WO2022059601A1 - Visualization method and information acquisition method - Google Patents

Abstract

This visualization method has the steps of: visualizing a first substance that is expressed on a target cell on which an active substance in an analyte acts; and visualizing a second substance that is generated by the action of the active substance in the analyte.

Description

Translated fromJapanese

可視化方法および情報取得方法Visualization method and information acquisition method

　本発明は、検体中における第１物質および第２物質を可視化するための可視化方法と、検体中における第１物質および第２物質に関する情報を取得するための情報取得方法に関する。The present invention relates to a visualization method for visualizing a first substance and a second substance in a sample, and an information acquisition method for acquiring information on the first substance and the second substance in a sample.

　医薬となる候補の化合物からは、スクリーニングにより、有効と評価された化合物のみ選定される。医薬は、生体内の受容体、酵素、イオンチャネル、トランスポーターなどの標的物質に結合することが多い。そして、医薬は細胞に到達し、標的物質に結合した後、標的物質に作用することで薬効を示す。したがって、医薬が標的物質に到達したか、または到達した薬物が薬効を示すかなどの判断は、スクリーニングにおいて重要な判断基準である。From the candidate compounds that can be used as pharmaceuticals, only the compounds evaluated to be effective are selected by screening. Drugs often bind to target substances such as receptors, enzymes, ion channels, and transporters in the body. Then, the drug reaches the cell, binds to the target substance, and then acts on the target substance to show its medicinal effect. Therefore, the judgment as to whether the drug has reached the target substance or whether the drug that has reached the target substance has a medicinal effect is an important criterion in screening.

　また、標的物質などを検出する方法として、作製した組織標本に対して、抗原抗体反応などを利用した免疫染色法が知られている（例えば、非特許文献１、２参照）。Further, as a method for detecting a target substance or the like, an immunostaining method using an antigen-antibody reaction or the like on a prepared tissue specimen is known (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).

　非特許文献１には、ＰＡＲＰ阻害剤であるＡＢＴ－８８８とトポテカンとを併用した第１相試験について記載されている。非特許文献１では、ＡＢＴ－８８８を経口投与し、トポテカンを静脈内投与し、腫瘍および末梢血単核細胞で、ポリ（ＡＤＰ－リボース）（ＰＡＲ）とＤＮＡ損傷マーカーであるγＨ２ＡＸの有無を観察している。また、γＨ２ＡＸの有無は、蛍光標識物質を用いた免疫染色法により確認されている。Non-Patent Document 1 describes a phase 1 study in which ABT-888, which is a PARP inhibitor, is used in combination with topotecan. In Non-Patent Document 1, ABT-888 is orally administered, topotecan is intravenously administered, and the presence or absence of poly (ADP-ribose) (PAR) and the DNA damage marker γH2AX is observed in tumors and peripheral blood mononuclear cells. is doing. The presence or absence of γH2AX has been confirmed by an immunostaining method using a fluorescent labeling substance.

　非特許文献２には、細胞傷害性の薬物によるＤＮＡ二本鎖切断と、アポトーシスに関連したＤＮＡ二本鎖切断との関係について記載されている。非特許文献２では、細胞内で複数のマーカーの共発現を観察することで、特定の細胞におけるγＨ２ＡＸの発現が細胞損傷性の薬物によるＤＮＡ二本鎖切断であるのか、アポトーシスに関連したＤＮＡ二本鎖切断であるのかを解析している。また、γＨ２ＡＸの有無は、蛍光標識物質を用いた免疫染色法により確認されている。Non-Patent Document 2 describes the relationship between DNA double-strand breaks caused by cytotoxic drugs and DNA double-strand breaks related to apoptosis. In Non-Patent Document 2, by observing the co-expression of a plurality of markers in cells, whether the expression of γH2AX in a specific cell is DNA double-strand break by a cell-damaging drug or DNA 2 related to apoptosis. We are analyzing whether it is a main-strand break. The presence or absence of γH2AX has been confirmed by an immunostaining method using a fluorescent labeling substance.

Shivaani Kummar et al., “Phase I Study of PARP Inhibitor ABT-888 in Combination with Topotecan in Adults with Refractory Solid Tumors and Lymphomas”, Cancer Research, 2011, Volume 71, Issue 17, p.5626-5634Shivaani Kummar et al., “Phase I Study of PARP Inhibitor ABT-888 in Combination with Topotecan in Adults with Reflectory Solid Tumors and Lymphomas”, Cancer Research, 2011, Volume 71,Angie B. Dull et al., “Development of a quantitative pharmacodynamic assay for apoptosis in fixed tumor tissue and its application in distinguishing cytotoxic drug-induced DNA double strand breaks from DNA double strand breaks associated with apoptosis”, Oncotarget, 2018, Volume 9, No. 24, p.17104-17116Angie B. Dull et al., “Development of a quantitative pharmacodynamic assay for apoptosis in fixed tumor tissue and its applications in distincting cytotoxic drug-induced DNA double strand breaks from Vol with DNA double strand breaks , No. 24, p.17104-17116Benjamin M. Larimer et al., “Granzyme B PET Imaging as a Predictive Biomarker of Immunotherapy Response”, Cancer Research, 2017, Volume 77, Issue 9, p.2318-2327Benjamin M. Larimer et al., “Granzyme B PET Imaging as a Predictive Biomarker of Immunotherapy Response”, Cancer Research, 2017, Volume 77, Issue 9, p.2318-2327

　しかしながら、非特許文献１、２では、医薬などを投与したことに対する結果のみを評価しているため、医薬の効果があったか否かは判断できるものの、その原因を把握することができない。よって、非特許文献１、２に記載された方法では、医薬の特性についての評価が不十分である。例えば、医薬が代謝された場合には医薬の存在を確認できないため、結果的に奏功しても、医薬では奏功していないと判断されるおそれがある。また、個々の細胞に対して、医薬の送達量が不明確であるため、実際に医薬が届いていないために効果が発揮されなかったのか、医薬が届いていたが別の要因で効果が発揮されなかったのかが不明のままであった。However, in Non-Patent Documents 1 and 2, since only the result of administration of a drug or the like is evaluated, it can be determined whether or not the drug was effective, but the cause cannot be grasped. Therefore, the methods described in Non-Patent Documents 1 and 2 are insufficient in evaluating the characteristics of a drug. For example, when a drug is metabolized, the existence of the drug cannot be confirmed, and even if the drug is successful as a result, it may be determined that the drug is not successful. In addition, because the amount of drug delivered to individual cells is unclear, the effect may not have been exhibited because the drug did not actually arrive, or the drug arrived but the effect was exhibited due to another factor. It remained unclear if it was not done.

