明 細 書 Specification
B型肝炎ウィルス遺伝子の変異検出方法および検出キット 技術分野 Method for detecting mutation of hepatitis B virus gene and detection kit
本発明は、 医学、 臨床検査分野において、 ラミブジン等の B型肝炎治療薬耐性 B型肝炎ウィルスの検出及び、投薬モニタリングに有用な、 B型肝炎ウィルスの逆 転写酵素活性中心をコードする遺伝子の変異の検出に関する。 背景技術 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention relates to the mutation of a gene encoding a reverse transcriptase activity center of hepatitis B virus, which is useful for the detection of hepatitis B therapeutic drug resistant hepatitis B virus such as lamivudine and the like in the field of medicine and clinical testing and for drug monitoring. Related to the detection of Background art
我国の B型肝炎ウィルス （hepat i t i s B vi rus：以下 HBVと略する） の持続感染 者は、 無症候性キャリアを含めると 150万人に達すると言われている。 現在、 抗 ウィルス療法としてはインタ一フエロンが用いられているが、 十分な効果が得ら れていない例も存在し、 有効な抗ウイルス薬が待望されている。 It is said that the number of people with persistent hepatitis B virus (hepatitis B virus: hereinafter abbreviated as HBV) in Japan will reach 1.5 million including asymptomatic carriers. At present, interferon is used as an antiviral therapy, but there are cases in which sufficient effects have not been obtained, and effective antiviral drugs are expected.
ラミブジン （Lamivudine) は英国グラクソ ·ウエルカム社で開発された抗ウイ Lamivudine is an anti-wizard developed by Glaxo Welcome
， ルス薬で、 当初は HIV治療薬として開発が進められたが、 HBVにも有効であるこ とが明らかになり、 B型慢性肝炎治療薬としての開発が進められている （谷川ら、 肝胆塍 35： 529 - 547, 1997； 日本ダラクソ株式会社、 BIO Cl i nic 13： 415 - 418, 1998)。ラミブジンの作用機序はラミブジンが細胞内で三リン酸誘導体にリン酸化 され HBVの逆転写酵素を阻害すると共にウイルスゲノムに取り込まれてその核酸 伸長合成 （複製） 反応を阻害することにより、 抗ウィルス活性を示すと考えられ ている。 ラミブジンは、 天然の核酸には存在しない光学異性体 （立体配置） であ るため、 哺乳類の DNA複製には悪影響を及ぼさないという特徴がある。 , Ruth was initially developed as a therapeutic agent for HIV, but was found to be effective for HBV, and is being developed as a therapeutic agent for chronic hepatitis B (Tanikawa et al., Hepatobiliary). 35: 529-547, 1997; Nippon Daraxo Corporation, BIO Clinic 13: 415-418, 1998). The mechanism of action of lamivudine is that lamivudine is phosphorylated into triphosphate derivatives in cells and inhibits HBV reverse transcriptase, and is taken into the viral genome to inhibit its nucleic acid elongation synthesis (replication) reaction. It is thought to show activity. Lamivudine is an optical isomer (configuration) that does not exist in natural nucleic acids, and therefore does not adversely affect mammalian DNA replication.
しかし最近になって、 ラミブジンの長期投与により、 ラミブジン耐性の HBVが 出現する例があることが問題となりつつあり、 この耐性を獲得した HBVは、 その ゲノム中の共通した遺伝子に変異が生じていることが報告されている （Kar l P. Fi scherら、 ANTIMI CROB. AGENTS CHEMOTHER 40： 1957 - 1960, 1996； Roger L ing ら、 HEPAT0L0GY 24： 714- 717, 1996)。 この変異が生ずる部位は、 HBV のポリメ ラーゼの逆転写酵素の活性中心部位であり、 逆転写酵素に特有なアミノ酸配列、 すなわち、 チロシン （Y) ·メチォニン （M) ·ァスパラギン酸 （D) ·ァスパラギン 酸 （D)からなるアミノ酸配列を有することから、 YMDDモチーフ （第 736〜747ヌ クレオチド） と呼ばれている (L. A. Koh l s taed t ら、 SCIENCE 256： 1783 - 1790, 1992)。 ラミブジンの長期投与においては、 この YMDDモチーフの M (メチォニン） が V (パリン）、 I (イソロイシン） に置換され、 HBVはラミブジン耐性を獲得する と言われている。 遺伝子レベルでは、 メチォニンのコドンである ATGの Aが Gに 変異することによりバリンへ、 または ATGの Gが T、 もしくは Αに置換される ことによりイソロイシンに置換されることになる。Recently, however, it has become a problem that long-term administration of lamivudine may result in the emergence of lamivudine-resistant HBV.HBV that has acquired this resistance has mutations in a common gene in its genome. (Karl P. Fischer et al., ANTIMI CROB. AGENTS CHEMOTHER 40: 1957-1960, 1996; Roger Ling et al., HEPAT0L0GY 24: 714-717, 1996). The site where this mutation occurs is the active center site of the reverse transcriptase of the HBV polymerase, and is an amino acid sequence unique to reverse transcriptase, that is, tyrosine (Y) · methionine (M) · aspartic acid (D) · asparagine. Since it has an amino acid sequence consisting of an acid (D), it is called a YMDD motif (nucleotides 736 to 747) (LA Kohls taedt et al., SCIENCE 256: 1783-1790, 1992). It is said that in long-term administration of lamivudine, M (methionine) of this YMDD motif is replaced by V (parin) and I (isoleucine), and HBV acquires lamivudine resistance. At the gene level, the methionine codon ATG in ATG is mutated to G and replaced with valine, or the G in ATG is replaced with T or Α to be replaced with isoleucine.
従って、 ラミブジン投薬時のラミブジン耐性ウィルス、つまり YMDDモチーフを コードする遺伝子に上記のような変異を持ったウィルスが出現することのモニタ リングは、 ラミブジンの効果判定及び投薬計画の一助となり、 大変有用であると 考えられる。. Therefore, the monitoring of the appearance of lamivudine-resistant virus at the time of lamivudine administration, that is, a virus having the above-mentioned mutation in the gene encoding the YMDD motif, will be helpful in determining the effect of lamivudine and in planning a dose, and is very useful. It is believed that there is. .
現在行われている HBVの上記のような変異の検出及び変異型ウィルス自体の検 出は、 アミノ酸レベルでの検出が大変困難であるため、 核酸レベルで行われてい る。 その一例としては、 患者から採取された血清中より HBVウィルス遺伝子を抽 出、 精製し、 次に変異が存在すると考えられる遺伝子配列周辺を PCR法により増 幅し、 増幅産物を直接 （ダイレクトシークェンス法） もしくはサブクローニング 後、 ダイデォキシ法により配列決定検査を行う方法が挙げられる。 At present, detection of the above mutations in HBV and detection of mutant viruses themselves are performed at the nucleic acid level because it is very difficult to detect them at the amino acid level. One example is the extraction and purification of the HBV virus gene from the serum collected from a patient, followed by amplification of the area around the gene sequence suspected of having a mutation by PCR, and direct amplification of the amplified product (direct sequence method). Alternatively, after subcloning, a sequencing test may be performed by the dideoxy method.
その他には、 点変異に対応する塩基を 3 ' 末端に有する遺伝子増幅用プライマ 一を用い、 変異遺伝子のみを PCR法により増幅することにより点変異を検出する ?01-33?法が用ぃられてぃる （茶山ら、 ？八1(^0 ¥ 27 : 171 1—1716, 1998)。 上記のような HBV遺伝子の配列決定による検査は、 ォ一トシークェンサ一等の 出現により現在ではかなりの部分で自動化されてはいるものの、 検体入手から検 出まで数日を要し、 時間がかかる上、 大変繁雑かつ熟練を要する作業が含まれて いる。 また、 経済的負担も大きく多数検体の処理には向いていない。 さらに、 遺 伝子配列検査では、 野生型と変異型のウィルスが共存する状態ではその存在比率 を反映した結果が出ない可能性がある等の欠点を有する。 In addition, the 0101-33? Method is used, which uses a gene amplification primer having a base corresponding to the point mutation at the 3 ′ end and amplifies only the mutated gene by PCR to detect the point mutation. T ぃ ru (Chayama et al.? 8 1 (^ 0 ¥ 27: 171 1-1716, 1998) The examination by HBV gene sequencing as described above is now a large part due to the appearance of auto sequencers and the like. Although it is automated, it takes several days from sample acquisition to detection, which is time-consuming, involves very complicated and skillful operations, and has a large economic burden and is difficult to process many samples. In addition, the genetic sequence test has the drawback that when the wild-type and mutant-type viruses coexist, the results that reflect the abundance ratio may not be obtained.
また PCR- SSP法は、 点変異の種類毎にプライマ一セッ卜の設計、 PCR条件等の 設定が必要であり、 検出系が複雑である等の欠点を有している。 In addition, the PCR-SSP method requires designing primer sets and setting PCR conditions for each type of point mutation, and has disadvantages such as a complicated detection system.
