UA83027C2 - Strains of bifidobacterium bifidum, galactooligosaccharide composition, use thereof and the preparation of substance for promoting the growth of bifidobacteria - Google Patents

Abstract

The invention relates to strain of Bifidobacterium bifidum capable of producing a galactosidase enzyme activity that converts lactose to a galactooligosaccharide mixture comprising at least one disaccharide Gal(1-6)-Gal, at least one trisaccharide selected from Gal(1-6)-Gal(1-4)-Glc or Gal(1-3)-Gal(1-4)-Glc, at least one tetrasaccharide Gal(1-6)-Gal(1-6)-Gal(1-4)-Glc and at least one pentasaccharide Gal(1-6)-Gal(1-6)-Gal(1-6)-Gal(1-4)-Glc. The mixture of oligosaccharidcs may be incorporated into numerous food products or animal feeds for improving gut health by promoting the growth of bifidobacteria in the gut, and repressing the growth of the pathogenic microflora.

Description

Translated fromUkrainian

25905 мас/об, тетрасахариду і від 10 до 2095 пентасахариду.25905 wt/vol, tetrasaccharide and from 10 to 2095 pentasaccharide.

Термін «ферментативна активність», що використовується в тексті відносно галактозидазної ферментативної активності згідно з даним винаходом, означає активність, що виявляється, принаймні, одним ферментом галактозидазою.The term "enzymatic activity" used in the context of galactosidase enzymatic activity according to the present invention means the activity detected by at least one galactosidase enzyme.

В одному аспекті було виявлено, що суміш галактоолігосахаридів містить дисахарид сСа!1-саї, трисахаридIn one aspect, it was found that the mixture of galactooligosaccharides contains the disaccharide cSa!1-sai, a trisaccharide

Са!-Са!І-СіІс, тетрасахарид Са1І-СаІ-СаІ-сіс і пентасахарид Са1І-Са!І-Са1І-СаІ-сіс, де Са! являє собою залишок галактози і біс являє собою залишок глюкози.Ca!-Ca!I-SiIs, tetrasaccharide Ca1I-CaI-CaI-sis and pentasaccharide Ca1I-Sa!I-Ca1I-CaI-sis, where Ca! is a galactose residue and bis is a glucose residue.

За допомогою аналізу шляхом метилування і ферментативного гідролізу суміші галактоолігосахаридів було виявлено, що суміш містить баї (81-6)-сза(рі-6)-Са! (р1-4)-сІс тетрасахарид; Саї (р1-6)-Са(р1-4)-сіс іWith the help of analysis by methylation and enzymatic hydrolysis of a mixture of galactooligosaccharides, it was found that the mixture contains bai (81-6)-sza(ri-6)-Sa! (p1-4)-сис tetrasaccharide; Sai (p1-6)-Ca(p1-4)-sis and

Сац(р1-3)-Са|(р1-4)-сіс трисахариди; Са|(р1-3)-Сіс, Сза|(р1-3)-Саї, Са|(рті-6)-саї і са(с1-6)-Сса! дисахариди.Sac(p1-3)-Ca|(p1-4)-cis trisaccharides; Sa|(p1-3)-Sis, Sza|(p1-3)-Sai, Sa|(rti-6)-sai and sa(s1-6)-Ssa! disaccharides

Штам Війдорасіегішт рійайцт, здатний продукувати фермент з галактозидазною активністю, який перетворює лактозу в суміш галактоолігосахаридів, як визначено вище, був депонований під інвентарним номером МСІМВ 41171 в Національній колекції промислових і морських бактерій, м.Абердин (Шотландія) 31 березня 2003.A strain of Vijdorasiegisht riajst, capable of producing an enzyme with galactosidase activity that converts lactose into a mixture of galactooligosaccharides as defined above, was deposited under inventory number МСИМВ 41171 in the National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen (Scotland) on March 31, 2003.

Такий штам Війаорасіегішт ріййит або його біологічно функціональний еквівалент може бути використаний для продукування суміші галактоолігосахаридів, як визначено вище. Суміш галактоолігосахаридів може бути частиною продукту, що використовується для поліпшення стану кишки шляхом стимулювання зростання біфідобактерій в кишці, особливо вихідного штаму-продуценту. Такий продукт може бути вибраний з групи, що складається з молочних продуктів (наприклад, рідкого молока, сухого порошкового молока, такого як незбиране сухе молоко, збиране сухе молоко, збагачене жирами сухе молоко, порошкова сироватка, молоко для немовлят, морозива, йогурту, сиру, сброджених молочних продуктів), напоїв, дитячого харчування, круп'яних продуктів, хліба, сухого печива, кондитерських виробів, тортів, харчових добавок, добавок до раціону, кормів для тварин, кормів для домашньої птиці або будь-якого іншого продукту харчування або напою.Such a strain of Vijaorasiegisht rijyit or its biologically functional equivalent can be used to produce a mixture of galactooligosaccharides as defined above. A mixture of galactooligosaccharides can be part of a product used to improve the condition of the intestine by stimulating the growth of bifidobacteria in the intestine, especially the original producer strain. Such a product may be selected from the group consisting of dairy products (e.g. liquid milk, dry milk powder such as whole milk powder, condensed milk powder, fat-enriched milk powder, whey powder, infant milk, ice cream, yogurt, cheese , fermented milk products), beverages, baby food, cereals, bread, biscuits, confectionery, cakes, food additives, dietary supplements, animal feed, poultry feed or any other food or drink .

Суміш олігосахаридів також може бути використана для отримання лікарських препаратів, спрямованих на запобігання адгезії патогенів або токсинів, що продукуються патогенами, до стінки кишки. Суміш може бути введена хворому після курсу терапії антибіотиками, який часто змінює або навіть руйнує нормальний стан кишкової флори, або після операції на кишці, для того, щоб "знову посіяти" або відновити в кишці нормальну флору, властиву здоровій кишці. Суміш галактоолігосахаридів може бути використана в комбінації з штамомA mixture of oligosaccharides can also be used to obtain drugs aimed at preventing the adhesion of pathogens or toxins produced by pathogens to the intestinal wall. The mixture can be administered to a patient after a course of antibiotic therapy, which often changes or even destroys the normal state of the intestinal flora, or after surgery on the intestine, in order to "reseed" or restore the normal flora characteristic of a healthy intestine in the intestine. A mixture of galactooligosaccharides can be used in combination with a strain

Віпаорасієгічт рійдит, вказаним вище, або біологічно функціональним еквівалентом.Vipaorasiegicht riydit, indicated above, or a biologically functional equivalent.

Фраза "біологічно функціональний еквівалент" використовується для позначення штаму Війдорасіегійт ріїдит, який виявляє здатність продукувати фермент з галактозидазною активністю, який перетворює лактозу в суміш галактоолігосахаридів, як визначено вище.The phrase "biologically functional equivalent" is used to refer to a strain of Vijdorasiegiit riidit that exhibits the ability to produce an enzyme with galactosidase activity that converts lactose into a mixture of galactooligosaccharides as defined above.

Згідно з іншим аспектом даного винаходу пропонується галактоолігосахаридна композиція для стимулювання зростання біфідобактерій, що містить як ефективні компоненти, принаймні, один дисахарид, принаймні, один трисахарид, принаймні, один тетрасахарид і, принаймні, один пентасахарид.According to another aspect of this invention, a galactooligosaccharide composition for stimulating the growth of bifidobacteria is proposed, containing as effective components at least one disaccharide, at least one trisaccharide, at least one tetrasaccharide and at least one pentasaccharide.

Галактоолігосахаридна композиція переважно являє собою суміш галактоолігосахаридів, як описано в тексті вище.The galactooligosaccharide composition is preferably a mixture of galactooligosaccharides, as described in the text above.

Переважно, галактоолігосахаридна композиція містить від 20 до 3595 мас./об. дисахариду, від 20 до 35905 мас/об, трисахариду(ів), від 15 до 2595 мас/об. тетрасахариду і від 10 до 2095 мас/об, пентасахариду.Preferably, the galactooligosaccharide composition contains from 20 to 3595 wt./vol. disaccharide, from 20 to 35905 wt/vol, trisaccharide(s), from 15 to 2595 wt/vol. tetrasaccharide and from 10 to 2095 wt/vol, pentasaccharide.

Згідно з іншим аспектом винаходу пропонується спосіб виробництва речовини, призначеної для стимулювання зростання біфідобактерій, який відрізняється тим, що лактозу або лактозовмісний матеріал обробляють штамом Війдобрасіегіт рійдит, як визначено вище.According to another aspect of the invention, a method of producing a substance intended to stimulate the growth of bifidobacteria is proposed, which is characterized by the fact that lactose or a lactose-containing material is treated with a strain of Vijdobrasiegit riidit, as defined above.

Придатний лактозовмісний матеріал може бути вибраний з комерційної лактози, незбираного молока, напівзбираного молока, збираного молока, сироватки і збагаченого жирами молока. Такі молочні продукти можуть бути отримані з молока корів, самиць буйвола, овець або кіз. Збагачене жирами молоко визначають як незбиране молоко, з якого зібрані вершки для видалення молочних жирів, які згодом замінюють шляхом додання рослинних жирів або масла.A suitable lactose-containing material may be selected from commercial lactose, whole milk, semi-skimmed milk, skimmed milk, whey and fat-enriched milk. Such dairy products can be obtained from the milk of cows, female buffaloes, sheep or goats. Fortified milk is defined as whole milk from which the cream has been skimmed to remove the milk fat, which is later replaced by adding vegetable fat or butter.

Використовуючи середовище для зростання, доповнене вуглеводними субстратами, відмінними від лактози, виявили, що Віїйдобасіегішт рійдит, згідно з винаходом, може утилізувати мальтозу, рафінозу, ксилан і фруктозу. Культивування бактерій в середовищі, доповненому одним з вказаних вуглеводів, індукує експресію о-глюкозидази, о-галактозидази, ксилозидази і Д-фруктофуранозидази, відповідно, і, таким чином, приводить до продукування о-глюкоолігосахаридів, о-галактоолігосахаридів, ксилоолігосахаридів |і фруктоолігосахаридів, відповідно.Using a growth medium supplemented with carbohydrate substrates other than lactose, it was found that Viiidobasiegisht riidit, according to the invention, can utilize maltose, raffinose, xylan and fructose. Cultivation of bacteria in a medium supplemented with one of these carbohydrates induces the expression of o-glucosidase, o-galactosidase, xylosidase, and D-fructofuranosidase, respectively, and thus leads to the production of o-glucooligosaccharides, o-galactooligosaccharides, xylooligosaccharides, and fructooligosaccharides. in accordance.

