WO2011080456A1 - Method for creating a microlaboratory for a bioanalysis on a microchip, and method for calibrating said laboratory - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a method for creating a biological microlaboratory on a microchip, wherein at least one optical guide (3) is created in a substrate. At least one microfluidic channel is then formed, intersecting at least one previously formed optical guide (3), then at least one biochip (5) is deposited onto the bottom of the microfluidic channel at the intersection of the latter with the optical guide (3), and the microfluidic channel is closed by depositing a closing cover. According to the invention, each deposited biochip(s) comprise(s) n contact pads of probes (7) that are deposited separately from each other in an orderly manner on the bottom of the microfluidic channel(s) by means of pad microprinting, n being a number greater than or equal to 2.

Description

Procédé de réalisation d'un microlaboratoire d'analyse biologique sur puce et procédé d'étalonnage de ce laboratoire Method for producing a micro-laboratory for on-chip biological analysis and calibration method of this laboratory

La présente invention concerne le domaine technique des microlaboratoires d'analyses biologiques sur puce.The present invention relates to the technical field of microlaboratories for on-chip biological analyzes.

De tels laboratoires sont communément dénommés dans le cadre de la communauté scientifique sous le terme "lab-on-chip" (en anglais). Such laboratories are commonly referred to in the context of the scientific community as the "lab-on-chip" (in English).

Ces microlaboratoires permettent de mettre en œuvre les techniques de microfluidique. Ils disposent en effet de canaux microfluidiques, qui autorisent la manipulation de microvolumes d'échantillons biologiques à analyser à l'aide de composants intégrés dans ces microlaboratoires : micropompes, microvalves, micromélangeurs, microséparateurs, microréservoirs, chambres de réaction, colonnes de séparation (en particulier dans le cadre d'analyses électrophorétiques), etc. These microlaboratories make it possible to implement microfluidic techniques. They have in fact microfluidic channels, which allow the manipulation of microvolumes of biological samples to be analyzed by means of integrated components in these microlaboratories: micropumps, microvalves, micromixers, microseparators, microreservoirs, reaction chambers, separation columns (in particularly in the context of electrophoretic analyzes), etc.

L'intérêt de ces microlaboratoires est qu'ils permettent d'automatiser le traitement des échantillons, de limiter la consommation en échantillons biologiques (qui peuvent être précieux) et réactifs, ainsi que d'accélérer les analyses. The interest of these microlaboratories is that they make it possible to automate the processing of samples, to limit the consumption of biological samples (which can be valuable) and reagents, as well as to speed up the analyzes.

La présente invention concerne aussi le domaine des « biopuces » (ou biochips en anglais). The present invention also relates to the field of "biochips" (or biochips in English).

Traditionnellement, les "biopuces" sont fabriquées sur des substrats plans; elles ne comportent donc pas des canaux comme les microlaboratoires sur puce. Le substrat des biopuces peut être constitué de matériaux divers tels que, par exemple : silicium, polymère, ou encore verre (lame de microscope, par exemple). Elles comportent en général des plots circulaires de 30 à 3000 Mm de diamètre séparés de centre à centre d'un pas de 60 à 6000 Mm, soit sensiblement le double du diamètre des plots. Sur chaque plot sont greffées des sondes biomoléculaires (ADN, oligopeptides, anticorps, protéines) dont la composition est parfaitement définie. La composition des sondes varie d'un plot à l'autre mais elle est unique pour chaque plot. Chaque plot comporte des sondes biologiques d'une composition donnée. Dans certaines réalisations, on dépose sur une biopuce plusieurs plots de composition identique pour fiabiliser le traitement des données. Par ailleurs, les biopuces sur support plan sont généralement hybridées dans une chambre fluidique constituée par un couvercle recouvrant en un seul bloc toute la surface de la puce et dont l'aire et le volume sont importants, typiquement de l'ordre de 1 cm² et 10 μΙ, respectivement (voire plus).Traditionally, "biochips" are made on flat substrates; they do not therefore include channels such as micro-laboratories on a chip. The substrate of the biochips can be made of various materials such as, for example: silicon, polymer, or even glass (microscope slide, for example). They generally comprise circular pads 30 to 3000 Mm in diameter separated from center to center in a pitch of 60 to 6000 Mm, or substantially double the diameter of the pads. On each plot are grafted biomolecular probes (DNA, oligopeptides, antibodies, proteins) whose composition is perfectly defined. The composition of the probes varies from one plot to the next, but it is unique for each plot. Each pad comprises biological probes of a given composition. In certain embodiments, a plurality of pads of identical composition are deposited on a biochip in order to make the data processing more reliable. Furthermore, the biochips on a plane support are generally hybridized in a fluidic chamber consisting of a cover covering in one single block the entire surface of the chip and whose area and volume are large, typically of the order of 1 cm^2. and 10 μΙ, respectively (or more).

Le nombre de sondes présentes sur une biopuce peut varier selon la problématique biologique que l'on souhaite traiter. En effet, dans certains cas, comme par exemple pour la réalisation d'analyses médicales, les biopuces peuvent ne comporter qu'une dizaine de sondes quand, dans d'autres cas, elles peuvent en comporter jusqu'à 20 000 ou plus (pour l'étude d'un génome entier, par exemple). The number of probes present on a biochip can vary according to the biological problem that one wishes to treat. Indeed, in some cases, for example for carrying out medical analyzes, biochips may have only about ten probes when, in other cases, they may contain up to 20,000 or more (for the study of an entire genome, for example).

Un autre exemple de procédé de fabrication de biopuces est donné dans le document EP 1 652 580 Al, qui présente une technique de production de plaques à puits contenant des biopuces déposées par photolithographie. Les dimensions des sondes biologiques de ces puces sont de l'ordre de plusieurs dizaines de micromètres, typiquement de l'ordre de 20 à 100 Mm au minimum par exemple. Another example of a microchip fabrication process is given in EP 1 652 580 A1, which discloses a well plate production technique containing biochips deposited by photolithography. The dimensions of the biological probes of these chips are of the order of several tens of micrometers, typically of the order of 20 to 100 Mm minimum for example.

Le principe de fonctionnement d'une biopuce repose sur l'interaction des cibles biologiques présentes dans une solution à analyser avec les sondes formées sur les plots de la biopuce. De telles interactions peuvent être par exemple des hybridations ADN/ADN, ou encore anticorps/antigène et de manière générale protéine/protéine. Ces interactions sont détectables par des techniques optiques et notamment par détection d'une émission de fluorescence induite, par exemple, à l'aide d'un laser. Les cibles sont marquées d'un fluorophore avant diffusion à la surface des plots de la puce. Les produits des interactions entre les cibles et les sondes produisent un signal de fluorescence quand ils sont excités par le laser. En l'absence d'interaction entre les cibles et les sondes, il n'y a pas de signal de fluorescence. The operating principle of a biochip is based on the interaction of the biological targets present in a solution to be analyzed with the probes formed on the biochip pads. Such interactions may be for example DNA / DNA hybridizations, or antibody / antigen and generally protein / protein. These interactions are detectable by optical techniques and in particular by detecting an emission of fluorescence induced, for example, using a laser. The targets are marked with a fluorophore before diffusion on the surface of the pads of the chip. The products of the interactions between the targets and the probes produce a fluorescence signal when they are excited by the laser. In the absence of interaction between the targets and the probes, there is no fluorescence signal.

La présence de fluorescence indique donc la présence des cibles compatibles avec les sondes qui existent sur la biopuce. L'excitation et la détection de la fluorescence au niveau de chaque plot de la puce sont actuellement réalisées par des dispositifs électro-optiques chers, complexes et encombrants.The presence of fluorescence therefore indicates the presence of compatible targets with the probes that exist on the biochip. The excitation and the detection of the fluorescence at each level of the chip are currently carried out by expensive, complex and bulky electro-optical devices.

Lorsque la puce est correctement conçue, les plots répondant avec une grande intensité lumineuse donnent une information «positive» sur la présence de la cible (par exemple : présence d'un code génétique donné) tandis que les plots ne répondant pas avec une grande intensité lumineuse donnent une information «négative» sur la présence de la cible (par exemple : absence d'un code génétique donné). Une combinaison des analyses positives et négatives permet ainsi de déterminer la composition de la solution à analyser. When the chip is correctly designed, the pads responding with great light intensity give a "positive" information on the presence of the target (for example: presence of a given genetic code) while the pads do not respond with great intensity bright give a "negative" information on the presence of the target (for example: absence of a given genetic code). A combination of positive and negative analyzes thus makes it possible to determine the composition of the solution to be analyzed.

Dans la pratique, il est souvent nécessaire de dupliquer les sondes d'un plot donné sur plusieurs plots du laboratoire sur puce et/ou de la biopuce pour fiabiliser la réponse de la biopuce par redondance. In practice, it is often necessary to duplicate the probes of a given plot on several plots of the laboratory-on-a-chip and / or the biochip to make reliable the response of the biochip by redundancy.

L'exploitation des biopuces se heurte aujourd'hui à trois problèmes principaux. The exploitation of biochips faces today three main problems.

Tout d'abord, la manipulation des sondes biologiques à analyser se fait le plus souvent manuellement par des opérateurs (par exemple avec des micropipettes, des chambres d'incubation pour agiter les fluides, des étuves pour mettre les couples cibles/sondes à la bonne température d'interaction, etc.), ce qui s'avère fastidieux. Il apparaît donc essentiel d'intégrer tout ou partie de ces opérations dans un seul microdispositif de façon à les automatiser. First of all, the manipulation of the biological probes to be analyzed is most often done manually by operators (for example with micropipettes, incubation chambers for agitating the fluids, incubators to put the target pairs / probes at the right place. interaction temperature, etc.), which is tedious. It therefore appears essential to integrate all or part of these operations into a single microdevice so as to automate them.

De plus, les systèmes existants d'excitation et de détection de fluorescence marqueurs d'une interaction entre sonde et cible sont chers et encombrants. Il est donc nécessaire de miniaturiser la partie du traitement des biopuces. In addition, the existing fluorescence detection and excitation detection systems that mark the interaction between probe and target are expensive and cumbersome. It is therefore necessary to miniaturize the part of the treatment of biochips.

Enfin il n'existe pas de méthode satisfaisante pour miniaturiser une biopuce et l'intégrer dans un microlaboratoire d'analyse sur puce. Finally, there is no satisfactory method for miniaturizing a biochip and integrating it into a micro-laboratory for on-chip analysis.

Pour des applications thérapeutiques ou de diagnostics, ne nécessitant que quelques sondes par puce, les inconvénients suscités deviennent majeurs et inacceptables. Cela freine considérablement le développement des applications des biopuces, pour les applications médicales de type analyses et diagnostics ambulatoires et à domicile chez les patients, dans le cadre de traitements d'oncologie, par exemple.For therapeutic or diagnostic applications, requiring only a few probes per chip, the disadvantages raised become major and unacceptable. This significantly hinders the development biochip applications, for medical applications such as outpatient and home-based diagnostics and diagnostics in patients, for example, oncology treatments.

L'invention s'adresse en tout premier lieu à la fabrication de biopuces à faible nombre de sondes pour des analyses biologiques liées à des applications médicales de diagnostics (détection de protéines «marqueurs» cancéreux, reconnaissance génétique et génotypage) mais aussi à d'autres applications comme la biodéfense, l'agroalimentaire... The invention is primarily intended for the manufacture of biochips with low number of probes for biological analyzes related to medical diagnostic applications (detection of cancer "marker" proteins, genetic recognition and genotyping) but also to other applications such as biodefense, agribusiness ...

Différentes techniques ont été récemment proposées dans l'état de la technique pour réduire notamment les coûts de fabrication et d'utilisation de laboratoires d'analyse biologique sur puce lorsqu'un faible nombre d'analyses est nécessaire. Ces techniques proposent notamment, comme décrit dans les publications intitulées "Discussion on optical intégration in Lab-on-a-chip microsystems for médical diagnostics", Phys.stat.sol. (c) 3, 998-1012 (2003) et "Towards médical diagnostic chips with monolithically integrated optics in glass substrates", Phys.stat.sol. (c) 4, No.4, 1581-1584 (2007), de réaliser des microlaboratoires sur puce dont les substrats intègrent directement les moyens de guidage de lumière nécessaires à l'excitation et la détection de la fluorescence au niveau des sondes de la puce. Une telle intégration des moyens optiques procure l'avantage d'une meilleure compacité des laboratoires biologiques sur puce ainsi que des coûts de ces laboratoires et de leurs performances. Various techniques have recently been proposed in the state of the art to reduce in particular the costs of manufacturing and use of on-chip biological analysis laboratories when a small number of analyzes is necessary. These techniques include, as described in the publications entitled "Discussion on optical integration in Lab-on-a-chip microsystems for medical diagnostics", Phys.stat.sol. (c) 3, 998-1012 (2003) and "Towards Medical Diagnostic Chips with Monolithically Integrated Optics in Glass Substrates", Phys.stat.sol. (c) 4, No.4, 1581-1584 (2007), to make micro-laboratories on a chip whose substrates directly integrate the light guiding means necessary for the excitation and the detection of the fluorescence at the level of the probes of the chip. Such an integration of the optical means provides the advantage of a better compactness of the on-chip biological laboratories as well as the costs of these laboratories and their performances.

Par ailleurs, il serait particulièrement avantageux aussi de pouvoir intégrer des biopuces dans les canaux microfluidiques des laboratoires sur puce. Ainsi, il serait possible d'intégrer dans le substrat toutes les fonctions nécessaires à la mise en œuvre des biopuces en profitant des avantages de techniques microfluidiques. Moreover, it would be particularly advantageous to be able to integrate microarrays in the microfluidic channels of the labs on a chip. Thus, it would be possible to integrate in the substrate all the functions necessary for the implementation of biochips by taking advantage of microfluidic techniques.

Par exemple, dans le cas d'une analyse de l'ADN d'une cellule, les fonctions suivantes pourront être intégrées : extraction de l'ADN, cission et marquage des brins d'ADN avec un fluorophore, hybridation avec les cibles de la biopuce, lavages pour optimiser la réponse de la biopuce. Comme indiqué précédemment, il est possible ainsi d'introduire aussi dans les microlaboratoires sur puces, des composants optiques comme des guides optiques intégrés de façon à exciter la fluorescence des molécules marquées. Aussi un but de l'invention est de proposer un procédé de fabrication de microlaboratoires biologiques sur puces qui ne présente pas les inconvénients et limites précédemment évoqués.For example, in the case of a DNA analysis of a cell, the following functions can be integrated: DNA extraction, cission and labeling of DNA strands with a fluorophore, hybridization with the targets of the biochip, washes to optimize the biochip response. As indicated above, it is thus possible to introduce also into microchips on chips, optical components such as integrated optical guides so as to excite the fluorescence of the labeled molecules. Also an object of the invention is to provide a method of manufacturing microlaboratories on chips which does not have the disadvantages and limitations mentioned above.

Pour cela, la présente invention se rapporte plus particulièrement à un procédé de fabrication de microlaboratoires d'analyse biologique sur puce par microtamponnage de sondes biologiques au fond de canaux microfluidiques, ainsi qu'un procédé d'étalonnage de tels laboratoires. L'objectif est non seulement de miniaturiser et d'intégrer la biopuce dans le microlaboratoire en déposant les sondes par microtamponnage mais aussi de pouvoir procéder à sa calibration. For this purpose, the present invention relates more particularly to a method of manufacturing microlaboratories for on-chip biological analysis by microtamping biological probes at the bottom of microfluidic channels, as well as a method for calibrating such laboratories. The objective is not only to miniaturize and integrate the biochip into the microlab- latory by depositing the probes by microtamping but also to be able to proceed with its calibration.

