MÉTODO PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA DE METHOD FOR THE CONSTRUCTION OF A LIBRARY OF
PLÁSMIDOS, QUE PERMITE LA SÍNTESIS DE OLIGOPÉPTIDOS A PLASMIDS, WHICH ALLOWS THE SYNTHESIS OF OLIGOPEPTIDES TO
PARTIR DE SECUENCIAS ALEATORIAS EN Saccharomyces cerevisiae START FROM RANDOM SEQUENCES IN Saccharomyces cerevisiae
I. CAMPO TÉCNICOI. TECHNICAL FIELD
La presente invención está comprendida en el campo técnico de la ingeniería genética y biotecnología. En el campo de las técnicas de mutación o de ingeniería genética, ADN relacionado con la ingeniería genética y vectores, como plásmidos, su aislamiento, preparación o purificación y la utilización de hospederos para ello. En la tecnología de ADN recombinante, para la introducción de material genético extraño, mediante la utilización de vectores y la utilización de hospederos eucariotes para esos fines.The present invention falls within the technical field of genetic engineering and biotechnology. In the field of mutation or genetic engineering techniques, DNA related to genetic engineering and vectors, such as plasmids, their isolation, preparation or purification and the use of hosts for this. In recombinant DNA technology, for the introduction of foreign genetic material, through the use of vectors and the use of eukaryotic hosts for these purposes.
II. OBJETO DE LA INVENCIÓNII. OBJECT OF THE INVENTION
El objetivo de la presente invención es proponer un método alternativo para la obtención de bibliotecas genéticas que permiten la síntesis de oligopéptidos de secuencias aleatorias, sóbre la base de la levadura S. cerevisiae como hospedero eucariótico.The objective of the present invention is to propose an alternative method for obtaining genetic libraries that allow the synthesis of oligopeptides of random sequences, on the base of the yeast S. cerevisiae as a eukaryotic host.
III. ESTADO DE LA TÉCNICA O ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNIII. STATE OF THE ART OR BACKGROUND OF THE INVENTION
Existen numerosos métodos en el estado de la técnica referidos a la producción de bibliotecas genéticas, en particular los que utilizan a S. cerevisiae como un hospedero para la expresión de una secuencia genética. Son métodos donde dichas secuencias han sido purificadas, secuenciadas previamente y clonadas en un vector apropiado. Se realiza el proceso de transformación de Escheríchia colr, luego se aísla el ADN, se purifica y la secuencia conocida es utilizada para ser incorporada en S. cerevisiae. El método descrito en el presente documento resulta mucho más sencillo, con menos etapas e igual proporciona una biblioteca estable.There are numerous methods in the state of the art related to the production of genetic libraries, in particular those that use S. cerevisiae as a host for the expression of a genetic sequence. They are methods where said sequences have been purified, previously sequenced and cloned in an appropriate vector. The Escheríchia colr transformation process is carried out, then the DNA is isolated, purified and the known sequence is used to be incorporated into S. cerevisiae. The method described in this document is much simpler, with fewer steps and still provides a stable library.
Swers et al (2014)1 proponen la generación de una biblioteca de plásmidos utilizando la levadura como célula hospedera. Se aprovecha la recombinación homologa, pero se parte de un fragmento de secuencia conocido, en particular una que codifica para un anticuerpo, y con la peculiaridad de que se expresa en superficie. Además de iniciarseSwers et al (2014)1 propose the generation of a plasmid library using yeast as a host cell. Homologous recombination is used, but the starting point is a known sequence fragment, in particular one that codes for an antibody, and with the peculiarity that it is expressed on the surface. In addition to starting
1 Swers J.; Kellogg B. and Wlttrup K.D.1 Shuffled antlbody librarles created by in vivo homologous recomblnatlon and yeast surface dlsplay. 2004. Nucleic Acids Research, 32 (3): e36, https://doi.ora/10.1093/nar/gnh030 con un fragmento de secuencia conocida, se trata de generar mayor variabilidad mediante la recombinación homologa.1 Swers J .; Kellogg B. and Wlttrup KD1 Shuffled antlbody free created by in vivo homologous recomblnatlon and yeast surface dlsplay. 2004. Nucleic Acids Research, 32 (3): e36, https: //doi.ora/10.1093/nar/gnh030 with a fragment of known sequence, the aim is to generate greater variability through homologous recombination.
