WO2004075917A1 - Organ or tissue fibrosis inhibitor - Google Patents

Abstract

It is intended to provide an organ or tissue fibrosis inhibitor and preventives/remedies for diseases caused by skin fibrosis (scleoderma, cheloid, thickened scar, etc.) and diseases caused by organ fibrosis (hepatic cirrhosis, lung fibrosis, etc.) each containing, as the active ingredient, a compound inhibiting the signal transduction pathway of promoting the expression of collagen gene mediated by integrin ανβ5. This object can be established by providing an organ or tissue fibrosis inhibitor which contains as the active ingredient compound inhibiting the signal transduction pathway of promoting the expression of collagen gene mediated by integrin ανβ5.

Description

明細書 器官または組織の線維化抑制剤 技術分野 Description Organ or tissue fibrosis inhibitor Technical field

本発明は、 器官、 組織における線維化の抑制剤に関し、 強皮症、 ケロイ ドおよ び肥厚性瘢痕等の皮膚の線維化が原因となる疾患、 肝硬変、 肺線維症等の器官の 線維化が原因となる疾患の抑制剤、 治療剤に関する。 背景技術 The present invention relates to an agent for suppressing fibrosis in organs and tissues, and relates to diseases caused by fibrosis of the skin such as scleroderma, keloids and hypertrophic scars, and fibrosis of organs such as cirrhosis and pulmonary fibrosis. The present invention relates to an inhibitor and a therapeutic agent for a disease caused by the disease. Background art

全身性硬化症または強皮症は通常皮膚や内部器官の線維症をもたらす後天的な 疾患である（1、 以下かっこ内の数字は参考文献番号を記す。 参考文献リス トは後 記する）。 強皮症、 ケロイ ド、 肥厚性瘢痕等の皮膚の線維化が原因となる疾患、 肝硬変、 肺線維症等の組織、 器官の線維化が原因となる疾患の病因は未だ解明さ れていないが、 炎症、 自己免疫性反応および血管損傷等が線維芽細胞の活性化を 導く （2， 3)。 強皮症において異常な線維芽細胞が存在する理由はまだわからない が、 正常なコントロール機構から逸脱した細胞の亜群から発生する可能性がある (4, 5)。 Systemic sclerosis or scleroderma is an acquired disease that usually results in fibrosis of the skin and internal organs (1; the numbers in parentheses indicate the reference numbers; a list of references is given below). The pathogenesis of diseases caused by skin fibrosis such as scleroderma, keloids, and hypertrophic scars, and diseases caused by fibrosis of tissues and organs such as cirrhosis and pulmonary fibrosis has not been elucidated. Inflammation, autoimmune reactions and vascular injury lead to fibroblast activation (2, 3). The reasons for the presence of abnormal fibroblasts in scleroderma are still unknown, but may arise from subpopulations of cells that deviate from normal control mechanisms (4,5).

TGF ^ 1はマルチ機能を有するサイ トカインであり、 種々の細胞の増殖、 分化 および機能を調節する（6)。 TGF 1 の間葉細胞に対する主な効果は細胞外マ ト リ ックス （ECM) の沈着の刺激である。 TGF /3 1はコラーゲン I型、 III型、 VI型、 VI I型および X型、 フイブロネクチンならびにプロテオグリ力ンの発現を增大させ ることが示されている（4， 7 - 12)。 TGF /3 1 による ECM産生の刺激は、 さらに TGF /3 1のマトリ ツタス分解、 プロテアーゼ合成の減少およびプロテアーゼィンヒ ビタ 一レベルの増加に対する抑制的効果により増大される（13)。 強皮症における皮膚 の線維芽細胞の活性化の機構はいまだ不明であるが、 多くの強皮症の線維芽細胞 の特徴は TGF i3 1により刺激された正常線維芽細胞の特徴と似ており （13, 14)、 こ のことは強皮症における皮膚線維芽細胞の活性化はォートクラインな TGF /3の刺 激の結果であることを示唆する。 この知見は本発明者らの先の研究での知見、 す なわち（i)強皮症の線維芽細胞は TGF /3 レセプターの発現が上昇しており、 この上 昇はひ 2 (I) コラーゲンの mRNAレべノレの上昇と相関してレヽる （15)、 ならびに (i i) TGF i3シグナル伝達の抗 TGF i3抗体または抗 TGF i3 1アンチセンスオリ ゴヌク レオチドによる遮断は強皮症の線維芽細胞におけるヒ ト α 2 (Ι)コラーゲン mRNAの 発現上昇を抑える、 という知見によりサポートされる（16、非特許文献 1参照）。 線維芽細胞における ECM代謝は、 ECMへの接着や TGF 3等の可溶性因子などの多 数の環境の影響によりタイ トに調節されている（17)。 細胞- ECM相互作用は細胞表 面の主にィンテグリ ンに属する特徴的なレセプタ一を介して行われる。 ィンテグ リ ンは ECMタンパク質と同様に細胞表面のへテロダイマーの力ゥンターレセプタ 一である。 インテグリンは細胞- ECM接着に関与するだけでなく、 活性レセプター としても作用し、 細胞骨格を通して細胞内部にシグナルを伝達する。 シグナル伝 達により、 遺伝子の発現を誘導し、 細胞の分化程度をモジュ レートし、 さらに細 胞周期に干渉する（18, 19)。 イ ンテグリ ンレセプターの異常な発現は線維性疾患 を含む種々の疾患の病因として重要な役割を果たしていることを示唆する証拠が 増えつつある（20)。 特発性の肺線維症患者から採った肺組織切片の免疫組織化学 分析により、 肺胞内線維症領域の上皮細胞および間葉細胞においてィンテグリン α 5 ]3 1の強い反応が認められた（21、 非特許文献 2参照）。 進行性の腎臓線維症 において、 免疫組織化学分析は間質性の線維芽細胞におけるイ ンテグリンひ 5、 β 1および α νサブュニッ トのァップレギュレ一トされた発現が線維化プロセス と相関していることを示唆していた（22、 非特許文献 3参照）。 さらに、 インテグ リ ン /3 5がアルコール性肝硬変患者の血清中で上昇していることも報告されてい る （29) 。 最近になって、 インテグリ ンひ v j8 6は TGF iS 1の潜在型複合体の特異 的コンポ一ネン卜である潜伏関連ぺプチド (latency-associated pept i de)と して 働き、 上皮細胞による潜在型 TGF /3 1の活性化に関与することが報告されている。 上皮限定（epithel ium— restri cted)インテク、、リ ン /3 6サフ、、ュニッ 卜（こお【ナるヌノレ 変異を有するマウスは炎症を発症するが、 ブレオマイシンにさらした後には肺線 維症から防御される（23)。TGF ^ 1 is a multifunctional cytokine that regulates the growth, differentiation and function of various cells (6). The main effect of TGF1 on mesenchymal cells is the stimulation of extracellular matrix (ECM) deposition. TGF / 31 has been shown to increase the expression of collagen types I, III, VI, VI I and X, fibronectin and proteogliin (4, 7-12). Stimulation of EGF production by TGF / 31 is further enhanced by its inhibitory effects on matrix degradation of TGF / 31, reduced protease synthesis and increased levels of protease inhibitors (13). Although the mechanism of activation of skin fibroblasts in scleroderma is still unclear, the characteristics of many scleroderma fibroblasts are similar to those of normal fibroblasts stimulated by TGF i31. (13, 14), suggesting that activation of dermal fibroblasts in scleroderma is the result of stimulation of autocrine TGF / 3. This finding is based on the findings of the inventors' previous research. That is, (i) scleroderma fibroblasts have increased expression of the TGF / 3 receptor, and this increase is correlated with an increase in the mRNA level of collagen 2 (I) (15). ), And (ii) Blockade of TGF i3 signaling by anti-TGF i3 antibody or anti-TGF i31 antisense oligonucleotide suppresses increased expression of human α2 (Ι) collagen mRNA in scleroderma fibroblasts (16, see Non-Patent Document 1). ECM metabolism in fibroblasts is tightly regulated by a number of environmental effects, including adhesion to ECM and soluble factors such as TGF3 (17). Cell-ECM interaction is carried out through a characteristic receptor mainly belonging to integrins on the cell surface. Integrin, like the ECM protein, is a receptor receptor for heterodimers on the cell surface. Integrins not only participate in cell-ECM adhesion, but also act as active receptors, transmitting signals inside the cell through the cytoskeleton. Signal transduction induces gene expression, modulates the degree of cell differentiation, and interferes with the cell cycle (18, 19). A growing body of evidence suggests that abnormal expression of the integrin receptor plays an important role in the pathogenesis of various diseases, including fibrotic diseases (20). Immunohistochemical analysis of lung tissue sections from patients with idiopathic pulmonary fibrosis showed a strong response of integrin α5] 31 in epithelial cells and mesenchymal cells in the area of alveolar fibrosis (21, Non-Patent Document 2). In progressive renal fibrosis, immunohistochemical analysis indicates that the upregulated expression of integrin 5, β1, and αν subunits in interstitial fibroblasts correlates with the fibrosis process (22, see Non-Patent Document 3). In addition, integrin / 35 has been reported to be elevated in the serum of patients with alcoholic cirrhosis (29). More recently, integrin vj86 has acted as a latency-associated peptide, a specific component of the latent complex of TGF iS1, and its potential for epithelial cells It has been reported to be involved in the activation of type TGF / 31. Epithelium-limited (epithelium-restri cted) intech, Lin / 36 saf, unity (mice with the mutation) develop inflammation, but lung fibrosis after exposure to bleomycin Protected from (23).

その他、 これまでに、 細胞を用いた in vitro解析により、 TGF i3の活性化に関 わるインテグリ ン分子として、 (X V β 1、 ανβ 3, 力 TGF i3 LAP(latensy- associated peptide of TGF 3 )との結合角军析より ひ v /35力 S幸 告されてレヽる （30、 31) 。 更にこれら以外のインテグリ ン分子として、 α鎖分子では 11種類の異なる タイプと、 /3鎖では 3種類の異なるタイプが存在する。 最近報告された 6を 欠失したマウスでの解析により同複合体が内皮細胞における TGF の活性化に関 わることは明らかにされたが、 臓器線維形成への寄与度が高いとされる線維芽細 胞での TGF 3活性化に、 多数存在するィンテグリン複合体のうちのどの分子が中 心的に関わるのかについては今後の課題と して残されている。In addition, to date, TGF i3 activation has been determined by in vitro analysis using cells. As an integrin molecule, (XVβ1, ανβ3, force TGF i3) The binding angle analysis with LAP (latensy-associated peptide of TGF3) was reported as v / 35 force S (30, 31 As other integrin molecules, there are 11 different types of α-chain molecules and 3 different types of / 3 chains. Although the complex was shown to be involved in TGF activation in endothelial cells, a large number of integrin complexes were found to be involved in TGF3 activation in fibroblasts, which are thought to contribute to organ fibrosis. Which molecules of the body are centrally involved remains for further study.

強皮症に関していえば、 従来の研究は皮膚線維芽細胞におけるコラーゲンレセ プタ一（ィンテグリ ン 1および a 2 j3 1 )の発現が中心であった。 これは、 これらのレセプターが線維芽細胞が接着およぴ I型コラーゲンを再構成するのに 利用されるからである（24)。 3次元コラーゲン格子中で培養された正常皮膚線維 芽細胞においては、 インテグリ ン α 1 3 1は α 1 (I)コラーゲン遺伝子発現に対 してネガティブにフィードバックする力 ィンテグリン a 2 β 1はコラゲナーゼ 遺伝子の発現を刺激する （25) 。 各々のレセプターは、 他のレセプターのシグナ ル伝達活性をモジュレートし、 マ ト リ ックス合成および再構成を強調させる。 先 の検討により、 両方のインテグリンの発現レベルが強皮症の線維芽細胞において 減じていることが報告され、 この知見はアップレギュレートされたコラーゲン遺 伝子発現とダウンレギュレートされた強皮症の線維芽細胞のコラゲナーゼ遺伝子 発現と関連している（26， 27)。 しかし、 他の報告では、 強皮症と正常コン トロー ルの皮膚線維芽細胞の培養においてィンテグリ ン c l /3 1 と c 2 /3 1の発現レべ ルには差がないことが示されている（28)。 従って、 強皮症線維芽細胞のこれらの 2つのレセプターの発現についての実験データには限界と矛盾がある。 しかし、 これらの先の検討は強皮症の病因における ECM-細胞相互作用の重要性を示唆して いる。 With respect to scleroderma, previous studies have focused on the expression of collagen receptors (integrin 1 and a2j31) on skin fibroblasts. This is because these receptors are used by fibroblasts to adhere and reconstitute type I collagen (24). In normal dermal fibroblasts cultured in a three-dimensional collagen lattice, integrin α13 31 provides a negative feedback on α1 (I) collagen gene expression, and integrin a2β1 expresses collagenase gene. Stimulates expression (25). Each receptor modulates the signaling activity of the other receptor, enhancing matrix synthesis and reconstitution. Previous studies reported that the expression levels of both integrins were reduced in scleroderma fibroblasts, a finding that indicates that up-regulated collagen gene expression and down-regulated scleroderma. It has been associated with collagenase gene expression in fibroblasts (26, 27). However, other reports have shown that there is no difference in the expression levels of integrin cl / 31 and c2 / 31 in scleroderma and normal control dermal fibroblast cultures. (28). Thus, experimental data on the expression of these two receptors in scleroderma fibroblasts are limited and inconsistent. However, these previous studies suggest the importance of ECM-cell interactions in the pathogenesis of scleroderma.

本発明者は、 先に強皮症皮膚線維芽細胞において正常皮膚線維芽細胞に比べて、 ィンテグリ ン /3 5が強発現しており、 細胞表面のィンテグリ ン_a V β 5の発現量 も強皮症皮膚線維芽細胞で亢進していることを示した。 さらに、 免疫染色により、 強皮症患者の皮膚線維芽細胞においてィンテグリ ン i3 5の発現が亢進していることも示した。 さらに、 インテグリ ン /3 5を正常皮膚 線維芽細胞において一過性に強発現させると、 ヒ ト α 2 (Ι)コラーゲンのプロモー ター活性を增加させることを見出した （厚生省強皮症会議 2002年 1月 2 5 日）_c 正常皮膚線維芽細胞と強皮症皮膚線維芽細胞の全細胞ライセートを材料に、 抗 インテグリン 5抗体を用いてィムノブロッテイングを行った。 この際、 コント ロールとして発現量を比較するために、 抗 ァクチン抗体を用いたィムノブ口ッ ティングも行った。 結果を図 1 2 Aに示す。 図 1 2 A中、 SScは強皮症皮膚線維 芽細胞である。 図 1 2 Aに示すように、 強皮症皮膚線維芽細胞においてインテグ リ ン i3 5が高発現している。 ；3ァクチンを基準にして正常皮膚線維芽細胞と比較 すると、 強皮症皮膚線維芽細胞のインテグリ ン ]3 5の発現は、 正常皮膚線維芽細 胞の約 3倍に亢進していた。The present inventors, as compared to previously scleroderma skin fibroblasts normal skin fibroblasts in cell Integuri emissions / 35 has been strongly expressed, the expression level of Integuri down_a V beta 5 cell surface also strong It was shown to be elevated in scleroderma skin fibroblasts. Furthermore, immunostaining showed that the expression of integrin i35 was enhanced in skin fibroblasts of scleroderma patients. Furthermore, it was found that transiently overexpressing integrin / 35 in normal skin fibroblasts increased the promoter activity of human α2 (Ι) collagen (Ministry of Health and Welfare Scleroderma 2002 (Jan. 25)_c ) Immunlotting was performed using anti-integrin 5 antibody using whole cell lysates of normal skin fibroblasts and scleroderma skin fibroblasts. At this time, in order to compare the expression level as a control, Imunobutsu using an anti-actin antibody was also performed. The results are shown in FIG. 12A. In Fig. 12A, SSc is a scleroderma dermal fibroblast. As shown in FIG. 12A, integrin i35 is highly expressed in scleroderma dermal fibroblasts. The expression of scleroderma dermal fibroblast integrin] 35 was enhanced about three times that of normal dermal fibroblasts when compared to normal dermal fibroblasts based on 3 actin.

また、 細胞表面でのインテグリン 5受容体の発現量を、 細胞表面に発現 しているタンパク質をピオチンでラベルし、 抗ィンテグリン 3 5抗体を用いて免 疫沈降法により調べた。 結果を図 1 2 Βに示す。 図 1 2 Βに示すように、 強皮症 皮膚線維芽細胞では正常皮膚線維芽細胞に比べてインテグリ ン （X V 13 5受容体の 発現量が著明に亢進していた。 The expression level of the integrin 5 receptor on the cell surface was examined by immunoprecipitation using anti-integrin 35 antibody by labeling the protein expressed on the cell surface with biotin. The results are shown in Figure 12Β. As shown in Figure 12Β, the expression level of integrin (XV135 receptor) was significantly enhanced in scleroderma skin fibroblasts as compared to normal skin fibroblasts.

さらに、 正常皮膚線維芽細胞と強皮症皮膚線維芽細胞におけるィンテグリ ン 3 5遺伝子の発現量をノーザンブロッティングにより調べた。 図 1 2 Cに結果を示 す。 図 1 2 Cに示すように、 強皮症皮膚線維芽細胞では、 正常皮膚線維芽細胞に 比べて、 インテグリ ン ; 3 5遺伝子の発現量が約 3倍に亢進していた。 Furthermore, the expression level of integrin 35 gene in normal skin fibroblasts and scleroderma skin fibroblasts was examined by Northern blotting. Figure 12C shows the results. As shown in FIG. 12C, the expression level of the integrin; 35 gene was increased about three times in scleroderma skin fibroblasts as compared with normal skin fibroblasts.