У дослідженні, яке привело до даного винаходу, ізольовані кишкові бактерії були перевірені з метою виявлення бактерій, які здатні продукувати галактозидазу і, таким чином, мають високий потенціал для продукування галактоолігосахариду(ів). У результаті було виявлено, що деякі бактерії, які належать до роду біфідобактерій, зокрема Війдорасіегішт ріїйадит, були здатні не тільки продукувати фермент з галактозидазною активністю, але також, що фермент міг перетворювати лактозу в галактоолігосахаридну суміш, що містить від 20 до 3595 мас/об, дисахариду, від 20 до 3595 мас/об, трисахариду, від 15 до 2595 мас/об. тетрасахариду, від до 2095 мас/об, пентасахариду. Окремий примірник Війдорасіегішт рітацт був депонований 31 березня 2003 в МСІМВ, м.Абердин, під інвентарним номером 41171.In the research that led to the present invention, isolated intestinal bacteria were screened to identify bacteria that are capable of producing galactosidase and thus have a high potential to produce galactooligosaccharide(s). As a result, it was found that some bacteria belonging to the genus Bifidobacteria, in particular Vijdorasiegist riiadit, were able not only to produce an enzyme with galactosidase activity, but also that the enzyme could convert lactose into a galactooligosaccharide mixture containing from 20 to 3595 wt/vol , disaccharide, from 20 to 3595 wt/vol, trisaccharide, from 15 to 2595 wt/vol. tetrasaccharide, from to 2095 wt/vol, pentasaccharide. A separate copy of the Vijdorasiegisht ritatst was deposited on March 31, 2003 in the Ministry of Foreign Affairs, Aberdeen, under inventory number 41171.

Для культивування вказаних бактерій може бути використане будь-яке поживне джерело, за умови, що воно може засвоюватися бактеріями. Відповідне культуральне середовище може бути приготоване, наприклад, з вуглеводами, такими як лактоза, сахароза або глюкоза; азотовмісними неорганічними або органічними поживними джерелами, такими як дріжджовий екстракт, триптон, м'ясний екстракт (Гар Гетосо) і тому подібне; неорганічними поживними джерелами, такими як фосфати, калій і тому подібне. Для культивування рН поживного середовища повинен знаходитися в діапазоні від 6,0 до 8,0, переважно 7,0, |і культивування здійснюють. в анаеробних умовах при температурі, що знаходиться в діапазоні від 35" до 402, переважно 37"С, протягом від 40 до 64 годин, переважно 50 годин.Any nutrient source can be used for the cultivation of these bacteria, provided that it can be assimilated by the bacteria. A suitable culture medium can be prepared, for example, with carbohydrates such as lactose, sucrose or glucose; nitrogen-containing inorganic or organic nutrient sources such as yeast extract, tryptone, meat extract (Gar Getoso) and the like; inorganic nutrient sources such as phosphates, potassium and the like. For cultivation, the pH of the nutrient medium should be in the range from 6.0 to 8.0, preferably 7.0, and cultivation is carried out. in anaerobic conditions at a temperature ranging from 35" to 402, preferably 37"C, for 40 to 64 hours, preferably 50 hours.

Штам може бути культивований будь-яким з відомих способів вирощування культур, таких як стаціонарна культура, анаеробна зважена культура або культура, вирощена при струшуванні. Бактерійні клітини збирають центрифугуванням або фільтрацією, і клітини можуть бути використані як такі як каталізатор реакції без подальшої обробки. Як альтернатива, клітини можуть бути використані в іммобілізованому стані за допомогою відповідної процедури іммобілізації.The strain can be cultivated by any of the known culture methods, such as stationary culture, anaerobic suspended culture, or culture grown by shaking. Bacterial cells are collected by centrifugation or filtration, and the cells can be used as such as a reaction catalyst without further processing. Alternatively, cells can be used in an immobilized state using an appropriate immobilization procedure.

Бактерії Війаорасіегчт рійдит згідно з винаходом можуть бути використані для перетворення лактози як такої або лактози, що міститься в молочному продукті, в нову галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом. Після перетворення бактерійні клітини можуть бути видалені центрифугуванням. Будь-який присутній моносахарид може бути видалений, наприклад, шляхом інкубації з дріжджами Засспаготуеев5 сегемізіае. Згодом суміш може бути піддана центрифугуванню і мікрофільтрації. Отриманий розчин СО5 потім може бути висушений розпиленням з утворенням порошку.Vijaorasiegcht riidit bacteria according to the invention can be used to convert lactose as such or lactose contained in a dairy product into a new galactooligosaccharide composition according to the invention. After transformation, bacterial cells can be removed by centrifugation. Any monosaccharide present can be removed, for example, by incubation with the yeast Zasspagotueev5 segemisiae. Subsequently, the mixture can be subjected to centrifugation and microfiltration. The resulting CO5 solution can then be spray-dried to form a powder.

Молоко, що містить галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом, приготовану даним способом, можуть вживати діти, дорослі або тварини. Як альтернатива, композиція може бути використана для отримання продуктів, таких як хліб, кондитерські вироби або тому подібне, де стійкість галактоолігосахаридів при кислих умовах і при високій температурі робить можливим використати їх без розкладання. Як альтернатива, порошок 5О5 може бути доданий до продуктів, перерахованих вище.Milk containing the galactooligosaccharide composition according to the invention, prepared by this method, can be consumed by children, adults or animals. Alternatively, the composition can be used to obtain products such as bread, confectionery or the like, where the stability of galactooligosaccharides under acidic conditions and at high temperature makes it possible to use them without decomposition. Alternatively, 5O5 powder can be added to the products listed above.

Порошок 5О5 може бути введений хворим, страждаючим від таких кишкових розладів, як запальне кишкове захворювання і синдром подразненої кишки, в такому випадку хворий може вживати добову дозу від 2 до 20г, переважно від 5 до 10г, найбільш переважно 7г, у вигляді двох окремих доз.5O5 powder can be administered to a patient suffering from such intestinal disorders as inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome, in which case the patient can use a daily dose of 2 to 20g, preferably 5 to 10g, most preferably 7g, in the form of two separate doses .

Як альтернатива, галактоолігосахаридна композиція згідно з винаходом може бути змішана з культуроюAlternatively, the galactooligosaccharide composition of the invention may be mixed with the culture

Віїаорасіегішт Біїдит згідно з винаходом для отримання суміші з метою поліпшення стану кишечнику. | таку суміш класифікують як синбіотична, яку визначають як "суміш пробіотика і пребіотика, яка благотворно діє на хазяїна за рахунок поліпшеної життєздатності і: введення живої мікробної харчової добавки в шлунково- кишковий тракт» (дивись ірзоп апа Кобегігоїд, 1995, Оіеїагу тоашіайоп ої те питап тісгобріоїа: іпігодисіпд пе сопсері ої ргебріоїісв. дошгпаї ої Миййіоп 125, 1401-1412. Така комбінація підвищує життєздатність пробіотика в несприятливому середовищі товстої кишки завдяки наданню доступного селективного субстрату. Бактерійний пробіотик може бути мікроіїнкапсульованим в галактоолігосахаридному пребіотику у вигляді, наприклад, порошку, який потім можна додавати до молочних продуктів, таких як йогурт, або використовувати як харчову добавку.Viiaorasiegisht Biidit according to the invention for obtaining a mixture for the purpose of improving the condition of the intestines. | such a mixture is classified as synbiotic, which is defined as "a mixture of probiotics and prebiotics that has a beneficial effect on the host due to improved viability and: the introduction of a live microbial food supplement into the gastrointestinal tract" (see irzop apa Kobegoid, 1995, Oieiagu toashiayop oi te pitap tisgobryoia: ipigodisipd pe sopseri oi rgebrioiisv doshgpai oi Miyiop 125, 1401-1412. Such a combination increases the viability of the probiotic in the unfavorable environment of the large intestine by providing an available selective substrate. The bacterial probiotic can be microencapsulated in a galactooligosaccharide prebiotic in the form of, for example, a powder, which is then can be added to dairy products such as yogurt or used as a food additive.

Перевага вживання молока або інших продуктів, що містять галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом, полягає в тому, що воно стимулює підвищення рівнів сприятливих біфідобактерій в кишці, при збіднінні інших менш бажаних бактерій, присутніх в кишковій мікрофлорі, таких як клостридії. Таким чином, відбувається зменшення деяких природних бактерій, які можуть надавати шкідливий вплив на стан здоров'я індивідууму. Цей ефект повинен привести до скорочення інфекцій шлунково-кишкового тракту.The advantage of consuming milk or other products containing the galactooligosaccharide composition according to the invention is that it stimulates an increase in the levels of beneficial bifidobacteria in the intestine, while depleting other less desirable bacteria present in the intestinal microflora, such as clostridia. Thus, there is a reduction of some natural bacteria that can have a harmful effect on the individual's health. This effect should lead to a reduction in gastrointestinal tract infections.

Галактоолігосахаридна композиція допомагає запобігти або лікувати коліт, зменшує випадки діареї і знижує ризик хронічних кишкових захворювань, таких як виразковий коліт і рак Вона також може допомогти в послабленні симптомів синдрому подразненої товстої кишки.The galacto-oligosaccharide composition helps prevent or treat colitis, reduces the incidence of diarrhea and reduces the risk of chronic intestinal diseases such as ulcerative colitis and cancer. It may also help relieve the symptoms of irritable bowel syndrome.

Вага сільськогосподарських тварин, що утримуються на кормі з доданою галактоолігосахаридною композицією згідно з винаходом у вигляді, наприклад, порошку, може поліпшуватися завдяки харчуванню.The weight of farm animals kept on feed with the added galactooligosaccharide composition according to the invention in the form of, for example, a powder can be improved by nutrition.

Даний винахід буде описаний далі за допомогою посилання на приклади.The present invention will be described below with reference to examples.