　ここで、医薬の標的細胞への到達量を検出することも考えられるが、医薬が代謝されてしまった場合や、医薬を標識できない場合には、標的細胞への到達量を検出できない。Here, it is conceivable to detect the amount of the drug reaching the target cell, but if the drug is metabolized or the drug cannot be labeled, the amount of the drug reaching the target cell cannot be detected.

　本発明の目的は、作用物質の特性を正確に評価できる可視化方法および情報取得方法を提供することである。An object of the present invention is to provide a visualization method and an information acquisition method that can accurately evaluate the characteristics of an agent.

　上記の課題を解決するための一手段としての可視化方法は、検体中における作用物質が作用する対象の標的細胞に発現する第１物質を可視化する工程と、検体中における前記作用物質の作用により生じる第２物質を可視化する工程とを有する。The visualization method as one means for solving the above-mentioned problems is caused by the step of visualizing the first substance expressed in the target cell of the target on which the agent acts in the sample, and the action of the agent in the sample. It has a step of visualizing a second substance.

　上記の課題を解決するための一手段としての情報取得方法は、検体中における作用物質が作用する対象の標的細胞に発現する第１物質が可視化された第１像を得る工程と、検体中における前記作用物質の作用により生じた第２物質が可視化された第２像を得る工程と、前記第１像および前記第２像から前記第１物質および前記第２物質に関する情報を得る工程と、を有する。The information acquisition method as one means for solving the above-mentioned problems includes a step of obtaining a first image in which the first substance expressed in the target cell of the target on which the acting substance acts in the sample is visualized, and a step in the sample. A step of obtaining a second image in which the second substance generated by the action of the working substance is visualized, and a step of obtaining information on the first substance and the second substance from the first image and the second image. Have.

　本発明によれば、作用物質の特性を正確に評価できる。According to the present invention, the characteristics of the acting substance can be accurately evaluated.

図１Ａ～Ｃは、第１物質および第２物質に関する情報を説明するための模式図である。FIGS. 1A to 1C are schematic views for explaining information regarding the first substance and the second substance.

　以下、本発明の実施の形態に係る可視化方法および情報取得方法について、添付した図面を参照して詳細に説明する。Hereinafter, the visualization method and the information acquisition method according to the embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the attached drawings.

　［実施の形態１］
　本発明の実施の形態１に係る情報取得方法は、検体中における作用物質が作用する対象の標的細胞に発現する第１物質が可視化された第１像を得る工程と、検体中における作用物質の作用により生じた第２物質が可視化された第２像を得る工程と、第１像および第２像から第１物質および第２物質に関する情報を得る工程と、を有する。第１像を得る工程および第２像を得る工程を行う順番は、特に限定されない。第１像を得る工程および第２像を得る工程を行う順番は、第１像を得る工程を先に行ってもよいし、第２像を得る工程を先に行ってもよいし、同時でもよい。[Embodiment 1]
The information acquisition method according to the first embodiment of the present invention includes a step of obtaining a first image in which the first substance expressed in the target cell on which the agent acts in the sample is visualized, and a step of obtaining the first image of the agent in the sample. It has a step of obtaining a second image in which the second substance produced by the action is visualized, and a step of obtaining information on the first substance and the second substance from the first image and the second image. The order in which the steps for obtaining the first image and the steps for obtaining the second image are performed is not particularly limited. The order of performing the steps of obtaining the first image and the step of obtaining the second image may be the step of obtaining the first image first, the step of obtaining the second image first, or simultaneously. good.

　第１像を得る工程では、検体中における作用物質が作用する対象の標的細胞に発現する第１物質が可視化された第１像を得る。第１像は、作用物質が投与される前の第１物質が可視化された画像でもよいし、作用物質が投与された後の第１物質が可視化された画像でもよい。In the step of obtaining the first image, the first image in which the first substance expressed on the target cell on which the active substance acts in the sample is visualized is obtained. The first image may be an image in which the first substance before the agent is administered is visualized, or an image in which the first substance after the agent is administered may be visualized.

　検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液（血清、血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水など）、各生体組織、培養により製造された細胞または組織が含まれる。The type of sample is not particularly limited. Examples of specimens include blood (serum, plasma), urine, nasal fluid, saliva, stool, body cavity fluid (medullary fluid, ascites, pleural effusion, etc.), biological tissues, and cells or tissues produced by culture.

　作用物質は、標的細胞に作用する物質である。作用物質の例には、抗体、抗体薬物複合体（ＡＤＣ；ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、通常の医薬化合物などの医薬、毒物が含まれる。医薬化合物は、細胞内におけるＤＮＡの複製を阻害する物質を含む。医薬の具体的な例には、各種疾病の治療薬、特に抗癌剤が含まれる。ここで、「標的細胞に作用する」とは、標的細胞に直接作用すること、標的細胞における受容体などに結合する場合を含む。The acting substance is a substance that acts on the target cell. Examples of agents include antibodies, antibody drug conjugates (ADCs), drugs such as ordinary pharmaceutical compounds, and toxic substances. Pharmaceutical compounds include substances that inhibit DNA replication in cells. Specific examples of pharmaceuticals include therapeutic agents for various diseases, especially anti-cancer agents. Here, "acting on a target cell" includes a case of directly acting on a target cell and a case of binding to a receptor or the like in the target cell.

　標的細胞の例には、エフェクターＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞を含むヘルパーＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞が含まれる。例えば、細胞は、がん免疫治療薬を開発する観点から、ヘルパーＣＤ８Ｔ細胞である。Examples of target cells include effector T cells, effector memory T cells, helper CD8 T cells including central memory T cells, B cells, NK cells, macrophages, and dendritic cells. For example, cells are helper CD8 T cells from the perspective of developing cancer immunotherapeutic agents.