Un but de l'invention est tout particulièrement de fournir un procédé de fabrication de microlaboratoires d'analyse biologique sur puce comportant peu de sondes et qui soit peu encombrant et peu cher pour faciliter leur utilisation à des fins d'analyses médicales et de diagnostics. An object of the invention is particularly to provide a method for manufacturing microlaboratories biological analysis on a chip with few probes and which is compact and inexpensive to facilitate their use for purposes of medical analysis and diagnostics.

Dans cet objectif, la présente invention propose un procédé de réalisation d'un microlaboratoire d'analyse biologique sur puce, dans lequel successivement : For this purpose, the present invention proposes a method for producing a micro-laboratory for on-chip biological analysis, in which, successively:

a. On réalise au moins un guide optique lumineux dans un substrat ; at. At least one light guide is made in a substrate;

b. On forme au moins un canal microfluidique sur une face du substrat, ledit canal microfluidique intersectant au moins un dit guide optique formé à l'étape a) ; b. At least one microfluidic channel is formed on one side of the substrate, said microfluidic channel intersecting at least one said optical guide formed in step a);

c. On dépose au moins une biopuce au fond du canal microfluidique au niveau de l'intersection de celui-ci avec le guide optique ; et vs. At least one biochip is deposited at the bottom of the microfluidic channel at the intersection thereof with the optical guide; and

d. On ferme au moins ledit canal microfluidique dans lequel une dite biopuce a été déposée à une intersection avec un guide optique par dépôt d'une couverture de fermeture, sur la face du substrat dans laquelle le canal microfluidique a été formé. En fonction du nombre d'analyses biologiques à réaliser, l'invention prévoit aussi de déposer plusieurs biopuces, côte à côte ou non, à l'intersection de plusieurs canaux microfluidiques avec plusieurs guides optiques.d. At least one said microfluidic channel is closed in which a said biochip has been deposited at an intersection with an optical guide by depositing a closure cover on the face of the substrate in which the microfluidic channel has been formed. Depending on the number of biological analyzes to be performed, the invention also provides for depositing several biochips, side by side or not, at the intersection of several microfluidic channels with several optical guides.

De façon caractéristique du procédé de l'invention, la ou les biopuce(s) biologique(s) déposée(s) à l'étape c) comporte(nt) chacune n plots de sondes, n étant un nombre entier supérieur ou égal à 2, déposés séparément les uns des autres et de façon ordonnée sur le fond du ou des canaux microfluidiques par microtamponnage. In a characteristic way of the method of the invention, the biological biochip (s) deposited in step (c) comprises (nt) each n pins of probes, n being an integer greater than or equal to 2, deposited separately from each other and in an orderly manner on the bottom of the microfluidic channel (s) by microtamping.

On entend ici par "ordonné" que le dépôt des plots de sondes est réalisé selon un arrangement déterminé, à pas d'écartement connu entre chaque plot de sondes, et non de façon aléatoire. By "ordered" is meant here that the deposit of the probe pads is made according to a determined arrangement, with no known spacing between each pad of probes, and not in a random manner.

De même, on entend ici par "plot de sondes" au moins une molécule ou groupement de molécules formant au moins une sonde biologique déposée par microtamponnage dans un canal microfluidique. Un plot peut ainsi comporter une seule molécule sonde ou bien plusieurs molécules sondes déposées simultanément par tamponnage en un même endroit, le plot étant constitué de la ou des molécules déposées. Similarly, here "probe pad" is understood to mean at least one molecule or group of molecules forming at least one biological probe deposited by microtamping in a microfluidic channel. A pad may thus comprise a single probe molecule or several probe molecules simultaneously deposited by buffering in one and the same place, the pad being composed of the deposited molecule or molecules.

Le procédé de l'invention propose ainsi de façon nouvelle de réaliser un laboratoire d'analyse biologique sur puce comportant au moins une biopuce composée de plusieurs sondes individuelles déposées sur des plots formés les uns à côté d'autres par microtamponnage au fond d'un canal microfluidique face à au moins un guide d'onde optique utile à l'excitation des signaux de fluorescence par les sondes. The method of the invention thus proposes in a novel way to produce an on-chip biological analysis laboratory comprising at least one biochip composed of several individual probes deposited on pads formed next to each other by microtamping at the bottom of a microfluidic channel facing at least one optical waveguide useful for the excitation of the fluorescence signals by the probes.

Un tel procédé de fabrication permet de réduire les coûts de production dans la mesure où la quantité de sondes déposées par microtamponnage est très faible par rapport aux biopuces typiques. Par ailleurs, le microtamponnage est un procédé de fabrication peu coûteux et d'une grande productivité. De plus, la procuration d'éléments d'optique intégrés sous la forme de guides optiques formés dans le substrat du laboratoire permet de n'utiliser qu'une seule source d'excitation lumineuse (laser par exemple), et permet aussi d'utiliser un dispositif de lecture de la puce peu coûteux et de faible encombrement. Cela facilite l'utilisation du microlaboratoire d'analyse biologique en ambulatoire chez des patients. De tels microsystèmes trouveraient aussi de nombreuses applications dans des domaines comme la biodéfense, le diagnostic environnemental, etc.Such a manufacturing process makes it possible to reduce production costs insofar as the quantity of probes deposited by microtamping is very small compared with typical biochips. In addition, microtamping is an inexpensive manufacturing process with high productivity. In addition, the procuration of integrated optical elements in the form of optical guides formed in the laboratory substrate makes it possible to use only one source of light excitation (laser for example), and also makes it possible to use an inexpensive chip reading device and small footprint. This facilitates the use of the microlaboratory for outpatient biological analysis in patients. Such microsystems would also find many applications in areas such as biodefense, environmental diagnostics, etc.

En particulier, l'utilisation d'éléments microfluidiques et d'optique intégrés dans le substrat du microlaboratoire obtenu selon le procédé de l'invention permet d'automatiser et d'accélérer les différentes étapes de mise en œuvre du microlaboratoire sur puce, qui peut alors être avantageusement considéré comme un élément jetable après chaque analyse. In particular, the use of microfluidic and optical elements integrated into the substrate of the micro-laboratory obtained according to the method of the invention makes it possible to automate and accelerate the various steps of implementation of the micro-laboratory on a chip, which can then be advantageously considered as a disposable item after each analysis.

Enfin, la miniaturisation de la surface des biopuces permet également d'augmenter très sensiblement la limite de détection de la ou des biopuces déposées. Cette limite de détection est définie comme la quantité minimale de molécules cibles qu'il faut envoyer sur une puce pour obtenir un signal de fluorescence détectable physiquement. Plus la surface de la biopuce est faible plus la biopuce est sensible (limite de détection faible) à condition de pouvoir envoyer les cibles biologiques à la surface de la biopuce. Dans la présente invention, cela est rendu possible et particulièrement avantageux par l'utilisation de techniques microfluidiques. Finally, the miniaturization of the surface of the biochips also makes it possible to increase the limit of detection of the biochips deposited. This limit of detection is defined as the minimum amount of target molecules that must be sent on a chip to obtain a physically detectable fluorescence signal. The smaller the area of the biochip, the more sensitive the biochip is (low detection limit), as long as the biological targets can be sent to the surface of the biochip. In the present invention, this is made possible and particularly advantageous by the use of microfluidic techniques.

Conformément à une caractéristique de l'invention, dans un plan horizontal parallèle au fond du canal microfluidique, la plus grande dimension des plots de sondes est comprise sensiblement entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence comprise entre 1 et 100 micromètres. According to a feature of the invention, in a horizontal plane parallel to the bottom of the microfluidic channel, the largest dimension of the probe pads is substantially between 0.5 and 500 microns, and preferably between 1 and 100 microns.

Selon une autre caractéristique de l'invention, aux intersections où elles sont déposées, les plots de sondes sont écartés les uns des autres d'une distance comprise entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence entre 1 et 100 micromètres. According to another characteristic of the invention, at the intersections where they are deposited, the probe pads are separated from each other by a distance of between 0.5 and 500 microns, and preferably between 1 and 100 microns.

Toujours selon le procédé de la présente invention, les n plots de sondes sont déposés simultanément au fond du canal microfluidique par une seule passe de microtamponnage à l'aide d'un tampon comportant un motif unique. En variante, les n plots de sondes sont déposés un à un sur le fond du canal microfluidique par n tampons distincts, chaque tampon correspondant à un plot d'une sonde déterminé et comportant tous les motifs de la sonde.Still according to the method of the present invention, the n plots of probes are simultaneously deposited at the bottom of the microfluidic channel by a single microtamping pass using a buffer comprising a single pattern. As a variant, the n plots of probes are deposited one by one on the bottom of the microfluidic channel by n distinct buffers, each buffer corresponding to a pad of a determined probe and comprising all the patterns of the probe.

En variante, les n plots de sondes sont déposés un à un sur le fond du canal microfluidique par un seul tampon dont la position est décalée relativement au substrat pour chaque plot de sondes, le tampon étant décontaminé entre chaque plot de sondes. In a variant, the n plots of probes are deposited one by one on the bottom of the microfluidic channel by a single buffer whose position is shifted relative to the substrate for each probe pad, the pad being decontaminated between each pad of probes.

Dans un mode de réalisation de l'invention, on dépose successivement lesdits plots de sondes sur plusieurs substrats par microtamponnages successifs desdits substrats repassés les uns après les autres pour déposer lesdits plots de sondes. In one embodiment of the invention, said probe pads are successively deposited on several substrates by successive microtamponnings of said substrates ironed one after the other to deposit said probe pads.

En variante, les n plots de sondes sont regroupés en sous-ensembles ; tous les plots de sondes d'un sous-ensemble sont déposés simultanément et les sous-ensembles sont déposés séquentiellement. Cette variante est particulièrement avantageuse lorsque l'on regroupe dans un sous-ensemble toutes les sondes correspondant à une biomolécule de composition donnée. De manière explicite, lorsqu'une sonde de composition donnée doit être tamponnée à plusieurs emplacements du substrat, il est avantageux de concevoir un tampon à plusieurs motifs permettant de tamponner tous les emplacements pour y déposer un plot de sondes en une seule fois. La consommation en sonde en est réduite drastiquement puisqu'il est nécessaire de ne tamponner qu'une seule fois. Les risques de contamination sont réduits et enfin la vitesse de fabrication est élevée puisque l'on a réduit le nombre d'opérations de tamponnage nécessaires. In a variant, the n plots of probes are grouped into subsets; all the probe pads of a subset are deposited simultaneously and the subsets are deposited sequentially. This variant is particularly advantageous when all the probes corresponding to a biomolecule of a given composition are grouped together in a subset. Explicitly, when a probe of a given composition is to be buffered at more than one location of the substrate, it is advantageous to design a multi-pattern buffer for buffering all locations for depositing a probe pad at one time. The consumption in probe is reduced drastically since it is necessary to buffer only once. The risks of contamination are reduced and finally the speed of manufacture is high since the number of buffering operations required has been reduced.

On peut également en variante déposer successivement les plots de sondes sur plusieurs substrats selon l'une quelconque des variantes précédentes en ré-encrant si nécessaire le tampon. It is also possible alternatively to successively deposit the probe pads on several substrates according to any one of the preceding variants by re-inking the buffer if necessary.

Il est bien évident que les combinaisons des variantes précédentes font partie intégrante de l'invention. It is obvious that the combinations of the previous variants are an integral part of the invention.

Selon des caractéristiques préférées du procédé de l'invention : According to preferred features of the process of the invention:

- le motif unique du tampon présente une base de hauteur H et comporte au moins un plot d'impression formant une saillie de hauteur h par rapport à la base du tampon et de surface s (l'épaisseur totale du tampon est donc H+h), la hauteur h étant supérieure à la profondeur d du canal microfluidique dans lequel les sondes sont déposées ;the unique pattern of the tampon has a base of height H and comprises at least one print pad forming a projection of height h by ratio to the base of the buffer and surface s (the total thickness of the buffer is H + h), the height h being greater than the depth d of the microfluidic channel in which the probes are deposited;

- la hauteur de la base H du tampon est comprise entre 10 Mm et 10 mm, de préférence entre 100 Mm et 1 mm et la hauteur h de ladite saillie est comprise entre 0,5 Mm et 100 Mm ; the height of the base H of the buffer is between 10 μm and 10 mm, preferably between 100 μm and 1 mm, and the height h of the said projection is between 0.5 μm and 100 μm;

- lors du microtampon nage on comprime le tampon, de façon à ce que la nouvelle hauteur h' de la saillie au cours de tamponnage soit supérieure ou égale à la profondeur du canal microfluidique. - During the microtampon swims the buffer is compressed, so that the new height h 'of the projection during buffering is greater than or equal to the depth of the microfluidic channel.

- selon une variante, le tampon d'impression comporte un corps de support rigide, notamment en silicium, avec une saillie, et une tête d'impression en PDMS, fixée à l'extrémité de ladite saillie, ladite tête étant de préférence sensiblement cubique ; la tête d'impression en PDMS présente une hauteur et une largeur comprises entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence comprise entre 1 et 100 Mm ; according to one variant, the printing buffer comprises a rigid support body, in particular made of silicon, with a projection, and a PDMS printing head, fixed at the end of said projection, said head preferably being substantially cubic ; the PDMS print head has a height and a width between 0.5 and 500 micrometers, and preferably between 1 and 100 Mm;

- le canal microfluidique présente une largeur comprise entre 1 Mm et 1 mm et une profondeur comprise entre 1 et 1 mm ; et le canal microfluidique présente de préférence une largeur comprise entre 10 et 200 Mm et de préférence une profondeur comprise entre 10 et 100 Mm. the microfluidic channel has a width of between 1 mm and 1 mm and a depth of between 1 and 1 mm; and the microfluidic channel preferably has a width of between 10 and 200 μm and preferably a depth of between 10 and 100 μm.

La présente invention concerne également dans un second objet un procédé d'étalonnage d'un microlaboratoire biologique sur puce obtenu selon le procédé précédemment décrit. Ce procédé consiste essentiellement, au niveau d'au moins une intersection entre un canal microfluidique et un guide optique, à : The present invention also relates in a second object to a method for calibrating a micro-laboratory on-chip obtained according to the method described above. This method essentially consists, at at least one intersection between a microfluidic channel and an optical guide, in:

a. déposer par microtamponnage au moins un plot de sondes si dans le fond du canal microfluidique à une intersection avec le guide optique, lesdites sondes si étant marquées par au moins un fluorophore en même quantité et étant inertes aux espèces présentes dans un échantillon biologique à tester par circulation dans le canal microfluidique, et at. depositing by microtamponnage at least one probe pad if in the bottom of the microfluidic channel at an intersection with the optical guide, said probes being marked by at least one fluorophore in the same quantity and being inert to the species present in a biological sample to be tested by circulation in the microfluidic channel, and

b. déposer par microtamponnage au moins un plot de sondes s2 dans le fond du canal microfluidique du laboratoire à côté des/du plot(s) des sonde(s) si à l'intersection dudit canal avec le guide optique, lesdites sondes s2 étant destinées à réagir avec une molécule F* à identifier marquée d'un fluorophore, présente dans l'échantillon biologique à tester ; ladite molécule F* n'interagissant pas avec les sondes si etb. deposit by microtamponnage at least one pad of probes s2 in the bottom of the microfluidic channel of the laboratory next to / from stud (s) of the probe (s) if at the intersection of said channel with the optical guide, said probes s2 being intended to react with a molecule F * to be labeled with a fluorophore, present in the biological sample to be tested; said F * molecule does not interact with the probes if and

c. déposer par microtamponnage au moins un plot de sondes s3 dans le fond dudit canal microfluidique, à côté des sondes si et s2, à l'intersection avec le guide optique, lesdites sondes s3 étant destinée à réagir avec au moins une molécule connue et de référence F₂* marquée par un fluorophore présente ou introduite en quantité connue dans l'échantillon biologique à tester, ladite molécule n'interagissant par avec les sondes si et s2 ni avec la molécule F* etvs. microtamping at least one probe pad s3 in the bottom of said microfluidic channel, next to the probes si and s2, at the intersection with the optical waveguide, said probes s3 being intended to react with at least one known and reference molecule F₂ * labeled with a fluorophore present or introduced in known quantity in the biological sample to be tested, said molecule interacting with the probes si and s2 or with the molecule F * and

d. fermer le dispositif avec un couvercle. d. close the device with a lid.