IV. ANÁLISIS PROBLEMA - SOLUCIÓN (INVENCIÓN)IV. PROBLEM ANALYSIS - SOLUTION (INVENTION)
La invención propone un método para la obtención de una biblioteca genética que permiten la síntesis de oligopéptidos de secuencias aleatorias, en S. cerevisiae, sin que sea requerida una etapa previa de clonación en E. coli, y sin que implique el aislamiento, purificación e identificación del segmento de ADN que es incorporado a vectores para la transformación de la levadura. El método propuesto, permite el clonaje mediante la transformación directa de S. cerevisiae, con segmentos aleatorios y la obtención eficiente de una biblioteca genética.The invention proposes a method for obtaining a genetic library that allows the synthesis of oligopeptides of random sequences, in S. cerevisiae, without requiring a previous stage of cloning in E. coli, and without involving isolation, purification and identification of the DNA segment that is incorporated into vectors for yeast transformation. The proposed method allows cloning by direct transformation of S. cerevisiae, with random segments and the efficient obtaining of a genetic library.
V. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓNV. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
El método para la producción de una biblioteca genética o una genoteca de plásmidos aprovechando el mecanismo de recombinación homologa de S. cerevisiae, comprende (Figura 1 ):The method for the production of a gene library or a plasmid library taking advantage of the homologous recombination mechanism of S. cerevisiae, comprises (Figure 1):
(1 ) Producir los insertos artificiales, los cuales se fabricarán a pedido, de manera tal que incluyan secuencias aleatorias y por tanto, con una gran variabilidad. Para la construcción de dichas secuencias se incluyen aleatoriamente a los nucleótidos en la formación de una secuencia que son a su vez, amplificados por PCR. A estas secuencias en adelante se le denominará "insertos". Generalmente estas secuencias producen oligopéptidos de hasta 20 aminoácidos o péptidos de 20 - 50 aminoácidos. (1) Produce artificial inserts, which will be made to order, in such a way that they include random sequences and therefore, with great variability. For the construction of said sequences, nucleotides are randomly included in the formation of a sequence which are in turn amplified by PCR. These sequences will be referred to hereinafter as "inserts". Generally these sequences produce oligopeptides of up to 20 amino acids or peptides of 20-50 amino acids.
(2) Se procede luego con la transformación de S. cerevisiae, para introducir los insertos y el plásmido en el que serán clonados; de manera tal, que cada célula transformada (también aquí llamada transformante) comprenderá un plásmido con un inserto en particular; eso es consecuencia, de que el plásmido es recirculado mediante el mecanismo de recombinación homologa de la levadura, que incorpora un inserto al unirlo a los extremos del plásmido linearizado, y de esta manera el plásmido queda reparado, recirculado, y dentro de la célula. Los plásmidos se eligen en función del oligopéptido o péptido que se espera producir y las condiciones de producción y regulación. Es necesario que el plásmido cuente con un gen de selección y, opcionalmente, según convenga una etiqueta, que por ejemplo facilite el proceso de purificación y aislamiento. Para la transformación, se dispone a la levadura en un medio apropiado; estas células deben estar competentes, con los Insertos y el plásmldo en condiciones apropiadas (debe tener la propiedad de ser mantenido estable en la levadura y estar llnearlzado al momento de la transformación). La cantidad total de ADN proveniente del plásmldo y de los Insertos en el medio de transformación puede ser de hasta 200 ng por tubo, pero eso está sujeto a cada caso en particular y los péptldos u oligopéptidos objetivos. Una vez que el plásmldo llnearlzado y el Inserto se han Incorporado a la célula hospedera, la recomblnaclón homologa, solo permite la Inserción del Inserto, tal cual fue suministrado para el procedimiento, pero dicha recomblnaclón no genera más variabilidad, solo se limita a unir un plásmldo con un Inserto en los extremos homólogos.