　第１物質は、作用物質が作用する標的細胞に特異的に発現する細胞マーカーであり、作用物質が直接作用する物質であっても良く、作用物質とは直接作用しない他の物質であってもよい。細胞マーカーの例には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ１６３が含まれる。ここで、「特異的に発現」とは、必ずしも標的細胞のみに発現していることを意味するわけではなく、標的細胞とその周囲に存在する他の細胞とを区別できる程度に標的細胞での発現量が多く、他の細胞での発現量が少なければよい。The first substance is a cell marker that is specifically expressed on the target cell on which the acting substance acts, and may be a substance that the acting substance acts directly on, or may be another substance that does not directly act on the acting substance. good. Examples of cell markers include CD3, CD4, CD11c, CD20, CD21, CD56, CD68, CD163. Here, "specifically expressed" does not necessarily mean that it is expressed only in the target cell, but in the target cell to the extent that the target cell and other cells existing around the target cell can be distinguished. It suffices if the expression level is high and the expression level in other cells is low.

　第１物質を可視化する方法は、特に限定されない。第１物質を可視化する方法の例には、免疫染色法、抗体に類似の分子認識基を用いた染色法が含まれる。The method of visualizing the first substance is not particularly limited. Examples of the method for visualizing the first substance include an immunostaining method and a staining method using a molecular recognition group similar to an antibody.

　免疫染色法により、第１物質を可視化する方法では、例えば作用物質を投与してから一定時間が経過した後、作用物質が作用する標的細胞に特異的に発現する第１物質を含む生体組織切片（検体）を免疫染色して、第１物質が蛍光標識または酵素標識により可視化された免疫染色像（第１像）を得る。In the method of visualizing the first substance by the immunostaining method, for example, a biological tissue section containing the first substance specifically expressed in the target cell on which the agonist acts after a certain period of time has passed after the administration of the agonist. (Sample) is immunostained to obtain an immunostained image (first image) in which the first substance is visualized by a fluorescent label or an enzyme label.

　また、免疫染色法における蛍光標識としては、蛍光体集積粒子を使用できる。蛍光体集積粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光体（例えば蛍光色素や半導体ナノ粒子）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。蛍光体集積ナノ粒子を構成する蛍光色素の例には、ローダミン系色素、Ｃｙ系色素、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、スクアリリウム系色素、シアニン系色素、芳香環系色素、オキサジン系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素が含まれる。蛍光体集積ナノ粒子を構成する半導体ナノ粒子の素材の例には、ＩＩ－ＶＩ族半導体、ＩＩＩ－Ｖ族半導体、またはＩＶ族半導体が含まれる。蛍光体集積粒子は、公知の方法に従って作製できる。Further, as the fluorescent label in the immunostaining method, fluorescent substance-accumulated particles can be used. Fluorescent integrated particles are based on particles made of organic or inorganic substances, and have a structure in which multiple phosphors (for example, fluorescent dyes and semiconductor nanoparticles) are contained therein and / or adsorbed on the surface thereof. It is a nano-sized particle. Examples of fluorescent dyes constituting the phosphor-accumulated nanoparticles include rhodamine-based dyes, Cy-based dyes, AlexaFluor® dyes, BODIPY-based dyes, squarylium-based dyes, cyanine-based dyes, aromatic ring-based dyes, and oxazines. Includes dyes, carbopyronine dyes, and pyromesene dyes. Examples of the material of the semiconductor nanoparticles constituting the phosphor-integrated nanoparticles include a group II-VI semiconductor, a group III-V semiconductor, or a group IV semiconductor. The fluorescent substance integrated particles can be produced according to a known method.

　抗体に類似の分子認識基を用いた染色法により第１物質を可視化する方法では、例えば分子認識基として、アプタマー、ＳＮＡＰ－ｔａｇを用いて第１像を得る。In the method of visualizing the first substance by a staining method using a molecular recognition group similar to an antibody, for example, an aptamer or SNAP-tag is used as a molecular recognition group to obtain a first image.

　第２像を得る工程では、作用物質の作用により生成された第２物質を可視化して第２像を得る。通常、第１像および第２像は、検体中の同一箇所（例えば同一の組織切片）または対応箇所（例えば隣接する組織切片）について得られる。In the step of obtaining the second image, the second substance produced by the action of the working substance is visualized to obtain the second image. Usually, the first image and the second image are obtained at the same site (for example, the same tissue section) or the corresponding site (for example, adjacent tissue sections) in the sample.

　第２物質は、作用物質の作用により生成された物質である。たとえば、作用物質が標的細胞におけるＤＮＡの複製を阻害する場合、第２物質は複製が阻害されたことにより生成されるバイオマーカーでもよい。作用物質が作用する対象は、特に限定されず、例えば細胞内の細胞小器官や細胞に存在する物質（例えば酵素や受容体などのタンパク質）などである。第２物質の例には、ＤＮＡの損傷応答マーカーと、微小管重合マーカーと、微小管脱重合マーカーと、アポトーシスマーカー、サロゲートマーカー、ストレスマーカーが含まれる。ＤＮＡの損傷応答マーカーの例には、５３ＢＰ１、Ｋｕ８０、ＭＤＣ１、Ｎｂｓ１、ｐＡＴＭ、ｐＡＴＲ、ｐＣｈｋ１、ｐＤＮＡ－ＰＫ、Ｒａｄ５１、γＨ２ＡＸが含まれる。微小管重合マーカーと、脱重合マーカーとの例には、ＡＰＣ、ＣＬＡＳＰ、ＣＬＩＰ１７０、ＥＢ１、ＥＢ３、ＭＡＣＦ、ＭＣＡＫ、ＳＴＩＭ１、ＸＭＡＰ２１５、α－Ｔｕｂｕｌｉｎ、β－Ｔｕｂｕｌｉｎが含まれる。アポトーシスマーカーの例には、活性型のＣａｓｐａｓｅ－３が含まれる。The second substance is a substance produced by the action of the acting substance. For example, if the agent inhibits DNA replication in the target cell, the second substance may be a biomarker produced by the inhibition of replication. The target on which the agent acts is not particularly limited, and is, for example, an intracellular organelle or a substance present in a cell (for example, a protein such as an enzyme or a receptor). Examples of the second substance include a DNA damage response marker, a microtubule polymerization marker, a microtubule depolymerization marker, an apoptosis marker, a surrogate marker, and a stress marker. Examples of DNA damage response markers include 53BP1, Ku80, MDC1, Nbs1, pATM, pATR, pChk1, pDNA-PK, Rad51, γH2AX. Examples of microtubule polymerization markers and depolymerization markers include APC, CLASP, CLIP170, EB1, EB3, MACF, MCAK, STIM1, XMAP215, α-Tubulin, β-Tubulin. Examples of apoptosis markers include the active form of Caspase-3.

