WO2003072773A1 - Fused protein having glucuronyl transferase activity - Google Patents

Abstract

A fused protein composed of a polypeptide comprising a specific amino acid sequence and a peptide for identification having been fused therewith, characterized by having an enzyme activity of transferring glucuronyl from a glucuronyl donor to an N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end in a chondroitin skeleton.

Description

明 細 書 ダルク口ン酸転移酵素活性を有する融合タンパク質 技術分野 Description Fusion protein having dulcus glucosyltransferase activity

本発明は、 酵素活性を有する融合タンパク質に関し、 より詳細にはコンドロ ィチン骨格中に存在する非還元末端の N-ァセチルガラク トサミン残基にダルク ロン酸を転移する酵素活性を有する融合タンパク質に関する。 背景技術 The present invention relates to a fusion protein having an enzymatic activity, and more particularly, to a fusion protein having an enzymatic activity to transfer dalcuronic acid to a non-reducing terminal N-acetylgalactosamine residue present in a chondroitin skeleton. Background art

コンドロイチン硫酸及びコンドロイチンは D-グルクロン酸 （以下単に 「ダル クロン酸」 又は 「GlcAj とも記載する） 残基と N-ァセチルガラク トサミン （以 下単に 「N-ァセチルガラク トサミン」 又は 「GalNAc」 とも記載する） 残基の二 糖の繰り返し構造 （すなわち、 - [GlcA ]3 (1，3) - GalNAc j3 (1，4) - ]_n： nは 2以上の 整数を示す） を基本骨格とするダリコサミノダリカンの一種である。Chondroitin sulfate and chondroitin are D-glucuronic acid (hereinafter simply referred to as "dalcuronic acid" or "GlcAj") residues and N-acetylgalactosamine (hereinafter also referred to simply as "N-acetylgalactosamine" or "GalNAc") residues. Darikosaminodarican having a basic skeleton of a repeating structure of the disaccharide of the group (that is,-[GlcA] 3 (1,3) -GalNAcj3 (1,4)-]_n : n is an integer of 2 or more) Is a kind of

ダリコサミノグリカン、 特にコンドロイチンやコンドロイチン硫酸は従来、 動物の臓器等から抽出 ·精製されていたが、 近年、 原料の不足から、 コンドロ イチンゃコンドロイチン硫酸に共通する前記二糖の繰り返し構造からなる基本 骨格 （コンドロイチン骨格とも称される） を人工的に合成する手法が模索され ている。 特に、 ヒ ト由来の酵素であれば、 人工的に合成したコンドロイチン又 はコンドロイチン硫酸に当該酵素が混入していても、 抗原抗体反応などの生体 防御機構が強く作用することもないが、 現時点においてこのような基本骨格を 合成するための酵素、 その中でも特にヒ ト由来であってグルクロン酸転移酵素 活性を有していて、 N_ァセチルガラク トサミン転移酵素活性は有していない酵 素は未だに発見されていない。 Daricosaminoglycans, especially chondroitin and chondroitin sulfate, have conventionally been extracted and purified from animal organs, etc.In recent years, due to a shortage of raw materials, chondroitin has a basic structure consisting of the repeating structure of the disaccharide common to chondroitin sulfate. A method for artificially synthesizing a skeleton (also called a chondroitin skeleton) is being sought. In particular, if the enzyme is derived from human, even if the enzyme is contaminated with artificially synthesized chondroitin or chondroitin sulfate, biological defense mechanisms such as antigen-antibody reaction do not act strongly. Enzymes for synthesizing such a basic skeleton, particularly enzymes derived from human and having glucuronyltransferase activity but not N_acetylgalactosaminetransferase activity have been discovered. Not.

コンドロイチン骨格の合成に関わるヒ ト由来の酵素のうち、 グルクロン酸転 移酵素活性を有しているが、 N-ァセチルガラク トサミン転移酵素活性を実質的 に有しない酵素の大量合成のためにその酵素をコードする遺伝子が必要とされ ており、 また遺伝子治療の可能性を模索するためにもそのような遺伝子が必要 とされているにも関わらず、 そのような酵素の遺伝子は得られていなかった。 発明の開示Among the human enzymes involved in the synthesis of the chondroitin skeleton, it has glucuronic acid transferase activity, but has substantial N-acetylgalactosamine transferase activity. Despite the need for genes encoding the enzymes for large-scale synthesis of enzymes that do not have them, and for those seeking gene therapy potential, No gene for such an enzyme has been obtained. Disclosure of the invention

本発明の目的はコンドロイチン骨格の合成に関与する酵素のうち、 N-ァセチ ルガラク トサミン転移酵素活性を実質的に有さず、 グルクロン酸転移酵素活性 を有する酵素 （以下 「GlcAT」 とも略記する） と識別ペプチドとの融合タンパ ク質及びその遺伝子工学的な製造方法並びにコンドロイチン骨格を有する糖鎖 の製造方法を提供することに存する。 An object of the present invention is to provide, among enzymes involved in the synthesis of a chondroitin skeleton, an enzyme having substantially no N-acetylgalactosamine transferase activity and having glucuronyltransferase activity (hereinafter abbreviated as "GlcAT"). An object of the present invention is to provide a fusion protein with an identification peptide, a method for producing the fusion protein by genetic engineering, and a method for producing a sugar chain having a chondroitin skeleton.

本発明者は上記目的を達成するために鋭意検討した結果、 ヒ トの GlcATの cDNAを見つけだし、 ヒ トの GlcATの大量合成を可能として、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は以下の通りである。 The present inventors have conducted intensive studies in order to achieve the above object, and as a result, have found human GlcAT cDNA, and have succeeded in synthesizing human GlcAT in large quantities, thereby completing the present invention. That is, the present invention is as follows.

( 1 ) 配列番号 4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 または配列番 号 4記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加 および Zまたは転位されたアミノ酸配列からなるポリぺプチドと、 識別べプチ ドとが融合してなり、 グルクロン酸供与体からコンドロイチン骨格中に存在す る非還元末端の N-ァセチルガラタ トサミン残基にダルク口ン酸を転移する酵素 活性を有することを特徴とする融合タンパク質。 (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added, or Z or transposed. The peptide and the discriminating peptide are fused, and have the enzyme activity to transfer dalc vulcanic acid from the glucuronic acid donor to the non-reducing terminal N-acetylgalatatosamine residue present in the chondroitin skeleton. Characterized fusion protein.

( 2 ) グルクロン酸供与体から、 非還元末端が N-ァセチルガラクトサミン残 基であり、 コンドロイチン骨格を有する 7糖からなるオリゴ糖の該 N-ァセチル ガラク トサミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、 N-ァセチルガラク ト サミン供与体から、 非還元末端がグルクロン酸残基であり、 コンドロイチン骨 格を有する 6糖からなるオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては実質的に N-ァセ チルガラタ トサミン残基を転移する活性を有しないことを特徴とする （1 ) 記 載の融合タンパク質。 (3) 識別ペプチドがシグナルペプチド、 プロテインキナーゼ 、 プロティ ン ダルタチオン S転移酵素、 Hisタグ、 mycタグ、 FLAGタンパク質、 T7タグ、(2) A glucuronic acid residue is transferred from the glucuronic acid donor to the N-acetylgalactosamine of an oligosaccharide comprising a heptasaccharide having a chondroitin skeleton, the non-reducing end of which is an N-acetylgalactosamine residue. However, from the N-acetylgalactosamine donor, a non-reducing end is a glucuronic acid residue, and the glucuronic acid of an oligosaccharide consisting of a hexasaccharide having a chondroitin skeleton is substantially N-acetylgalactosamine. (1) The fusion protein according to (1), which has no activity of transferring a residue. (3) Identification peptides are signal peptide, protein kinase, protein daltathione S-transferase, His tag, myc tag, FLAG protein, T7 tag,

Sタグ、 HSVタグ、 pelB、 HAタグ、 Trxタグ、 CBPタグ、 CBDタグ、 CBRタグ、 0- lac/blu、 β -gal , luc、 HP- Thio、 HSP、 Ln γ、 Fn、 GFP、 YFP、 CFP、 BFP、 DsRed、 DsRed2、 MBP、 LacZ、 IgG、 アビジン、 及びプロテイン Gからなる群から 選択されるいずれか一つのペプチドであることを特徴とする （1) 又は （2) 記載の融合タンパク質。S tag, HSV tag, pelB, HA tag, Trx tag, CBP tag, CBD tag, CBR tag, 0-lac / blu, β-gal, luc, HP-Thio, HSP, Lnγ, Fn, GFP, YFP, The fusion protein according to (1) or (2), which is any one peptide selected from the group consisting of CFP, BFP, DsRed, DsRed2, MBP, LacZ, IgG, avidin, and protein G.

(4) (1) 乃至 （3) のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードする DNA。 (4) A DNA encoding the fusion protein according to any one of (1) to (3).

(5) (4) 記載の DNAを含むベクター。 (5) A vector containing the DNA of (4).

(6) (5) 記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。 (6) A transformant obtained by introducing the vector according to (5) into a host cell.

(7) (6) 記載の形質転換体を生育させ、 生育物から融合タンパク質を単 離することを特徴とする （1) 乃至 （3) のいずれか一項記載の融合タンパク 質の製造方法。 (7) The method for producing a fusion protein according to any one of (1) to (3), wherein the transformant according to (6) is grown, and a fusion protein is isolated from the grown product.

( 8 ) 下記性質を有するダルク口ン酸転移酵素。 (8) A Dulco-glucosyltransferase having the following properties.

(a) 作用 (a) Action

グルクロン酸供与体から、 受容体である N-ァセチルガラタ トサミン残基にグ ルク口ン酸残基を転移する。 The glucuronic acid residue is transferred from the glucuronic acid donor to the acceptor N-acetylgalatatosamine residue.

(b) 基質特異性 (b) Substrate specificity

グルクロン酸供与体から、 非還元末端が N-ァセチルガラク トサミン残基であ り、 コンドロイチン骨格を有する 7糖からなるオリゴ糖の該 N-ァセチルガラク トサミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、 N -ァセチルガラク トサミン 供与体から、 非還元末端がグルクロン酸残基であり、 コンドロイチン骨格を有 する 6糖からなるオリゴ糖の該ダルクロン酸に対しては実質的に N-ァセチルガ ラクトサミン残基を転移する活性を有しない。 The glucuronic acid donor transfers the glucuronic acid residue to the N-acetylgalactosamine of an oligosaccharide comprising a heptasaccharide having a chondroitin skeleton from the glucuronic acid donor. From the acetyl galactosamine donor, the non-reducing end is a glucuronic acid residue, and the oligosaccharide consisting of a hexasaccharide having a chondroitin skeleton has an activity of substantially transferring an N-acetyl galactosamine residue to the dalcuronic acid. Do not have.

(c) 活性の阻害 (c) Inhibition of activity

エチレンジアミン四酢酸共存下では酵素活性を実質的に示さなレ、。 ( 9 ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列、 または配列番号 4記載のァミノ酸配 列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加および Zまたは転位 されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする （8 ) 記載のグルクロン酸転移酵 素。In the presence of ethylenediaminetetraacetic acid, substantially no enzyme activity is exhibited. (9) The amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 wherein one or more amino acids include a deleted, substituted, inserted, added, or Z- or transposed amino acid sequence. The glucuronic acid transferase according to (8).

