WO1989001941A1 - Chemical process for obtaining labelled oligonucleotides and biological applications - Google Patents

Abstract

The process described is characterized in that activated thymidines are incorporated in the 4 position, in the place of cytidines, in an oligonucleotide sequence during construction, the sequence formed is reacted with a bifunctional compound, and a marker is attached to the function which remains free.

Description

PROCEDE D'OBTENTION PAR VOIE CHIMIQUE D'OLIGONUCLEOTIDES PROCESS FOR THE CHEMICAL PRODUCTION OF OLIGONUCLEOTIDES

MARQUES ET APPLICATIONS BIOLOGIQUES.BIOLOGICAL BRANDS AND APPLICATIONS.

L'invention a pour objet un procédé de synthèse chimique d'oligonucléotides marqués et les applications biologiques de ces oligonucléotides comme sondes froides.The subject of the invention is a process for the chemical synthesis of labeled oligonucleotides and the biological applications of these oligonucleotides as cold probes.

Elle vise plus spécialement la synthèse de fragments d'ADN, complémentaires de fragments d'ADN ou d'ARN de séquences connues, utilisables commme sondes d'hybridation, Pendant de nombreuses années, on a utilisé, pour la détection de séquences de gènes, des sondes marquées avec des radioisotopes, appelées sondes chaudes. Or si l'autoradiographie constitue une méthode assez sensible, cette technique s'avère longue, coûteuse et présente les défauts et les risques liés à la manipulation de produits radioactifs.It relates more specifically to the synthesis of DNA fragments, complementary to DNA or RNA fragments of known sequences, usable as hybridization probes. For many years, we have used, for the detection of gene sequences, probes marked with radioisotopes, called hot probes. However, if autoradiography is a fairly sensitive method, this technique proves to be long, expensive and presents the defects and risks associated with the handling of radioactive products.

Au cours de ces cinq dernières années, on a vu se développer un intérêt croissant pour la recherche de méthodes de détection de séquences d'acides nucléiques mettant en jeu des sondes, dites sondes froides, ne comportant pas d'éléments radioactifs.Over the past five years, there has been a growing interest in the search for methods of detecting nucleic acid sequences involving probes, called cold probes, which do not contain radioactive elements.

Ainsi, plusieurs kits de marquage enzymatique des sondes oligonucléotidiques par des nucléotides triphosphates biotinylés sont déjà commercialisés. La détection de telles sondes biotinylées se fait par des systèmes enzymatiques, tels que la peroxidase, la phosphatase alcaline, ou la galactosidase, ou des systèmes colorimétriques par fluorescence ou chimioluminescence, couplés à de la streptavidine, protéine de très forte affinité pour la biotine.Thus, several kits for the enzymatic labeling of oligonucleotide probes with biotinylated triphosphate nucleotides are already marketed. The detection of such biotinylated probes is done by enzymatic systems, such as peroxidase, alkaline phosphatase, or galactosidase, or colorimetric systems by fluorescence or chemiluminescence, coupled to streptavidin, protein of very high affinity for biotin.

On conçoit l'intérêt de disposer, pour assurer des détections de grande sensibilité, de sondes de compositions définies, marquées de manière contrôlée, en des sites déterminés. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amenés à développer une stratégie permettant d'améliorer la synthèse de sondes froides. Cette stratégie est basée sur l'incorporation, au cours de la construction de la séquence oligonucléotidique, de nucléosides modifiés, à la place des bases classiques dans la séquence. Les bases modifiées permettent alors d'introduire des chaînes de substitution sur lesquelles seront fixés les marqueurs, tout en gardant les mêmes possibilités de liaison hydrogène que les bases usuelles.It is understandable the advantage of having, for ensuring high sensitivity detections, probes of defined compositions, marked in a controlled manner, at determined sites. The inventors' work in this area have led to the development of a strategy to improve the synthesis of cold probes. This strategy is based on the incorporation, during the construction of the oligonucleotide sequence, of modified nucleosides, in place of the conventional bases in the sequence. The modified bases then make it possible to introduce substitution chains on which the markers will be fixed, while retaining the same possibilities of hydrogen bonding as the usual bases.

L'invention a donc pour but de fournir un procédé d'obtention d'oligonucléotides par synthèse chimique, permettant l'incorporation de motifs marqués en un ou plusieurs sites et ce, de façon déterminée.The object of the invention is therefore to provide a process for obtaining oligonucleotides by chemical synthesis, allowing the incorporation of labeled motifs at one or more sites and this, in a determined manner.

Dans la description et dans les revendications, les motifs de la séquence faisant l'objet du procédé de synthèse seront identifiés en désignant leur base.In the description and in the claims, the motifs of the sequence which is the subject of the synthesis process will be identified by designating their base.

Ces motifs peuvent être aussi bien des nucléosides que des nucléotides, et comporter comme sucre un ribose et/ou un déoxy-2 ribose.These motifs can be both nucleosides and nucleotides, and may include ribose and / or 2-deoxy-ribose as sugar.

D'une manière générale, il est fait référence à la synthèse d'oligodésoxynucléotides mais il va de soi que le procédé de l'invention couvre également la synthèse des oligoribonucléotides correspondants.In general, reference is made to the synthesis of oligodeoxynucleotides but it goes without saying that the process of the invention also covers the synthesis of the corresponding oligoribonucleotides.

Le procédé de synthèse par voie chimique selon l'invention est caractérisé par les étapes suivantes : - on incorpore, lors de la synthèse chimique en phase solide de la séquence oligonucléotidique à construire, à la place d'une ou plusieurs cytosines prévues sur la séquence, respectivement une ou plusieurs thymines dont la position 4 est substituée par un groupe activateur, on fait réagir la séquence oligonucléotidique construite avec un composé de formule R-A-R' dans laquelle R et R', sont identiques et représentent un groupe -NH₂, -SH ou -OH, ou R et R' sont différents, l'un représentant un groupe -NH₂, SH ou -OH, l'autre un groupe -NH-X, S-X ou -O-X, dans lequel X est un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule ; etThe chemical synthesis method according to the invention is characterized by the following stages: - during the solid phase chemical synthesis of the oligonucleotide sequence to be constructed, there is incorporated in the place of one or more cytosines provided on the sequence , respectively one or more thymines whose position 4 is substituted by an activating group, the oligonucleotide sequence constructed is reacted with a compound of formula RAR 'in which R and R', are identical and represent a group -NH₂ , -SH or -OH, or R and R 'are different, one representing a group -NH₂ , SH or -OH, the other one group -NH-X, SX or -OX, in which X is a group capable of serving as a marker for the molecule; and

