAmin2)의 제조Example 1-3: Preparation of bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl][3-(piperidin-1-yl)propyl]amine (RAmin2)

아르곤 대기 하에서 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에날(250mg, 2.2eq), 3-(피페리딘-1-일)프로판-1-아민(61mg, 0.43mmol), NaBH(OAc)₃(365mg, 4eq)을 DCM(HPLC용) 5ml에 넣고 교반한다. 상온에서 12시간 교반하고 Ice bath로 온도를 내린 후 sat.NaHCO₃을 조심스럽게 첨가하여 반응을 종료시킨다. 유기층을 MgSO₄처리 후 여과하여 농축시킨다. 컬럼정제(DCM:MeOH=10:1, 0.4% 암모니아수)하였으며 110mg의 비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일][3-(피페리딘-1-일)프로필]아민(brown oil, Y=40%)을 획득하였다.(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienal (250mg, 2.2eq), 3-(piperidin-1-yl)propan-1-amine (61mg, 0.43mmol), NaBH under argon atmosphere (OAc)₃ (365mg, 4eq) was added to 5ml of DCM (for HPLC) and stirred. After stirring at room temperature for 12 hours, lowering the temperature with an ice bath, sat.NaHCO₃ was carefully added to terminate the reaction. The organic layer was treated with MgSO₄ , filtered, and concentrated. Column purification (DCM:MeOH=10:1, 0.4% aqueous ammonia) and 110 mg of bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl][3-(piperidin-1- 1) propyl] amine (brown oil, Y = 40%) was obtained.

1H NMR(400 MHz, CDCl₃) ppm 5.47-5.26(m, 8H), 2.77(t, 4H), 2.57-2.23(m, 12H), 2.05(q, 8H), 1.60(m, 6H), 1.50-1.15(m, 38H), 0.89(t, 6H). 예상분자량 639.2g/mol, 측정분자량 639.7g/mol.1H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) ppm 5.47-5.26 (m, 8H), 2.77 (t, 4H), 2.57-2.23 (m, 12H), 2.05 (q, 8H), 1.60 (m, 6H), 1.50 -1.15 (m, 38H), 0.89 (t, 6H). Expected molecular weight 639.2 g/mol, measured molecular weight 639.7 g/mol.

실시예 1-4: [(1-메틸피페리딘-4-일)메틸]비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아민(RAmin3)의 제조Example 1-4: Preparation of [(1-methylpiperidin-4-yl)methyl]bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl]amine (RAmin3)

아르곤 대기 하에서 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에날(250mg, 2.2eq), (1-메틸피페리딘-4-일)메탄아민(55mg, 0.43mmol), NaBH(OAc)₃(273mg, 3eq)를 DCM(HPLC용) 5ml에 넣고 교반한다. 상온에서 12시간 교반하고 Ice bath로 온도를 내린 후 sat.NaHCO₃을 조심스럽게 첨가하여 반응을 종료시킨다. 유기층을 MgSO₄처리 후 여과하여 농축시킨다. 컬럼정제(DCM:MeOH=10:1, 0.2% 암모니아수)하였으며 90mg의 [(1-메틸피페리딘-4-일)메틸]비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아민(brown oil, Y=33%)을 획득하였다.(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienal (250mg, 2.2eq), (1-methylpiperidin-4-yl)methanamine (55mg, 0.43mmol), NaBH (OAc) under argon atmosphere )₃ (273mg, 3eq) was added to 5ml of DCM (for HPLC) and stirred. After stirring at room temperature for 12 hours, lowering the temperature with an ice bath, sat.NaHCO₃ was carefully added to terminate the reaction. The organic layer was treated with MgSO₄ , filtered, and concentrated. Column purification (DCM:MeOH=10:1, 0.2% aqueous ammonia) and 90 mg of [(1-methylpiperidin-4-yl)methyl]bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-diene -1-yl] amine (brown oil, Y=33%) was obtained.

1H NMR(400 MHz, CDCl₃) ppm 5.49-5.24(m, 8H), 2.88(d, 2H), 2.77(t, 4H), 2.32(m, 7H), 2.18(d, 2H), 2.00-1.8(m, 11H), 1.76(d, 2H), 1.50-1.12(m, 38H), 0.90(t, 6H). 예상분자량 625.1g/mol, 측정분자량 625.7g/mol.1H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) ppm 5.49-5.24 (m, 8H), 2.88 (d, 2H), 2.77 (t, 4H), 2.32 (m, 7H), 2.18 (d, 2H), 2.00-1.8 (m, 11H), 1.76 (d, 2H), 1.50-1.12 (m, 38H), 0.90 (t, 6H). Expected molecular weight 625.1 g/mol, measured molecular weight 625.7 g/mol.