( 1 0 ) 非還元末端に N-ァセチルガラク トサミン残基を有するとともにコン ドロイチン骨格を有する糖鎖に対し、 （1 ) 乃至 （3 ) のいずれか一項記載の 融合タンパク質或いは （8 ) 又は （9 ) 記載のグルクロン酸転移酵素を作用さ せ、 グルクロン酸供与体から該糖鎖の非還元末端の N-ァセチルガラク トサミン 残基にグルクロン酸を転移することを特徴とする、 コンドロイチン骨格を有す る糖鎖の製造方法。 (10) The fusion protein according to any one of (1) to (3), or (8) or (9), for a sugar chain having an N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end and having a chondroitin skeleton. ) Having a chondroitin skeleton, wherein the sugar has a chondroitin skeleton by reacting the glucuronyltransferase according to (1) to transfer glucuronic acid from a glucuronic acid donor to an N-acetylgalactosamine residue at a non-reducing end of the sugar chain. Chain manufacturing method.

( 1 1 ) 配列番号 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、 または配列 番号 4記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付 加および/または転位されたァミノ酸配列からなるポリぺプチドを含むタンパ ク質を含有し、 非還元末端に N-ァセチルガラク トサミン残基を有するコンドロ ィチン骨格からなる糖鎖にダルク口ン酸供与体からダルク口ン酸を転移する活 性を有する糖鎖合成剤。 (11) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added and / or transposed in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Activity of transferring dalc oxalic acid from a dalc oxalate donor to a sugar chain comprising a chondroitin skeleton containing a protein containing a polypeptide consisting of N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end And a sugar chain synthesizing agent.

( 1 2 ) タンパク質が配列番号 4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 または配列番号 4記載のァミノ酸配列において 1以上のァミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加および または転位されたァミノ酸配列からなるポリぺプチドと、 識別ペプチドとの融合タンパク質を含むことを特徴とする （1 1 ) 記載の糖鎖 合成剤。 図面の簡単な説明 (12) a polypeptide in which a protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added, or transposed in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (11) The sugar chain synthesizing agent according to (11), comprising a fusion protein of a polypeptide consisting of: and an identification peptide. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

第 1図は、 各形質転換体の培養物をウェスタンプロッティング法により解析 した写真である。 矢印は本発明物質のバンドを示す。 FIG. 1 is a photograph of a culture of each transformant analyzed by Western blotting. The arrow indicates the band of the substance of the present invention.

第 2図は、 コンドロイチンに対する N-ァセチルガラク トサミン転移活性を示 す図である。 白丸は本発明物質を、 黒丸は陽性対照を示す。 第 3図は、 コンドロイチン硫酸 6糖に対する N-ァセチルガラク トサミン転移 酵素活性を示す図である。 白丸は本発明物質を、 黒丸は陽性対照を示す。FIG. 2 shows N-acetylgalactosamine transfer activity on chondroitin. Open circles indicate the substance of the present invention, solid circles indicate a positive control. FIG. 3 is a graph showing the activity of N-acetylgalactosamine transferase on chondroitin sulfate hexasaccharide. Open circles indicate the substance of the present invention, solid circles indicate a positive control.

第 4図は、 コンドロイチンに対するグルクロン酸転移活性を示す図である。 白丸は本発明物質を、 黒丸は陽性対照を示す。 FIG. 4 is a diagram showing glucuronyl transfer activity on chondroitin. Open circles indicate the substance of the present invention, solid circles indicate a positive control.

第 5図は、 コンドロイチン硫酸 7糖に対するダルク口ン酸転移活性を示す図 である。 白丸は本発明物質を、 黒丸は陽性対照を示す。 FIG. 5 is a diagram showing the activity of transfer of dalc to chondroitin sulfate heptasaccharide. Open circles indicate the substance of the present invention, solid circles indicate a positive control.

第 6図は、 エチレンジァミン四酢酸によるダルク口ン酸転移活性の阻害を示 す図である。 白丸はエチレンジァミン四酢酸非存在下での本発明物質を、 黒丸 はエチレンジァミン四酢酸存在下での本発明物質を、 白四角は陰 t¾対照を示す。 第 7図は、 コンドロイチン硫酸 7糖にダルクロン酸が転移されて生じたコン ドロイチン硫酸 8糖とその酵素分解による影響を示す図である。 白丸は本発明 物質によって調製したコンドロイチン硫酸 8糖を、 黒丸は前記コンドロイチン 硫酸 8糖をコンドロイチナーゼ ABCで消化した産物を示す。 FIG. 6 is a diagram showing the inhibition of transfer activity of dulc acid by ethylenediaminetetraacetic acid. Open circles indicate the substance of the present invention in the absence of ethylenediaminetetraacetic acid, black circles indicate the substance of the present invention in the presence of ethylenediaminetetraacetic acid, and open squares indicate the negative control. FIG. 7 is a diagram showing chondroitin sulfate octasaccharide produced by transfer of dalcuronate to chondroitin sulfate heptasaccharide and the effect of enzymatic degradation thereof. Open circles indicate chondroitin sulfate octasaccharide prepared by the substance of the present invention, and black circles indicate products obtained by digesting the chondroitin sulfate octasaccharide with chondroitinase ABC.

第 8図は、 コンドロイチン硫酸 11糖 （CS11) 濃度とグルクロン酸転移酵素活 性との関係を示す図である。 FIG. 8 is a graph showing the relationship between chondroitin sulfate 11 sugar (CS11) concentration and glucuronyltransferase activity.

第 9図は、 ゥリジン二リン酸 （UDP) -ダルク口ン酸濃度とダルク口ン酸転移 酵素活性との関係を示す図である。 FIG. 9 is a graph showing the relationship between the concentration of peridine diphosphate (UDP) -dalc oxalate and the activity of the enzyme.

第 1 0図は、 ヒ ト健常組織及び株化細胞における本発明酵素の発現を定量的 PCR反応で測定した図である。 発明を実施するための最良の形態 FIG. 10 is a diagram showing the expression of the enzyme of the present invention in healthy human tissues and cell lines measured by quantitative PCR. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

以下、 発明の実施の形態により本発明を詳説する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by embodiments of the present invention.

( 1 ) 本発明酵素 (1) Enzyme of the present invention

本発明酵素は下記性質を有する。 The enzyme of the present invention has the following properties.

( a ) 作用 (a) Action

グルクロン酸供与体から、 受容体である N-ァセチルガラタ トサミン残基にグ ルクロン酸残基を転移する。 ( b ) 基質特異性Transfer glucuronic acid residue from glucuronic acid donor to acceptor N-acetylgalatatosamine residue. (b) Substrate specificity

グルクロン酸供与体から、 非還元末端が N-ァセチルガラク トサミン残基であ り、 コンドロイチン骨格を有する 7糖からなるオリゴ糖の該 N -ァセチルガラク トサミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、 N-ァセチルガラタトサミン 供与体から、 非還元末端がグルクロン酸残基であり、 コンドロイチン骨格を有 する 6糖からなるオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては実質的に N-ァセチルガ ラクトサミン残基を転移する活性を有しない。 The glucuronic acid donor transfers the glucuronic acid residue to the N-acetylgalactosamine of an oligosaccharide consisting of a heptasaccharide having a chondroitin skeleton from the glucuronic acid donor, where the non-reducing end is an N-acetylgalactosamine residue. A non-reducing end is a glucuronic acid residue from an acetyl galatatosamine donor, and an N-acetyl galactosamine residue is substantially transferred to the glucuronic acid of an oligosaccharide composed of a hexasaccharide having a chondroitin skeleton. Do not have the activity to

( c ) 活性の阻害 (c) Inhibition of activity

二価金属陽イオン非存在下では酵素活性を実質的に示さない。 In the absence of divalent metal cations, it does not substantially exhibit enzymatic activity.

本発明酵素におけるグルクロン酸供与体としては、 グルクロン酸ヌクレオチ ドが例示され、 例えば ADP (アデノシン二リン酸） - GlcA、 UDP (ゥリジンニリ ン酸） - GlcA、 CDP (シチジン二リン酸） -GlcA、 GDP (グアノシン二リン酸） - GlcA等が例示されるが、 その中でも生体内で一般的にグルクロン酸供与体とし て働く UDP-GlcAが最も好ましい。 Examples of glucuronic acid donors in the enzyme of the present invention include glucuronic acid nucleotides. (Guanosine diphosphate)-GlcA, etc., among which UDP-GlcA, which generally acts as a glucuronic acid donor in vivo, is most preferred.

非還元末端が N-ァセチルガラク トサミン残基であり、 コンドロイチン骨格を 有する 7糖からなるオリゴ糖とは、 例えば実施例に記載された様に睾丸ヒアル 口-ダーゼによりクジラ軟骨由来又はサメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸を限 定分解して精製したコンドロイチン硫酸 6糖を基質とし、 N-ァセチルガラク ト サミン供与体存在下において、 大腸菌 K4株由来のコンドロイチン合成酵素を作 用させて N-ァセチルガラク トサミンを非還元末端に転移して調製することがで さる。 An oligosaccharide consisting of a heptasaccharide having a non-reducing end at an N-acetylgalactosamine residue and having a chondroitin skeleton is, for example, chondroitin derived from whale cartilage or shark cartilage by testicular hyalurodase as described in Examples. Using chondroitin sulfate hexasaccharide purified by limited decomposition of sulfuric acid as a substrate, chondroitin synthase derived from Escherichia coli K4 is activated in the presence of an N-acetylgalactosamine donor to convert N-acetylgalactosamine to the non-reducing end. It can be prepared by transfer.

N-ァセチルガラク トサミン供与体とは、 N-ァセチルガラク トサミンヌクレオ チド例えば ADP_GalNAc、 UDP-GalNAc、 CDP- GalNAc、 GDP- GalNAc等が例示される が、 その中でも生体内で一般的に N-ァセチルガラク トサミン供与体として働く UDP- GalNAcが最も好ましく例示される。 The N-acetylgalactosamine donor is exemplified by N-acetylgalactosamine nucleotides such as ADP_GalNAc, UDP-GalNAc, CDP-GalNAc, GDP-GalNAc and the like. Working UDP-GalNAc is most preferably exemplified.

非還元末端がダルク口ン酸残基であり、 コンドロイチン骨格を有する 6糖か らなるオリゴ糖とは、 実施例に記載された様に睾丸ヒアルロニダーゼによりク ジラ軟骨由来又はサメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸を限定分解して精製する ことで得られるコンドロイチン硫酸 6糖が例示される。The oligosaccharide consisting of a hexasaccharide having a chondroitin skeleton whose non-reducing end is a dalcuchanoic acid residue is ligated with testicular hyaluronidase as described in the Examples. An example is chondroitin sulfate hexasaccharide obtained by subjecting chondroitin sulfate derived from zilla cartilage or shark cartilage to limited decomposition and purification.