(2) Then proceed with the transformation of S. cerevisiae, to introduce the inserts and the plasmid into which they will be cloned; such that each transformed cell (also here called transformant) will comprise a plasmid with a particular insert; This is a consequence of the plasmid being recirculated through the yeast homologous recombination mechanism, which incorporates an insert by joining it to the ends of the linearized plasmid, and in this way the plasmid is repaired, recirculated, and inside the cell. Plasmids are chosen based on the oligopeptide or peptide expected to be produced and the conditions of production and regulation. It is necessary for the plasmid to have a selection gene and, optionally, as appropriate, a label, which for example facilitates the purification and isolation process. For transformation, the yeast is placed in an appropriate medium; These cells must be competent, with the Inserts and the plasmid in appropriate conditions (it must have the property of being stable in yeast and being filled at the time of transformation). The total amount of DNA from the plasmid and the Inserts in the transformation medium can be up to 200 ng per tube, but this is subject to each individual case and the target peptides or oligopeptides. Once the filled plasmid and the Insert have been incorporated into the host cell, homologous recombination only allows Insertion of the Insert, as supplied for the procedure, but said recombination does not generate more variability, it is only limited to joining a plasmid with an Insert at the homologous ends.
Cada transformante de S. cerevisiae obtenido contiene el plásmldo con un Inserto de secuencia particular y única. La selección de transformantes que Incluyen los plásmldos reclrcularlzados, se efectúa mediante el cultivo de las células en un medio de cultivo selectivo, que permita la proliferación solo de células transformadas, aquí se aprovecha las cualidades del gen de selección. Hasta aquí ya se cuenta con la biblioteca genética. Obtenida la biblioteca, pueden entonces analizarse miles de estos transformantes para la búsqueda de aquellos que tienen un plásmldo con la característica deseada (que confiera por ejemplo resistencia a algún agente químico o físico, efecto en la rapidez de crecimiento, característica metabóllca, etc.; mediante lo comúnmente llamado "tamlzaje"). Luego de la selección de los transformantes con las características deseadas, se procede con la purificación del ADN total de cada uno, con la finalidad de realizar una recuperación y análisis de los plásmldos.Each S. cerevisiae transformant obtained contains the plasmid with a particular and unique sequence Insert. The selection of transformants that include the recirculated plasmids is carried out by cultivating the cells in a selective culture medium, which allows the proliferation of only transformed cells, here the qualities of the selection gene are exploited. So far, the genetic library is already available. Once the library has been obtained, thousands of these transformants can then be analyzed to search for those that have a plasmid with the desired characteristic (that confers, for example, resistance to some chemical or physical agent, effect on growth speed, metabolic characteristic, etc .; through what is commonly called "tamlzaje"). After selecting the transformants with the desired characteristics, we proceed with the purification of the total DNA of each one, in order to carry out a recovery and analysis of the plasmids.