실시예 1-5: {3-[4-(3-{비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아미노}프로필)피페라진-1-일]프로필}비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아민(RAmin6)의 제조Example 1-5: {3-[4-(3-{bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl]amino}propyl)piperazin-1-yl]propyl } Preparation of bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl]amine (RAmin6)

아르곤 대기 하에서 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에날(400mg, 4.3eq), 3,3'-(피페라진-1,4-다이일)비스(프로판-1-아민) (70mg, 0.35mmol), NaBH(OAc)₃(742mg, 10eq)를 DCM(HPLC용) 10ml에 넣고 교반한다. 상온에서 3일간 교반하고 Ice bath로 온도를 내린 후 sat.NaHCO₃을 조심스럽게 첨가하여 반응을 종료시킨다. 유기층을 MgSO₄처리 후 여과하여 농축시킨다. 컬럼정제(DCM:MeOH=10:1, 0.2% 암모니아수)하였으며 108mg의 {3-[4-(3-{비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아미노}프로필)피페라진-1-일]프로필}비스[(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이엔-1-일]아민(brown oil, Y=25%)을 획득하였다.(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienal (400mg, 4.3eq), 3,3'-(piperazine-1,4-diyl)bis(propan-1-amine) under argon atmosphere (70mg, 0.35mmol) and NaBH(OAc)₃ (742mg, 10eq) were added to 10ml of DCM (for HPLC) and stirred. After stirring at room temperature for 3 days, lowering the temperature with an ice bath, sat.NaHCO₃ was carefully added to terminate the reaction. The organic layer was treated with MgSO₄ , filtered, and concentrated. Column purification (DCM:MeOH=10:1, 0.2% ammonia water) and 108 mg of {3-[4-(3-{bis[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yl] Amino} propyl) piperazin-1-yl] propyl} bis [(9Z, 12Z) -octadeca-9,12-dien-1-yl] amine (brown oil, Y = 25%) was obtained.

1H NMR(400 MHz, CDCl₃) ppm 5.49-5.26(m, 16H), 2.81(t, 8H), 2.68-2.26(m, 16H), 2.08(q, 16H), 1.84-1.56(m, 8H), 1.54-1.19(m, 76H), 0.92(t, 12H)1H NMR (400 MHz, CDCl₃ ) ppm 5.49-5.26 (m, 16H), 2.81 (t, 8H), 2.68-2.26 (m, 16H), 2.08 (q, 16H), 1.84-1.56 (m, 8H) , 1.54-1.19(m, 76H), 0.92(t, 12H)

실시예 2: 지질 나노입자의 제조Example 2: Preparation of lipid nanoparticles

지질 나노입자를 제조하기 위하여 두 가지 용액을 준비하였다. 하나는 지질 성분을 포함하는 유기 용액으로서 에탄올에 지질 나노입자를 구성하는 지질 성분을 용해하여 준비하였다. 실시예 1에서 합성한 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제조함에 있어, 이온화 지질, DSPC(distearoylphosphatidylcholine), 콜레스테롤, PEG-DMG(1,2-dimyristoyl-3-PEG-glycerol)를 각각 50:10:38.5:1.5 몰비를 유지하면서 총 4.5mg/mL의 농도가 되도록 준비하였다.Two solutions were prepared to prepare lipid nanoparticles. One was prepared by dissolving lipid components constituting lipid nanoparticles in ethanol as an organic solution containing lipid components. In preparing lipid nanoparticles containing the ionized lipid synthesized in Example 1, the ionized lipid, DSPC (distearoylphosphatidylcholine), cholesterol, and PEG-DMG (1,2-dimyristoyl-3-PEG-glycerol) were mixed at a ratio of 50:10, respectively. : 38.5: 1.5 while maintaining the molar ratio was prepared so as to have a total concentration of 4.5mg / mL.