ダルク口ン酸残基を転移する活性や、 N-ァセチルガラタ トサミン残基を転移 する活性は、 例えば各供与体を放射能 （好ましくは炭素同位体：¹⁴ C、³H (トリ チウム） 等） や蛍光物質 （基質に立体障害などを起こさないことから放射能が 好ましい） でラベルし、 この供与体を使用して酵素を反応させ、 反応生成物を 液体シンチレーシヨンカウンター、 又はオートラジオグラフィ等、 ラベノレした 物質を検出するための方法で解析することで酵素活性を検出することが可能で める。The activity of transferring a darconic acid residue or transferring an N-acetylgalatatosamine residue may be determined, for example, by activating each donor with radioactivity (preferably, carbon isotope:¹⁴ C,³ H (tritium), etc.) Label with a fluorescent substance (preferably radioactivity because it does not cause steric hindrance to the substrate), react the enzyme with this donor, and label the reaction product with a liquid scintillation counter or autoradiography. Enzyme activity can be detected by analyzing it with a method for detecting such substances.

二価金属陽イオンによる酵素反応への影響は、 例えば実施例記載の様に、 反 応系に二価金属陽イオン、 好ましくはマンガンイオン （Mn²⁺) を共存させた際 の酵素反応と、 その反応系にさらにエチレンジァミン四酢酸 （以下 「EDTA」 と も記載する） などの金属イオンに対するキレート剤を添加した反応系での酵素 反応とを比較することで容易に対比することが可能である。The effect of the divalent metal cation on the enzymatic reaction is, for example, as described in Examples, the enzymatic reaction when a divalent metal cation, preferably manganese ion (Mn²⁺ ) coexists in the reaction system. This can be easily compared by comparing the reaction system with an enzyme reaction in a reaction system in which a chelating agent for a metal ion such as ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter also referred to as “EDTA”) is added.

本発明において、 「コンドロイチン骨格を有する 6糖からなるオリゴ糖の該 グルクロン酸に対しては実質的に N-ァセチルガラク トサミン残基を転移する活 性を有しない」 とは、 実施例 1の < 4 >項に従い測定を行った時に、 コンドロ ィチン骨格を有する 6糖からなるオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては N-ァセ チルガラタ トサミン残基を転移する活性を有しないことを意味する。 In the present invention, "the oligosaccharide consisting of a hexasaccharide having a chondroitin skeleton has substantially no activity of transferring an N-acetylgalactosamine residue to the glucuronic acid" refers to <4 in Example 1. When the measurement is performed in accordance with the section, it means that the oligosaccharide comprising a hexasaccharide having a chondroitin skeleton does not have an activity of transferring an N-acetylgalatasamine residue to the glucuronic acid.

配列番号 4記載のアミノ酸配列を融合タンパク質とした際に同様の酵素活性 を有することが後述の実施例から明かとなっているため、 本発明酵素は配列番 号 4記載のァミノ酸配列を含むことが好ましく、 配列番号 4記載のァミノ酸配 列にさらに 10〜20の疎水性ァミノ酸残基からなる膜貫通領域などを有していて も良レ、。 また、 配列番号 4記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠 失、 置換、 挿入、 付加および/または転位されたアミノ酸配列を含む酵素も、 上記の酵素活性を有している限り、 本発明酵素の範囲に含まれる。 ここで、 欠 失、 置換、 挿入、 付加および/または転位されるアミノ酸の個数や、 配列番号 4記載のアミノ酸配列との相同性の好ましい範囲は、 下記 2 . 本発明物質に記 載の 「修飾ポリペプチド」 と同様である。Since it is clear from the Examples below that the same enzyme activity is obtained when the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is used as a fusion protein, the enzyme of the present invention must contain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It is preferable that the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 further have a transmembrane region composed of 10 to 20 hydrophobic amino acid residues. In addition, an enzyme comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted, added, and / or transposed in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is also an enzyme of the present invention as long as it has the above enzyme activity. Included in the range. Where the number of amino acids deleted, substituted, inserted, added and / or transposed, The preferred range of homology with the amino acid sequence described in 4 is the same as that of the “modified polypeptide” described in 2. The present invention below.

また、 遺伝子工学的手法で本発明酵素を調製する際には、 疎水性アミノ酸領 域からなる膜貫通領域は、 本発明酵素の精製，単離を煩雑とするため、 最も好 ましい本発明酵素は、 配列番号 4記載のアミノ酸配列のみからなるポリべプチ ド或いはそれに糖鎖が結合した糖ポリペプチドである。 When the enzyme of the present invention is prepared by a genetic engineering technique, the most preferred enzyme of the present invention is a transmembrane region composed of a hydrophobic amino acid region, which makes the purification and isolation of the enzyme of the present invention complicated. Is a polypeptide consisting solely of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a sugar polypeptide having a sugar chain bound thereto.

( 2 ) 本発明物質(2) Substance of the present invention

本発明物質は配列番号 4記載のアミノ酸配列からなるポリべプチド、 または 配列番号 4記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入、 付加および または転位されたアミノ酸配列からなるポリペプチド （以下、 両 ポリペプチドを合わせて、 「本発明のポリペプチド」 とも記載する） と、 識別 ぺプチドとが融合してなり、 コンドロイチン骨格中に存在する非還元末端の N- ァセチルガラク トサミン残基にグルクロン酸残基を転移する活性を有すること を特徴とする融合タンパク質である。 The substance of the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added and / or transposed. A non-reducing terminal N-acetylgalactosamine residue present in the chondroitin skeleton, which is obtained by fusing a peptide (hereinafter, both polypeptides are collectively referred to as “the polypeptide of the present invention”) and a discriminating peptide. It is a fusion protein characterized by having an activity of transferring a glucuronic acid residue to a fusion protein.

ここで、 識別ペプチドとは、 融合タンパク質を遺伝子組み換えによって調製 する場合に、 形質転換体の生育物から融合タンパク質の分泌、 分離、 精製、 検 出を容易とするために用いられるぺプチドであり、 例えばシグナルぺプチド (多くのタンパク質の N末端に存在し、 タンパク質の選別のために細胞内では 機能している 15〜30アミノ酸残基からなるペプチド：例えば 0mpA、 0mpT、 Dsb 等） 、 プロテインキナ"ゼ 、 プロテイン A (黄色ブドウ球菌細胞壁の構成成分 で分子量約 42， 000のタンパク質） 、 ダルタチオン S転移酵素、 Hisタグ （ヒスチ ジン残基を 6〜10個並べて配した配列） 、 mycタグ （cMycタンパク質由来の 13ァ ミノ酸配列） 、 FLAGペプチド （8アミノ酸配列からなる分析用マーカー） 、 T7 タグ （genelOタンパク質の最初の 11アミノ酸配列） 、 Sタグ （陴臓 RNaseA由来 の 15アミノ酸配列） 、 HSVタグ、 pelB (大腸菌外膜タンパク質 pelBの 22ァミノ 酸配列） 、 HAタグ （へマダルチェン由来の 10アミノ酸配列） 、 Trxタグ （チォ レドキシン配列） 、 CBPタグ （カルモジュリン結合ペプチド） 、 CBDタグ （セル ロース結合ドメイン） 、 CBRタグ （コラーゲン結合ドメイン） 、 ]3 - lac/bluHere, the discriminating peptide is a peptide used for facilitating secretion, separation, purification, and detection of the fusion protein from the growth of the transformant when the fusion protein is prepared by genetic recombination. For example, signal peptides (peptides consisting of 15 to 30 amino acid residues that are present at the N-terminus of many proteins and function in cells for protein selection: eg, 0mpA, 0mpT, Dsb, etc.), protein kinases ” Ze, protein A (a component of the cell wall of S. aureus, which has a molecular weight of about 42,000), daltathione S-transferase, His tag (a sequence in which 6 to 10 histidine residues are arranged), myc tag (cMyc protein Derived 13 amino acid sequence), FLAG peptide (analytical marker consisting of 8 amino acid sequences), T7 tag (first 11 amino acids of genelO protein) Amino acid sequence), S tag (15 amino acid sequence from mouse RNaseA), HSV tag, pelB (22 amino acid sequence of E. coli outer membrane protein pelB), HA tag (10 amino acid sequence from hemadalchen), Trx tag ( Chio Redoxin sequence), CBP tag (calmodulin binding peptide), CBD tag (cellulose binding domain), CBR tag (collagen binding domain),] 3-lac / blu

( ]3ラクタマーゼ） 、 /3 - gal ( ]3ガラク トシダーゼ） 、 luc (ルシフェラー ゼ） 、 HP- Thio (His- patchチォレドキシン） 、 HSP (熱ショックペプチド） 、 Ln y (ラミニン γペプチド） 、 Fn (フイブロネクチン部分ペプチド） 、 GFP(] 3 lactamase), / 3-gal (] 3 galactosidase), luc (luciferase), HP- Thio (His-patch thioredoxin), HSP (heat shock peptide), Lny (laminin γ peptide), Fn ( Fibronectin partial peptide), GFP

(緑色蛍光ペプチド） 、 YFP (黄色蛍光ペプチド） 、 CFP (シアン蛍光べプチ ド） 、 BFP (青色蛍光ペプチド） 、 DsRed、 DsRed2 (赤色蛍光ペプチド） 、 MBP(Green fluorescent peptide), YFP (yellow fluorescent peptide), CFP (cyan fluorescent peptide), BFP (blue fluorescent peptide), DsRed, DsRed2 (red fluorescent peptide), MBP

(マルトース結合ペプチド） 、 LacZ (ラク トースオペレーター） 、 IgG (免疫 グロブリン G) 、 アビジン、 プロテイン Gからなる群から選択されるいずれかの ぺプチドを指称し、 何れの識別べプチドであっても使用することが可能である。 その中でも特にシグナルペプチド、 プロテインキナーゼ 、 プロテイン A、 グル タチオン S転移酵素、 Hi sタグ、 mycタグ、 FLAGペプチド、 T7タグ、 Sタグ、 HSV タグ、 pelB又は HAタグが、 遺伝子工学的手法による本発明物質の発現、 精製が より容易となることから好ましい。(Maltose-binding peptide), LacZ (lactose operator), IgG (immunoglobulin G), avidin, protein G, and any peptide selected from the group. It is possible to Among them, the signal peptide, protein kinase, protein A, glutathione S-transferase, His tag, myc tag, FLAG peptide, T7 tag, S tag, HSV tag, pelB or HA tag are the present invention by genetic engineering techniques. It is preferable because expression and purification of the substance become easier.

本発明物質中での本発明のポリべプチドと識別べプチドとの配置は、 識別べ プチドが本発明のポリぺプチドの C末端側に結合していても或いは N末端側に結 合していてもよい。 また、 このような結合は、 何ら生理活性を有しないァミノ 酸配列 （2〜10個程度のアミノ酸からなるペプチド） からなるスぺーサーを介 してなされていても、 本発明物質がコンドロイチンの基本骨格中に存在する N- ァセチルガラク トサミン残基にグルクロン酸残基を転移する活性 （以下、 The arrangement of the polypeptide of the present invention and the discriminating peptide in the substance of the present invention may be such that the discriminating peptide is bonded to the C-terminal side or the N-terminal side of the polypeptide of the present invention. You may. In addition, even if such a bond is made via a spacer consisting of an amino acid sequence having no physiological activity (a peptide consisting of about 2 to 10 amino acids), the substance of the present invention is a basic chondroitin. Activity to transfer glucuronic acid residues to N-acetylgalactosamine residues present in the skeleton (hereinafter referred to as

「GlcAT活性」 とも記載する） を有する限りにおいて制限はされない。It is not limited as long as it has “GlcAT activity”).