そこで、 本発明は、 （ i ) 検体入手から検出までが 1日で終了し、 （i i ) オート シークェンサ一等特別かつ高価な装置、 及び熟練を要する技術なしに実施可能で あり、 （i i i ) 感度及び特異性が高く、 そして （iv) 野生型と変異型の存在比率が 互いに 1 0倍程度であれば両者ともに検出が可能である、 B 型肝炎ウィルスの逆 転写酵素活性中心をコードする遺伝子の変異検出方法を提供することを目的とす る。 発明の開示Accordingly, the present invention provides (i) a method that completes the process from obtaining a sample to detection in one day; It can be carried out without special and expensive equipment such as sequencers and skilled techniques, (iii) has high sensitivity and specificity, and (iv) has a wild-type and mutant-type abundance of about 10 times each other. An object of the present invention is to provide a method for detecting a mutation in the gene encoding the reverse transcriptase activity center of hepatitis B virus, which can detect both if present. Disclosure of the invention
本発明者等は、 B型肝炎ウィルスの逆転写酵素活性中心 （YMDDモチーフ） をコ 一ドする遺伝子の変異を検出する方法において、 The present inventors have proposed a method for detecting a mutation in a gene encoding a reverse transcriptase activity center (YMDD motif) of hepatitis B virus,
HBVゲノム遺伝子の一定領域、 即ち、 YMDDモチーフをコードする遺伝子の周辺 領域の増幅に際し、 特定のプライマーセットを用いること、 When amplifying a certain region of the HBV genomic gene, that is, the region around the gene encoding the YMDD motif, using a specific primer set;
さらには、 増幅産物のハイブリダィゼーシヨンに 3 ' 末端近傍をラミブジン長 期投与時に YMDD モチーフをコードする遺伝子上で生ずる可能性のある遺伝子変 異に応じて変化させ、 さらには非特異的反応が生じないような人為的な変異の導 入及びプローブ長の適正化などの工夫を施した特定のプローブを用いること、 次いで、 DNA ポリメラ一ゼにより、 プローブの 3 ' 末端側に標識基質の取り込 みを行わせ、 取り込み反応を分析することにより、 Furthermore, the 3 'end of the amplification product is changed in the vicinity of the 3' end according to the gene mutation that may occur on the gene encoding the YMDD motif during long-term administration of lamivudine. Use of a specific probe that has been devised to introduce artificial mutations and to optimize the probe length that will not cause cloning, and then use a DNA polymerase to remove a labeled substrate at the 3 'end of the probe. By performing the integration and analyzing the uptake reaction,
簡易で、 短時間で操作でき、 かつ遺伝子上の変異を正確に判定する方法を見い 出し、 本発明を完成するに至った。 The present inventors have found a method that is simple, can be operated in a short time, and accurately determines a mutation on a gene, thereby completing the present invention.
即ち、 本発明の方法は、 検体に含まれる対立遺伝子とプローブが相補性を有す るかどう力 及びその相補性の程度により、 次いで行う DNAポリメラーゼによる 標識基質の取り込み反応が影響されることを利用する。 That is, the method of the present invention is based on the fact that the ability of the probe to complement the allele contained in the sample and the degree of complementarity affect the subsequent incorporation of the labeled substrate by the DNA polymerase. Use.
以下に、 本発明を更に詳しく、 ラミブジン長期投与時に生ずるラミブジン耐性 HBVの検出及び HBV遺伝子上の YMDDモチーフをコ一ドする遺伝子の変異検出を例 にとつて説明する。 しかしながら、 ラミブジン以外の薬剤投与により HBVの YMDD モチーフ上に同様な変異を起こす場合があれば、 それについても検出できること は言うまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by taking, as an example, the detection of lamivudine-resistant HBV generated during long-term administration of lamivudine and the detection of a mutation in a gene encoding the YMDD motif on the HBV gene. However, if a similar mutation is caused on the YMDD motif of HBV by administration of a drug other than lamivudine, it goes without saying that it can be detected.
尚、 配列表においては、配列の小文字表記が義務付けられており、 また、 i (ィ ノシン） は nとして記載して、 別途に iとして特定しなければならないが、 配列 表を除く本明細書においては、 便宜上、 特に断らない限り、 配列は大文字表記を 原則とし、 イノシンは Iとして記載する。 図面の簡単な説明In the sequence listing, lowercase notation of the sequence is obligatory, and i (inosine) must be written as n and specified separately as i. In the present specification except for the tables, for convenience, unless otherwise specified, sequences are generally written in upper case, and inosine is described as I. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 HBV-DNA中の、 YMDDモチーフの位置及び配列番号： 1及び配列番号： 2のプライマー配列の位置を示す。 発明を実施するための最良の形態 FIG. 1 shows the position of the YMDD motif and the positions of the primer sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in HBV-DNA. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明の目的のためには、 まず、 予め HBVの逆転転写素の活性中心である YMDD モチーフをコードする遺伝子領域を含むように検体中の DNAを増幅しておくこと が望ましい。 For the purpose of the present invention, it is desirable to first amplify the DNA in the sample in advance so as to include the gene region encoding the YMDD motif, which is the active center of the reverse transcript of HBV.
分析される铸型 HBV遺伝子は、 HBV感染者からの血清、 組織等より抽出、 精製 するのが好ましい。 The type II HBV gene to be analyzed is preferably extracted and purified from serum, tissue, etc., from an HBV infected person.
本方法で使用する増幅産物は、 50b 以上 300bp以下が好ましく、 80b 以上 130bp 以下が更に好ましい。 The amplification product used in the present method preferably has a size of 50 b or more and 300 bp or less, more preferably 80 b or more and 130 bp or less.
増幅した産物はアルカリ変性させて 1本鎖としたのち、 変異に応じた各プロ一 ブとハイブリダイゼ一シヨンさせる。 The amplified product is denatured with alkali to form a single strand, and then hybridized with each probe corresponding to the mutation.
'一配列の選択 'Select one array
HBV は比較的変異しやすいウィルスであることから、 プライマー設定位置は各 クローン間で保存性が高い部位を使用することが望ましい。 Since HBV is a virus that is relatively easily mutated, it is desirable to use a site that is highly conserved between clones when setting primers.
また、 PCR の増幅効率やプライマーと標的核酸のハイブリダィゼーシヨン特異 性は、 プライマ一設定位置やプライマーの配列にも依存することから、 PCR増幅 効率が良く、 且つ特異性の高い部分にプライマーを設定する必要がある。 In addition, since the amplification efficiency of PCR and the hybridization specificity of the primer and target nucleic acid also depend on the primer setting position and the primer sequence, primers with high PCR amplification efficiency and high specificity are used. Need to be set.
以上のことを総て考慮した結果、 本発明では、 以下のプライマーセット ： As a result of considering all of the above, the present invention provides the following primer set:
'一： 5' -AGTGGGCCTC AGNCCGTTTC-3' (配列番号： 1 )、 及び 'One: 5'-AGTGGGCCTC AGNCCGTTTC-3' (SEQ ID NO: 1), and
マ一： 5' -AGACTTGGCC CCCAATACCA - 3' (配列番号： 2 ) を用いる （但し、 Nは A， T， C又は Gの何れかもしくはイノシンもしくはュニバ ーサル塩基である）。 配列番号： 1及び 2は、 図 1に示すとおり、 YMDD モチーフ の前後に位置する。 HBV-DNAは 3215ヌクレオチドからなるが、 配列番号： 1は第 645〜664ヌクレオチドに、 そして配列番号： 2は第 749〜768ヌクレオチドに相 当する。1. Use 5'-AGACTTGGCC CCCAATACCA-3 '(SEQ ID NO: 2) (where N is any of A, T, C or G, or inosine or universal base). SEQ ID NOs: 1 and 2 are located before and after the YMDD motif, as shown in FIG. HBV-DNA consists of 3215 nucleotides. SEQ ID NO: 2 corresponds to nucleotides 645-664 and SEQ ID NO: 2 corresponds to nucleotides 749-768.
但し、 該配列プライマーセッ卜で PCR法により増幅される部位の内側もしくは 近傍外側であり、設定した遺伝子プローブ配列と完全に重複しない部位であれば、 該増幅産物の内側もしくは近傍外側にプライマーセットを設定することができる ことは言うまでもない。 However, if the site is inside or near the site to be amplified by the PCR method in the sequence primer set and does not completely overlap with the set gene probe sequence, the primer set should be inside or near the outside of the amplification product. It goes without saying that it can be set.
プローブのデザィンProbe design
一般に、 プローブのデザインにおいてハイブリダィゼーシヨン特異性に影響す る因子として考慮しなければならないのは、 標的との配列の相同性とヌクレオチ ドの長さである。 In general, factors that affect hybridization specificity in probe design must be considered sequence homology to the target and nucleotide length.
単一の配列のみを標的とするのならば、 標的配列と全く同一な配列を有するプ ローブを用いればよい。 長さに関しては、 ヌクレオチドの合成コストを考えれば 10〜40bp程度が一般的である。 If only a single sequence is targeted, probes having exactly the same sequence as the target sequence may be used. The length is generally about 10 to 40 bp considering the cost of nucleotide synthesis.
しかしながら、 変異及び Z又は縮重により生じ得る複数の対立遺伝子同志を識 別する場合や、 複数の対立遺伝子群をまとめて識別したい場合であって、 しかも 検体数が多い場合には、可能な限りプローブの数を減らすのが普通である。即ち、 複数の対立遺伝子群を識別する際、 最も一般的には、 各群に対するプローブを 1 種類のみ用いる。 よって、 各群において縮重が複数存在する場合には、 各々のプ ローブに関してひとつまたは複数のミスマツチ塩基が存在せざるを得なくなる。 即ち、 より少ない数のプローブを用いて一度に多くの遺伝子群を識別するために は、 目的の群と目的としない群との間のハイブリダイゼーション強度に偏りを生 じさせるようにプロ一ブをデザィンしなくてはならず、 プローブ中のミスマッチ 塩基の数及び導入位置の選択はより困難になる。 However, when identifying multiple alleles that can occur due to mutation and Z or degeneracy, or when it is desired to identify multiple alleles collectively and the number of samples is large, It is common to reduce the number of probes. That is, when identifying multiple allele groups, most commonly, only one probe for each group is used. Therefore, when there is a plurality of degeneracy in each group, one or more Misuchi bases must be present for each probe. That is, in order to discriminate many gene groups at a time using a smaller number of probes, the probe should be designed so as to bias the hybridization intensity between the target group and the non-target group. It must be designed, and it becomes more difficult to select the number of mismatched bases in the probe and the position of introduction.