한편, siRNA를 pH 4의 시트르산 완충 용액에 0.046mg/mL의 농도가 되도록 준비하였다. 마이크로 믹서칩 또는 T-line 칩을 이용하여 에탄올 용액과 버퍼 수용액을 3:1의 부피비로 혼합하여 지질 나노입자를 제조하는데, 혼합 용액의 유속은 4mL/min이 되도록 하였다. 혼합액을 수거하여 pH 7.5 PBS 완충 용액에서 24시간 투석을 진행하였다. 제조된 지질 나노입자를 동적 광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 장치를 사용하여 입자의 크기와 PDI(poly dispersity index)를 측정하였다(표 1 및 도 1).Meanwhile, siRNA was prepared at a concentration of 0.046 mg/mL in a citric acid buffer solution of pH 4. Lipid nanoparticles were prepared by mixing an ethanol solution and an aqueous buffer solution at a volume ratio of 3: 1 using a micro mixer chip or a T-line chip, and the flow rate of the mixed solution was set to 4 mL/min. The mixed solution was collected and dialysis was performed in a pH 7.5 PBS buffer solution for 24 hours. The prepared lipid nanoparticles were measured for particle size and poly dispersity index (PDI) using a dynamic light scattering (DLS) device (Table 1 and FIG. 1).

실시예 3: 지질 나노입자의 pKa 측정Example 3: pKa measurement of lipid nanoparticles

지질 나노입자의 pKa를 측정하기 위하여 형광 물질인 TNS(6-p-Toluidino-2-naphthalenesulfonic acid)를 사용하였다. TNS는 수용액 상태에서는 형광 상태가 아니지만, 지질 나노입자의 지질 성분에 흡착되면 형광 상태가 된다. 이온화 지질이 포함된 지질 나노입자를 서로 다른 pH를 갖는 여러 종류의 완충용액에 투입하면, 이온화 지질의 pKa보다 높은 pH의 완충용액에서는 나노입자의 표면 전하가 중성을 유지하여 TNS의 흡착을 유발하지 않는다. 하지만, 이온화 지질의 pKa보다 낮은 pH 완충용액에서는 나노입자의 표면이 양성 전하를 띠게 되므로 TNS의 흡착을 유발하여 형광을 측정할 수 있게 된다. 이러한 성질을 이용하여 나노입자를 구성하는 이온화 지질의 pKa를 측정할 수 있다. 이를 위하여 pH 2에서 pH 12 구간까지 pH 0.5 단위로 완충 용액을 제조하였다. 완충 용액의 조성은 10mM HEPES, 10mM MES, 10mM Ammonium acetate, 130mM NaCl을 기본으로 하고 pH를 조절하였다. 96 well Black plate에 용액의 부피를 100μl로 하고 이온화 지질 농도를 기준으로 하여 100μM 지질 나노입자와 완충 용액을 혼합하였다. 이때 지질 나노입자를 첨가하지 않은 시료도 함께 제조하였다. 실온에서 10분간 유지한 후 각 well에 TNS가 1μM의 농도가 되도록 첨가하고 orbital shaker를 사용하여 2분간 혼합하였다. 시료의 형광을 형광 측정 장치(multiplate reader)를 이용하여 Ex321nm/Em429nm에서 측정하였으며, 각 형광 측정값은 지질 나노입자를 포함하지 않은 측정값으로 보정하였다.In order to measure the pKa of the lipid nanoparticles, a fluorescent material, TNS (6-p-Toluidino-2-naphthalenesulfonic acid) was used. TNS is not fluorescent in an aqueous solution, but becomes fluorescent when adsorbed to the lipid component of the lipid nanoparticle. When lipid nanoparticles containing ionized lipids are put into various types of buffer solutions having different pHs, the surface charge of the nanoparticles maintains neutrality in the buffer solutions with a pH higher than the pKa of the ionized lipids, preventing adsorption of TNS. don't However, in a buffer solution with a pH lower than the pKa of the ionized lipid, since the surface of the nanoparticle is positively charged, adsorption of TNS is induced and fluorescence can be measured. Using this property, the pKa of the ionized lipid constituting the nanoparticle can be measured. To this end, a buffer solution was prepared in the pH 0.5 unit from pH 2 topH 12. The composition of the buffer solution was based on 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM Ammonium acetate, and 130 mM NaCl, and the pH was adjusted. The volume of the solution was set to 100 μl in a 96 well black plate, and 100 μM lipid nanoparticles and buffer solution were mixed based on the ionized lipid concentration. At this time, a sample without the addition of lipid nanoparticles was also prepared. After maintaining at room temperature for 10 minutes, TNS was added to each well to a concentration of 1 μM and mixed for 2 minutes using an orbital shaker. The fluorescence of the sample was measured at Ex321nm/Em429nm using a fluorescence measuring device (multiplate reader), and each fluorescence measurement value was corrected with a measurement value not including lipid nanoparticles.