ここで、 GlcAT活性は、 例えば Kitagawa et al. , J. Biol. Chem. , 276, 38721-38726 (2001) を改変した方法 （後述の実施例に記載） を用いることに より検出することが可能である。 かかる方法によって本発明物質の GlcAT活性 を測定した際に得られるミカエリス定数 （Km値） は、 後述の実施例記載の 「コ ンドロイチン硫酸由来の 11糖 （CS11 ) 」 に対しては lOO w mol/l以下であること が好ましく、 特に 90 μ πιο1/1以下であることが好ましく、 特に 80 μ πιο1/1以下で あることが好ましい。 また、 更にグルクロン酸供与体の好ましい例である UDP- GlcUAに対する Km値は、 100 /z mol/l以下であることが好ましく、 95 μ ιηο1/1であ ることがより好ましく、 90 μ πι_Ο1八以下であることが最も好ましい。 このよう な極めて特異性の高い GlcAT活性は本発明物質が配列番号 4記載のァミノ酸配 列という特定のァミノ酸配列を融合タンパク質とした形態であることによる驚 くべき効果の一つと考えられる。Here, the GlcAT activity can be detected, for example, by using a method modified from Kitagawa et al., J. Biol. Chem., 276, 38721-38726 (2001) (described in Examples described later). It is. The Michaelis constant (Km value) obtained when the GlcAT activity of the substance of the present invention was measured by such a method was 100 wmol / ml for “11-saccharide (CS11) derived from chondroitin sulfate” described in Examples described later. l or less, particularly preferably 90 μπιο1 / 1 or less, particularly preferably 80 μπιο1 / 1 or less. Preferably, there is. Further, Km values for more are preferred examples of glucuronic acid donor UDP-GlcUA is preferably less 100 / z mol / l, more preferably from 95 μ ιηο1 / 1 der_Rukoto, 90 μ πι Ο Most preferably, it is 18 or less. Such a highly specific GlcAT activity is considered to be one of the surprising effects of the substance of the present invention in the form of a specific amino acid sequence, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, as a fusion protein.

N -ァセチルガラク トサミン残基へのダルク口ン酸残基の転移活性におけるグ ルクロン酸の結合様式は、 特に限定はされないが、 コンドロイチン骨格の N-ァ セチルガラク トサミン残基の 3位ヒ ドロキシル基とグルクロン酸残基の 1位ヒ ド 口キシル基との /3 1-3グリコシド結合であることから、 /3 1-3グリコシド結合で あることが好ましい。 The binding mode of glucuronic acid in the transfer activity of the dalc oxalate residue to the N-acetylgalactosamine residue is not particularly limited, but the hydroxyl group at position 3 of the N-acetylgalactosamine residue of the chondroitin skeleton and glucuronide are not particularly limited. Since it is a / 3 1-3 glycoside bond with the 1-hydroxyl group of the acid residue, it is preferably a / 3 1-3 glycoside bond.

一般に、 酵素タンパク質のアミノ酸配列のうち、 1又は数十個 （通常は 2以 上 50以下） の構成アミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加および または転位して も酵素活性が維持されることが知られ、 同一酵素のバリアントであるというこ とができるが、 本発明物質においても配列番号 4記載のアミノ酸配列に 1又は 複数 （好ましくは 2以上 50以下、 より好ましくは 2以上 36以下、 最も好ましくは 2以上 22以下） の構成アミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 或いは転位等の部分的な 変異が起こっていても融合タンパク質が GlcAT活性を保持している限りにおい て、 本発明物質と実質的に同一の物質であるということができる （このような 配列番号 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドに部分的な変異を有する ポリペプチドを便宜的に 「修飾ポリペプチド」 と記載する） 。 このような修飾 ポリぺプチドのァミノ酸配列は、 配列番号 4に示されるァミノ酸配列と 93%以 上、 好ましくは 95%以上、 さらに 97%以上の相同性を有することを好ましい。 ァミノ酸配列の相同性は、 FASTAのような周知のコンピュータソフトウェアを 用いて容易に算出することができ、 このようなソフトウエアはインターネット によっても利用に供されている。 尚、 上記融合タンパク質は、 そのアミノ酸配列が上記した通りのものであり、 上記した酵素活性を有するものであればタンパク質に糖鎖が結合していても良 い。 すなわち本発明物質の融合タンパク質には糖タンパク質の形態の融合タン パク質も包含する。Generally, the enzyme activity can be maintained even when one or several tens (usually 2 to 50) constituent amino acids of the amino acid sequence of the enzyme protein are substituted, deleted, inserted, added or rearranged. Although it is known and can be said to be variants of the same enzyme, one or more (preferably 2 or more and 50 or less, more preferably 2 or more and 36 or less, and most preferably 2 to 22 or less) as long as the fusion protein retains GlcAT activity, even if partial mutations such as substitution, deletion, insertion, or transposition of the constituent amino acids have occurred. (A polypeptide having a partial mutation in the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is conveniently referred to as “modified.” Polypeptide "). The amino acid sequence of such a modified polypeptide preferably has a homology of 93% or more, preferably 95% or more, and more preferably 97% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. The homology of an amino acid sequence can be easily calculated using well-known computer software such as FASTA, and such software is also available on the Internet. The amino acid sequence of the fusion protein is as described above, and a sugar chain may be bound to the protein as long as it has the above-mentioned enzyme activity. That is, the fusion protein of the substance of the present invention also includes a fusion protein in the form of a glycoprotein.

このような本発明物質は、 コンドロイチン骨格を有するダリコサミノグリカ ンを基質とし、 グルクロン酸供与体存在下、 非還元末端のガラク トサミン残基 に対して、 グルクロン酸残基を転移する後述の 「本発明糖鎖合成剤」 の有効成 分として使用することが可能である。 Such a substance of the present invention uses a daricosaminoglycan having a chondroitin skeleton as a substrate and transfers a glucuronic acid residue to a non-reducing terminal galactosamine residue in the presence of a glucuronic acid donor as described below. The sugar chain synthesizing agent of the present invention can be used as an effective component.

( 3 ) 本発明物質の調製法(3) Preparation method of the substance of the present invention

本発明物質は、 本発明のポリべプチドのアミノ酸配列をコードする DNAと識 別ぺプチドをコ一ドする DNAとを同一読み出し領域に配置してなり、 且つ本発 明のポリべプチドと識別べプチドとが発現しうるようなプロモーター領域を有 するベクターでトランスフエク トした、 適当な宿主細胞を生育させることで、 GlcAT遺伝子を発現させ生育物中に蓄積させる調製を行うことが可能である。 尚、 ここで宿主細胞は上記遺伝子が発現しうるものであれば原核細胞 （例えば 大腸菌等） であると真核細胞 （例えば酵母、 哺乳動物由来の細胞又は昆虫由来 の細胞等） であると限定はされない。 特に配列番号 4記載のアミノ酸配列を有 するポリべプチドは本来真核細胞中で発現しているポリべプチドであることか ら、 真核細胞が宿主細胞として好ましく、 特にほ乳類由来の細胞が好ましい。 ここで、 宿主細胞の生育とは、 宿主細胞を培養することの他、 宿主細胞を生 体などに投与し、 その生体内で宿主細胞を生育させることも含む概念である。 また、 生育物とは、 培養された宿主細胞、 培養上清の他、 宿主細胞を生体内で 生育させた場合には、 その生体の排泄物、 分泌物なども含む概念である。 The substance of the present invention comprises a DNA encoding the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention and a DNA encoding the identification peptide arranged in the same readout region, and is distinguished from the polypeptide of the present invention. By growing an appropriate host cell transfected with a vector having a promoter region capable of expressing a peptide, the GlcAT gene can be expressed and accumulated in a grown product. . Here, a host cell is limited to a prokaryotic cell (eg, Escherichia coli etc.) and a eukaryotic cell (eg, yeast, mammal-derived cells, insect-derived cells, etc.) as long as it can express the above gene. Is not done. In particular, eukaryotic cells are preferred as host cells, and mammalian-derived cells are particularly preferred, since polypeptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 are naturally expressed in eukaryotic cells. . Here, the growth of the host cell is a concept including, in addition to culturing the host cell, administering the host cell to a living body or the like and growing the host cell in the living body. The term “growth” is a concept including, in addition to cultured host cells and culture supernatant, excretions and secretions of the living body when the host cells are grown in the living body.

本発明者らは実施例記載の方法により、 GenBank受け入れ番号 AB037823の cDNA (配列番号 1記載の塩基配列からなる） 力 ヒ トの GlcATをコードする DNA であることを明らかとしたため、 当該 cDNAを基に本発明物質を調製することが 可能である。 上記 cDNAは、 市販の pBluescriptll SK (+)プラスミ ドに揷入され た形態で保管することができる。The inventors of the present invention have clarified that it is a DNA encoding the GlcAT of cDNA (comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) of GenBank accession number AB037823 by the method described in the Examples. Preparation of the substance of the present invention It is possible. The above cDNA can be stored in a form inserted in commercially available pBluescriptll SK (+) plasmid.

本発明物質の識別べプチドとして例えば FLAGぺプチドを使用し、 宿主細胞と して哺乳動物由来の細胞を使用する場合には、 例えば pFLAG-CMV-3ベクター (シグマ社製） などを発現ベクターとして使用することができる。 When FLAG peptide is used as an identification peptide of the substance of the present invention and mammalian cells are used as host cells, for example, pFLAG-CMV-3 vector (manufactured by Sigma) or the like is used as an expression vector. Can be used.

pBluescriptll SK (+)プラスミ ドに揷入されている上記 cDNAを pFLAG-CMV- 3ベ クタ一に挿入するためには、 pBluescriptll SK (+)プラスミ ドベクターから例 えば Narl及び BamHIなどの適当な制限酵素を用いて cDNAを切り出して、 cDNAの 粘着末端を平滑化して cDNA断片を得 （配列番号 3記載の塩基配列からなる） 、 pFLAG-CMV- 3ベクターに挿入するために例えば Hindlllの様な適当な制限末端を 連結させて、 適当な制限酵素で処理した pFLAG-CMV_3ベクターに挿入すること が可能である。 In order to insert the above cDNA inserted in pBluescriptll SK (+) plasmid into pFLAG-CMV-3 vector, appropriate restriction such as Narl and BamHI from pBluescriptll SK (+) plasmid vector is required. The cDNA is cut out using an enzyme, the cohesive end of the cDNA is blunt-ended to obtain a cDNA fragment (consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3), and an appropriate fragment such as Hindlll is inserted into the pFLAG-CMV-3 vector. Such restriction ends can be ligated and inserted into the pFLAG-CMV_3 vector treated with an appropriate restriction enzyme.