A représente une chaîne alcoyle de 4 à 20 atomes de carbone environ, comportant le cas échéant des hétéroatomes, tels que 0, N ou S ; ce qui conduit à l'obtention de méthyl-5-cytosine(s) avec une chaîne de substitution en position 4, à la place de la ou des thymines activées, et lorsque le composé R-A-R' ne renferme pas de groupe marqueur, on introduit un groupement marqueur sur la chaîne de substitution des méthyl-cytosines.A represents an alkyl chain of approximately 4 to 20 carbon atoms, optionally comprising heteroatoms, such as 0, N or S; which leads to obtaining methyl-5-cytosine (s) with a substitution chain in position 4, instead of the activated thymine (s), and when the compound RAR 'does not contain a marker group, the following are introduced a marker group on the methyl-cytosine substitution chain.

On observera que le remplacement d'une cytidine par une thymidine activée permet de mettre en place, dans la séquence en construction, le motif destiné à être marqué. Les produits obtenus sont donc parfaite- ment définis en ce qui concerne leur structure et leurs substitutions et ce, contrairement aux oligonucléotides marqués obtenus par les synthèses enzymatiques classiques dans lesquels les nucléotides sont incorporés de façon non contrôlable à partir d'un primer. De plus, le motif incorporé peut être substitué avec une grande souplesse par des chaînes de structures variées, ce qui permet de fixer divers marqueurs et d'obtenir à partir d'une seule séquence activée plusieurs sondes comportant des chaînes différentes ou des marqueurs différents.It will be observed that the replacement of a cytidine by an activated thymidine makes it possible to set up, in the sequence under construction, the motif intended to be labeled. The products obtained are therefore perfectly defined with regard to their structure and their substitutions, unlike the labeled oligonucleotides obtained by conventional enzymatic syntheses in which the nucleotides are incorporated in a non-controllable manner from a primer. In addition, the incorporated motif can be substituted with great flexibility by chains of varied structures, which makes it possible to fix various markers and to obtain from a single activated sequence several probes comprising different chains or different markers.

Le procédé de synthèse selon l'invention présente également l'intérêt de conduire à des oligonucléotides dans lesquels les extrémités 5' OH et 3' OH restent libres. Il est ainsi possible, par exemple, de les insérer dans des vecteurs biologiques.The synthesis method according to the invention also has the advantage of leading to oligonucleotides in which the 5 'OH and 3' OH ends remain free. It is thus possible, for example, to insert them into biological vectors.

Un autre avantage de ce procédé réside dans la possibilité de son automatisation permettant une construction rapide, à faible coût, de grandes quantités de fragments d'ADN. L'étape d'incorporation des motifs thymine activés en position 4 est effectuée au cours de la construction de la séquence oligonucléotidique. Cette séquence est construite en couplant successivement, à partir d'un premier nucléotide, ou nucléoside, fixé sur un support solide, les motifs de la séquence recherchée et en remplaçant, comme souhaité, un motif cytosine par un motif thymine activé en position 4.Another advantage of this process lies in the possibility of its automation allowing rapid construction, at low cost, of large quantities of DNA fragments. The step of incorporating thymine motifs activated at position 4 is carried out during the construction of the oligonucleotide sequence. This sequence is constructed by successively coupling, from a first nucleotide, or nucleoside, attached to a solid support, the motifs of the sequence sought and by replacing, as desired, a cytosine motif with a thymine motif activated in position 4.

L'expression "support solide" recouvre tout support qui peut rester insoluble dans au moins un milieu déterminé susceptible de contenir des acides nucléiques en solution. De nombreux supports peuvent être utilisés. Il s'agit par exemple de polymères organiques de silice ou de billes de verre. Ces supports sont avantageusement traités au préalable (fonctionnalisation) afin de leur conférer des groupements fonctionnels susceptibles d'être mis en jeu dans une réaction de fixation d'une molécule distincte, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras. Des supports de ce type sont disponibles dans le commerce. Il s'agit par exemple des gels de type polyâcrylmorpholide, par exemple ceux commercialisés sous la désignation "ENZACRYL K-2". On citera également les polyacrylamides, polystyrènes ou cellulose.The expression "solid support" covers any support which may remain insoluble in at least one specific medium capable of containing nucleic acids in solution. Many supports can be used. These are, for example, organic polymers of silica or glass beads. These supports are advantageously treated beforehand (functionalization) in order to give them functional groups capable of being brought into play in a reaction for fixing a separate molecule, either directly or via an arm. Such supports are commercially available. These are, for example, polyacrylmorpholide type gels, for example those sold under the designation "ENZACRYL K-2". Polyacrylamides, polystyrenes or cellulose will also be mentioned.

Le couplage des nucléosides, ou des nucléotides, est effectué motif par motif, ou par groupes de nucléotides. Pour la constitution de la séquence, on a avantageusement recours aux méthodes connues d'allongement de chaînes de nucléotides en phase solide, en particulier les méthodes dites aux phosphotriesters ou aux phophoramidites. Des techniques de ce type sont décrites par exemple dans les références bibliographiques (1) à (6), données en fin de description. La condensation est effectuée en présence d'un agent de couplage, de préférence utilisé en excès. L'étude des rendements de couplage montre que la condensation de motifs thymidine activés ne s'accompagne pas d'une baisse sigificative de ces derniers. L'activation de la position 4 de la thymine comprend la fixation, sur ce sommet, d'un dérivé hétérocyclique du type triazole, nitro-triazole ou tétrazole, imidazole. Un groupe activateur préféré, permettant de disposer aisément d'une thymine activée comme souhaité, est constitué par le groupe 1,2,4-triazolyle. Sa fixation sur la thymine est réalisée en opérant, par exemple, selon l'une des techiques décrites dans (7), (8) ou (9).The coupling of nucleosides, or nucleotides, is carried out pattern by pattern, or by groups of nucleotides. For the constitution of the sequence, use is advantageously made of known methods of extending nucleotide chains in solid phase, in particular the so-called phosphotriesters or phophoramidite methods. Techniques of this type are described for example in the bibliographical references (1) to (6), given at the end of the description. The condensation is carried out in the presence of a coupling agent, preferably used in excess. The study of coupling yields shows that the condensation of activated thymidine units is not accompanied by a significant drop in the latter. The activation of position 4 of the thymine comprises the fixing, on this vertex, of a heterocyclic derivative of the triazole, nitro-triazole or tetrazole, imidazole type. A preferred activating group, which makes it easy to have an activated thymine as desired, consists of the 1,2,4-triazolyl group. Its fixation on thymine is carried out by operating, for example, according to one of the techniques described in (7), (8) or (9).