Ese ADN recuperado se utiliza para transformar E. coli, con la finalidad de recuperar y amplificar los plásmldos y analizarlos para verificar la presencia de dichos Insertos usando por ejemplo enzimas de restricción. Y por último se realiza un análisis por secuenclaclón de nucleótldos de los plásmldos purificados, para determinar la Identidad del Inserto clonado y a partir de este, Inferir la secuencia de aminoácidos del péptido u oligopéptido producido. Este análisis puede también realizarse en base a plásmldos amplificados o purificados de colonias de transformantes de S. cerevisiae aleatoriamente seleccionados, para poder confirmar la diversidad de las secuencias de los Insertos y validar la correcta construcción de la biblioteca genética. VI. RESEÑAS DE LAS FIGURASThis recovered DNA is used to transform E. coli, in order to recover and amplify the plasmids and analyze them to verify the presence of said Inserts using, for example, restriction enzymes. And finally, a nucleotide sequencing analysis of the purified plasmils is performed to determine the Identity of the cloned Insert and from this, Infer the amino acid sequence of the peptide or oligopeptide produced. This analysis can also be carried out on the basis of amplified or purified plasmids from colonies of randomly selected S. cerevisiae transformants, in order to confirm the diversity of the Inserts sequences and validate the correct construction of the genetic library. SAW. FIGURE REVIEWS
Fig. 1 . Diagrama de flujo del proceso para la construcción de una biblioteca de secuencias aleatorias. Por un lado, para la generación de los insertos a clonar, se requiere primero del diseño de los oligonucleótidos (que incluyen las secuencias aleatorias y extremos homólogos al punto de inserción en el plásmido). Los oligonucleótidos sintetizados son luego usados para generar los insertos mediante amplificación por PCR. En forma paralela, se lineariza el plásmido seleccionado usando la enzima de restricción apropiada. Los insertos (productos de PCR) y el plásmido linearizado son usados para transformar a las células de levadura en las que se realiza el clonaje mediante recombinación homologa. Cada transformante seleccionado contiene un plásmido regenerado que incluye un tipo particular de inserto y la colección de transformantes, por tanto incluye la biblioteca de plásmidos. En el tamizado, los transformantes obtenidos son analizados para identificar aquellos con las características deseadas al producir un oligopéptido con la secuencia apropiada. Fig. 1. Flow diagram of the process for the construction of a library of random sequences. On the one hand, for the generation of the inserts to be cloned, the design of the oligonucleotides (which include the random sequences and ends homologous to the insertion point in the plasmid) is first required. The synthesized oligonucleotides are then used to generate the inserts by PCR amplification. In parallel, the selected plasmid is linearized using the appropriate restriction enzyme. The inserts (PCR products) and the linearized plasmid are used to transform the yeast cells into which cloning is performed by homologous recombination. Each selected transformant contains a regenerated plasmid that includes a particular type of insert and the library of transformants, thus including the library of plasmids. On screening, the transformants obtained are analyzed to identify those with the desired characteristics by producing an oligopeptide with the appropriate sequence.
Fig. 2. Representación esquemática de los principales componentes del plásmido de expresión pEGH. GST: Gen codificante para la glutatión S- transferasa que se sintetiza como una etiqueta fusionada a la proteína o péptido permitiendo su purificación mediante el uso de resinas conjugadas con glutatión; P GAL: Promotor que regula la expresión de genes responsables del metabolismo de galactosa; URA3: Gen que codifica para la orotidina-5-fosfato descarboxilasa y funciona como un marcador de selección de transformantes de S. cerevisiae en medios sintéticos que carecen de uracilo; AmpR: Gen que confiere resistencia al antibiótico ampicilina; Poli His -Tag: secuencia que codifica para una etiqueta de polihistidina para la purificación de proteínas usando resinas que contienen níquel.Fig. 2. Schematic representation of the main components of the expression plasmid pEGH. GST: Coding gene for glutathione S-transferase that is synthesized as a tag fused to the protein or peptide allowing its purification through the use of glutathione-conjugated resins; P GAL: Promoter that regulates the expression of genes responsible for galactose metabolism; URA3: Gene that codes for orotidine-5-phosphate decarboxylase and functions as a selection marker for transformants of S. cerevisiae in synthetic media lacking uracil; AmpR : Gene that confers resistance to the antibiotic ampicillin; Poly His -Tag: sequence encoding a polyhistidine tag for protein purification using nickel-containing resins.
Fig. 3. Representación del procedimiento seguido para la construcción de la biblioteca de plásmidos pEGH. El producto de PCR obtenido incluye una gran diversidad de secuencias, ya que uno de los oligonucleótidos o iniciadores usados fue sintetizado de manera tal que incluye secuencias NNN que conducen a la inserción de 18 codones aleatorios. Durante la amplificación por PCR se incluye en el fragmento a clonar, los extremos con secuencias homologas al sitio de clonaje en el plásmido (zonas oscuras). Las células de levadura son transformadas con el plásmido pEGH linearizado y el producto de PCR, para permitir la recombinación homologa y por tanto, la regeneración del plásmido circular estable. Este a su vez, confiere a las células la capacidad de crecer en medio sintético que carece de uracilo, en el que solo darán lugar a la formación de colonias aquellas células que han logrado regenerar y mantener el plásmido.Fig. 3. Representation of the procedure followed for the construction of the pEGH plasmid library. The PCR product obtained includes a great diversity of sequences, since one of the oligonucleotides or primers used was synthesized in such a way that it includes NNN sequences that lead to the insertion of 18 random codons. During PCR amplification, the ends with sequences homologous to the cloning site in the plasmid (dark areas) are included in the fragment to be cloned. Yeast cells are transformed with the linearized pEGH plasmid and the product of PCR, to allow homologous recombination and therefore regeneration of the stable circular plasmid. This, in turn, gives cells the ability to grow in synthetic medium lacking uracil, in which only those cells that have managed to regenerate and maintain the plasmid will give rise to the formation of colonies.