次に、 強皮症皮膚線維芽細胞におけるインテグリ ン 3 5遺伝子の発現亢進が転 写レべノレの充進なの力 \ message stabi 1 ityによるものなの力 を検討するため、 ァクチノマイシン Dを加える直前、 加えて 4時間後、 8時間後のインテグリ ン 5遺伝子の発現量をノーザンブロッテイングにより調べた。 結果を図 1 2 Dに示 す。 図 1 2 Dに示すように、 インテグリ ン ) 3 5遺伝子発現の半減期は、 強皮症皮 膚線維芽細胞と正常皮膚線維芽細胞との間で有意差は認められなかった。 このこ とから、 強皮症皮膚線維芽細胞におけるインテグリ ン i3 5の発現量の亢進は転写 レベルでの調節の異常であることが示唆される。Next, in order to examine whether the enhanced expression of the integrin 35 gene in scleroderma dermal fibroblasts is due to the enhancement of transcription level \ message stabi 1ity, immediately before adding actinomycin D, In addition, the expression level of the integrin 5 gene after 4 hours and 8 hours was examined by Northern blotting. The results are shown in FIG. 12D. As shown in FIG. 12D, the half-life of integrin) 35 gene expression was not significantly different between scleroderma skin fibroblasts and normal skin fibroblasts. Therefore, the increase in integrin i35 expression in scleroderma dermal fibroblasts is It is suggested that the level of regulation is abnormal.

さらに、 強皮症患者の皮膚と正常人の皮膚において、 免疫組織染色を用いて、 インテグリ ン /3 5の発現量について検討した。 図 12 Eに示すように、 線維芽細胞 および膠原線維間にインテグリ ン /3 5の強い発現が認められた。 Furthermore, the expression level of integrin / 35 was examined in the skin of scleroderma patients and the skin of normal humans using immunohistochemical staining. As shown in FIG. 12E, strong expression of integrin / 35 was observed between fibroblasts and collagen fibers.

次いで、 インテグリ ン α ν ]3 5受容体の発現亢進が、 線維芽細胞の細胞外マ ト リ ックス産生に及ぼす影響を調べるため、 正常皮膚線維芽細胞にインテグリ ン 3 5を一過性に強発現させ、 C A Tアツセィを用いてヒ ト ひ 2 (I)コラーゲンプロ モーター活性を調べた。 図 12 Fに示すように、 インテグリン α ν /3 5受容体を強 発現させた群に比べ、 プロモーター活性が約 1. 4倍と有意に亢進していた。 また、 正常皮膚線維芽細胞に一過性にィンテグリ ン β 5を過剰発現すると ひ 2 ( I)コラ 一ゲン遺伝子転写活性が 1 . 5倍に亢進した （図 1 2 Ε )。 しかしながら、 過去 にフォーボーノレエステノレ （Phorbol ester)を,乎泉維芽糸田胞に添カ卩した場合、 a 2 ( I ) コラーゲン遺伝子転写活性は亢進するが、 ひ 2 (I)コラーゲン遺伝子は発現 せず （J. Biol Chera 272： 14738-19745, 1997)インテグリ ン 5の過剰発現がコラ 一ゲン遺伝子を発現亢進させるのか、 線維化を誘導するのかは、 明らかではなか つた。 Next, in order to investigate the effect of enhanced expression of integrin αν] 35 receptor on extracellular matrix production of fibroblasts, integrin 35 was transiently enhanced in normal skin fibroblasts. After expression, human 2 (I) collagen promoter activity was examined using CAT technology. As shown in FIG. 12F, the promoter activity was significantly increased by about 1.4 times as compared with the group in which the integrin αν / 35 receptor was overexpressed. In addition, transient expression of integrin β5 in normal skin fibroblasts resulted in a 1.5-fold increase in transcription activity of collagen 2 (I) collagen gene (FIG. 12 (2)). However, when phorbol ester (Phorbol ester) was added to Izumi vesicles in the past, the transcriptional activity of a 2 (I) collagen gene was increased, but the expression of the 2 (I) collagen gene was increased. No (J. Biol Chera 272: 14738-19745, 1997). It was not clear whether overexpression of integrin 5 increased collagen gene expression or induced fibrosis.

—方、 イ ンテグリ ン β 5 t TGF β LAP ( latency-assoc iated pept i de of TGF ) の結合について報告されているがその親和性は非常に低く、 その生物学的意 義は明らかになつていない （30, 31)。 発明の開示 On the other hand, binding of integrin β5t TGF β LAP (latency-associated peptide of TGF) has been reported, but its affinity is very low, and its biological significance is clear. No (30, 31). Disclosure of the invention

本発明は、 具体的には、 インテグリン 5を介しコラーゲン遺伝子の発現 を促進するシグナル伝達経路を阻害する化合物を有効成分として含む、 器官もし くは組織の線維化抑制剤、 または強皮症、 ケロイ ドおよび肥厚性瘢痕等の皮膚の 線維化が原因となる疾患、 肝硬変、 肺線維症、 糖尿病性腎症を含む慢性腎不全等 の器官の線維化が原因となる疾患の抑制剤、 治療剤の提供を目的とする。 Specifically, the present invention relates to an agent for suppressing fibrosis of an organ or tissue, or a scleroderma, a keloid, comprising a compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin 5 as an active ingredient. Of diseases caused by fibrosis of the skin, such as skin and hypertrophic scars, and diseases caused by fibrosis of organs such as cirrhosis, pulmonary fibrosis, and chronic renal failure, including diabetic nephropathy. For the purpose of providing.

本発明者は、 上述の先に得られた知見から、 強皮症患者の線維芽細胞における アップレギュレートされたィンテグリ ンひ ν 3 5の発現が線維化に関与している と予測し、 さらに検討を行った。 本発明者の以前の検討においては、 正常皮膚線維芽細胞でイ ンテグリ ン（X V βThe present inventors have predicted from the above-mentioned findings that the expression of up-regulated integrin ν 35 in fibroblasts of scleroderma patients is involved in fibrosis, Study was carried out. In a previous study by the present inventors, it was suggested that integrin (XVβ

5を一過性に過剰発現させただけであったので、 イ ンテグリ ン ctvi3 5から、 ヒ ト ひ 2(1)コラーゲンのプロモーター活性増加までの経路の特定は不可能であった が、 本発明者らは新たに皮膚線維芽細胞をインテグリ ンひ v)3 5をコードする遺 伝子でトランスフエク トしたィンテグリ ンひ vj3 5を細胞表面に過剰発現する安 定なトランスフエクタン卜を作製し、 ィンテグリン avi3 5からコラーゲン発現 に至る経路について鋭意検討を行った。 その結果、 TGFi3の非存在下において、 インテグリ ン c v/3 5力 STGF/3 I型レセプター （Tj3RI) および TGF /3 II型レセプタ ― (T/3 RII) と相互作用し、 主に Smadシグナル伝達経路および PI3K/Aktシグナル 伝達経路でシグナルが伝達されコラーゲン発現を誘導することを新たに見出した インテグリ ン αν 3 5力 STGF/3 I型レセプター （T j3 RI) および TGF /3 II型レセプタ 一 (T/3RII) と相互作用し複合体を形成するというのは新たな知見であった。 ま た TGF]3の非存在下において、 Smadシグナル伝達経路が活性化されるとレ、うのも 新たな知見であった。 さらに、 これらの伝達経路の阻害について検討した結果、 ィンテグリ ン avi3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝達経 路を阻害することにより、 器官、 組織における線維化が抑制され、 強皮症等の皮 膚の線維化が原因となる疾患、 肺線維症、 肝硬変、 糖尿病性腎症を含む慢性腎不 全等の器官の線維化が原因となる疾患を抑制、 治療し得ることを見出し、 本発明 を完成させるに至った。However, it was not possible to identify the pathway from the integrin ctvi35 to the increase of the human 2 (1) collagen promoter activity, since only the transient overexpression of They newly produced a stable transfectant overexpressing integrin vj35, which transfected dermal fibroblasts with a gene encoding integrin v) 35, on the cell surface. Intense studies were conducted on the pathway from integrin avi35 to collagen expression. As a result, in the absence of TGFi3, it interacts with integrin cv / 3 5 force STGF / 3 type I receptor (Tj3RI) and TGF / 3 type II receptor-(T / 3 RII), and mainly Smad signaling Αν35 force, which is newly found to induce collagen expression by signaling through the PI3K / Akt pathway and PI3K / Akt signaling pathway (T j3 RI) and TGF / 3 type II receptor ( Interaction with T / 3RII) is a new finding. It was also new finding that the Smad signaling pathway was activated in the absence of [TGF] 3. Furthermore, as a result of examining the inhibition of these transduction pathways, by inhibiting the signal transduction pathway that promotes the expression of collagen genes via integrin avi35, fibrosis in organs and tissues is suppressed, and scleroderma, etc. Of the disease caused by fibrosis of the skin, pulmonary fibrosis, cirrhosis, diabetic nephropathy, and other diseases caused by organ fibrosis, including diabetic nephropathy. The invention has been completed.

さらに、 本発明者らは、 多数存在するイ ンテグリ ンのうち、 イ ンテグリ ン αν β 5が線維化に中心的に関わる因子であることを証明するため、 強皮症患者より 単離した線維芽細胞を用いて、 抗イ ンテグリ ン αν)3 5抗体の線維化関連蛋白質 の発現に対する効果についても鋭意検討した。 Furthermore, the present inventors have proposed that, among the many existing integrins, in order to prove that integrin ανβ5 is a factor mainly involved in fibrosis, fibroblasts isolated from scleroderma patients were used. Using the cells, the effect of the anti-integrin αν) 35 antibody on the expression of a fibrosis-related protein was also studied diligently.

また、 インテグリン 5と他のシグナル伝達に関与する物質との相互作用を阻 害する化合物、 例えば抗インテグリ ン i3 5抗体が線維化の治療に有効であること を見出し、 本発明を完成させた。 In addition, they have found that a compound that inhibits the interaction between integrin 5 and other substances involved in signal transduction, for example, an anti-integrin i35 antibody is effective for treating fibrosis, and thus completed the present invention.

すなわち、 本発明は以下の通りである。 That is, the present invention is as follows.

( 1 ) ィンテグリン α ν 3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路を阻害する化合物を有効成分と して含む、 器官または組織の線維化抑 制剤、(1) Signa that promotes collagen gene expression via integrin αν35 An organ or tissue fibrosis-suppressing agent, comprising as an active ingredient a compound that inhibits the signaling pathway

( 2 ) ィンテダリン c ν]3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路が PI3K/Aktシグナル伝達経路である、 上記 （ 1 ) の器官または組織の 線維化抑制剤、 (2) The agent for suppressing fibrosis of an organ or tissue according to (1) above, wherein the signal transmission pathway that promotes the expression of a collagen gene via intedarin c v] 35 is a PI3K / Akt signaling pathway.

( 3 ) ィンテグリ ン a_V β 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路が Smad経路である、 上記 （ 1 ) の器官または組織の線維化抑制剤、(3) signal transduction pathway that promotes the expression of collagen gene via Integuri down a_V beta 5 is Smad pathway, fibrosis inhibitors of organs or tissues of (1),

( 4 ) ィンテグリン a V β 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路を阻害する化合物が抗 i3 5抗体である上記 （ 1 ) の線維化抑制剤、(4) The fibrosis-suppressing agent according to (1), wherein the compound that inhibits a signal transmission pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin aVβ5 is an anti-i35 antibody;

( 5 ) 抗インテグリン i3 5抗体が、 TGF/3 I型受容体とクラスリ ンの会合および /または TGFi3 II型受容体とクラス リ ンの会合を阻害する上記 （4 ) の線維芽化 制剤剤、(5) The fibroblastic agent according to (4) above, wherein the anti-integrin i35 antibody inhibits the association of TGF / 3 type I receptor with clathrin and / or the association of TGFi3 type II receptor with clathrin. ,

( 6 ) 抗インテグリン J3 5抗体が、 インテグリン 0 5 と TGFi3 I型受容体との結 合およびノまたはィンテグリ ン ) 3 5 と TGF )3 II型受容体との結合を阻害する上記 (6) The anti-integrin J35 antibody inhibits the binding of integrin 05 to the TGFi3 type I receptor and the binding of no or integrin) 35 to the TGF) 3 type II receptor

(4 ) の線維化抑制剤、(4) a fibrosis inhibitor,

( 7 ) ィンテグリン α ν]3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路を阻害する化合物が抗 TGF/3 レセプター抗体である上記 （ 1 ) の線維 化抑制剤、 (7) The fibrosis-suppressing agent according to (1), wherein the compound that inhibits a signal transmission pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin αν] 35 is an anti-TGF / 3 receptor antibody.

( 8 ) ィンテグリン avj3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路を阻害する化合物がサイ トカラシン Dである上記 （ 1 ) の線維化抑制 剤、 (8) The fibrosis-suppressing agent according to (1), wherein the compound that inhibits a signal transmission pathway that promotes the expression of a collagen gene through integrins avj35 is cytochalasin D;

( 9 ) ィンテグリン αν]3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路を阻害する化合物が FAKを標的とする化合物である上記 （ 1 ) の線維 化抑制剤、 (9) The fibrosis-suppressing agent according to (1), wherein the compound that inhibits a signal transmission pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin αν] 35 is a compound that targets FAK.

( 1 0 ) PI3K/Aktシグナル伝達経路を阻害する化合物が ΡΙ3キナーゼインヒ ビ ターまたは Aktィンヒビタ一である上記 （ 2 ) の線維化抑制剤、 (10) the fibrosis-suppressing agent according to (2), wherein the compound that inhibits the PI3K / Akt signaling pathway is ΡΙ3 kinase inhibitor or Akt inhibitor;

( 1 1 ) PI3キナーゼインヒ ビターが LY294002である上記 （ 1 0) の線維化抑 制剤、 ( 1 2) 抗体がモノク ローナル抗体である上記 （4) から （ 7) のいずれかの 線維化抑制剤、(11) the fibrosis-suppressing agent according to (10), wherein the PI3 kinase inhibitor is LY294002; (12) The fibrosis inhibitor according to any of (4) to (7) above, wherein the antibody is a monoclonal antibody.

( 1 3) 抗体がヒ ト化抗体またはヒ 卜抗体である上記 （4) から （ 7) のいず れかの線維化抑制剤、 (13) The fibrosis inhibitor according to any of (4) to (7) above, wherein the antibody is a humanized antibody or a human antibody.

( 1 4) 肝硬変における肝臓の線維化を抑制する、 上記 （ 1 ) から （ 1 3) の いずれかの線維化抑制剤、 (14) The fibrosis inhibitor according to any of (1) to (13), which suppresses liver fibrosis in cirrhosis.

( 1 5) 皮膚の線維化を抑制する、 上記 （ 1 ) から （ 1 3) のいずれかの線維 化抑制剤、 (15) The fibrosis inhibitor according to any of (1) to (13), which suppresses skin fibrosis,

( 1 6) 強皮症、 ケロイ ドおよび肥厚性瘢痕からなる群から選択される皮膚の 線維化が原因となる疾患の治療薬として用い得る、 上記 （ 1 5) の線維化抑制剤, (16) The fibrosis inhibitor according to (15), which can be used as a therapeutic agent for a disease caused by skin fibrosis selected from the group consisting of scleroderma, keloid and hypertrophic scar.

( 1 7) 糖尿病性腎症を含む慢性腎疾患および急性腎不全においてみられる腎 線維化を抑制する、 （ 1 ) から （ 1 3) のいずれかの線維化抑制剤、(17) a fibrosis inhibitor according to any one of (1) to (13), which suppresses renal fibrosis seen in chronic kidney disease including diabetic nephropathy and acute renal failure;

( 1 8 ) 腹膜透析で問題となる腹膜硬化症の線維化を抑制する、 （ 1 ) から ( 1 3) のいずれかの線維化抑制剤、 (18) A fibrosis inhibitor according to any one of (1) to (13), which suppresses fibrosis of peritoneal sclerosis, which is a problem in peritoneal dialysis.

( 1 9) 肺線維症における肺の線維化を抑制する、 （ 1 ) から （ 1 3) のいず れかの線維化抑制剤、 (19) An inhibitor of fibrosis of any one of (1) to (13), which suppresses lung fibrosis in pulmonary fibrosis.

( 2 0) ィンテグリン β 5をコードする遺伝子でトランスフエク 卜した動物線 維芽細胞由来の、 インテグリ ン 5を強発現し線維化した器官または組織の 細胞のモデル細胞として用い得る細胞、 (20) a cell derived from an animal fibroblast transfected with a gene encoding integrin β5, which can be used as a model cell of a fibrotic organ or tissue cell that strongly expresses integrin 5;

( 2 1 ) トランスフエクタント Sa V ;3 5 (受託番号 FERM BP— 08632) である上 記 (2 0) の細胞、 および (21) the cell of the above (20), which is transfectant SaV; 35 (accession number FERM BP—08632); and

( 2 2) 器官または組織の線維化の治療および/または予防薬と して有用な化 合物をスク リーニングする方法であって、 試験化合物を上記 （2 0) または （ 2 1 ) の細胞と接触させて、 細胞におけるコラーゲン発現を検出し、 コラーゲン発 現が抑制された場合に前記化合物が線維化の治療および/または予防薬と して有 用であると決定することを含む方法。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 054481号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明 図 1 Aは、 mockトランスフエクタントぉよび安定トランスフエクタントの間の タイプ Iコラーゲン、 フイブロネクチン、 テナシン Cの発現レベルの比較の結果を 示す写真である。(22) A method for screening a compound useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for fibrosis of an organ or tissue, comprising the steps of: (a) testing a test compound with the cells of (20) or (21) above; Contacting, detecting collagen expression in the cells, and determining that the compound is useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for fibrosis when collagen expression is suppressed. This description includes part or all of the contents as disclosed in the description and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2003-054481, which is a priority document of the present application. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1A is a photograph showing the results of comparing the expression levels of type I collagen, fibronectin, and tenascin C between mock and stable transfectants.

図 1 Bは、 mockトランスフエクタントおよび安定卜ランスフェクタントの間の MMP— 1、 TIMP— 1、 TIMP— 2、 PAI— 1および ct SMAの発現レべノレの 1：匕較の結果を示す写 真である。 Figure 1B shows the results of 1: comparison of MMP-1, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 and ctSMA expression levels between mock transfectants and stable transfectants. This is the photo shown.

図 2 Aは、 mockトランスフエクタントおよび安定トランスフエクタントの間の α 2 (1)コラーゲンの mRNAレベルの比較の結果を示す写真である。 FIG. 2A is a photograph showing the result of comparing the mRNA levels of α2 (1) collagen between mock and stable transfectants.

図 2 Bは、 mockトランスフヱクタントぉよび安定トランスフヱクタントの間の フィブロネクチンの mRNAレベルの比較の結果を示す写真である。 FIG. 2B is a photograph showing the results of a comparison of fibronectin mRNA levels between mock and stable transfectants.

図 2 Cは、 mockトランスフエクタントぉよび安定卜ランスフェクタン卜の間の テナシン Cの mRNAレベルの比較の結果を示す写真である。 FIG. 2C is a photograph showing the results of comparing the mRNA levels of tenascin C between mock transfectants and stable transfectants.