D ' autres modes d'activation du sommet 4 des thymines peuvent être utilisés, par exemple à l'aide d'un chlorure d'acide, selon les techniques décrites dans (10) et (11).Other modes of activation of the top 4 of the thymines can be used, for example using an acid chloride, according to the techniques described in (10) and (11).

Dans la deuxième étape du procédé de l'invention, on fait réagir la séquence oligonucléotidique synthétisée, qui renferme, au(x) site(s) souhaité(s), un motif thymine activé, avec un composé de formule R-A-R'. On utilise avantageusement un composé bifonctionnel tel qu'un diaminoalcane, un glycol ou un α, ω-aminoalcool. Des diaminoalcanes appropriés comprennent l'éthylène-diamine, le diamino 1-6 hexane, le diamino 1-10 décane ou la spermine.In the second step of the process of the invention, the synthesized oligonucleotide sequence, which contains, at the desired site (s), an activated thymine motif, is reacted with a compound of formula R-A-R '. Advantageously, a bifunctional compound such as a diaminoalkane, a glycol or an α, ω-aminoalcohol is used. Suitable diaminoalkanes include ethylene diamine, diamino 1-6 hexane, diamino 1-10 decane or spermine.

La substitution des thymines activées par un diaminoalcane est réalisée dans un solvant organique tel que la pyridine, de préférence avec un excès d'aminé.The substitution of activated thymines with a diaminoalkane is carried out in an organic solvent such as pyridine, preferably with an excess of amine.

Les séquences oligonucléotidiques obtenues, renfermant les motifs méthyl-cytosine substitués sont décrochées du support sur lequel elles étaient fixées durant leur construction et sont débloquées. On utilise avantageusement les méthodes classiques d'élimination des groupes protecteurs des bases et des phosphates mises en oeuvre en synthèse en phase solide.The oligonucleotide sequences obtained, containing the substituted methyl-cytosine units are unhooked from the support on which they were fixed during their construction and are unlocked. Advantageously, conventional methods of elimination are used protecting groups for bases and for phosphates used in solid phase synthesis.

Les groupes phosphates sont plus spécialement débloqués en utilisant par exemple du TMGPAO, puis de l'ammoniaque concentré. En opérant à température ambiante, on laisse agir le TMGPAO durant environ 14 heures. L'action de l'ammoniaque concentrée est réalisée avantageusement à une température supérieure à l'ambiante, de préférence de l'ordre de 50ºC durant 2 à 7 heures environ, notamment 5 heures environ.The phosphate groups are more specifically unblocked using for example TMGPAO, then concentrated ammonia. Operating at room temperature, the TMGPAO is left to act for approximately 14 hours. The action of concentrated ammonia is advantageously carried out at a temperature above ambient, preferably of the order of 50 ° C. for approximately 2 to 7 hours, in particular approximately 5 hours.

Les fragments d'ADN sont ensuite purifiés par passage sur une ou plusieurs colonnes échangeuses d'ions, puis déprotégés, par exemple à l'aide d'acide acétique et, de préférence, à nouveau purifiés. Lorsque la chaîne de substitution ne comporte pas de groupe marqueur, on fait réagir la séquence oligonucléotidique, comportant le ou les motifs méthylcytosine substitués par une chaîne en position 4, avec un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule.The DNA fragments are then purified by passage through one or more ion exchange columns, then deprotected, for example using acetic acid and, preferably, again purified. When the substitution chain does not contain a marker group, the oligonucleotide sequence, comprising the methylcytosine motif (s) substituted by a chain in position 4, is reacted with a group capable of serving as a marker for the molecule.

Parmi les groupes habituellement utilisés, on citera les peptides, les haptènes, des groupement colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, le fluorescéine ou le dansyl, ou encore des enzymes telles que la phosphatase ou la peroxydase.Among the groups usually used, mention will be made of peptides, haptens, colored or fluorescent groups such as rhodamine, fluorescein or dansyl, or even enzymes such as phosphatase or peroxidase.

Des marqueurs préférés sont constitués par des peptides, et sont couplés avec des oligonucléotides comportant des chaînes de substitution à terminaison amino. La biotine est plus spécialement utilisée sous forme activée, par exemple sous forme d'ester de biotinyl-N-hydroxysuccinimide.Preferred markers are constituted by peptides, and are coupled with oligonucleotides comprising amino-terminated substitution chains. Biotin is more especially used in activated form, for example in the form of a biotinyl-N-hydroxysuccinimide ester.

La biotinylation des oligonucléotides aminés est réalisée, de préférence, en soumettant ces oligonucléotides, en milieu basique, à l'action de la biotine sous fαrme activée, dans un solvant organique du type DMF.The biotinylation of amino oligonucleotides is preferably carried out by subjecting these oligonucleotides, in basic medium, to the action of biotin under activated form, in an organic solvent of the DMF type.

Les oligonucléotides sont ainsi plus spécialement en solution dans un tampon de pH de 8 à 10 environ, de préférence de 9.The oligonucleotides are thus more especially in solution in a buffer of pH from 8 to 10 approximately, preferably 9.

La réaction est réalisée avantageusement avec un excès de biotine activée.The reaction is advantageously carried out with an excess of activated biotin.

La concentration en oligonucléotide est dans un rapport de 10^-3/1 environ par rapport à celle de la biotine activée. La température de la réaction ne dépasse pas l'ambiante et peut varier d'environ 0ºC à 25ºC. des résultats satisfaisants sont obtenus en maintenant le mélange réactionnel de 3 à 8 heures, de préférence environ 6 heures, à une température voisine de l'ambiante, puis de 8 à 20 heures, de préférence environ de 12 à 14 heures à une température voisine de 0ºC.The oligonucleotide concentration is in a ratio of approximately 10^-3 / 1 relative to that of the activated biotin. The reaction temperature does not exceed the ambient and can vary from approximately 0ºC to 25ºC. satisfactory results are obtained by maintaining the reaction mixture for 3 to 8 hours, preferably approximately 6 hours, at a temperature close to ambient, then from 8 to 20 hours, preferably approximately from 12 to 14 hours at a temperature close to from 0ºC.