Fig. 4. Obtención de los insertos a clonar para la construcción de la biblioteca de plásmidos pEGH. Los insertos son obtenidos mediante PCR. En el ciclo 1 , se usan solo los iniciadores "Adir" (que incluye los 18 codones aleatorios NNN) y "EXTrv". Terminado este primer ciclo, se añaden los iniciadores "EG22rv" y "EG24dir" y se procesan los ciclos 2 y 3 para lograr la amplificación de los insertos. Las líneas punteadas simbolizan la extensión de los iniciadores durante las amplificaciones. Para todos los ciclos, las condiciones de amplificación fueron: desnaturalización a 952C x 30 segundos, hibridación a 66 2C por 30 segundos y extensión a 722C por 20 segundos.Fig. 4. Obtaining the inserts to be cloned for the construction of the pEGH plasmid library. The inserts are obtained by PCR. In cycle 1, only the primers "Adir" (which includes the 18 random codons NNN) and "EXTrv" are used. At the end of this first cycle, the primers "EG22rv" and "EG24dir" are added and cycles 2 and 3 are processed to achieve amplification of the inserts. The dotted lines symbolize the extension of the primers during the amplifications. For all cycles, the amplification conditions were: denaturation at 952 C x 30 seconds, hybridization at 66 2 C for 30 seconds and extension at 722 C for 20 seconds.
Vil. EJEMPLOS PREFERIDOS O REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓNVile. PREFERRED EXAMPLES OR PREFERRED EMBODIMENT OF THE INVENTION
El siguiente ejemplo o realización preferente, es de carácter ilustrativo pero no limitativo de la invención. Se describe un ejemplo de la implementación de la invención que sigue el procedimiento descrito en el diagrama de flujo incluido en la Figura 1:The following example or preferred embodiment is illustrative but not limiting of the invention. An example of the implementation of the invention is described that follows the procedure described in the flow diagram included in Figure 1:
Construcción de una biblioteca de plásmidos pEGH, que permite la síntesis de oligopéptidos a partir de secuencias genéticas aleatorias: pEGH (Figura 2), derivado del plásmido pEG(KG) (Mitchell et al., 1993)2 es un plásmido de expresión en S. cerevisiae que puede ser amplificado en E. coli. Incluye al promotor inducible PGAL (Pierce and Wendland, 2009)3, que es reprimido en presencia de glucosa e inducido en presencia de galactosa, ya que regula la expresión de genes queConstruction of a library of plasmids pEGH, which allows the synthesis of oligopeptides from random genetic sequences: pEGH (Figure 2), derived from plasmid pEG (KG) (Mitchell et al., 1993)2 is an expression plasmid in S cerevisiae that can be amplified in E. coli. It includes the inducible promoter PGAL (Pierce and Wendland, 2009)3 , which is repressed in the presence of glucose and induced in the presence of galactose, since it regulates the expression of genes that
2 Mitchell DA, Marshall TK, Deschenes RJ. 1993. Vectors for the ¡nducible overexpression of glutathione S- transferase fusión proteins in yeast. Yeast 9 (7): 715-722.2 Mitchell DA, Marshall TK, Deschenes RJ. 1993. Vectors for the unducible overexpression of glutathione S-transferase fusion proteins in yeast. Yeast 9 (7): 715-722.