각 pH 완충 용액에서의 형광값을 측정한 그래프(도 2)에서 최대 형광값의 절반값에 도달하는 pH 값으로 pKa 값을 구하였다. 이온화 지질의 pKa 측정값은 표 2에 기재된 바와 같으며, pKa 값은 5 내지 7 사이에 분포하고 있다.In the graph (FIG. 2) in which fluorescence values in each pH buffer solution were measured, the pKa value was obtained as a pH value reaching half of the maximum fluorescence value. The measured pKa values of the ionized lipids are as shown in Table 2, and the pKa values are distributed between 5 and 7.

실시예 4: 지질 나노입자의in vitro 효능 측정Example 4:In vitro efficacy measurement of lipid nanoparticles

본 발명에 따른 지질 나노입자의in vitro 효능을 측정하기 위하여 각 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자를 실시예 2에 기재된 방법으로 제조하였다. 각 지질 나노입자는 루시퍼라아제(luciferase)를 타겟으로 하는 siRNA를 동일한 양으로 포함하도록 제조하였다. 루시퍼라아제를 상시적으로 발현하도록 유전자 변형된 HepG2 세포주에 지질 나노입자를 siRNA 농도 기준으로 2, 10, 25, 50nM로 24시간 동안 처리한 후 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 측정하였다(도 3). 각 농도에서의 측정 3 반복으로 진행하여 평균값을 산출하여 대조군 대비하여 상대적인 값으로 표시하였다. 높은 처리 농도로 처리할수록 루시퍼라아제의 활성이 효과적으로 저해되는 것을 확인할 수 있었다.In order to measure thein vitro efficacy of the lipid nanoparticles according to the present invention, lipid nanoparticles containing each ionized lipid were prepared by the method described in Example 2. Each lipid nanoparticle was prepared to contain the same amount of siRNA targeting luciferase. HepG2 cell line genetically modified to constitutively express luciferase was treated with 2, 10, 25, and 50 nM of lipid nanoparticles based on siRNA concentration for 24 hours, and then luciferase activity was measured (Fig. 3). The average value was calculated by repeating 3 measurements at each concentration and expressed as a relative value compared to the control group. It was confirmed that the activity of luciferase was effectively inhibited as the treatment was performed at a higher treatment concentration.

실시예 5: 지질 나노입자를 구성하는 지질 성분의 구성 비율에 따른 지질 나노입자의 효능 비교Example 5: Comparison of efficacy of lipid nanoparticles according to composition ratio of lipid components constituting lipid nanoparticles

본 발명에 따른 지질 나노입자는 이온화 지질, 인지질, 콜레스테롤과 PEG 결합 지질을 주요 성분으로 한다. 그리고, 지질 나노입자는 각 지질 성분의 화학적 특성 및 성분들의 상호 혼합 비율로 인하여 약리적 효능의 차이가 발생하게 된다. 이러한 지질 나노입자의 특성을 확인하기 위하여 RAmin2 또는 RAmin3 이온화 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제조할 때, 인지질, 콜레스테롤, PEG 결합 지질의 성분 비율을 다양하게 변경하여 제조하였다. 이 때 인지질은 DSPC(distearoylphosphatidylcholine)를 사용하고, PEG 결합 지질은 PEG-DMG를 사용하였다. 평가하고자 하는 성분의 비율은 표 3에 기재하였다.Lipid nanoparticles according to the present invention are mainly composed of ionized lipids, phospholipids, cholesterol and PEG-linked lipids. In addition, differences in pharmacological efficacy of lipid nanoparticles occur due to the chemical characteristics of each lipid component and the mutual mixing ratio of the components. In order to confirm the characteristics of these lipid nanoparticles, when preparing lipid nanoparticles containing RAmin2 or RAmin3 ionized lipids, the composition ratios of phospholipids, cholesterol, and PEG-linked lipids were varied. At this time, DSPC (distearoylphosphatidylcholine) was used as the phospholipid, and PEG-DMG was used as the PEG-linked lipid. The ratio of components to be evaluated is shown in Table 3.

지질 나노입자의 효능 평가는 실시예 4에 기재한 바와 동일한 방식으로 진행하였다. 그 결과, 도 4에 표시한 바와 같이, 지질 나노입자의 효능은 입자를 구성하는 지질의 특성과 각 지질의 상대적 비율에 따라 차이가 발생하지만, 기본적으로 타겟 유전자 발현을 억제하는 효능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.Efficacy evaluation of the lipid nanoparticles was performed in the same manner as described in Example 4. As a result, as shown in FIG. 4, the efficacy of the lipid nanoparticles differs depending on the characteristics of the lipids constituting the particles and the relative ratio of each lipid, but basically has the effect of inhibiting target gene expression. I was able to confirm.