On injecte ensuite dans le canal microfluidique l'échantillon biologique à tester pouvant comporter la molécule à identifier F* et dans lequel a été introduit la molécule de référence F₂* et l'on injecte également une lumière excitatrice dans le(s) guide(s) optique. Les phénomènes suivants peuvent alors être observés :The biological sample to be tested, which may include the molecule to be identified F * and into which the reference molecule F₂ * has been introduced, is then injected into the microfluidic channel and an excitatory light is also injected into the guide (s). s) optics. The following phenomena can then be observed:

- la détection de l'émission de fluorescence de la sonde si permet de confirmer la présence effective d'un signal lumineux d'excitation à l'emplacement de la biopuce : the detection of the fluorescence emission of the probe if it makes it possible to confirm the effective presence of an excitation light signal at the location of the biochip:

- la détection de l'émission de fluorescence de la sonde s2 indique la présence effective de la cible F* dans le fluide biologique ; the detection of the fluorescence emission of the probe s2 indicates the effective presence of the target F * in the biological fluid;

- la détection de l'émission de fluorescence de la sonde s3 permet de confirmer l'écoulement de la molécule de référence F₂* et donne une indication sur le bon fonctionnement du dispositif microfluidique.the detection of the fluorescence emission of the probe s3 confirms the flow of the reference molecule F₂ * and gives an indication of the proper functioning of the microfluidic device.

Dans la description qui précède, il a été raisonné implicitement sur un ensemble de sondes si, s2 et s3 disposées à l'intersection d'un seul canal microfluidique et d'un seul guide d'onde. II est bien entendu que les sondes si, s2 et s3 peuvent être réparties à plusieurs intersections de plusieurs canaux microfluidiques avec plusieurs guides d'onde. La réponse biologique de la puce pourra être avantageusement dérivée des comparaisons des niveaux de fluorescence de plots répartis à plusieurs intersections.In the foregoing description, it has been implicitly reasoned on a set of probes si, s2 and s3 arranged at the intersection of a single microfluidic channel and a single waveguide. It is understood that the probes si, s2 and s3 can be distributed at several intersections of several microfluidic channels with several waveguides. The biological response of the chip can be advantageously derived from comparisons of the fluorescence levels of pads distributed at several intersections.

En effet, pour confirmer ou non la présence de la molécule cible F*, il est souvent nécessaire de tester son interaction possible avec un nombre entier w de sondes de type s2_(z) de composition différentes avec z = 1 à w et w supérieur ou égal à 2. Pour détecter w interactions biomoléculaires possibles avec la cible, le dispositif peut alors avantageusement comporter :Indeed, to confirm or not the presence of the target molecule F *, it is often necessary to test its possible interaction with an integer w of probes of type s2_(z) of different composition with z = 1 to w and higher w or equal to 2. To detect possible biomolecular interactions with the target, the device can then advantageously comprise:

- une sonde si dupliquée w fois (si_z= i à w)a probe if duplicated w times (if_z = i to w)

- w sondes s2_(z) avec z = 1 à w pour détecter w interactions biomoléculaires possibles et w supérieur ou égal à 2 ;w probes s2_(z) with z = 1 to w for detecting w possible biomolecular interactions and w greater than or equal to 2;

- une sonde s3 dupliquée w fois (s3_z= i à w) ;a probe s3 duplicated w times (s3_z = i to w);

les sondes étant réparties à la surface du microlaboratoire sur puce en w triplets (si_z= i à w, s2_z= i à w, s3_z= i à w) et disposées à une et/ou plusieurs intersections canal (aux) microfluidique(s) / guide(s) optique.the probes being distributed on the surface of the micro-laboratory on a chip in w triplets (if_z = 1 to w, s 2_z = 1 to w, s 3_z = 1 to w) and arranged at one and / or more intersections channel (s) microfluidic (s) / optical guide (s).

La lecture de la biopuce, à savoir la reconnaissance biomoléculaire proprement dite, consiste alors à mesurer la fluorescence émise par l'ensemble des w triplets (si_z= i à w, s2_z= i à_w, s3_z= i à_w) en comparant 2 à 2 le signal émis par les sondes s2_z= i à w. Il est alors essentiel que les w sondes s2_z= i à w soient éclairées par un signal d'excitation lumineux équivalent et qu'elles reçoivent une quantité équivalente de cibles à détecter. Cette double condition d'équivalence n'est pas facilement réalisable dans la pratique :The reading of the biochip, namely the biomolecular recognition proper, then consists in measuring the fluorescence emitted by the set of triplets w (w =_z = i to w, s2_{z =} i to_w , s3_z = i to_w ) comparing 2 to 2 the signal emitted by the probes s2_z = i to w. It is then essential that the w probes s 2_{z =} 1 to w are illuminated by an equivalent light excitation signal and that they receive an equivalent quantity of targets to be detected. This dual condition of equivalence is not easily achievable in practice:

- en ce qui concerne l'optique intégrée : à cause des inhomogénéités de fabrication des guides d'onde, de répartition de la lumière d'excitation entre les guides, etc. - with regard to integrated optics: because of inhomogeneities in waveguide fabrication, distribution of excitation light between the guides, etc.

- en ce qui concerne la microfluidique : à cause des inhomogénéités de fabrication des canaux microfluidiques, des différences d'acheminement et/ou de contrôle des fluides, etc. - as regards microfluidics: because of the inhomogeneities of microfluidic channel manufacturing, differences in the routing and / or control of fluids, etc.

C'est pourquoi, afin de compenser toutes ces causes d'erreur, dans le cas où w est supérieur ou égal à 2, le procédé d'étalonnage d'un microlaboratoire biologique sur puce selon selon l'invention prévoit également de façon avantageuse : e. l'introduction du liquide biologique contenant :That is why, in order to compensate for all these causes of error, in the case where w is greater than or equal to 2, the method of calibration of a micro-biological on-chip according to the invention also advantageously provides: e. the introduction of the biological fluid containing:

- éventuellement la molécule recherchée F* - optionally the desired molecule F *

- au moins une molécule de référence F₂* en quantité connue. f. l'injection du faisceau lumineux d'excitation dans le guide optique.at least one reference molecule F₂ * in known quantity. f. the injection of the excitation light beam into the optical guide.

g. la détection et la mesure à l'aide d'un dispositif optique dont la résolution permet la séparation spatiale d'au moins deux sondes consécutives de l'intensité du signal de fluorescence émis par chacun des plots de tous les triplets (si_z= i à w, s2_z= i à_w, s3_z= i à w) .boy Wut. detection and measurement using an optical device whose resolution allows the spatial separation of at least two consecutive probes of the intensity of the fluorescence signal emitted by each of the pads of all the triplets (if_z = i to w, s2_{z =} i to_w , s3_z = i to w).

h. la comparaison 2 à 2 de la fluorescence émise par les plots (si_z= î à w, s2_z= i à w, s3_z= î à w) et (si_z= î, s2_z= i, s3_z= i) .h. the comparison 2 to 2 of the fluorescence emitted by the pads (if_z = 1 to w, s 2_z = 1 to w, s 3_z = 1 to w) and (if_z = 1, s 2_z = i, s 3_z = i ).

De façon avantageuse, le procédé d'étalonnage de la présente invention prévoit également de corriger les différences de variation d'intensité lumineuse incidente en se servant comme référence de la fluorescence émise par les plots de sondes si_z= i à_w, de chaque triplet ; ainsi que les différences de débit microfluidique en se servant comme référence de la fluorescence émise par les plots de sondes s3_z= i à_w de chaque triplet.Advantageously, the calibration method of the present invention also provides for correcting the differences in incident light intensity variation by using as a reference the fluorescence emitted by the probe pads if_z = i to_w , of each triplet ; as well as the differences in microfluidic flow rate by using as a reference the fluorescence emitted by the probe pads s3_z = i to_w of each triplet.

D'autres caractéristiques de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre, réalisée en référence aux figures annexées parmi lesquelles : Other features of the invention will emerge from the detailed description which follows, with reference to the appended figures among which:

- la Figure 1 représente, grossie 100 fois, une jonction de 2 canaux microfluidiques croisés dans un laboratoire biologique réalisé selon le procédé de l'invention, le laboratoire présentant également une série de guides optiques perpendiculaires au canal microfluidique de séparation ; - Figure 1 shows, magnified 100 times, a junction of 2 crossed microfluidic channels in a biological laboratory performed according to the method of the invention, the laboratory also having a series of optical guides perpendicular to the microfluidic channel separation;

- la Figure 2A représente une puce biologique à 9 sondes réalisée à l'intersection d'un canal microfluidique et d'un guide lumineux intégré au substrat d'un laboratoire sur puce obtenu selon le procédé de l'invention ; FIG. 2A represents a 9-probe biological chip made at the intersection of a microfluidic channel and a light guide integrated into the substrate of a lab-on-a-chip obtained according to the process of the invention;

- la Figure 2B représente une puce biologique à 9 sondes répartis à 2 intersections d'un canal microfluidique avec deux guides d'onde optique. FIG. 2B represents a biological chip with 9 probes distributed at 2 intersections of a microfluidic channel with two optical waveguides.

- les Figures 3A à 3C représentent schématiquement le principe de microtampon nage de sondes biologiques sur un substrat plan ; - les Figures 4A et 4B représentent schématiquement le microtampon nage d'une sonde biologique au fond d'un canal microfluidique formé dans un substrat dans le cadre du procédé selon l'invention ;FIGS. 3A to 3C schematically represent the principle of microtampon swimming biological probes on a plane substrate; FIGS. 4A and 4B schematically represent the microtampon of a biological probe at the bottom of a microfluidic channel formed in a substrate in the context of the process according to the invention;

- les Figures 5A et 5B représente schématiquement le principe de microtampon nage avec un tampon Si/PDMS à haut facteur de forme pour la mise en œuvre du procédé de l'invention ; FIGS. 5A and 5B schematically represent the principle of microtampon swimming with a Si / PDMS buffer with a high form factor for the implementation of the method of the invention;

- la Figure 6 représente un premier mode de réalisation d'un laboratoire sur puce obtenu conformément au procédé selon l'invention ; FIG. 6 represents a first embodiment of a lab-on-a-chip obtained according to the method according to the invention;

- les Figures 7A et 7B représentent un exemple de mise en œuvre d'un procédé d'étalonnage d'un laboratoire biologique sur puce du type représenté à la Figure 6. FIGS. 7A and 7B show an example of implementation of a calibration method of a biological on-chip laboratory of the type represented in FIG. 6.

La présente invention propose un nouveau procédé de fabrication de microlaboratoires d'analyse biologique sur puce. The present invention proposes a novel process for the production of micro-laboratories for on-chip biological analysis.

Conformément à ce procédé, on réalise dans une première étape au moins un composant d'optique intégrée, en pratique un canal de guidage lumineux, dans un substrat support dans lequel on souhaite réaliser un laboratoire biologique. According to this method, at least one integrated optical component, in practice a light guide channel, is produced in a first step in a support substrate in which it is desired to produce a biological laboratory.

Cette première étape est réalisée de préférence, dans le cadre de l'invention, dans un substrat de verre par une méthode d'échange d'ions dans un bain de sels fondus maintenu à une température élevée. Le choix du verre comme substrat est privilégié dans le cadre de l'invention car il présente l'avantage d'être transparent, isolant, biocompatible et peu cher. La surface peut être contrôlée chimiquement de manière répétable. Grâce au développement de l'optoélectronique et de la microélectronique, la technologie de fabrication des composants d'optique intégrée et les techniques de micro-intégration sur verre sont aujourd'hui bien maîtrisées. This first step is preferably carried out in the context of the invention in a glass substrate by an ion exchange method in a molten salt bath maintained at a high temperature. The choice of glass as substrate is preferred in the context of the invention because it has the advantage of being transparent, insulating, biocompatible and inexpensive. The surface can be chemically controlled in a repeatable manner. Thanks to the development of optoelectronics and microelectronics, the manufacturing technology of integrated optical components and micro-integration techniques on glass are now well mastered.

Néanmoins, il est possible de réaliser des microlaboratoires sur puce dans d'autres matériaux que le verre avec des guides d'onde et des composants optiques intégrés. Il est possible aussi de mettre en œuvre des microlaboratoires sur puce constitués de couches de différents matériaux. Par exemple, on peut réaliser de tels dispositifs avec du PDMS (Polydiméthylesiloxane), ou encore du COC (CycloOléfine Copolymère) ou encore en intégrant des guides d'ondes InGaN (Nitrure de Gallium-Indium) dans du silicium.Nevertheless, it is possible to carry out on-chip micro-laboratories in materials other than glass with waveguides and integrated optical components. It is also possible to implement micro-laboratories on a chip consisting of layers of different materials. For example, such devices can be made with PDMS (Polydimethylsiloxane), or else COC (CycloOlefine Copolymer) or again by integrating InGaN (Gallium-Indium Nitride) waveguides in silicon.

Dans ce qui suit, nous allons détailler à titre d'exemple le mode de fabrication des microlaboratoires en verre avec guide d'ondes optiques obtenus par échange d'ions. Notons qu'il est possible d'intégrer à de tels dispositifs des microcomposants constitués d'un autre matériau. On peut, par exemple, introduire des microvannes fluidiques en PDMS dans un dispositif en verre. In the following, we will detail by way of example the manufacturing method of glass microlaboratories with optical waveguide obtained by ion exchange. Note that it is possible to integrate in such devices microcomponents made of another material. For example, PDMS fluidic microvannes can be introduced into a glass device.

Selon le mode de réalisation préférentiel, la fabrication des guides optiques dans les substrats de verre relève d'un échange d'ions s'effectuant entre les ions sodium (Na⁺) présents dans le substrat de verre et ceux présents dans un bain de sels fondus comportant des ions de potassium K⁺ ou d'argent Ag⁺ à une température d'environ 380°C. Ce traitement induit un changement local de la composition chimique du substrat de verre qui se traduit par une augmentation de l'indice de réfraction du verre, permettant ainsi de réaliser un guide lumineux tel qu'un guide optique simple, des connections ou une jonction Y.According to the preferred embodiment, the manufacture of the optical guides in the glass substrates is an ion exchange taking place between the sodium ions (Na⁺ ) present in the glass substrate and those present in a bath of salts fusions comprising K⁺ potassium ions or Ag⁺ silver at a temperature of about 380 ° C. This treatment induces a local change in the chemical composition of the glass substrate which results in an increase in the refractive index of the glass, thus making it possible to produce a light guide such as a simple optical guide, connections or a Y junction .