3 Pierce BD and Wendland B. 2009. Sequence of the yeast protein expression plasmid pEG(KT). Yeast26 (6): 349-353. codifican para enzimas responsables del metabolismo de galactosa (Munberg et al., 1994)4.3 Pierce BD and Wendland B. 2009. Sequence of the yeast protein expression plasmid pEG (KT). Yeast26 (6): 349-353. they code for enzymes responsible for galactose metabolism (Munberg et al., 1994)4 .
pEGH permite sintetizar y purificar altos niveles de proteínas estables gracias a que se fusionan a la proteína glutatión S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum (Smith and Johnson, 1988)5. Para la purificación de las proteínas de interés, se utilizan resinas que incluyen glutatión, el cual se asocia con gran afinidad a GST. De otro lado, la eliminación de la etiqueta GST se puede realizar empleando una secuencia de reconocimiento de proteasa de sitio específico, localizada entre GST y la proteína diana (Harper and Speicher, 201 1 )6. La purificación de proteínas empleando el sistema de fusión a GST se ha utilizado en numerosas aplicaciones tales como estudios inmunológicos, producción de vacunas y estudios proteómicos (Yip et al., 2001 )7. Asimismo, la síntesis de proteínas a través del plásmido pEGH permite un método de purificación por afinidad adicional, debido a la presencia de una etiqueta de polihistidina (poliHis) mediante la cual se logra selectiva asociación con iones níquel conjugados a resinas (Rocha, 2005)8. Para poder seleccionar las células de levadura que han sido transformadas, pEGH incluye al marcador primario URA3 que permite la selección de protótrofos en medios sintéticos que carecen de uracilo. El gen URA3 codifica para la enzima orotidina-5'-fosfato descarboxilasa, la cual es esencial para la biosíntesis de uracilo (Pronk, 2002)9.pEGH makes it possible to synthesize and purify high levels of stable proteins thanks to their fusion to the glutathione S-transferase (GST) protein of Schistosoma japonicum (Smith and Johnson, 1988)5 . For the purification of the proteins of interest, resins are used that include glutathione, which is associated with high affinity to GST. On the other hand, removal of the GST tag can be carried out using a site-specific protease recognition sequence, located between GST and the target protein (Harper and Speicher, 201 1)6 . Protein purification using the GST fusion system has been used in numerous applications such as immunological studies, vaccine production and proteomic studies (Yip et al., 2001)7 . Likewise, protein synthesis through the plasmid pEGH allows an additional affinity purification method, due to the presence of a polyhistidine tag (polyHis) through which selective association with nickel ions conjugated to resins is achieved (Rocha, 2005)8 . In order to select for yeast cells that have been transformed, pEGH includes the primary marker URA3 which allows for the selection of prototrophs in synthetic media lacking uracil. The URA3 gene codes for the enzyme orotidine-5'-phosphate decarboxylase, which is essential for the biosynthesis of uracil (Pronk, 2002)9 .
El procedimiento seguido para la construcción de la biblioteca usando el plásmido pEGH está resumido en la Figura 3. Previo a la transformación de S. cerevisiae, el plásmido pEGH fue digerido con la enzima de restricción Sa/I (secuencia de reconocimiento: g/tcgac) dentro del sitio de clonaje múltiple para generar el plásmido linearizado.The procedure followed for the construction of the library using the plasmid pEGH is summarized in Figure 3. Prior to the transformation of S. cerevisiae, the plasmid pEGH was digested with the restriction enzyme Sa / I (recognition sequence: g / tcgac ) within the multiple cloning site to generate the linearized plasmid.
4 Mumberg D, Miiller R and Funk M. 1994. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic acids research 22 (25): 5767- 5768.4 Mumberg D, Miiller R and Funk M. 1994. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic acids research 22 (25): 5767-5768.
5Sm¡th DB and Johnson KS. 1988. Single-step purification of polypeptides expressed ¡n Escherichia eoli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67 (1 ): 31 -40.5 Smth DB and Johnson KS. 1988. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia eoli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67 (1): 31-40.