図 3 Aは、 安定トランスフエクタン トにおけるコラーゲンレベルに対する LY294002および Aktィンヒビターの影響を示す写真である。 FIG. 3A is a photograph showing the effect of LY294002 and Akt inhibitor on collagen levels in stable transfectants.

図 3 Bは、 安定トランスフエクタントにおけるコラーゲンレべノレに対するサイ トカラシン Dの影響を示す写真である。 FIG. 3B is a photograph showing the effect of cytochalasin D on collagen levels in stable transfectants.

図 4 Aは、 トランスフェクタントにおける PI3K/Aktシグナル経路（p85)の活性 化を示す写真である。 FIG. 4A is a photograph showing activation of the PI3K / Akt signaling pathway (p85) in transfectants.

図 4 Bは、 トランスフエクタントにおける PI3K/Aktシグナル経路（Akt)の活个生 化を示す写真である。 FIG. 4B is a photograph showing the activation of the PI3K / Akt signaling pathway (Akt) in transfectants.

図 4 Cは、 トランスフエクタントにおける PI3K/Aktシグナノレ経路（GSK— 3ひ/ ） の活性化を示す写真である。 FIG. 4C is a photograph showing activation of the PI3K / Akt signonole pathway (GSK-3h /) in transfectants.

図 5は、 FAK Tyr- 397のチロシンリン酸化レベルの決定の結果を示す写真であ る。 FIG. 5 is a photograph showing the result of determining the tyrosine phosphorylation level of FAK Tyr-397.

図 6 Aは、 安定トランスフエクタントの TGF )3シグナル伝達経路 （T /3 RI) の活 性化を示す写真である。 FIG. 6A is a photograph showing the activation of the TGF) 3 signaling pathway (T / 3RI) of stable transfectants.

図 6 Bは、 安定トランスフエクタントの TGF i3シグナル伝達経路 （Smad) の活 性化を示す写真である。Figure 6B shows the activity of the stable transfectant TGF i3 signaling pathway (Smad). It is a photograph which shows sex.

図 7は、 CAGAモチーフを含むピオチン標識オリ ゴヌクレオチドを用いたブルダ ゥンアツセィの結果を示す写真である。 FIG. 7 is a photograph showing the results of a Burundian assay using a biotin-labeled oligonucleotide containing a CAGA motif.

図 8は、 C0L1A2プロモーター中の安定なトランスフエクタン トの反応エレメ ン トのマッピングを示す図である。 FIG. 8 is a diagram showing mapping of reaction elements of stable transfectants in the C0L1A2 promoter.

図 9は、 ドミナントネガティブ p85、 ドミナントネガティブ Akt、 キナーゼ欠失 タイプ I受容体、 キナーゼ欠失 TGF- <9タイプ II受容体、 ドミナン トネガテ イブ FAKまたはインテグリン αν β 5に対する抗体の安定トランスフエクタントに おける C0L1A2プロモーター活性に対する効果を示す図である。 Figure 9 shows stable transfectants of antibodies against dominant negative p85, dominant negative Akt, kinase deficient type I receptor, kinase deficient TGF- <9 type II receptor, dominant negative FAK or integrin ανβ5 FIG. 3 is a view showing the effect on C0L1A2 promoter activity.

図 1 0 Αは、 強皮症患者由来線維芽細胞における α 2 (I)コラーゲンおよび MMP- 1発現に対する抗ィンテグリ ン β 5抗体の効果の検討の結果を示す写真であ る。 FIG. 10Α is a photograph showing the results of examining the effect of anti-integrin β5 antibody on α2 (I) collagen and MMP-1 expression in scleroderma patient-derived fibroblasts.

図 1 Ο Βは、 正常線維芽細胞における α 2 (I)コラーゲンおよび MMP-1発現に対 する抗ィンテグリン 5抗体の効果の検討の結果を示す写真である。 FIG. 1 is a photograph showing the results of examining the effect of the anti-integrin 5 antibody on α2 (I) collagen and MMP-1 expression in normal fibroblasts.

図 1 1 Aは、 クラスリ ンと αν、 i3 5、 Tj3 RIおよび T jS RIIとの会合を示す写真 である。 FIG. 11A is a photograph showing the association of clathrin with αν, i35, Tj3 RI and TjS RII.

図 1 1 Bは、 3 5とクラスリ ンとの会合を示す写真である。 Figure 11B is a photograph showing the meeting between 35 and Clathrin.

図 1 1 Cは、 i3 5と T/3 RIおよび T i3 RIIとの会合を示す写真である。 FIG. 11C is a photograph showing the association of i35 with T / 3 RI and Ti3 RII.

図 1 2 Aは、 強皮症皮膚線維芽細胞におけるインテグリ ン 05の発現を示す写 真である。 FIG. 12A is a photograph showing the expression of integrin 05 in scleroderma dermal fibroblasts.

図 1 2 Bは、 強皮症皮膚線維芽細胞におけるィンテグリ ン ct v j3 5の発現を示 す写真である。 FIG. 12B is a photograph showing the expression of integrin ct v j35 in scleroderma dermal fibroblasts.

図 1 2 Cは、 強皮症皮膚線維芽細胞におけるインテグリ ン β 5遺伝子の発現を 示す写真である。 FIG. 12C is a photograph showing the expression of the integrin β5 gene in scleroderma dermal fibroblasts.

図 1 2 Dは、 ィンテグリン β 5遺伝子発現の半減期を示す図である。 FIG. 12D shows the half-life of integrin β5 gene expression.

図 1 2 Εは、 インテグリ ン β 5を一過性に過剰発現させた正常皮膚細胞におけ る ct 2 (I)コラーゲン遺伝子の転写活性を示す図である。 FIG. 12Ε shows the transcriptional activity of the ct2 (I) collagen gene in normal skin cells in which integrin β5 was transiently overexpressed.

図 1 2 Fは、 インテグリ ン β 5を強発現させた正常皮膚線維芽細胞におけるコ ラーゲンプロモータ一活性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態Figure 12F shows the results of normal skin fibroblasts that overexpress integrin β5. It is a figure which shows one activity of a lagen promoter. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

以下、 本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明は、 ィンテグリン ct v 3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシ グナル伝達経路を阻害する化合物を有効成分と して含む、 器官または組織の線維 化抑制剤である。 The present invention is an agent for suppressing fibrosis of an organ or tissue, which comprises, as an active ingredient, a compound that inhibits a signal transmission pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin ct v35.

ィンテグリン α ν 3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝達 経路は特定の経路に限定されないが、 Smad2/3が関与する Smadシグナル伝達経路- PI3キナーゼ （PI3K) および Aktが関与する PI3K/Aktシグナル伝達経路が挙げられ る。 ィンテグリン α ν ]3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝 達経路において、 インテグリン o:v i3 5は TGFj3 I型レセプター （TGF]3 RI) および TGFi3 II型レセプター （TGFj3 RII) と会合し、 Smad2/3がリン酸化され他の化合物 例えば、 p300/CBP、 p38MAPK、 Smad4等と複合体を形成し、 コラーゲンプロモータ 一に結合し、 コラーゲン発現を促進し、 同時にインテグリ ン a v i3 5は TGF/3 I型 レセプタ一 （TGF RI) および TGF )3 II型レセプター （TGF /3 RII) と会合し、 PI3K, Akt、 GSK- 3 ct / )3 と続く リン酸化カスケード反応が生じ、 Smadシグナル伝達経路 の活性を促進すると考えられている。 また、 このシグナル伝達経路において、 チ 口シンキナーゼの一つである FAK (focal adhesion kinase) (Schaller, M. D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89， 5192—5196， 1992)力 S関与してレヽること もわかっている。 また、 強皮症患者の皮膚の線維芽細胞ではインテグリ ン α ν ]3 5が過剰発現しており、 この過剰発現がシグナル伝達経路の引き金を引きコラー ゲンの過剰発現をもたらしている。 なお、 インテグリン i3 5に対する抗体は、 生 体におけるィンテグリン β 5の作用を抑制するが、 ィンテグリン β 5遺伝子をノ ックァゥ トしたマウスを用いた検討により、 インテグリン /3 5の作用が抑制され ても、 重篤な症状は現れなレヽこ とが報告されてお り （ HUANG, X et al. , Molecular and Cellular Biology, Feb, 2000, p.755 - 759) 、 イ ンテグリ ン ]3 5 に対する抗体を用いて、 インテグリ ン c v β 5を介してコラーゲン遺伝子の発現 を促進するシグナル伝達経路を阻害したと しても大きな負の影響は表れない。 ィンテグリ ン ひ v 3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝達 経路を阻害する化合物は、 これらの経路によるシグナル伝達を遮断し得る化合物 である。 例えば、 インテグリ ン α V /3 5から Smadシグナノレ伝達経路へのシグナノレ 伝達、 インテグリ ン α ν /3 5カゝら PI3K/Aktシグナル伝達経路へのシグナル伝達を 阻害する化合物と してインテグリ ン /3 5に対する抗体が挙げられる。 また、 TGF /3 レセプタ一 （I型もしくは I I型） に対する抗体または TGF ]3 レセプターのアンタ ゴニス トもこれらのシグナル伝達を阻害する化合物と して挙げられる。 特に、 ィ ンテグリン /3 5ノ ックァゥ トマウスを用いた検討により、 ィンテグリン /3 5の機 能が失われていも生存等に影響を与えないので、 インテグリン ]3 5を介するシグ ナル伝達を阻害する抗インテグリン 5抗体は、 副作用のない線維化抑制剤と し て用い得る。Signaling pathways that promote collagen gene expression via integrin α ν 35 are not limited to specific pathways, but Smad2 / 3 is involved in Smad signaling pathway-PI3 kinase (PI3K) and PI3K / Akt is involved in Akt Signaling pathways. In the signal transduction pathway that promotes the expression of collagen genes via integrin αν] 35, integrin o: vi35 associates with TGFj3 type I receptor (TGF] 3 RI) and TGFi3 type II receptor (TGFj3 RII). When Smad2 / 3 is phosphorylated, it forms a complex with other compounds such as p300 / CBP, p38MAPK, Smad4, etc., binds to collagen promoter, promotes collagen expression, and at the same time, integrin av i3 5 becomes TGF / 3 Type I receptor (TGF RI) and TGF) 3 Type II receptor (TGF / 3RII) associates with PI3K, Akt, GSK-3ct /) 3, followed by a phosphorylation cascade reaction, and Smad signaling pathway It is thought to promote the activity of. In this signaling pathway, FAK (focal adhesion kinase) (Schaller, MD et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5192-5196, 1992) We know that we are involved in S. In addition, integrin α ν] 35 is overexpressed in fibroblasts of the skin of scleroderma patients, and this overexpression triggers a signal transduction pathway, resulting in overexpression of collagen. Although an antibody against integrin i35 suppresses the action of integrin β5 in living organisms, even when the action of integrin / 35 was suppressed by studies using mice in which the integrin β5 gene was knocked out, No serious symptoms have been reported (HUANG, X et al., Molecular and Cellular Biology, Feb, 2000, p. 755-759), using antibodies to integrins] 35. Expression of collagen gene via integrin cvβ5 Inhibiting the signaling pathways that promote mitigation have no significant negative effects. Compounds that inhibit signal transduction pathways that promote collagen gene expression via integrin v35 are compounds that can block signal transduction by these pathways. For example, as a compound that inhibits signal transduction from integrin αV / 35 to the Smad signal transduction pathway, integrin αν / 3 Antibodies to 5. In addition, an antibody against the TGF / 3 receptor (type I or II) or an antagonist of the TGF] 3 receptor is also exemplified as a compound that inhibits these signal transductions. In particular, studies using integrin / 35 knockout mice show that even if the function of integrin / 35 is lost, there is no effect on survival, etc., and that anti-integrin / 35 knockout-mediated signal transduction is inhibited. Integrin 5 antibody can be used as a fibrosis inhibitor without side effects.

抗インテグリ ン i3 5抗体は公知の方法により作製できる。 例えば、 免疫原と し てインテグリン i3 5もしくはその断片またはィンテグリン 3 5を細胞膜上に担持 している細胞を、 場合によっては種々のアジュバントと共に、 免疫する動物に適 量 （通常は 0. 1 μ g〜lg/匹程度） を 1回もしくは複数回投与する （該投与は、 皮下、 静脈内、 腹腔投与などで可能であるがこれらに限定はされない） ことにより抗ィ ンテグリン J3 5抗体を得ることができる。 抗体は、 ポリク ローナル、 モノクロ一 ナルのいずれも用いることができ、 ポリクローナル抗体は、 免疫した動物から採 取した血液から精製することができる。 モノク ローナル抗体は、 免疫した動物か ら脾臓細胞を得て、 ミエローマ細胞とポリエチレングリ コールなどの融合剤を用 いて細胞融合してハイブリ ドーマを得、 該ハイプリ ドーマを培養し、 得られた増 殖クローンの中から、 ィンテグリン ]3 5に結合する抗体を産生するク口一ンをス ク リ一二ングすることにより得ることができる。 このようにして得られたハイブ リ ドーマの培養液または該クローンを動物体内に移植して得られる腹水等の体液 力 らモノクローナル抗体を得ることができる。 The anti-integrin i35 antibody can be prepared by a known method. For example, cells carrying integrin i35 or a fragment thereof or integrin 35 as an immunogen on the cell membrane, optionally with various adjuvants, can be added to the immunized animal in an appropriate amount (usually 0.1 μg). (About ~ lg / animal) one or more times (the administration is possible by, but not limited to, subcutaneous, intravenous, intraperitoneal administration, etc.), whereby an anti-integrin J35 antibody can be obtained. it can. Antibodies can be either polyclonal or monoclonal, and polyclonal antibodies can be purified from blood collected from immunized animals. Monoclonal antibodies are obtained by obtaining spleen cells from immunized animals, performing cell fusion using a fusion agent such as polyethylene glycol with myeloma cells, obtaining hybridomas, and culturing the hybridomas. It can be obtained from the clones by screening a mouse that produces an antibody that binds to integrin] 35. A monoclonal antibody can be obtained from a body fluid such as ascites obtained by transplanting the hybridoma culture solution or the clone thus obtained into an animal body.

これらの抗体作製法に用いる免疫原ならびにスク リ一二ング用および抗体力価 測定用の抗原には、 上記ィンテグリン ) 3 5もしくはその断片またはィンテグリン β 5を細胞膜上に担持している細胞等を用いることができる。 これらは生物試料 から単離したものでも、 遺伝子工学的手法により得られたものでもよい。 この他 にも、 抗体作製法は種々知られており、 本明細書中の記載に限定されることなく、 当業者であれば、 目的および用途に応じた抗体を作製でき、 またその抗体を目的 および用途に応じた純度および組成が得られるように精製することもできる。 ま た、 抗ィンテグリン 13 5抗体と して市販のものを用いてもよレ、。The immunogen used in these antibody production methods and the antigen for screening and antibody titer measurement include integrin) 35 or a fragment thereof or integrin. Cells carrying β5 on a cell membrane can be used. These may be isolated from biological samples or obtained by genetic engineering techniques. In addition, various methods for producing antibodies are known, and the present invention is not limited to the description in this specification, and those skilled in the art can produce antibodies according to the purpose and use, and It can also be purified to obtain the purity and composition according to the application. Alternatively, a commercially available anti-integrin 135 antibody may be used.

本明細書において、 「抗体」 は、 いずれのィムノグロブリンクラス及びサブク ラスを有する抗体も包含する。 また、 「抗体」 は、 ポリ クローナル抗体、 モノク ローナル抗体、 ヒ ト化抗体、 ヒ ト抗体および抗体ライブラリー由来の抗体、 なら びにそれらの機能的断片をも含む。 抗体の機能的断片とは、 （Fab)₂フラグメ ン トおよび （Fab) フラグメン ト等を含む抗体分子の可変部を保持しているあらゆ る分子を意味する。 具体的には F (ab' ) 2 、 Fab' 、 Fab 、 F v 、 di sulphi de- l i nked FV、 Singl e-Chain FV (scFV)及びこれらの重合体等力 S挙げられる ( D. J. King. , Appl icat ions and Engineering of Monoclonal Ant ibodi es. , 1998 T. J. Internat ional Ltd) 。 このような抗体の機食 的断片は、パパイン、 ぺ プシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、 あるいは公知の遺伝子工学的手 法等の公知の方法により得ることができる。 「機能的断片」 とは、 完全抗体が特 異的に結合する抗原に対して、 特異的に結合する抗体の断片を意味する。 また、 該分子は、 抗体の可変部を保持し、 抗原への結合性を有しているものであれば、 免疫グロブリ ンに由来しない分子（アミノ酸鎖、 修飾分子などを含む）を含有して いてもよい。 抗体を治療剤と してヒ トに投与する場合、 ヒ ト体内において異物認 識応答を起こさないものが好ましい。 従って、 一般にヒ 卜化抗体と呼ばれている キメラ抗体または再構成抗体等が好ましい。 キメラ抗体とは、 動物由来の抗体の 可変部を異種動物（この場合はヒ ト）の定常領域に接合したものであるが、 さらに 異種動物（この場合はヒ ト）における抗原性を低減または消滅させるために、 上記 可変部の抗原結合性を消失しないようにァミノ酸配列を置換することもできる (特開平 7- 194384、 特開平 8- 280387)。 再構成抗体とは、 動物抗体由来の相補性決 定領域（CDR)部分のみを異種動物 （この場合はヒ ト） 由来の抗体に移植して作製 された分子である（特開平 11- 4694、 特開平 11- 243955)。 この際、 上記可変部また は相補性決定領域（CDR)部分は抗インテグリ ン /3 5抗体を産生するマウスハイブ リ ドーマから得ることができる。 これらのヒ ト化抗体は、 トランスジエニック動 物を利用して作製することが可能である。 また、 この他にも、 ファ一ジデイスプ レーヒ ト化抗体ライブラリ一からィンテグリン 5への結合性を指標にスク リ一 ニングした抗体を用いてもよい。 また好ましくは、 本発明の抗体はヒ ト抗体であ る。 再配列されていないヒ 卜抗体遺伝子を保持し、 免疫感作により当該免疫原に 特異的なヒ ト抗体を産生する非ヒ ト動物を用いることにより、 例えば富塚らの報 告 (Tomi zuka. et al . , Proc. Nat l . Acad. Sci . USA. , 2000 Vol97 : 722 ) に言己 載されているヒ ト抗体産生マウスを用いることで作製できる。 ここで、 ヒ ト抗体 とは、 ヒ ト由来の抗体遺伝子の発現産物である抗体、 又はその機能的な断片を意 味する。As used herein, “antibody” includes antibodies having any of the immunoglobulin classes and subclasses. The term “antibody” also includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, humanized antibodies, human antibodies and antibodies derived from antibody libraries, and functional fragments thereof. A functional fragment of an antibody means any molecule that retains the variable region of an antibody molecule, including (Fab)₂ fragments and (Fab) fragments. Specifically, F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv, di sulphi de-linked FV, Single e-Chain FV (scFV), and a polymer such as S (DJ King. Appl icat ions and Engineering of Monoclonal Ant ibodi es., 1998 TJ International Ltd). Such a catastrophic fragment of an antibody can be obtained by a known method such as digestion of an antibody molecule with a protease such as papain or pepsin, or a known genetic engineering method. “Functional fragment” refers to a fragment of an antibody that specifically binds to an antigen to which a complete antibody specifically binds. The molecule may include a molecule (including an amino acid chain and a modified molecule) that is not derived from immunoglobulin as long as it retains the variable region of the antibody and has an antigen-binding property. It may be. When the antibody is administered to a human as a therapeutic agent, it is preferable that the antibody does not cause a foreign body recognition response in the human body. Therefore, chimeric antibodies or reconstituted antibodies, which are generally called humanized antibodies, are preferred. A chimeric antibody is one in which the variable region of an animal-derived antibody is conjugated to the constant region of a heterologous animal (in this case, human), and further reduces or eliminates antigenicity in the heterologous animal (in this case, human). To achieve this, the amino acid sequence can be substituted so as not to lose the antigen binding property of the above-mentioned variable region (JP-A-7-194384, JP-A-8-280387). A reshaped antibody is produced by transplanting only the complementarity determining region (CDR) derived from an animal antibody into an antibody derived from a heterologous animal (in this case, human) (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) Nos. 11-4694 and 11-243955). At this time, the variable region or complementarity determining region (CDR) can be obtained from a mouse hybridoma that produces an anti-integrin / 35 antibody. These humanized antibodies can be produced using transgenic animals. In addition, an antibody screened using the binding of the phage-displayed antibody library to integrin 5 as an index may be used. Also preferably, the antibody of the present invention is a human antibody. By using non-human animals that retain unrearranged human antibody genes and produce human antibodies specific to the immunogen by immunization, for example, the report of Tomizuka et al. (Tomi zuka. Natl. Acad. Sci. USA., 2000 Vol.97: 722) can be used to produce a human antibody-producing mouse. Here, the term “human antibody” means an antibody that is an expression product of a human-derived antibody gene, or a functional fragment thereof.