Après réalisation, les composants optiques réalisés sont soumis à des caractérisations optiques rigoureuses. After completion, the optical components produced are subjected to rigorous optical characterizations.

On forme ensuite dans une seconde étape au moins un canal microfluidique sur une face du substrat de verre, ledit canal microfluidique intersectant au moins le ou les canaux de guidage lumineux formé à l'étape précédente. In a second step at least one microfluidic channel is formed on one side of the glass substrate, said microfluidic channel intersecting at least one or more light guide channels formed in the preceding step.

Pour réaliser ce canal microfluidique, on nettoie dans un premier temps la surface du substrat dans laquelle on souhaite former le canal microfluidique, par exemple à l'aide d'une solution de type "piranha". On dépose ensuite un masque métallique en chrome et une résine photosensible sur la face nettoyée, puis on procède à une étape de photolithographie suivie d'une première étape de gravure de façon à constituer des ouvertures sur la résine, suivie d'une deuxième étape de gravure humide à travers les ouvertures dans la couche de chrome à l'aide d'une solution à base d'acide chlorhydrique, suivie d'une nouvelle étape de gravure humide du verre à l'aide d'une solution d'acide fluorhydrique, puis enfin une étape d'enlèvement de la couche de chrome afin de dégager le verre, par exemple avec de l'eau régale. Pour finir, on perce le cas échéant des trous dans le verre par exemple avec des forets diamantés spéciaux. Ces trous ont notamment pour fonction d'amener les fluides. Selon des variantes connues de l'homme de l'art, on procède non pas à des gravures humides mais pour certaines étapes à des gravures sèches.To achieve this microfluidic channel, it first cleans the surface of the substrate in which it is desired to form the microfluidic channel, for example using a "piranha" type solution. A chromium metal mask and a photosensitive resin are then deposited on the cleaned face, followed by a photolithography step followed by a first etching step so as to form openings on the resin, followed by a second step of wet etching through the openings in the chromium layer using a solution based on hydrochloric acid, followed by a new step of wet etching the glass using a solution of hydrofluoric acid, then finally a step of removing the chromium layer in order to clear the glass, for example with aqua regia. Finally, if necessary holes are drilled in the glass, for example with special diamond drills. These holes have the particular function of bringing fluids. According to variants known to those skilled in the art, one proceeds not to wet etchings but for some steps to dry etchings.

Une fois le canal microfluidique formé, celui-ci intersecte le ou les guides lumineux formés au préalable à la perpendiculaire, comme représenté sur la Figure 1. Once the microfluidic channel formed, it intersects the light guide or guides previously formed perpendicular, as shown in Figure 1.

Sur cette Figure 1, qui est une image grossie 100 fois d'une portion d'un laboratoire biologique sur puce obtenu selon le procédé de l'invention, on distingue un canal microfluidique principal 1 s'étirant perpendiculairement à un canal microfluidique 2 secondaire ainsi qu'à huit guides lumineux 3. Les canaux microfluidiques 1, 2 et les guides lumineux 3 sont formés tels que précédemment décrits dans la masse d'un substrat 4 de verre. Les canaux microfluidiques 1, 2 présentent une largeur de l'ordre de 20 Mm et les guides lumineux 3 une largeur de l'ordre de 2 à 10 Mm. In this FIG. 1, which is a 100-fold magnified image of a portion of a biological on-chip laboratory obtained according to the method of the invention, there is a main microfluidic channel 1 stretching perpendicular to a secondary microfluidic channel 2 and than eight light guides 3. The microfluidic channels 1, 2 and the light guides 3 are formed as previously described in the mass of a substrate 4 of glass. The microfluidic channels 1, 2 have a width of the order of 20 Mm and the light guides 3 a width of the order of 2 to 10 Mm.

Après avoir formé au moins un guide lumineux 3 et au moins un canal microfluidique 1 intersectant ce guide lumineux, on dépose ensuite dans une troisième étape, comme représenté sur la Figure 2A, au moins une puce biologique 5 au fond du canal microfluidique 1 au niveau d'au moins une intersection 6 de celui-ci avec un canal de guidage lumineux 3. De façon caractéristique du procédé de l'invention et tel que représenté sur la Figure 2A, la puce biologique 5 formée comporte n plots 7 individuels formés distinctement les uns des autres, et de façon ordonnée sur le fond du canal microfluidique 1, n étant un nombre entier, ces plots 7 formant chacun une sonde. Pour cette raison on parlera sans distinction de plot ou de sonde ou encore de plot de sonde(s) 7 dans la suite de la présente description. Dans l'exemple représenté sur la Figure 2A, la biopuce, ou puce biologique, 5 comporte neuf plots 7 et donc neuf sondes individuelles. Dans la Figure 2B, selon une variante, les neufs sondes 7 de la biopuce 5 sont réparties à deux intersections 6. Bien entendu, on peut également envisager de répartir les neuf sondes 7 sur un nombre plus important d'intersections 6 entre le canal microfluidique 1 et les guides d'ondes lumineux 3.After forming at least one light guide 3 and at least one microfluidic channel 1 intersecting this light guide, a third step is then deposited, as shown in FIG. 2A, at least one biological chip 5 at the bottom of the microfluidic channel 1 at the level of the light guide. at least one intersection 6 thereof with a light guide channel 3. Typically the method of the invention and as shown in Figure 2A, the biological chip 5 formed has n individual pads 7 formed distinctly the each other, and neatly on the bottom of the microfluidic channel 1, n being an integer, these pads 7 each forming a probe. For this reason we speak without distinction pad or probe or probe pad (s) 7 in the following description. In the example shown in FIG. 2A, the biochip, or biological chip, comprises nine pads 7 and thus nine individual probes. In FIG. 2B, according to one variant, the nine probes 7 of the biochip 5 are distributed at two intersections 6. Of course, it is also possible to envisage spreading the nine probes 7 over a larger number of intersections 6 between the microfluidic channel. 1 and the light waveguides 3.

De façon très générale et théorique, il peut y avoir un nombre entier (i,j) de guides d'onde lumineux 3 et de canaux microfluidiques 1 différents sur chaque substrat de verre 4, ainsi qu'un nombre entier n_k de sondes 7 à chaque intersection 6 entre un dit guide d'onde lumineux 3 et un dit canal microfluidique 1, avec k=l à i x j et n_k= 1 à n si l'on considère que chaque guide d'onde 3 ne coupe un canal microfluidique 1, 2 qu'une seule fois et qu'il y a au moins une sonde 7 à chaque intersection 6.In a very general and theoretical way, there may be an integer (i, j) of light waveguides 3 and of different microfluidic channels 1 on each glass substrate 4, as well as an integer n_k of probes 7 at each intersection 6 between a said light waveguide 3 and a said microfluidic channel 1, with k = 1 to ixj and n_k = 1 to n if it is considered that each waveguide 3 does not cut a microfluidic channel 1, 2 only once and that there is at least one probe 7 at each intersection 6.

Les n sondes biologiques 7 sont déposées au fond du canal microfluidique 1 par microtampon nage. Cette technique de dépôt des sondes biologiques 7 s'avère particulièrement originale et même essentielle dans le cadre de l'invention. The n biological probes 7 are deposited at the bottom of the microfluidic channel 1 by microtampon swimming. This technique of depositing biological probes 7 is particularly original and even essential in the context of the invention.

En effet, dans l'état de la technique, les puces biologiques sont traditionnellement fabriquées sur des substrats plans (silicium, lame de microscope, polymère). Elles sont formées en général de plots ou sondes de 30 à 300 Mm de diamètre, séparés d'un pas de 60 à 600 Mm. Chaque plot forme une sonde biomoléculaire greffée (ADN, oligopeptides, anticorps, protéines) dont la composition est parfaitement définie. Cette composition des sondes biomoléculaires peut varier d'un plot à l'autre mais elle est unique pour chaque plot. Indeed, in the state of the art, biological chips are traditionally manufactured on flat substrates (silicon, microscope slide, polymer). They are generally formed of pads or probes of 30 to 300 mm in diameter, separated by a step of 60 to 600 mm. Each pad forms a grafted biomolecular probe (DNA, oligopeptides, antibodies, proteins) whose composition is perfectly defined. . This composition of the biomolecular probes can vary from one plot to the next, but it is unique for each plot.

Les méthodes connues de fabrication de puces biologiques sur substrat plan reposent à ce jour essentiellement sur l'adressage des sondes par voie fluidique, photochimique, par projection, ou encore par microscopie à force atomique. The known methods for producing biological chips on a planar substrate currently rely essentially on the addressing of the probes by fluidic, photochemical, projection or atomic force microscopy.

Ces techniques de fabrication de sondes ne sont cependant pas adaptées au dépôt de sondes biologiques au fond de canaux microfluidiques. En effet, la technique de microscopie à force atomique est à exclure en raison du risque important de détérioration de la pointe de détection du dispositif lors du dépôt à l'intérieur d'un canal.These probe manufacturing techniques are however not suitable for depositing biological probes on the bottom of microfluidic channels. Indeed, the atomic force microscopy technique is to be excluded because of the significant risk of deterioration of the detection tip of the device during the deposition inside a channel.

Les méthodes de dépôt par projection sont quant à elles limitées à des adressages de réactifs de l'ordre du picolitre soit au mieux d'un diamètre de goutte de 30 Mm, donc plus large que la largeur du canal microfluidique 1 et des guides d'ondes lumineux 3 formés dans le substrat 4 de verre suivant le procédé de l'invention. The sputter deposition methods are in turn limited to addressing picoliter-type reagents, at best a drop diameter of 30 μm, which is therefore wider than the width of the microfluidic channel 1 and the guides. 3 light waves formed in the glass substrate 4 according to the method of the invention.

Le dépôt de sondes biologiques au fond d'un canal microfluidique par voie uniquement fluidique, ou combinée avec une activation photochimique locale n'est pas compatible avec la nécessité d'un dépôt précis et ordonné de plusieurs sondes les unes à côté des autres, sans contamination entre elles, sur une très faible surface de plot comme proposé par l'invention. The deposition of biological probes at the bottom of a microfluidic channel solely by fluidic means, or combined with a local photochemical activation is not compatible with the need for precise and ordered deposition of several probes next to each other, without contamination between them, on a very small pad surface as proposed by the invention.

La technique de microtamponnage ne présente de limites techniques au dépôt de sondes microscopiques dans un canal microfluidique ; au contraire le microtamponnage consomme très peu de sondes comparativement aux autres méthodes, sa résolution est très grande (limite connue de l'ordre de 50 nm) et il est facile de tamponner aussi bien un nombre très faible qu'un nombre très important de sondes avec une machine de tamponnage telle que par exemple la machine décrite dans la demande de brevet français FR 2922813 Al, déposée par les inventeurs, le tout de façon très rapide. The microtamping technique has no technical limits to the deposit of microscopic probes in a microfluidic channel; on the contrary, microtamping consumes very few probes compared to other methods, its resolution is very large (known limit of the order of 50 nm) and it is easy to buffer both a very small number and a very large number of probes with a stamping machine such as for example the machine described in the French patent application FR 2922813 A1, filed by the inventors, all in a very fast manner.

La technique de microtamponnage est décrite ci-après en référence aux Figures 3A à 3C, puis plus en détail quant à sa mise en œuvre concrète dans le cadre de la présente invention en référence aux Figures 4A, 4B et 5. The microtamping technique is described hereinafter with reference to FIGS. 3A to 3C, then in more detail as to its concrete implementation in the context of the present invention with reference to FIGS. 4A, 4B and 5.

Les Figures 3A à 3C représentent schématiquement le principe de microtamponnage de sondes biologiques Sb sur un substrat plan P à l'aide d'un tampon T comportant un nombre de motifs M de dépôt égal au nombre de sondes Sb à déposer sur le substrat. Pour effectuer le dépôt des sondes Sb, on encre dans un premier temps le tampon T, et plus particulièrement ses motifs M d'une nano-encre chimique ou biologique destinée à former les sondes Sb sur le substrat plan P, puis on vient apposer lesdits motifs M du tampon T sur une face plane du substrat P avec une pression déterminée suffisante pour effectuer un transfert de l'encre chimique ou biologique enduite sur le tampon T sur la surface supérieure du substrat P. Après retrait du tampon T, les sondes Sb sont déposées les unes à côtés des autres sous forme de plots avec un écartement déterminé sur la surface du substrat P, formant ainsi une biopuce biologique.FIGS. 3A to 3C schematically represent the principle of microtamping biological probes Sb on a plane substrate P using a buffer T comprising a number of M units of deposit equal to the number of Sb probes to be deposited on the substrate. To carry out the deposition of the probes Sb, the buffer T is first inked, and more particularly its M units, with a chemical or biological nano-ink intended to form the probes Sb on the planar substrate P, and then the said label is affixed. patterns M of buffer T on a flat face of the substrate P with a determined pressure sufficient to carry out a transfer of the chemical or biological ink coated on the buffer T on the upper surface of the substrate P. After removal of the buffer T, the probes Sb are deposited on next to each other in the form of pads with a determined spacing on the surface of the substrate P, thus forming a biological biochip.

De façon générale là encore, beaucoup de cas de figures différents peuvent être envisagés et mis en œuvre pour ce qui concerne la forme du tampon et/ou son utilisation. En particulier, on peut jouer en fonction du tampon utilisé sur : In general, again, many different cases can be envisaged and implemented with regard to the shape of the stamp and / or its use. In particular, one can play according to the buffer used on:

- le nombre de sondes tamponnées en même temps si le tampon comporte plusieurs motifs d'impression, the number of probes buffered at the same time if the buffer comprises several printing patterns,

- la nature des sondes tamponnées en même temps lorsque le tampon comporte plusieurs motifs d'impression. the nature of the probes buffered at the same time when the buffer comprises several printing patterns.

II est également possible de déposer une seule sonde par coup de tamponnage ou plusieurs sondes avec un tampon muni de plusieurs motifs de sondes par exemple. It is also possible to deposit a single probe for buffering or several probes with a buffer provided with several probe patterns, for example.

Il est également possible d'envisager la mise en œuvre de plusieurs tampons pour les différentes sondes déposées ou encore de mettre en œuvre un seul tampon en le nettoyant entre chaque dépôt de sondes de nature différente. Dans ce cas, la mise en œuvre de plusieurs tampons est grandement facilitée par l'utilisation d'une machine de microtampon nage comme celle décrite dans la demande FR 2922813 Al (alignement facile des coups de tampon les uns par rapport aux autres). De même la machine est prévue pour tamponner facilement une série de substrats, ce qui autorise une production importante de microlaboratoires. It is also possible to envisage the implementation of several buffers for the various probes deposited or to implement a single buffer by cleaning it between each deposit of probes of different nature. In this case, the implementation of several buffers is greatly facilitated by the use of a microtampon machine such as that described in FR 2922813 A1 (easy alignment of the stamp strokes relative to each other). Similarly, the machine is designed to easily buffer a series of substrates, which allows a large production of microlaboratories.

Il convient également de considérer la possibilité d'effectuer un mouvement relatif du tampon par rapport au substrat entre chaque coup de tampon. Consideration should also be given to the possibility of making a relative movement of the pad with respect to the substrate between each shot of pad.