ミスマッチ導入の選択において、 例えば、 2つの連続するミスマッチと 2つの 連続しないミスマッチとでは、 同じミスマッチ含有率でもプローブ全体のハイブ リダィゼーシヨン強度に対する影響は違うし、 また、 ミスマッチの位置によって もプローブ全体のハイブリダイゼ一ション効率に対する影響があると考えられる。 特定の対立遺伝子群のみのミスマッチ塩基の数を加減するためには、 ュニバー サルな塩基 （ニュートラルな塩基） を用いることもできる。 ユニバーサルな塩基 としてはイノシン （ I ) が最も一般的であるが、 隣接塩基の種類やハイブリダィ ゼーション条件等により、 イノシンの特定の塩基に対する水素結合強度は影響を 受けるとの報告もある。 また、 場合によっては、 I ： G結合よりも、 ミスマッチ 結合である T： G結合の方が安定であるとの報告もある。In selection of mismatch introduction, for example, two consecutive mismatches and two non-consecutive mismatches have different effects on the hybridization intensity of the entire probe even at the same mismatch content, and the hybridization of the entire probe also depends on the position of the mismatch. It is considered that there is an effect on the efficiency of the application. Universal bases (neutral bases) can also be used to moderate the number of mismatched bases in a particular allele group only. Universal base Inosine (I) is the most common, but it has been reported that the hydrogen bond strength of inosine to a specific base is affected by the type of adjacent base and hybridization conditions. In some cases, it has been reported that a T: G bond, which is a mismatch bond, is more stable than an I: G bond.
また、 標的配列とプローブの結合においては、 ハイブリダィゼ一シヨン条件に おけるストリンジェンシ一が影響する。 ストリンジェンシ一が高くなれば、 一般 に、 ミスマッチな塩基対合は生じにくくなる。 しかしながら、 プローブの長さを 変更したり、 ミスマッチの導入位置や数を調節することにより、 ストリンジェン シ一による影響は加減することができる。 即ち、 何らかの理由により、 プローブ の長さを長くできない場合や、 ミスマッチ導入部位に制限がある場合などは、 ス トリンジエンシーにより対立遺伝子群間の八ィプリダイゼ一シヨン強度を調節す ることもできる。 In addition, the binding between the target sequence and the probe is affected by the stringency under the hybridization conditions. The higher the stringency, the less likely it is that mismatched base pairing generally occurs. However, the effect of stringency can be moderated by changing the length of the probe or by adjusting the location and number of mismatches. That is, when the length of the probe cannot be increased for some reason, or when there is a restriction in the site of mismatch introduction, the stringency can be used to adjust the strength of allied groups between alleles.
生検中のウィルスの変異遺伝子の識別に用いるためのプローブのデザィンにお いては、 変異型遺伝子の縮重を全てカバーすることに加えて、 複合感染あるいは 変異型の復帰による野生型と変異型の共存の可能性を考慮しなければならない。 なお、 復帰変異に関しては、 完全に野生型の遺伝子型に戻る真正復帰と、 新たな 変異により表現型上復帰させる抑圧復帰があるので、 後者の可能性がある場合に は、 新たな対立遺伝子の可能性を考慮しなければならない。 The design of the probe used to identify the mutated gene of the virus during the biopsy should cover all degeneracy of the mutated gene, as well as the wild-type and mutated forms due to complex infection or reversion of the mutated form. Consider the possibility of coexistence. Regarding reversion, there are two types of reversion: genuine reversion that completely returns to the wild-type genotype and repression that reverts phenotypically to a new mutation. Possibilities must be considered.
また、 一般に、 プローブの長さは、 20bp以上 40bpが好ましく、 25bp以上 35bp 以下が更に好ましい。 In general, the length of the probe is preferably from 20 bp to 40 bp, more preferably from 25 bp to 35 bp.
本発明のプローブは、 3 ' 末端から数塩基上流側にミスマッチ変異部位が位置 するようにデザィンすると好適な結果が得られることを見いだしたうえで、 デザ インしたものである。 The probe of the present invention has been designed after finding that suitable results can be obtained by designing such that the mismatch mutation site is located several bases upstream from the 3 ′ end.
ラミブジン長期投与時に生ずるラミブジン耐性 HBVの YMDDモチーフの変異は、 アミノ酸レベルでは 2種類が存在する。 即ち、 YMDDモチーフの YVDD (変異型 V ) もしくは YIDD (変異型 I ) への変異が確認されている。 対応するコドンの塩基配 列は、 理論上、 野生型 M (ATG)から変異型 V (GTA、 GTT、 GTC及び GTG) 及び変異 型 I (ATA、 ATT及び ATC) を含めて、 8種類の対立遺伝子が存在することになる。 以下の表 1において、 各変異アミノ酸配列の塩基配列を比較する。 表 1At the amino acid level, there are two types of mutations in the YMDD motif of lamivudine-resistant HBV caused by long-term administration of lamivudine. That is, mutation of the YMDD motif to YVDD (mutant V) or YIDD (mutant I) has been confirmed. The base sequence of the corresponding codon is theoretically eight different types, including wild type M (ATG) to mutant V (GTA, GTT, GTC and GTG) and mutant I (ATA, ATT and ATC). The gene will be present. In Table 1 below, the nucleotide sequences of each mutant amino acid sequence are compared. table 1
野生型 YMD D TAT ATG GAT GATWild type YMD D TAT ATG GAT GAT
Y V D D型変異 TAT gTA GAT GAT Y V D D type mutation TAT gTA GAT GAT
TAT gTt GAT GAT TAT gTt GAT GAT
TAT gTc GAT GAT TAT gTc GAT GAT
TAT gTG GAT GAT TAT gTG GAT GAT
Y I D D型変異 TAT AT a GAT GAT Y I D D type mutation TAT AT a GAT GAT
TAT ATc GAT GAT TAT ATc GAT GAT
TAT ATt GAT GAT TAT ATt GAT GAT
但し、 現在まで、 ヒト由来の HBVについてラミブジン投与により生ずる変異型 は、変異型 Vの場合、野生型 M (ATG)からみて 2ポイントの変異型となる GTA、 GTT 及び GTCなる変異型は報告されていない。 また、 変異型 Iの場合は ATTへの変異 のみが報告されているが、 自然界には ATAへの変異例がラミブジン投与と関係無 く存在するとの報告がある （S tephan Guntherら、 VIROLOGY 235： 104— 108, 1997)。 野生型 （YMDD) の検出用プローブ However, to date, mutations of human-derived HBV caused by lamivudine administration have been reported in the case of mutant V; mutants of GTA, GTT, and GTC, which are 2-point mutants compared to wild-type M (ATG), have been reported. Not. In the case of variant I, only mutations to ATT have been reported, but mutations to ATA in nature have been reported to exist independently of lamivudine administration (Stephan Gunther et al., VIROLOGY 235: 104—108, 1997). Probe for detection of wild type (YMDD)
野生型 （YMDD型） を検出する為のプローブには、 野生型 YMDDモチーフの塩基 配列である TAT ATG GAT GATの下線部を末端に含む、 Probes for detecting wild-type (YMDD) include the underlined TAT ATG GAT GAT, which is the nucleotide sequence of the wild-type YMDD motif, at the end.
5' - TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATATGG-3' (配列番号： 3 ) 5 '-TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATATGG-3' (SEQ ID NO: 3)
を有するプローブを使用することができる。 これで十分に野生型 （YMDD) を検出 できるが、 本プローブは、 下線部のメチォニンのコドン ATGにおいて、 変異型の 配列である YVDD型： TAT gTG GAT GATもしくは YIDD型： TAT ATa GAT GAT、 TAT ΑΠ GAT GAT及び TAT ATc GAT GATと 1塩基しか違いがなく （小文字部分）、 検体中に これら変異型が混在すると、 時に変異型の増幅産物も弱いながらハイブリダィゼ ーシヨンしてしまう可能性も考えられる。Can be used. This probe can sufficiently detect wild-type (YMDD). However, this probe is a mutant sequence in the underlined methionine codon ATG. YVDD type: TAT gTG GAT GAT or YIDD type: TAT ATa GAT GAT, TATな く Only one base is different from GAT GAT and TAT ATc GAT GAT (lower case part). If these mutants are mixed in the sample, it is possible that the amplification product of the mutant is sometimes weakly hybridized.
この点を考慮すると、 With this in mind,
5' -TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATAVGG-3' (配列番号： 4 ) 5'-TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATAVGG-3 '(SEQ ID NO: 4)
を有するプローブが好ましい （Vは、 A又は G又は Cである）。 このプローブは下 線で示した部位に人為的に新たな変異を導入し、 各変異型の遺伝子配列から見て 2〜 3塩基のミスマッチになるようにすることにより、 野生型での反応特異性を 低下させることなく、 変異型との非特異反応を抑えることができる。 Vは A、 Gで もよいが、 Cへの変異を導入した、(V is A or G or C). This probe artificially introduces a new mutation at the site indicated by underlining and makes it a mismatch of 2-3 bases from the gene sequence of each mutant type, so that the reaction specificity in the wild type is To Non-specific reaction with the mutant can be suppressed without lowering. V may be A or G, but the mutation to C has been introduced,
5' - TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATACGG-3' (配列番号： 5 ) 5 '-TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATACGG-3' (SEQ ID NO: 5)
を有するプローブを使用することがより好ましい。 即ち、 配列番号： 5のプロ一 ブの末端 7塩基（T A T A c G G) は、 ( i ) 野生型とのミスマッチが小文字の 1 塩基であり、 そして （i i) 7種の変異型とのミスマッチが下線部中のいずれか 2 〜3塩基である。It is more preferable to use a probe having That is, the terminal 7 bases (TATA c GG) of the probe of SEQ ID NO: 5 are (i) a mismatch with the wild-type is a single base in lower case, and (ii) a mismatch with the 7 mutants is Any two to three bases in the underlined part.