さらに、 ハイブリ ドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコードす る遺伝子をクロ一ユングし、 適当なベクターに糸且み込んで、 チャイニーズハムス ター卵巣 （CH0) 細胞等の哺乳類細胞株、 大腸菌、 酵母細胞、 昆虫細胞、 植物細 胞などの宿主細胞に導入し、 遺伝子組換え技術を用いて作製したリ コンビナン ト 抗体を用レヽる こ と もでき る ( P. J. Delves. , ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES. , 1997 WILEY, P. Shepherd and C. Dean. , Monoclonal Ant i bodi es. , 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J. W. Goding. , Monoclonal Furthermore, a gene encoding a monoclonal antibody is cloned from an antibody-producing cell such as a hybridoma and inserted into an appropriate vector, and the cell line is transformed into a mammalian cell line such as a Chinese hamster ovary (CH0) cell, Escherichia coli, or yeast. Recombinant antibodies produced using gene recombination techniques can also be used by introducing them into host cells such as cells, insect cells, and plant cells (PJ Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997). WILEY, P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Ant i bodi es., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, JW Goding., Monoclonal

Ant ibodies princ ipl es and pract i ce. , 1993 ACADEMIC PRESS) 。 抗インテグジ ン 3 5抗体を産生するハイブリ ドーマは上述の方法により得ることができる。 さ らに、 トランスジヱニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が染色体に組 み込まれたトランスジエニック動物な作製し、 そのトランスジエニック動物の体 液からモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。 動物と しては、 ゥシ、 ャギ、 ヒッジ、 ブタ等があり、 例えばこれらの動物の乳から抗体を回収す ることができる。Ant ibodies princ iples and practice., 1993 ACADEMIC PRESS). A hybridoma producing an anti-integrin 35 antibody can be obtained by the above-described method. In addition, using transgenic animal production technology, a transgenic animal in which the gene of the antibody of interest is integrated into the chromosome is produced, and a large amount of monoclonal antibody is obtained from the body fluid of the transgenic animal. It is also possible. Examples of animals include redheads, goats, sheep, pigs, and the like. For example, antibodies can be recovered from the milk of these animals.

産生された抗体は、 プロティン Aあるいはプロティン G力ラムによるクロマ トグ ラフィー、 イオン交換クロマ トグラフィー、 疎水クロマ トグラフィー、硫安塩析 法、 ゲル濾過、 ァフィ二ティクロマトグラフィー等の公知の精製方法を適宜組み 合わせて精製すればよい。Produced antibodies can be obtained by a known purification method such as chromatography using protein A or protein G, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, ammonium sulfate precipitation, gel filtration, and affinity chromatography. Braid It may be purified together.

ィンテグリン_{α v i}3 5を介してコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝 達が生じる際、 インテグリ ン） 3 5はクラスリ ン、 力べオリ ン、 TGF3受容体 I (TGF /3 RI) 、 TGF /3受容体 II (TGF RII)等と会合する。 本発明の抗イ ンテグリ ン β 5抗体は、 ィンテグリン β 5 とこれらの物質との結合を阻害し得る抗体であ る。When integrin_{α vi} 35 induces signal transduction that promotes the expression of collagen genes, integrin) 35 includes clathrin, motive force, TGF3 receptor I (TGF / 3RI), TGF / 3 It associates with receptor II (TGF RII) and the like. The anti-integrin β5 antibody of the present invention is an antibody that can inhibit the binding of integrin β5 to these substances.

ィンテグリン ex V β 5を介してコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝 達経路を阻害する化合物と して、 抗 TGF /3 レセプタ一抗体を用いる場合も上記の 方法により入手することができる。 In the case where an anti-TGF / 3 receptor 1 antibody is used as a compound that inhibits a signal transmission pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin exVβ5, it can also be obtained by the above method.

また、 ィンテグリンひ 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナ ル伝達経路を阻害する化合物と して、 PI3K/Aktシグナル伝達経路を阻害する化合 物が挙げられ、 このようなィ匕合物として PI3キナーゼのィンヒ ビターまたは Aktィ ンヒ ビターがある。 PI3キナーゼイ ンヒ ビタ一と しては、 LY294002 (2- (4- morphol inyl -8-phenyichromone) 、 quercetin \ό, 3 , 4 ，5, 7— pentahydroxyf lavone)、 wortmanninを用レヽること力^sできる。Compounds that inhibit the signal transduction pathway that promotes the expression of collagen genes via integrin 5 include compounds that inhibit the PI3K / Akt signal transduction pathway. Kinase inhibitors or Akt inhibitors. As the PI3 Kinazei Nhi Vita one is, LY294002 (2- (4- morphol inyl -8-phenyichromone), quercetin \ ό, 3, 4, 5, 7- pentahydroxyf lavone), can Rereru possible force^s use of wortmannin .

さらに、 ィンテグリン cx V β 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグ ナル伝達経路を阻害する化合物として、 Smadシグナル伝達経路を阻害する化合物 が挙げられる。 さらに、 FAKを標的と し、 FAKからシグナル伝達経路下流へのシグ ナル伝達を阻害する化合物も挙げられる。 さらに、 細胞におけるマイクロフイラ メン トによる細胞運動を阻害する物質であるサイ トカラシン Dもィンテグリ ン β 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝達経路を阻害する化合 物として用いることができる。 Furthermore, compounds that inhibit the signal transduction pathway that promotes the expression of collagen genes via integrins cxVβ5 include compounds that inhibit the Smad signaling pathway. Furthermore, there are also compounds that target FAK and inhibit signal transmission from FAK to a downstream of a signal transduction pathway. Furthermore, cytochalasin D, which is a substance that inhibits cell movement by microfilaments in cells, can also be used as a compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes collagen gene expression via integrin β5.

本発明の線維化抑制剤は、 種々の組織 ·器官の線維化抑制剤と して有用であり、 種々の組織 ·器官の線維化が原因となる疾患、 すなわち線維症の予防薬、 治療薬 として用いることができる。 線維化が原因となる疾患と して、 皮膚の線維化が原 因となる強皮症、 ケロイ ド、 肥厚性瘢痕、 肝臓の線維化が原因となる肝硬変、 ァ ルコール性肝線維症、 先天性肝線維症、 肺の線維化が原因となる肺線維症、 腎臓 の線維化が原因となる糖尿病性腎症を含む慢性腎疾患および急性腎不全等があり、 その他に心内膜の線維化に起因する心内膜線維症、 クモ膜下腔の線維化に起因す る軟膜線維症、 上大静脈、 肺動脈、 肺静脈、 気管支等の線維化に起因する縦隔線 維症、 動脈の中膜外層の線維化に起因する筋周囲線維化、 萎縮または変性および 壊死を起こした種々の細胞や組織に線維組織が形成される置換性線維形成、 後腹 膜の線維化に起因する腹膜後線維症、 腹膜透析に由来する腹膜硬化症、 白内障、 緑内障などの術後におこる瘢痕形成等が挙げられるが、 これらに限定されず、 あ らゆる器官、 組織の線維化に起因する線維症の予防、 治療薬と して用い得る。 本発明の線維化抑制剤は種々の剤形で用いることができ、 またその投与経路も 限定さ ない。The fibrosis inhibitor of the present invention is useful as a fibrosis inhibitor for various tissues and organs, and as a prophylactic and therapeutic agent for diseases caused by fibrosis of various tissues and organs, ie, fibrosis. Can be used. Diseases caused by fibrosis include scleroderma caused by skin fibrosis, keloids, hypertrophic scars, cirrhosis caused by liver fibrosis, alcoholic liver fibrosis, congenital Liver fibrosis, pulmonary fibrosis caused by lung fibrosis, chronic kidney disease including diabetic nephropathy caused by renal fibrosis, acute renal failure, etc. Due to endocardial fibrosis, subarachnoid fibrosis Fibroids, mediastinal fibrosis caused by fibrosis of the superior vena cava, pulmonary artery, pulmonary vein, bronchi, etc. Post-operative surgery such as replacement fibrosis, in which fibrous tissue is formed in various cells and tissues, retroperitoneal fibrosis caused by retroperitoneal fibrosis, peritoneal sclerosis caused by peritoneal dialysis, cataract, glaucoma, etc. Examples include, but are not limited to, scarring that occurs, and can be used as an agent for preventing or treating fibrosis caused by fibrosis of any organ or tissue. The fibrosis inhibitor of the present invention can be used in various dosage forms, and the administration route is not limited.

本発明の線維化抑制剤は、 上記のインテグリン α v ]3 5を介しコラーゲン遺伝 子の発現を促進するシグナル伝達経路を阻害する化合物の他に、 薬学的に許容さ れる担体を含み、 必要に応じて増粘剤、 安定剤および/または可溶化剤などの添 加剤を含有することができる。 「薬学的に許容される」 という用語は、 各国政府 の監督当局により承認されているか、 または各国の薬局方もしくは一般的に認知 されている薬局方に動物、 哺乳動物、 および特にヒ トへの使用に関して列記され ていることを指し、 当業者ならば容易に理解できる。 本発明の製剤は、 様々な経 路で投与することができるが、 静脈内ならびに連続輸液による非経口投与、 患部 への塗布による投与が望ましい。 本発明の線維化抑制剤を含む製剤は、 軟膏、 溶 液、 懸濁液、 ェマルジヨンをはじめ、 様々な用途に適した形態とすることができ る。 また該組成物は、 1回または複数回の用量にて、 凍結乾燥粉末またはペレツ トの形態で、 投与の前に該組成物を所望の濃度となるように混合するための注射 用の滅菌済みの水、 生理的食塩水またはバッファーの入ったアンプルと共に提供 してもよレ、。 The fibrosis-suppressing agent of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via the integrin αv] 35. If necessary, additives such as a thickener, a stabilizer and / or a solubilizer can be contained. The term “pharmaceutically acceptable” has been approved by a governmental supervisory authority or refers to animals, mammals, and especially humans, in the pharmacopoeia or the generally recognized pharmacopoeia of each country. Refers to the use listed, which can be easily understood by those skilled in the art. The preparation of the present invention can be administered by various routes, but parenteral administration by intravenous or continuous infusion, and application by application to the affected area are desirable. The preparation containing the fibrosis-suppressing agent of the present invention can be in a form suitable for various uses, including ointments, solutions, suspensions, and emulsions. The compositions may also be in the form of lyophilized powders or pellets, in one or more doses, sterile for injection and for mixing the compositions to a desired concentration prior to administration. May be provided with an ampoule containing water, saline or buffer.

本発明の組成物の治療に有効な量は、 標準的な臨床技術により医療従事者によ り判断することができる。 例えば、 体重 l kg当たり 0. 1〜： ! OOOmgの抗インテグリン 0 5抗体を、 週に数回投与するとよレ、。 さらに、 i n v i troまたは in v i voアツセ ィを適宜利用して、 最適用量範囲の特定に役立てることができる。 投与量は、 投 与経路および疾患の重篤度にも依存し、 実施者の判断および各患者の症状に応じ て決定すればよい。 これらの適切な投与方法は、 医療従事者の通常の知識、 なら びにモデル動物を用いた試験等により決定することができる。A therapeutically effective amount of a composition of the present invention can be determined by a healthcare professional using standard clinical techniques. For example, from 0.1 to 1 kg / kg of body weight:! Mg / kg of anti-integrin 05 antibody administered several times a week. In addition, in vitro or in vivo assays can be employed as appropriate to help identify optimal dosage ranges. The dose also depends on the route of administration and the severity of the disease, and may be determined according to the judgment of the practitioner and the condition of each patient. Appropriate methods of administration are well known to healthcare professionals, And a test using a model animal.

本発明は、 ィンテグリ ン β 5遺伝子を用いてトランスフエク ト した細胞をも包 含する。 このような細胞は、 インテグリ ン; 8 5を強発現し、 その結果ひ V )3 5を 細胞表面に過剰発現する。 このような細胞を線維化の機構の解明、 線維化を抑制 する化合物のスクリ一ニング等に用いることができる。 ヒ トインテグリン |3 5遺 伝 子 は 、 Amer i can Type Cu l ture Col l ec t i on (ATCC) 力、 ら ATCC Number 95497 (bet a5 c lone 5. 1、 ベクター pBluescr ipt KS+)で入手できる。 また塩基配 列は公知であり該公知配列定法に基づいて容易に入手することができる。 例えば、 Ramaswamy H et al . ， EMBO J. 9： 1561- 1568, 1990を参照すればよレヽ。 また、 イン テグリン β 5遺伝子は、 ヒ ト以外の動物由来のものを用いてもよレ、。 The present invention also includes cells transfected using the integrin β5 gene. Such cells strongly express integrin; 85 and consequently overexpress V) 35 on the cell surface. Such cells can be used for elucidation of the mechanism of fibrosis, screening of compounds that inhibit fibrosis, and the like. The human integrin | 35 gene is available from American Type Culture Collection (ATCC), ATCC Number 95497 (bet a5 clone 5.1, vector pBluescr ipt KS +). In addition, the base sequence is known and can be easily obtained based on the known sequence standardization method. See, for example, Ramaswamy H et al., EMBO J. 9: 1561-1568, 1990. The integrin β5 gene may be derived from animals other than humans.

インテグリン β 5遺伝子を用いてトランスフエク トする細胞は、 動物細胞であ り、 線維化し得る組織、 器官の線維芽細胞である。 特に、 ヒ ト線維芽細胞が望ま しい。 Cells transfected using the integrin β5 gene are animal cells and fibroblasts of tissues and organs capable of fibrosis. In particular, human fibroblasts are desirable.

ィンテグリ ン j3 5遺伝子を用いて トランスフエク ト した細胞と して、 例えば 2003年 2月 26日 （原寄託） こ、 受託番号 FERM BP- 08632と して、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 地 1中央第 6 ) に寄託されている （2004年 2月 19日付で原寄託よりブタペス ト条 約に基づく寄託への移管請求受領） トランスフエクタント Sひ v /3 5が挙げられる。 本発明のトランスフエクタントは、 適当な動物細胞用発現べクターにィンテグ リ ン β 5遺伝子を組込んで、 該ベクターで動物細胞を 卜ランスフエタ トすること により得ることができる。 本発明のトランスフエクタン卜の作製に用い得るベタ タ一と して無毒ィ匕したレ トロ ウイルス、 アデノ ウイノレス、 アデノ随伴ウイノレス、 へノレぺスゥイノレス、 ワクシニアウイ/レス、 ポックスゥイノレス、 ポリオゥイノレス、 シンビスウィルス、 センダイウィルス、 SV40、 免疫不全症ウィルス（HIV)等の DNA ウィルスまたは RNAウィルス等が挙げられる。 ベタタ一に本発明の遺伝子を挿入 するには、 まず、 精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、 適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイ トに挿入してべクターに連結す る方法などが採用される。 本発明の遺伝子は、 その遺伝子の機能が発揮されるよ うにベクターに組み込まれることが必要である。 そこで、 本発明のベクターには, プロモーター、 本発明の遺伝子のほ力 \ 所望によりェンハンサーなどのシスエレ メ ン ト、 イン トロンの 5 ' 末端側に存在するスプライス供与部位およびイン トロ ンの 3 ' 末端側に存在するスプライス受容部位からなるスプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 リボソーム結合配列 （SD配列） などを含有 するものを連結することができる。 なお、 選択マーカーとしては、 例えばジヒ ド 口葉酸還元酵素遺伝子、 アンピシリ ン耐性遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子等が 挙げられる。 これらの、 プロモーター、 耐性遺伝子等を含むベクタ一と して、 pcDNA3、 pcDNAI、 pCDM8、 pRc/CMV、 pRc/RSV、 pREP4、 pREP7、 pREP8、 pREP9、 pREP10、 pCEP4、 pCI- neo、 pZeoSV、 pCR2. 1、 pDEST ( Invitrogen社、 STRATAGENE 社） 等の市販のベクターを用いることもできる。As a cell transfected using the integrin j35 gene, for example, Feb. 26, 2003 (Hara Deposit), accession number FERM BP-08632, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Deposited at the Deposit Center (Tsukuba-Higashi 1-chome 1-Chome No. 6 Ibaraki, Japan) (Request for transfer from the original deposit to a deposit based on the Budapest Convention on February 19, 2004) Ectant S hi v / 35. The transfectants of the present invention can be obtained by incorporating the integrin β5 gene into an appropriate animal cell expression vector and transducing the animal cells with the vector. Non-toxic retroviruses, adeno-winnowes, adeno-associated winnowes, henoreus-winores, vaccinia-wi / less, pox-winores, polio-innoles, as non-toxic solids that can be used for the production of the transfectants of the present invention, DNA viruses or RNA viruses such as Synvis virus, Sendai virus, SV40, and immunodeficiency virus (HIV). In order to insert the gene of the present invention into a solid, first, the purified DNA is cut with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate vector DNA restriction enzyme site or a multicloning site, and ligated to a vector. Method is adopted. The gene of the present invention has the function of that gene. Need to be integrated into the vector. Therefore, the vector of the present invention comprises a promoter, a gene of the present invention, a cis element such as an enhancer, a splice donor site located at the 5 'end of the intron, and a 3' end of the intron, if desired. A splicing signal comprising a splice acceptor site present on the side, a polyA addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), or the like can be linked. In addition, examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like. As one of the vectors containing the promoter, the resistance gene, etc., pcDNA3, pcDNAI, pCDM8, pRc / CMV, pRc / RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP10, pCEP4, pCI-neo, pZeoSV, pCR2. 1. Commercially available vectors such as pDEST (Invitrogen, STRATAGENE) can also be used.

