SU1694643A1 - Strain of bacteria escherichia coli - a producer of l-threonine - Google Patents

Description

Translated fromRussian

1one

(21)4334022/13(21) 4334022/13

(22)26.11.87(22) 11/26/87

(46) 30.11.91. Бюл. №44(46) 11/30/91. Bul №44

(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(71) All-Union Scientific Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms

(72)В.Г.Дебабов, Ю.И.Козлов, Е.М.Хургес, В.А.Лившиц, Н.И.Жданова, М.М.Гус ти- нер, А.К.Соколов, Т.А.Бачина, Н.К.Янковский , Ю.Д.Цыганков, А.Ю.Чистосердов, Т.Г.Плотникова, И.О.Шакалис. А.В.Беларе- ва, Р.А.Арсат нц, А.Ф.Шолин и Т.М.Поздн кова(72) V.G. Debabov, Yu.I. Kozlov, E.M. Hurges, V.A. Livshits, N.I. Zhdanova, M.M.Gus Tyner, A.K.Sokolov, T. A. Bachina, N. K. Yankovsky, Yu. D. Tsygankov, A. Yu. Chistoserdov, T. G. Plotnikova, I. O. Shakalis. A.V.Belareva, R.A. Arsat nts, A.F.Sholin and T.M.Pozdnova

(53)663.15(088.8)(53) 663.15 (088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР № 974817, кл. С 12 Р 13/08, 1981.(56) USSR Copyright Certificate No. 974817, cl. C 12 R 13/08, 1981.

Авторское свидетельство СССР № 1362021, кл. С 12 Р 13/08, 1987. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНАUSSR Author's Certificate No. 1362021, cl. C 12 P 13/08, 1987. (54) STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI - PRODUCER OF L-TREONIN

(57)Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма бактерий, продуцирующего(57) The invention relates to the microbiological industry and concerns a new strain of bacteria producing

незаменимую аминокислоту L-треонин, который примен етс  как компонент различных питательных смесей медицинского назначени , в качестве добавки в корма животных , а также как реактив дл  фармацевтической и химической промышленности. Цель изобретени  - штамм бактерий Escherichla coll ВКПМ-3996, позвол ющий получить высокий выход L-треонина в услови х большого числа генераций бактериальной культуры. Штамм содержит рекомбинантную плазмиду котора  в отличие от плазмиды pYN 7 иззестного штамма-продуцента стабильно сохран етс  при росте культуры без селективного давлени , направленного на поддержание плазмиды . Предлагаемый штамм позвол ет получать до 85 г/л L-треонина за 36 ч ферментации в лабораторных услови х. В услови х , аналогичных -промышленной ферментации по числу генераций, продуцирует до 79 г/л L-треонина за 50 ч ферментации . 3 табл.The essential amino acid is L-threonine, which is used as a component of various nutritional mixtures for medical purposes, as an additive in animal feed, and also as a reagent for the pharmaceutical and chemical industries. The purpose of the invention is the strain of Escherichla coll bacteria VKPM-3996, which allows to obtain a high yield of L-threonine under conditions of a large number of generations of bacterial culture. The strain contains a recombinant plasmid which, unlike the pYN 7 plasmid of the producer strain, is stably maintained as the culture grows without selective pressure aimed at maintaining the plasmid. The proposed strain allows up to 85 g / l of L-threonine to be obtained in 36 hours of fermentation under laboratory conditions. Under conditions similar to industrial fermentation by the number of generations, it produces up to 79 g / l of L-threonine per 50 h of fermentation. 3 tab.

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма бактерий, продуцирующего незаменимую аминокислоту L-треонин, который примен етс  как компонент различных питательных смесей медицинского назначени , в качестве добавки о корма жи- вотных, а также как реактив дл  фармацевтической и химической промышленности .The invention relates to the microbiological industry and concerns a new bacterial strain producing the essential amino acid L-threonine, which is used as a component of various nutritional mixtures for medical purposes, as an additive to animal feed, and also as a reagent for the pharmaceutical and chemical industries.

Цель изобретени  - штамм бактерий, позвол ющий получить высокий выход Lтреонинавуслови хбольшого числа генераций бактериальной культуры при отсутствии в питательной среде антибиотик1.The purpose of the invention is a bacterial strain, which allows to obtain a high yield of Threoninvial and a large number of generations of bacterial culture in the absence of antibiotic in the nutrient medium.

Новый штамм бактерий Escherichla col ВНИИгенешка-640 содержит рекомбинантную плазмиду pVIC 40, котора  в отличие от плазмиды pYN7 известного штамма-продуцента L-треонина Е.соП ВКПМ В-3420 (лабораторный номер ВНИИ- генетика ТДГ-6)стабильно сохран етс  при росте культуры без селективного давлени , направленного на поддержание плэзмиды,The new bacterial strain Escherichla col VNIIgenshka-640 contains the recombinant plasmid pVIC 40, which, unlike the pYN7 plasmid of the well-known L-threonine producer strain E. coli VKPM B-3420 (laboratory number of the VNII-Genetics TDG-6), remains stable with the growth without selective pressure to maintain the playmid,

оabout

4Ь W4b w

т.е в отсутствие в питательной среде антибиотика . Это свойство плазмиды pVIC 40 позвол ет предлагаемому штамму обеспечивать высокий вывод треонина в услови х большого числа генераций бактериальной культуры, а именно при обогащении питательной среды ростовыми факторами (аминокислотами ), а также в услови х промышленного производства.i.e. in the absence of antibiotic in the nutrient medium. This property of the pVIC 40 plasmid allows the proposed strain to provide a high output of threonine under conditions of a large number of generations of bacterial culture, namely, when the nutrient medium is enriched with growth factors (amino acids), as well as under industrial production conditions.