この工夫は、 ラミブジン投与により、 いったんほぼ完全にラミブジン耐性 （変 異型） となった HBVが、 ラミブジン投与停止後、 野生型に復帰変異を起こすとい う臨床上重要な所見をフォローする上で重要である。 This ingenuity is important in following the clinically important finding that HBV, which has become almost completely lamivudine-resistant (mutant) once administered with lamivudine, reverts to the wild type after lamivudine administration is stopped. is there.
YVDD変異の検出用プローブProbe for detecting YVDD mutation
変異型 （YVDD型） の検出には、 その塩基配列として、 TAT GTa GAT GAT、 TAT GTt GAT GAT, TAT GTc GAT GAT及び TAT GTg GAT GATの 4種類が考えられる為、 これ ら 4種類を同時に検出する場合は、 これらの最初の 7塩基を 3 ' 末端に含む以下 の 4配列： Mutants (YVDD type) can be detected in four base sequences: TAT GTa GAT GAT, TAT GTt GAT GAT, TAT GTc GAT GAT, and TAT GTg GAT GAT. If so, the following 4 sequences containing these first 7 bases at the 3 'end:
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTAG-3' (配列番号： 6 )、 5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTAG-3 '(SEQ ID NO: 6),
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTTG-3' (配列番号： 7 )、5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTTG-3 '(SEQ ID NO: 7),
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTCG-3' (配列番号： 8 )、 及び5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTCG-3 '(SEQ ID NO: 8), and
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTGG-3' (配列番号： 9 )5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTGG-3 '(SEQ ID NO: 9)
を有する' 4種類のプローブの混合物、 ないしは、A mixture of four types of probes, or
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTIG-3' (配列番号： 10) 5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTATGTIG-3 '(SEQ ID NO: 10)
を有するプローブを使用することが好ましい。 これで十分に変異型 （YVDD型） を 検出できるが、 野生型が混在する場合、 配列番号： 9又は配列番号： 10のプロ一 ブは野生型遺伝子と 1塩基しか違いがなく （I：イノシンはどの塩基とも結合する ユニバーサル塩基）、検体中に野生型が存在すれば、野生型の増幅産物も弱いなが らハイブリダィゼーシヨンしてしまう可能性がある。It is preferable to use a probe having This can sufficiently detect the mutant type (YVDD type), but when wild type is mixed, the probe of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 has only one base difference from the wild type gene (I: inosine Is a universal base that binds to any base), and if wild-type is present in the sample, the wild-type amplification product may hybridize though weak.
この点を考慮すると、 With this in mind,
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTAG-3' (配列番号： 1 1 )、5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTAG-3 '(SEQ ID NO: 11),
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTTG-3' (配列番号： 12)、 5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTCG-3' (配列番号： 13) 及び5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTTG-3 '(SEQ ID NO: 12), 5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTCG-3 '(SEQ ID NO: 13) and
5'- TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTGG-3' (配列番号： 14)5'- TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTGG-3 '(SEQ ID NO: 14)
の各々の配列を含むプローブの混合物、 ないしは、A mixture of probes comprising each sequence of
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTIG-3' (配列番号： 15)5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTAVGTIG-3 '(SEQ ID NO: 15)
を有するプローブが好ましい。 配列番号： 11〜14のプローブは、 下線で示した部 位に人為的に新たな変異を導入し （Vは、 A又は G又は Cである）、 野生型及び変 異型 （YIDD型） の遺伝子配列から見て 2塩基のミスマッチになるようにすること により、 変異型 （YVDD型） での反応特異性を低下させることなく、 野生型もしく は変異型 YIDDとの非特異反応を抑えることができる。 あるいは、 総ての YVDD型 を検出できる配列番号： 15のプローブを使用してもよい。 Vは A、 Gでもよいが、 Cへの変異を導入した、Are preferred. The probes of SEQ ID NOS: 11 to 14 artificially introduce a new mutation (V is A or G or C) at the underlined positions, and are wild-type and mutant (YIDD) genes. Non-specific reactions with wild-type or mutant YIDD can be suppressed without reducing the reaction specificity of the mutant (YVDD type) by making a mismatch of 2 bases in the sequence. it can. Alternatively, a probe of SEQ ID NO: 15 that can detect all YVDD types may be used. V may be A or G, but a mutation to C has been introduced,
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTAG-3' (配列番号： 16)、 5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTAG-3 '(SEQ ID NO: 16),
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTTG-3' (配列番号： Π)、5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTTG-3 '(SEQ ID NO: Π),
5' - TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTCG-3' (配列番号： 18) 及び5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTCG-3 '(SEQ ID NO: 18) and
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTGG-3' (配列番号： 19)5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTGG-3 '(SEQ ID NO: 19)
の各々の配列を含むプローブの混合物、 ないしは、A mixture of probes comprising each sequence of
5' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTIG-3' (配列番号： 20)5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTIG-3 '(SEQ ID NO: 20)
を有するプローブを使用することがより好ましい。 以下の表 2に、 配列番号： 5 〜L0及び 16〜20の末端 7塩基の変異部位周辺の塩基配列を比較する。It is more preferable to use a probe having Table 2 below compares the nucleotide sequences around the mutation site at the terminal 7 bases of SEQ ID NOS: 5 to L0 and 16 to 20.
表 2Table 2
野生型とのミス YIDD型とのミス YVDD型との マッチ（小文字） マッチ _ (下線） ミスマッチ 配列番号： 6 TAT旦 T a G 2 1 0 配列番号： 7 TATg.T t G 2 1 0 配列番号： 8 TAT_ T c G 2 1 0 配列番号： 9 TATg.TGG 1 2 0 配列番号： 10 TAT旦 T I G 1 1 0 配列番号： 16 TAc gT a G 3 2 1 配列番号： 17 TAc gT t G 3 2 1 配列番号： 18 TA c g T c G 3 2 1 配列番号： 19 T A c g T G G 2 3 1 配列番号： 20 T A c g T I G 2 2 1Mismatch with wild type Mismatch with YIDD type Match with YVDD type (lowercase) Match _ (underlined) Mismatch SEQ ID NO: 6 TAT Dan Ta G2 10 SEQ ID NO: 7 TATg.T t G2 10 SEQ ID NO: : 8 TAT_T c G 2 10 SEQ ID NO: 9 TATg.TGG 1 2 0 SEQ ID NO: 10 TAT Dan TIG 1 10 SEQ ID NO: 16 TAc gT a G 3 2 1 SEQ ID NO: 17 TAc gT t G 3 2 1 SEQ ID NO: 18 TA cg Tc G32 1 SEQ ID NO: 19 TA cg TGG 23 1 SEQ ID NO: 20 TA cg TIG 22 1
(注： ミスマッチの数に関して、 配列番号： 11〜15はそれぞれ配列番号： 16〜20 と同じであるため、 記載を省略する）(Note: Regarding the number of mismatches, the description of SEQ ID NOS: 11 to 15 is omitted because they are the same as SEQ ID NOs: 16 to 20, respectively)
YIDD変異の検出用プローブProbe for detecting YIDD mutation
変異型 （YIDD型） の検出には、 その塩基配列として、 TAT ATa GAT GAT、 TAT AT c GAT GAT及び TAT ATt GAT GATの 3種類が考えられる為、 これら 3種類を同時に 検出する場合は、 これらの最初の 7塩基を 3 ' 末端に含む以下の 3配列： Mutants (YIDD type) can be detected in three base sequences: TAT ATa GAT GAT, TAT AT c GAT GAT, and TAT ATt GAT GAT. The following 3 sequences containing the first 7 bases of the 3 ′ end:
5' -CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATaG-3' (配列番号： 21)、5'-CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATaG-3 '(SEQ ID NO: 21),
5' -CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATcG-3' (配列番号： 22) 及び 5'-CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATcG-3 '(SEQ ID NO: 22) and
5' - CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATtG-3' (配列番号： 23)5 '-CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATtG-3' (SEQ ID NO: 23)
を有する 3種類のプローブの混合物を使用する。 これらのプロ一ブは、 変異型 (YVDD型） に関して現在までに報告されている配列が TAT £T£ G のみであり、 下線部において配列番号： 21〜23 と 2塩基の違いが生じるため、 変異型 （YVDD 型） による非特異反応が生じず、実際の検出上問題とならない。 また野生型（YMDD 型） の塩基配列とは 1塩基のみの違いであるが （小文字）、 他のプローブ （30bp) と同温度でのハイブリダイゼ一シヨン反応において、 プロ一ブ長を 5 bp短くする ことにより、 3 ' 末端部の変異導入部位の影響を大きくし、 ハイブリダィゼーシ ョンの特異性を向上させ、非特異的反応を防ぐことができる。従って、変異型 (YIDD 型） における遺伝子変異検出には、 配列番号： 21、 22及び 23を有するプローブ を使用する。A mixture of three types of probes having is used. In these probes, the sequence reported to date for the mutant (YVDD type) is only TAT £ T £ G, and the underlined portion has a difference of 2 nucleotides from SEQ ID NOS: 21 to 23. Non-specific reaction due to the mutant type (YVDD type) does not occur and does not pose a problem in actual detection. In addition, it differs from the wild type (YMDD type) base sequence by only one base (lower case), but in the hybridization reaction at the same temperature as other probes (30 bp), the probe length is shortened by 5 bp. This makes it possible to increase the influence of the mutation introduction site at the 3 ′ end, improve the specificity of hybridization, and prevent nonspecific reactions. Therefore, a probe having SEQ ID NOs: 21, 22, and 23 is used for detecting a gene mutation in a mutant type (YIDD type).
アミノ酸置換は生じないが、 遺伝子置換が生ずるコドンの 3番目の塩基につい ての変異をも確認したい場合は、 YVDD型変異の場合は、 配列番号： 6、 7、 8及 び 9のプロ一ブ、 もしくは 16、 17、 18及び 19のプローブを使用し、 また、 YIDD 型変異の場合は配列番号： 21、 22及び 23のプローブを分けて使用することが好 ましい。 If no amino acid substitution occurs, but it is also desired to confirm a mutation at the third base of the codon at which the gene substitution occurs, the probe of SEQ ID NO: 6, 7, 8, and 9 can be used for the YVDD type mutation. , Or 16, 17, 18 and 19, and in the case of YIDD mutation, the probes of SEQ ID NOs: 21, 22 and 23 are preferably used separately.