Приклад 1Example 1

Тл середовища (рН 7,0), що містить 10,Ог/л триптону, 5,0г/л Гар--ЕМСО (м'ясний екстракт), 5,0г/л дріжджового екстракту, З,0г/л КаНРО», 0,05г/л цистеїну: НСІ, 10г/л лактози і 1 мл/л твін 80, стерилізували при 12 ГО протягом 15хв. Після стерилізації середовище засівали 1,095 (об./06.) свіжою культурою Віїйдорасіегінт рійайит МСІМВ 41171 і інкубували при анаеробних умовах при 372С протягом 50год. Бактерійні клітини збирали центрифугуванням (300009 протягом 20хв.). Після промивання двічі фосфатним буфером (0,02М, рН 7,0) клітини були готові до використання в реакціях синтезу олігосахаридів.Tl medium (pH 7.0) containing 10.0 g/l tryptone, 5.0 g/l Har--EMSO (meat extract), 5.0 g/l yeast extract, 3.0 g/l CaHRO» 0.05 g/l cysteine: NSI, 10 g/l lactose and 1 ml/l tween 80, sterilized at 12 HO for 15 min. After sterilization, the medium was inoculated with 1.095 (vol./06.) fresh culture Viiidorasiegint riyait MCIMV 41171 and incubated under anaerobic conditions at 372C for 50 hours. Bacterial cells were collected by centrifugation (300,000 for 20 min.). After washing twice with phosphate buffer (0.02M, pH 7.0), the cells were ready for use in oligosaccharide synthesis reactions.

Бактерійні клітини (40 одиниць р-галактозидазної активності) знову суспендували в 100 мл фосфатного буферу (0,02М, рн 7,0), що містить 50г лактози. Реакцію проводили при 402С, і після 7год. суміш складалася з 3595 (мас/об.) продуктів гідролізу (глюкоза, галактоза), 3795 (мас/об.) лактози і 1895 (мас/об.) галактоолігосахаридів із мірою полімеризації між 2 і 5. Після видалення бактерійних клітин центрифугуванням (30009 протягом 20хв.) моносахариди (глюкоза і галактоза) видаляли за допомогою інкубації з дріжджами засспаготусевз сегемізіае. Згодом дріжджі видаляли центрифугуванням (10000 д протягом 10Охв.), і потім суміш фільтрували через мікрофільтр ОД мкм, щоб забезпечити мікробіологічні показники продукту. Розчин цукру потім сушили розпиленням для отримання порошку. Продукти кількісно аналізували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, використовуючи систему Мегок-Ніаспі ГаСпгот (Мегск, Рооїіе, рогзеї, ОК), забезпечену колонкою АРЕХ Сагропуагаге (опе5 Спготаїодгарпу, Міа Сіатогдап, ШК) і детекторBacterial cells (40 units of β-galactosidase activity) were resuspended in 100 ml of phosphate buffer (0.02 M, pH 7.0) containing 50 g of lactose. The reaction was carried out at 402C, and after 7 hours. the mixture consisted of 3595 (w/v) hydrolysis products (glucose, galactose), 3795 (w/v) lactose and 1895 (w/v) galactooligosaccharides with a degree of polymerization between 2 and 5. After removal of bacterial cells by centrifugation (30009 within 20 min.) monosaccharides (glucose and galactose) were removed by incubation with the yeast zasspagotusevs segemisiae. Subsequently, the yeast was removed by centrifugation (10,000 rpm for 10 hours), and then the mixture was filtered through a OD microfilter to ensure the microbiological parameters of the product. The sugar solution was then spray-dried to obtain a powder. The products were quantitatively analyzed by high-performance liquid chromatography using a Megok-Niaspi HaSpgot system (Megsk, Rooiie, Rogsey, OK) equipped with an AREX Sagropuagage column (ope5 Spgothaiodgarpu, Mia Siatogdap, ShK) and a detector

Мегек-Нігасні ГаСпгот РІ. Як елюент використовували 7095 (06./об.) ацетонітрил при 252С і швидкості потокуMegek-Nigasni HaSpgot RI. As an eluent, 7095 (06./vol.) acetonitrile was used at 252C and a flow rate

О,дмл/хв.Oh, dml/min.

Галактоолігосахаридна суміш складалася з 2595 Са1І-Саї, 3595 СаІ-Са1І-сіс, 24925 (заІ-Са1І-Са1І-сіс і 1695 са!1-The galactooligosaccharide mixture consisted of 2595 Ca1I-Cai, 3595 CaI-Ca1I-cis, 24925 (zaI-Ca1I-Ca1I-cis and 1695 sa!1-

СхаІ-СаІ-Са!1І-(іс.ShaI-SaI-Sa!1I-(is.

Приклад 2Example 2

Клітини Війдобрасієгішт ріййшт МСІМВ 41171 отримували способом прикладу 1 і додавали до 500мл збираного молока в перемішуваному резервуарі, додавали (300 одиниць Др-галактозидазної активності).Cells of Vijdobrasiegisht riyisht MCIMV 41171 were obtained by the method of example 1 and added to 500 ml of collected milk in a stirred tank, added (300 units of Dr-galactosidase activity).

Перетворення лактози відбувалося при 402С. Після 8год. концентрація галактоолігосахаридів становила 2295 (мас/об.), і суміш містила 2895 са1-сзаї, 3295 (хаІ-СаІ-с1іІс, 2195 Са!І-сза!-СЗа1-с1с і 1995 (заІ-СаІ-СхаІ-Са1І-(1с.Lactose conversion took place at 402С. After 8 hours the concentration of galactooligosaccharides was 2295 (wt/vol), and the mixture contained 2895 sA1-szai, 3295 (xaI-SaI-s1iIs, 2195 sA!I-sza!-Sza1-s1s and 1995 (zaI-SaI-SkhaI-Sa1I-( 1s.

Приклад ЗExample C

Іп міго модель кишкиIp migo gut model

Умови, що мають місце в товстій кишці, відтворювали в тристадійному безперервному ферментеріColonic conditions were replicated in a three-stage continuous fermenter

ІМастапапе еї аї., 1998, Місгобріо! Есоіоду, 35, 180-187), в який вносили 1095 (мас/об.) фекального гомогенату від здорових добровольців в середовищі для зростання без 5БО5 суміші і з 195 (мас/об.) 505 суміші, приготованої способом прикладу 1 (таблиця 2). Модель складалася з трьох посудин, МІ, М2 і М3, з відповідними робочими об'ємами 270, 300 і З00мл. Температуру встановлювали на 372 і її разом з рн контролювали автоматично. рН культур в трьох посудинах підтримували при 5,5, 6,2 і 6,8, відповідно. Кожний ферментер перемішували за допомогою магніту, і в ньому підтримували анаеробні умови шляхом безперервного барботування суміші М», вільного від О» (15мл/хв.).IMastapape ei ai., 1998, Misgobrio! Esoiodu, 35, 180-187), into which 1095 (w/v) fecal homogenate from healthy volunteers was added to the medium for growth without 5BO5 mixture and 195 (w/v) 505 mixture prepared by the method of example 1 (table 2 ). The model consisted of three vessels, MI, M2 and M3, with corresponding working volumes of 270, 300 and 300 ml. The temperature was set at 372 and it was controlled automatically along with the pH. The pH of cultures in three vessels was maintained at 5.5, 6.2, and 6.8, respectively. Each fermenter was stirred with a magnet, and anaerobic conditions were maintained in it by continuous bubbling of the O-free M" mixture (15 ml/min).

Середовище для зростання містило наступні інгредієнти: крохмаль 8г/л, муцин 4г/л, казеїн Зг/л, лептонну воду 5г/л, триптонну воду 5г/л, жовч МеЗ 0,4г/л, дріжджі 4,5г/л, РебОхї 0,005г/л, Масі 4,5г/л, КСІ 4,5г/л, КНгРОХThe growth medium contained the following ingredients: starch 8g/l, mucin 4g/l, casein 3g/l, leptonic water 5g/l, tryptonic water 5g/l, MeZ bile 0.4g/l, yeast 4.5g/l, RebOhi 0.005g/l, Masi 4.5g/l, KSI 4.5g/l, KNgROH

О,5г/л, МазО»4:7НгО 1,25г/л, Сасі»бНгО 0,15г/л, Мансо»з 1,5г/л, твін 80 мл, гемін 0,05г/л, цистеїн" НСІ 0,вг/л.O.5g/l, MazO»4:7NgO 1.25g/l, Sasi»bNgO 0.15g/l, Manso»z 1.5g/l, tween 80 ml, hemin 0.05g/l, cysteine" NSI 0 , g/l

Середовище подавали до М1 за допомогою перистальтичного насоса, і М1 послідовно забезпечував М2 і 3 через серію трубок. Система працювала при часі втримання приблизно 36 годин. Модель кишки залишали на ніч, щоб врівноважити систему до того, як підключали насос для подачі середовища, і він працював протягом, принаймні, 10 днів до того, як була введене середовище, що містить тестований субстрат, і систему залишали протягом ще 10 днів. Зразки відбирали на початку і в кінці кожного циклу. Об'єм видаленого зразка становив 5мл, і цю кількість використовували для встановлення кількості групи бактерій.Medium was fed to M1 by a peristaltic pump, and M1 was sequentially supplied to M2 and 3 through a series of tubes. The system worked with a retention time of approximately 36 hours. The gut model was left overnight to equilibrate the system before the medium pump was connected and was run for at least 10 days before the medium containing the test substrate was introduced and the system was left for another 10 days. Samples were taken at the beginning and at the end of each cycle. The volume of the removed sample was 5 ml, and this amount was used to establish the number of bacterial groups.