실시예 6: 인지질의 종류에 따른 지질 나노입자의 효능 비교Example 6: Comparison of efficacy of lipid nanoparticles according to types of phospholipids

지질 나노입자를 구성하는 성분 중 인지질은 아민 관능기의 형태와 지질 부분의 화학적 구조에 따라 다양한 특성을 지니기 때문에, 서로 다른 화학적, 생물학적 특징을 가진다. 본 발명에 따른 이온화 지질과 이를 구성 성분으로 하는 지질 나노입자는 다양한 종류의 인지질을 사용하여도 효능을 유지하는 특성을 가지고 있다. 이를 확인하기 위하여 서로 다른 인지질을 사용하여 나노입자를 제조하였다. 이온화 지질로서 RAmin2 또는 RAmin3를 사용하고, 인지질은 DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine), DSPE(distearoylphosphatidylethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidyethanolamine), egg SM(sphingomyelin), brain SM을 사용하였다. 이온화 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 50:10:38.5:1.5의 조성비를 기준으로 하여 지질 나노입자를 제조하고, 실시예 4에 기재한 방법으로 효능을 평가하였다.Among the components constituting the lipid nanoparticles, phospholipids have different chemical and biological characteristics because they have various characteristics depending on the type of amine functional group and the chemical structure of the lipid moiety. Ionized lipids and lipid nanoparticles containing them as constituents according to the present invention have characteristics of maintaining efficacy even when using various types of phospholipids. To confirm this, nanoparticles were prepared using different phospholipids. RAmin2 or RAmin3 was used as an ionized lipid, and distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), dioleoylphosphatidyethanolamine (DOPE), egg SM (sphingomyelin), and brain SM were used as phospholipids. Lipid nanoparticles were prepared based on the composition ratio of 50:10:38.5:1.5 of ionized lipid, phospholipid, cholesterol and PEG-DMG, and the efficacy was evaluated by the method described in Example 4.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 이온화 지질 및 이를 구성 성분으로 하는 지질 나노입자는 인지질의 종류를 변경하여도 효능을 가짐을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the ionized lipid and lipid nanoparticles containing the ionized lipid according to the present invention have efficacy even when the type of phospholipid is changed.

비교예 1: 상이한 구조의 화합물을 포함하는 지질 나노입자와의 효능 비교Comparative Example 1: Comparison of efficacy with lipid nanoparticles containing compounds of different structures

본 발명에 따른 지질 나노입자의 현저한 효과를 입증하기 위해, 본 발명에 따른 화합물과 구조가 유사한 화합물을 제조하고, 이를 구성 성분으로 하는 지질 나노입자와의 효능을 비교하였다.In order to prove the significant effect of the lipid nanoparticles according to the present invention, compounds having a structure similar to the compounds according to the present invention were prepared, and the efficacy was compared with lipid nanoparticles containing the compounds as constituents.

비교예 1-1: N-도데실-N-(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)도데칸-1-아민의 제조Comparative Example 1-1: Preparation of N-dodecyl-N-(2-(4-methylpiperazin-1-yl)ethyl)dodecan-1-amine

25mL RBF에 DCM 1mL와 50.0mg(1.00eq)의 2-(4-메틸피페라진-1-일)에탄-1-아민과 304μL(3.95eq)의 dodecanal, 170mg(2.30eq)의 NaBH(OAc)₃, AcOH 46μL(2.30eq)를 넣고 상온에서 하룻밤 교반한다. DCM 10mL를 가한 후, 2N NaOH로 wash(5mL x 3)한다. 칼럼 크로마토그래피(Silica gel 60 0.040-0.063 mm(Merck))를 통해 분리한다(EA 100% -> DCM 90~85/EtOH 10~15 TEA 0.1). 54.6mg의N-도데실-N-(2-(4-메틸피페라진-1-일)에틸)도데칸-1-아민(yellow oil, Y=33%)을 획득하였다.In 25mL RBF, DCM 1mL, 50.0mg (1.00eq) of 2-(4-methylpiperazin-1-yl)ethan-1-amine, 304μL (3.95eq) of dodecanal, 170mg (2.30eq) of NaBH (OAc)₃ , Add AcOH 46μL (2.30eq) and stir overnight at room temperature. After adding 10 mL of DCM, wash (5 mL x 3) with 2N NaOH. It is separated through column chromatography (Silica gel 60 0.040-0.063 mm (Merck)) (EA 100% -> DCM 90-85/EtOH 10-15 TEA 0.1). 54.6 mg ofN -dodecyl-N- (2-(4-methylpiperazin-1-yl)ethyl)dodecan-1-amine (yellow oil, Y=33%) was obtained.