Pour la mise en œuvre du procédé de l'invention, les inventeurs ont déterminé qu'il est préférable de prévoir autant de tampons que de sondes 5 de composition différente à tamponner, puis de tamponner une série de substrats 4 en changeant de tampon à chaque fois si l'on ne dispose que d'une machine ou, si l'on dispose d'autant de machines que de sondes 5 à tamponner, tamponner tous les substrats 4 en ligne sur un tapis roulant. L'avantage est que l'on réduit le nombre d'encrage à effectuer sur un tampon, ce qui réduit la consommation en sonde. Il convient de plus de noter que les tampons doivent être nettoyés entre chaque phase d'encrage avec une sonde différente pour éviter toute contamination ; la méthode précédente permet donc de réduire le nombre de lavage d'un tampon.For the implementation of the method of the invention, the inventors have determined that it is preferable to provide as many buffers as probes of different composition to be buffered, then to buffer a series of substrates 4 by changing the buffer each time if one has only one machine or, if one has as many machines as probes 5 to be stamped, stamp all the substrates 4 in line on a treadmill . The advantage is that it reduces the number of inking to be performed on a buffer, which reduces the consumption of probe. It should also be noted that buffers should be cleaned between each inking phase with a different probe to avoid contamination; the previous method thus makes it possible to reduce the number of washings of a buffer.

Le microtamponnage mis en œuvre dans le cadre du procédé de l'invention relève du principe général décrit ci-avant mais adapté aux exigences de dimensionnement réduit des sondes 5 déposées et de leur écartement au fond d'un canal microfluidique 1 de quelques micromètres de largeur et de profondeur. The microtamping implemented in the context of the method of the invention is based on the general principle described above but adapted to the requirements of reduced dimensioning of the deposited probes and their spacing at the bottom of a microfluidic channel 1 of a few micrometers in width and depth.

Les Figures 4A et 4B représentent un mode de microtamponnage de sondes biologiques développé et mis en œuvre dans le cadre du procédé de l'invention pour par exemple, comme représenté sur la Figure 2A ou encore la Figure 6, réaliser une puce biologique 5 à neuf sondes biologiques 7 individuelles et de compositions différentes. FIGS. 4A and 4B show a method for microtamping biological probes developed and implemented in the context of the method of the invention for, for example, as represented in FIG. 2A or again FIG. 6, producing a biological chip 5 to nine biological probes 7 individual and of different compositions.

Trois solutions sont principalement envisageables pour réaliser une telle puce 5 par microtamponnage. La première solution consiste à déposer simultanément les neuf sondes au fond du canal microfluidique 1 en une seule passe de tamponnage à l'aide d'un tampon comportant neuf motifs distincts comme le tampon des Figures 3A et 3B, les neuf motifs étant encrés individuellement avant tamponnage avec une encre adaptée pour réaliser un type de sonde particulier. Three solutions are mainly conceivable for producing such a chip 5 by microtamping. The first solution is to simultaneously deposit the nine probes at the bottom of the microfluidic channel 1 in a single buffering pass with a buffer comprising nine distinct patterns such as the buffer of Figures 3A and 3B, the nine patterns being individually inked before buffering with an ink adapted to perform a particular type of probe.

La deuxième solution consiste à prévoir 9 tampons et à encrer chaque tampon avec une sonde différente puis à procéder à 9 coups de tamponnage par substrat. The second solution is to provide 9 buffers and to ink each pad with a different probe and then 9 shots per substrate.

La troisième solution envisagée pour réaliser une puce biologique à l'intersection d'un canal microfluidique 1 et d'un guide d'onde lumineux 3 conformément à l'invention consiste à utiliser un tampon à motif unique pour déposer une seule sonde 7 à la fois et procéder à 9 coups de tamponnage successifs pour chacune des sondes 7 différentes, le tampon étant décalé d'une distance appropriée à chaque coup de tampon. Cette solution est possible lorsque le motif à réaliser est le même pour toutes les sondes. Les difficultés résultent alors principalement de la précision nécessaire à la mécanique de déplacement et d'application du tampon au fond du canal microfluidique pour respecter l'écartement entre chacune des sondes constituant la puce.The third solution envisaged for producing a biological chip at the intersection of a microfluidic channel 1 and a light waveguide 3 according to the invention consists in using a single-patterned buffer to deposit a single probe 7 at the times and proceed to 9 buffering strokes successive for each of the different probes 7, the buffer being shifted by an appropriate distance to each stroke of buffer. This solution is possible when the pattern to be carried out is the same for all the probes. The difficulties then result mainly from the accuracy required for the movement mechanics and application of the buffer at the bottom of the microfluidic channel to respect the spacing between each of the probes constituting the chip.

Cette solution, est décrite à titre d'exemple plus en détail ci-après en référence aux Figures 4A et 4B. This solution is described by way of example in more detail hereinafter with reference to FIGS. 4A and 4B.

Sur les Figures 4A et 4B est représenté schématiquement un dispositif de microtamponnage 8 destiné à déposer des sondes biologiques 7 dans au moins un canal microfluidique 1 d'une largeur d' comprise entre 1 m et 1 mm, de préférence de l'ordre de 10 à 200 Mm, et d'une profondeur d de l'ordre de 1 Mm à 1 mm, de préférence comprise entre 10 et 100 Mm, formé dans un substrat de verre 4 par l'intermédiaire d'un tampon 9 à motif d'impression 10 unique. FIGS. 4A and 4B show diagrammatically a microtamping device 8 intended to deposit biological probes 7 in at least one microfluidic channel 1 with a width of between 1 m and 1 mm, preferably of the order of 10 at 200 μm, and with a depth d of the order of 1 μm to 1 mm, preferably in the range 10 μm to 100 μm, formed in a glass substrate 4 by means of a patterned pad 9 10 unique printing.

Le dispositif 8 de microtamponnage est stabilisé sur un plan horizontal X, Y et comporte une table 11 de support du substrat et un porte-tampon 12 parallèles entre eux et avec le plan X, Y et mobiles relativement l'un à l'autre selon une direction verticale Z. Le tampon 9 est fixé sur le porte- tampon 12 sans aucun degré de liberté. Il est composé de préférence d'un élastomère tel que du PDMS et comporte un unique motif d'impression 10 s'étendant en saillie sur sa surface d'application 13. La surface s du motif d'impression 10 correspond à la surface d'une sonde 7 de la puce biologique 5 à former au fond du canal microfluidique 1. The microtamping device 8 is stabilized on a horizontal plane X, Y and comprises a substrate support table 11 and a buffer holder 12 parallel to each other and to the X, Y plane and relatively movable relative to one another. a vertical direction Z. The buffer 9 is fixed on the buffer holder 12 without any degree of freedom. It is preferably composed of an elastomer such as PDMS and has a single printing pattern 10 projecting over its application surface 13. The surface of the printing pattern 10 corresponds to the surface area of the printing surface. a probe 7 of the biological chip 5 to be formed at the bottom of the microfluidic channel 1.

Le porte-tampon 12 est constitué d'une plaque 14, par exemple rectangulaire, d'un matériau rigide tel que de l'aluminium ou de l'acier et est monté solidaire d'un mécanisme de translation suivant la direction verticale Z de manière à pouvoir effectuer des mouvements d'application de haut en bas et de retrait de bas en haut du tampon dans le canal microfluidique 1 sur le substrat. Le mécanisme de translation, non représenté sur les Figures 4A, 4B peut notamment comporter un chariot monté coulissant sur des rails verticaux fixés solidement sur un châssis du dispositif 8 de microtampon nage reposant sur le plan horizontal X, Y. Ledit chariot peut être mobilisé le long desdits rails par tout système mécanique ou hydraulique par exemple permettant un déplacement à vitesse et puissance de déplacement contrôlées, et donc de pression d'application du tampon, déterminées.The buffer holder 12 consists of a plate 14, for example rectangular, of a rigid material such as aluminum or steel and is mounted integral with a translation mechanism in the vertical direction Z so to be able to perform upward and downward application movements of the buffer in the microfluidic channel 1 on the substrate. The translation mechanism, not shown in FIGS. 4A, 4B, may notably comprise a carriage slidably mounted on rails vertical members securely fixed to a frame of the device 8 microtampon swimming resting on the horizontal plane X, Y. said carriage can be mobilized along said rails by any mechanical or hydraulic system for example allowing movement at a controlled speed and power displacement, and therefore of application pressure of the buffer, determined.

La table 11 de support du substrat 4 est quant à elle également constituée d'une plaque 15 de matériau rigide tel que de l'aluminium ou l'acier, ou encore une céramique par exemple. Elle est par ailleurs déplaçable en translation dans le plan X, Y par des actionneurs micrométriques (non représentés) afin de pouvoir positionner le substrat 4 sous le motif d'impression 10 du tampon 9 en différentes positions afin de réaliser la puce 5 multisondes souhaitée. De manière avantageuse, lorsque le tampon comporte plus d'un motif, des rotations peuvent être prévues pour aligner plus facilement le tampon avec les canaux microfluidiques du substrat. The support table 11 of the substrate 4 is itself also constituted by a plate 15 of rigid material such as aluminum or steel, or a ceramic for example. It is also movable in translation in the X, Y plane by micrometric actuators (not shown) in order to position the substrate 4 under the print pattern 10 of the buffer 9 in different positions in order to achieve the desired multisonde chip 5. Advantageously, when the buffer has more than one pattern, rotations may be provided to more easily align the buffer with the microfluidic channels of the substrate.

La table 11 de support du substrat 4 est également montée réglable en hauteur sur des butées 16 réglables à vis. The support table 11 of the substrate 4 is also mounted height-adjustable on 16 screw-adjustable stops.

Les butées 16 ont une fonction propre de butées d'arrêt du porte- tampon 12 comme cela ressort particulièrement de la Figure 4B. En effet, les butées 16 réglables comportent chacune une tige verticale formée d'une vis micrométrique 17 qui s'étend en saillie selon une direction parallèle à l'axe Z au travers de la table 11 de support du substrat. La partie des vis 17 s'étendant en saillie au dessus de la paroi supérieure de la table 11 de support présente une hauteur D supérieure à l'épaisseur du substrat 4. Cette hauteur D dépend bien entendu de la hauteur de réglage de la table 11 de support du substrat. En pratique, cette hauteur D détermine la hauteur de réglage de la table de support 11. En effet, D est choisie de sorte que le porte-tampon 12 vienne appuyer en butée sur les extrémités 18 des tiges des butées réglables 16 lors de l'application du tampon 9 au fond du canal microfluidique 1 du substrat 4 et donc de la descente du porte-tampon 12. Cet appui du porte-tampon 12 en butée sur l'extrémité supérieure des butées 16 n'intervient avantageusement qu'après un très léger écrasement du motif d'impression 10 du tampon 9 dans le canal microfluidique 1 mais sans contact de la surface d'application du tampon contre la surface supérieure du substrat 4, comme représenté sur la Figure 4B. Grâce à cet arrangement de butées 16, il est possible de régler très précisément la pression d'application du tampon 9 dans le canal microfluidique 1.The stops 16 have a specific function stop stops buffer holder 12 as is particularly apparent from Figure 4B. Indeed, the adjustable stops 16 each comprise a vertical rod formed of a micrometer screw 17 which protrudes in a direction parallel to the Z axis through the support table 11 of the substrate. The portion of the screws 17 projecting above the upper wall of the support table 11 has a height D greater than the thickness of the substrate 4. This height D of course depends on the height of adjustment of the table 11 substrate support. In practice, this height D determines the height of adjustment of the support table 11. Indeed, D is chosen so that the buffer holder 12 comes abutting against the ends 18 of the rods of the adjustable stops 16 when the application of the buffer 9 at the bottom of the microfluidic channel 1 of the substrate 4 and thus the descent of the buffer holder 12. This support of the buffer holder 12 abuts on the upper end of the stops 16 does not intervene advantageously after a very slight crushing of the printing pattern 10 of the buffer 9 in the microfluidic channel 1 but without contact of the pad application surface against the upper surface of the substrate 4, as shown in Figure 4B. With this arrangement of stops 16, it is possible to very precisely adjust the application pressure of the buffer 9 in the microfluidic channel 1.

Les butées 16 ont donc une double fonction : elles servent de butées d'arrêt du porte-tampon et elles permettent de contrôler la pression appliquée sur le tampon. The stops 16 therefore have a dual function: they serve as stopping abutments of the buffer holder and they allow to control the pressure applied to the buffer.

Pour un canal microfluidique 1 de profondeur d suffisante pour un bon écoulement de fluides (par exemple un profondeur de l'ordre de 10 Mm), il faut utiliser un tampon 9 dont le motif d'impression 10 présente une hauteur h supérieure à la profondeur d (soit par exemple h = 15 Mm) et comprimer le tampon de façon à ce que la nouvelle hauteur h' de la saillie soit supérieure ou égale à d pour ne déposer la sonde 7 qu'au fond du canal 1 (soit par exemple h' = 12,5 M^m)- Ainsi, même si toute la surface du tampon est entièrement encrée avec la sonde, un espacement est aménagé entre le tampon et le substrat en dehors du motif d'impression, de sorte que le transfert de l'encre n'est assuré qu'au contact du motif avec le fond du canal.For a microfluidic channel 1 of sufficient depth for a good flow of fluids (for example a depth of the order of 10 mm), it is necessary to use a buffer 9 whose printing pattern 10 has a height h greater than the depth d (ie for example h = 15 mm) and compress the buffer so that the new height h 'of the projection is greater than or equal to d to deposit the probe 7 only at the bottom of the channel 1 (for example h '= 12.5 M^m ). Thus, even though the entire surface of the pad is fully inked with the probe, spacing is provided between the pad and the substrate outside the printing pattern, so that the transfer of the ink is assured only in contact with the pattern with the bottom of the channel.

De façon connue dans le domaine du microtamponnage, il est nécessaire que la largeur s du motif d'impression 10 soit sensiblement égale à sa hauteur h faute de quoi le motif d'impression est écrasé lors du contact. Autrement dit, si le motif d'impression 10 est trop haut, le tampon 9 en élastomère ne conserve pas sa forme lors de l'application et il s'effondre. C'est notamment le cas, si l'on veut une sonde 7 de surface 1 Mm² avec h égal à 15 Mm.In known manner in the field of microtamponnage, it is necessary that the width s of the printing pattern 10 is substantially equal to its height h otherwise the printing pattern is overwritten during the contact. In other words, if the printing pattern 10 is too high, the elastomeric pad 9 does not retain its shape during application and collapses. This is particularly the case, if one wants a probe 7 of surface 1 Mm² with h equal to 15 Mm.

Ce réglage est d'autant plus difficile que : This setting is even more difficult than:

- le canal 1 est profond (h grand), ce qui est nécessaire pour un bon écoulement des fluides, et que - channel 1 is deep (h large), which is necessary for a good flow of fluids, and that

- la surface des sondes 7 de puce est faible, ce qui est utile pour une bonne sensibilité. - The surface of chip probes 7 is low, which is useful for good sensitivity.