このようにして調製した pFLAG_CMV-3ベクタ一 （pFLAGGlcAT) を、 例えば pFLAG-CMV-3ベクターの宿主細胞として機能する C0S-1細胞や COS- 7細胞にェレ ク トロポレーション法などの常法を用いて導入して形質転換体を得ることがで さる。 The pFLAG_CMV-3 vector (pFLAGGlcAT) prepared in this manner can be transferred to C0S-1 cells or COS-7 cells, which function as host cells for the pFLAG-CMV-3 vector, by standard methods such as electroporation. To obtain a transformant.

形質転換体はその基となった宿主細胞が生育するのに適した条件下で生育さ せて、 その生育物から本発明物質を調製することができる。 例えば C0S-7細胞 を宿主細胞として選択した場合には、 in vitroで形質転換体を培養し、 その培 養物 （培養後の形質転換体及び培養上清） から本発明物質を単離して精製する ことが可能である。 上記 pFLAG_CMV-3ベクターを用いた場合には本発明物質は FLAGぺプチドを含むことになるので、 本発明物質は例えば抗 FLAG抗体を用いて、 例えばァフィニティ一精製などの方法で本発明物質を単離、 精製することが可 能である。 単離、 精製の方法は、 本発明物質における識別ペプチドによって適 宜、 適当な方法を常套的に選択することが可能である。 The transformant can be grown under conditions suitable for the growth of the host cell on which the transformant is grown, and the substance of the present invention can be prepared from the grown product. For example, when C0S-7 cells are selected as host cells, transformants are cultured in vitro, and the substance of the present invention is isolated and purified from the culture (the transformants after culture and the culture supernatant). It is possible to do. When the above-mentioned pFLAG_CMV-3 vector is used, the substance of the present invention contains a FLAG peptide.Therefore, the substance of the present invention is obtained by simply using an anti-FLAG antibody, for example, by affinity purification, etc. Separation and purification are possible. The method of isolation and purification can be routinely selected as appropriate depending on the identification peptide in the substance of the present invention.

また、 識別べプチドは例えばコラゲナーゼなどによって特異的に認識される ァミノ酸配列 （例えば特開平 1 1一 1 3 7 2 5 6の配列番号 3記載のァミノ酸 配列など） を使用することにより、 配列番号 4記載のアミノ酸配列を含む ( 1 ) で記載した本発明酵素を得ることができる。Further, the discriminating peptide is specifically recognized by, for example, collagenase or the like (for example, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 in JP-A-11-137256). ), The enzyme of the present invention described in (1) including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 can be obtained.

( 4 ) 本発明糖鎖合成剤(4) The sugar chain synthesizing agent of the present invention

本発明糖鎖合成剤は、 本発明のポリペプチドを含むタンパク質を含有し、 非 還元末端に N-ァセチルガラク トサミン残基を有するコンドロイチン骨格からな る糖鎖にグルクロン酸供与体からグルクロン酸を転移する活性を有する。 The sugar chain synthesizing agent of the present invention contains a protein containing the polypeptide of the present invention, and transfers glucuronic acid from a glucuronic acid donor to a sugar chain having a chondroitin skeleton having an N-acetylgalactosamine residue at a non-reducing end. Have activity.

本発明糖鎖合成剤に含有されるタンパク質は、 本発明のポリぺプチドと識別 ぺプチドとの融合タンパク質であることが好ましく、 前記本発明物質によって なることが最も好ましい。 The protein contained in the sugar chain synthesizing agent of the present invention is preferably a fusion protein of the polypeptide of the present invention and the discriminating peptide, and most preferably the fusion protein of the present invention.

本発明糖鎖合成剤は、 コンドロイチン骨格の非還元末端に存在する N-ァセチ ルガラクトサミン残基に対してグルクロン酸を転移する試薬として使用するこ とが可能である。 また、 本発明糖鎖合成剤を構成する目的酵素活性を有する部 分である配列番号 4記載のアミノ酸配列がヒ ト由来のアミノ酸配列であるため、 本発明糖鎖合成剤をヒ トに投与したとしても抗原性が低いことが期待され、 ま た培養軟骨などを本発明糖鎖合成剤で修飾した後に生体に対して移植したとし ても、 本発明糖鎖合成剤に起因する抗原抗体反応、 炎症は惹起されないことが 期待される。 The sugar chain synthesizing agent of the present invention can be used as a reagent for transferring glucuronic acid to an N-acetylgalactosamine residue present at the non-reducing end of the chondroitin skeleton. In addition, since the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 which is the part having the target enzyme activity constituting the sugar chain synthesizing agent of the present invention is an amino acid sequence derived from human, the sugar chain synthesizing agent of the present invention was administered to human In addition, even if cultured cartilage and the like are modified with the sugar chain synthesizing agent of the present invention and then transplanted to a living body, antigen-antibody reactions caused by the sugar chain synthesizing agent of the present invention can be expected. It is expected that inflammation will not be induced.

以下、 本発明を実施例により具体的に説明する。 実施例 1 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples. Example 1

< 1 >ヒト GlcATを発現させるためのベクターの調製 <1> Preparation of vector for expressing human GlcAT

GenBank受け入れ番号 AB037823の cDNA (配列番号 1記載の塩基配列からな る） を含む pBluescriptll SK (+)プラスミ ド （かずさ DNA研究所： KIAA1402) を 常法に従って制限酵素 Narl及ぴ BamHIにより消化した。 この消化産物をァガロ ースゲル電気泳動に供し、 5. 4kbpのバンドを Gel Extraction Kit (QIAGEN社 製） を用いて回収した。 回収した消化産物を TaKaRa Blunting Kit (宝酒造株 式会社製） を用いて平滑化した後、 Hindl l lリンカ一 （宝酒造株式会社製） を 結合させ、 セルフライゲーシヨンさせた。PBluescriptll SK (+) plasmid (Kazusa DNA Research Institute: KIAA1402) containing the cDNA of GenBank accession number AB037823 (consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1) was digested with restriction enzymes Narl and BamHI according to a conventional method. The digestion product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a 5.4 kbp band was recovered using a Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN). Collect the digested product using TaKaRa Blunting Kit (Takara Shuzo After smoothing using Shimadzu Co., Ltd., Hindl II linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was combined and self-ligated.

このようにして調製した DNA断片を、 制限酵素 Hindl l lおよび Not lによって消 化し、 消化産物をァガロースゲル電気泳動に供し、 2. 3kbpの断片を回収した。 この DNA断片を、 常法に従って制限酵素 Hindl l lおよび Not lで消化した pFLAG- CMV- 3に連結させた。 得られたプラスミ ドの塩基配列を、 常法に従ってシーク エンスし、 配列番号 3記載の塩基配列からなる GlcATcDNAを FLAGタンパク質と の融合タンパク質として発現するように構築されたベクターを pFLAGGlcATとし た。 The DNA fragment thus prepared was digested with the restriction enzymes HindIII and Notl, and the digest was subjected to agarose gel electrophoresis to recover a 2.3 kbp fragment. This DNA fragment was ligated to pFLAG-CMV-3 digested with restriction enzymes HindIII and Notl in a conventional manner. The nucleotide sequence of the obtained plasmid was sequenced according to a conventional method, and a vector constructed to express GlcAT cDNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 as a fusion protein with FLAG protein was designated as pFLAGGlcAT.

< 2〉組換体の調製<2> Preparation of recombinant

組換体を調製するための宿主細胞としては、 サル腎臓由来の培養細胞 COS - 7 細胞 （ダルベッコの調整最小培地：以下 「DMEM」 とも記載する） を使用した。 上記で調製した pFLAGGl cAT (2 μ g) を TransFast (商標名 ：プロメガ社製） を 用いて、 添付されたプロ トコールに従って C0S-7細胞 （サル腎臓由来の培養細 胞） に導入し、 一過性発現細胞を常法に従って回収するととも （trans i ent : K2) 、 eOO g/mlの濃度の抗生物質 G418を培地に添加することにより、 薬剤耐 性スクリーニングを行って安定株を回収した （stab l e： K2-2〜K2- 21) 。 Monkey kidney-derived cultured cells COS-7 cells (Dulbecco's adjusted minimal medium: also referred to as “DMEM” below) were used as host cells for preparing recombinants. The pFLAGGlcAT (2 μg) prepared above was introduced into C0S-7 cells (monkey kidney-derived cultured cells) using TransFast (trade name: manufactured by Promega) according to the attached protocol. The cells expressing the sex-expressing cells were collected according to a conventional method (transient: K2), and drug-resistant screening was carried out by adding antibiotic G418 at a concentration of eOO g / ml to obtain stable strains (stab le: K2-2 to K2-21).

得られた各クローンの培養物を、 細胞と培養上清に遠心分離を用いて分離し、 細胞溶解液及び培養上清から、 抗 FLAG抗体ァフィ二ティゲル （M₂ァフィ二ティ ゲル： シグマ社製） を用いて融合タンパク質を回収し、 抗 FLAG抗体 （M₂： シグ マ社製） を一次抗体、 二次抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マウス IgG抗体 (ザィメッ ド社製） を用いてウェスタンブロッテイング法 （Towbin et al. , PNAS U. S. A. , 76 : 4350 - 4354 ( 1979) ) を行った （第 1図） 。 第 1図中の Mockは pFLAG-CMV-3を導入した COS- 7細胞を用いて上記と同様に処理した試料を表す。 その結果、 K2-5の細胞株が培地中に特に高濃度で FLAGタンパク質と GlcATと の融合タンパク質を発現することが明かとなった。 く 3〉FLAGタンパク質と GlcATとの融合タンパク質の精製Cultures of each clone obtained was separated using a centrifuge to cells and culture supernatants, cell lysates and culture supernatant, anti-FLAG antibody Afi two Tigeru (M₂ Afi two tee gel: manufactured by Sigma ) recovered fusion protein using an anti-FLAG antibody (M_2: Sigma Co., Ltd.) primary antibody, Peruokishidaze labeled anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody (Zaime' de Co.) Western blotting using the ( Towbin et al., PNAS USA, 76: 4350-4354 (1979)) (Fig. 1). Mock in FIG. 1 represents a sample treated in the same manner as described above using COS-7 cells into which pFLAG-CMV-3 had been introduced. As a result, it was revealed that the K2-5 cell line expresses a fusion protein of FLAG protein and GlcAT at a particularly high concentration in the medium. <3> Purification of fusion protein of FLAG protein and GlcAT

上記で得られた K2- 5株を 150睡培養皿を用いて、 20mlの DMEM (10%牛胎児血清、 lOOU/mlペニシリ ン Gカリウム、 100 μ g/mlス トレプトマイシン硫酸塩、 600 g/ml G418を含む） で培養し、 コンフルェントになった後、 培地を交換してさ らに 3日間培養して得られた培養上清を回収した。 The K2-5 strain obtained above was used in a 150-well culture dish in 20 ml of DMEM (10% fetal bovine serum, lOU / ml potassium penicillin G, 100 μg / ml streptomycin sulfate, 600 g). / ml G418), and after confluence, the medium was replaced and the culture was further cultured for 3 days, and the resulting culture supernatant was collected.