Гібридизація іп 5йш із застосуванням флуоресцентно мічених зондів (РІЗН) Відмінності між бактерійними популяціями оцінювали за допомогою використання методу РІЗН з олігонуклеотидними зондами, сконструйованими для націлення на діагностичні області 163 рРНК. Дані олігонуклеотиди були комерційно синтезованими і міченими флуоресцентним барвником СуЗз (наданим Еигодепіес ШК Ца). Використані молекулярні зонди представлені в таблиці 1. Для загального бактерійного рахунку використали барвник нуклеїнових кислот 4,6-діаміно-2-феніліндол (АРІ). Зразки, взяті з ферментаційних посудин, розбавляли в 495 (мас/об.) параформальдегіді і фіксували протягом ночі при 42С. Потім клітини центрифугували при 1500 х 4 протягом 5 хвилин, промивали двічі забуференим фосфатом фізіологічним розчином (РВ5; 0,1М, рН 7,0), знову суспендували в суміші РВ5/9995 етанол (1:11 мас/об.) і зберігали при -202С протягом, принаймні, 1 години. Потім суспензію клітин додавали до гібридизованої суміші і гібридизували при відповідній для кожного зонда температурі протягом ночі. Гібридизовану суміш піддавали вакуум-фільтрації, використовуючи мембранний фільтр Ізороге 0,2мкм (МіПіроге Согрогайоп, Негі5, ОК). Фільтр відставляли, вміщували на предметне скло з 5іомРаде (МоїІесшаг Ргоре5, Еидап, ОК, ОА) і перевіряли за допомогою флуоресцентного мікроскопа (Місоп Ерсіїрзе, Е400)|. Клітини, забарвлені за допомогою ОАРІ, перевіряли в УФф-світлі, і гібридизовані клітини оцінювали, використовуючи фільтр ОМ510. Для кожного предметного скла було оцінено, принаймні, 15 різних полів зору.ip hybridization using fluorescently labeled probes (FTL) Differences between bacterial populations were assessed using the FTL method with oligonucleotide probes designed to target diagnostic regions of 163 rRNA. These oligonucleotides were commercially synthesized and labeled with the fluorescent dye SuZz (provided by Eigodepies ShK Tsa). The molecular probes used are presented in Table 1. The nucleic acid dye 4,6-diamino-2-phenylindole (API) was used for the total bacterial count. Samples taken from fermentation vessels were diluted in 495 (w/v) paraformaldehyde and fixed overnight at 42C. Then the cells were centrifuged at 1500 x 4 for 5 minutes, washed twice with phosphate-buffered saline (PB5; 0.1M, pH 7.0), resuspended in a mixture of PB5/9995 ethanol (1:11 wt/vol.) and stored at -202C for at least 1 hour. Then the cell suspension was added to the hybridized mixture and hybridized at the appropriate temperature for each probe overnight. The hybridized mixture was subjected to vacuum filtration using a 0.2 μm Isoroge membrane filter (MiPiroge Sogrogayop, Negi5, OK). The filter was set aside, placed on a glass slide with 5µmRade (MoiIeschag Pgore5, Eidap, OK, OA) and examined using a fluorescence microscope (Misop Ercierze, E400). Cells stained with OARI were examined in UV light, and hybridized cells were evaluated using an OM510 filter. At least 15 different visual fields were evaluated for each slide.

Таблиця 1Table 1

Олігонуклеотидні зонди, що використовуються для характеристики кишкової мікрофлори з допомогою ІБНOligonucleotide probes used to characterize the intestinal microflora using IBN

Зонд Послідовність Видмішені Температура Посилання с 0 5 ССААТаТОпОбОЛеСТТУ Вссівгоідех грі. сс ізодезйк м ді (1995) вігіб4 в'СКТООВОСАТТАССАСССУ ВІйобасветиит хро. дис й Мал ві ві. (1996У сь) 3ЗАЛАСЧААОАСЛІААЦАССОСАЦАІ Січі пілобуйсь Пра щ-- Есилкя ес аг. (1998) звід 0 ЗоТКТТАОСАТКСІСТОТТТОСАЗ ГаподавійноЕьютсвевяю ОС Нагтитей а ві. (1999)Probe Sequence Mixture Temperature Reference s 0 5 ССААТАTOPОБОЛЕСТТУ Vssivgoidekh гри. ss isodezyk m di (1995) vihib4 v'SKTOOVOSATTASSASSSU VIyobasvetiit hro. dis and Mal vi vi. (1996U s) 3ZALASCHAAOASLIAAATSASSOSATSAI Sichi pilobuis Pra sh-- Esilkya es ag. (1998). (1999)

РезультатиThe results

Таблиця 2Table 2

Бактерійні популяції, визначені за допомогою ЕІ5Е в іп уйто моделі кишки при використанні комерційних СО5 (Уіхіпа! (КТМ)) як субстрату в кількості 7 г на деньBacterial populations determined with the help of EI5E in the intestinal model IP using commercial CO5 (Uihipa! (KTM)) as a substrate in the amount of 7 g per day

У1 Уг УЗU1 Ug UZ

Час (дні) 1 10.5..21 1 105 21 1 105. 21Time (days) 1 10.5..21 1 105 21 1 105. 21

Усього бактерій (ор) 9,5 95 96 95 ЖД.94 Д95 Д 95 94 96Total bacteria (or) 9.5 95 96 95 ZH.94 D95 D 95 94 96

Війдобасісгійт зрр. 80 7,9 83 80 80 83 80 80 82Vojdobasisgiit zrr. 80 7.9 83 80 80 83 80 80 82

Ї астобасіШиз 5рр. 72 72 71 7070 71.70 7,0 69Y astobashi Shiz 5 years. 72 72 71 7070 71.70 7.0 69

Васіетоїдез рр. в Ви 07,5 80 82 7,5 80 81 7,9Vasietoides yr. in You 07.5 80 82 7.5 80 81 7.9

СІозцідішт вібіобуйсшп 6,8 6,9 71 69 68 70 69 68 70 (група)Siozcidisht vibiobuyshp 6.8 6.9 71 69 68 70 69 68 70 (group)

Таблиця 3Table 3

Бактерійні популяції, визначені з допомогою ЕЇ5Н в іл уйго моделі кишки при використанні синтезованих СОБ5, згідно з даним винаходом, як субстрат в кількості й І 7 г на деньBacterial populations determined with the help of EI5H in the ileum of the intestine model when using synthesized COB5, according to the present invention, as a substrate in the amount of 7 g per day

У1 У2 УЗ ЇU1 U2 UZ Y

Час (дні) 1 10,5 21 1 10,5 21 1 10,5 721Time (days) 1 10.5 21 1 10.5 21 1 10.5 721

Усього бактерій (Іов) 94 97 96 94 95 96 96 Щ95 9,5Total bacteria (Iov) 94 97 96 94 95 96 96 Sh95 9.5

Вібдобасістішт рр. В1 80 89 80 80 87 8,72 82 84Vibdobasistist year B1 80 89 80 80 87 8.72 82 84

Іастобасіи» 5рр. 74 76 76 73 73 7,5 74 7,3 73Iastobasia" 5 years 74 76 76 73 73 7.5 74 7.3 73

Васіетоідез рр. 850 852 82 850 81 81 78 78 7,Vasietoidez year 850 852 82 850 81 81 78 78 7,

СіІозіпдішт Візіоїуйсоі 6,9 70 68 68 68 67,70 70 69 (трупа)SiIozipdisht Visioiuysoi 6.9 70 68 68 68 67.70 70 69 (corpse)

ВисновокConclusion

З таблиці З видно, що 505 суміш, приготована згідно з даним винаходом, виявляла кращі пребіотичні властивості (тобто, спостерігали більш значне збільшення біфідобактерій, а також зменшення бактероїдів, ніж спостерігали для комерційного еквівалента 5О5 (дивись таблицю 2). Пребіотичний ефект був більш вираженим в посудині 1 (М11) і 2 (М2), що пояснюється тим фактом, що 505 суміш згідно з даним винаходом складається з низькомолекулярних олігосахаридів.It can be seen from Table C that the 505 mixture prepared according to the present invention showed better prebiotic properties (that is, a more significant increase in bifidobacteria was observed, as well as a decrease in Bacteroidetes, than was observed for the commercial equivalent 5O5 (see Table 2). The prebiotic effect was more pronounced in vessels 1 (M11) and 2 (M2), which is explained by the fact that the 505 mixture according to the present invention consists of low molecular weight oligosaccharides.

Приклад 4Example 4

Метод метилуванняMethylation method

Синтетичні галактоолігосахаридні продукти, отримані за способом прикладу 1, очищали гель-фільтрацією на колонці Віоде! Р2 (Рпагтасіа), проводячи елюювання водою з швидкістю Змл хв.7.Synthetic galactooligosaccharide products obtained by the method of example 1 were purified by gel filtration on a Viode column! P2 (Rpagtasia), carrying out elution with water at a speed of Zml min.7.

Положення зв'язків для відповідних галактоолігосахаридних препаратів визначали методом метилування.The position of bonds for the corresponding galactooligosaccharide preparations was determined by the methylation method.

Ліофілізовані зразки (5-бмг) диспергували в сухому диметилсульфоксиді (0ОМ5ЗО) при 202С протягом 16бгод. після продування аргоном. Зразки метилували за допомогою послідовного додання порошків гідроокису натрію (0,5г) і йодометану (4мл) (Сіисапи апа Кегек, 1984; МассСопгтіск еї а!., 1993). Після елюції-екстракції наLyophilized samples (5-bmg) were dispersed in dry dimethylsulfoxide (0OM5ZO) at 202C for 16 hours. after purging with argon. Samples were methylated by sequential addition of sodium hydroxide (0.5 g) and iodomethane (4 ml) powders (Siisapi apa Kegek, 1984; MassSopgtisk ei a!., 1993). After elution-extraction on

С18-зв'язаному картриджі ІзЗер-Рак, УмМаїег5, МУанога, ОКІ| метиловані вуглеводи сушили, екстрагували сумішшю СНеСІзЗ/СНЗОН (11, об./о6.) і упарювали досуха. Зразки гідролізували за допомогою трифтороцтової кислоти ІВіакепеу еї а!Ї., 1983| і перетворювали в частково метиловані алдитолацетати (РМАА5) шляхом відновлення за допомогою МавоОх і ацетилування оцтовим ангідридом і М-метилімідазолом (АЇІрегспеїт еї аї., 1967).C18-linked cartridge Izzer-Rak, UmMaieg5, MUanoga, OKI| methylated carbohydrates were dried, extracted with a mixture of СНеСИзЗ/СНЗОН (11, vol./о6.) and evaporated to dryness. The samples were hydrolyzed with the help of trifluoroacetic acid IViacepeu ei a!Yi., 1983| and converted into partially methylated alditol acetates (PMAA5) by reduction with MavoOx and acetylation with acetic anhydride and M-methylimidazole (АЙИрегспейт ей ай., 1967).