　第２物質を可視化する方法は、特に限定されない。第２物質を可視化する方法の例には、免疫染色法、抗体に類似の分子認識基を用いた染色法が含まれる。The method of visualizing the second substance is not particularly limited. Examples of methods for visualizing the second substance include an immunostaining method and a staining method using a molecular recognition group similar to an antibody.

　免疫染色法により、第２物質を可視化する方法では、例えば作用物質（例えば抗体薬物複合体）を投与してから一定時間が経過した後、作用物質の作用により生じた第２物質（例えばＤＮＡの断片）を含む生体組織切片（検体）を免疫染色して、第１物質の作用により生成された第２物質が蛍光標識または酵素標識により可視化された免疫染色像（第２像）を得る。免疫染色法における蛍光標識としては、上記の蛍光体集積粒子を使用できる。In the method of visualizing the second substance by the immunostaining method, for example, after a certain period of time has passed since the administration of the agent (for example, an antibody drug complex), the second substance (for example, DNA) produced by the action of the agent is used. The biological tissue section (specimen) containing the fragment) is immunostained to obtain an immunostaining image (second image) in which the second substance produced by the action of the first substance is visualized by a fluorescent label or an enzyme label. As the fluorescent label in the immunostaining method, the above-mentioned fluorescent substance-accumulated particles can be used.

　第１像および第２像から第１物質および第２物質に関する情報を得る工程では、第１像および第２像から第１物質および第２物質に関する情報を得る。In the step of obtaining information on the first substance and the second substance from the first image and the second image, information on the first substance and the second substance is obtained from the first image and the second image.

　図１Ａ～Ｃは、第１物質および第２物質に関する情報について説明するための模式図である。図１Ａは、薬効（抗腫瘍効果）が高い場合の例を示しており、図１Ｂ、Ｃは、薬効（抗腫瘍効果）が低い場合の例を示している。なお、図１Ａ～Ｃにおける小さい黒丸はＣＤ８を示ており、小さい白丸はグランザイムＢを示している。図１Ａ～Ｃの模式図では、医薬が到達した免疫細胞にＣＤ８が発現し、医薬が作用することによりグランザイムＢが生じ、グランザイムＢがん細胞のアポトーシスを引き起こす程度を図示している。図１Ａの例では、多くの医薬（作用物質）が標的細胞に到達するとともに、多くのグランザイムＢがアポトーシスを引き起こしているため、薬効が大きいことが示されている。図１Ｂの例では、多くの医薬（作用物質）が標的細胞に到達しているが、グランザイムＢが多くないため、アポトーシスを引き起こしている程度が低く、薬効が小さいことが示されている。図１Ｃの例では、医薬（作用物質）の到達量が少なく、グランザイムＢも少ないため、薬効が極めて小さいことが示されている。FIGS. 1A to 1C are schematic views for explaining information regarding the first substance and the second substance. FIG. 1A shows an example when the drug effect (antitumor effect) is high, and FIGS. 1B and 1C show an example when the drug effect (antitumor effect) is low. The small black circles in FIGS. 1A to 1C indicate CD8, and the small white circles indicate Granzyme B. The schematic views of FIGS. 1A to 1C show the degree to which CD8 is expressed in the immune cells reached by the drug, and the action of the drug produces Granzyme B, which causes apoptosis of Granzyme B cancer cells. In the example of FIG. 1A, it is shown that the medicinal effect is large because many drugs (acting substances) reach the target cells and many Granzyme B cause apoptosis. In the example of FIG. 1B, many drugs (acting substances) have reached the target cells, but since there are not many Granzyme B, the degree of causing apoptosis is low, and the drug efficacy is shown to be small. In the example of FIG. 1C, it is shown that the medicinal effect is extremely small because the amount of the drug (acting substance) reached is small and the amount of Granzyme B is also small.

第１物質および第２物質に関する情報の種類は、第１像および第２像から得られるものであれば、特に限定されない。図１に示されるように、第１物質および第２物質に関する情報は、第１物質の位置または量に関する情報と、第２物質の位置または量に関する情報とを含む。例えば、情報を得る工程では、作用物質が結合した標的細胞に特異的に発現した第１物質の量と、作用物質が作用したことにより生じた第２物質の量とを得ることができる。また、得られた第１物質および第２物質に関する情報に基づいて、作用物質の作用または効果に関する情報をさらに得ることもできる。例えば、作用物質の作用または効果に関する情報として、標的細胞に特異的な第１物質の位置または量と、作用物質が作用したことにより生じた第２物質の位置または量との関係に関する情報をさらに生成してもよい。具体的には、標的細胞から発現した第１物質または作用物質の量に対してどのぐらいの第２物質が生じたかに関する情報や、標的細胞から発現した第１物質または作用物質の量に対してどのぐらいの標的細胞に第２物質が生じたかに関する情報が含まれる。The type of information regarding the first substance and the second substance is not particularly limited as long as it is obtained from the first image and the second image. As shown in FIG. 1, the information regarding the first substance and the second substance includes information regarding the position or amount of the first substance and information regarding the position or amount of the second substance. For example, in the step of obtaining information, it is possible to obtain the amount of the first substance specifically expressed in the target cell to which the agent is bound and the amount of the second substance produced by the action of the agent. Further, it is possible to further obtain information on the action or effect of the agent based on the obtained information on the first substance and the second substance. For example, as information on the action or effect of the agent, further information on the relationship between the position or amount of the first substance specific to the target cell and the position or amount of the second substance generated by the action of the agent. May be generated. Specifically, with respect to information on how much the second substance was produced with respect to the amount of the first substance or the agent expressed from the target cell, or with respect to the amount of the first substance or the agent expressed from the target cell. Contains information on how many target cells produced the second substance.