プローブの組み合わせProbe combinations
したがって、 本発明の一つの態様において、 B型肝炎ウィルスの逆転写酵素活 性中心をコードする遺伝子の変異の有無の検出に用いるプローブセットは、Thus, in one embodiment of the invention, the reverse transcriptase activity of hepatitis B virus Probe set used to detect the presence or absence of mutations in the gene encoding the sex center,
( i )配列番号： 3を有するプローブ、 配列番号： 4を有するプローブ及び配列 番号： 5を有するプローブのうち少なくとも 1種からなるプローブセット ；及び(i) a probe having SEQ ID NO: 3, a probe having SEQ ID NO: 4 and a probe set consisting of at least one of probes having SEQ ID NO: 5;
(ii) (a) 配列番号： 6を有するプローブ、 配列番号： 7を有するプローブ、 配列番号： 8を有するプローブ及び配列番号： 9を有するプローブを含むプロ一 ブ混合物、(ii) (a) a probe having SEQ ID NO: 6; a probe having SEQ ID NO: 7; a probe mixture comprising a probe having SEQ ID NO: 8 and a probe having SEQ ID NO: 9;
(b) 配列番号： 10を有するプローブ、 (b) a probe having SEQ ID NO: 10,
(c) 配列番号： 11を有するプローブ、 配列番号： 12を有するプローブ、 配列番号： 13を有するプローブ及び配列番号： 14を有するプローブを含むプロ一 ブ混合物、 及び (c) a probe having SEQ ID NO: 11, a probe having SEQ ID NO: 12, a probe mixture including a probe having SEQ ID NO: 13 and a probe having SEQ ID NO: 14, and
(d) 配列番号： 15を有するプローブ (d) a probe having SEQ ID NO: 15
のうち少なくとも 1種からなるプローブセット ；及び Z又はA probe set consisting of at least one of the following; and Z or
(iii) 配列番号： 21を有するプローブ、 配列番号： 1を有するプローブ及び 配列番号： 23を有するプローブを含むプローブ混合物 (iii) a probe mixture comprising a probe having SEQ ID NO: 21; a probe having SEQ ID NO: 1; and a probe having SEQ ID NO: 23
からなる。Consists of
本発明のもう一つの態様において、 B型肝炎ウイルスの逆転写酵素活性中心を コ一ドする遺伝子の変異の有無の検出に用いるプローブセットは、 In another embodiment of the present invention, a probe set used to detect the presence or absence of a mutation in a gene encoding the reverse transcriptase activity center of hepatitis B virus,
( i )配列番号： 5を有するプローブ； (i) a probe having SEQ ID NO: 5;
(ii) (a) 配列番号： 16を有するプローブ、 配列番号： 17を有するプローブ、 配列番号： 18を有するプローブ及び配列番号： 19を有するプローブを含むプロ一 ブ混合物、 及び (ii) (a) a probe having SEQ ID NO: 16; a probe having SEQ ID NO: 17; a probe mixture having a probe having SEQ ID NO: 18 and a probe having SEQ ID NO: 19;
(b) 配列番号： 20を有するプローブ (b) a probe having SEQ ID NO: 20
のうち少なくとも 1種からなるプローブセット ；及びA probe set consisting of at least one of:
(iii) 配列番号： 21を有するプローブ、 配列番号： 11を有するプローブ及び 配列番号： 23を有するプローブを含むプローブ混合物 (iii) a probe mixture comprising a probe having SEQ ID NO: 21, a probe having SEQ ID NO: 11, and a probe having SEQ ID NO: 23
からなる。Consists of
また、 本発明のさらなる態様において、 B型肝炎ウィルスの逆転写酵素活性中 心をコードする遺伝子の変異の有無の検出に用いるプロ一ブセットは、 In a further embodiment of the present invention, a probe set used for detecting the presence or absence of a mutation in a gene encoding the reverse transcriptase activity center of hepatitis B virus comprises:
( i )配列番号： 5を有するプロ一ブ； ( i i ) 配列番号： 20を有するプローブ；及び(i) a probe having SEQ ID NO: 5; (ii) a probe having SEQ ID NO: 20; and
( i i i ) 配列番号： 21 を有するプローブ、 配列番号： 11を有するプローブ及び配 列番号： 23を有するプローブを含むプローブ混合物 (iiii) a probe mixture comprising a probe having SEQ ID NO: 21, a probe having SEQ ID NO: 11, and a probe having SEQ ID NO: 23
からなる。Consists of
使用する遺伝子プローブは、 予め変異の種類別に担体に固相化しておくことが 望ましい。 例えば、 上記のプローブ 3セット 5種類 （配列番号： 5、 配列番号： 20及び配列番号： 21、 22及び 23の混合物） を用いる態様であれば、 固相化担体 として操作が容易なマイクロプレートのゥエルに 3ゥエル/ 1検体となるように 固相化しておくことが好ましく、 このプローブが固相化されたゥエル内で八イブ リダィゼ一シヨン反応を行う。 It is desirable that the gene probe to be used is previously immobilized on a carrier for each type of mutation. For example, in an embodiment using the above three sets of three sets of probes (a mixture of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NOs: 21, 22, and 23), a microplate that can be easily operated as a solid-phased carrier is used. It is preferable that the solid phase be immobilized so that the volume of the probe is 3 gel / sample, and an eight-bridging reaction is performed in the well where the probe is immobilized.
ハイブリダイゼーション反応Hybridization reaction
ハイブリダィゼーシヨン反応は、 増幅時の副産物を選択的に除去する反応でも ある。 更にハイブリダィゼーシヨンの際に選択性を追求するのであれば、 ハイブ リダィゼ一シヨンの際の温度を適正化することが必要である。 本発明のハイプリ ダイゼ一ション時の温度は好ましくは 25 ：〜 65 であり、より好ましくは 37"C〜 60 である。 The hybridization reaction is a reaction for selectively removing by-products during amplification. Furthermore, if the selectivity is to be pursued during the hybridization, it is necessary to optimize the temperature during the hybridization. The temperature during the hybridization of the present invention is preferably from 25: to 65, more preferably from 37 "C to 60.
検体中の標的遺伝子とプローブをハイブリダィゼーシヨンさせた後、 標識基質 と DNAポリメラ一ゼを加えて取り込み反応（ミニシークェンス反応） を実施する。 この時、 温度、 反応緩衝液組成などの反応条件の調整を行い、 プローブが八ィ ブリダィゼ一シヨンした時のみ標識基質の取り込みが起こるようにする。 After hybridization of the probe with the target gene in the sample, the labeling substrate and DNA polymerase are added to perform the uptake reaction (mini-sequence reaction). At this time, the reaction conditions such as the temperature and the composition of the reaction buffer are adjusted so that the incorporation of the labeled substrate occurs only when the probe is hybridized.
取り込み反応Uptake reaction
D N Aの取り込み反応 （ミニシークェンス反応） において、 分子運動を高めて 特異性を上げる必要がある場合は、 耐熱性の DNAポリメラーゼを用いて高い反応 温度で行うことが望ましい。 Taq DNAポリメラ一ゼ （パーキンエルマ一社製） を ミニシークェンス反応の DNAポリメラーゼとして使用する場合、 反応温度は好ま しくは 37で〜80でであり、 より好ましくは 50°C〜75°Cである。 If it is necessary to increase the molecular motion in the DNA incorporation reaction (mini-sequence reaction), it is preferable to use a heat-resistant DNA polymerase at a high reaction temperature. When Taq DNA polymerase (PerkinElmer) is used as a DNA polymerase for mini-sequence reaction, the reaction temperature is preferably 37 to 80, more preferably 50 to 75 ° C. .
伸長合成反応を行う際に用いる反応緩衝液は、 通常、 使用する DNAポリメラー ゼの酵素活性が発揮されるように条件を整えた緩衝液を用いれば良い。 しかし As the reaction buffer used for carrying out the extension synthesis reaction, generally, a buffer prepared under conditions so that the enzyme activity of the DNA polymerase used is exhibited may be used. However
DNA ポリメラーゼの酵素活性が強すぎて非特異的取り込み反応が出る場合は、 本 測定法においては最終濃度が 0. 1〜 1. 5M程度になるよう尿素を加えることにより DNA ポリメラーゼの酵素活性を微妙に抑制的にコントロールすることが可能であ る。If the DNA polymerase enzyme activity is too strong and a nonspecific uptake reaction occurs, In the measurement method, the enzymatic activity of DNA polymerase can be controlled subtly by adding urea so that the final concentration is about 0.1 to 1.5M.
Taq DNA ポリメラーゼを伸長合成反応時の DNAポリメラーゼとして使用する場 合は、酵素購入時に添付されてくる反応緩衝液に対して、最終濃度が 0. 5M〜0. 75M になるよう尿素を添加して使用することができる。 When using Taq DNA polymerase as the DNA polymerase for the elongation synthesis reaction, add urea to the reaction buffer supplied when purchasing the enzyme to a final concentration of 0.5M to 0.75M. Can be used.