РМАА5 аналізували за допомогою ГХ на колонці з поперечно-зв'язаним носієм 5095 ціанопропілметил-509о фенілметилполісилоксаном (Ппате5 СПготаїодгарпу, Маіїдеппеад, КІ, використовуючи полум'яно- іонізаційний детектор і температурну програму: 552С (2хв.), 452С хв." (1,9хв.), 14090 (2 хв.), 220 хв." (3Бхв.), 21020 (4.0хв.). РМАА5 ідентифікували шляхом вимірювання їх часу втримання відносно міо- інозитолгексаацетату і порівняння відносного часу втримання з часом втримання зовнішніх стандартів. Суміш стандартів для кожного цукру готували шляхом цільового метилування метилглікозидів (Осагез еї аї, 19911.PMAA5 was analyzed by GC on a column with cross-linked carrier 5095 cyanopropylmethyl-509o phenylmethylpolysiloxane (Ppate5 SPgothaiodgarpu, Mayideppead, KI, using a flame ionization detector and temperature program: 552С (2 min.), 452С min. (1 , 9 min.), 14090 (2 min.), 220 min. (3Bmin.), 21020 (4.0 min.). PMAA5 were identified by measuring their retention time relative to myo-inositol hexaacetate and comparing the relative retention time with the retention time of external standards. A mixture of standards for each sugar was prepared by targeted methylation of methylglycosides (Osagez et al., 19911.

Площі піків були представлені як відносні молярні кількості, використовуючи фактори ефективності відповідей вуглеводнів ІЗугеєї еї аї., 19751|.The peak areas were presented as relative molar amounts using the response efficiency factors of hydrocarbons IZugeei ei ai., 19751|.

Ідентичності РМААЗ5 були підтверджені їх електронно-іонізаційними мас-спектрами ІСагріга апа 5піа, 19891.The identities of RMAAZ5 were confirmed by their electron ionization mass spectra ISagrig apa 5pia, 19891.

Аналіз ГХ-МС виконували на ідентичному ГХ в серії з мас-спектрометром Різоп5 Апаїуїса! Тгіо ІБ, використовуючи температуру джерела 2002 і потенціал іонізації 7бев.GC-MS analysis was performed on an identical GC in series with a Rizop5 mass spectrometer of Apaiuis! Tgio IB, using a source temperature of 2002 and an ionization potential of 7 bev.

Для того, щоб визначити аномерну конфігурацію продукту синтезу, олігосахариди обробляли с- галактозидазою і р-галактозидазою (Меїїріазе; Зідта) при оптимальних умовах протягом ЗОхв. Продукти реакції аналізували за допомогою ВЕРХ.In order to determine the anomeric configuration of the synthesis product, the oligosaccharides were treated with c-galactosidase and p-galactosidase (Meiriase; Zidt) under optimal conditions for 30 minutes. The reaction products were analyzed by HPLC.

РезультатиThe results

Виходячи з описаного вище аналізу, була встановлена структура олігосахаридів, яка була для тетрасахаридної фракції Са(р1-6)-Сса(Ц(р1-6)-са(рі-4)-Сіс, трисахаридної фракції Сак(р1і-6)-са|(рт-4)-сіс;Based on the analysis described above, the structure of oligosaccharides was established, which was for the tetrasaccharide fraction Са(р1-6)-Сса(Ц(р1-6)-са(при-4)-Сис, for the trisaccharide fraction Сак(п1и-6)- sa|(rt-4)-sis;

Са(р1і1-3)-Са|(р1-4)-Сіс і дисахаридної фракції Са(р1-4)-Сіс (субстрат лактоза); Са|(р1-3)-Сіс; Са!ц(81-3)-саї;Ca(p1-1-3)-Ca|(p1-4)-Cys and disaccharide fraction Ca(p1-4)-Cys (lactose substrate); Ca|(p1-3)-Cys; Sa!ts(81-3)-sai;

Сац(р1-6)-Саї; СаМої1-6)-Саї! (галабіоза). баї!: галактоза, біс: глюкозаSats(p1-6)-Sai; SaMoi1-6)-Sai! (galabiosis). bai!: galactose, bis: glucose

Посилання: 1. АіІрегеНеїт Р.О., 0.9. Меміпв, Р.О. ЕподіївН апа А. Каїт. 1967. А теїпоа юг Ше апаїузіз ої зидагз оп ріапі сеїІ-маїЇ роїзузасспатіадез Бу давз-іїдиіа спготайодгарну. Сапопуаг Нез 5: 340-345. 2. Віакепеу А.В., Р.у. Наїтіз, В.3. Непгу апа В.А. 5іопе. 1983. А вітріє апа гаріа ргерагайоп ої аїдію! асеїасез г топозасспагіде апаїузіз. Сагропуаг Невз 113: 291-299.References: 1. AiIregeNeit RO, 0.9. Memipv, R.O. EpodiivN apa A. Kait. 1967. A teipoa yug She apaiuziz oi zidagz op riapi seiI-maiY roizasspatiadez Bu davz-iidiia spgotayodgarnu. Sapopuag Nez 5: 340-345. 2. Viakepeu A.V., R.u. Naitiz, V.3. Nepgu apa V.A. 5 iope. 1983. A vitrie apa garia rgeragayop oi aidiyu! aseiasez g topozasspagide apaiuziz. Sagropuag Nevs 113: 291-299.

З. Сагтріа М.С. апа Е.М. 5піа. 1989. Ііпкаде взігисіште ої сагропуйгаєз Бу да5 спготайдгарпу-тавзв5 зресігозсору (4С-М5) г рапіапйу теїНуїатеа апа! асеїагев, р.157-216. Іп Су. Віепптапп апа а.О0. Меаіппіз (єд.),Z. Sagtria M.S. apa E.M. 5 pia. 1989. Iipkade vzygisishte oi sagropuygaez Bu da5 spgotaidgarpu-tavzv5 zresigozsoru (4C-M5) g rapiapyu teiNuiatea apa! Aseyagev, pp. 157-216. Ip Su. Viepptapp apa a.O0. Meaippis (unit),

Апа/їувзіз ої сагпропуагаїйез Бу давз-їїдиїа спготаїодгарну апа таз зресігозсору. САС Ргезв Воса Найп, Ріа. 4. Сіисапи ГІ. апа КЕ. Кегек. 1984. А зітріє апа гарій тейїйоа юг їпе регтеїпуїайоп ої сагбопуагаїез. СагропуагApa/iuvziz oi sagpropuagaiiez Bu davz-iidiya spgotaiodgarnu apa taz zresigozsoru. SAS Rgezv Vosa Naip, Ria. 4. Siysap GI. apa KE. Kegek 1984. A zitriye apa garii teyiyoa yug ipe regteipuiaiop oi sagbopuagaieez. Sagropuag

Вез 131: 209-217. 5. Осагев 5.Н., Р. АІрегзпеїт апа А.а. ВагміїІ. 1991. Ап ітргомед теїной юг їйе ргерагайоп ої зіапдагав гVez 131: 209-217. 5. Osagev 5.N., R. AIregzpeit apa A.a. VaghmiiI. 1991. Ap itrgomed teinoy yug yye rgeragayop oi ziapdagav g

Ше діусозуї!-ІпКаде апаїузіз ої сотрієх сагропуагайгез. Сагропуаг Нез 210: 311-317. 6. МасСогтіск С.А., У.Е. Наїіз, А. Р. Сиппіпд апа М.уУ. Могтів5. 1993. Спагасіегілайоп ої а мапйапі ої роїузасспагіде асеїап ргодисейд ру а тшїап ої Асеїобасієг хуїїпитвігаіп СА 1/4. У Аррі Васіеєпої! 74: 196-199. 7. Змееї О.Р., А. ЗПпарігюо апа Р. АЇІрегеПпеїйт. 1975. Оцапійайме апаїузізв Бу мапйоив СІ С гезропве-6тасіогShe diusozui!-IpKade apaiuziz oi sotrieh sagropuagaygez. Sagropuag Nez 210: 311-317. 6. MasSogtisk S.A., U.E. Naiiz, A. R. Sippipd apa M.uU. Could 5 1993. Spagasiegilaiop oi a mapyapi oi roiiuzasspagide aseiap rgosideyd ru a tshiap oi Aseiobasieg huiiipitvigaip SA 1/4. In Arri Vasieepoi! 74: 196-199. 7. Zmeei O.R., A. ZPpariguo apa R. AIIregePpeiit. 1975. Otsapiyaime apaiuzizv Bu mapyoiv SI S gezropve-6tasiog

Шеопез юг рапіанпу теїпуїасеа апа рагіаїйу екпуїайгеа аїдію! асеїагез. Сагропуаг Нез 40: 217-225.Sheopez yug rapianpu teipuiasea apa ragiaiyu ekpuiaigea aidiyu! aseiages Sagropuag Nez 40: 217-225.

Приклад 5Example 5

Матеріали і методиMaterials and methods

Клітинна лінія НТ29 була отримана з Європейської колекції культур клітин для прикладної мікробіології і дослідження. Лінії клітин культивували при 377С в зволоженій 5906 СО» в стандартному середовищі, що включає в себе модифіковане по Дульбекко середовище Ігла (ОМЕМ) з високим вмістом глюкози, доповнене 595 (о06./06.) телячою фетальною сироваткою (ЕВ5), 100мМ пеніциліном, 0,1М стрептоміцином, неістотними амінокислотами (МЕААХ100) і 200мММ ос-глутаміном. Клітини забезпечували харчуванням шляхом зміни середовища кожні 48 годин і пасирували доти, поки клітини не досягали конфлюентного стану.The HT29 cell line was obtained from the European Collection of Cell Cultures for Applied Microbiology and Research. Cell lines were cultured at 377C in humidified 5906 CO" in a standard medium, which includes Dulbecco's modified Eagle's medium (OMEM) with a high glucose content, supplemented with 595 (o06./06.) fetal calf serum (EB5), 100 mM penicillin, 0.1 M streptomycin, non-essential amino acids (MEAAH100) and 200 mM os-glutamine. Cells were fed by changing the medium every 48 hours and passaged until the cells reached a confluent state.