Les fragments d'ADN marqués obtenus selon l'invention sont purifiés en vue de leurs applications biologiques.The labeled DNA fragments obtained according to the invention are purified for their biological applications.

L'élimination des sels formés lors de la synthèse est avantageusement réalisée à l'aide d'une ou plusieurs colonnes de résines échangeuse d'ions ou de Séphadex ou Biogel.The elimination of the salts formed during the synthesis is advantageously carried out using one or more columns of ion exchange resins or of Sephadex or Biogel.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent relatifs à la préparation de sondes d'ADN biotinylées utilisées pour la détection du gène clone de l'antithrombine III.Other characteristics and advantages of the invention are given in the examples which follow relating to the preparation of biotinylated DNA probes used for the detection of the cloned antithrombin III gene.

Les abréviations utilisées dans les exemples présentent les significations suivantes : tT : 2'-désoxythymidine substituée par un groupe 1,2,4-triazole en position 4,The abbreviations used in the examples have the following meanings: tT: 2'-deoxythymidine substituted by a 1,2,4-triazole group in position 4,

DMTr : diméthoxytrityle,DMTr: dimethoxytrityl,

^DMTrT : thymidine protégée en 5' par un groupe

diméthoxytrityle et substituée en 3' par un groupe de formule

TPSNT : triisopropyl -2,4,6 benzène sulfonyl nitro-3 triazole -1,2,4, TMGPAO : pyridine-aldoximate-tétraméthyl guanidine DCCI : dicyclohexyl carbodiimide DCU : dicyclohexyl urée BNHS : biotinyl N hydroxysuccinimide TEAB : bicarbonate de triéthyl ammnonium Exemple 1 :^DMTr T: thymidine protected in 5 'by a group

dimethoxytrityl and substituted in 3 'with a group of formula

TPSNT: triisopropyl -2,4,6 benzene sulfonyl-3-nitro triazole -1,2,4, TMGPAO: pyridine-aldoximate-tetramethyl guanidine DCCI: dicyclohexyl carbodiimide DCU: dicyclohexyl urea BNHS: biotinyl N hydroxysuccinimide TEAB: triethyl bicarbonate 1:

Synthèse de sondes biotinylees complémentaires d'un fragment d'ADN-c de l'antithrombine III humaine (ou AT III).Synthesis of biotinylated probes complementary to a cDNA fragment of human antithrombin III (or AT III).

Des expériences précédentes des inventeurs ont permis d'isoler, à l'aide de sondes marquées enzymatiquement en 5' au³²P, de l'ADN-c de l'AT III inséré dans des plasmides.Previous experiments of the inventors have made it possible to isolate, using probes labeled enzymatically in 5 ′ with³² P, c-DNA of AT III inserted in plasmids.

Ces ADN-c ont été séquences et la séquence de l'ARN-m correspondant à été décrite. Connaissant cette séquence, les trois sondes biotinylees suivantes ont été synthétisées manuellement, en phase solide, par la méthode au phosphotriester :These cDNAs have been sequenced and the corresponding mRNA sequence has been described. Knowing this sequence, the following three biotinylated probes were synthesized manually, in solid phase, by the phosphotriester method:

sonde 1^3'TAC TAC ATG GTC CTT C*(B)₅, (5'Biot) sonde 2^3'TAC TAC*(B) ATG GTC CTT C_5' (3'Biot) sonde 3^3'TAC TAC*(B) ATG GTC CTT C* (B)₅' (5',3' Biot)probe 1^{3 '} TAC TAC ATG GTC CTT C * (B)₅ , (5'Biot) probe 2^3' TAC TAC * (B) ATG GTC CTT C_{5 '} (3'Biot) probe 3^3' TAC TAC * ( B) ATG GTC CTT C * (B)₅ '(5', 3 'Biot)

C* = 5 méthyl, 2'-déoxycytidine ;C * = 5 methyl, 2'-deoxycytidine;

Biot = biotinyle ; B = (NH -(CH₂)₁₀-NH-Biot) en position 4 de C*Biot = biotinyl; B = (NH - (CH₂ )₁₀ -NH-Biot) in position 4 of C *

Cette synthèse comprend trois étapes :This synthesis includes three stages:

1) La synthèse chimique d'une séquence d'ADN triazolée,1) Chemical synthesis of a triazole DNA sequence,

2) la substitution des groupements 1,2,4-triazolyl des T pas de la décanediamine, 3) la biotinylation des séquences d'ADN aminées.2) the substitution of the 1,2,4-triazolyl groups of T not of decanediamine, 3) biotinylation of amino DNA sequences.

Ces étapes sont réalisées comme suit pour synthétiser la sonde 1 :These steps are carried out as follows to synthesize the probe 1:

1) Synthèse chimique d'une séquences d'ADN triazolée :1) Chemical synthesis of a triazole DNA sequence:

On utilise comme support une résine du type polyacrylamide telle que celle commercialisée sous la marque Enzacryl K₂ dont le taux de substitution en thymidine est de 130 μmoles par gramme de support.A polyacrylamide type resin such as that sold under the brand Enzacryl K₂ is used as support, the thymidine substitution rate being 130 μmol per gram of support.

Le taux de substitution du support, c'est-à-dire la quantité du premier nucleoside fixé au support, est évalué par dosage en UV à 507 nm du cation DMT libéré par traitement acide (acide benzène sulfonique à 2 %) dans un mélange CH₂Cl₂/CH₃OH : 70-30.The rate of substitution of the support, that is to say the quantity of the first nucleoside attached to the support, is evaluated by assaying in UV at 507 nm of the DMT cation released by acid treatment (2% benzene sulfonic acid) in a mixture. CH₂ Cl₂ / CH₃ OH: 70-30.

. Synthèse des motifs^tT selon le schéma 1 :. Synthesis of the patterns^t T according to diagram 1:

Schéma 1Diagram 1

4g de thymidine entièrement protégée^DMTrT

(5,07 mmoles) sont coévaporés dans la pyridine avec 1,4g (20,3 mmoles) de 1,2,4-triazole.

4g of fully protected thymidine^DMTr T

(5.07 mmol) are coevaporated in pyridine with 1.4 g (20.3 mmol) of 1,2,4-triazole.