　（効果）
　以上のように、本実施の形態に係る情報取得方法では、第１物質が可視化された第１像と、第２物質が可視化された第２像とから、第１物質および第２物質に関する情報を得るため、第１物質に関する情報と、第２物質に関する情報とを共に把握することができ、第１物質と、第２物質との関係を正確に特定できる。これにより、作用物質の特性を正確に評価することが可能になる。例えば、作用物質が代謝されてしまう医薬であったり、標識できない医薬であった場合であっても作用物質と作用物質の作用との関係を正確に特定することができ、作用物質の特性を正確に評価できる。(effect)
As described above, in the information acquisition method according to the present embodiment, information on the first substance and the second substance is obtained from the first image in which the first substance is visualized and the second image in which the second substance is visualized. In order to obtain the information, both the information on the first substance and the information on the second substance can be grasped, and the relationship between the first substance and the second substance can be accurately specified. This makes it possible to accurately evaluate the properties of the agent. For example, even if the drug is a drug in which the active substance is metabolized or cannot be labeled, the relationship between the active substance and the action of the active substance can be accurately identified, and the characteristics of the active substance can be accurately identified. Can be evaluated.

　［実施の形態２］
　次に本発明の実施の形態２に係る可視化方法について説明する。[Embodiment 2]
Next, the visualization method according to the second embodiment of the present invention will be described.

　本発明の実施の形態２に係る可視化方法は、検体中における作用物質が作用する対象の標的細胞に発現する第１物質を可視化する工程と、検体中における作用物質の作用により生じる第２物質を可視化する工程とを有する。第１物質を可視化する工程と、第２物質を可視化する工程とを行う順番は、特に限定されない。第１物質を可視化する工程を先に行ってもよいし、第２物質を可視化する工程を先に行ってもよいし、同時でもよい。In the visualization method according to the second embodiment of the present invention, a step of visualizing a first substance expressed on a target cell on which an agent acts in a sample and a second substance generated by the action of the agent in the sample are used. It has a step of visualization. The order in which the step of visualizing the first substance and the step of visualizing the second substance are performed is not particularly limited. The step of visualizing the first substance may be performed first, the step of visualizing the second substance may be performed first, or the process may be performed at the same time.

　第１物質を可視化する工程では、検体中における作用物質が作用する標的細胞に発現する第１物質を可視化する。第１物質を可視化する工程は、実施の形態１における「第１像を得る工程」と同じ方法で行うことができる。作用物質、標的細胞および第１物質は、実施の形態１と同様である。In the step of visualizing the first substance, the first substance expressed on the target cell on which the acting substance acts in the sample is visualized. The step of visualizing the first substance can be performed by the same method as the "step of obtaining the first image" in the first embodiment. The agent, target cell and first substance are the same as in the first embodiment.

　第２物質を可視化する工程では、検体中における作用物質の作用により生成された第２物質を可視化する。第２物質を可視化する工程は、実施の形態１における「第２像を得る工程」と同じ方法で行うことができる。第２物質は、実施の形態１と同様である。In the step of visualizing the second substance, the second substance produced by the action of the active substance in the sample is visualized. The step of visualizing the second substance can be performed by the same method as the "step of obtaining the second image" in the first embodiment. The second substance is the same as that of the first embodiment.

　（効果）
　以上のように、本実施の形態に係る可視化方法では、第１物質と、第２物質との関係を正確に特定できる。(effect)
As described above, in the visualization method according to the present embodiment, the relationship between the first substance and the second substance can be accurately specified.

　以下、実施例により本発明をさらに詳細に述べるが、本発明はこれらの実施例に限定されない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

　本実施例では、ＣＤ８Ｔ細胞に発現するタンパク質と相互作用する医薬（例えば、オプジーボ）が投与され、抗ＰＤ－１治療を実施した肺がん患者と、医薬が投与されておらず、抗ＰＤ－１治療を実施していない肺がん患者の組織スライドを入手して行った。In this example, a lung cancer patient who received a drug (for example, Opdivo) that interacts with a protein expressed in CD8T cells and received anti-PD-1 treatment, and a lung cancer patient who did not receive the drug and received anti-PD-1 treatment. We obtained tissue slides of lung cancer patients who did not perform the procedure.

　（１）細胞マーカーの染色準備
　（テキサスレッド色素集積メラミン樹脂粒子の作製）
　テキサスレッド色素分子（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１；シグマアルドリッチ社）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持ながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂（ニカラックＭＸ－０３５；日本カーバイド工業株式会社）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄した。得られた樹脂粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、上述のように平均粒子径を測定したところ、平均粒子径１５２ｎｍであった。このようにして作製されたテキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子を次の手順で表面修飾した。(1) Preparation for staining of cell markers (preparation of Texas red pigment-accumulated melamine resin particles)
After dissolving 2.5 mg of Texas red dye molecule (Sulphorhodamine 101; Sigma-Aldrich) in 22.5 mL of pure water, the solution was stirred with a hot stirrer for 20 minutes while maintaining the temperature of the solution at 70 ° C. To the stirred solution, 1.5 g of melamine resin (Nicarac MX-035; Nippon Carbide Industries, Ltd.) was added, and the mixture was further heated and stirred under the same conditions for 5 minutes. After adding 100 μL of formic acid to the stirred solution and stirring for 20 minutes while maintaining the temperature of the solution at 60 ° C., the solution was left to cool to room temperature. The cooled solution was dispensed into a plurality of centrifuge tubes and centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes to precipitate the Texas red dye-encapsulating melamine resin particles contained as a mixture in the solution. The supernatant was removed and the precipitated particles were washed with ethanol and water. SEM observation was performed on 1000 of the obtained resin particles, and the average particle size was measured as described above. As a result, the average particle size was 152 nm. The Texas red dye-encapsulating melamine resin particles thus produced were surface-modified by the following procedure.

　＜ストレプトアビジン結合テキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子の作製＞
　得られた粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ－３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行った。<Preparation of streptavidin-bound Texas red dye-encapsulating melamine resin particles>
0.1 mg of the obtained particles were dispersed in 1.5 mL of EtOH, 2 μL of amine propyltrimethoxysilane LS-3150 (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) was added, and the mixture was reacted for 8 hours to perform surface amination treatment.