Pour vaincre ces contraintes contradictoires, selon une variante avantageuse, les inventeurs proposent dans le cadre du procédé de la présente invention d'utiliser un tampon 9' dur, en silicium par exemple, et comportant, au niveau de l'extrémité du motif d'impression 10 et de hauteur h"i, une tête d'impression 19 de PDMS sensiblement cubique et de hauteur h"₂, comme représenté schématiquement sur la Figure 5 A. Ainsi, il est possible de tamponner n'importe quelle sonde biologique 7 au fond d'un canal microfluidique 1 par microtamponnage à l'air sans subir les limites structurelles précédemment évoquées pour les motifs 10 de tampon intégralement en PDMS (Figure 5 B). Un tel tampon 9' de nature "mixte" ne peut pas s'effondrer dans la mesure où seule la tête d'impression 19 du motif du tampon est constituée d'élastomère. La hauteur h"₂ de la tête d'impression 19 de PDMS peut ainsi être réduite à 1 Mm et sa largeur également, même si la hauteur totale h" du motif est elle de 15 Mm ou plus. De façon générale, la tête d'impression 19 en PDMS peut présenter une hauteur et une largeur comprises entre 0,5 et 500 μπ\, et de préférence comprise entre 1 et 100 MmIn order to overcome these contradictory constraints, according to an advantageous variant, the inventors propose, in the context of the method of the present invention, to use a 9 'hard buffer, made of silicon for example, and comprising, at the end of the printing pattern 10 and height h "i, a substantially cubic PDMS print head 19 and height h"₂ , as shown schematically in FIG. 5 A. Thus, it It is possible to buffer any biological probe 7 at the bottom of a microfluidic channel 1 by air microtamping without suffering the structural limitations previously mentioned for the fully PDMS buffer patterns (Figure 5B). Such a 9 'buffer of "mixed" nature can not collapse, since only the print head 19 of the stamp pattern is made of elastomer. The height h "₂ of the PDMS print head 19 can thus be reduced to 1 μm and its width also, even if the total height h" of the pattern is 15 mm or more. In general, the PDMS print head 19 may have a height and a width of between 0.5 and 500 μm, and preferably between 1 and 100 μm.

II est ainsi possible de déposer des sondes biologiques de 1 à 5 Mm de large dans un canal microfluidique d'une largeur de 30 Mm environ avec un écartement approprié de 1 à 5 μιτι entre chaque sonde pour former par exemple une puce biologique à 9 sondes comme représenté sur la Figure 2 ainsi que sur la Figure 6 qui représente un laboratoire biologique sur puce tel qu'obtenu par mise en œuvre du procédé de l'invention. It is thus possible to deposit biological probes of 1 to 5 Mm wide in a microfluidic channel of a width of approximately 30 Mm with a suitable spacing of 1 to 5 μιτι between each probe to form, for example, a 9-probe biological chip as represented in FIG. 2 as well as in FIG. 6 which represents a biological on-chip laboratory as obtained by implementing the method of the invention.

Sur la Figure 6, le laboratoire comporte un canal microfluidique 1 qui intersecte trois guides d'ondes lumineux 3 orientés perpendiculairement au canal microfluidique 1. Ces guides lumineux 3 sont parallèles entre eux et se rejoignent tous trois à leur entrée pour former un guide d'introduction 20 d'un faisceau laser d'excitation E. In FIG. 6, the laboratory comprises a microfluidic channel 1 which intersects three light waveguides 3 oriented perpendicularly to the microfluidic channel 1. These light guides 3 are parallel to each other and all join at their entrance to form a guide. introduction of an excitation laser beam E.

A l'intersection 6 de chaque guide d'onde lumineux 3 avec le canal microfluidique 1 est formé une biopuce 5 composée de 9 sondes biologiques 7 déposées les unes à côté des autres au fond du canal microfluidique 1 par microtamponnage à l'aide d'un dispositif 8 et d'un tampon 9, 9' tels que décrits aux Figures 4A, 4B et 5. Chaque sonde 7 de chaque biopuce 5 formée présente une largeur comprise entre 1 à 5 Mm², et lesdites sondes sont également séparées entre elles d'une même distance comprise entre 1 et 5 Mm.At the intersection 6 of each light waveguide 3 with the microfluidic channel 1 is formed a biochip 5 composed of 9 biological probes 7 deposited next to each other at the bottom of the microfluidic channel 1 by microtamping with the help of a device 8 and a buffer 9, 9 'as described in Figures 4A, 4B and 5. Each probe 7 of each biochip 5 formed has a width of between 1 to 5 Mm² , and said probes are also separated from each other by the same distance of between 1 and 5 Mm.

Une telle configuration de laboratoire biologique à puce présente l'avantage d'être plus sensible que les biopuces à sonde unique. En effet, la limite de détection de chacune des biopuces est plus basse car la surface de la puce est réduite à l'aire de l'intersection canal microfluidique-guide d'onde. Such a configuration of a biological laboratory chip has the advantage of being more sensitive than single probe biochips. Indeed, the detection limit of each of the biochips is lower because the surface of the chip is reduced to the area of the intersection microfluidic channel waveguide.

Une fois la ou les sondes 7 constituant la ou les biopuces 5 du laboratoire réalisé déposée(s) par microtamponnage, il convient pour terminer le laboratoire de refermer le canal microfluidique 1 et pour ce faire on dépose une couverture de fermeture sur la face du substrat de verre dans laquelle le canal microfluidique a été formé. Une telle couverture de fermeture peut notamment être constituée, par exemple, d'une lame de verre collée sur la surface supérieure du microlaboratoire ou encore une plaque en polymère COC, ou de PDMS. Once the probe (s) 7 constituting the biochip (s) 5 of the produced laboratory deposited (s) microtamponnage, it is appropriate to complete the laboratory to close the microfluidic channel 1 and to do this is deposited a closure cover on the face of the substrate of glass in which the microfluidic channel has been formed. Such a closure cover may in particular consist of, for example, a glass slide bonded to the upper surface of the microlaboratory or a COC polymer plate, or PDMS.

La présente invention propose également un procédé d'étalonnage optique des biopuces 5 tamponnées à l'intérieur du ou des canaux microfluidiques 1 des laboratoires fabriqués. The present invention also provides a method for optical calibration of biochips buffered within the microfluidic channel (s) 1 of the laboratories manufactured.

La calibration optique consiste principalement à évaluer la réponse en fluorescence des sondes 7 de type s2 des biopuces 5 déposées dans les canaux microfluidiques 1 au regard de sondes étalons de type si* connues, disposées à coté de sondes si, pour ensuite pouvoir lors des analyses effectuées corriger les variations d'énergie excitatrice incidente sur les sondes s2. The optical calibration mainly consists of evaluating the fluorescence response of the s2-type probes 7 of the biochips 5 deposited in the microfluidic channels 1 with respect to standard probes of known * type, arranged next to probes if, to then be able to be analyzed. performed to correct the exciter energy variations incident on the probes s2.

Cette calibration doit pouvoir notamment prendre en compte les points suivants : This calibration must be able to take into account the following points:

1) La puissance de la lumière excitatrice qui arrive sur une sonde donnée peut varier entre une biopuce et une autre. 1) The power of the excitatory light that arrives on a given probe can vary between one biochip and another.

2) La puissance de la lumière excitatrice n'est pas identique sur les différentes sondes d'une même biopuce. 2) The power of the excitatory light is not identical on the different probes of the same biochip.

De plus, même si, sur une sonde donnée, la lumière excitatrice est la même entre une biopuce et une autre, il n'est pas évident que toutes les sondes de la deuxième biopuce reçoivent la même proportion de lumière que dans la première biopuce.Moreover, even if, on a given probe, the excitatory light is the same between one biochip and another, it is not obvious that all probes of the second biochip receive the same proportion of light as in the first biochip.

Il faut donc que les différences du signal d'excitation de fluorescence de sondes soient corrigées entre les différentes biopuces, ainsi qu'entre les sondes d'une même biopuce. It is therefore necessary that the differences in the fluorescence excitation signal of probes are corrected between the different biochips, as well as between the probes of the same biochip.

Comme cela a précédemment été exposé, les sondes biologiques constituant la ou les biopuces déposées dans un canal microfluidique d'un laboratoire d'analyse biologique sur puce réalisé selon la présente invention sont localisées à au moins une intersection entre un guide d'onde lumineux et le canal microfluidique. As previously discussed, the biological probes constituting the microchip or microchips deposited in a microfluidic channel of a biological on-chip analysis laboratory produced according to the present invention are located at at least one intersection between a light waveguide and the microfluidic channel.

Les guides optiques sont reliés à leur entrée à une source lumineuse laser destinées à exciter les sondes biologiques. Un dispositif optique, comportant de préférence un capteur optique de type CCD très sensible et de très haute résolution spatiale et dont l'axe optique est perpendiculaire à la surface de la ou des sonde(s) biologiques permet de détecter la fluorescence émise par les sondes pour en établir un signal d'analyse exploitable. The optical guides are connected at their input to a laser light source for exciting the biological probes. An optical device, preferably comprising a very sensitive CCD type optical sensor of very high spatial resolution and whose optical axis is perpendicular to the surface of the biological probe (s), makes it possible to detect the fluorescence emitted by the probes. to establish an exploitable analysis signal.

Selon une variante, le capteur CCD du dispositif optique peut être remplacé par des photodiodes (ou autre capteur optique équivalent discret) qui seront disposées en regard des intersections entre les guides optiques et les canaux microfluidiques. Des microlentilles peuvent alors être disposées dans la lame de verre fermant le laboratoire et disposées en regard des photodiodes de façon à collecter avec efficacité la fluorescence émise. Le couvercle et les microlentilles peuvent par exemple être fabriqués de manière très économique dans du polymère COC de façon à former avec le laboratoire un dispositif jetable. Les photodiodes peuvent par exemple être fabriquées dans un substrat silicium, qui peut faire partie ou pas du dispositif jetable. Des filtres optiques de filtration travaillant dans la gamme de longueurs d'onde de fluorescence des fluorophores sont aussi prévus. According to one variant, the CCD sensor of the optical device may be replaced by photodiodes (or other discrete equivalent optical sensor) which will be arranged opposite the intersections between the optical guides and the microfluidic channels. Microlenses can then be placed in the glass slide closing the laboratory and arranged facing the photodiodes so as to efficiently collect the emitted fluorescence. The cover and the microlenses can for example be very economically manufactured in COC polymer so as to form a disposable device with the laboratory. The photodiodes may for example be manufactured in a silicon substrate, which may or may not be part of the disposable device. Filtration optical filters working in the fluorescence wavelength range of the fluorophores are also provided.

Le procédé d'étalonnage et de mesure de la présente invention va être décrit ci-après en référence aux Figures 7A et 7B, qui représentent à titre d'exemple une biopuce comportant 2 triplets de plots déposées au fond d'un canal microfluidique, à deux intersections consécutives dudit canal microfluidique avec deux guides d'onde lumineux, soit (sli, s2i, s3i) et (sl_z, s2_z, s3_z).The calibration and measurement method of the present invention will be described hereinafter with reference to FIGS. 7A and 7B, which represent by way of example a biochip comprising 2 triplets of pads deposited at the bottom of a microfluidic channel, at two consecutive intersections of said channel microfluidic with two light waveguides, or (sli, S2i, S3I) and (sl_z,z s2, s3_z).

Les sondes si (si_z= i à w) sont destinées à la calibration du laboratoire et du dispositif optique de mesure (les Figures 7 A et 7B correspondant au cas w=2). Ces sondes si sont marquées avec une même quantité d'un fluorophore déterminé qui donne toujours une réponse quand il est excité par un faisceau laser transmis par les guides d'onde lumineux. La molécule marquée par un fluorophore, qui est utilisée pour réaliser les sondes si, ne rentre pas en réaction avec les produits chimiques qui sont injectés dans le canal microfluidique. Les signaux de fluorescence émis par les sondes si dépendent donc uniquement de l'intensité locale du signal lumineux d'excitation. En mesurant l'intensité du signal de fluorescence émis par les sondes si, (si_z= i à w) on détermine ainsi quantitativement une valeur d'intensité du signal d'excitation, qui arrive sur tous les plots d'un même voisinage.The probes si (if_z = i to w) are intended for the calibration of the laboratory and the optical measurement device (FIGS. 7A and 7B corresponding to the case w = 2). These probes are labeled with the same amount of a given fluorophore which always gives an answer when it is excited by a laser beam transmitted by the light waveguides. The fluorophore-labeled molecule, which is used to make probes if, does not react with the chemicals that are injected into the microfluidic channel. The fluorescence signals emitted by the probes therefore depend only on the local intensity of the excitation light signal. By measuring the intensity of the fluorescence signal emitted by the probes if, (if_z = i to w), a quantity of intensity of the excitation signal is thus quantitatively determined, which arrives on all the pads of the same neighborhood.

Les sondes s2 (s2_z= i à_w,) comportent par exemple des sondes connues d'ADN sensibles à des cibles d'ADN F* dont on souhaite déterminer la présence. Les cibles en question se trouvent dans une solution de fluide biologique à tester, provenant par exemple d'un sérum sanguin. Le fluide biologique est traité, de préférence, par des microdispositifs fluidiques intégrés au microlaboratoire sur puce, de façon à marquer les cibles F* avec un fluorophore (par exemple le même fluorophore qui a servi à marquer les sondes sl).The probes s 2 (s 2_{z =} 1 to_{w 1} ) comprise, for example, known DNA probes sensitive to F * DNA targets whose presence is desired to be determined. The targets in question are in a solution of biological fluid to be tested, for example from a blood serum. The biological fluid is preferably treated with fluidic micro-devices integrated in the on-chip microlab, so as to mark the F * targets with a fluorophore (for example the same fluorophore that was used to mark the sl probes).

Lorsque la solution à tester est injectée dans le canal microfluidique, les cibles F* marquées du fluorophore sont piégées par les sondes s2_z= i à w En conséquence, l'une (ou plusieurs) sondes s2_z= i à_w émet(ent) un signal de fluorescence, ce qui permet d'identifier la cible. Si les sondes s2 (s2_z= i à w) n'émettent pas de signal de fluorescence, cela signifie que les cibles correspondantes ne sont pas ou plus présentes dans la solution testée.When the test solution is injected into the microfluidic channel, the labeled F * targets of the fluorophore are trapped by the probes s2_z = i to w As a consequence, one (or more) probes s2_{z =} i to_w emit ) a fluorescence signal, which makes it possible to identify the target. If the probes s2 (s2_z = 1 to w) do not emit a fluorescence signal, this means that the corresponding targets are not or no longer present in the tested solution.

Les sondes s3, (s3_z= i à w), quant à elles sont utilisées, comme les sondes si, (si_z= i à w), pour étalonner le système de mesure. Elles comportent toutes une molécule, par exemple une sonde d'ADN, différente des sondes si, (si_z= i à w), et s2, (s2_z= i à_w), qui ne correspond pas à un ADN que l'on souhaite identifier dans la solution testée. Au contraire, une cible ADN complémentaire des sondes s3, (s3_z= i à w), est ajoutée dans une concentration bien définie dans la solution testée et injecté avec elle dans le canal microfluidique. Cette cible complémentaire des sondes s3, que l'on peut appeler d'étalonnage, est également marquée avec un fluorophore. Dans le cas d'une biopuce idéale, les sondes s3, (s3_z= i à w), devraient donner le même signal de fluorescence aux deux intersections du canal microfluidique avec les guides d'onde lumineux. Il existe cependant de nombreuses raisons pour que cela ne soit pas le cas.The probes s3, (s3_z = i to w), as for them are used, as the probes si, (if_z = i to w), to calibrate the measurement system. They all include a molecule, for example a DNA probe, different probes if, (if_z = i to w), and s2, (s2_{z =} i to_w ), which does not correspond to a DNA that one wishes to identify in the tested solution. In contrast, a DNA target complementary to the s3 probes, (s3_z = 1 to w), is added in a well-defined concentration in the test solution and injected with it into the microfluidic channel. This complementary target of s3 probes, which may be called calibration, is also labeled with a fluorophore. In the case of an ideal biochip, the s3 probes, (s3_z = i to w), should give the same fluorescence signal at both intersections of the microfluidic channel with the light waveguides. There are, however, many reasons for this not to be the case.