この培養上清に 1M TrisHCl、 pH7. 4、 グリセロールをそれぞれ終濃度 50mM、 20%になるように加え、 使用するまで- 80°Cで保存した。 保存した培地を融解後、 Anti-FLAG M2- Agarose Affinity Gel (SIGMA社製）を加え、 4°C、 ー晚、 転倒混 和した。 反応後、 ゲルを Tris緩衝生理的食塩水 （以下 「TBS」 とも記載する） /0. 05% Tween20 (商標名 ： ICN社製） で、 3回、 つづいて TBSで 1回洗浄した後、 27Gの注射針をつけたシリンジを用い余分な洗浄液を除き、 融合タンパク質を 精製した。 く 4〉精製した融合タンパク質の活性測定 1 M TrisHCl, pH 7.4, and glycerol were added to the culture supernatant to a final concentration of 50 mM and 20%, respectively, and stored at -80 ° C until use. After the stored medium was thawed, Anti-FLAG M2-Agarose Affinity Gel (manufactured by SIGMA) was added, and the mixture was mixed by inversion at 4 ° C, 晚. After the reaction, the gel was washed three times with Tris-buffered saline (hereinafter also referred to as “TBS”) / 0.05% Tween20 (trade name: manufactured by ICN), then once with TBS, and then washed with TBS. Excess washing solution was removed using a syringe fitted with a syringe needle, and the fusion protein was purified. <4> Activity measurement of purified fusion protein

( 1 ) N-ァセチルガラク トサミン転移酵素 （GalNAcT) 活性の測定 (1) Measurement of N-acetylgalactosamine transferase (GalNAcT) activity

10mMの MnCl₂、 171 μ Mのアデノシン三リン酸 （ΑΤΡ) ナトリウム塩を含む 50mM の M E S緩衝液 （_PH6. 5) に、 培養上清 10m 目当の上記く 3〉で得られた融合 タンパク質を添加し、 N-ァセチルガラク トサミン残基供与体としてトリチウム ラベルした UDP (ゥリジン二リン酸） -GalNAc (9 X 10⁵cpm ： NEN社製） 、 ガラク トサミン残基受容体としてコンドロイチン （0. 28_{g :} 生化学工業株式会社 製） を添加して、 全量を 100 1となるように蒸留水で調整した。 この反応液を 37°Cで 3時間反応させた。 その後、 100°Cで 5分加熱することで酵素を失活させ て反応を停止した。 反応液をポアサイズ 0. 22 ^ ηιのマイクロフィルター （ミリ ポア社製） で濾過した後、 流速 0. 5ml /分の 0. 2Mの NaClを移動相とする Superdex peptideカラム （30 X 10瞧 ： フアルマシア社製） に通筒して 0. 5ml毎 の画分として溶出液を回収した。 そして各画分の放射能をシンチレーシヨン力 ゥンターにより計数した （第 2図） 。 尚、 陽性対照としては、 大腸菌 K 4株由 来のコン ドロイチン合成酵素標品 （J. Biol. Chem. , 277, 21567-21575 (2002) ) 3 μ ΐ)を使用した。 その結果、 陽性対象はコンドロイチンに対して Ν -ァ セチルガラク トサミン残基を転移しているのに対し、 本発明の融合タンパク質 は、 コンドロイチンに対しては Ν-ァセチルガラタ トサミン残基を転移しないこ とが明かとなった。10mM of MnCl_2, 171 mu M of adenosine triphosphate (ΑΤΡ) MES buffer 50mM containing sodium salt of_(P H6. 5), the culture supernatant 10m th fusion protein obtained in question above rather 3> Was added, and tritium-labeled UDP (peridine diphosphate) -GalNAc (9 × 10⁵ cpm: NEN) as a N-acetylgalactosamine residue donor and chondroitin (0.28_g ) as a galactosamine residue acceptor were added.₍ Manufactured by Seikagaku Corporation) and adjusted to 1001 with distilled water. This reaction solution was reacted at 37 ° C. for 3 hours. Thereafter, the enzyme was inactivated by heating at 100 ° C for 5 minutes to stop the reaction. The reaction mixture was filtered through a 0.22 ^ ηι microfilter (manufactured by Millipore), and then a Superdex peptide column (30 × 10 瞧: Pharmacia) using 0.2 M NaCl as a mobile phase at a flow rate of 0.5 ml / min. The eluate was collected as 0.5 ml fractions. And the radioactivity of each fraction is scintillation power It was counted by the center (Fig. 2). In addition, as a positive control, a chondroitin synthase preparation (J. Biol. Chem., 277, 21567-21575 (2002)) 3 μ μ from E. coli K4 strain was used. As a result, while the positive subject transferred Ν-acetylgalactosamine residue to chondroitin, the fusion protein of the present invention did not transfer Ν-acetylgalatatosamine residue to chondroitin. It became clear.

さらに、 睾丸ヒアルロニダーゼにより限定分解して精製したコンドロイチン 硫酸 6糖 （lnmol：生化学工業株式会社製） を受容体として同様の測定を行った (第 3図） 。 ここで、 第 3図 Bは、 第 3図 Aを拡大して示したものである。 そ の結果、 このようなオリゴ糖に対しても本発明の融合タンパク質は、 N -ァセチ ルガラクトサミン残基を転移しないことが明かとなった。 Further, the same measurement was performed using chondroitin sulfate hexasaccharide (lnmol: manufactured by Seikagaku Corporation) as a receptor which was purified by limited digestion with testicular hyaluronidase (Fig. 3). Here, FIG. 3B is an enlarged view of FIG. 3A. As a result, it was revealed that the fusion protein of the present invention did not transfer N-acetylgalactosamine residues even to such an oligosaccharide.

( 2 ) グルクロン酸転移酵素 （GlcAT) 活性の測定(2) Measurement of glucuronyltransferase (GlcAT) activity

10mMの MnCl₂を含む 50mMの酢酸ナトリウム緩衝液 （ρΗ5· 6) に、 培養上清 10ml 相当の上記 < 3〉で得られた融合タンパク質を添加し、 ダルク口ン酸残基供与 体として¹⁴ Cでラベルした UDP-GlcA (9 X 10⁵cpm ： ICN社製） 、 グルクロン酸残基 受容体としてコンドロイチン （0. 28 / g：生化学工業株式会社製） を添加して、 全量を 100 μ 1となるように蒸留水で調整した。 この反応液を 37°Cで 3時間反応 させた。 その後、 100°Cで 5分加熱することで酵素を失活させて反応を停止した。 反応液をポアサイズ 0. 22 μ ηιのマイクロフィルター （ミリポア社製） で濾過し た後、 流速 0. 5ml /分の 0. 2Μの NaClを移動相とする Superdex peptideカラムTo a 50 mM sodium acetate buffer (ρΗ5.6) containing 10 mM MnCl₂ , add the fusion protein obtained in the above <3> corresponding to 10 ml of the culture supernatant, and add¹⁴ C (9 × 10⁵ cpm: ICN) and chondroitin (0.28 / g: Seikagaku Corporation) as a glucuronic acid receptor were added, and the total amount was 100 μl. It adjusted with distilled water so that it might become. This reaction solution was reacted at 37 ° C. for 3 hours. Thereafter, the reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes to inactivate the enzyme. The reaction mixture was filtered through a microfilter (manufactured by Millipore) with a pore size of 0.22 μηι, and then a Superdex peptide column using a mobile phase of 0.2 ml of NaCl at a flow rate of 0.5 ml / min.

(30 X 10讓 ： フアルマシア社製） に通筒して 0. 5ml毎の画分として溶出液を回 収した。 そして各画分の放射能をシンチレーションカウンタ一により計数したThe eluate was collected as a 0.5 ml fraction by passing through a tube (30 X 10 beads: manufactured by Pharmacia). The radioactivity of each fraction was counted by a scintillation counter.

(第 4図） 。 尚、 陽性対象としては、 大腸菌 K4株由来のコンドロイチン合成酵 素標品 （J. Biol. Chem. , 277, 21567-21575 (2002) ) 3 μ υを使用した。 その 結果、 陽性対象においてはコンドロイチンに対してグルクロン酸残基の転移活 性が観察されたのに対し、 本発明の融合タンパク質は、 コンドロイチンに対し てはグルク口ン酸残基を転移しないことが明かとなつた。(Figure 4). As a positive control, 3 μυ of a chondroitin synthase standard derived from Escherichia coli K4 (J. Biol. Chem., 277, 21567-21575 (2002)) was used. As a result, in positive subjects, the transfer activity of glucuronic acid residues to chondroitin was observed. On the other hand, it was revealed that the fusion protein of the present invention did not transfer glucuronic acid residues to chondroitin.

さらに、 睾丸ヒアルロニダーゼにより限定分解して精製したコンドロイチン 硫酸 6糖 （lnmol：生化学工業株式会社製） に、 その非還元末端に大腸菌 K4株由 来のコンドロイチン合成酵素 （J. Biol. Chem. , 277, 21567-21575 (2002) ) により Ν-ァセチルガラク トサミンを転移して調製したコンドロイチン硫酸 7糖 を受容体として同様の測定を行った （第 5図） 。 ここで、 第 5図 Βは、 第 5図 Αを拡大して示したものである。 その結果、 このようなオリゴ糖に対して、 本 発明の融合タンパク質はグルクロン酸残基を転移してコンドロイチン硫酸 8糖 が得られることが明かとなった。 In addition, chondroitin sulfate hexasaccharide (lnmol: manufactured by Seikagaku Corporation) purified by limited digestion with testicular hyaluronidase and chondroitin synthase (J. Biol. Chem., 277) derived from Escherichia coli K4 strain at its non-reducing end. , 21567-21575 (2002)) using chondroitin sulfate heptasaccharide prepared by transfer of Ν-acetylgalactosamine as a receptor (FIG. 5). Here, FIG. 5Β is an enlarged view of FIG. 5Α. As a result, it was revealed that the fusion protein of the present invention transfers glucuronic acid residues to such oligosaccharides to obtain chondroitin sulfate octasaccharide.

尚、 上記受容体としてのコンドロイチン硫酸 7糖は、 20mMの MnCl₂、 0. 1Mの (NH₄)₂S0₄、 1Mのエチレングリコールを含む 50mMの Tris- HC1緩衝液 （pH7. 2) に大 腸菌 K 4株由来のコンドロイチン合成酵素 12 μ ΙΙを用い、 Ν-ァセチルガラク ト サミン受容体として睾丸ヒアルロニダーゼにより限定分解して精製したコンド ロイチン硫酸 6糖 （50 μ g：生化学工業株式会社製） を使用して調製した。 この 反応において N-ァセチルガラタ トサミン供与体としては 1. 5mMの UDP-GalNAc (シグマ社製） を加えて、 全量を蒸留水により 500 に調整した。 この反応液 を 30°Cで 1時間反応させ、 その後 100°Cで 5分間加熱して酵素を失活させること で反応を停止した。 この反応液を流速 2ml/分の 0. 2M NH₄HC0₃を移動相とする Superdex 30カラム （60 X 16醒 ： フアルマシア社製） で精製し、 溶出液を 215nm でモニターしながら 2ml毎に分画した。 そしてコンドロイチン硫酸 7糖相当画 分をプールし、 凍結乾燥後、 50 μ ΐの蒸留水に溶解して調製した。Incidentally, chondroitin sulfate 7 sugar as the receptor, MnCl₂ in 20 mM, large in the_{0. 1M (NH 4) 2 S0} 4, 1M Tris- HC1 buffer 50mM comprising ethylene glycol (pH 7. 2) Chondroitin sulfate hexasaccharide (50 μg: manufactured by Seikagaku Corporation) purified by limited digestion with testicular hyaluronidase as a Ν-acetylcyclogalactosamine receptor using 12 μ コ ン of chondroitin synthase derived from Enterobacterium K strain Was prepared using In this reaction, 1.5 mM UDP-GalNAc (manufactured by Sigma) was added as the N-acetylgalatatosamine donor, and the total amount was adjusted to 500 with distilled water. This reaction solution was reacted at 30 ° C. for 1 hour, and then heated at 100 ° C. for 5 minutes to stop the reaction by inactivating the enzyme. The reaction mixture flow rate 2ml / min 0. 2M NH₄ HC0₃ and the mobile phase Superdex 30 column was purified by (60 X 16 s Awakening Pharmacia Co.), minutes per 2ml while monitoring at 215nm of the eluate Painted. Then, fractions equivalent to chondroitin sulfate heptasaccharide were pooled, lyophilized, and dissolved in 50 μl of distilled water to prepare.