Le résidu est dissous dans 25 ml de pyridine distillée et le ballon est placé dans un bain de glace. 2,5g (10,14 mmoles) d'o-chlorophényl phosphodi- chloridate sont ajoutés et le milieu reactionnel est soumis à agitation pendant 10 minutes à 0ºC, puis 48 heures à température ambiante.The residue is dissolved in 25 ml of distilled pyridine and the flask is placed in an ice bath. 2.5 g (10.14 mmol) of o-chlorophenyl phosphodichloridate are added and the reaction medium is stirred for 10 minutes at 0 ° C, then 48 hours at room temperature.

Après évaporation à sec, le résidu est repris par du CH₂Cl₂, lavé au NaHCO₃ concentré, rincé à 1'H20 jusqu'à pH neutre, séché sur Na₂SO₄, filtré puis évaporé.After evaporation to dryness, the residue is taken up in CH₂ Cl₂ , washed with concentrated NaHCO₃ , rinsed with H2O until neutral pH, dried over Na₂ SO₄ , filtered and then evaporated.

Le produit est dissous dans un minimum de CH₂Cl₂ et reprécipité trois fois dans l'éther de pétrole. Après plusieurs purifications sur colonnes de silice et sur colonne de Séphadex LH2O^R, on obtient 1,7g de^DMTr(t)T (Rdt = 40 %)

The product is dissolved in a minimum of CH₂ Cl₂ and reprecipitated three times in petroleum ether. After several purifications on silica columns and on a Sephadex LH2O^R column, 1.7 g of^{DMTr (t)} T are obtained (yield = 40%)

Chromatographie en couche mince (CH₂Cl₂, MeOH:95-5) Rf = 0,48. . Synthèse de la séquence d'ADN triazolée : 120 mg de support^DMTrT soit 15,5 μmoles sont

détritylés par de l'acide benzène sulfonique (ABS) à 2Thin layer chromatography (CH₂ Cl₂ , MeOH: 95-5) Rf = 0.48. . Synthesis of the triazole DNA sequence: 120 mg of^DMTr T support, ie 15.5 μmoles are

detritylated with benzene sulfonic acid (ABS) at 2

%. Le nucleoside^DMTrCA (6 éq) est âecyanoéthylé

par un mélange de triéthylamine-pyridine-H₂O:1-3-1 (TPE) pendant 20 minutes, puis activé par 18 éq. de TPSNT et couplé sur la fonction 5'OH de la thymidine fixée sur le support.%. The nucleoside^DMTr CA (6 eq) is âecyanoethylated

with a mixture of triethylamine-pyridine-H₂ O: 1-3-1 (TPE) for 20 minutes, then activated with 18 eq. of TPSNT and coupled to the 5'OH function of the thymidine attached to the support.

Le rendement du couplage a été évalué par dosage en UV à 507 nm du cation DMT libéré par traitement avec l'acide benzène sulfonique. Il est de 100 % pour ce premier couplage.The coupling yield was evaluated by UV dosage at 507 nm of the DMT cation released by treatment with benzene sulfonic acid. It is 100% for this first coupling.

Les rendements des couplages des nucléosides suivants sont : DMTrCAT (59 % ) ; DMTrGTA (65 % ) ; DMTrCTG (86 %) ; DMTrTTC (93 %) .The yields of the following nucleoside couplings are: DMTrCAT (59%); DMTrGTA (65%); DMTrCTG (86%); DMTrTTC (93%).

2) Substitution des groupements 1,2,4 triazolyl des^tT présentes dans les séquences par de la décanediamine selon le schéma 2 suivant :2) Substitution of the 1,2,4 triazolyl groups of the^t Ts present in the sequences with decanediamine according to scheme 2 below:

schéma 2diagram 2

61 mg de résine (7,9 μmoles) sont mis en suspension dans 610 μl (10 éq) d'une solution 120 mM de décanediamine dans la pyridine.61 mg of resin (7.9 μmoles) are suspended in 610 μl (10 eq) of a 120 mM solution of decanediamine in pyridine.

Le milieu reactionnel est conservé à température ambiante pendant au moins 2 jours. La résine est alors essorée puis rincée à la pyridine pour éliminer toute trace de diamine restante.The reaction medium is stored at room temperature for at least 2 days. The resin is then wrung and then rinsed with pyridine to remove any trace of remaining diamine.

Les séquences aminées sont alors décrochées du support et débloquées par les méthodes classiques utilisées en synthèse en phase solide. Les oligonucléotides sont débloqués par addition de 1,1 ml (1,1 mmoles) d'une solution de TMGPAO 1 M dans un mélange eau-dioxane : 1/1. On utilise 10 éq. de TMGPAO par phosphate à débloquer ; soit pour la séquence d'ADN ci-dessus 150 éq. de TMGPAO 1 M. Après une nuit à température ambiante, le milieu reactionnel est évaporé à sec.The amino sequences are then detached from the support and released by the conventional methods used in solid phase synthesis. The oligonucleotides are released by adding 1.1 ml (1.1 mmol) of a solution of 1 M TMGPAO in a water-dioxane mixture: 1/1. We use 10 eq. of TMGPAO by unlockable phosphate; or for the DNA sequence above 150 eq. of TMGPAO 1 M. After overnight at room temperature, the reaction medium is evaporated to dryness.

On ajoute 3 ml d'ammoniaque concentrée (20 % ) et l'on chauffe à 50ºC pendant 5 heures.3 ml of concentrated ammonia (20%) are added and the mixture is heated at 50 ° C for 5 hours.

La résine est alors filtrée, rincée et le jus est concentré puis déposé sur une colonne de résine Dowex NH₄^+® éluée avec H₂O. Le produit est lyophilisé, puis purifié au stade DMTr par HPLC sur une colonne Nucléosil^® préparative avec un gradient de 5 à 25 % ou de 5 à 50 % d'acétonitrile dans un tampon d'acétate de triéthyl ammonium 10 M en 20 minutes.The resin is then filtered, rinsed and the juice is concentrated and then deposited on a column of Dowex NH₄^{+ ®} resin eluted with H₂ O. The product is lyophilized, then purified at the DMTr stage by HPLC on a preparative Nucleosil^® column with a gradient from 5 to 25% or from 5 to 50% acetonitrile in a buffer of 10 M triethyl ammonium acetate in 20 minutes.