動物細胞への糸且換えベクターの導入方法と しては、 例えばエレク トロポレーシ ヨン法、 リン酸カルシウム法、 リボフヱクシヨン法等が挙げられる。 Examples of the method for introducing the recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a ribofusion method.

このようにして得られた安定なトランスフヱクタントを器官または組織の線維 化抑制剤と して使用できる、 ィンテグリ ンひ v i3 5を介しコラーゲン遺伝子の発 現を促進するシグナル伝達経路を阻害する化合物のスク リ一ニングに利用でき 5 c 安定な トランスフエクタントと、 候補化合物を接触させ、 コラーゲン遺伝子の転 写または発現のレベルを測定すればよい。 候補化合物と トランスフエクタントを 接触させたときの トランスフエクタントにおけるコラーゲン遺伝子の転写または 発現のレベルが候補化合物と接触させないときのコラ一ゲン遺伝子の転写または 発現レベルに比べ有意に減少したとき、 その候補化合物はインテグリ ン α ν /3 5 を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝達経路を阻害する化合物と して用い得る。 ここで転写または発現を測定するコラーゲンの型は限定されない が、 I型または I I I型を主に用いる。 どの型を用いるかは、 トランスフエクタント の起源器官または組織に基づいて選択すればよい。 例えば、 皮膚では I型コラー ゲンが多く存在するので、 トランスフエクタン卜が皮膚線維芽細胞由来の場合は, I型コラーゲンの転写または発現レベルを測定すればよい。 コラーゲンの転写レ ベノレは、 ノーザンブロッテイングにより測定でき、 またコラーゲンの発現レべノレ は、 ウェスタンブロッテイング、 ELISA等の免疫測定法により測定することがで さる。The stable transfectant thus obtained can be used as an agent for suppressing fibrosis of an organ or tissue, and inhibits a signal transduction pathway that promotes collagen gene expression via integrin vi35. A candidate compound can be brought into contact with 5c-stable transfectants, which can be used for screening compounds, and the level of transcription or expression of the collagen gene can be measured. If the level of transcription or expression of the collagen gene in the transfectant when contacting the candidate compound with the transfectant is significantly reduced compared to the level of transcription or expression of the collagen gene without contacting the candidate compound, Candidate compounds can be used as compounds that inhibit a signaling pathway that promotes collagen gene expression via integrin αν / 35. Here, the type of collagen for which transcription or expression is measured is not limited, but type I or type III is mainly used. Which type to use may be selected based on the source organ or tissue of the transfectant. For example, since there is a lot of type I collagen in the skin, when the transfectant is derived from dermal fibroblasts, the transcription or expression level of type I collagen may be measured. The transcription level of collagen can be measured by Northern blotting, and the expression level of collagen can be measured. Can be measured by immunoassay such as Western blotting and ELISA.

以下、 本発明を実施例に基づき、 よ り具体的に説明する。 もっとも、 本発 明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

以下の実施例において、 用いた試薬および入手先は以下の通りである。 In the following examples, the reagents and sources used are as follows.

LY294002, Aktインヒ ビターおよび PP - 2は Calbiochem社より入手した。 リ コン ビナン ト ヒ 卜 TGF- β 1 は R&D systems社よ り入手した。 ァクチノマイシン！）、 mythramycin A, サイ トカラシン Dおよび抗 i3ァクチン抗体は Sigma社より入手し た。 抗インテグリン i3 5抗体 （E- 19) 、 抗 Ti3 RI抗体 （H- 100) 、 抗 Tj3 RII抗体 LY294002, Akt inhibitor and PP-2 were obtained from Calbiochem. Recombinant human TGF-β1 was obtained from R & D systems. Actinomycin! ), Mythramycin A, cytochalasin D and anti-i3actin antibody were obtained from Sigma. Anti-integrin i3 5 antibody (E-19), anti-Ti3 RI antibody (H-100), anti-Tj3 RII antibody

(C - 16) 、 抗 Smad2/3抗体 （N- 19) 、 抗 Smad 3抗体 (FL-425) 、 抗フイブロネク チン抗体 (EP5) および抗 Spl抗体 (PEP2) は Santa Cruz Biotechnology 社よ 入手した。 インテグリ ンひ v]3 5に対する中和抗体は、 Chemicon社から入手した_c Aktおよびリン酸ィヒ Aktに特異的な抗体 (Ser473) および Aktキナーゼアツセィキ ッ トは England Biolabs 社より入手した。 抗 PI3K p85抗体および抗リ ン酸化チロ シン（4G10)抗体は Upstate Biotechonology 社よ り入手した。 抗 Smad2/3抗体(C-16), anti-Smad2 / 3 antibody (N-19), anti-Smad3 antibody (FL-425), anti-fibronectin antibody (EP5) and anti-Spl antibody (PEP2) were obtained from Santa Cruz Biotechnology. Integrin Nhi v] neutralizing antibodies against 3-5, specific antibody (Ser473) and Akt kinase mediation Si kit to_c Akt and phosphate I inhibit Akt were from Chemicon Inc. were obtained from England Biolabs, Inc.. Anti-PI3K p85 antibody and anti-phosphorylated tyrosine (4G10) antibody were obtained from Upstate Biotechonology. Anti-Smad2 / 3 antibody

(S66220) は Transduction laboratories社よ り入手した。 抗ヒ 卜 TN (テナシ ン） - C抗体（NEClb)は Thomae Biberach (独）の Dr. Wolfgang Rettig より提供を 受けた。 ヒ ト TIMP- 1に特異的な抗体 （F- 26) およびヒ ト TIMPに特異的な抗体 （F- 70) は富士化学工業株式会社より入手した。 抗 MMP- 1抗体は Chemicon社より入手 した。 抗タイプ Iコラーゲン抗体は Sourthern Biotechnology Associates 社より 入手した。 FuGENE (商標） 6は Roche Diagnostics社より入手した。(S66220) was obtained from Transduction laboratories. Anti-human TN (tenascin) -C antibody (NEClb) was provided by Dr. Wolfgang Rettig of Thomae Biberach (Germany). An antibody specific to human TIMP-1 (F-26) and an antibody specific to human TIMP (F-70) were obtained from Fuji Chemical Co., Ltd. Anti-MMP-1 antibody was obtained from Chemicon. Anti-type I collagen antibody was obtained from Sourthern Biotechnology Associates. FuGENE ™ 6 was obtained from Roche Diagnostics.

〔実施例 1〕 ィンテグリ ン c V i3 5遺伝子を用いたトランスフエクタン トの作 製 [Example 1] Production of transfectants using integrin cVi35 gene

健常提供者から、 インフォームドコンセン トの下、 皮膚組織診により線維芽細 胞を採取した。 一次移植培養は 25cm²培養フラスコ中、 10% FBS、 2mMグノレタ ミン およぴ 50μ g/mlのゲンタマィシンを含む MEM培地を用いて確立した。 単層培養は 37°C、 5 %C0²下で行った。Fibroblasts were collected from healthy donors by skin histology under informed consent. Primary transplant culture was established in a 25 cm² culture flask using MEM medium containing 10% FBS, 2 mM gnoletamine and 50 μg / ml gentamicin. Monolayer culture was performed at 37 ° C. under 5% CO² .

ATCCより入手したインテク、'];ン β 5 cDNA (ATCC Number 95497) を EcoRIを用レヽ て†肖ィ匕し、 EcoRIで消ィ匕した pcDNA3 ( Invi trogen Li fe Technologies 社）と連結し た （PCDNA3- ITGB5) 。 正しく連結されていることは、 配列決定及び発現したタン パク質のウェスタンブロ ッ ト分析によ り行った。 正常ヒ ト皮膚線維芽細胞を pcDNA3- ITGB5または空ベクター （pcDNA3) を用いエレク ト口ポレーシヨン法によ り トランスフエタ トした。 空べクターを用いて得られた トランスフエクタントを 安定な トランスフエクタン 卜に対して mock卜ランスフエクタントと称する。 安定 な トランスフエクタントはネオマイシン誘導体である G418 (0. 56mg/mL、 シグマ 社） で選別し、 i3 5サブユニッ ト転写および対応するポリペプチドの発現をそれ ぞれウェスタンブロッ トおよび免疫沈降分析により確認した。 β 5サブュニッ ト の発現の確認は以下のようにして行った。Intech obtained from ATCC, ']; β5 cDNA (ATCC Number 95497) was used for EcoRI It was linked to pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies, Inc.), which was transformed with EcoRI (PCDNA3-ITGB5). Correct ligation was performed by sequencing and Western blot analysis of the expressed protein. Normal human skin fibroblasts were transfected with pcDNA3-ITGB5 or empty vector (pcDNA3) by electoral poration. Transfectants obtained using an empty vector are referred to as mock transfectants for stable transfectants. Stable transfectants were screened with the neomycin derivative G418 (0.56 mg / mL, Sigma), and i35 subunit transcripts and corresponding polypeptide expression were confirmed by Western blot and immunoprecipitation analysis, respectively. did. Confirmation of the expression of the β5-subunit was performed as follows.

(細胞表面のインテグリン β 5のビォチン化および免疫沈降） (Cell surface integrin β5 biotinylation and immunoprecipitation)

細胞を上述の培養液 （10% FBS、 2mMグルタミンおよび 50 μ g/mlのゲンタマイシ ンを含む MEM培地） を用いて 37° (：、 5 %C0₂の条件下で、 コンフノレェントになるま で培養した。 血清無添加培地 （0. 1 %のゥシ血清アルブミンを含む MEM培地） を用 いた 24時間の培養の後に細胞を冷 PBSで洗浄した。 次に、 細胞を膜不透過性の NHS- LC -ピオチン （ピアスケミカル社） を 0. 5mg/mlの濃度で溶解させた PBSを用い て 37°Cで 30分間培養した。 細胞を冷 PBSで洗浄し溶解バッファー （lO ^ g/ml ロイ ぺプチン，ぺプスタチン，ァプロチニンおよび PMSFを含む 50mM Tri s-HCl , pH7. 4, 1% Triton X- 100, 150mM NaCl, 3mM MgCl₂) 中に回収した。 β 5インテグリ ンを 抗ィンテグリ ン β 5抗体を用いて免疫沈降させた。 免疫複合体をプロティン Αァ ガロースを用いて回収し SDS- PAGEに力 ナウエスタンブロッティングを行った。 ゥ エスタンフ"ロッテイングはホースラディ ッシュぺノレ才キシダーゼ (HRP) 結合ス 卜 レプ卜アビジン (Amersham Pharmac ia Biotech社） を用レヽ、 ECL検出システムCells above culture solution 37 ° with (10% FBS, MEM medium containing gentamicin of 2mM glutamine and 50 μ g / ml) (: , under the conditions of 5% C0_2, cultured until becomes Konfunoreento After culturing for 24 hours in a serum-free medium (MEM medium containing 0.1% serum albumin), the cells were washed with cold PBS. LC-Piotin (Pierce Chemical Co., Ltd.) was cultured at a concentration of 0.5 mg / ml in PBS for 30 minutes at 37 ° C. The cells were washed with cold PBS and lysed in lysis buffer (lO ^ g / ml Roy ぺ). Recovered in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ ) containing putin, pepstatin, aprotinin and PMSF β5 integrin anti-integrin β5 antibody The immune complex was recovered using protein agarose and analyzed by SDS-PAGE. Was Na Western blotting. © Esutanfu "blotting is Hosuradi Mesh Bae Norre old oxidase (HRP) coupled scan Bok replica Bok avidin (Amersham Pharmac ia Biotech Co., Ltd.) Rere use the, ECL detection system

(Amersham社） で可視ィ匕して 亍つた。(Amersham) and made a visual doodle.

さ らに、 トランスフエクタン ト細胞について、 以下の方法で増殖を確認し た。 In addition, proliferation of the transfectant cells was confirmed by the following method.

(増殖ァッセィ） (Proliferation Assy)

増殖が停止した トランスフヱクタント細胞を増殖培地で 4 X 10⁵細胞/ mLに希釈 し、 24ゥヱル培養プレー ト （Coaster社） に 0.5mL/ゥエルの密度で播いた。 細胞 を 48時間の培養の最後の 2 時間 0.5mCi/ウ ノレの³ H-チ ミ ジン ( Amersham Pharmacia Biotech社） でパルスした。 細胞を PBSで 3回、 氷冷した 5 %ト リクロ 口酢酸で 3回洗浄し取り込まれていなレ、 -チミジンを除去し、 0. IN NaOH, 0. 1% SDS中に溶解させ中和した。 サンプルの一部をシンチレーショ ン液に添加し力ゥ ントした （Beckman Instruments社のカウンターを使用） 。 安定なトランスフエ クタントは若干増殖能が低下していた。Dilute transfectant cells that have stopped growing to 4 x 10⁵ cells / mL in growth medium Then, the cells were seeded on a 24-well culture plate (Coaster) at a density of 0.5 mL / well. Cells were pulsed with³ H- Ji Mi Jin last 2 hours 0.5 mCi / c Honoré culture of 48 hours (Amersham Pharmacia Biotech). The cells were washed three times with PBS and three times with ice-cold 5% trichloroacetic acid to remove unincorporated, -thymidine, and dissolved and neutralized in 0.1 IN NaOH, 0.1% SDS. . A part of the sample was added to the scintillation liquid and the reaction was performed (using a Beckman Instruments counter). The stable transfectants had slightly reduced growth potential.

得られた安定な トランスフエクタン ト S a v j3 5は、 2003年 2月 26日付 （原寄 託） で、 受託番号 FERM BP- 08632と して、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に寄託 されている （2004年 2月 19日付で原寄託よりブタぺス ト条約に基づく寄託への移 管請求受領） 。 The obtained stable transfectant Sav j35 was deposited on February 26, 2003 (Hara Deposit) under the accession number FERM BP-08632, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary. (Deposited at 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Central No. 6) (A request for transfer from the original deposit to a deposit based on the Budapest Treaty on February 19, 2004).

〔実施例 2〕 トランスフヱクタントにおけるコラーゲン等の転写および発現 本実施例において、 ィムノブロッテイング、 RNAの抽出およびノーザンブロッ ト分析、 ならびに免疫沈降は以下のようにして行った。 [Example 2] Transcription and expression of collagen and the like in transfectants In this example, immunoblotting, RNA extraction and Northern blot analysis, and immunoprecipitation were performed as follows.

(ィムノブロ ッティング） (Imno blotting)

細胞をコンフルェントまで培養し、 24時間の無血清状態の後、 溶解バッファー (10 μ g/ml 口ィぺプチン，ぺプスタチン，ァプロチニンおよび PMSFを含む 50mM Tris - HC1， pH7.4, 1% Triton X- 100, 150mM NaCl, 3mM MgCl₂) で処理した。 24 時間後、 培地を回収し残った細胞を冷 PBSで 3回洗浄し、 上述の溶解バッファー 中に溶解させた。 タンパク質抽出物または培養上清を用いて SDS- PAGEを行い- ト ロセルロース膜に転写した。 膜を抗ィンテグリン /3 5抗体を用いてー晚ィンキュ ペートし、 洗浄し二次抗体を用いて 60分間インキュベーショ ンした。 洗浄後、 増 巾畐ケミ ノレミネッセンス （Araersham Pharmacia Biotech社） により可視ィ匕を行レヽ、 デンシトメーターを用いてバンドの強さを測定した。After culturing the cells to confluence, and after 24 hours of serum-free condition, lysis buffer (50 mM Tris-HC1, pH 7.4, 1% Triton X containing 10 μg / ml oral iptin, papstatin, aprotinin and PMSF) -Treatment with 100, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ ). After 24 hours, the medium was collected and the remaining cells were washed three times with cold PBS and lysed in the lysis buffer described above. SDS-PAGE was performed using the protein extract or the culture supernatant and transferred to a torocellulose membrane. Membranes were incubated with anti-integrin / 35 antibody, washed, and incubated with secondary antibody for 60 minutes. After washing, visualization was carried out by means of amplification chemnoluminescence (Araersham Pharmacia Biotech), and the band intensity was measured using a densitometer.