6 Harper S and Speicher DW. 2010. Purification of proteins fused to glutathione S-transferase. Methods in molecular biology 681 : 259-280.6 Harper S and Speicher DW. 2010. Purification of proteins fused to glutathione S-transferase. Methods in molecular biology 681: 259-280.
7 Yip YL, Smith G and Ward RL. 2001. Comparison of phage plll, pVIII and GST as carrier proteins for peptide immunization in Balb/c mice. Immunology Letters 79 (3): 197-2027 Yip YL, Smith G and Ward RL. 2001. Comparison of phage plll, pVIII and GST as carrier proteins for peptide immunization in Balb / c mice. Immunology Letters 79 (3): 197-202
8 Rocha MR. 2005. Utilidad de una etiqueta de Poli-Histidina para la purificación de la hormona del crecimiento bovino recombinante.Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias con Especialidad en Biología Molecular e Ingeniería Genética. Monterrey, México, Universidad Autónoma de Nuevo León. 69p.8 Rocha MR. 2005. Usefulness of a Poly-Histidine label for the purification of recombinant bovine growth hormone. Thesis to obtain the degree of Master of Science with a Specialty in Molecular Biology and Genetic Engineering. Monterrey, Mexico, Autonomous University of Nuevo León. 69p.
9 Pronk JT. 2002. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology 68 (5): 2095-2100. Los oligonucleótidos fueron diseñados con la finalidad de ser amplificados por PCR para la obtención de los insertos a clonar (Figura 4). Se realizó el diseño para la construcción de la biblioteca de plásmidos que permiten la síntesis de oligopéptidos conformados por un total de 18 aminoácidos de secuencia aleatoria. Para tal efecto, se diseñaron un total de cuatro oligonucleótidos. El oligonucleótido "Adir" de 150 bases incluye los 18 codones "NNN" (N = cualquier base A, G, C o T) y las secuencias homologas al sitio de clonaje de pEGH y al oligonucleótido de extensión "EXTrv". Este oligonucleótido tiene en un extremo una secuencia complementaria a "Adir" y en el otro, al del sitio de clonaje de pEGH. Los cebadores EG22rv y EG24dir se emplearon para la amplificación de los fragmentos (Véase Lista de secuencias).9 Pronk JT. 2002. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology 68 (5): 2095-2100. The oligonucleotides were designed in order to be amplified by PCR to obtain the inserts to be cloned (Figure 4). The design was carried out for the construction of the plasmid library that allow the synthesis of oligopeptides made up of a total of 18 amino acids of random sequence. For this purpose, a total of four oligonucleotides were designed. The 150 base "Adir" oligonucleotide includes the 18 "NNN" codons (N = any base A, G, C or T) and sequences homologous to the cloning site of pEGH and to the extension oligonucleotide "EXTrv". This oligonucleotide has at one end a sequence complementary to "Adir" and at the other, to that of the pEGH cloning site. The primers EG22rv and EG24dir were used for the amplification of the fragments (See Sequence List).
El proceso de transformación de las células de levadura fue realizado con un método convencional basado en un choque térmico en buffer conteniendo acetato de litio y polietilenglicol (Schiestl and Gietz, 1989)10. Para cada tratamiento en tubos de microcentrífuga, se usaron 175 ng del plásmido linearizado y 20 ng del producto PCR (Kitazono, 201 1 )11. La transformación se llevó a cabo empleando tratamientos con buffer que contiene acetato de litio e incubando a 422C, por 20 min. Terminado el tratamiento, se incubó por dos horas en caldo nutritivo no selectivo; las células se colectaron, se resuspendieron en agua y se plaquearon en medio sintético completo que carece de uracilo (medio - Ura), con la finalidad de seleccionar los transformantes que expresan el marcador URA3 presente en pEGH.The yeast cell transformation process was carried out with a conventional method based on a heat shock in a buffer containing lithium acetate and polyethylene glycol (Schiestl and Gietz, 1989)10 . For each treatment in microcentrifuge tubes, 175 ng of the linearized plasmid and 20 ng of the PCR product (Kitazono, 201 1)11 were used . The transformation was carried out using buffer treatments containing lithium acetate and incubating at 422 C for 20 min. After the treatment, it was incubated for two hours in non-selective nutrient broth; the cells were collected, resuspended in water and plated in complete synthetic medium lacking uracil (medium-Ura), in order to select transformants that express the URA3 marker present in pEGH.