1H NMR (500 MHz; CDCl3): δ 2.59-2.43 (m, 16H), 2.27 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.29-1.24 (m, 34H), 0.86 (t, J = 6.94, 6H)1H NMR (500 MHz; CDCl3): δ 2.59-2.43 (m, 16H), 2.27 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.29-1.24 (m, 34H), 0.86 (t, J = 6.94, 6H)

비교예 1-2:N-도데실-N-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)도데칸-1-아민의 제조Comparative Example 1-2: Preparation ofN -dodecyl-N- (2-(pyrrolidin-1-yl)ethyl)dodecan-1-amine

25mL RBF에 DCM 5mL와 100.0mg(1.00eq)의 2-(피롤리딘-1-일)에탄-1-아민과 764μL(3.95eq)의 dodecanal, 427mg(2.30eq)의 NaBH(OAc)₃, AcOH 115μL(2.30eq)를 넣고 상온에서 하룻밤 교반한다. DCM 10mL를 가한 후, 2N NaOH로 wash(5mL x 3)한다. 칼럼 크로마토그래피(Silica gel 60 0.040-0.063 mm(Merck))를 통해 분리한다(EA 100% -> DCM 97~95/EtOH 3~5 TEA 0.1). 189mg의N-도데실-N-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)도데칸-1-아민(yellow oil, Y=48%)을 획득하였다.In 25 mL RBF, 5 mL of DCM, 100.0 mg (1.00 eq) of 2-(pyrrolidin-1-yl)ethan-1-amine, 764 μL (3.95 eq) of dodecanal, 427 mg (2.30 eq) of NaBH (OAc)₃ , Add AcOH 115μL (2.30eq) and stir overnight at room temperature. After adding 10 mL of DCM, wash (5 mL x 3) with 2N NaOH. It is separated through column chromatography (Silica gel 60 0.040-0.063 mm (Merck)) (EA 100% -> DCM 97-95/EtOH 3-5 TEA 0.1). 189 mg ofN -dodecyl-N- (2-(pyrrolidin-1-yl)ethyl)dodecan-1-amine (yellow oil, Y=48%) was obtained.

1H NMR (500 MHz; CDCl3): δ2.84 (br s, 2H), 2.59 (dd, J = 16.4, 4.1, 6H), 2.44-2.40 (m, 4H), 1.77 (q, J = 3.4, 3H), 1.43-1.40 (m, 3H), 1.23 (s, 30H), 0.86 (t, J = 7.0, 6H)1H NMR (500 MHz; CDCl3): δ2.84 (br s, 2H), 2.59 (dd, J = 16.4, 4.1, 6H), 2.44-2.40 (m, 4H), 1.77 (q, J = 3.4, 3H ), 1.43–1.40 (m, 3H), 1.23 (s, 30H), 0.86 (t, J = 7.0, 6H)

비교예 1-3: 지질 나노입자의 물성 측정 및 효능 평가Comparative Example 1-3: Physical property measurement and efficacy evaluation of lipid nanoparticles

비교예 1-1 및 비교예 1-2의 화합물을 이용하여, 실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방법으로 지질 나노입자를 제조하고, 입자의 크기를 측정하였다(도 6). 또한, 실시예 3에 기재된 방법과 동일한 방법으로 pKa를 측정하였으며(도 7), 실시예 4에 기재된 방법과 동일한 방법으로 지질 나노입자의in vitro 효능을 측정하였다(도 8).Using the compounds of Comparative Examples 1-1 and 1-2, lipid nanoparticles were prepared in the same manner as described in Example 2, and the size of the particles was measured (FIG. 6). In addition, the pKa was measured in the same way as in Example 3 (Fig. 7), and thein vitro efficacy of the lipid nanoparticles was measured in the same way as in Example 4 (Fig. 8).