さらに、 本発明の融合タンパク質を 10mMの EDTA存在下で、 Mn²⁺をキレートし て上記 7糖への GlcAT活性の測定を行ったところ、 活性が完全に失われることが 明かとなった （第 6図） 。 このことは、 少なくとも本発明の融合タンパク質は 二価陽イオンを反応に必要としていることを示している。 ( 3 ) 本発明の融合タンパク質の反応生成物の解析Further, when the fusion protein of the present invention was chelated with Mn^{2+ in the} presence of 10 mM EDTA and the GlcAT activity on the heptasaccharide was measured, it was revealed that the activity was completely lost (No. 6). This indicates that at least the fusion protein of the present invention requires a divalent cation for the reaction. (3) Analysis of the reaction product of the fusion protein of the present invention

( 2 ) で、 コンドロイチン硫酸 7糖に本発明の融合タンパク質を反応させて 得たコンドロイチン硫酸 8糖の構造を解析するために、 生成した前記 8糖をコン ドロイチナーゼ ABCで消化して、 どの様な消化産物が得られるかを解析した。 すなわち、 上記 8糖の放射能が観察された 23〜27番目の画分を回収し凍結乾 燥した後、 流速 lml/分の 0. 2M NH₄HC0₃を移動相として用いた脱塩カラム （Fast Desalting Column： フアルマシア社製） により脱塩し、 さらに溶出液を二分し て凍結乾燥した。 一方 （対照群） を 30mMの酢酸ナトリウムを含む 0. 1Mの Tris- HC1緩衝液 （pH8. 0) 200 μ ΐに溶解し、 他方 （試験群） 〖ま lOOmUのコンドロイチ ナーゼ ABC (生化学工業株式会社製） 、 30mMの酢酸ナトリ ウムを含む 0. 1Mの Tris_HCl緩衝液 （pH8. 0) 200 μ 1に溶解した。 各々を 37°Cで 30分間反応させ、 その後 100°Cで 5分間加熱してコンドロイチナーゼ ABCを失活させて酵素反応を 停止した。 この反応液をポアサイズ 0. 22 μ ηιのマイクロフィルター （ミリポア 社製） で濾過した後、 流速 0. 5ml/分の 0. 2M NaClを移動相とする Superdex peptideカラム （30 X 10讓： フアルマシア社製） により溶出し、 溶出液を 0. 5ml 毎に分画した。 そして各画分の放射能をシンチレーシヨンカウンタ一により計 数した （第 7図） 。In (2), in order to analyze the structure of chondroitin sulfate octasaccharide obtained by reacting the fusion protein of the present invention with chondroitin sulfate heptasaccharide, the produced octasaccharide was digested with chondroitinase ABC. It was analyzed whether a digestion product was obtained. That is, after lyophilized to recover 23 to 27 th fractions radioactivity of the 8 sugar was observed, desalting column with 0. 2M NH₄ HC0₃ at a flow rate lml / min as the mobile phase ( (Fast Desalting Column: manufactured by Pharmacia Co.), and the eluate was further divided into two portions and freeze-dried. One (control group) was dissolved in 200 µl of 0.1 M Tris-HC1 buffer (pH 8.0) containing 30 mM sodium acetate, and the other (test group) was chondroitinase ABC of lOOmU (Seikagaku Corporation). Was dissolved in 200 μl of 0.1 M Tris_HCl buffer (pH 8.0) containing 30 mM sodium acetate. Each was reacted at 37 ° C. for 30 minutes, and then heated at 100 ° C. for 5 minutes to inactivate chondroitinase ABC to stop the enzymatic reaction. The reaction solution was filtered through a microfilter (manufactured by Millipore) with a pore size of 0.22 μηι, and then a Superdex peptide column (30 × 10%: Pharmacia) with a mobile phase of 0.2 M NaCl at a flow rate of 0.5 ml / min. The eluate was fractionated every 0.5 ml. The radioactivity of each fraction was counted by a scintillation counter (Fig. 7).

その結果、 対照群はコンドロイチナーゼ ABCで消化しない元の状態と同じパ ターンで溶出されるが、 試験群では A di- OS (不飽和ゥロン酸一 N-ァセチルガ ラク トサミンからなる硫酸基を有しない二糖） とほぼ同じ位置にピークがシフ トした。 このことから本発明の融合タンパク質は、 コンドロイチン骨格の非還 元末端の N-ァセチルガラク トサミン残基に対して β 1, 3結合でダルク口ン酸残 基を転移することが明かとなった。 As a result, the control group is eluted with the same pattern as the original state without digestion with chondroitinase ABC, but the test group has a sulfate group consisting of Adi-OS (unsaturated peronate-N-acetylgalactosamine). The peak was shifted at almost the same position as that of the non-disaccharide. From this, it was revealed that the fusion protein of the present invention transfers a dalc oxalate residue by β1,3 bond to N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end of the chondroitin skeleton.

( 4 ) 基質の鎖長による酵素反応の変化(4) Change in enzyme reaction due to substrate chain length

サメ由来コンドロイチン硫酸 （コンドロイチン硫酸 C：生化学工業株式会社 製） 及びコンドロイチン （上記サメ由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸 化したもの：生化学工業株式会社製） とを使用して J. Biochem. , 111, 91-98 (1992) に記載された方法に従ってこれらを分解、 精製し、 それぞれ 5糖、 7糖、 9糖、 11糖、 及び 13糖からなるオリゴ糖を調製した （コンドロイチン硫酸由来 のこれらオリゴ糖はそれぞれ CS5、 CS7、 CS9、 CS11、 及び CS13と表記し、 同様 にコンドロイチン由来のこれらオリゴ糖はそれぞれ CH5、 CH7、 CH9、 CH11、 及 び CHI 3と表記する） 。Chondroitin sulfate (chondroitin sulfate C: manufactured by Seikagaku Corporation) and chondroitin (chemically desulfate the above-mentioned shark-derived chondroitin sulfate) These were decomposed and purified according to the method described in J. Biochem., 111, 91-98 (1992) using pentasaccharide, heptasaccharide, and pentasaccharide, respectively. Oligosaccharides consisting of saccharides, 11-saccharides, and 13-saccharides were prepared. (These oligosaccharides derived from chondroitin sulfate are referred to as CS5, CS7, CS9, CS11, and CS13, respectively. Similarly, these oligosaccharides derived from chondroitin are CH5 , CH7, CH9, CH11, and CHI 3).

これらをグルクロン酸残基受容体として用いて、 （2 ) と同様の方法でそれ ぞれのオリゴ糖の 「グルクロン酸残基受容体としての働き」 を測定した （表 1 ) 。 その結果、 特に 9糖以上のオリゴ糖がダルクロン酸残基受容体として好 ましいことが明かとなった。 Using these as glucuronic acid residue receptors, the “function as glucuronic acid residue receptor” of each oligosaccharide was measured in the same manner as in (2) (Table 1). As a result, it was revealed that oligosaccharides having 9 or more sugars are particularly preferable as the receptor for dalcuronate.

上記 （2 ) の条件下で、 上記 CS11の濃度を変化させた場合と、 UDP- GlcUAの 濃度を変化させた場合の GlcAT活性の変化を測定した （CS11の濃度を変化させ た場合：第 8図、 UDP-GldJAの濃度を変化させた場合：第 9図） 。 その結果、 何れも濃度を上げていくと反応速度が飽和する傾向を示すことが明かとなった。 これらを使用して CS11と UDP-GlcUAに対するミカエリス定数 （Km) 値を算出し たところ、 CS11の Km値は 65. 3 /x mol/l、 UDP-GlcUAの Km値は 82. 4 /z mol/1であつ た。 この値を見る限りにおいて、 本発明物質の基質への親和性は極めて高いこ とが明かである。

Under the conditions of (2) above, the change in GlcAT activity was measured when the concentration of CS11 was changed and when the concentration of UDP-GlcUA was changed (when the concentration of CS11 was changed: No. 8). Figure, when the concentration of UDP-GldJA is changed: Fig. 9). As a result, it became clear that the reaction rate tended to be saturated when the concentration was increased. Using these to calculate the Michaelis constant (Km) value for CS11 and UDP-GlcUA, the Km value for CS11 was 65.3 / x mol / l, and the Km value for UDP-GlcUA was 82.4 / z mol. / 1 Was. From this value, it is clear that the affinity of the substance of the present invention for the substrate is extremely high.