Аналіз чутливості до олігосахаридівAnalysis of sensitivity to oligosaccharides

Сироваткове стандартне середовище (195 об./06б.), доповнене різними концентраціями олігосахаридів (0,01, 01, 1, 10, 100мМ), використовували для аналізу чутливості до олігосахаридів по методу ОІапо-Мапіп єї а!., 2003. Клітини «підживлювали» експериментальним середовищем (що містить цікавлячий олігосахарид) щодня, і вимірювання прилипаючих клітин здійснювали шляхом видалення експериментальних середовищ і промивання клітин фізіологічним розчином без Са", забуференим фосфатом (рН 7, 9,вгл"). Потім прилиплі клітини трипсинізували і нейтралізували рівним об'ємом сироваткового стандартного середовища. Клітинну суспензію розбавляли в Ізоїоп ІЇ, і клітини підраховували на лічильнику Сошнег Сошпіег. Міру виживання клітин, виражену в процентах, розраховували таким чином (Фіг.1)Serum standard medium (195 vol./06b.), supplemented with different concentrations of oligosaccharides (0.01, 01, 1, 10, 100 mM), was used to analyze the sensitivity to oligosaccharides according to the method of Oiapo-Mapipei a!., 2003. Cells " fed" with the experimental medium (containing the oligosaccharide of interest) daily, and the measurement of adherent cells was performed by removing the experimental media and washing the cells with Ca-free, phosphate-buffered saline (pH 7.9, vgl"). Then the adherent cells were trypsinized and neutralized with an equal volume of serum standard medium. The cell suspension was diluted in Isohyop II, and the cells were counted in a Soshneg Soshpieg counter. The rate of cell survival, expressed as a percentage, was calculated as follows (Fig. 1)

Уо виживання - (середнє поглинання оброблених клітин/середнє поглинання контролю) х 100Uo survival - (mean absorbance of treated cells/mean absorbance of control) x 100

Аналіз адгезіїAdhesion analysis

НТтТ29 клітини вирощували в 12-ямкових планшетах для культури тканини до стану 29095 конфлюентності за допомогою стандартного середовища. Для останнього до виконання аналізу живлення клітин використовували середовище без антибіотика.HTtT29 cells were grown in 12-well plates for tissue culture to a state of 29095 confluency using standard medium. For the latter, an antibiotic-free medium was used prior to performing the cell feeding assay.

Патогени вирощували в анаеробних умовах в культуральному середовищі без антибіотика протягом, принаймні, трьох пересівань. У день аналізу свіже заздалегідь відновлене середовище для культури тканини засівали 1095 патогенною культурою, вирощеною протягом ночі, і інкубували протягом 4год. до аналізу.Pathogens were grown in anaerobic conditions in a culture medium without antibiotics for at least three transplants. On the day of analysis, fresh pre-reconstituted medium for tissue culture was inoculated with 1095 pathogen culture grown overnight and incubated for 4 hours. to the analysis.

Основний розчин випробуваних олігосахаридів готували при концентрації 5М в забуференому фосфатом фізіологічному розчині і піддавали стерилізації фільтруванням.The basic solution of the tested oligosaccharides was prepared at a concentration of 5M in a phosphate-buffered saline solution and sterilized by filtration.

Розбавлення 1/1000 патогенної культури, інкубованої протягом 4год., здійснювали в РВ5Б, і число клітин оцінювали шляхом підрахунку планшетів. Середовище видаляли з планшетів для культури тканини, і клітини промивали один раз в РВ5 (мл).A 1/1000 dilution of the pathogenic culture, incubated for 4 hours, was carried out in РВ5B, and the number of cells was estimated by counting plates. The medium was removed from the tissue culture plates and the cells were washed once in PB5 (ml).

Для кожного досліджуваного олігосахариду О0,5мл розчину олігосахариду (5М) додавали до трьох ямок.For each studied oligosaccharide, 0.5 ml of oligosaccharide solution (5M) was added to three wells.

Забуферений фосфатом фізіологічний розчин (РВ5) без якого-небудь олігосахариду включали як контроль.Phosphate-buffered saline (PB5) without any oligosaccharide was included as a control.

Суспензію культури 0,5мл додавали до всієї ямки, планшет струшували і інкубували в аеробних умовах при 372С протягом 2год.A culture suspension of 0.5 ml was added to the entire well, the tablet was shaken and incubated under aerobic conditions at 372C for 2 hours.

Культуру видаляли, і всі ямки промивали три рази в стерильному РВ5 (мл на ямку). Після кінцевого промивання РВ5 видаляли, і 7О0мкл розчину трипсин/ЕОТА додавали до кожної ямки, перемішували і залишали протягом 5 хвилин при 3770.The culture was removed and all wells were washed three times in sterile PB5 (ml per well). After the final wash, PB5 was removed, and 700 μl of trypsin/EOTA solution was added to each well, mixed, and left for 5 minutes at 3770.

На ямку додавали їмл РВ5 і піпеткою перемішували для того, щоб пересвідчитися, що всі клітини видалені з дна ямки і злиплі грудки розбиті.IML PB5 was added to the well and mixed with a pipette in order to make sure that all the cells were removed from the bottom of the well and the stuck lumps were broken.

Клітинну суспензію в кількості тїмл за допомогою піпетки вміщували в універсальний бутель МКЕО (Махітит Кесомегу Ойнеп!і) і далі розводили як призначено. Розведені суспензії вміщували на агарові пластини для рахунку (РСА) і інкубували при 37"С протягом 24год.The cell suspension in the amount of thiml was placed in a universal MKEO bottle (Mahitit Kesomegu Oinep!i) using a pipette and further diluted as prescribed. Diluted suspensions were placed on counting agar plates (PCA) and incubated at 37"C for 24 hours.

Після інкубації колонії підраховували і інгібування адгезії розраховували як відношення бактерій (КУО мл" 1), присутніх в зразку, до контролю (РВБ) (Фіг.2).After incubation, the colonies were counted and adhesion inhibition was calculated as the ratio of bacteria (CFU ml" 1) present in the sample to the control (RVB) (Fig. 2).

ВисновокConclusion

Результати, представлені на Фіг.2, вказують на значне інгібування адгезії Е.соїї ЕРЕС і 5. їурпітигійт в присутності фракції дисахаридів, причому вказане інгібування також властиве суміші 505. Менший анти- адгезивний ефект спостерігається в присутності фракції більш високої, ніж трисахарид (три) в суміші, проти за4урпітигішт.The results presented in Fig. 2 indicate a significant inhibition of the adhesion of E. soybean ERES and 5. urpitigiit in the presence of the fraction of disaccharides, and the specified inhibition is also characteristic of the mixture 505. A smaller anti-adhesive effect is observed in the presence of a fraction higher than the trisaccharide (three ) in a mixture, against za4urpitigisht.

Аналіз чутливості до олігосахаридів здійснювали для того, щоб пересвідчитися в тому, що олігосахаридна суміш не є токсичною по відношенню до клітин НТ29 (фіг.1).Analysis of sensitivity to oligosaccharides was carried out in order to make sure that the oligosaccharide mixture is not toxic in relation to HT29 cells (Fig.1).

Посилання:Link:

Оіапо-Мапіп Е., УМіШате М.А., сірзоп С.А8., Навіа! А.А. 2003 Ресіїп5 апа ресііс-оїїдозасснагідез іпніріїOiapo-Mapip E., UMiShate M.A., Sirzop S.A8., Navia! A.A. 2003 Resiip5 apa resiis-oiidozassnahidez ipniria

Езспепсніа соїї 0157: Н7 5Ніда Ююхіп аз аїгесієд юмжмагавз те питап соіопіс сеї! їпе НТ29. РЕМ5 Місгобіо! І ецетгв 218 (1): 101-105.Ezspepsnia soii 0157: H7 5Nida Yuyuhip az aigesied yumzhmagavs te pitap soiopis sei! Ipe NT29. REM5 Misgobio! I etsetgv 218 (1): 101-105.

Фіг.1. Виживаність клітин, на які впливали доданням різних концентрацій олігосахаридів (0,01-100МмМ), після 24 і 48год. інкубації.Fig.1. The survival of cells affected by the addition of different concentrations of oligosaccharides (0.01-100 mM) after 24 and 48 hours. incubation

Ффіг2. Вплив суміші олігосахаридів (всіх) і різних фракцій суміші на адгезію Е.соїї ЕРЕС, Е.соїї МТЕС і заітопеїйа їурпітигішт до клітин НТ29.Fig. 2. The effect of a mixture of oligosaccharides (all) and different fractions of the mixture on the adhesion of E. soya ERES, E. soya MTES and zytopeia yurpitigist to HT29 cells.

Приклад 6Example 6

Продукт 505, що використовується в даному експерименті, був зроблений, як описано раніше (приклад 1), і інулін був отриманий від Огаїйй| (ВеїІдіит).Product 505 used in this experiment was made as previously described (Example 1), and inulin was obtained from Ohio. (VeiIdiit).

Сорок невихолощених поросят, відлучених від матки, придбавали від 95. Сепеїїсз ЦЯ, Зошприт, Огітенїа,Forty non-castrated piglets, weaned, were purchased from 95. Sepeiysz Tsya, Zosprit, Ohitenia,

МУогкзпіге. 025 9ЕО.MUogkzpige. 025 9EO.

Після прибуття в Редінгський університет поросят вміщували в чотири групи по десять поросят протягом періоду сім днів, щоб дати поросятам час заспокоїтися після транспортування і звикнути до секції і харчування. Середня вага поросят при доставці була 14,7Окг.On arrival at the University of Reading, the piglets were housed in four groups of ten piglets for a period of seven days to allow the piglets time to settle after transport and to become accustomed to the section and feeding. The average weight of piglets at delivery was 14.7 kg.

Після семиденного періоду звикання поросят переміщували в індивідуальні невеликі загороди, в одній і тій же секції. Середня вага поросят при утриманні в індивідуальній загороді була 17,46кг.After a seven-day habituation period, the piglets were moved to individual small enclosures in the same section. The average weight of piglets when kept in an individual fence was 17.46 kg.

Поросят ідентифікували за допомогою унікального татуювання на вухах, їх також індивідуально нумерували, використовуючи водостійкий маркер. Кожну індивідуальну загороду нумерували таким же ідентифікаційним номером, який використали, щоб позначити кожне поросятко.The piglets were identified with a unique ear tattoo and individually numbered using a waterproof marker. Each individual pen was numbered with the same identification number used to identify each piglet.

Десяти поросятам встановлювали одну з чотирьох дієт, контрольну дієту (МЕС), дієту з доданням до контрольної дієти 1,695 (мас/мас.) 505, отриманих способом прикладу 1, дієту з доданням до контрольної дієти 495 (мас/мас.) 505 або дієту з доданням до контрольної дієти 1,695 (мас/мас.) інуліну.Ten piglets were given one of four diets, a control diet (MES), a diet supplemented with 1.695 (w/w) 505 prepared by the method of Example 1, a diet supplemented with 495 (w/w) 505, or with the addition of 1.695 (w/w) inulin to the control diet.

Поросятам підстилали тирсу протягом всього дослідження, крім того, забезпечували соломою для поліпшення навколишнього оточення, а також були іграшки, щоб сприяти ослабленню апатії.Piglets were littered with sawdust throughout the study, and were also provided with straw to improve the environment and toys to help reduce apathy.