(RNAの調製およびノーザンブロッ ト分析） (RNA preparation and Northern blot analysis)

線維芽細胞を 10%FCS含有 MEM培地中でコンフルェン 卜まで増殖させ、 次いで無 血清培地中で 24時間インキュベーションを itつた。 総 RNAを酸グァニジンチオシ ァニンフエノールク口ロフオノレム法で抽出し定法に従いノーザンブロッ 卜分析を 行った。 簡単には、 抽出 RNA 2 μ gを用いて 1%ァガロース/フオルムアルデヒ ドゲ ノレを用いた電気?永動を tiい、 ナイロンフィ /レター （Roche Diagnost ic社） にブロ ッ トした。 フィルタ一を UV架橋させ、 プレハイブリダィズさせ、 ハイブリダィズ させた。 次いでその後 ct 2 (I)コラーゲン、 フイブロネクチン、 テナシン - ま たは GAPDH用 DNAプローブとハイブリダィズさせた。 その後膜を洗浄し、 X線フィ ルムに暴露した。 X線フィルムを定法に従いスキャンした。Fibroblasts were grown to confluence in MEM medium containing 10% FCS and then incubated for 24 hours in serum-free medium. Total RNA is acid guanidine The samples were extracted by the lanin phenolic Lofonolem method and subjected to Northern blot analysis according to a standard method. Briefly, 2 μg of the extracted RNA was used for electrophoresis using 1% agarose / formaldehyde reagent, and blotted on nylon filler / letter (Roche Diagnostics). The filters were UV cross-linked, pre-hybridized and hybridized. Then, it was then hybridized with ct2 (I) collagen, fibronectin, tenascin- or a DNA probe for GAPDH. Thereafter, the membrane was washed and exposed to an X-ray film. The X-ray film was scanned according to a standard method.

(免疫沈降） (Immunoprecipitation)

免疫沈降アツセィを行うため、 タンパク質抽出物の一部 （lmg) をプロテイン A-Sepharose (Pharmaci a-Bi otech社） またはプロティ ン G -ァガロース ビーズ (Santa-Cruz Biotech社）を用いて、 4 °Cで 2時間垂直ローテ一ター上でプレ吸収 させ、 1〜 2 μ gの免疫沈降用抗体と 1時間インキュベーショ ンし、 最後にプロ ティン A- Sepharoseプロティンまたは G -ァガロースビーズと 2時間ィンキュベー シヨンした。 ビーズを遠心沈降させ、 溶解バッファーを用いて 3回洗浄し、 電気 泳動用サンプルバッファーを用いて再溶解させた。 次いで、 3分間煮沸し、 簡単 に遠心し、 上清について図に示した抗体を用いてウェスタンブロッティングを行 つた。 定量分析は、 ImageQuantプログラムを用いて行なった。 To perform the immunoprecipitation assay, a portion (lmg) of the protein extract was used at 4 ° C using protein A-Sepharose (Pharmacia-Biotech) or protein G-agarose beads (Santa-Cruz Biotech). Pre-absorbed on a vertical rotator for 2 hours, incubated for 1 hour with 1-2 μg of immunoprecipitation antibody, and finally incubated with protein A-Sepharose protein or G-agarose beads for 2 hours. The beads were spun down, washed three times with lysis buffer, and redissolved with sample buffer for electrophoresis. Then, the mixture was boiled for 3 minutes, centrifuged briefly, and the supernatant was subjected to Western blotting using the antibodies shown in the figure. Quantitative analysis was performed using the ImageQuant program.

( 1 ) mockトランスフエクタン トおよび安定トランスフエクタン トの間のタイ プ Iコラーゲン、 フイブロネクチン、 テナシン (：、 MMP - 1、 TIMP - 1、 TIMP - 2、 PAI-1 および a SMAの発現レべノレの比較 (1) Expression levels of type I collagen, fibronectin, tenascin (:, MMP-1, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 and a SMA) between mock and stable transfectants Nore comparison

mock トランスフエクタン 卜およぴ安定トランスフヱクタン トをコンフノレェン ト まで培養した。 24時間の無血清培養の後、 細胞を別の新しい無血清培地で培養し た。 培地を回収し、 残った細胞を溶解バッファーで溶解した。 培養上清を用いて 抗コラーゲン I抗体、 抗フイブロネクチン抗体、 抗テナシン C抗体、 抗 MMP-1抗体、 抗 TIMP- 1抗体、 抗 TIMP- 2抗体または抗 PAI- 1抗体を用いたゥエスタンブロッティ ングを行った。 タンパク質抽出物は抗 a SMA抗体を用いたウェスタンブロッティ ングに用いた。 この際、 トランスフエクタントと して 4株 （S 1〜S4) 用いた。 The mock transfectants and stable transfectants were cultivated up to the concept. After 24 hours of serum-free culture, cells were cultured in another fresh serum-free medium. The medium was collected and the remaining cells were lysed with lysis buffer. Using culture supernatant Anti-collagen I antibody, anti-fibronectin antibody, anti-tenascin C antibody, anti-MMP-1, anti-TIMP-1 antibody, anti-TIMP-2 antibody or anti-PAI-1 antibody Was performed. The protein extract was used for Western blotting using anti-a SMA antibody. At this time, four strains (S1 to S4) were used as transfectants.

図 1 Aおよび図 1 Bに結果を示した。 図 1 Aは、 ひ 1 (1)コラーゲン、 ひ 2 (1)コ ラーゲン、 フイブロネクチンおよびテナシン Cの発現レべノレを示し、 図 1 Bは MMP— 1、 TIMP— 1、 TIMP— 2、 PAI— 1および a SMAの発現レべノレを示す。 図 ίこ示すよう に、 安定な トランスフェクタン ト （S1〜S4)は mockトランスフエクタン ト （M)に比 ベ、 発現レベルが高くなつている。The results are shown in FIGS. 1A and 1B. Fig.1A shows the results of (1) collagen and (2) The expression levels of lagen, fibronectin and tenascin C are shown, and FIG. 1B shows the expression levels of MMP-1, TIMP-1, TIMP-2, PAI-1 and a SMA. As shown in the figure, the stable transfectants (S1 to S4) have higher expression levels than the mock transfectants (M).

( 2 ) mock トランスフエク タ ン トおよび安定 ト ランスフエク タン 卜の間の ひ 2 (1)コラ一ゲン、 フィブロネクチンおよびテナシン Cの mRNAレべノレの比較 (2) Comparison of mRNA levels of collagen, fibronectin and tenascin-C between mock transfectants and stable transfectants

mockトランスフエクタン トおよび安定トランスフヱクタン トをコンフノレェン ト まで培養した。 24時間の無血清培養の後、 総 RNAを抽出した。 2 gのそれぞれの 抽出 RNAについて α 2 (1)コラーゲン、 フィプロネクチンおよびテナシン C用の DNA プローブ'を用いてノーザンフ"ロッティングを なった。 Mock and stable transfectants were cultivated up to the concept. After 24 hours of serum-free culture, total RNA was extracted. Northern blotting was performed on 2 g of each extracted RNA using DNA probes for α2 (1) collagen, fipronectin and tenascin-C.

図 2 A、 図 2 Bおよび図 2 Cに結果を示す。 それぞれ、 ひ 2 (1)コラーゲン、 フ イブロネクチンおよびテナシン Cの mRNAレべノレを示す。 図に示すように、 安定な トランスフエクタン ト（S1〜S4) ίま mockトランスフエクタン ト （M)に！;匕べ、 mRNAレ ベルが高くなっている。 Figures 2A, 2B and 2C show the results. The mRNA levels of collagen 2 (1) collagen, fibronectin and tenascin C are shown, respectively. As shown in the figure, stable transfectants (S1 to S4) become mock transfectants (M)! The mRNA level is high.

( 3 ) 安定卜ランスフエクタントにおけるコラーゲンレべノレに対する LY294002、 Aktイ ンヒ ビターおよびサイ トカラシン Dの影響 (3) Effects of LY294002, Akt inhibitor and cytochalasin D on collagen levels in stable transfectants

線維芽細胞を 24時間無血清状態で培養し、 5もしくは 10 Mの PP-2、 10もしく ίま 30 μ Mの LY294002、 10もしく（ま 20 μ Mの Aktインヒ ヒ "ターまた fま 100nM、 300nM、 1 μ Mもしくは 3 μ Μのサイ トカラシン Dを用いて 24時間前処理を い、 培養上清 を回収した。 この際、 コン ト ロールとして DMS0で処理したものを用いた。 培養上 清について抗タイプ I コラーゲン抗体を用いたブロッティングを行なった。 Fibroblasts are cultured in serum-free condition for 24 hours, and 5 or 10 M PP-2, 10 or 30 μM LY294002, 10 or (20 μM Akt inhibitor or fM). Pretreatment was performed for 24 hours using 100 nM, 300 nM, 1 μM, or 3 μM cytochalasin D, and the culture supernatant was collected, using DMS0-treated control. The blot was blotted using an anti-type I collagen antibody.

図 3 Αおよび図 3 Βに結果を示す。 図 3 Aは、 PP- 2、 LY294002 , Aktインヒ ビ ターを用いたとき、 図 3 Bはサイ トカラシン Dを用いたときの α 1 (1)コラーゲン および α 2 (Ι)コラーゲンの発現量を示す。 図に示すように、 ΡΙ3キナーゼのイン ヒ ビターである LY294002、 Aktインヒ ビターおよびサイ トカラシン D処理した場合 にコラーゲンの発現が阻害された。 Figures 3 結果 and 3 図 show the results. Figure 3A shows the expression levels of α1 (1) collagen and α2 (Ι) collagen when PP-2, LY294002, and Akt inhibitors were used, and Figure 3B shows that when cytochalasin D was used. . As shown in the figure, collagen expression was inhibited by treatment with LY294002, an inhibitor of ΡΙ3 kinase, Akt inhibitor and cytochalasin D.

LY294002および Aktィンヒ ビタ一でコラーゲン発現が阻害されることは、 コラー ゲンの発現に PI3K/Aktシグナル伝達経路が大きく関与していることを示す。 また、 サイ トカラシン Dでコラーゲン発現が阻害されたことは、 ィンテグリ ンの関与が 示唆される。Inhibition of collagen expression by LY294002 and Akt inhibitor indicates that PI3K / Akt signaling pathway is significantly involved in collagen expression. Also, Inhibition of collagen expression by cytochalasin D suggests the involvement of integrins.

〔実施例 3〕 トランスフエクタントにおける PI3K/Aktシグナル伝達経路の活性 化 [Example 3] Activation of PI3K / Akt signaling pathway in transfectants

本実施例における Akt活性化ァッセィは以下の方法で行った。 The Akt activation assay in this example was performed by the following method.

Aktの活性化は、 Aktキナーゼアツセィキッ トを用いて製造者の指示に従い測定 した。 細胞を 24時間無血清状態におき、 次いで線維芽細胞を氷冷 PBSで洗浄し溶 角早した。 Aktキナーゼアツセィのために、 細月包ライセートの 200 μ 1のァリ コー ト を固定化抗 Akt抗体と 4 °Cで一晚インキュベーショ ンし、 免疫沈降させた。 キナ ーゼァッセィのために、 ビーズを 200 μ Mの ATPおよび 2 μ gのグリ コーゲン合成キ ナーゼ（GSK) - 3 α / )3融合タンパク質を Aktの基質と して用いた。 反応は 25 μ 1の SDSサンプルバッファ一を添加して停止させた。 サンプノレを 5分間煮沸し、 抗リ ン酸ィ匕 GSK— 3ひ/ （Ser21/9) 抗体 （1 : 1000希釈） を用いてウェスタンブロッテ ィングを行なった。 Akt activation was measured using the Akt kinase assay according to the manufacturer's instructions. The cells were left serum-free for 24 hours, and the fibroblasts were then washed with ice-cold PBS to speed up lysis. For the Akt kinase assay, 200 μl of an aliquot of the meniscus lysate was incubated with immobilized anti-Akt antibody at 4 ° C. for 10 minutes and immunoprecipitated. For the kinase assay, beads were used with 200 μM ATP and 2 μg glycogen synthase (GSK) -3α /) 3 fusion protein as a substrate for Akt. The reaction was stopped by adding 25 μl of SDS sample buffer. The sample was boiled for 5 minutes and subjected to Western blotting using anti-phosphorylated GSK-3 / (Ser21 / 9) antibody (1: 1000 dilution).

線維芽細胞を 24時間無血清状態で培養し、 細胞ライセートを調製した。 細胞ラ イセ一ト （サンプル当たり lmgタンパク質） を抗 p85抗体で免疫沈降し （p85は IP3 キナーゼのサブユニッ ト） 、 抗リン酸ィ匕チ口シン （4G10) 抗体を用いてィムノブ ロッテイングを行なった。 次に、 使用したのと同じ膜からス トリ ップを得て、 再 度抗 p85抗体と結合させ総 p85タンパク質の存在量を決定した。 細胞ライセー ト (サンプル当たり 30 μ gタンパク質） について抗リン酸ィ匕 Akt (Ser473)抗体を用レヽ てィムノブロッテイングを行なった。 次に、 使用したのと同じ膜からス トリ ップ を得て、 再度抗 Akt抗体と結合させ総 Aktタンパク質の存在量を決定した。 Aktキ ナーゼ活性を測定するために Aktを免疫沈降により回収し、 GSK- 3 α / ]3の存在下 で in vi troキナーゼアツセィを行なった。 サンプノレを抗リン酸ィ匕 GSK— 3 α / /3抗体 を用いてィムノブ口ッティングを行なった。 The fibroblasts were cultured in a serum-free state for 24 hours to prepare a cell lysate. Cell lysates (lmg protein per sample) were immunoprecipitated with anti-p85 antibody (p85 is a subunit of IP3 kinase), and Immunoblotting was performed using anti-phosphoridin-chiguchi syn (4G10) antibody . Next, strips were obtained from the same membranes used and again bound to anti-p85 antibodies to determine the abundance of total p85 protein. The cell lysate (30 μg protein per sample) was subjected to immunoblotting using an anti-phosphoridyl Akt (Ser473) antibody. Next, strips were obtained from the same membranes used and again bound to the anti-Akt antibody to determine the amount of total Akt protein present. In order to measure Akt kinase activity, Akt was recovered by immunoprecipitation, and in vitro kinase assay was performed in the presence of GSK-3α /] 3. Sampnole was subjected to imnob mouthing using an anti-phosphoridai GSK-3α / 3 antibody.

図 4 Α、 図 4 Βおよび図 4 Cに結果を示した。 図 4 Αおよび図 4 Βは、 それぞ れ、 p85、 Aktについての結果を示し、 図 4 Cは GSK- 3 a / i3を用いて行った Aktキ ナーゼ活'|~生の強さを示す。 図 4 Aおよび図 4 Bに示すように、 mockトランスフエ クタント（Mまたは M1〜M3)と安定トランスフエクタント（S1〜S4)の間で、 p85も Aktも総発現量に差はなかったが、 これらのタンパク質のリ ン酸化は安定トラン スフェクタントのみで認められた。 また、 図 4 Cも安定トランスフエクタントで Aktキナーゼ活性が亢進しているが、 mockトランスフエクタントでは亢進してレヽ ないことを示している。 このことは、 インテグリン ]3 5が過剰発現している安定 トランスフェクタントで、 PI3K/Aktシグナル伝達経路が活性化されていることを 示している。The results are shown in Figure 4Α, Figure 4Β, and Figure 4C. Figures 4Α and 4 4 show the results for p85 and Akt, respectively, and Figure 4C shows the Akt kinase activity using GSK-3a / i3. . As shown in Figures 4A and 4B, the mock transfer There was no difference in total expression between pactants (M or M1-M3) and stable transfectants (S1-S4) in both p85 and Akt, but phosphorylation of these proteins was observed only in stable transfectants. Was done. FIG. 4C also shows that Akt kinase activity is enhanced in stable transfectants but not in mock transfectants. This indicates that the PI3K / Akt signaling pathway is activated in stable transfectants overexpressing integrin] 35.

〔実施例 4〕 FAK Tyr- 397のチロシンリ ン酸化レベルの決定 Example 4 Determination of Tyrosine Phosphorylation Level of FAK Tyr-397

FAKの免疫沈降を lmgのタンパク質抽出物を抗 FAK抗体と共にィンキュベーショ ンすることにより行レ、、 免疫沈降物をウェスタンプロッティングにより分析した_c ウェスタンブロッテイングは最初は抗リン酸化 FAK Tyr397抗体を用い、 別のス ト リ ップでは抗 FAK抗体を用いた。 免疫沈降およびウェスタンブロッテイングは上 述の方法により テつた。_C Western blotting for the row-,, immunoprecipitates were analyzed by western plotting by Inkyubesho down with protein extracts lmg of FAK Immunoprecipitation Anti FAK antibody initially with an anti-phosphorylated FAK Tyr397 antibody, In another strip, anti-FAK antibodies were used. Immunoprecipitation and Western blotting were performed as described above.

図 5に結果を示す。 図が示すように、 mockトランスフエクタント（Ml)と安定卜 ランスフエクタン ト（S1〜S4)の間で FAKの総発現量に差はなかったが、 リ ン酸化 は トランスフエクタン卜のみで認、められた。 この結果は、 FAKのリ ン酸化すなわ ち活性化がコラーゲンをはじめとする細胞外マ トリ ックス過剰発現に関与するこ とを示している Figure 5 shows the results. As shown in the figure, there was no difference in total FAK expression between mock transfectants (Ml) and stable transfectants (S1-S4), but phosphorylation was observed only in transfectants. Was called. This result indicates that phosphorylation, or activation, of FAK is involved in overexpression of extracellular matrix, including collagen.

〔実施例 5〕 安定卜ランスフエクタン 卜の TGF J3シグナル伝達経路の活性化 mockトランスフェクタントおよび安定トランスフエクタントを 24時間無血清状 態で培養し、 細胞ライセートを調製した。 （a) 細胞ライセ一 ト （サンプル当 り lmgタンパク質） を抗 Smad3抗体を用いて免疫沈降し、 抗リン酸化セリ ン抗体を用 いてィムノブロッ トを行った。 同じ fl莫からス トリ ップを得て、 抗 Smad2/3抗体と 結合させ総 Smad3タンパク質量を測定した。 （b) 細胞ライセー ト （サンプル当り lmgタンパク質） を抗 T /3 RI抗体を用いて免疫沈降し、 抗リ ン酸化セリ ン抗体を用 いてィムノブロッ トを行った。 同じ膜からス トリ ップを得て、 抗 T /3 RI抗体と結 合させ総 T /3 RIタンパク質量を測定した。 免疫沈降およびィムノブ口ッティング は上述の方法により行った。 図 6 Aおよび図 6 Bにそれぞれ、 T i3 RIおよび Smad3の結果を示した。 図に示す ように、 mockトランスフエクタント（M1〜M3)と安定トランスフエクタント（Sl〜 S3)の間で T i3 RIおよび Smad3の発現量に差は認められなかったが、 リン酸化は安 定トランスフエクタン卜のみで認、められた。 このことは、 インテグリン ]3 5が過 剰発現している安定トランスフエクタントで、 Smadシグナル経路が活性化されて いることを示している。Example 5 Activation of TGF J3 Signaling Pathway of Stable Transfectants A mock transfectant and a stable transfectant were cultured in a serum-free state for 24 hours to prepare a cell lysate. (A) Cell lysate (lmg protein per sample) was immunoprecipitated using anti-Smad3 antibody, and immunoblotting was performed using anti-phosphorylated serine antibody. Strips were obtained from the same flmo, bound to anti-Smad2 / 3 antibody and total Smad3 protein was measured. (B) The cell lysate (lmg protein per sample) was immunoprecipitated using an anti-T / 3 RI antibody and subjected to immunoblotting using an anti-phosphorylated serine antibody. Strips were obtained from the same membrane, conjugated with anti-T / 3RI antibody and total T / 3RI protein was measured. The immunoprecipitation and the immunobutting were performed by the methods described above. FIGS. 6A and 6B show the results of Ti3 RI and Smad3, respectively. As shown in the figure, there was no difference in the expression levels of Ti3 RI and Smad3 between mock transfectants (M1 to M3) and stable transfectants (S1 to S3), but phosphorylation was stable. Approved and approved only by Transfectant. This indicates that the Smad signaling pathway is activated in stable transfectants in which integrin] 35 is overexpressed.