本発明においては、 ハイブリダィゼーシヨンしたプローブ群の 3 ' 末端から伸 長合成反応 （取り込み反応） を行うので、 変異しないアミノ酸に対応する塩基部 分が全プローブの末端部分に来るように選択して、 第 1に取り込まれる塩基が共 通になるようにすることが好ましい。 本発明の好ましい態様において使用される 配列番号： 3〜23は、 YMDDモチーフ中の変異するアミノ酸 Mのすぐ次の、 変異し ないアミノ酸 Dのコドン （GAT) の第 1ヌクレオチドの Gで終わっているので、 全 てのプローブの 3 ' 末端に最初に付加される塩基は、 第 2ヌクレオチドの Aであ る。 従って、 標識基質は dATPを用い、 標的遺伝子とプローブの 3 ' 末端部分が 2 本鎖を形成していれば、 標識基質である塩基「A」が DNAポリメラ一ゼにより取り 込まれ、 2本鎖になっていなければ、 取り込み反応は理論上起こらない。 In the present invention, an extension synthesis reaction (incorporation reaction) is performed from the 3 'end of the hybridized probe group, so that the base portion corresponding to the unmutated amino acid is located at the end portion of all probes. Then, it is preferable that the first base to be incorporated is common. SEQ ID NOs: 3-23 used in a preferred embodiment of the invention end with a G in the first nucleotide of the codon (GAT) of the unmutated amino acid D, immediately following the mutated amino acid M in the YMDD motif. Thus, the first base added to the 3 'end of all probes is the A of the second nucleotide. Therefore, if dATP is used as the labeling substrate and the target gene and the 3'-terminal portion of the probe form a double strand, the base `` A '', which is the labeling substrate, is incorporated by DNA polymerase, and the double-stranded If not, the incorporation reaction does not occur theoretically.
標識の検出Sign detection
この標識体を特異的に検出する方法としては、 標識体と特異的に結合できる酵 素標識を施した物質を使用して発色法、 発光法、 蛍光法など使用して行う。但し、 蛍光法の場合、 蛍光物質の多くは比較的低分子量であるため塩基に直接標識させ て、 伸長合成反応において直接取り込ませることも可能である。 As a method for specifically detecting the label, a color-forming method, a luminescence method, a fluorescence method, or the like is performed using an enzyme-labeled substance capable of specifically binding to the label. However, in the case of the fluorescence method, since many of the fluorescent substances have relatively low molecular weights, it is also possible to directly label the base and directly incorporate them in the extension synthesis reaction.
標識自体を酵素にする方法も考えられるが、 蛋白質酵素は一般的に高分子であ り、 標識塩基の取り込みの際に立体障害を起こす可能性が高く、 取り込み時の加 熱に際して酵素が失活する可能性も高い為、 標識体は、 分子量が小さく、 比較的 安定且つ、 特異的検出が可能な物質である、 ピオチン、 ジニトロフエニル （DNP)、 ジゴキシゲニン （DIG) などを用いることが望ましい。 Although it is conceivable to use the label itself as an enzyme, protein enzymes are generally macromolecules and are likely to cause steric hindrance when the labeled base is incorporated, and the enzyme is deactivated when heated during incorporation Since it is highly likely that the labeling is performed, it is desirable to use a substance having a small molecular weight, a relatively stable substance that can be specifically detected, such as piotin, dinitrophenyl (DNP), and digoxigenin (DIG).
標識体の検出には、 ピオチンであればアビジンもしくはストレプトアビジン、 DNP、 DIGに対しては各々を認識する抗体に酵素を標識したものを結合させて、 そ の酵素活性を発色法、 発光法、 蛍光法などにより、 吸光度計、 ルミノメータ一、 蛍光光度計にて検出する。For the detection of the labeled substance, for biotin, avidin or streptavidin, and for DNP and DIG, an enzyme-recognized antibody is bound to an antibody that recognizes each, and the enzyme activity is measured by a colorimetric method, a luminescent method, or the like. Absorbance meter, luminometer, Detect with a fluorometer.
標識体の検出を行った結果、 標識体が検出されたゥエルでは、 そのゥエルに固 相化されたプローブの 3 ' 末端付近の配列に対して、 ほぼ相補的な配列を持つ遺 伝子が存在していたと判定される。 標識体が検出されなかったゥエルでは、 その ゥエルに固相化されたプローブとほぼ相補的な配列を持った遺伝子が存在しない 力、 もしくは検出感度以下であると判定される。 また複数の遺伝子型が混在して いる場合は、 複数のゥエルで標識体が検出されることになる。 各型の遺伝子の増 幅前の存在比率は、 増幅後の増幅産物の存在比率に反映されるため、 各ゥ Xルの 検出の強度により対立遺伝子の存在比率の概算も可能である。 As a result of detection of the labeled substance, in the well where the labeled substance was detected, there was a gene having a sequence almost complementary to the sequence near the 3 'end of the probe immobilized in the well. Is determined to have been. If no label is detected in the well, it is determined that the level is such that no gene having a sequence almost complementary to the probe immobilized on the well exists, or the detection sensitivity is lower. If multiple genotypes are mixed, the label will be detected in multiple wells. Since the abundance ratio of each type of gene before amplification is reflected in the abundance ratio of the amplified product after amplification, the abundance ratio of alleles can also be estimated based on the detection intensity of each X-ray.
キットKit
更に、 本発明は、 HBVゲノム遺伝子における YMDDモチーフをコードする遺伝子 上の点変異を検出する方法を使用したキットにも関し、キッ卜の好適例としては、 ( 1 ) HBVゲノム遺伝子の YMDDモチーフをコードする遺伝子の周辺領域の増幅産 物を得るための配列番号： 1のプライマー及び配列番号： 2のプライマーからな る PCR用プライマ一セット、 （2 ) HBVの YMDDモチーフをコードする遺伝子上の 点変異部位に対応する塩基を 3 ' 末端近傍に有する遺伝子プローブ、 好ましくは 配列番号： 5、 配列番号： 20、 及び配列番号： 21 ~23の混合プローブ、 もしくは その各プローブの固相化物、 （3 )二本鎖の増幅産物を一本鎖にするためのアル力 リ変性液、 （ 4 )ハイブリダイゼ一ション反応時に用いるハイブリダイゼーシヨン 緩衝液、 （5 ) DNA ポリメラーゼ、 （6 ) 標識基質を拿有するミニシークェンス用 緩衝液が挙げられる。 Further, the present invention relates to a kit using a method for detecting a point mutation on a gene encoding the YMDD motif in the HBV genomic gene. Preferred examples of the kit include: A set of primers for PCR consisting of the primer of SEQ ID NO: 1 and the primer of SEQ ID NO: 2 for obtaining an amplified product in the peripheral region of the encoding gene, (2) a point on the gene encoding the YMDD motif of HBV A gene probe having a base corresponding to the mutation site near the 3 ′ end, preferably a mixed probe of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 20, and SEQ ID NOS: 21 to 23, or a solid-phased product of each probe; ) A denaturing solution for converting the double-stranded amplification product into a single strand, (4) a hybridization buffer used for the hybridization reaction, and (5) a DNA polymer. Over zero, and a buffer for mini Sequence for 拿有 (6) labeled substrate.
本発明の方法の目的とする遺伝子に対する特異性を評価するため、 本発明で PCR増幅を行う領域を含み且つ、 野生型、 変異型に対応する配列を含む 8種類の 特異性評価用プラスミドを作製し、 これを铸型に PCR増幅を行い、 変性後、 プレ —卜に固相化したプローブにハイブリダィゼーシヨンさせ、 標識基質の取り込み を検出した。 その結果、 野生型の配列を持つ評価用プラスミドは野生型用のプロ 一ブを固相化したゥエルについて、 ノ リン型、 イソロイシン型の変異型の配列を 持つ評価用プラスミドは各々の変異型のプロ一ブを固相化したゥエルについての み標識体の取り込みが検出され、 互いに違う型のプローブが固相されたゥエルに ついては検出されなかった。In order to evaluate the specificity for the target gene of the method of the present invention, eight types of plasmids for specificity evaluation containing a region to be subjected to PCR amplification in the present invention and containing sequences corresponding to wild type and mutant type were prepared. This was subjected to PCR amplification to form III, denatured, hybridized to a probe immobilized on a plate, and the incorporation of the labeled substrate was detected. As a result, the evaluation plasmid having the wild-type sequence was used for the well on which the probe for wild-type was immobilized, and the evaluation plasmid having the mutant-type sequence of norin-type and isoleucine-type was used for each mutant type. Incorporation of the labeled substance was detected only in the gel on which the probe was immobilized. Was not detected.
更に、 各変異型用プラスミドを野生型用プラスミドに対して 「1 /10または 10 倍」 混合させて同様に検出を行った場合、 「1 /10または 10倍」 までについては 両型の検出が可能であった。 Furthermore, when each mutant type plasmid is mixed 1/10 or 10 times with the wild type plasmid and detection is performed in the same manner, detection of both types is possible up to 1/10 or 10 times. It was possible.
これらの結果から、 本発明方法により非常に特異性高く、 目的とする点変異を 検出できることがわかる。 実施例 These results indicate that the method of the present invention can detect a target point mutation with extremely high specificity. Example
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明は下記実施例に限定 されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
〈铸型遺伝子の準備〉 <Preparation of type III gene>
「野生型 HBVのみを含む」 と従来法により確認された血清 10例 （検体番号 1〜 10) 及び、 「逆転写酵素活性中心コード遺伝子に変異を有する変異型 HBVを含む」 と従来法により確認された血清 9例 （検体番号 1 1〜19) の計 19 検体より、 HBV 遺伝子を抽出及び精製した。 10 sera confirmed by the conventional method to contain only wild-type HBV (sample Nos. 1 to 10) and confirmed to contain the mutant HBV having a mutation in the reverse transcriptase activity center encoding gene by the conventional method The HBV gene was extracted and purified from a total of 19 samples from 9 serum samples (sample numbers 11 to 19).
なお、 本明細書における従来法とは、 血清中より HBV遺伝子を抽出， 精製し、 逆転写酵素活性中心コード遺伝子配列周辺を PCR法により増幅後、 その増幅産物 についてダイデォキシ法により塩基配列を決定する方法である。 この方法では、 変異有無の検出までに 2 ~ 3日要する。 The conventional method in this specification means that the HBV gene is extracted and purified from serum, the area around the gene sequence encoding the reverse transcriptase activity center is amplified by PCR, and the nucleotide sequence of the amplified product is determined by the dideoxy method. Is the way. In this method, it takes 2-3 days to detect the presence or absence of the mutation.