Протягом всього дослідження поросята отримували гранули ОеМКажеап 15 МОР (АВМ, АВМ Ноизе, РО Вох 250, Оцпаіе ка, Ууосазіоп, Регегрогопдп. РЕ ЗОРЕ), повнораціонний комбікорм, яким годували ад-ірнит для зростання поросят.During the entire study, the piglets received OeMkazheap 15 MOR pellets (AVM, AVM Noize, RO Vokh 250, Otspaieka, Uuosaziop, Regegrogopdp. RE ZORE), complete ration compound feed, which was fed ad-irnit for the growth of piglets.

Поживний/мінеральний склад Пенахезп 15 МОРNutrient/mineral composition of Penakhezp 15 MOR

Поживна речовина ВключенняNutrient Inclusion

Масло Й І 3,390Oil Y I 3,390

Білок 19,25Protein 19,25

Волокно 2,890Fiber 2,890

Зола 4,890Ash 4,890

Волога 13,80Moisture 13.80

Вітамін А 9500 МО/кгVitamin A 9500 IU/kg

Вітамін Е, альфа токоферол 100 Мо/кгVitamin E, alpha tocopherol 100 Mo/kg

Вітамін ОЗ 1850 Мо/кгVitamin OZ 1850 Mo/kg

Селен, селеніт натрію 0,30 мг/кгSelenium, sodium selenite 0.30 mg/kg

Лізин 1,3295Lysine 1.3295

Мідь, сірнокисла мідь 170 мг/кгCopper, copper sulphide 170 mg/kg

Їжа поросят також містила дозволені антиоксиданти, бутильований гідроксіанізол (ВНА), бутильований гідрокситолуол (ВНТ) і етоксихін.Piglet food also contained the permitted antioxidants, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), and ethoxyquin.

Поросят розміщували довільно для обробки, хоча двох або трьох поросят, що піддаються однаковій харчовій обробці, індивідуально вміщували на один і той же майданчик групової загороди. Поросят групували таким шляхом, щоб уникнути змішування обробок, на випадок, якщо вони вибігали з індивідуальної загороди, тобто могли їсти тільки їжу, призначену для відповідної харчової обробки такого окремого поросятка.Piglets were placed randomly for treatment, although two or three piglets exposed to the same food treatment were individually placed in the same area of the group pen. Piglets were grouped in such a way as to avoid mixing of treatments in case they ran out of an individual pen, i.e. they could only eat the food intended for the respective food treatment of that individual piglet.

Індивідуально вміщених поросят, в групах з двох або трьох, при однаковій обробці, розміщували довільно по всьому відсіку.Individually placed piglets, in groups of two or three, with the same treatment, were randomly placed throughout the compartment.

Фекальні зразки збирали від кожного поросятка на початку дієти і після чотирьох тижнів утримання на випробуваній дієті, і фекальні мікробні популяції визначали методом РІЗН (таблиця 4), як описано раніше (приклад 3). У кінці експерименту поросят забивали для отримання зразків вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки. Величини рН (таблиця 5), коротколанцюжкові жирні кислоти (ЗСЕА) (таблиця 6) і мікробні популяції (таблиця 7) визначали у вмісті проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки. Дані представлені як середні значення ж стандартне відхилення (50). Відмінності аналізували за допомогою 1- критерію Стьюдента. Відмінності вважали значними при Р«е0,05.Faecal samples were collected from each piglet at the start of the diet and after four weeks of maintenance on the test diet, and the faecal microbial populations were determined by the RISN method (Table 4) as described previously (Example 3). At the end of the experiment, the piglets were slaughtered to obtain samples of the contents of the proximal and distal segments of the colon. Values of pH (table 5), short-chain fatty acids (SCFA) (table 6) and microbial populations (table 7) were determined in the contents of the proximal and distal segments of the large intestine. Data are presented as mean values and standard deviation (50). Differences were analyzed using Student's 1-test. Differences were considered significant at P<0.05.

І Таблиця 4And Table 4

Вплив обробки пребіотиками і дієти на міхробну популяцію в фекаліях поросят на початку і після чотирьох тижнів експериментального періодуEffect of treatment with prebiotics and diet on the microbial population in the feces of piglets at the beginning and after four weeks of the experimental period

Час 05 Час 4 тижні тваА ТО топа а СО Талія 000Time 05 Time 4 weeks tvaA TO topa and SO Waist 000

МЕС 169505 495005 ТнулінMES 169505 495005 Tnulin

Усього бактерій 8,75-0,22 8,97-0,24 8,99-0,23 8,9720,28 8,955-0,28Total bacteria 8.75-0.22 8.97-0.24 8.99-0.23 8.9720.28 8.955-0.28

Війдобасієгійт 5рр. 6,48-0,29 6,910,252 7,070,237 7,34--0,2179 7,45н0 аюVijdobasiegiit 5 years. 6.48-0.29 6.910.252 7.070.237 7.34--0.2179 7.45n0 ayu

Гасіобасіййе рр. 6,33--0,25 6,55-0,23 6,93-0,162 7,1750,249ч9 б,о4н0обHasiobassiye year 6.33--0.25 6.55-0.23 6.93-0.162 7.1750.249х9 b,о4н0об

Васіегоїідев 5рр. 7,27-0,23 7,7550,249 7,84ь0,272 7,85-0,222 8 0дьО0 187Vasiegoiidev 5yr. 7.27-0.23 7.7550.249 7.84х0.272 7.85-0.222 8 0хО0 187

СіІозіпдіт 7,43-0,33 8,040,242 8,1450,252 83350282 82250237 візою уйсит (група)SiIosipdit 7.43-0.33 8,040,242 8,1450,252 83350282 82250237 visa Uysit (group)

КУО Іордуо/г фекалій; кожна величина є середньою ж 50), ж п-йО, ! п-10; відмінності аналізували за допомогою г-критерію Стьюдента.CFU Iorduo/g feces; each value is the average of 50), and n-jO, ! n-10; differences were analyzed using Student's g-test.

Середні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Р-0,05) 7 відAverage values in the series with superscripts differed significantly (Р-0.05) 7 from

МЕС," відСО5 1,695, 7 від часу 0.МЕС," from СО5 1.695, 7 from time 0.

Таблиця 5Table 5

Вплив обробки пребіотиками і дієти на рН зразків вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кишкиEffect of treatment with prebiotics and diet on the pH of samples of the contents of the proximal and distal segments of the large intestine

МЕС 169005 45605 інулін ---5-И5.УИИШВШ ТТН ДАТА а Б АНЯМЕС 169005 45605 inulin ---5-Й5.УЙИШВШ TTN DATE a B ANYA

Проксим. сегмент товстої кишки 5,71--0,16 5,65530,11 5,9-0,14772 5,9050,27Proxim. colon segment 5.71--0.16 5.65530.11 5.9-0.14772 5.9050.27

Дистал. сегмент товстої кишки 7,163-0,04 7,16-50,03 7,16550,04 7,1250,02Distal. colon segment 7.163-0.04 7.16-50.03 7.16550.04 7.1250.02

Кожна величина являє собою середнє значення ж 50), п-10, Відмінності аналізували за допомогою (-критерію Стьюдента. Середні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Р«0,05) " від МЕС, " від 505 1,695, 7 від інуліну.Each value represents the average value of the same 50), n-10. Differences were analyzed using (-Student's test. The average values in the series with superscripts differed significantly (Р«0.05) " from MES, " from 505 1.695, 7 from inulin

Й Таблиця 5And Table 5

Вплив обробки пребіотиками і дієти на концентрації" ЗСЕА в зразках вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кишкиEffect of treatment with prebiotics and diet on the concentration of "ZCEA" in the samples of the contents of the proximal and distal segments of the large intestine

Пр оксимальний сегмент товстої кишки. но 1 Дистальний сегмент товстої кишкиProximal segment of the colon. but 1 Distal segment of the large intestine

МБО 0000 БббО5 49605 інулін ГоОоМЕо робо 00605 ІнулінMBO 0000 BbbO5 49605 inulin GoOoMEo robo 00605 Inulin

Молочна кислота 2,62-0,73 6бокі,б7а дано золі Ма Мо че МОLactic acid 2.62-0.73 6boki,b7a given ash Ma Mo che MO

Онтова кислота 4143653 444581 515768 44585331 31,015,50 30,6822,32 33,5752,21 ЗВ, 5аЖЗоВеOnthic acid 4143653 444581 515768 44585331 31.015.50 30.6822.32 33.5752.21 ZV, 5аЖЗоВе

Пропіонова кислота. 35,58ж5,1 27,522,87 32.9948,39. 3063361 |15,365346 15275192 16754388 1736516Propionic acid. 35.58x5.1 27.522.87 32.9948.39. 3063361 |15.365346 15275192 16754388 1736516

Масляна киснота 10,515:1,42 10,5751,56 1195324 1,563 бо | ія я 051309 каButyric acid 10.515:1.42 10.5751.56 1195324 1.563 bo | iia i 051309 ka

Кожна величина являє собою середнє значення ЖІ), и10. Відмінкості аналізували за допомогою. ї«критерію Стеюдента,Each value represents the average value of Ж), and 10. Differences were analyzed using i"Student's criterion,

Сереяні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Р«0505)" від МЕС, є від 605 1,65, від інуліну. МІХ не визначали;" мкмоль/г в розрахунку на вологий матерів; ІSerial values in the series with superscripts differed significantly (P"0505)" from MES, from 605 1.65, from inulin. MIC was not determined;" μmol/g in the calculation of wet mothers; AND

Таблиця 7Table 7

Впилив обробки пребіотиками і дієти на мікробну популяцію в зразках вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кнІнКи ІThe effect of treatment with prebiotics and diet on the microbial population in the samples of the contents of the proximal and distal segments of the thick colon I

Проксимальний сегмент товстої киткно 00000000 дистальний сегмент товстої кишки 33Proximal colon segment 00000000 distal colon segment 33

МБ 166005 Жо0О5 0 інулін (00 МБО 01666085 46605 інулінMB 166005 Жо0О5 0 inulin (00 MBO 01666085 46605 inulin

Усвого бактерій: 5бінвоЯ 85685022, 8еюві ооо 1 83028 0 БОДІ 880-025 855020,29All bacteria: 5binvoYa 85685022, 8eyuvi ooo 1 83028 0 BODI 880-025 855020.29

Війбобасістіштовро. 70133025 7308026 77026 7ать)3о 0 7035095 т0О5206 Тато 75ВЕОДоVijbobassististovro. 70133025 7308026 77026 7ат)3о 0 7035095 т0О5206 Dad 75ВЕОДо

Тастобасіа5 рр. 64023 77026 738,4" 7194024 ) 66003 боб 7Иибио35" 7055030Tastobasia 5 years 64023 77026 738.4" 7194024 ) 66003 bob 7Iybio35" 7055030

КУСМор /гз урахуванням вологи: кожна величина є серединою 5, пе 10; відмінності аналізували за допомогою критеріюKUSMor / gz taking into account moisture: each value is the middle of 5, pe 10; differences were analyzed using the criterion

Стеюдента. Середні значення в ряду з верхніми індексами значно відрізнялися (Ре 0053" від МЕС, 5 від 6О5 1,655, с від інуліву.a student Average values in the series with superscripts differed significantly (Ре 0053" from МЕС, 5 from 6О5 1.655, с from inuliv.