그 결과, 비교예 1-1 및 비교예 1-2의 화합물은 효능이 전혀 측정되지 않은 반면, 비교예 1-1 및 비교예 1-2에 따른 화합물에 비해 본 발명에 따른 RAmin1, RAmin2, RAmin3 또는 RAmin6의 화합물에 의해 루시퍼라아제 활성(도 3)이 훨씬 효과적으로 저해되는 것을 확인하였다.As a result, the efficacy of the compounds of Comparative Examples 1-1 and 1-2 was not measured at all, whereas RAmin1, RAmin2, and RAmin3 according to the present invention were compared to the compounds according to Comparative Examples 1-1 and 1-2. Alternatively, it was confirmed that the luciferase activity (FIG. 3) was inhibited much more effectively by the compound of RAmin6.

비교예 2: 양이온성 지질의 구조 차이에 의한 물성 비교Comparative Example 2: Comparison of physical properties due to structural differences in cationic lipids

유사한 구조의 양이온성 지질이라도 미세한 구조의 차이에 의해서도 물성이 상이함을 확인하기 위해, 다양한 구조의 화합물들의 pK_a 및 ED₅₀을 비교하였다(표 4).In order to confirm that even cationic lipids with similar structures have different physical properties due to differences in fine structures, the pK_a and ED₅₀ of compounds with various structures were compared (Table 4).

상기 표 4의 ID 14 내지 18의 화합물 구조는 dimethylamine과 carbonyl carbon 사이의 탄소수만 다를 뿐, 나머지 조건은 모두 같은 구조인 한편, ED₅₀ 값은 5 이상(ID 14)에서부터 0.03(ID 16)까지 지질 나노입자의 효능 측면에서는 무려 100배 이상의 차이가 있었다. 또한, ID 48에서 ID 31까지의 물질은 amine과 carbonyl carbon 사이의 탄소수를 3으로 고정하는 대신, amine에 붙는 치환기를 다양하게 변형시킨 것으로, 상기 예시와 마찬가지로 미세한 치환기의 변형은 지질 나노입자의 효능 측면에서 ED₅₀ 값이 5 이상(ID 48, 41)에서부터 0.03(ID 47)까지 100배 이상의 차이가 있었다.The compound structures of ID 14 to 18 in Table 4 differ only in the number of carbon atoms between dimethylamine and carbonyl carbon, and all other conditions are the same structure, while the ED₅₀ values range from 5 or more (ID 14) to 0.03 (ID 16). In terms of the efficacy of nanoparticles, there was a difference of more than 100 times. In addition, materials withID 48 to ID 31 have variously modified substituents attached to the amine instead of fixing the number of carbon atoms between the amine and carbonyl carbon to 3. On the side, there was a difference of more than 100 times in the ED₅₀ value from 5 or more (ID 48, 41) to 0.03 (ID 47).

결과적으로, 작용기의 탄소수에서 미세한 차이라도 화합물의 효과에 큰 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다.As a result, it was confirmed that even a slight difference in the number of carbon atoms of the functional group has a great effect on the effect of the compound.

본 발명에 따른 지질 나노입자는 새로운 형태의 이온화 지질을 포함하고 있으며, 생체 안에서 혈류를 타고 순환하는 동안은 주변의 구성 성분과의 불필요한 상호 작용을 최소화할 수 있고, 세포의 엔도좀 안으로 진입하였을 때는 엔도좀의 산성 조건에서 양이온 전하를 띠는 나노입자로 전환되기 때문에 음성 전하를 띠는 엔도좀 지질막과의 융합을 원활하게 하여 약리 효능 물질을 세포안으로 안전하게 전달하는 효과가 있다.Lipid nanoparticles according to the present invention contain a new type of ionized lipid, and can minimize unnecessary interactions with surrounding components while circulating in the bloodstream in the living body, and when entering the endosome of the cell Since it is converted into nanoparticles with positive charges in the acidic condition of endosomes, it has the effect of safely delivering pharmacologically effective substances into cells by facilitating the fusion with the negatively charged lipid membrane of endosomes.

본 발명에 따른 지질 나노입자를 이용한 치료제는 나노입자의 구성 성분으로 인한 생체내 부작용을 최소화하고, 나노입자를 타겟 세포로 효과적으로 전달하며, 타겟 세포내의 엔도좀을 탈피하여 핵산 등의 약리 효능 물질을 세포질로 효율적으로 운반할 수 있다.The therapeutic agent using lipid nanoparticles according to the present invention minimizes side effects in vivo due to the constituents of nanoparticles, effectively delivers nanoparticles to target cells, and escapes endosomes in target cells to release pharmacologically effective substances such as nucleic acids. efficient transport into the cytoplasm.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it will be clear to those skilled in the art that these specific descriptions are merely preferred embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (11)