< 5 >ヒ ト健常組織及び株化細胞における GlcATの発現の定量<5> Quantification of GlcAT expression in healthy human tissues and cell lines

ヒ ト正常組織及ぴ株化細胞の cDNAを用いて、 定量的ポリメラーゼチェイン反 応 （PCR) により GlcAT遺伝子の発現量を定量した。 cDNAとしては Marathon Ready cDNA (クロンテック社製） を使用した。 GlcATの定量的 PCRにはプライマ 一として K2-Fw (配列番号 5記載）及び K2-Rv (配列番号 6記載） を使用し、 プロ ーブとしてはアプライ ドバイオシステムズ社のマイナ一グループバインダーを 結合した K2-MGB (配列番号 7記載） を使用した。 酵素及び反応液と して Universal PCR Master Mix (アプライ ドバイオシステムズ社製） を使用し、 ABI PRISM 770 Sequence Detection System (アプライ ドバイオシステムズ社 製） により反応液量 25 /i 1で定量を行った。 定量の標準遺伝子としてはグリセ ルアルデヒ ド -3-リン酸脱水素酵素 （GAPDH) 遺伝子を使用し、 既知濃度の铸型 DNAにより定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行った。 反応温 度は 50°C2分、 95°C10分のあと、 95°C15秒 · 60°C1分を 50サイクル行った （第 1 0図） 。 第 1 0図における発現量は、 1 ： 甲状腺、 2 ：副腎、 3 ：全脳、 4 ： 大脳皮質、 5 ：小脳、 6 ：骨髄、 7 ：脾臓、 8 ： 白血球、 9 ：末梢血単核細胞 (PBMC) 、 1 0 :胸腺、 1 1 ： 白血病細胞、 1 2 ：乳腺、 1 3 ：睾丸、 1 4 ： 胎盤、 1 5 ：子宮、 1 6 ：卵巣、 1 7 ：腎臓、 1 8 ：骨格筋、 1 9 ：心臓、 2 0 ：メラノ一マ、 2 1 ：膝臓、 2 2 ：肝臓、 2 3 ：肺、 2 4 ： 胃、 2 5 :小腸、 2 6 ：大腸における発現量を表す。 その結果、 GlcATは、 ほぼ全ての健常組織、 株化細胞で発現が観察されたものの、 胎盤、 小腸、 膝臓および脾臓、 特に胎盤 において大量に発現していることが明かとなった。 産業上の利用可能性GlcAT gene expression was quantified by quantitative polymerase chain reaction (PCR) using cDNAs from human normal tissues and cell lines. Marathon Ready cDNA (Clontech) was used as cDNA. For quantitative PCR of GlcAT, K2-Fw (described in SEQ ID NO: 5) and K2-Rv (described in SEQ ID NO: 6) were used as primers, and a minor group binder from Applied Biosystems was used as a probe. K2-MGB (described in SEQ ID NO: 7) was used. Using Universal PCR Master Mix (manufactured by Applied Biosystems) as the enzyme and reaction solution, quantification was performed using the ABI PRISM 770 Sequence Detection System (manufactured by Applied Biosystems) at a reaction solution volume of 25 / i1. . The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was used as a standard gene for quantification, and a standard curve for quantification was prepared using a known concentration of type III DNA to standardize the expression level of the gene. The reaction temperature was 50 ° C for 2 minutes and 95 ° C for 10 minutes, followed by 50 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute (Fig. 10). The expression levels in Fig. 10 are: 1: thyroid, 2: adrenal gland, 3: whole brain, 4: cerebral cortex, 5: cerebellum, 6: bone marrow, 7: spleen, 8: leukocyte, 9: peripheral blood mononuclear cell (PBMC), 10: thymus, 11: leukemia cell, 12: mammary gland, 13: testis, 14: placenta, 15: uterus, 16: ovary, 17: kidney, 18: skeletal muscle , 19: heart, 20: melanoma, 21: knee, 22: liver, 23: lung, 24: stomach, 25: small intestine, 26: large intestine. As a result, it was revealed that GlcAT was expressed in a large amount in placenta, small intestine, knee and spleen, especially in placenta, although expression was observed in almost all healthy tissues and cell lines. Industrial applicability

本発明により、 コンドロイチン骨格の合成に関与する酵素のうち、 N—ァセ チルガラク トサミン転移酵素活性を実質的に有さず、 グルクロン酸転移酵素活 性を有する酵素を遺伝子工学的に得る際に有用である融合タンパク質及ぴその 製造が提供される。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, among enzymes involved in the synthesis of a chondroitin skeleton, it is useful for genetic engineering to obtain an enzyme having substantially no N-acetylgalactosamine transferase activity and having glucuronyltransferase activity. And a production thereof.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims

1 . 配列番号 4記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、 または配列番 号 4記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加 および/または転位されたァミノ酸配列からなるポリぺプチドと、 識別べプチ ドとが融合してなり、 グルクロン酸供与体からコンドロイチン骨格中に存在す る非還元末端の N-ァセチルガラク トサミン残基にグルクロン酸を転移する酵素 活性を有することを特徴とする融合タンパク質。1. A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added and / or translocated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 The fusion of the polypeptide with the discriminating peptide has the enzyme activity of transferring glucuronic acid from the glucuronic acid donor to the non-reducing terminal N-acetylgalactosamine residue present in the chondroitin skeleton. Characterized fusion protein.

2 . グルクロン酸供与体から、 非還元末端が N-ァセチルガラクトサミン残 基であり、 コンドロイチン骨格を有する 7糖からなるオリゴ糖の該 N-ァセチル ガラク トサミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、 N-ァセチルガラタ ト サミン供与体から、 非還元末端がグルクロン酸残基であり、 コンドロイチン骨 格を有する 6糖からなるオリゴ糖の該ダルク口ン酸に対しては実質的に N-ァセ チルガラク トサミン残基を転移する活性を有しないことを特徴とする請求の範 囲 1記載の融合タンパク質。2. The glucuronic acid donor transfers a glucuronic acid residue to the N-acetylgalactosamine of an oligosaccharide consisting of a heptasaccharide having a chondroitin skeleton, the non-reducing end of which is an N-acetylgalactosamine residue. From the N-acetylgalatatosamine donor, the non-reducing end is a glucuronic acid residue, and an oligosaccharide consisting of a hexasaccharide having a chondroitin skeletal structure is substantially N-acetylgalactose with respect to the darcynic acid. 2. The fusion protein according to claim 1, wherein the fusion protein has no activity of transferring a tosamine residue.

3 . 識別ペプチドがシグナルペプチド、 プロテインキナーゼ 、 プロティ ン八、 グ^/タチオン S転移酵素、 Hisタグ、 mycタグ、 FLAGタンパク質、 T7タグ、3. Identification peptides are signal peptide, protein kinase, protein 8, G ^ / tathione S transferase, His tag, myc tag, FLAG protein, T7 tag,

Sタグ、 HSVタグ、 pelB、 HAタグ、 Trxタグ、 CBPタグ、 CBDタグ、 CBRタグ、 β - lac/blu、 ]3 - gal、 luc、 HP- Thio、 HSP、 Ln γ , Fn、 GFP、 YFP、 CFP、 BFP、 DsRed、 DsRed2、 MBP、 LacZ、 IgG、 アビジン、 及びプロテイン Gからなる群から 選択されるいずれか一つのぺプチドであることを特徴とする請求の範囲 1又は 2記载の融合タンパク質。S tag, HSV tag, pelB, HA tag, Trx tag, CBP tag, CBD tag, CBR tag, β-lac / blu,] 3-gal, luc, HP-Thio, HSP, Lnγ, Fn, GFP, YFP , CFP, BFP, DsRed, DsRed2, MBP, LacZ, IgG, avidin, and protein G, any one of the peptides selected from the group consisting of: protein.

4 . 請求の範囲 1乃至 3のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードす る DNA。4. A DNA encoding the fusion protein according to any one of claims 1 to 3.

5 . 請求の範囲 4記載の DNAを含むベクター。5. A vector comprising the DNA according to claim 4.

6 . 請求の範囲 5記載のベクターが宿主細胞に導入されてなる形質転換体。6. A transformant obtained by introducing the vector according to claim 5 into a host cell.

7 . 請求の範囲 6記載の形質転換体を生育させ、 生育物から融合タンパク 質を単離することを特徴とする請求の範囲 1乃至 3のいずれか一項記載の融合 タンパク質の製造方法。7. The method for producing a fusion protein according to any one of claims 1 to 3, wherein the transformant according to claim 6 is grown, and the fusion protein is isolated from the grown product.

8 . 下記性質を有するダルク口ン酸転移酵素。8. Dulcus glucosyltransferase having the following properties.

( a ) 作用 (a) Action

グルクロン酸供与体から、 受容体である N-ァセチルガラク トサミン残基にグ ルクロン酸残基を転移する。 Transfer glucuronic acid residue from glucuronic acid donor to acceptor, N-acetylgalactosamine residue.

( b ) 基質特異性 (b) Substrate specificity

グルクロン酸供与体から、 非還元末端が N-ァセチルガラタトサミン残基であ り、 コンドロイチン骨格を有する 7糖からなるオリゴ糖の該 N-ァセチルガラク トサミンに対してグルクロン酸残基を転移するが、 N-ァセチルガラク トサミン 供与体から、 非還元末端がグルクロン酸残基であり、 コンドロイチン骨格を有 する 6糖からなるオリゴ糖の該グルクロン酸に対しては実質的に N-ァセチルガ ラク トサミン残基を転移する活性を有しない。 The glucuronic acid donor transfers the glucuronic acid residue to the N-acetylgalactosamine of an oligosaccharide comprising a heptasaccharide having a chondroitin skeleton from the glucuronic acid donor, where the non-reducing end is an N-acetylgalatatosamine residue. From the N-acetylgalactosamine donor, the non-reducing end is a glucuronic acid residue, and an oligosaccharide consisting of a hexasaccharide having a chondroitin skeleton is substantially converted to an N-acetylgalactosamine residue with respect to the glucuronic acid. Has no metastatic activity.

( c ) 活性の阻害 (c) Inhibition of activity

エチレンジァミン四酢酸共存下では酵素活性を実質的に示さない。 In the presence of ethylenediaminetetraacetic acid, the enzyme activity is not substantially exhibited.

9 . 配列番号 4記載のァミノ酸配列、 または配列番号 4記載のアミノ酸配 列において、 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付加および/または転位 されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求の範囲 8記載のグルクロン酸 転移酵素。9. The amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 includes an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added, and / or transposed. 9. The glucuronyltransferase according to claim 8, wherein:

1 0 . 非還元末端に N -ァセチルガラク トサミン残基を有するとともにコン ドロイチン骨格を有する糖鎖に対し、 請求の範囲 1乃至 3のレ、ずれか一項記載 の融合タンパク質或いは請求の範囲 8又は 9記載のダルク口ン酸転移酵素を作 用させ、 グルクロン酸供与体から該糖鎖の非還元末端の N-ァセチルガラク トサ ミン残基にグルクロン酸を転移することを特徴とする、 コンドロイチン骨格を 有する糖鎖の製造方法。10. The fusion protein according to any one of claims 1 to 3 or claim 8, or claim 8 or 9 for a sugar chain having an N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end and having a chondroitin skeleton. A sugar having a chondroitin skeleton, wherein the sugar has a chondroitin skeleton, wherein the sugar is transferred from a glucuronic acid donor to an N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end of the sugar chain by the action of the above-mentioned dalc gluconate transferase. Chain manufacturing method.

1 1 . 配列番号 4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 または配列 番号 4記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 付 加および/または転位されたァミノ酸配列からなるポリペプチドを含むタンパ ク質を含有し、 非還元末端に N-ァセチルガラク トサミン残基を有するコンドロ ィチン骨格からなる糖鎖にダルク口ン酸供与体からダルク口ン酸を転移する活 性を有する糖鎖合成剤。11. A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added and / or transposed in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. A sugar chain containing a peptide-containing protein and having the activity of transferring dalc oxalic acid from a dalc oxalate donor to a sugar chain having a chondroitin skeleton having an N-acetylgalactosamine residue at the non-reducing end. Synthetic agent.

1 2 . タンパク質が配列番号 4記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 または配列番号 4記載のァミノ酸配列において 1以上のァミノ酸が欠失、 置換、 揷入、 付加および/または転位されたァミノ酸配列からなるポリペプチドと、 識別べプチドとの融合タンパク質を含むことを特徴とする請求の範囲 1 1記載 の糖鎖合成剤。1 2. A polypeptide whose protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or an amino acid in which one or more amino acids have been deleted, substituted, inserted, added and / or translocated in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. The sugar chain synthesizing agent according to claim 11, comprising a fusion protein of a polypeptide having a sequence and a discriminating peptide.