　次いで、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて上記表面アミノ化処理を行った粒子を３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）１２（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことで末端にマレイミド基が付いたテキサスレッド集積メラミン粒子を得た。Next, the particles subjected to the surface amination treatment were adjusted to 3 nM using PBS (phosphate buffered saline) containing 2 mM of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) so that the final concentration of the solution was 10 mM. SM (PEG) 12 (succinimidyl- [(N-maleimideropionamide) -dodecaethylneglycol] ester, manufactured by Thermoscientific Co., Ltd.) was mixed and reacted for 1 hour. This mixed solution was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes to remove the supernatant, then PBS containing 2 mM of EDTA was added to disperse the precipitate, and the mixture was centrifuged again. By washing by the same procedure three times, Texas red accumulated melamine particles having a maleimide group at the end were obtained.

　一方、ストレプトアビジン（和光純薬工業株式会社）をＮ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、テキサスレッド集積メラミン粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。On the other hand, streptavidin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be bound to Texas red accumulated melamine particles by performing thiol group addition treatment using N-succinimidyl S-aceticylthioacetylate (SATA) and then filtering with a gel filtration column. A streptavidin solution was obtained.

　上記のテキサスレッド集積メラミン粒子とストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジンなどを除去し、得られたストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン粒子を、赤色ＰＩＤ染色剤とした。The above Texas red accumulated melamine particles and streptavidin were mixed in PBS containing 2 mM of EDTA and reacted at room temperature for 1 hour. 10 mM mercaptoethanol was added to terminate the reaction. After concentrating the obtained solution with a centrifugal filter, unreacted streptavidin and the like were removed using a gel filtration column for purification, and the obtained streptavidin-bound Texas red accumulated melamine particles were used as a red PID stain.

　赤色ＰＩＤ染色剤にストレプトアビジン（３２２４３－２４；ナカライテスク株式会社）を結合させ、ストレプトアビジン結合赤ＰＩＤを作製した。また、二次抗体として抗マウスＩｇＧ１抗体　ＳＢ７７ｅ（ａｂ９９６０１；アブカム株式会社）にＥＺ－Ｌｉｎｋ　マレイミド－ＰＥＧ１１－ビオチン（２１９１１；サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を結合させて、ビオチン結合抗マウスＩｇＧ１抗体を作製した。なお、赤色ＰＩＤ染色剤では、ＣＤ８が染色される。Streptavidin (32243-24; Nacalai Tesque, Inc.) was bound to a red PID stain to prepare a streptavidin-bound red PID. In addition, as a secondary antibody, EZ-Link maleimide-PEG11-biotin (21911; Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was bound to the anti-mouse IgG1 antibody SB77e (ab99601; Abcam Co., Ltd.) to obtain a biotin-bound anti-mouse IgG1 antibody. Made. The red PID stain stains CD8.

　（２）薬効マーカーの染色準備
　上記（ストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製）の手順に準じ、テキサスレッド色素分子（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ　１０１；シグマアルドリッチ社）に代えてＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）を用い、平均粒子径１５９ｎｍのＦＩＴＣ色素集積メラミン樹脂粒子を作製した。得られた粒子の表面修飾は、上記の手順に従い、ストレプトアビジンに代えて抗ブレンツキシマブ抗体（精製したブレンツキシマブをウサギ脾臓に添加して抗体を作製した）を用いることで、抗体結合ＦＩＴＣ色素内包メラミン樹脂粒子を作製し、緑色ＰＩＤ染色剤として使用した。(2) Preparation for staining of medicinal effect marker According to the procedure of the above (preparation of streptavidin-bound Texas red integrated melamine resin particles), Fluorescein isothiocyanate (FITC) was used instead of the Texas red dye molecule (Sulfurhodamine 101; Sigma-Aldrich). FITC dye-accumulated melamine resin particles having an average particle diameter of 159 nm were prepared. For surface modification of the obtained particles, an antibody-bound FITC was prepared by using an anti-brentuximab antibody (purified brentuximab was added to rabbit spleen to prepare an antibody) instead of streptavidin according to the above procedure. Dye-encapsulating melamine resin particles were prepared and used as a green PID stain.

　緑色ＰＩＤ染色剤に抗ＦＩＴＣ抗体（Ａ１５０－１１２Ａ；Ｂｅｔｈｙｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．）を結合させて、抗ＦＩＴＣ抗体結合緑ＰＩＤを作製した。また、二次抗体として抗マウスＩｇＧ２ａ抗体　ＬＯ－ＭＧ２ａ－７（ＭＣＡ４２１；バイオ・ラッド　ラボラトリーズ株式会社）にフルオレセイン－５－マレイミド（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドを最大２％含む）（Ｆ０８１０；東京化成工業株式会社）を結合させて、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ２ａ抗体を作製した。なお、緑色ＰＩＤ染色剤では、グランザイムＢが染色される。An anti-FITC antibody (A150-112A; Fluor Laboratories, Inc.) was bound to a green PID stain to prepare an anti-FITC antibody-bound green PID. In addition, as a secondary antibody, anti-mouse IgG2a antibody LO-MG2a-7 (MCA421; Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) and fluorescein-5-maleimide (containing up to 2% of N, N-dimethylformamide) (F0810; Tokyo Chemical Industry) Co., Ltd.) was combined to prepare a FITC-bound anti-mouse IgG2a antibody. Granzyme B is stained with the green PID stain.

　（３）混合液の調製
　上記のストレプトアビジン結合赤ＰＩＤと、抗ＦＩＴＣ抗体結合緑ＰＩＤを混合して、ＰＩＤ混合溶液を調製した。上記のビオチン結合抗マウスＩｇＧ１抗体と、上記のＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ２ａ抗体を混合して、二次抗体混合溶液を調製した。また、抗ＣＤ８抗体　Ｃ８／１４４Ｂ（マウスＩｇＧ１、Ｍ７１０３；アジレント・テクノロジー株式会社）と抗グランザイムＢ抗体　ＧｒＢ－７（マウスＩｇＧ２ａ、Ｍ７２３５，アジレント・テクノロジー株式会社）を混合し、一次抗体混合溶液を調製した。(3) Preparation of mixed solution The above-mentioned streptavidin-bound red PID and anti-FITC antibody-bound green PID were mixed to prepare a PID mixed solution. The above-mentioned biotin-binding anti-mouse IgG1 antibody and the above-mentioned FITC-binding anti-mouse IgG2a antibody were mixed to prepare a secondary antibody mixed solution. In addition, anti-CD8 antibody C8 / 144B (mouse IgG1, M7103; Agilent Technologies, Inc.) and anti-Granzyme B antibody GrB-7 (mouse IgG2a, M7235, Agilent Technologies, Inc.) are mixed to prepare a primary antibody mixed solution. did.