Les sondes si, (si_z= i à w), sont sensibles à l'intensité locale de la lumière excitatrice, qui peut varier en raison de fluctuation du laser, d'imperfection d'injection de la lumière laser dans les guides d'onde lumineux, d'imperfections des jonctions Y qui divise les guides d'onde lumineux etc.. Les sondes s3, (s3_z= i à w), sont, elles, sensibles à des non- uniformités «microfluidiques» dans le canal (uniformité du mélange, variation de concentration locale des antigènes dans la longueur du canal, différences de débits entre deux canaux microfluidiques etc....).The probes si, (if_z = i to w), are sensitive to the local intensity of the excitatory light, which can vary due to laser fluctuation, laser injection light imperfection in the guides. light wave, imperfections of the Y junctions which divide the light waveguides etc. The probes s3, (s3_z = i to w), are sensitive to non-uniformities "microfluidic" in the channel ( uniformity of the mixture, variation of local concentration of antigens in the length of the channel, differences in flow rates between two microfluidic channels, etc.).

On considère ensuite les valeurs 11₁, I2i et I3i de fluorescence émise respectivement par les plots sli, s2i et s3i de l'intersection 6i, et les valeurs Il_z, I2_z et I3_z de fluorescence émise par les plots sl_z, s2_z et s3_z de l'intersection 6_z. Une comparaison des niveaux d'interaction biomoléculaire de la cible F* avec les sondes s2i et s2_z donne une information sur la composition de la sonde. Cette reconnaissance peut néanmoins être faussée par une différence de lumière incidente et/ou de quantité de matière passant sur les plots.The fluorescence values 11₁ , I 2 and I 3 i respectively emitted by the pads s11, s2i and s3i of the intersection 6i, and the values Il_z , I2_z and I3_z of fluorescence emitted by the pads sl_z , s2 are then considered._z and s3_z from the intersection 6_z . A comparison of the biomolecular interaction levels of the target F * with the probes s2i and s2_z gives information on the composition of the probe. This recognition can nevertheless be distorted by a difference in incident light and / or quantity of material passing over the pads.

Nous allons ci-dessous décrire la calibration d'un microlaboratoire sur puce qui comporte à titre d'exemple un nombre w de triplets des sondes. Below we will describe the calibration of a micro-laboratory on a chip which includes as an example a number w of triplets of the probes.

L'étalonnage des triplets comporte logiquement trois étapes. Triplet calibration logically involves three steps.

Dans une première étape, on vérifie l'uniformité de la lumière excitatrice qui arrive sur chacun des w triplets. Des non-uniformités de lumière incidente sur les triplets sont détectées par leur répercussion sur la non uniformité de l'intensité de fluorescence émise par les plots si_z= i à w, les valeurs II_z= i à w, qui ne sont pas égales.In a first step, the uniformity of the excitation light that arrives on each of the w triplets is verified. Non-uniformities of light incident on the triplets are detected by their repercussion on the non-uniformity of the fluorescence intensity emitted by the pads if_z = i to w, the values II_z = i to w, which are not equal.

En prenant comme référence le premier triplet, on peut calculer, les rapports : Il_z= i à w / 111- Différents critères de qualité peuvent être introduits par l'utilisateur, concernant l'uniformité de la lumière excitatrice.Taking as reference the first triplet, we can calculate, the ratios: Il_z = i to w / 111- Different quality criteria can be introduced by the user, concerning the uniformity of the excitatory light.

On considère dans le cadre de l'invention comme corrigeables les résultats obtenu avec les rapports II_z= i à w / Hi situés dans la gamme de 10 à 0,1, de préférence entre 2 et 0,5. En d'autres termes, si au moins un des rapportsWithin the scope of the invention, the results obtained with the ratios II_z = 1 to w / Hi lying in the range of 10 to 0.1, preferably between 2 and 0.5, are considered as being correctable. In other words, if at least one of the reports

Il_z= î à w / H i est supérieur à 10 ou inférieur à 0,1, le microlaboratoire sur puce est considéré comme non-utilisable. Si les rapports II_z= i à w / 111 sont tous dans la gamme de 10 à 0,1, les résultats d'analyse peuvent être corrigés, comme cela sera expliqué ci-dessous.If_z = 1 at w / H i is greater than 10 or less than 0.1, the micro-laboratory on a chip is considered as non-usable. If the ratios II_z = i to w / 111 are all in the range of 10 to 0.1, the analysis results can be corrected, as will be explained below.

Ensuite, dans une seconde étape, on vérifie l'uniformité Then, in a second step, we check the uniformity

« microfluidique » de flux des molécules qui arrivent sur chacun des w triplets."Microfluidic" flow of the molecules that arrive on each w triplets.

Différents critères de qualité peuvent aussi être introduits par l'utilisateur, concernant l'uniformité « microfluidique » des microlaboratoires sur puce. En prenant comme référence la sonde s3 de la première rangée de plots, c'est-à-dire, la sonde s3i sur la Figure 7 A, on peut calculer le rapport 13_z= i à w / I3i. Ce rapport exprime la non-uniformité « microfluidique ».Different quality criteria can also be introduced by the user, concerning the "microfluidic" uniformity of micro-laboratories on a chip. Taking as reference the probe s3 of the first row of pads, that is to say, the probe s3i in Figure 7 A, we can calculate the ratio 13_z = i to w / I3i. This report expresses the "microfluidic" non-uniformity.

Les résultats considérés comme corrigeables couvre la gamme des rapports 13_z= i à w / 131 compris entre 10 et 0,1. En d'autres termes, si au moins un rapport 13_z= i à w / I3i est supérieur à 10 ou inférieur à 0,1, le microlaboratoire sur puce est considéré comme non utilisable. Si en revanche les rapports 13_z= i à w / 131 sont tous dans la gamme de 10 à 0,1 (de préférence dans la gamme de 2 à 0,5), les résultats d'analyse peuvent être corrigés.The results considered to be correctable cover the range of ratios 13_z = i to w / 131 of between 10 and 0.1. In other words, if at least one ratio_z = i to w / I3i is greater than 10 or less than 0.1, the on-chip micro-laboratory is considered as not usable. If, on the other hand, the ratios_z = i to w / 131 are all in the range of 10 to 0.1 (preferably in the range of 2 to 0.5), the analysis results can be corrected.

Une dernière étape consiste à corriger la valeur du niveau de fluorescence 12_z= i à_w mesurée.A final step is to correct the value of the fluorescence level 12_z = i to_w measured.

La calibration a pour objectif de corriger les niveaux de fluorescence The calibration aims to correct the fluorescence levels

I2_Z=2 à w par rapport à I2i. Pour ce faire on définit à w comme étant la valeur du niveau de fluorescence du plot à w après correction (avec comme cas particulier I2CORi = I2i ; ce qui revient à étudier la réponse de la puce en prenant comme référence relative le premier triplet).I2_Z = 2 to w relative to I2i. To do this, we define w as the value of the fluorescence level of the pad at w after correction (with the special case I2CORi = I2i, which amounts to studying the response of the chip by taking the first triplet as a relative reference).

L'objectif de la calibration est de déterminer les w-1 valeurs The purpose of the calibration is to determine the w-1 values

I2COR_z=₂ à w à partir des données expérimentales, c'est-à-dire les niveaux de fluorescence des plots de tous les triplets.I2COR_z =₂ to w from the experimental data, ie the fluorescence levels of the pads of all the triplets.

Le procédé de calibration selon l'invention consiste à prendre comme valeur corrigée du niveau de fluorescence du plot s2_z du triplet (si, s2, s3)_z pour z variant de 2 à w, la valeur suivante :The calibration method according to the invention consists in taking as corrected value the fluorescence level of the pad s2_z of the triplet (si, s2, s3)_z for z varying from 2 to w, the following value:

I2COR_z= 2 à w = (Il_z= 2 à w /111) x (I3_Z= 2 à w / I3i) x I2_{Z= 2} à wI2COR_z = 2 to w = (II_z = 2 to w / 111) x (I3_Z = 2 to w / I3i) x I2_{Z = 2} to w

Les exemples qui vont suivre permettent une meilleure compréhension du principe de calibration selon l'invention.The following examples allow a better understanding of the calibration principle according to the invention.

Exemple 1 : le triplet 2 reçoit deux fois plus de lumière excitatrice que le triplet 1.

Example 1: triplet 2 receives twice as much exciting light as triplet 1.

Le niveau de fluorescence corrigé I2COR₂ du plot 2 du triplet 2 est doncThe level of corrected fluorescence I2COR₂ of plot 2 of triplet 2 is therefore

I2COR₂ = (1 /0,5) x (1 / 1) x 1,5 = 3 et non plus 1,5.I2COR₂ = (1 / 0.5) x (1/1) x 1.5 = 3 and not 1.5.

Ainsi après correction, le niveau de fluorescence du plot 2 du triplet 2 est supérieur et non pas inférieur au niveau de fluorescence du plot 2 du triplet 1. Cela revient à inverser la réponse de la puce. Thus, after correction, the fluorescence level of pad 2 of triplet 2 is greater and not less than the fluorescence level of pad 2 of triplet 1. This amounts to reversing the response of the chip.

Exemple 2 : le triplet 2 reçoit deux fois moins de produit biologique que le triplet 1 et la réponse des plots 2 est apparemment la même.

Le niveau de fluorescence corrigé I2COR₂ du plot 2 du triplet 2 est doncExample 2: Triplet 2 receives half as much biological product as triplet 1 and the response of pads 2 is apparently the same.

The level of corrected fluorescence I2COR₂ of plot 2 of triplet 2 is therefore

I2COR₂ = (1 /l) x (1 / 2) x 2 = 1 et non plus 2.I2COR₂ = (1 / l) x (1/2) x 2 = 1 and no longer 2.

Ainsi le niveau de fluorescence du plot 2 du triplet 2 doit être divisé par deux pour tenir compte de la variation de débit microfluidique. Thus, the fluorescence level of pad 2 of triplet 2 must be halved to take into account the variation of microfluidic flow.

Exemple 3:

Example 3

Le niveau de fluoresence corrigé I2COR₂ du plot 2 du triplet 2 est donc I2COR₂ = (0,25 /0,5) x (1,5 / 3) x 1 = 0,25 et non plus 1.The level of corrected I2COR₂ fluorescence of pad 2 of triplet 2 is therefore I2COR₂ = (0.25 / 0.5) x (1.5 / 3) x 1 = 0.25 and no longer 1.

Après calibration, la fluorescence du plot 2 du triplet 2 est inférieure d'un facteur 2 à celle du plot 1 du triplet et non pas supérieure d'un facteur 2. La réponse biologique de la puce est donc inversée. After calibration, the fluorescence of pad 2 of triplet 2 is 2 times less than that of pad 1 of the triplet and not greater by a factor of 2. The biological response of the chip is therefore reversed.

La cible est « plus » reconnue par le plot 2 du triplet 2 que par le plot 2 du triplet 1. On en peut en déduire une information sur la composition chimique de la cible selon des techniques classiques d'analyse de puces à ADN (voir par exemple J.-C. Brès, Y. Mérieux, V. Dugas, J. Broutin, E Vnuk, M. Jaber, D. Rigal, J.R. Martin, E Souteyrand, M. Cabrera, J.P. Cloarec, New method for DNA Microarrays Development: Applied to Human Platelet Antigens Polymorphisms, Biomédical Microdevices 7:2, 137-141, 2005). The target is "more" recognized by the pad 2 of the triplet 2 than by the pad 2 of the triplet 1. This can be deduced from the information on the chemical composition of the target according to conventional techniques for analyzing DNA chips (see FIG. for example J.-C. Brès, Y. Mérieux, V. Dugas, J. Broutin, E Vnuk, M. Jaber, D. Rigal, JR Martin, E Souteyrand, M. Cabrera, JP Cloarec, New method for DNA Microarrays Development: Applied to Human Platelet Antigens Polymorphisms, Biomedical Microdevices 7: 2, 137-141, 2005).

Dans ce qui précède, on a considéré pour simplifier que tous les plots des sondes ont la même géométrie (et notamment une même surface), qu'ils ont été tamponnés avec un même nombre de biomolécules, que tous les rendements d'interactions biomoléculaires sont égaux, que toutes les interactions sont indépendantes entre des biomolécules différentes et que tous les rendements de fluorescence sont égaux; l'homme de l'art sachant apporter les corrections nécessaires à ce qui précède si les conditions énoncées ci-dessus ne sont pas totalement remplies dans la pratique, toutes les variantes de la formule 1 et de la formule 2 font donc partie intégrante de l'invention. Une grande quantité de mesures est indispensable pour aboutir à des relations expérimentales entre les signaux de fluorescence des sondes si, s2 et s3 et les concentrations recherchées de cibles. Un traitement informatique des données peut rendre ensuite la mesure fiable et plus facile.In the foregoing, it has been considered to simplify that all the probes of the probes have the same geometry (and in particular the same surface), that they have been buffered with the same number of biomolecules, that all the biomolecular interaction yields are equal, that all interactions are independent between different biomolecules and that all fluorescence yields are equal; those skilled in the art knowing how to make the necessary corrections to the foregoing if the conditions set out above are not fully met in practice, all the variants of formula 1 and formula 2 are therefore an integral part of the process. 'invention. A large quantity of measurements is essential to achieve experimental relations between the fluorescence signals of the probes si, s2 and s3 and the desired target concentrations. Computer processing of the data can then make the measurement reliable and easier.

L'excitation de la fluorescence des sondes si, s2 et s3 peut être réalisée de deux manières : avec une seule source lumineuse d'excitation E telle qu'un laser par exemple comme déjà évoqué ou avec plusieurs sources lumineuses d'excitation pour chaque guide d'onde lumineux 3 particulier intersectant un canal microfluidique 1. The excitation of the fluorescence of the probes si, s2 and s3 can be carried out in two ways: with a single excitation light source E such as a laser for example as already mentioned or with several excitation light sources for each guide of particular light wave intersecting a microfluidic channel 1.

L'utilisation d'une source lumineuse unique n'est envisageable que si l'on dispose d'un capteur optique d'analyse dont la résolution spatiale permet de différentier toutes les sondes formant une biopuce à une intersection considérée d'un laboratoire. On peut ainsi utiliser le même fluorophore pour marquer toutes les sondes déposées. The use of a single light source is only possible if there is an optical analysis sensor whose spatial resolution makes it possible to differentiate all the probes forming a biochip at a considered intersection of a laboratory. It is thus possible to use the same fluorophore to mark all the probes deposited.