Les séquences sont détritylées dans de l'acide acétique à 80 % dans H₂O pendant 20 minutes à température ambiante. L'acide est alors évaporé puis entraîné par 2 ou 3 coévaporations au toluène.The sequences are detritylated in 80% acetic acid in H₂ O for 20 minutes at room temperature. The acid is then evaporated and then entrained by 2 or 3 co-evaporations with toluene.

Le résidu est dissous dans H₂O, lavé à l'éther éthylique puis concentré.The residue is dissolved in H₂ O, washed with ethyl ether and then concentrated.

Les produits, entièrement déprotégés, sont à nouveau purifiés par HPLC sur une colonne Nucléosil^® préparative, puis vérifiés sur une colonne Nucléosil^® analytique.The products, completely deprotected, are again purified by HPLC on a preparative Nucleosil^® column, then checked on a Nucleosil^® column analytic.

3) Biotinylation des séquences d'ADN aminées : Synthèse de l'ester de biotinyl , N-hydroxysuccinimide : (B.N.H.S.)3) Biotinylation of amino DNA sequences: Synthesis of the biotinyl ester, N-hydroxysuccinimide: (B.N.H.S.)

Le protocole utilisé a été décrit par BAYER et WILCHEK dans Methods in Enzymol. (1974), 34, 265-7. A une solution de 250 mg de biotine (1 mmole) dans 3 ml deThe protocol used has been described by BAYER and WILCHEK in Methods in Enzymol. (1974), 34, 265-7. To a solution of 250 mg of biotin (1 mmol) in 3 ml of

DMF passé sur alumine sont ajoutés 150 mg (1,3 éq.) deDMF passed on alumina are added 150 mg (1.3 eq.) Of

N-hydroxysuccinimide et 412 mg (2 éq.) de DCCI.N-hydroxysuccinimide and 412 mg (2 eq.) Of DCCI.

Le milieu reactionnel se présente sous forme d'une suspension blanche qui est chauffée une demi-heure à 50ºC puis gardée 20 heures sous agitation à température ambiante.The reaction medium is in the form of a white suspension which is heated for half an hour at 50 ° C. and then kept for 20 hours with stirring at room temperature.

Le précipité de dicyclohexyl urée formé est filtré et le filtrat est entreposé environ 14 heures à 0ºC. La partie insoluble de DCU formée est ensuite filtrée et le filtrat est concentré . Le BNHS est recristallisé dans un grand volume d'isopropanol.The precipitate of dicyclohexyl urea formed is filtered and the filtrate is stored for approximately 14 hours at 0 ° C. The insoluble part of DCU formed is then filtered and the filtrate is concentrated. BNHS is recrystallized from a large volume of isopropanol.

271 mg de produit sont obtenus, soit un rendement d'estérification de 77,6 % . . Biotinylation des sondes aminées selon le schéma 3 suivant :271 mg of product are obtained, ie an esterification yield of 77.6%. . Biotinylation of the amino probes according to the following scheme 3:

1 DO de sonde aminée est disssoute dans un mélange de 200 μl d'H₂O et de 100 μl de tampon NaHCO₃ pH1 DO of amino probe is dissolved in a mixture of 200 μl of H₂ O and 100 μl of NaHCO₃ pH buffer

9. 1 mg (2,93 μmoles) d'ester de biotinyl, N-hydroxysuccinimide sont ajoutés dans 40 μl de DMF. Après 6 heures à température ambiante et une nuit à 0ºC, le DMF est évaporé et le produit est déposé sur une colonne de9. 1 mg (2.93 μmol) of biotinyl ester, N-hydroxysuccinimide are added to 40 μl of DMF. After 6 hours at room temperature and overnight at 0ºC, the DMF is evaporated and the product is placed on a column of

Séphadex G10^® éluée avec un tampon de TEAB 0,05 M.Sephadex G10^® eluted with a 0.05 M TEAB buffer.

Les sondas sont ensuite purifiées par HPLC sur colonne Nucléosil^® analytique ou préparative.The probes are then purified by HPLC on an analytical or preparative Nucleosil^® column.

En fin de purification, les oligonucléotides sont échangea sous forme ammonium sur une colonne DowexAt the end of the purification, the oligonucleotides are exchanged in ammonium form on a Dowex column

50 W NH^{+ ®}, puis vérifiés par HPLC sur colonne50 W NH^{+ ®} , then verified by HPLC on a column

Nucléosil^® analytique.Analytical nucleosil^® .

Les rendements de biotinylation sont de 21 % àBiotinylation yields are 21% at

23 % ; 5' Biot = 3,18 DO. Exemple 2 :23%; 5 'Biot = 3.18 DO. Example 2:

On prépare les sondes 2 et 3 en opérant comme indiqué ci-dessus.Probes 2 and 3 are prepared by operating as indicated above.

Sonde 2 3' NH₂ = 5,23 D0 3' Biot = 1,124 DOProbe 2 3 'NH₂ = 5.23 D0 3' Biot = 1.124 DO

Rdt = 21,5 % Sonde 3 5' 3' NH₂ = 1 D0 5' 3' Biot = 0,228 DOYield = 21.5% Probe 3 5 '3' NH₂ = 1 D0 5 '3' Biot = 0.228 DO

Rdt = 22,8 %Yid = 22.8%

Exemple 3 : Révélation de Dot Blots de sondes biotinylees.Example 3: Disclosure of Dot Blots of biotinylated probes.

Les sondes décrites ci-dessus ont été utilisées pour éprouver l'efficacité de deux kits de détection de l'ADN biotinylé commercialisés par la société BRL :The probes described above were used to test the effectiveness of two biotinylated DNA detection kits sold by the company BRL:

1. Products for Nucleic Acid Détection, réf. 8239 SA1. Products for Nucleic Acid Detection, ref. 8239 SA

2. Blu GENE^™, réf. 8279 SA. La très forte affinité de la biotine pour les protéines avidine ou streptavidine est à la base de la mise au point de ces deux méthodes de détection enzymatique.2. Blu GENE^™ , ref. 8279 SA. The very strong affinity of biotin for the proteins avidin or streptavidin is the basis of the development of these two methods of enzymatic detection.

Les premières révélations ont été faites sur des dot blots de sondes biotinylees.The first revelations were made on dot blots of biotinylated probes.