〔実施例 6〕 CAGAモチーフを含むピオチン標識オリ ゴヌク レオチドを用いたプ ノレダウンァッセィ [Example 6] Pholoredown assay using a biotin-labeled oligonucleotide containing a CAGA motif

ビォチン-ス トレプトァビジンプルダウンァッセィは以下の方法で行った。 センス鎖の 5 '末端にピオチンを含むォリ ゴヌク レオチドを用いてプルダウン ァッセィを行なった。 ォリ ゴヌク レオチドの配列は以下の通りであった。 Biotin-streptavidin pull-down assay was performed by the following method. Pull-down assays were performed using oligonucleotides containing biotin at the 5 'end of the sense strand. The sequence of the oligonucleotide was as follows.

1 ) 3 X CAGAォリ ゴ、 1) 3 X CAGA Oligo,

5 ' -TCGAGAGCCAGACAAGGAGCCAGACAAGGAGCCAGACACTCGAG ( CAGAモチーフの 卜 ジ マ 一） （配列番号 1 ) 5'-TCGAGAGCCAGACAAGGAGCCAGACAAGGAGCCAGACACTCGAG (TOGA I of CAGA motif) (SEQ ID NO: 1)

2 ) 3 X CAGA- Mォジゴ2) 3 X CAGA-M

5 ' - TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATACTCGA (変異 CAGAモチーフの 卜リマ 一） （配列番号 2 ) 5'-TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATACTCGA (trimer of mutant CAGA motif) (SEQ ID NO: 2)

これらのォリ ゴヌクレオチドはそれぞれの相ネ甫的ォリ ゴヌクレオチドにァニー ルし、 二重鎖オリゴヌクレオチドをゲルを用いて精製し用いた。 核タンパク質を 10mM Tri s-HCl , pH7. 4， 150mM NaCl, ImM EDTA, 1% Noni det P - 40， 50mM フツイ匕 ナトリ ウム， ImM フエニノレメチノレスノレフォニルフロ リ ド， ImM オノレ 卜ノくナデー ト ナト リ ウム， 1 μ g/ml ロイぺプチン， 1 g/ml ァプロチニンおよび 1 g/mlぺプ スタチンを含む溶解バッファーを用いて抽出した。 5_{μ β}のポリ （dl-dC) コンペ ティターを 500 μ gの核タンパク質と 4°Cで 30分間ィンキュベーションし、 次いで 500pmolのそれぞれの二重鎖才リ ゴヌク レオチドと 1時間ィンキュベーシヨンし た。 インキュベーション後、 65 μ 1のス トレプトアビジン ' ァガロース（Si gma社） を反応系に添カ卩し、 4 °Cでー晚インキュベーショ ンを ί亍なつた。 タンパク質- DNA-ス 卜レプトァビジン-ァガロース複合体を溶解バッファーを用いて 3回洗浄 し、 電気泳動用サンプルバッファーに再溶解させ、 3分間煮沸し、 簡単に遠心し、 上清について抗 Smad2/3抗体（S6620)を用いてゥエスタンブロッティングを行なつ た。These oligonucleotides were annealed to the respective oligonucleotides, and the double-stranded oligonucleotides were purified using a gel and used. Nucleoprotein was prepared from 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, ImM EDTA, 1% Noni det P-40, 50 mM Nadium sodium, ImM heninolemethinolesnorrefonyl fluoride, ImM onoletone. Extraction was carried out using a lysis buffer containing sodium sodium, 1 μg / ml leptin, 1 g / ml aprotinin and 1 g / ml peptatin. 5_{mu beta} poly (dl-dC) competition Tita the fin and incubation for 30 minutes at 500 mu g nuclear protein and 4 ° C, then each double Kusarisairi Gonuku Reochido and 1 hour Inkyu of 500pmol I did the basis. After the incubation, 65 μl of streptavidin 'agarose (Sigma) was added to the reaction system, and the mixture was incubated at 4 ° C. Wash protein-DNA-streptavidin-agarose complex 3 times with lysis buffer Then, the mixture was redissolved in an electrophoresis sample buffer, boiled for 3 minutes, centrifuged briefly, and the supernatant was subjected to estan blotting using an anti-Smad2 / 3 antibody (S6620).

24時間の無血清状態での培養後、 細胞を 24時間溶解バッファー （10 g/ml 口 ィぺプチン，ぺプスタチン，ァプロチニンおよび PMSFを含む 50mM Tri s- HC1， pH7. 4, 1% Tri ton X- 100， 150mM NaCl, 3m MgCl₂) で処理し核抽出物を調製した。 核抽 出物をピオチン標識オリ ゴヌクレオチドと共にィンキュベーションした。 これら のヌクレオチドに結合したタンパク質をス トレプトァビジンァガロースビーズを 用いて単離し、 Smad3をィムノブ口ッ ト分析により検出した。After 24 hours of serum-free culture, cells were lysed in a lysis buffer (50 mM Tris-HC1, pH 7.4, 1% Triton X containing 10 g / ml oral diptin, papstatin, aprotinin and PMSF) for 24 hours. -Nuclear extract was prepared by treatment with 100, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ ). Nuclear extracts were incubated with a biotin-labeled oligonucleotide. Proteins bound to these nucleotides were isolated using streptavidin agarose beads and Smad3 was detected by Immunobut analysis.

図 7に結果を示した。 用いたプローブ 3 X CAGAは、 安定トランスフエクタント (S1〜S3)に結合したが、 mockトランスフエクタン ト （M1〜M3) には結合しなかつ た。 また、 3 X CAGAMは両者とも結合しなかった。 この結果は、 安定な トランス フエクタントでは Smadが活性化し、 DNA結合能が亢進していることを示す。 Figure 7 shows the results. The probe 3X CAGA used bound to stable transfectants (S1-S3), but did not bind to mock transfectants (M1-M3). Also, 3X CAGAM did not bind to both. This result indicates that Smad is activated and DNA binding ability is enhanced in stable transfectants.

〔実施例 7〕 C0L1A2プロモーター中の安定な 卜ランスフェクタントの反応ェレ メ ン トのマッピング [Example 7] Mapping of reaction elements of stable transfectants in C0L1A2 promoter

プラスミ ドの構築は以下のようにして行った。 Construction of plasmid was performed as follows.

クロラムフエニコーノレァセチノレトランスフェラーゼ (CAT) レポーター遺伝子 に連結したヒ トコラーゲン α 2 (1)遺伝子断片 （転写開始部位を基準に +58 ^ ^ - 353bp) からなる - 353C0L1A2/CAT構築物および欠失分析に用いる C0L1A2/CAT構築 物を生成した （Ihn et al. ， J. Biol. Chem. 271： 26717-26723, 1996) 。 一過性転 写アツセィに用いるプラスミ ドは CsCl勾配を用いた遠心分離で 2回精製した。 2 つの調製物を用いて 2回の実験を行なった。 The 353C0L1A2 / CAT construct and its deletion consist of a human collagen α2 (1) gene fragment (+58 ^ ^-353 bp based on the transcription start site) linked to the chloramphenicolease transferase (CAT) reporter gene. A C0L1A2 / CAT construct was generated for loss analysis (Ihn et al., J. Biol. Chem. 271: 26717-26723, 1996). Plasmids used for transient transcription were purified twice by centrifugation using a CsCl gradient. Two experiments were performed with the two preparations.

mock卜ランスフエクタン 卜および安定な 卜ランスフエクタントを CATレポ一タ 一遺伝子に連結した種々の長さの C0L1A2プロモータ一を含むプラスミ ドでトラン スフェク 卜した。 mockトランスフエクタントにおける- 353プロモーター構築物の 活十生を 100と した。 他のプロモーターの活生は、 -353プロモーターに対する相対 値で表している。 グラフは C0L1A2プロモーター活性の 3〜 5回の実験の平均土 S. D.で表している。 図 8に結果を示した。 図 8の横軸は用いたプロモーター部位、 縦軸は相対的 CAT活性を示し、 コラーゲンの転写量を反映している。 この結果は、 Smad結合部 位を介して作用していることが示された。Mock transfectants and stable transfectants were transfected with plasmids containing various lengths of the C0L1A2 promoter linked to the CAT reporter gene. The activity of the -353 promoter construct in mock transfectants was set at 100. The activity of other promoters is expressed relative to the -353 promoter. The graph represents the average soil SD of 3-5 experiments of C0L1A2 promoter activity. Figure 8 shows the results. The horizontal axis in FIG. 8 shows the promoter site used, and the vertical axis shows the relative CAT activity, which reflects the transcription amount of collagen. This result indicated that it acts through the Smad binding site.

〔実施例 8〕 ドミナン トネガティブ_P85、 ドミナン トネガティブ Akt、 キナーゼ 欠失 TGF- タイプ I受容体、 キナーゼ欠失 TGF- 3タイプ II受容体、 ドミナントネ ガティブ FAKまたはィンテグリ ン α ν 3 5に対する抗体の安定トランスフェクタン トにおける C0L1 A2プ口モータ一活生に対する効果Example 8 Dominan preparative negative_P 85, Dominan preparative negative Akt kinase deficient TGF- type I receptor, kinase deficient TGF- 3 type II receptors, antibodies against dominant Ne Gatibu FAK or Integuri down alpha [nu 3 5 Of C0L1 A2 motor on stable life in stable transfectants

本実施例において一過性の転写は以下の方法で行った。 In this example, the transient transfer was performed by the following method.

線維芽細胞を 100mmディ ッシュ中、 10%FCSを含むダルベッコの MEM培地を用いて 50%コンフルェントまで増殖させた。 培地を無血清培地で置換し、 4時間のイン キュベ一シヨ ンの後、 培養物を 2 の- 353 C0L1A2/CAT構築物でトランスフエク トした。 この際、 2 μ gのミュータン トベクター （ドミナントネガティブ p85、 ド ミナントネガティブ Akt、 キナ一ゼ欠失 TbRI、 キナーゼ欠失 TbRI Iおよびドミナン トネガティブ FAK) またはそれぞれに対応する空の構築物を トランスフエク トに 用レヽた。 これらのベクターと して FuGENE6 (Roche Mol ecular Biochemi cal s社） を用いた。 ト ラ ンスフエク ト効率の小さな差を調整すべく 、 l g pSV-b- galactos i daseべクターをすベてのトランスフエタ トの際に用いた。 48時間のィ ンキュベーシヨ ン後、 細胞を 0. 25M Tri s HCl (pH8)中に回収し、 凍結融角? こよ り 破壊した。 バイオラッ ド試薬による測定によりタンパク質含量を一定にした抽出 物をブチル CoAおよび¹⁴ C -ク口ラムフエ二コールと共に 37°Cで 90分間ィンキュベ —トした。 ブチル化クロラムフエ二コールを有機溶媒 （テトラメチルペンタデカ ンとキシレンの 2 : 1混合物） を用いて抽出しシンチレーターカウンタ一により定 量した。 それぞれの実験は 2回行なった。Fibroblasts were grown to 50% confluence in 100 mm dishes using Dulbecco's MEM medium containing 10% FCS. The medium was replaced with serum-free medium and after 4 hours of incubation, the culture was transfected with 2 -353 C0L1A2 / CAT constructs. At this time, 2 μg of the mutant vector (dominant negative p85, dominant negative Akt, kinase deficient TbRI, kinase deficient TbRI I and dominant negative FAK) or the corresponding empty construct were transfected. I used it. FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals) was used as these vectors. In order to adjust for small differences in transfection efficiency, the lgpSV-b-galactosidase vector was used for all transfection. After incubation for 48 hours, the cells were collected in 0.25M Tris HCl (pH 8) and disrupted by freeze-thaw. Extracts with constant protein content as determined by Bio-Rad reagent were incubated with butyl CoA and¹⁴ C-mouth ramphenicol for 90 minutes at 37 ° C. Butylated chloramphenicol was extracted with an organic solvent (2: 1 mixture of tetramethylpentadecane and xylene) and quantified by a scintillator counter. Each experiment was performed twice.

mockトランスフエクタン 卜および安定トランスフェクタン トを一過'性に - 353 C0L1A2プロモータ一で空ベクターまたは図 9に示した各種ドミナントネガティブ 変異体構築物と共に同時トランスフエク トした。 これらの細胞をさらに抗インテ グリ ンひ V 5抗体またはコン ト ロール IgGの存在下、 -353 C0L1A2プロモータ一 で一過的にトランスフエク ト した。 黒塗りのバーは安定トランスフエクタン トに おけるプロモーター活性を示す。 白抜きのバーは mockトランスフェクタントの結 果を示す。 -353 C0L1A2プロモーター活性は空べクターコン ト口ールまたはコン トロール IgGに対する CAT活性の倍率で評価した。 データは 3回の独立した実験の 結果の平均土 S. D.で示す。The mock and stable transfectants were transiently transfected with the -353 C0L1A2 promoter together with the empty vector or the various dominant negative mutant constructs shown in FIG. These cells were further transiently transfected with the -353 C0L1A2 promoter in the presence of anti-integrin V5 antibody or control IgG. Black bars for stable transfer 4 shows promoter activity in the present invention. Open bars indicate the results of the mock transfectant. -353 C0L1A2 promoter activity was evaluated by the fold CAT activity relative to empty vector control or control IgG. Data are presented as mean soil SD from three independent experiments.

図 9に結果を示す、 図 9中横軸は同時トランスフヱク 卜したベクター中の変異 体を示し （但し、 右端は抗_a v i3 5抗体を外部から投与したことを示す） 、 縦軸 は相対的 CAT活性を示し、 コラーゲンの転写量を反映している。 図 9は、 用いた 全てのドミナントネガティブ、 欠失変異体で安定トランスフエクタントにおいて 空ベクターでトランスフエクタントした場合に比べコラーゲン転写量が抑制され ていることを示しており、 p85、 Akt、 FAK、 および T i3 RI Iのすべてがコラ一 ゲン転写に関与していることを示す。 mockトランスフェクタントでは空べクター と差はなかった。 また、 安定トランスフエクタントでは、 抗 α ν 3 5抗体を外部 から投与した場合にも、 コラーゲン転写量は抑制された。The results are shown in FIG. 9, FIG. 9, the horizontal axis represents the mutants in vector Bok co Toransufuweku (however, the right end indicates that the administration of_anti-a v i3 5 antibodies from outside), the vertical axis relative Shows CAT activity and reflects the amount of transcribed collagen. Figure 9 shows that in all the dominant negative and deletion mutants used, the amount of collagen transcript was suppressed in stable transfectants compared to transfection with empty vector, and p85, Akt, FAK , And Ti3RII are all involved in collagen transcription. The mock transfectant did not differ from the empty vector. In addition, in the case of stable transfectants, the amount of collagen transcribed was suppressed even when an anti-αν35 antibody was externally administered.

〔実施例 9〕 強皮症患者由来線維芽細胞における α 2 (I)コラーゲンおよび ΜΜΡ- 1発現に対する抗ィンテグリ ン β 5抗体の効果の検討 [Example 9] Examination of the effect of anti-integrin β5 antibody on α2 (I) collagen and ΜΜΡ-1 expression in scleroderma patient-derived fibroblasts

強皮症患者 2名よりそれぞれ採取した皮膚由来線維芽細胞 （SSc-1および SSc- 2) および正常人より採取した皮膚由来線維芽細胞 （NS)を 24時間の無血清培養の 後、 別の新しい無血清培地で抗イ ンテグ リ ン ]3 5抗体または対照と して pre immune IgG (S i gma社） を 10 μ g/mlの濃度で添加して培養した。 培養上清を用 いて、 抗 I型コラーゲン抗体および抗 MMP-1抗体を用いてゥエスタンブロティング を行った。 結果を図 1 0に示す。 図 1 0 Aは、 強皮症患者由来線維芽細胞での結 果を、 図 1 0 Bは、 正常線維芽細胞での結果を示す。 強皮症患者由来線維芽細胞 では、 pre immune IgGを添加した場合には （コントローノレでは） 、 α 2 ( 1)コラー ゲンの発現が多いが、 抗インテグリ ン ]3 5を添加した場合には、 " 2 (1)コラー ゲンの発現はほとんど認、められなかった。 正常,線糸隹芽細胞では、 preimmune IgG を添加した場合も、 抗インテグリ ン j3 5抗体を添加した場合も、 α 2 (1)コラー ゲンの発現は変化せず、 少なかった。 これらの結果は、 強皮症患者由来線維芽細 胞における a 2 (I)コラーゲン発現の亢進および MMP-1発現の低下に、 ィンテグリ ン β 5が中心的に関わっていることを示すものである。After skin-derived fibroblasts (SSc-1 and SSc-2) collected from two scleroderma patients and skin-derived fibroblasts (NS) collected from normal subjects, serum-free culture was performed for 24 hours. Anti-integrin] 35 antibody or a pre-immune IgG (Sigma) as a control was added at a concentration of 10 μg / ml in a fresh serum-free medium. Using the culture supernatant, eastern blotting was performed using an anti-type I collagen antibody and an anti-MMP-1 antibody. The results are shown in FIG. FIG. 10A shows the results with fibroblasts derived from scleroderma patients, and FIG. 10B shows the results with normal fibroblasts. In fibroblasts derived from scleroderma patients, when pre-immune IgG was added (in the control), α2 (1) collagen was highly expressed, but when anti-integrin] 35 was added, (2) (1) The expression of collagen was scarcely observed. In normal and fibroblastic blast cells, both preimmune IgG and anti-integrin j35 antibody, α2 (1) Collagen expression remained unchanged and was small These results indicate that a2 (I) increased collagen expression and decreased MMP-1 expression in fibroblasts derived from scleroderma patients. This indicates that β5 is centrally involved.