ВисновокConclusion

Таблиця 5: спостерігається зниження рН в проксимальних сегментах кишки в присутності СО5 (для 1,695 і особливо для 490), що в поєднанні з даними 5СЕА (таблиця 6) свідчить про те, що продукт 5О5 досягає проксимальних частин кишки (продукти бродіння підвищені).Table 5: there is a decrease in pH in the proximal segments of the intestine in the presence of CO5 (for 1.695 and especially for 490), which, in combination with the 5SEA data (table 6), indicates that the product 5O5 reaches the proximal parts of the intestine (fermentation products are increased).

Таблиця 7: в присутності СО5 (4905) спостерігається значне збільшення в числі популяцій благотворних бактерій (біфідобактерії, молочнокислі бактерії) в проксимальних частинах кишки. Вказане збільшення числа популяцій нижче в дистальній частині і в фекальних зразках що можна пояснити тим фактом, що продукт бО5, мабуть, зазнає бродіння, головним чином, в проксимальній частині кишки. Результати обробки 1,695 бО5 показали подібну тенденцію.Table 7: in the presence of CO5 (4905), there is a significant increase in the number of populations of beneficial bacteria (bifidobacteria, lactic acid bacteria) in the proximal parts of the intestine. The specified increase in the number of populations is lower in the distal part and in fecal samples, which can be explained by the fact that the product bO5 apparently undergoes fermentation, mainly in the proximal part of the intestine. The results of processing 1.695 bO5 showed a similar trend.

У проксимальних сегментах кишки збільшення числа популяції біфідобактерій можна спостерігати, а також збільшення продукції оцтової кислоти (головний продукт бродіння біфідобактерій). На основі отриманих даних вважають, що продукт 5О5 є вельми виборчим відносно видів біфідобактерій.In the proximal segments of the intestine, an increase in the population of bifidobacteria can be observed, as well as an increase in the production of acetic acid (the main product of bifidobacteria fermentation). Based on the obtained data, it is believed that the 5O5 product is very selective for bifidobacteria species.

Приклад 7Example 7

Вивчення окремих випадківStudy of individual cases

Вивчення випадку 1 - Запальне кишкове захворювання (ІВО)Case Study 1 - Inflammatory Bowel Disease (IBD)

Наводиться випадок з 43-річною хворою жінкою з діагнозом виразковий коліт (одна з основних форм ІВО), яка піддавалася лікуванню продуктом 505, приготованим за способом прикладу 1.The case of a 43-year-old female patient with a diagnosis of ulcerative colitis (one of the main forms of IVI) is presented, who was treated with product 505, prepared according to the method of example 1.

Хвора страждала від виразкового коліту протягом 5 років і не приймала лікування до і протягом періоду досліджень. Протизапальний засіб сульфасалазин використовували раніше, але без позитивного ефекту.The patient suffered from ulcerative colitis for 5 years and did not receive treatment before and during the study period. The anti-inflammatory drug sulfasalazine was used earlier, but without a positive effect.

Хвора мала ускладнення в травленні їжі, була на стандартній дієті, страждала від нудоти, діареї і болів в животі. Біль був в лівому боці товстої кишки, що корелювало з діагнозом коліт на основі запалення низхідної ободової кишки.The patient had complications in digesting food, was on a standard diet, suffered from nausea, diarrhea and abdominal pain. The pain was in the left side of the colon, which correlated with a diagnosis of colitis based on inflammation of the descending colon.

Загальна добова доза СО5 7г/день (в 2 роздільні дози) була вжита. Протягом 4 днів прийому симптоми почали слабшати. Хвора могла краще перетравлювати їжу, кишкові болі почали відступати, і нудота поменшала. Клінічного аналізу за допомогою ендоскопії зроблено не було, але, проте, хвора переживала відчуття поліпшення здоров'я. Єдиною зміною в дієті було додання 505. Через шість тижнів цей ефект зберігався.A total daily dose of CO5 of 7g/day (in 2 separate doses) was used. Within 4 days of taking the symptoms began to weaken. The patient could digest food better, intestinal pains began to recede, and nausea decreased. Clinical analysis using endoscopy was not done, but, nevertheless, the patient experienced a feeling of improvement in her health. The only change in the diet was the addition of 505. After six weeks, this effect was maintained.

Хоч багаторазове дослідження на хворих не контролювали з плацебо, даний конкретний випадок представив окремий доказ позитивного ефекту пребіотика СО5 для однієї основної форми ІВО.Although the multiple patient study was not placebo-controlled, this particular case provided separate evidence of a positive effect of the CO5 prebiotic for one major form of IVI.

Вивчення випадку 2 - Синдром подразненої кишки (ІВ5)Case Study 2 - Irritable Bowel Syndrome (IB5)

Чоловік 27 років, який страждав від ІВ5 протягом З років, протягом З тижнів приймав 7г/день СО5, приготованого за способом прикладу 1, у вигляді двох роздільних доз. До цього періоду він відчував здуття живота, запор, кишковий біль і млявість. Спостерігалися класичні симптоми, асоційовані з ІВ5. Хворий не приймав антибіотики протягом 6 місяців і був на дієті без пшениці/глютену і цукру.A 27-year-old man, who suffered from IV5 for 3 years, took 7g/day of CO5, prepared according to the method of example 1, in two separate doses for 3 weeks. Before this period, he experienced bloating, constipation, intestinal pain and lethargy. Classical symptoms associated with IV5 were observed. The patient had not taken antibiotics for 6 months and was on a wheat/gluten- and sugar-free diet.

Після прийому пребіотиків спостерігали значне послаблення симптомів протягом З днів, і ефект зберігався. Суб'єкт говорить про помітне поліпшення загального стану і стану кишки, а саме: «Я тепер готовий пробігти марафон», Він приймає нормальну їжу без труднощів.After taking prebiotics, a significant reduction in symptoms was observed within 3 days, and the effect was maintained. The subject talks about a noticeable improvement in the general condition and the condition of the intestine, namely: "I am now ready to run a marathon", He takes normal food without difficulty.

Дане повідомлення не контролювалося дослідженням, але було окремим прикладом, який показує, що 6О5 можуть поліпшувати стан ІВ5 і якість життя хворого.This report was not controlled by the study, but was a separate example showing that 6O5 can improve the condition of IV5 and the patient's quality of life.

Аналіз чутливості до олігосахаридів вот - п дтрк тире от овес ти и тр тес вин Пи и ен Овна: ря Е кю вк А р кт ЕЕ и Ми и у ти НКAnalysis of sensitivity to oligosaccharides of oat - p dtrk tire ot oaves ti and tr tes wine Pi i en Aries: rya E kyu vk A r kt EE i Mi i u ti NK

ДЯ: де реє ре 0 Нв т | ГУДЯ що атиоріюй ОО БлСЯНІНЯ ситі 00 еконо ва що й пеня Бі евка ійети 0 онов юки к х-НВІ М есе ря вин евро ШІ є оре. чес кока ва БЕ вх їні жо ун ведення жи 0 Пежо ек Ви о» т ТА л Я й в У екДЯ: where ree re 0 Nv t | HUDYA that atioriyuy OO BlSIANINYA city 00 econo va what and penya Bievka iyeti 0 onov yuki k h-NVI M ese rya vyn euro AI is ore. Český koka wa BE vyhini jo un leading life 0 Peugeot ek You o» t TA l I y in U ek

В в. но на на че роя шо зіхие ся БеЯ Енея поем пев ехIn the but on the face of which BeYa Aeneas sang a poem

Е- Каг.: з, теекльеої р жвет ГЕеюити розі у фе 8 85 ше ще у Не ся тій веде еф сот ПВС саме ння шеE- Kag.: z, teekleoi r rzhvet GEeyuiti rozi u fe 8 85 she still u Ne sia tiy leads ef sot PVS same nya she

Нет; Ей Берн ГЕДевен дЕБелис МН СНІ а ше сш ще и Кия ак Бо ення НЕ Де ЩІК КЕР зн ШИН віз юь ва в: 1 о чоNo; Hey Bern Gedeven deBelis MN SNI a she ssh sce y Kiya ak Bo eney NE De SHIK KER zn SHYN vis yu va v: 1 o cho

Олігосахарид, мМ ФігOligosaccharide, mM Fig

Вплив фракцій олігосахаридів на адгезію бактерійEffect of oligosaccharide fractions on bacterial adhesion

БВ й в деп КК Я в и ДА т "в | ЕЕ ежлН й ев ВН в пн НЯBV y v dep KK I v y DA t "v | EE ezhlN y ev VN v pn NE

Гм Мол тв в ек ЕНHm Mol tv v ek EN

Е ПД ун св м ен ши но а в - Сн си в В ЕН а анE PD un sv m menshin no a v - Sn sy v V EN a an

З рр с ПО ВВ етивиют щ То я оч ква МЕТО ен Бан зорі (ЗЕ со ЕРЕС. ц «Яке пив и В М ве ощ Мештикен в оо КДВЯИІ в еКе ИеК (оз з й ск Кене АН мА пот ве т Мавки в зем а ан и І Ева ше ШЕ о шоZ rr s PO VV etiviyut sh To i och kva METO en Ban zori (ZE so ERES. ts "What pyv i V M ve oshch Meshtiken v oo KDVYAII v eKe IeK (oz z y sk Kene AN MA pot ve t Mavky v zem a an y I Eva she SHE o sho

Ю сиг ве І ее ма ке тYu sig ve I ee ma ke t

РОБ коні рюпь соб Де три зіехROB kony ryup sob Where are three yahes

Фракція олігосахаридів фігThe fraction of oligosaccharides fig