Les sondes sont déposées à différentes concentrations (de 100 pmoles à 0,5 fmole)sur de la nitrocellulose puis fixées par passage au four à 80ºC pendant 1 heure. Les filtres sont bloqués par de l'albumine de sérum bovine à. 3 % dans un tampon 0,1 M tris-HCl (pH 7,5 ; 0,15 M NaCl à 55ºC pendant 2 heures.The probes are deposited at different concentrations (from 100 pmol to 0.5 fmol) on nitrocellulose and then fixed by passage in the oven at 80ºC for 1 hour. The filters are blocked with bovine serum albumin. 3% in 0.1 M tris-HCl buffer (pH 7.5; 0.15 M NaCl at 55ºC for 2 hours.

Suivant le kit de détection employé, la révélation se fait en deux ou trois étapes. Le premier kit de détection commercialisé 1 suit un protocole en 3 étapes :Depending on the detection kit used, the revelation is done in two or three stages. The first detection kit marketed 1 follows a 3-step protocol:

1. couplage avec la streptavidine ;1. coupling with streptavidin;

2. couplage avec la phosphate alcaline biotinylée; 3. réaction enzymatique colorée avec le nitroblue tetrazolium (NBT) et le 5 bromo-4-chloro-3- indonyl phosphate (BCIP).2. coupling with biotinylated alkaline phosphate; 3. colored enzymatic reaction with nitroblue tetrazolium (NBT) and bromo-4-chloro-3-indonyl phosphate (BCIP).

Des signaux amplifiés peuvent être obtenus grâce à la propriété de la streptavidine de lier 4 molécules de biotine.Amplified signals can be obtained thanks to the property of streptavidin to bind 4 molecules of biotin.

Le second kit 2 se fait en deux étapes :The second kit 2 is done in two stages:

1. couplage avec la streptavidine-phosphatase alcaline,1. coupling with streptavidin-alkaline phosphatase,

2. réaction enzymatique colorée avec le NBT et le BCIP.2. colored enzymatic reaction with NBT and BCIP.

L'intensité des révélations est appréciée visuellement.The intensity of the revelations is assessed visually.

Chaque révélation de sondes biotinylees synthétiques est menée en parallèle avec la révélation d'ADN biotinylé enzymatiquement, fourni par BRL, et déposé à différentes concentrations sur de la nitrocellulose, ce qui permet d'éprouver la sensibilité de chaque détection d'ADN.Each revelation of synthetic biotinylated probes is carried out in parallel with the revelation of biotinylated DNA enzymatically, supplied by BRL, and deposited at different concentrations on nitrocellulose, which makes it possible to test the sensitivity of each detection of DNA.

Des quantités de 50 fmoles d'ADN de sondes biotinylees déposées sur de la nitrocellulose ont été révélées. Hybridation des sondes avec de l'ADN immobilisé sur nitrocellulose.Amounts of 50 fmol of DNA from biotinylated probes deposited on nitrocellulose have been revealed. Hybridization of the probes with DNA immobilized on nitrocellulose.

. Préparation des filtres de nitrocellulose. De l'ADN plasmidique cible dans lequel sont insérés 1.6 kb correspondant à l'ADN-c de l'AT III et de l'ADN contrôle de pBR 322 ont été déposés sur nitrocellulose : ces ADNs préalablement linéarisés par l'enzyme de restiction HindIII ont été dilués de 2 en 2 pour obtenir une gamme de concentrations variant de 10 μg à 0,01 μg, dénaturés par chauffage 10 minutes à 100ºC et additionnés de 0,5 M NaOH 20 minutes à température du laboratoire puis neutralisés dans la glace avec 0,3 M HCl, 0,3 M NaCl, 0,15 M Tris HCl pH 8, 0,1 M citrate de sodium. 7,5 μl de chaque dilution ont été déposés sur nitrocellulose. Les filtres ont été séchés 1 heure à l'air libre, puis 2 heures au four à 80ºC. . Hybridation. Preparation of nitrocellulose filters. Target plasmid DNA into which 1.6 kb are inserted corresponding to the c-DNA of AT III and the control DNA of pBR 322 were deposited on nitrocellulose: these DNAs previously linearized by the restriction enzyme HindIII were diluted 2 in 2 to obtain a range of concentrations varying from 10 μg to 0.01 μg, denatured by heating for 10 minutes at 100 ° C and added with 0.5 M NaOH 20 minutes at laboratory temperature then neutralized in ice with 0.3 M HCl, 0.3 M NaCl, 0.15 M Tris HCl pH 8, 0.1 M sodium citrate. 7.5 μl of each dilution was deposited on nitrocellulose. The filters were dried 1 hour in the open air, then 2 hours in the oven at 80ºC. . Hybridization

Des filtres de nitrocellulose ont été préhybridés 2 heures à 37ºC en 6 x NET (1 x NET = 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris HCl, pH 7,5, 0,001 M EDTA), 5 x Denhardt's (100 Denhardt's 0,02 % sérum albumine bovine, 0,02 % polyvinyl pyrolidone, 0,02 % ficoll), 5 % sulfate de dextran , 0,1 % SDS et 100 μg par ml d'ADN soniqué de sperme de saumon. L'hybridation a été effectuée 20 heures à 37ºC dans la même solution contenant soit 10 cpm par ml de sonde marquée en 5' au [³²P] par la polynucléotide kinase, soit 100 ng par ml de sonde biotinylée. Les filtres ont été lavés 3 fois 15 minutes enNitrocellulose filters were prehybridized for 2 hours at 37ºC in 6 x NET (1 x NET = 0.15 M NaCl, 0.05 M Tris HCl, pH 7.5, 0.001 M EDTA), 5 x Denhardt's (100 Denhardt's 0 , 02% bovine albumin serum, 0.02% polyvinyl pyrolidone, 0.02% ficoll), 5% dextran sulfate, 0.1% SDS and 100 μg per ml of sonicated DNA from salmon sperm. The hybridization was carried out for 20 hours at 37 ° C. in the same solution containing either 10 cpm per ml of probe labeled in 5 'with [³² P] with polynucleotide kinase, or 100 ng per ml of biotinylated probe. The filters were washed 3 times 15 minutes in

6SSC à 4ºC et 1 fois 5 minutes à 40ºC puis soumis à une autoradiographie ou à une réaction colorée.6SSC at 4ºC and 1 time 5 minutes at 40ºC then subjected to autoradiography or a colored reaction.