〔実施例 1 0〕 (Example 10)

mockトランスフエクタントおよび /3 5 トランスフェクタントから蛋白質を抽出 し、 抗クラスリン （clathrin) 抗体を用いて免疫沈降を行った。 免疫プロッ ト法 を用いて、 沈降された蛋白中の ct v、 ）3 5、 T)3 RI、 Tj3 RIIおよびクラスリンの量 を検討した。 Proteins were extracted from mock transfectants and / 35 transfectants and immunoprecipitated using anti-clathrin antibody. The amounts of ctv,) 35, T) 3RI, Tj3RII and clathrin in the precipitated proteins were examined using an immunoplot method.

結果を図 1 1 Aに示す。 この実験の結果は、 過去の報告と同様にクラスリンは α ν、 /3 5、 T /3 RIおよび T j3 RIIと会合していることを示している。 The results are shown in FIG. 11A. The results of this experiment indicate that clathrin is associated with αν, / 35, T / 3RI and Tj3RII, as in previous reports.

また、 mockトランスフエクタン トおよび i3 5 トランスフエクタントから蛋白質 を抽出し、 抗クラスリン抗体あるいは抗力べオリン （caveolin) 抗体を用いて免 疫沈降を行った。 免疫プロッ ト法を用いて、 沈降された蛋白中の α ν、 /3 5、 ク ラスリ ンおよび力べォリンの量を検討した（図 1 1 Β左） 。 また、 これらの抗体 を用いた免疫沈降法の効率を検討するため、 免疫沈降されなかった蛋白質中のク ラスリンおよび力べオリンの量を免疫ブロッ ト法にて検討した（図 1 1 Β右） 。 図 1 1 B右に示したように、 これらの抗体は効率的に標的蛋白を沈降できるこ とから、 図 1 1 Β左においてクラスリンおよび力べオリンと β 5の会合の比較が 可能となる。 図 1 1 Β左の結果は、 3 5は力べオリンと比較して、 クラスリンと より強く会合していることを示している。 In addition, proteins were extracted from mock and i35 transfectants and immunoprecipitated using anti-clathrin or caveolin antibodies. The amounts of αν, / 35, clarin and kyveolin in the precipitated proteins were examined using the immunoplot method (Fig. 11, left). In addition, in order to examine the efficiency of immunoprecipitation using these antibodies, the amounts of clarin and kyveline in the proteins that had not been immunoprecipitated were examined by immunoblotting (Fig. 11, right). . As shown on the right of Fig. 11B, these antibodies can efficiently precipitate the target protein, allowing comparison of the association of β5 with clathrin and ryveolin on the left of Fig. 11 Β . Fig. 11 Β The results on the left show that 35 is more strongly associated with clathrin than with rybeolin.

さらに、 mock卜ランスフエクタントおよび ]3 5 トランスフエクタント力 ら蛋白 質を抽出し、 抗 0 5抗体を用いて免疫沈降を行った。 免疫ブロッ ト法を用いて、 沈降された蛋白中の 3 5、 T 3 RIおよび T 3 RIIの量を検討した。 Furthermore, proteins were extracted from mock transfectants and] 35 transfectants, and immunoprecipitated using anti-0.5 antibodies. The amount of 35, T3RI and T3RII in the precipitated proteins was examined using the immunoblot method.

図 1 1 Cに結果を示した。 この実験結果は、 /3 5 と T j3 RIおよび T i3 RIIが会合 していることを示している。 〔参考文献リスト〕Fig. 11C shows the results. The results of this experiment indicate that / 35 is associated with Tj3RI and Ti3RII. [Reference List]

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A strategy for determining the pathogenesis of systemic sclerosis. Is transforming growth factor β the answer? Arthritis JRheum, 32,817-825. A strategy for determining the pathogenesis of systemic sclerosis.Is transforming growth factor β the answer? Arthritis JRheum, 32,817-825.

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35. Hodivala - Dilke, K. M. Mc Hugh, K. P. Tsakiris, D. A. Rayburn, H. Cr owley, D. Ul Iman-Cul lere, M. Ross, F. P. Coller, B. S. Tei telbaum, S. and Hynes, R.0. β 3~integr in-def icient mice are a model for Glanzmann t hrombasthenia showing placental defects and reduced survival. J. Clin. I nvest. 1999； 103： 229-238 35. Hodivala-Dilke, KM Mc Hugh, KP Tsakiris, DA Rayburn, H. Cowley, D. Ul Iman-Cul lere, M. Ross, FP Coller, BS Tei telbaum, S. and Hynes, R.0.β 3 ~ integr in-def icient mice are a model for Glanzmann thrombasthenia showing placental defects and reduced survival.J. Clin. Invest. 1999; 103: 229-238

36. Mc Hugh, K. P. Hodivala- Dilke, K. Zheng, M. H Namba, N. Lam, J. , Novack, D. Feng, X Ross, F. P. Hynes, R.0. and Tei telbaum, S.し Mic e lacking β 3 integr ins are osteosclerotic because of dysfunctional oste oclasts. J. Clin. Invest. 2000； 105： 433 - 440 36. Mc Hugh, KP Hodivala- Dilke, K. Zheng, M. H Namba, N. Lam, J., Novack, D. Feng, X Ross, FP Hynes, R.0. And Tei telbaum, S. Mic e lacking β 3 integr ins are osteosclerotic because of dysfunctional oste oclasts. J. Clin. Invest. 2000; 105: 433-440

37. Feng, X. , Novack, D. V. Faccio, R. 0ry D. S. Aya K. Boyer, M. I. , Mc Hugh, K. P. , Ross, F. P. and Tei telbaum, S. L. A Glanzmann' s mutation in 33 integrin specifically impairs osteoclast function. J. Clin. Inves t. 2001； 107： 1137 - 1144 37.Feng, X., Novack, DV Faccio, R. 0ry DS Aya K. Boyer, MI, Mc Hugh, KP, Ross, FP and Tei telbaum, SL A Glanzmann's mutation in 33 integrin specifically impairs osteoclast function. J Clin. Inves t. 2001; 107: 1137-1144.

38. Weinacker A, Chen A, Agrez M Cone RI Nishimura S Wayner E Pytela R and Sheppard D. Role of the integrin a v jS 6 in cell attachment to f ibronect in. Heterologous expression of intact and secreted forms of the receptor. J. Biol. Chem. 1994； 269: 6940 - 694838. Weinacker A, Chen A, Agrez M Cone RI Nishimura S Wayner E Pytela R and Sheppard D. Role of the integrin av jS 6 in cell attachment to f ibronect in. Heterologous expression of intact and secreted forms of the receptor. Biol. Chem. 1994; 269: 6940-6948.

39. Moyle M Napier MA, and McLeanSg JW. Cloning and Expression of a Di ergent Integrin Subunit β 8. J. Biol. Chem. 1991； 266： 19650 - 19658 配列表フリーワード39. Moyle M Napier MA, and McLeanSg JW. Cloning and Expression of a Diergent Integrin Subunit β 8. J. Biol. Chem. 1991; 266: 19650-19658 Sequence Listing Free Word

配列番号 1および 2 ：合成 DNASEQ ID NOS: 1 and 2: Synthetic DNA

産業上の利用可能性Industrial applicability

実施例が示すように、 ヒ ト線維芽細胞をインテグリ ン /3 5をコードする遺伝子 で トランスフエク トすることにより細胞表面にィンテグリ ンひ v iS 5を過剰に発 現する安定なトランスフエクタントが得られる。 該トランスフヱクタン トでは、 TGF βの非存在化においてィンテグリン a v ;S 5を介してコラ一ゲン遺伝子の発現 を促進するシグナル伝達経路である Sma dシグナル伝達経路および P 13K/ A k tシグ ナル伝達経路が活性化されており、 常にコラーゲン遺伝子の発現が亢進している_c 従って、 該トランスフエクタン 卜は線維化している組織や器官特に皮膚のモデル 細胞と して利用することができる。 また、 該トランスフエクタントを用いてイン テグリ ン 5を介してコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル伝達経路 を阻害する化合物をスク リ一ユングすることができ、 このスク リ一ユングにより 得られた化合物は線維化に起因する疾患の予防薬または治療薬と して使用しうる さらに、 実施例が示すよ うに、 インテグリ ン a V jS 5を介しコラーゲン遺伝子 の発現を促進するシグナル伝達経路を阻害する化合物により コラーゲンの発現を 抑制することができ、 このような化合物を線維化抑制剤と して用いることができ る。As the examples show, transfection of human fibroblasts with a gene encoding integrin / 35 yields a stable transfectant that overexpresses integrins or iS5 on the cell surface. can get. The transfectants include Smad signaling pathway and P13K / Akt signaling, which are signaling pathways that promote expression of collagen genes via integrin av; S5 in the absence of TGFβ. pathway has been activated, always therefore_c expression of collagen genes is enhanced, the transflector Ek Tan I can be utilized as a model cell tissues and organs, especially the skin is fibrosis. Further, a compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin 5 can be screened using the transfectant, and a compound obtained by the screening can be used. Can be used as a prophylactic or therapeutic agent for diseases caused by fibrosis.In addition, as shown in Examples, compounds that inhibit signal transduction pathways that promote collagen gene expression via integrin a V jS5 Thus, the expression of collagen can be suppressed, and such a compound can be used as a fibrosis inhibitor.

特に、 抗インテグリン /3 5抗体は、 インテグリン i3 5 と他のシグナル伝達に関 与する物質の会合を阻害し、 線維化のシグナルの伝達を抑制することにより線維 化を抑制することができる。 この点、 実施例 9において、 抗インテグリ ン 5抗体 の投与により、 線維化の原因となるコラーゲンの発現が抑制されることが示され ている。 また、 インテグリン J3 5ノックアウ トマウスを用いた検討により、 イン テグリン 5の機能が抑えられてもマウスの生存等に影響はないことがわかって おり、 インテグリ ン /3 5と他の物質との会合を阻害しても、 大きな副作用は生じ ないことが予測される。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書に取 り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発 明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能である ことは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形およ び変更をも包含することを意図している。In particular, the anti-integrin / 35 antibody can inhibit fibrosis by inhibiting the association of integrin i35 with other substances involved in signal transduction, and by suppressing the transmission of fibrosis signals. In this regard, Example 9 shows that administration of an anti-integrin 5 antibody suppresses the expression of collagen that causes fibrosis. In addition, studies using integrin J35 knockout mice have shown that suppressing the function of integrin 5 has no effect on the survival of mice, and the association of integrin / 35 with other substances was confirmed. Inhibition is not expected to cause significant side effects. All publications cited herein are incorporated by reference in their entirety. Shall be included. It will be readily understood by those skilled in the art that various modifications and changes of the present invention are possible without departing from the scope of the technical idea and the invention described in the appended claims. . The present invention is intended to cover such modifications and variations.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims

1. ィンテグリン α 5を介しコラ一ゲン遺伝子の発現を促進するシグナル 伝達経路を阻害する化合物を有効成分と して含む、 器官または組織の線維化抑制 剤。 1. An organ or tissue fibrosis inhibitor comprising, as an active ingredient, a compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin α5.

2. ィンテグリン c vi3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル 伝達経路が PI3K/Aktシグナル伝達経路である、 請求項 1記載の器官または組織の 線維化抑制剤。 2. The organ or tissue fibrosis inhibitor according to claim 1, wherein the signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin cvi35 is the PI3K / Akt signal transduction pathway.

3. ィンテグリン a V β 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル 伝達経路が Smad経路である、 請求項 1記載の器官または組織の線維化抑制剤。 3. The organ or tissue fibrosis inhibitor according to claim 1, wherein the signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin aVβ5 is the Smad pathway.

4. ィンテグリン a V β 5を介しコラ一ゲン遺伝子の発現を促進するシグナル 伝達経路を阻害する化合物が抗インテグリン /3 5抗体である請求項 1記載の線維 化抑制剤。4. The fibrosis-suppressing agent according to claim 1, wherein the compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin aVβ5 is an anti-integrin / 35 antibody.

5. 抗インテグリ ン /3 5抗体が、 TGF/3 I型受容体とクラスリ ンの会合およびノ または TGF/3 II型受容体とクラスリ ンの会合を阻害する請求項 4記載の線維芽化 制剤剤。 5. The fibroblast formation inhibitor according to claim 4, wherein the anti-integrin / 35 antibody inhibits the association between TGF / 3 type I receptor and clathrin and the association between TGF / 3 type II receptor and clathrin. Agent.

6. 抗インテグリン /3 5抗体が、 インテグリ ン i3 5 と TGF/3 I型受容体との結合 および Zまたはィンテグリ ン 3 5と TGFi3 II型受容体との結合を阻害する請求項 4記載の線維化抑制剤。 6. The fiber according to claim 4, wherein the anti-integrin / 35 antibody inhibits binding of integrin i35 to TGF / 3 type I receptor and binding of Z or integrin 35 to TGFi3 type II receptor. Chemical inhibitor.

7. インテグリ ン αν]3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル 伝達経路を阻害する化合物が抗 TGF/3 レセプター抗体である請求項 1記載の線維 化抑制剤。 7. The fibrosis inhibitor according to claim 1, wherein the compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes collagen gene expression via integrin αν] 35 is an anti-TGF / 3 receptor antibody.

8. ィンテグリン ανβ 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル 伝達経路を阻害する化合物がサイ トカラシン Dである請求項 1記載の線維化抑制 剤。 8. The fibrosis inhibitor according to claim 1, wherein the compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin ανβ5 is cytochalasin D.

9. インテグリ ン αν]3 5を介しコラーゲン遺伝子の発現を促進するシグナル 伝達経路を阻害する化合物が FAKを標的とする化合物である請求項 1記載の線維 化抑制剤。 9. The fibrosis inhibitor according to claim 1, wherein the compound that inhibits a signal transduction pathway that promotes the expression of a collagen gene via integrin αν] 35 is a compound that targets FAK.

1 0. PI3K/Aktシグナル伝達経路を阻害する化合物が ΡΙ3キナーゼインヒ ビタ 1 0. Compounds that inhibit the PI3K / Akt signaling pathway are ΡΙ3 kinase inhibitors

—または Aktィンヒ ビターである請求項 2記載の線維化抑制剤。3. The fibrosis inhibitor according to claim 2, which is Akt inhibitor.

1 1 . PI 3キナーゼィンヒ ビターが LY294002である請求項 1 0記載の,線維ィ匕抑 制剤。11. The fibrillation inhibitor according to claim 10, wherein the PI3 kinase inhibitor is LY294002.

1 2 . 抗体がモノクローナル抗体である請求項 4から 7のいずれか 1項に記載 の線維化抑制剤。 12. The fibrosis inhibitor according to any one of claims 4 to 7, wherein the antibody is a monoclonal antibody.

1 3 . 抗体がヒ 卜化抗体またはヒ ト抗体である請求項 4から 7のいずれか 1項 に記載の線維化抑制剤。 13. The fibrosis inhibitor according to any one of claims 4 to 7, wherein the antibody is a humanized antibody or a human antibody.

1 4 . 肝硬変における肝臓の線維化を抑制する、 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の線維化抑制剤。 14. The fibrosis inhibitor according to any one of claims 1 to 13, which suppresses liver fibrosis in cirrhosis.

1 5 . 皮膚の線維化を抑制する、 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の線 維化抑制剤。 15. The fibrosis inhibitor according to any one of claims 1 to 13, which suppresses skin fibrosis.

1 6 . 強皮症、 ケロイ ドおよび肥厚性瘢痕からなる群から選択される皮膚の線 維化が原因となる疾患の治療薬として用い得る、 請求項 1 5記載の線維化抑制剤_c16. The fibrosis inhibitor_{c according to} claim 15, which can be used as a therapeutic agent for a disease caused by skin fibrosis selected from the group consisting of scleroderma, keloids, and hypertrophic scars.

1 7 . 糖尿病性腎症を含む慢性腎疾患および急性腎不全においてみられる腎線 維化を抑制する、 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の線維化抑制剤。17. The fibrosis inhibitor according to any one of claims 1 to 13, which suppresses renal fibrosis seen in chronic kidney disease including diabetic nephropathy and acute renal failure.

1 8 . 腹膜透析で問題となる腹膜硬化症の線維化を抑制する、 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の線維化抑制剤。 18. The fibrosis inhibitor according to any one of claims 1 to 13, which suppresses fibrosis of peritoneal sclerosis, which is a problem in peritoneal dialysis.

1 9 . 肺線維症における肺の線維化を抑制する、 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の線維化抑制剤。 19. The fibrosis inhibitor according to any one of claims 1 to 13, which suppresses lung fibrosis in pulmonary fibrosis.

2 0 . インテグリン ]3 5をコードする遺伝子でトランスフエク トした動物線維 芽細胞由来の、 イ ンテグリ ン a y 0 5を強発現し線維化器官または組織の細胞の モデル細胞として用い得る細胞。 20. A cell derived from an animal fibroblast transfected with a gene encoding integrin] 35, which strongly expresses integrin ay05 and can be used as a model cell of a cell of a fibrotic organ or tissue.

2 1 . トランスフエクタン ト S ct v )3 5 (受託番号 FERM BP- 08632) である請求 項 2 0記載の細胞。 21. The cell according to claim 20, which is a transfectant Sct v) 35 (accession number FERM BP-08632).

2 2 . 器官または組織の線維化の治療および/または予防薬と して有用な化合 物をスク リ一二ングする方法であって、 試験化合物を請求項 2 0または 2 1に記 載の細胞と接触させて、 細胞におけるコラーゲン発現を検出し、 コラーゲン発現 が抑制された場合に前記化合物が線維化の治療および/または予防薬と して有用 であると決定することを含む方法。 22. A method for screening for a compound useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for fibrosis of an organ or tissue, comprising a test compound comprising the cell according to claim 20 or 21. Detecting collagen expression in cells, and determining that the compound is useful as a therapeutic and / or prophylactic agent for fibrosis when collagen expression is suppressed.