　（４）蛍光色素集積粒子を用いた染色
　組織スライドに脱パラフィン処理、賦活化処理、ブロッキング処理を行い、一次抗体混合溶液を添加し室温で一晩反応させた。次いで、組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、二次抗体混合溶液を添加し室温で３０分反応させた。次いで、組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、ＰＩＤ混合溶液を添加し室温で時間反応させた。次いで、組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、封入処理を行った。蛍光顕微鏡を用いて、赤色の蛍光を放出する蛍光色素集積粒子および緑色の蛍光を放出する蛍光色素集積粒子の輝点数をそれぞれ計測した。(4) Staining using fluorescent dye-accumulated particles Deparaffin treatment, activation treatment, and blocking treatment were performed on the tissue slides, a primary antibody mixed solution was added, and the tissue slides were reacted overnight at room temperature. Then, after washing the tissue slide with PBS, a secondary antibody mixed solution was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The tissue slides were then washed with PBS, then a PID mixed solution was added and allowed to react for hours at room temperature. The tissue slides were then washed with PBS and then encapsulated. Using a fluorescence microscope, the number of bright spots of the fluorescent dye-accumulated particles emitting red fluorescence and the fluorescent dye-accumulated particles emitting green fluorescence were measured, respectively.

　（５）ＤＡＢ染色
　組織スライドに脱パラフィン処理、賦活化処理、ブロッキング処理を行い、一次抗体混合溶液（抗ＣＤ８抗体　Ｃ８／１４４Ｂ（マウスＩｇＧ１、Ｍ７１０３；アジレント・テクノロジー株式会社））を添加し室温で一時間反応させた。次いで、組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、フィストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（ＭＵＬＴＩ）（０４９－２２８３１；株式会社ニチレイバイオサイエンス）を添加し室温で３０分反応させた。次いで、組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、３０％過酸化水素を加えたＤＡＢを添加し、室温で３分間反応させた後、純水に５分間浸漬させた。最後に、光学顕微鏡でＤＡＢ染色された領域の発光強度を測定した。ＤＡＢ染色では、グランザイムＢが染色される。(5) DAB-stained tissue slides are deparaffinized, activated, and blocked, and a primary antibody mixed solution (anti-CD8 antibody C8 / 144B (mouse IgG1, M7103; Agilent Technologies, Inc.)) is added at room temperature. Reacted for 1 hour. Then, after washing the tissue slide with PBS, Fistfine Simple Stain MAX-PO (MULTI) (049-22831; Nichirei Bioscience Co., Ltd.) was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The tissue slides were then washed with PBS, DAB with 30% hydrogen peroxide was added, reacted at room temperature for 3 minutes and then immersed in pure water for 5 minutes. Finally, the emission intensity of the DAB-stained area was measured with an optical microscope. In DAB staining, Granzyme B is stained.

　（６）ＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ染色
　ＤＡＢ染色後の組織スライドを再度賦活化処理、ブロッキング処理を行い、一次抗体混合溶液（ＢＳＡを１％含有するＰＢＳを用いて抗グランザイムＢ抗体　ＧｒＢ－７（マウスＩｇＧ２ａ、Ｍ７２３５，アジレント・テクノロジー株式会社）を５０倍希釈した溶液）を添加し４℃で一晩反応させた。次いで、組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、フィストファインシンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（ＭＵＬＴＩ）（０４９－２２８３１；株式会社ニチレイバイオサイエンス）を添加し室温で３０分反応させた。次いで、組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、ＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ（Ｅ１０９；ＡｂＣｙｓ社）を添加し、室温で３分間反応させた後、純水に５分間浸漬させた。最後に、光学顕微鏡でＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ染色された領域の発光強度を測定した。ＨｉｓｔｏＧｒｅｅｎ染色では、ＣＤ８が染色される。(6) Agilent-stained tissue slides after DAB staining were reactivated and blocked, and anti-granzyme B antibody GrB-7 (mouse IgG2a, M7235, using PBS containing 1% BSA) was subjected to primary antibody mixed solution. A 50-fold diluted solution of Agilent Technologies, Inc.) was added and reacted at 4 ° C. overnight. Then, after washing the tissue slide with PBS, Fistfine Simple Stain MAX-PO (MULTI) (049-22831; Nichirei Bioscience Co., Ltd.) was added and reacted at room temperature for 30 minutes. The tissue slides were then washed with PBS, HistoGreen (E109; AbCys) was added, reacted at room temperature for 3 minutes and then immersed in pure water for 5 minutes. Finally, the emission intensity of the HistoGreen-stained area was measured with an optical microscope. With HistoGreen staining, CD8 is stained.

　各測定結果を表１に示す。以下に示す「Ａ」および「Ｂ」は、抗ＰＤ－１治療を実施した肺がん患者から採取した組織スライドについての結果であり、「Ｃ」は、抗ＰＤ－１治療を実施していない肺がん患者から採取した組織スライドについての結果である。Table 1 shows the results of each measurement. "A" and "B" shown below are the results of tissue slides collected from lung cancer patients who received anti-PD-1 treatment, and "C" are lung cancer patients who did not receive anti-PD-1 treatment. Results for tissue slides taken from.

　表１に示されるように、Ａ、ＢおよびＣの実施例では、抗ＰＤ－１治療の効果の有無をＣＤ８の輝点数とグランザイムＢの輝点数との比として評価できる。実施例Ａでは、ＣＤ８の輝点数とグランザイムＢの輝点数との比が１に近く、発現されたＣＤ８の数に対して同等の数のグランザイムＢが生成されていることが分かるため、医薬の効果が極めて高いと評価できる。As shown in Table 1, in the examples of A, B and C, the presence or absence of the effect of anti-PD-1 treatment can be evaluated as the ratio of the number of bright spots of CD8 to the number of bright spots of Granzyme B. In Example A, the ratio of the number of bright spots of CD8 to the number of bright spots of Granzyme B is close to 1, and it can be seen that an equivalent number of Granzyme B is produced with respect to the number of expressed CD8. It can be evaluated that the effect is extremely high.