Si la résolution spatiale du capteur optique d'analyse n'est pas suffisante, il faut alors utiliser plusieurs sources lumineuses d'excitation. Dans l'exemple des Figures 7A et 7B, il faut alors utiliser trois fluorophores différents fonctionnant à trois bandes de longueurs d'onde différentes d'excitation et d'émission pour marquer chacune des sondes si, s2, s3. La récolte et l'exploitation des signaux de fluorescence des sondes nécessite alors l'emploi d'un filtre interférentiel disposé entre chacune des puces et le capteur optique d'analyse pour distinguer l'émission provenant de chaque type de sonde si, s2 ou s3 en allumant/éteignant la source lumineuse correspondante. If the spatial resolution of the optical analysis sensor is not sufficient, then several excitation light sources must be used. In the example of FIGS. 7A and 7B, it is then necessary to use three different fluorophores operating at three different wavelength excitation and emission wavelengths to mark each of the probes si, s2, s3. Harvesting and exploitation of the fluorescence signals of the probes then requires the use of an interference filter disposed between each of the chips and the optical analysis sensor to distinguish the emission from each type of probe si, s2 or s3. turning on / off the corresponding light source.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de réalisation d'un microlaboratoire biologique sur puce, dans lequel successivement : A method for producing a micro-laboratory on a microchip, in which:

a. On réalise au moins un guide optique (3) dans un substrat (4); b. On forme au moins un canal microfluidique (1) sur une face du substrat (4), ledit canal microfluidique (1) intersectant au moins un guide optique (3) formé à l'étape a) ; at. At least one optical guide (3) is made in a substrate (4); b. At least one microfluidic channel (1) is formed on one side of the substrate (4), said microfluidic channel (1) intersecting at least one optical guide (3) formed in step a);

c. On dépose au moins une biopuce (5) au fond du canal microfluidique (1) au niveau de l'intersection (6) de celui-ci avec le guide optique (3) ; vs. At least one biochip (5) is deposited at the bottom of the microfluidic channel (1) at the intersection (6) thereof with the optical guide (3);

d. On ferme au moins ledit canal microfluidique dans lequel une dite biopuce (5) a été déposée à une intersection (6) avec le guide optique (3) par dépôt d'une couverture de fermeture sur la face du substrat (4) dans laquelle le canal microfluidique a été formé, d. At least said microfluidic channel is closed in which a said biochip (5) has been deposited at an intersection (6) with the optical guide (3) by depositing a closure cover on the face of the substrate (4) in which the microfluidic channel was formed,

caractérisé en ce que la ou les biopuce(s) déposée(s) à l'étape c) comporte(nt) chacune n plots de sondes (7), déposés séparément les uns des autres et de façon ordonnée sur le fond du ou des canaux microfluidiques (1) par microtampon nage ; n étant un nombre supérieur ou égal à 2.characterized in that the biochip (s) deposited in step c) comprises (nt) each n pins of probes (7), deposited separately from one another and in an orderly manner on the bottom of the microfluidic channels (1) per microtampon swims; n being a number greater than or equal to 2.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, dans un plan horizontal parallèle au fond du canal microfluidique (1), la plus grande dimension des n plots de sondes (7) est comprise entre 0,5 et 500 micromètres, de préférence comprise entre 1 et 100 micromètres. 2. Method according to claim 1, characterized in that, in a horizontal plane parallel to the bottom of the microfluidic channel (1), the largest dimension of n studs of probes (7) is between 0.5 and 500 micrometers, preferably between 1 and 100 micrometers.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, aux intersections (6) où elles sont déposées, les plots de sondes (7) sont écartés les uns des autres d'une distance comprise entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence entre 1 et 100 micromètres. 3. Method according to claim 1, characterized in that at the intersections (6) where they are deposited, the probe pads (7) are separated from each other by a distance of between 0.5 and 500 micrometers, and preferably between 1 and 100 microns.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les n plots de sondes (7) sont déposés simultanément au fond du canal microfluidique (1) par une seule passe de microtamponnage à l'aide d'un tampon (9).4. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the n studs of probes (7) are simultaneously deposited at the bottom of the channel microfluidic (1) by a single microtamping pass with a buffer (9).

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les n plots de sondes (7) sont déposés une à une sur le fond du canal microfluidique (1) par n tampons (9) distincts, chaque tampon correspondant à plot ou une sonde déterminée et comportant tous les motifs de la sonde. 5. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the n pads of probes (7) are deposited one by one on the bottom of the microfluidic channel (1) by n pads (9), each corresponding buffer plot or a specific probe and having all the patterns of the probe.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3 et la revendication 5, caractérisé en ce que l'on dépose les n plots de sondes (7) une à une sur le fond du canal microfluidique (1) par un tampon unique (9) en n coups de tamponnage successifs, et dont la position est décalée relativement au substrat (4) pour chaque sonde, le tampon étant décontaminé entre chaque sonde, de sorte que la biopuce est constitué par n coups de tamponnage décalés.6. Method according to one of claims 1 to 3 and claim 5, characterized in that the n plots of probes (7) are deposited one by one on the bottom of the microfluidic channel (1) by a single buffer ( 9) in n successive buffering strokes, and whose position is shifted relative to the substrate (4) for each probe, the buffer being decontaminated between each probe, so that the biochip is constituted by n staggered buffering strokes.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'on dépose successivement lesdits plots de sondes (7) sur plusieurs substrats (4) par microtampon nages successifs desdits substrats repassés les uns après les autres pour déposer lesdites sondes. 7. Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that one deposits successively said probe pads (7) on several substrates (4) by microtampon successive swimming said substrates ironed one after the other to deposit said probes.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'on dépose successivement lesdits plots de sondes (7) un à un sur plusieurs substrats (4) par microtampon nages successifs de chaque sonde à l'aide de plusieurs tampons (9) sur chaque substrat passant les uns après les autres sous chaque dit tampon. 8. Method according to claim 7, characterized in that one deposits successively said probes of probes (7) one by one on several substrates (4) by successive microtamponings of each probe with the aid of several buffers (9) on each substrate passing one after the other under each said buffer.

9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que le tampon (9) présente une base de hauteur H et au moins un motif (10) correspondant à un plot d'impression formant une saillie de hauteur h au dessus de la base et de surface s au niveau d'une surface d'impression (13) du tampon de microtamponnage, la hauteur h étant supérieure à la profondeur d du canal microfluidique (1) dans lequel les sondes (7) sont déposées. 9. Method according to one of claims 4 to 8, characterized in that the buffer (9) has a base of height H and at least one pattern (10) corresponding to a printing pad forming a projection of height h to above the base and surface s at a printing surface (13) of the microtamping pad, the height h being greater than the depth d of the microfluidic channel (1) in which the probes (7) are deposited.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la base H du tampon (9) est comprise entre 10 Mm et 10 mm, de préférence entre 100 Mm et 1 mm et en ce que la hauteur h de ladite saillie (10) est comprise entre 0,5 Mm et 100 Mm.10. Process according to Claim 9, characterized in that the base H of the buffer (9) is between 10 μm and 10 mm, preferably between 100 μm. and 1 mm and in that the height h of said projection (10) is between 0.5 mm and 100 mm.

11. Procédé selon l'une des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que lors du microtamponnage on comprime le tampon et que la hauteur h' de la saillie du tampon après compression est supérieure à la profondeur du canal d. 11. Method according to one of claims 4 to 10, characterized in that during microtamponnage the tampon is compressed and the height h 'of the protrusion of the buffer after compression is greater than the depth of the channel d.

12. Procédé selon l'un des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que le tampon (9) d'impression comporte un corps de support rigide, notamment en silicium, et une tête d'impression (19) en PDMS, fixée à l'extrémité d'un motif d'impression rigide en saillie (10) et de hauteur h"i, ladite tête étant de préférence sensiblement cubique et de hauteur h"₂.12. Method according to one of claims 4 to 11, characterized in that the printing pad (9) comprises a rigid support body, in particular silicon, and a printing head (19) PDMS, fixed to the end of a rigid printing pattern protruding (10) and height h "i, said head being preferably substantially cubic and height h"₂ .

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la tête d'impression (19) en PDMS présente une hauteur h"₂ et une largeur comprises entre 0,5 et 500 micromètres, et de préférence comprise entre 1 et 100 Mm.13. The method of claim 12, characterized in that the PDMS printing head (19) has a height h "₂ and a width between 0.5 and 500 micrometers, and preferably between 1 and 100 Mm.

14. Procédé selon l'une des revendications 12 à 13, caractérisé en ce que lors du microtamponnage on comprime le tampon (9) et que la hauteur h" après compression de la saillie rigide (10) du tampon et de la tête d'impression (19) en PDMS est supérieure à la profondeur du canal d. 14. Method according to one of claims 12 to 13, characterized in that during microtamponnage is compressed the buffer (9) and the height h "after compression of the rigid projection (10) of the buffer and the head of PDMS printing (19) is greater than channel depth d.

15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le canal microfluidique (1) présente une largeur D' comprise entre 1 Mm et 1 mm, de préférence entre 50 Mm et 200 Mm, et une profondeur d comprise entre 1 Mm et 1 mm, de préférence entre 10 Mm et 50 Mm.15. Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that the microfluidic channel (1) has a width D 'between 1 Mm and 1 mm, preferably between 50 Mm and 200 Mm, and a depth d included between 1 mm and 1 mm, preferably between 10 mm and 50 mm.

16. Procédé d'étalonnage et de lecture d'un microlaboratoire sur puce obtenu selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que, au niveau d'au moins une intersection entre un canal microfluidique et un guide optique :16. Method for calibrating and reading a micro-laboratory on a chip obtained according to one of claims 1 to 15, characterized in that, at at least one intersection between a microfluidic channel and an optical guide:

a) On dépose par microtamponnage au moins un plot de sondes si dans le fond dudit canal microfluidique, lesdites sondes si étant marquées par au moins un fluorophore et étant inertes aux espèces présentes dans un échantillon biologique à tester, et b) On dépose par microtamponnage au moins un plot de sondes s2 dans le fond du premier canal microfluidique du laboratoire à côté des/du plot(s) des sonde(s) si, lesdites sondes s2 étant destinées à réagir avec une molécule F* à identifier marquée d'un fluorophore, présente dans un dit échantillon biologique à tester ; ladite molécule F* n'interagissant ni avec les sondes si et c) On dépose par microtamponnage au moins un plot de sondes s3 dans le fond dudit canal microfluidique, à côté des sondes si et s2, à l'intersection avec ledit guide optique, lesdites sondes s3 étant destinée à réagir avec au moins une molécule connue et de référence F₂* marquée par un fluorophore présente ou introduite en quantité connue dans dans ledit échantillon biologique à tester, lesdites sondes s3 n'interagissant pas avec la molécule F* et ladite molécule F₂* n'interagissant par avec les sondes si et s2, constituant ainsi au moins un triplet de sondes (si, s2, s3)_z=i eta) is deposited by microtamponnage at least one pad of probes if in the bottom of said microfluidic channel, said probes if being marked by at least one fluorophore and being inert to the species present in a biological sample to be tested, and b) At least one probe pad s2 is deposited by microtamping in the bottom of the first microfluidic channel of the laboratory next to / of the pad (s) of the probe (s) si, said probes s2 being intended to react with a molecule F * labeled with a fluorophore, present in a said biological sample to be tested; said molecule F * does not interact with the probes si and c) is deposited by microtamponnage at least one pad of probes s3 in the bottom of said microfluidic channel, next to the probes si and s2, at the intersection with said optical guide, said probes s3 being intended to react with at least one known fluorophore-labeled reference molecule F₂ * present or introduced in known quantity in said biological sample to be tested, said s3 probes not interacting with the F * molecule and said molecule F₂ * does not interact with the probes si and s2, thus constituting at least one triplet of probes (si, s2, s3)_z = i and

d) On ferme le dispositif avec un couvercle.d) Close the device with a cover.

e) On injecte un fluide biologique à analyser dans le canal microfluidique après avoir au préalable marqué la molécule F* à identifier avec un fluorophore, et introduit en quantité connue dans ledit fluide, une molécule de référence F₂* marquée avec un flurophore, ete) injecting a biological fluid to be analyzed in the microfluidic channel after having previously labeled the molecule F * to be identified with a fluorophore, and introduced in known quantity into said fluid, a reference molecule F₂ * labeled with a flurophore, and

f) On introduit un faisceau lumineux d'exitation (E) dans le guide optique et on détecte et on mesure ensuite à l'aide d'un dispositif optique, dont la résolution permet la séparation spatiale d'au moins deux sondes consécutives, le signal de fluorescence émis par chacune des sondes si, s3 etf) An excitation light beam (E) is introduced into the optical guide and is then detected and measured using an optical device whose resolution allows the spatial separation of at least two consecutive probes. fluorescence signal emitted by each of the probes si, s3 and

g) on corrèle ces mesures pour déterminer :(g) these measures are correlated to determine:

i. la présence effective d'un signal lumineux d'excitation par l'émission de fluorescence de la sonde si, i. the effective presence of an excitation light signal by the fluorescence emission of the probe if,

ii. la présente effective de la cible F* dans le fluide biologique par l'émission de fluorescence de la sonde s2 ; iii. le bon fonctionnement du dispositif microfluidique, lié à l'écoulement de la molécule de référence F₂*, par l'émission de fluorescence de la sonde s3.ii. the effective present of the target F * in the biological fluid by the fluorescence emission of the probe s2; iii. the proper functioning of the microfluidic device, linked to the flow of the reference molecule F₂ *, by the fluorescence emission of the probe s3.

17. Procédé d'étalonnage et de lecture d'un microlaboratoire d'analyse biologique sur puce selon la revendication 16, selon lequel lorsque ledit microlaboratoire comporte un nombre entier w de triplets de sondes (si, s2, s3)_z= i à w, le triplet w=l étant pris comme triplet de référence, et caractérisé en ce que l'on corrige l'intensité de fluorescence des plots s2_z=₂ à_w de la formule suivante :17. A method for calibrating and reading a micro-laboratory on-chip biological analysis according to claim 16, wherein when said microlaboratory comprises an integer w of triplets of probes (si, s2, s3)_z = i to w , the triplet w = 1 being taken as the reference triplet, and characterized in that the fluorescence intensity of the pads s2_z =₂ to_w of the following formula is corrected:

I2COR_z= 2 à w = 12_z= 2 à w x ( 12_{z= 2} à w / I2i ) x (13_z= 2 à w /I3i)I2COR_z = 2 to w = 12_z = 2 to wx (12_{z = 2} to w / I2i) x (13_z = 2 to w / I3i)

11_z= î à w étant la mesure de l'intensité de fluorescence des plots si_z= i à w11_z = i to w being the measurement of the fluorescence intensity of the pads if_z = i to w

12_z= î à w étant la mesure de l'intensité de fluorescence des plots s2_z= i à w12_z = 1 to w being the measurement of the fluorescence intensity of the pads s2_z = i to w

13_z= î à w étant la mesure de l'intensité de fluorescence des plots s3_z= i à w13_z = 1 to w being the measurement of the fluorescence intensity of the pads s3_z = i to w

18. Procédé selon l'une des revendications 16 ou 17 caractérisé en ce que l'on introduit un unique faisceau lumineux (E) d'excitation dans un guide optique lumineux (3) et on utilise le même fluorophore pour détecter et mesurer les signaux des sondes si, s2 et s3.18. Method according to one of claims 16 or 17 characterized in that one introduces a single light beam (E) of excitation in a light optical guide (3) and the same fluorophore is used to detect and measure signals probes si, s2 and s3.

19. Procédé selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que l'on introduit plusieurs faisceaux lumineux d'excitation dans le guide optique lumineux (3) et on utilise des fluorophores différents pour détecter et mesurer les signaux des sondes si, s2 et s3, lesdits signaux étant sélectionnés à l'aide d'un filtre interférentiel disposé en sortie dudit canal de guidage face au dispositif optique.19. Method according to one of claims 16 to 18, characterized in that several excitation light beams are introduced into the optical light guide (3) and different fluorophores are used to detect and measure the signals of the probes. , s2 and s3, said signals being selected using an interference filter disposed at the output of said guide channel facing the optical device.

20. Procédé selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisé en ce que le dispositif optique comporte au moins un capteur CCD. 20. Method according to one of claims 16 to 19, characterized in that the optical device comprises at least one CCD sensor.