10 Schiestl R and Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of ¡ntact yeast cells using single stranded nucleic acid as a carrier. Current Genetics 16 (5-6): 339-34610 Schiestl R and Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of contact yeast cells using single stranded nucleic acid as a carrier. Current Genetics 16 (5-6): 339-346
11 Kitazono AA. 201 1. Optimized protocols and plasmids for in vivo cloning in yeast. Gene 484: 86-89.11 Kitazono AA. 201 1. Optimized protocols and plasmids for in vivo cloning in yeast. Gene 484: 86-89.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PE2019000894APE20191049A1 (en) | 2019-04-26 | 2019-04-26 | METHOD FOR THE CONSTRUCTION OF A PLASMID LIBRARY, WHICH ALLOWS THE SYNTHESIS OF OLIGOPEPTIDES FROM RANDOM SEQUENCES IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE |
| PE000894-2019/DIN | 2019-04-26 |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2020226516A1true WO2020226516A1 (en) | 2020-11-12 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/PE2020/000001CeasedWO2020226516A1 (en) | 2019-04-26 | 2020-04-27 | Method for building a plasmid library which allows oligopeptides to be synthesised using random sequences in saccharomyces cerevisiae |
| Country | Link |
|---|---|
| PE (1) | PE20191049A1 (en) |
| WO (1) | WO2020226516A1 (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100331192A1 (en)* | 2008-03-03 | 2010-12-30 | Dongxing Zha | Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100331192A1 (en)* | 2008-03-03 | 2010-12-30 | Dongxing Zha | Surface display of recombinant proteins in lower eukaryotes |
| Title |
|---|
| ALBAYRAK, SAADET: "Construction and Screening of Custom Peptide Libraries Derived from Synthetic DNA Pools", DISSERTATION, 2011, XP055760121, Retrieved from the Internet <URL:https://deepblue.lib.umich.edu/handle/2027.42/86451> [retrieved on 20201009]* |
| BULTER T. ET AL.: "Preparing Libraries in Saccharomyces cerevisiae", METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 231, 2003, pages 17 - 22, DOI: 10.1385/1-59259-395-X:17* |
| DATABASE Nucleotide 11 June 2009 (2009-06-11), "Cloning vector pEG (KG) , complete sequence", XP055760280, retrieved from NCBI Database accession no. FJ526991.1* |
| JOSKA, T. M. ET AL.: "A universal cloning method based on yeast homologous recombination that is simple, efficient, and versatile", JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, vol. 100, 2014, pages 46 - 51, XP055679128, DOI: 10.1 016/j.mimet. 2013.11.01 3* |
| MADHU V. SINGH, P. ANTHONY WEIL: "A method for plasmid purification directly from yeast", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 307, no. 1, 2002, pages 13 - 17, XP055760123, DOI: 10.1016/s0003-2697 (02)00018-0* |
| MARIO GONZÁLEZ, NÉLIDA BRITO, EDUARDO HERNÁNDEZ‐BOLAÑOS, CELEDONIO GONZÁLEZ: "New tools for high-throughput expression of fungal secretory proteins in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris", MICROBIAL BIOTECHNOLOGY, vol. 12, no. 6, 2019, pages 1139 - 1153, XP055760127, DOI: 10.1111/1751-7915.13322* |
| MATSUI KEN; KURODA KOUICHI; UEDA MITSUYOSHI: "Creation of a novel peptide endowing yeasts with acid tolerance using yeast cell -surface engineering", APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 82, no. 1, 2009, pages 105 - 113, XP037016469, DOI: 1 0.1 007/S00253-008-1761-2* |
| OLDENBURG, K . ET AL.: "Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 25, no. 2, 1997, pages 451 - 452, XP002990102, DOI: 10.1093/nar/25.2.451* |
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|---|---|
| PE20191049A1 (en) | 2019-08-06 |
| Publication | Publication Date | Title |
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