Translated fromKorean

하기 화학식 1로 표시되는 이온화 지질(ionizable lipid) 또는 약학적으로 허용 가능한 염:An ionizable lipid represented by Formula 1 below or a pharmaceutically acceptable salt thereof:[화학식 1][Formula 1]

상기 화학식 1에서,In Formula 1,R₁, R₂및 R₃는 H, C_1-30알킬 또는 C_2-30알케닐이며,R₁ , R₂ and R₃ are H, C_1-30 alkyl or C_2-30 alkenyl;n은 1, 2, 3 또는 4이고,n is 1, 2, 3 or 4;m은 1, 2 또는 3이며,m is 1, 2 or 3;X 및 Y는 N 또는 CH이되, X, Y 중 적어도 하나는 N이다.X and Y are N or CH, and at least one of X and Y is N.제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 이온화 지질은 하기 화학식 2 내지 화학식 5 중 어느 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는 이온화 지질 또는 약학적으로 허용 가능한 염:The ionized lipid or pharmaceutically acceptable salt according to claim 1, wherein the ionized lipid represented by Formula 1 is represented by any one of the following Formulas 2 to 5:[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3][Formula 3]

[화학식 4][Formula 4]

[화학식 5][Formula 5]

제1항의 이온화 지질 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 나노입자(lipid nanoparticle; LNP).A lipid nanoparticle (LNP) comprising the ionized lipid or pharmaceutically acceptable salt of claim 1.제3항에 있어서, 상기 이온화 지질의 함량은 20~70 몰%인 것을 특징으로 하는 지질 나노입자.The lipid nanoparticle according to claim 3, wherein the content of the ionized lipid is 20 to 70 mol%.제3항에 있어서, 인지질, 콜레스테롤 또는 PEG 결합 지질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 나노입자.The lipid nanoparticle according to claim 3, further comprising phospholipid, cholesterol or PEG-linked lipid.제5항에 있어서, 상기 인지질은 DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC(distearoylphosphatidylcholine), POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), EPC(egg phosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol), DSPE(distearoylphosphatidylethanolamine), PE(phosphatidylethanolamine,), DPPE(dipalmitoylphosphatidylethanolamine), POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPS(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 지질 나노입자.The method of claim 5, wherein the phospholipid is DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine; 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC (distearoylphosphatidylcholine), POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine; 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine), EPC (egg phosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG (dioleoylphosphatidylglycerol), DPPG (dipalmitoylphosphatidylglycerol), DSPE (distearoylphosphatidylethanolamine), PE (phosphatidylethanolamine, ), DPPE (dipalmitoylphosphatidylethanolamine), POPE (1- Selected from the group consisting of palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine]) and sphingomyelin Lipid nanoparticles, characterized in that any one or more of being.제5항에 있어서, 상기 PEG 결합 지질은 PEG(polyethyleneglycol)-DMG(dimyristoylglycerol)인 것을 특징으로 하는 지질 나노입자.The lipid nanoparticle according to claim 5, wherein the PEG-linked lipid is PEG (polyethyleneglycol)-DMG (dimyristoylglycerol).제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 지질 나노입자; 및 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합을 포함하는 약물 전달용 조성물.The lipid nanoparticle of any one of claims 3 to 7; and an anionic drug, a nucleic acid, or a drug delivery composition comprising a combination thereof.제8항에 있어서, 상기 음이온성 약물, 핵산 또는 이의 조합은 상기 지질 나노입자 내부에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.The drug delivery composition according to claim 8, wherein the anionic drug, nucleic acid or a combination thereof is encapsulated inside the lipid nanoparticle.제8항에 있어서, 상기 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 약물, 단백질-핵산 구조체 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.The drug delivery composition according to claim 8, wherein the anionic drug is at least one selected from the group consisting of peptides, protein drugs, protein-nucleic acid structures, and anionic biopolymer-drug conjugates.제8항에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥(single-stranded) siRNA, 이중 가닥(double-stranded) siRNA, rRNA, RNA, DNA, cDNA, plasmid, 앱타머(aptamer), mRNA, tRNA, lncRNA, piRNA, circRNA, saRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA 및 DNAzyme로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.The method of claim 8, wherein the nucleic acid is single-stranded siRNA, double-stranded siRNA, rRNA, RNA, DNA, cDNA, plasmid, aptamer, mRNA, tRNA, lncRNA, piRNA , circRNA, saRNA, antisense oligonucleotide, shRNA, miRNA, ribozyme (ribozyme), PNA and DNAzyme, characterized in that any one or more selected from the group consisting of drug delivery composition.

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