Le procédé de l'invention permet d'obtenir, par voie chimique, des oligonucléotides utilisables comme sondes de détection de séquences complémentaires d'acides nucléiques. On notera à cet égard que la limite de détection avec le kit streptavidine-phosphatase alcaline est de l'ordre de 15 fentomoles. Ces sondes revêtent également un grand intérêt pour la séparation d'un polynucléotide complémentaire contenu dans une solution amenée au contact de cette molécule supportée, la détection ou la séparation étant mise en oeuvre dans des conditions autorisant leur hybridation mutuelle. Grâce à la formation d'un double brin sur le support il est également possible de purifier des protéines donnant lieu à une interaction avec un fragment d'ADN.The method of the invention makes it possible to obtain, by chemical means, oligonucleotides which can be used as probes for detecting complementary sequences of nucleic acids. In this respect, it should be noted that the detection limit with the streptavidin-alkaline phosphatase kit is around 15 fentomoles. These probes are also of great interest for the separation of a complementary polynucleotide contained in a solution brought into contact with this supported molecule, the detection or separation being carried out under conditions allowing their mutual hybridization. Thanks to the formation of a double strand on the support, it is also possible to purify proteins giving rise to an interaction with a DNA fragment.

Les inventeurs ont constaté que lorsqu'on in- troduit le groupement marqueur du côté 5', on obtient un duplex plus stable à l'hybridation que lorsque ce groupement se trouve du côté 3'.The inventors have found that when the marker group is introduced on the 5 'side, a duplex which is more stable to hybridization is obtained than when this group is on the 3' side.

BIBLIOGRAPHIEBIBLIOGRAPHY

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Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé d'obtention par voie chimique, d'oligonucléotidides marqués, caractérisé par les étapes suivantes : on incorpore, lors de la synthèse chimique en phase solide de la séquence d'oligonucléotides à construire, à la place des cytosines prévues sur la séquence, respectivement une ou plusieurs thymines dont la position 4 est substituée par un groupe activateur, on fait réagir la séquence oligonucléotidique construite avec un composé de formule R-A-R' dans laquelle1. Method for obtaining chemically, labeled oligonucleotidides, characterized by the following steps: during the solid phase chemical synthesis of the sequence of oligonucleotides to be constructed, instead of the cytosines provided on the sequence , respectively one or more thymines whose position 4 is substituted by an activating group, the oligonucleotide sequence constructed is reacted with a compound of formula RAR 'in which

R et R', sont identiques et représentent un groupeR and R ', are identical and represent a group

-NH₂, -SH ou -OH, ou R et R' sont différents, l'un représentant un groupe -NH₂, -SH ou -OH, l'autre un groupe -NH-X, -SX ou -O-X, dans lequel X est un groupe capable de servir de marqueur pour la molécule ; et-NH₂ , -SH or -OH, or R and R 'are different, one representing a group -NH₂ , -SH or -OH, the other a group -NH-X, -SX or -OX, wherein X is a group capable of serving as a marker for the molecule; and

A représente une chaîne alcoyle de 4 à 20 atomes de carbone environ, comportant le cas échéant des hétéroatomes, tels que O, N ou S ; ce qui conduit à l'obtention de méthyl-5-cytosine(s) avec une chaîne de substitution en position 4, à la place de la ou des thymines activées, et lorsque le composé R-A-R' ne renferme pas de groupe marqueur, on introduit un groupement marqueur sur la chaîne de substitution des méthyl-cytosines. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'activation de la position 4 de la thymine comprend la fixation sur ce sommet d'un dérivé hétérocyclique du type triazole, en particulier 1,A represents an alkyl chain of approximately 4 to 20 carbon atoms, optionally comprising heteroatoms, such as O, N or S; which leads to the production of methyl-5-cytosine (s) with a substitution chain in position 4, instead of the activated thymine (s), and when the compound RAR 'does not contain a marker group, we introduce a marker group on the methyl-cytosine substitution chain. 2. Method according to claim 1, characterized in that the activation of position 4 of the thymine comprises the fixing on this vertex of a heterocyclic derivative of the triazole type, in particular 1,

2,4-triazole, nitro-triazole ou tetrazole, imidazole ou encore d'un chlorure d'acide.2,4-triazole, nitro-triazole or tetrazole, imidazole or an acid chloride.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le couplage des nucléosides ou des nucléotides pour la construction de la chaîne est effectuée motif par motif ou par blocs de nucléotides, après fixation d'un motif sur un support solide.3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the coupling of the nucleosides or nucleotides for the construction of the chain is carried out pattern by pattern or by blocks of nucleotides, after fixation of a pattern on a solid support.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le composé R-A-R' est un diaminoalcane, en particulier le diamino 1-10 décane, un glycol ou un α, ω-aminoalcool.4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the compound R-A-R 'is a diaminoalkane, in particular diamino 1-10 decane, a glycol or an α, ω-aminoalcohol.

5. Procédé selon la revendication 4 , caractérisé en ce que en ce que la substitution des thymines activées par un diaminoalcane est réalisée dans un solvant organique tel que la pyridine, de préférence avec un excès d'aminé.5. Method according to claim 4, characterized in that in that the substitution of the activated thymines by a diaminoalkane is carried out in an organic solvent such as pyridine, preferably with an excess of amine.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les oligonucléotides comportant les motifs méthyl-cytosines avec une chaîne de substitution en position 4 sont décrochés du support, puis débloqués et soumis à une ou plusieurs types de purification.6. Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the oligonucleotides comprising the methyl-cytosine units with a substitution chain in position 4 are unhooked from the support, then released and subjected to one or more types of purification .

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on fait réagir la séquence d'oligonucléotide renfermant le ou les motifs méthyl-cytosines substitués avec un ou plusieurs groupes capable de servir de marqueur pour la molécule.7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the oligonucleotide sequence containing the substituted methyl-cytosine motif (s) is reacted with one or more groups capable of serving as a marker for the molecule.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupe marqueur est choisi parmi les peptides, les haptènes, des groupement colorés ou fluorescents tels que la rhodamine, le fluoresceine ou le dansyl, ou encore des enzymes telles que la phosphatase alcaline ou la peroxydase.8. Method according to claim 7, characterized in that the marker group is chosen from peptides, haptens, colored or fluorescent groups such as rhodamine, fluorescein or dansyl, or even enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase.

9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le groupe marqueur est la biotine.9. Method according to claim 7, characterized in that the marker group is biotin.

10. Application des oligonucléotides obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à10. Application of the oligonucleotides obtained by the process according to any one of claims 1 to

9, en tant que sondes froides de détection de séquences complémentaires d'acides nucléiques.9, as cold probes for detecting complementary nucleic acid sequences.