　実施例Ｂでは、ＣＤ８の輝点数とグランザイムＢの輝点数との比が大きく、発現されたＣＤ８の数に対して生成されたグランザイムＢの数が少ないことが分かるため、医薬の効果は実施例Ａより低いと評価できる。In Example B, it can be seen that the ratio of the number of bright spots of CD8 to the number of bright spots of Granzyme B is large, and the number of Granzyme B produced is small with respect to the number of expressed CD8. It can be evaluated as lower than A.

　実施例Ｃでは、ＣＤ８の輝点数とグランザイムＢの輝点数との比が更に大きく、発現されたＣＤ８の数に対して、生成されたグランザイムＢの数がその１０分の１未満であることが分かるため、医薬の効果がないか、または極めて低いと評価できる。In Example C, the ratio of the number of bright spots of CD8 to the number of bright spots of Granzyme B is even larger, and the number of Granzyme B produced is less than one tenth of the number of expressed CD8. As it is known, it can be evaluated that the drug has no effect or is extremely low.

　一方、比較例Ａ、Ｂ、Ｃでは、医薬の投与の有無、また薬効の優劣に関わらず、同程度の値を示している。このことから、ＤＡＢ染色やｈｉｓｔｏｇｒｅｅｎ染色による染色画像では、色分離などが困難なため、医薬の効果を正確に評価できないことが分かる。On the other hand, in Comparative Examples A, B, and C, the same value is shown regardless of the presence or absence of administration of the drug and the superiority or inferiority of the drug efficacy. From this, it can be seen that the effect of the drug cannot be accurately evaluated because color separation and the like are difficult in the stained image by DAB staining or histogreen staining.

　表２は、グランザイムＢの輝点数を、発現されたＣＤ８の数ではなく、ＣＤ８を発現した細胞の数で割った結果を示している。ＣＤ８はあくまでもタンパク質であり、細胞自体の活性を直接できに評価できるものではないため、発現されたタンパク質の数ではなく、タンパク質を発現した細胞の数で評価した方が、医薬の効果をより正確に評価できる。Table 2 shows the result of dividing the number of bright spots of Granzyme B by the number of cells expressing CD8, not by the number of expressed CD8. Since CD8 is a protein and cannot directly evaluate the activity of the cells themselves, it is more accurate to evaluate the effect of the drug by the number of cells expressing the protein rather than the number of expressed proteins. Can be evaluated.

　表１および表２に示されるように、Ａ、ＢおよびＣの実施例から、抗ＰＤ－１治療の有無に関わらず、細胞外におけるグランザイムＢの輝点数をグランザイムＢの放出量とし、細胞内におけるグランザイムＢの輝点数をグランザイムＢの生産量（発現量）として評価できる。表１のＡ、ＢおよびＣの実施例から、いずれも同様の数のＴ細胞が生成されているが、表１のＡ、Ｂと、Ｃと、を比較すると、グランザイムＢの発現量が違うことから、Ｃではアポトーシスが起きていない（薬効が小さい）ことが分かる。As shown in Tables 1 and 2, from the examples of A, B and C, the number of bright spots of Granzyme B extracellularly is defined as the amount of Granzyme B released, regardless of the presence or absence of anti-PD-1 treatment, and is intracellular. The number of bright spots of Granzyme B in the above can be evaluated as the production amount (expression level) of Granzyme B. From the examples of A, B and C in Table 1, the same number of T cells were generated, but when A, B and C in Table 1 were compared, the expression level of Granzyme B was different. From this, it can be seen that apoptosis does not occur in C (the drug efficacy is small).

　本出願は、２０２０年９月１６日出願の特願２０２０－１５５８０３に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-155803 filed on September 16, 2020. All the contents described in the application specification and drawings are incorporated herein by reference.

　本発明によれば、例えば、作用物質のスクリーニング、作用物質の薬効評価に有用である。According to the present invention, it is useful for, for example, screening of an active substance and evaluation of the medicinal effect of the active substance.

Claims (8)

Translated fromJapanese

　検体中における作用物質が作用する対象の標的細胞に発現する第１物質を可視化する工程と、
　検体中における前記作用物質の作用により生じる第２物質を可視化する工程と、
　を有する、可視化方法。The step of visualizing the first substance expressed in the target cell of the target on which the active substance acts in the sample, and
The step of visualizing the second substance generated by the action of the agent in the sample, and
A visualization method that has.　前記第１物質を可視化する工程および前記第２物質を可視化する工程では、蛍光体集積粒子を用いて前記第１物質または前記第２物質を可視化する、請求項１に記載の可視化方法。The visualization method according to claim 1, wherein in the step of visualizing the first substance and the step of visualizing the second substance, the first substance or the second substance is visualized by using phosphor-accumulated particles.　前記標的細胞は、Ｔ細胞である、請求項１または請求項２に記載に記載の可視化方法。The visualization method according to claim 1 or 2, wherein the target cell is a T cell.　前記作用物質は、医薬である、請求項１～３のいずれか一項に記載の可視化方法。The visualization method according to any one of claims 1 to 3, wherein the active substance is a pharmaceutical product.　検体中における作用物質が作用する対象の標的細胞に発現する第１物質が可視化された第１像を得る工程と、
　検体中における前記作用物質の作用により生じた第２物質が可視化された第２像を得る工程と、
　前記第１像および前記第２像から前記第１物質および前記第２物質に関する情報を得る工程と、
　を有する、情報取得方法。The step of obtaining a first image in which the first substance expressed on the target cell on which the acting substance acts in the sample is visualized, and
A step of obtaining a second image in which the second substance generated by the action of the acting substance in the sample is visualized, and
A step of obtaining information on the first substance and the second substance from the first image and the second image, and
Information acquisition method.　前記第１像を得る工程および前記第２像を得る工程では、蛍光体集積粒子を用いて前記第１物質または前記第２物質を可視化する、請求項５に記載の情報取得方法。The information acquisition method according to claim 5, wherein in the step of obtaining the first image and the step of obtaining the second image, the first substance or the second substance is visualized by using phosphor-accumulated particles.　前記標的細胞は、Ｔ細胞である、請求項５または請求項６に記載に記載の情報取得方法。The information acquisition method according to claim 5, wherein the target cell is a T cell.　前記作用物質は、医薬である、請求項５～７のいずれか一項に記載の情報取得方法。
 The information acquisition method according to any one of claims 5 to 7, wherein the active substance is a pharmaceutical product.

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