く PCR法による遺伝子増幅〉 Gene amplification by PCR method)
プライマーは、 以下の 2種類： There are two types of primers:
センスプライマ一： 5' - AGTGGGCCTC AGNCCGTTTC-3' (配列番号： 1 ) 及び アンチセンスプライマー： 5 ' - AGACTTGGCC CCCAATACCA-3' (配列番号： 2 ) を用いた。 但し、 配列番号： 1の Nは I (イノシン） にて使用することとした。 上記プライマ一を使用して下記組成の遺伝子増幅液 50 i l を調製し、 PCR法に より遺伝子増幅を行った。 Sense primer: 5'-AGTGGGCCTC AGNCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 1) and antisense primer: 5'-AGACTTGGCC CCCAATACCA-3' (SEQ ID NO: 2) were used. However, N in SEQ ID NO: 1 was used for I (inosine). Using the primers described above, 50 l of a gene amplification solution having the following composition was prepared, and the gene was amplified by PCR.
1 O mM トリス塩酸緩衝液 （pH8. 3) 1 O mM Tris-HCl buffer (pH 8.3)
5 O mM 塩化カリウム 5 O mM potassium chloride
1 . 2 5 mM 塩化マグネシウム 1 2 . 5 % グリセロール1.2 5 mM magnesium chloride 12.5% glycerol
2 0 0 /z M dNTP (dATP, dTTP, dCTP及び dGTP ) 200 / zM dNTP (dATP, dTTP, dCTP and dGTP)
0 . 6 0.6
0 . 6 M 0.6 M
2 5 U/ml Taq DNA ポリメラ一ゼ （パーキンエルマ一社製） 2 5 U / ml Taq DNA polymerase (PerkinElmer)
铸型遺伝子 遺 伝 子 type gene
上記溶液をサーマルサイクラ一 PJ-9600 (パーキンエルマ一社製）にセットした PCRの温度条件は 95T:で 2分間の後、 で 15秒— 60 で 20秒のサイクルを 5回、 続いて 90°Cで 15秒— 6(TCで 20秒のサイクルを 65回繰り返して遺伝子増 幅を行った。 その結果、 HBVが陽性の場合は、 124bpの増幅産物が得られた。 The above solution was set on a Thermal Cycler PJ-9600 (PerkinElmer) .The temperature conditions for PCR were 95T: for 2 minutes, then for 15 seconds to 60 seconds for 20 seconds, followed by 5 cycles of 90 °. Gene amplification was carried out by repeating the cycle of 15 seconds at C-6 (20 seconds at TC 65 times. As a result, when HBV was positive, a 124 bp amplification product was obtained.
〈増幅産物の変性〉 <Denaturation of amplification product>
得られた増幅産物 50 /i 1に対して 3Mの水酸化ナトリウム溶液 100 1を加え、 5分間室温で放置し、 増幅産物のアルカリ変性 （2本鎖 DNAを 1本鎖にする） を 行った。 To the obtained amplification product 50 / i1, 3M sodium hydroxide solution 1001 was added and left at room temperature for 5 minutes to perform alkali denaturation of the amplification product (to convert double-stranded DNA to single-stranded). .
〈ハイブリダィゼーシヨン〉 <Hybridization>
次に、 予め、 Next,
第 1ゥエルには、In the 1st Elle,
5' -TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATACGG-3' (配列番号： 5 ) のプローブを、 第 2ゥエルには、 5'-TCCCCCACTG TCTGGCTTTC AGTTATACGG-3 '(SEQ ID NO: 5)
5 ' -TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTIG-3' (配列番号： 20) のプローブを、 そ して 5'-TCCCCCACTG TTTGGCTTTC AGTTACGTIG-3 '(SEQ ID NO: 20)
第 3ゥエルには、In the third el,
5' -CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATAG-3' (配列番号： 21 )、 5'-CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATAG-3 '(SEQ ID NO: 21),
5' - CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATCG-3' (配列番号： 22) 及び 5 '-CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATCG-3' (SEQ ID NO: 22) and
5 ' -CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATTG-3' (配列番号： 23) の 3種類のプローブの混 合物 5'-CACTGTTTGG CTTTCAGTTA TATTG-3 '(SEQ ID NO: 23) Mixture of three types of probes
をそれぞれ固相化した。 即ち、 野生型 （YMDD 型） 検出用ゥエル、 変異型 （YVDD 型）検出用ゥエル、及び変異型（YIDD型）検出用ゥエルの 3ゥエルで 1セット （1 検体） のプローブ固相化ゥエルを用意した。 各ゥエルに、 以下に示す組成のハイ ブリダイゼーション緩衝液を 100^ 1ずつ分注した。Were respectively immobilized. In other words, one set (one sample) of the probe-immobilized probe is provided for the probe for detecting the wild-type (YMDD), the probe for detecting the mutant (YVDD), and the probe for detecting the mutant (YIDD). did. Each well has the composition shown below. The hybridization buffer was dispensed at 100 ^ 1 each.
7. 5 X SSPE 7.5 X SSPE
1. 2 % ポリオキシエチレンソルビ夕ンモノラウレート （Tween20) 0. 0 7 塩酸 1.2% polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween20) 0.07 Hydrochloric acid
次に、 アルカリ変性を行った増幅産物を 25 1ずつ、 上記ハイブリダィゼーシ ョン緩衝液を分注した各ゥエルに添加し、 よく混合した。 Next, 25 1 of the amplification product subjected to alkali denaturation was added to each well into which the above hybridization buffer was dispensed, and mixed well.
混合物を 55°Cで 30分間放置し、 ハイブリダィゼーションを行った。 この反応 により PCR法の段階において仮に非特異の増幅産物として増幅された遺伝子断片 が存在したとしても、 目的とする増幅産物以外は選択的に除かれる。 但し、 目的 とする各型の増幅産物は型別各プローブに対して末端が 1から 2塩基程度の違い であるため、. 程度の差はあれ、 総てのプローブに対してハイブリダィゼーシヨン していると考えられる。 The mixture was left at 55 ° C. for 30 minutes for hybridization. By this reaction, even if a gene fragment amplified as a non-specific amplification product is present at the stage of the PCR method, a gene fragment other than the target amplification product is selectively removed. However, the target amplification product of each type has a difference of about 1 to 2 bases at each end from each type of probe, so hybridization to all probes is somewhat it seems to do.
ハイプリダイゼーション反応終了後、 下記組成の洗浄溶液を使用して 1ゥエル あたり 350/ 1ずつ 5回洗浄を行った。 After the completion of the hybridization reaction, washing was carried out five times at a rate of 350/1 per well using a washing solution having the following composition.
0. 4% 塩化ナトリウム 0.4% sodium chloride
0. 0 1 % 塩化カリウム 0.0 1% potassium chloride
0. 145 % リン酸一水素ニナトリウム 0.145% disodium hydrogen phosphate
0. 0 1 % リン酸二水素一カリウム 0.0 1% monopotassium dihydrogen phosphate
0. 1 % Tween20 0.1% Tween20
0. 00 5 % アジ化ナトリウム 0.005% sodium azide
〈ミニシークェンス反応〉 <Mini-sequence reaction>
洗浄操作終了後、 下記組成のように塩基 Aの標識体であるピオチンを結合させ たピオチン dATPと Taq DNAポリメラ一ゼを添加した溶液 100 1を各ゥエルに 加え、 55 で 30分間、 反応させた。 After the completion of the washing operation, a solution 1001 containing the addition of a biotin dATP to which the base A labeled biotin was bound and Taq DNA polymerase as shown below was added to each well, and reacted at 55 for 30 minutes. .
1 OmM トリス塩酸緩衝液 （PH8.3) 1 OmM Tris-HCl buffer (PH8.3)
5 OmM 塩化カリウム 5 OmM potassium chloride
1. 5m 塩化マグネシウム 1.5m magnesium chloride
0. 0 0 1 ゼラチン 0.0 1 Gelatin
0. 6M 尿素 0 . 0 4. ^ M ピオチン一 dATP0.6 M urea 0. 0 4. ^ M Piotin-dATP
l U/ml Taq DNA ポリメラ一ゼ l U / ml Taq DNA polymerase
〈変性〉 <Denaturation>
反応終了後、 0. 3 の水酸化ナ卜リゥム溶液 100 1を加え、 5分間 室温で放置 し、 前述の洗浄溶液と洗浄条件で洗浄を行った。 この処理により、 固相化プロ一 ブに八イブリダィゼーシヨンした増幅産物は、 プローブより除去され、 固相面に は 1本鎖のプローブのみが残り、 増幅産物の副反応などにより非特異的に取り込 まれたピオチン標識基質が除去される。 After the completion of the reaction, 0.3% sodium hydroxide solution 1001 was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes, and washed with the above-mentioned washing solution and washing conditions. As a result of this treatment, the amplification product that has been lysed on the solid-phased probe is removed from the probe, leaving only a single-stranded probe on the solid-phase surface, and is non-specific due to side reactions of the amplification product. The specifically incorporated biotin-labeled substrate is removed.
〈アビジン一ピオチン複合体の形成〉 <Avidin-Piotin complex formation>
次に、 ペルォキシダ一ゼ標識ストレプトアビジンを 20mM トリスー塩酸緩衝液 (pH7. 5)に 0. 2U/mlの濃度になるように加え、各ゥエルに 100 1ずつ加えて 55^ で 30分間反応させた。ピオチンとストレプトアビジンの特異反応を利用したこの 反応により、' 前述の反応でピオチン標識基質が取り込まれた固相化プローブにぺ ルォキシダーゼが標識される。 反応終了後、 前述の洗浄溶液と洗浄条件で洗浄を 行った。 Next, peroxidase-labeled streptavidin was added to 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) to a concentration of 0.2 U / ml, and 100 1 was added to each well, followed by reaction at 55 ^ for 30 minutes. . By this reaction utilizing a specific reaction between biotin and streptavidin, peroxidase is labeled on the immobilized probe into which the biotin-labeled substrate has been incorporated in the above-mentioned reaction. After the completion of the reaction, washing was performed using the above-described washing solution and washing conditions.
〈発色反応〉 <Color reaction>
洗浄後、 ペルォキシダーゼの発色基質である H202 (過酸化水素） と 3, 3' , 5, 5' - テトラメチルベンジジンを各ゥエルに Ι Οθ ί 1ずつ加え、室温で 15分間発色させ た。 この工程で、ペルォキシダーゼ標識された固相化プローブが存在するゥエル、 つまり固相化プローブと目的とする PCR増幅産物がハイブリダィゼーションし、 且つ、 前述の反応でピオチン標識基質が取り込み反応が起こったゥエルは、 青色 に発色する。 反応終了後、 反応停止液を 100 1ずつ加えて発色反応を停止した。 この操作により、 青色に発色したゥエルは黄色に変色する。 最後に各ゥエルを吸 光度計にて波長 450nmにおける吸光度を測定し検出を行った。After washing, H2 O2 (hydrogen peroxide), a peroxidase chromogenic substrate, and 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine were added to each well, one at a time, and the color was developed at room temperature for 15 minutes. . In this step, the peroxidase-labeled solid-phased probe is present, that is, the solid-phased probe is hybridized with the target PCR amplification product, and the biotin-labeled substrate is incorporated in the above-mentioned reaction, and the reaction occurs. The tank develops a blue color. After the reaction was completed, the reaction was stopped by adding 100 1 of a reaction terminating solution. By this operation, the blue colored tube turns yellow. Finally, each well was detected by measuring the absorbance at a wavelength of 450 nm using an absorptiometer.
〈結果〉 <Result>
1 . 検体番号 1〜10 1. Sample number 1-10
「野生型のみを含む」 と従来法で確認されている検体番号 1〜10については、 本実施例での変異検出の結果においても、 全ての検体でメチォニン型 （ATG) を検 出する第 1ゥエルにのみ発色が観察され、 野生型のみを含むと判定された。 測定された吸光度は以下に示す通りである。 なお、 吸光度値のカットオフ値は 第 1ゥエルは 0.1、第 2ゥエルは 0.3、第 3ゥエルは 0.3とした。括弧内に示す「十」 は陽性を、 そして 「一」 は陰性を示す。Regarding the sample numbers 1 to 10, which were confirmed to contain only the wild type by the conventional method, the results of the mutation detection in this example indicate that the first sample in which methionine type (ATG) was detected in all samples Color development was observed only in Dwell, and it was determined that only wild type was included. The measured absorbance is as shown below. The cutoff value of the absorbance value was 0.1 for the first well, 0.3 for the second well, and 0.3 for the third well. "10" in parentheses indicates positive, and "one" indicates negative.
表 3Table 3
検体 吸光度 （判定） 型判定 in Sample absorbance (Judgment) Type judgment in
番号 第 1ゥエル 笛^) ノ 《 τノ J1レ 9n ノ J_ノレ Number 1st el flute ^) no 《τ no J1le 9n no J_nore
1 3.694(1) 0.113 (-) 0.074 (-) 野生型 1 3.694 (1) 0.113 (-) 0.074 (-) Wild type
2 3.257(f) 0.119(-) 0.145 (-） 野生型2 3.257 (f) 0.119 (-) 0.145 (-) Wild type
3 3.073(f) 0.116 (-） 0.075 (一） 野生型3 3.073 (f) 0.116 (-) 0.075 (one) Wild type
4 3.098 (+) 0.167(-) 0.145 (-) 野生型4 3.098 (+) 0.167 (-) 0.145 (-) Wild type
5 2.358 (1) 0. 136(-) 0.059 (-) 野生型5 2.358 (1) 0.136 (-) 0.059 (-) Wild type
6 3.141 (+) 0. 110(-) 0.068 (-) 野生型6 3.141 (+) 0.110 (-) 0.068 (-) Wild type
7 2.750(1) 0.099 (-) 0.146 (-) 野生型7 2.750 (1) 0.099 (-) 0.146 (-) Wild type
8 3.208(1) 0.117(-) 0.060 (-) 野生型8 3.208 (1) 0.117 (-) 0.060 (-) Wild type
9 3.312(+) 0.155(-) 0.121 (-) 野生型9 3.312 (+) 0.155 (-) 0.121 (-) Wild type
1 0 3.479 (+) 0.137 (-) 0.066 (-） 野生型1 0 3.479 (+) 0.137 (-) 0.066 (-) Wild type
2. 検体番号 11〜192. Specimen number 11-19
「変異型 HBVを含む」と従来法で確認されている検体番号 11〜19については、 本実施例での変異検出の結果においても、 下表の通り全ての検体で従来法で得ら れた結果と同一の型判定結果が得られた。 即ち、 検体がパリン型の変異型遺伝子 を有する場合は第 2ゥエルに発色が観察され、 検体がイソロイシン型の変異型遺 伝子を有する場合は、 第 3ゥエルに発色が観察された。 検体が野生型遺伝子も含 む場合は、 第 1ゥエルにも発色が認められた。 For sample numbers 11 to 19, which were confirmed to contain mutated HBV by the conventional method, all the samples were obtained by the conventional method as shown in the table below in the results of mutation detection in this example. The same type determination result as the result was obtained. That is, when the specimen had a palin-type mutant gene, color development was observed in the second well, and when the specimen had an isoleucine-type mutant gene, color development was observed in the third well. When the sample also contained a wild-type gene, color development was observed in the 1st well.
測定された吸光度は下表に示すとおりである。 The measured absorbance is as shown in the table below.
なお、 吸光度値のカットオフ値は第 1ゥエルは 0.1、 第 2ゥエルは 0.3、 第 3ゥ エルは 0.3とした。 括弧内に示す 「十」 は陽性を、 そして 「一」 は陰性を示す。 検体 吸光度 （判定） 本発明による 従来法による 番号 第 1ゥエル 第 2ゥエル 第 3ゥエ 判定 ― 判定 ― 1 1 L 082 (r 0. 460 (+) ヽThe cutoff value of the absorbance value was 0.1 for the first level, 0.3 for the second level, and 0.3 for the third level. "10" in parentheses indicates positive, and "one" indicates negative. Specimen Absorbance (judgment) No. by the conventional method according to the present invention No. 1st No. 2nd No. 3rd No. J 1 1 L 082 (r 0.460 (+) ヽ
0. 182 (-） 野生型 +変異型（V) 同左 0.182 (-) Wild type + mutant type (V) Same as left
1 I 1. l (+) L 880 (r) l . 166 (+) 野生型 +変異型（V+I) 同左1 I 1. l (+) L 880 (r) l. 166 (+) wild-type + mutant (V + I) Same as left
1 3 0. 059 (- ハ ヽ1 3 0. 059 (-C ヽ
3. o70 (+) l . 122 (+) 変異型 （V+I) 同左 ハ O 1 3. o70 (+) l. 122 (+) mutant (V + I) Same as at left O 1
1 4 3. 149 (+) 0. 301 (†) 0. 097 (-） 野生型 +変異型 (V) 同左 1 4 3.149 (+) 0.301 (†) 0.097 (-) Wild type + mutant (V) Same as left
1 5 3. 318 (1) 0. 750 (f) 0. 174 (-) 野生型 +変異型 （V) 同左1 5 3.318 (1) 0.750 (f) 0.174 (-) Wild type + mutant (V) Same as left
1 6 3. 144 (+) 1. 457 (+) 0. 188 ( -） 野生型 +変異型 （V) 同左1 6 3.144 (+) 1.457 (+) 0.188 (-) Wild type + mutant (V) Same as left
1 7 2. 453 (1) 1. 488 (1) 0. 177 ( -) 野生型 +変異型 （V) 同左1 7 2.453 (1) 1.488 (1) 0.177 (-) Wild type + mutant (V) Same as left
1 8 0. 089 (-） 3. 439 (f) 2. 230 (1) 変異型 （V+I) 同左1 8 0.089 (-) 3.439 (f) 2.230 (1) Mutant (V + I) Same as left
1 9 1. 139 (1) 3. 749 (1) 0. 643 (1) 野生型 +変異型 (V+I) 同左 産業上の利用の可能性1 9 1. 139 (1) 3. 749 (1) 0.64 (1) Wild type + mutant (V + I) Same as on the left Industrial potential
本発明によれば、特定のプライマ一及び、遺伝子プローブを用いることにより、 また特定のプライマー及び、 固相支持体に固相化した特定の遺伝子プローブ、 成 分調製を行い適正化したアルカリ変性液、ハイブリダィゼ一シヨン用緩衝液、 DNA ポリメラ一ゼ、 標識基質を含有するミニシークェンス用緩衝液を含有したキット を用いることにより、 HBV遺伝子上の YMDDモチーフをコードしている遺伝子の点 変異を簡便且つ、 正確に、 また短時間で判定することができる。 このことは、 投 薬時、 特にラミブジン長期継続投与時の投薬効果の判定（モニタリング)、 投与計 画を立てる上で有用である。 According to the present invention, by using a specific primer and a gene probe, a specific primer, a specific gene probe immobilized on a solid support, and an alkali denaturing solution prepared by component preparation and optimized By using a kit containing a hybridization buffer, a DNA polymerase, and a minisequence buffer containing a labeling substrate, point mutation of the gene encoding the YMDD motif on the HBV gene can be easily and easily performed. Can be determined accurately and in a short time. This is useful for judging (monitoring) the effect of medication at the time of administration, especially for long-term continuous administration of lamivudine, and for formulating a dosage plan.