Предлагаемый штамм позвол ет пол- учать до 85 г/л треонина за 36 ч ферментации в лабораторных услови х. В услови х, аналогичных промышленной ферментации по числу генераций (клеточных делений) культуры на средах без антибиотиков, штамм продуцирует до 79 г/л L-треонина за 50 ч ферментации. Накопление подобных аминокислот (аланин, глицин, глутаминова  кислота) составл ет не более 3 г/л.The proposed strain allows to obtain up to 85 g / l of threonine in 36 hours of fermentation under laboratory conditions. Under conditions similar to industrial fermentation according to the number of generations (cell divisions) of a culture on media without antibiotics, the strain produces up to 79 g / l of L-threonine per 50 h of fermentation. The accumulation of such amino acids (alanine, glycine, glutamic acid) is not more than 3 g / l.

Новый продуцент получен в результате генетической трансформации плазмидой pVIC 40 бесплазмидных клеток известного штамма ВНИИгенетика ТДГ-6 и сохран ет те генетические свойства известного штамма , которые определ ютс  хромосомой кле- ток. Нова  гибридна  плазмида pVIC40 несет тот же фрагмент хромосомы E.coli, что и плазмида pYN7, кодирующа  ген биосинтеза треонина, и сообщает клеткам устойчивость к антибиотику стрептомицину. В отличие от нее нова  плазмида сохран етс  в клетках при росте в неселективных услови х.The new producer was obtained as a result of the genetic transformation by the plasmid pVIC 40 of plasmid-free cells of the known strain VNIIgenetika TDG-6 and preserves the genetic properties of the known strain, which are determined by the chromosome of the cells. The new hybrid plasmid pVIC40 carries the same E. coli chromosome fragment as the plasmid pYN7, which encodes the threonine biosynthesis gene, and imparts resistance to the antibiotic streptomycin to cells. In contrast, a new plasmid is stored in cells during growth under non-selective conditions.

Нова  гибридна  плазмида pVIC 40 получена путем обработки плазмиды pYN 7, а также векторной плазмиды,  вл ющейс  производной известных плазмид pRSF1010 и pBR322, характеризующейс  высокой стабильностью в клетках E.coli, рестриктазами Bam H 1 и Pst I с последующей обработкой полинуклеотидлигазой. Смесью после лиги- ровани  трансформировали клетки бес- плазмидного варианта штамма ВНИИ-генетика ТДГ-6, нуждающегос  в треонине, и на минимальном агаре (среда Мд), лишенном треонина, но содержащем стрептомицин (100 мкг/мл), отбирали колонии трансформантов, утративших устойчивость к пенициллину. Из клеток одного такого трансформанта выделена плазмида pViC40 с молекул рной массой 9,7 МД, сообщающа  устойчивость к стрептомицину, но не к пенициллину, и несуща  фрагмент плазмиды pYN7, детерминирующий ген тре- онинового биосинтеза у E;coli.The new hybrid plasmid pVIC 40 was obtained by treating the plasmid pYN 7, as well as a vector plasmid derived from the known plasmids pRSF1010 and pBR322, characterized by high stability in E. coli cells, restriction enzymes Bam H 1 and Pst I, followed by processing with polynucleotide ligase. After the ligation mixture, cells of a plasmid-free variant of a strain of the All-Russia Research Institute of Genetics TDG-6, in need of threonine, and minimal agar (medium MD), lacking threonine, but containing streptomycin (100 µg / ml) were selected, the transformants that lost resistance to penicillin. The plasmid pViC40 with a molecular weight of 9.7 MD was isolated from the cells of one such transformant, conferring resistance to streptomycin, but not to penicillin, and carrying a fragment of the plasmid pYN7, which determines the gene for the threonine biosynthesis in E; coli.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-3996 и имеет следующую характеристику.The strain deposited in the All-Union collection of industrial microorganisms under the number VKPM B-3996 and has the following characteristics.

Культу рал ьно-морфологичес кие признаки . Грамотрицательные слабо подвижные палочки с закругленными концами, размер 1,5 - 2 мкм в длину.Cult ral-morphological signs. Gram-negative, slightly mobile sticks with rounded ends, size 1.5-2 microns in length.

М со-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37°С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колоний гладка , кра  ровные или слегка волнистые, центр колоний приподн т , структура однородна , консистенци  пастообразна , легко эмульгируетс .M so-peptone agar. After 24 hours of growth at 37 ° C, it forms round whitish translucent colonies with a diameter of 1.5-3 mm, the surface of the colonies is smooth, the edges are even or slightly wavy, the center of the colonies is raised, the structure is uniform, paste-like consistency, and is easily emulsified.

Агар-Луриа. Через 24 ч роста при 37°С образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладка , кра  ровные, структура однородна , консистенци  пастообразна , легко эмульгируетс .Agar-Luria. After 24 hours of growth at 37 ° C, whitish translucent colonies with a diameter of 1.5-2.5 mm form, the surface of the colonies is smooth, smooth, the structure is uniform, paste-like consistency, and is easily emulsified.

Агаризованна  минимальна  среда Адамса. Через 40 - 48 ч роста при 37°С образует колонии диаметром 0,5 - 1,5 мм. серовато-белые, полупрозрачные, слегка выпуклые, с блест щей поверхностью.Agarized minimal Adams medium. After 40–48 hours of growth at 37 ° C, it forms colonies with a diameter of 0.5–1.5 mm. grayish-white, translucent, slightly convex, with a glossy surface.

Рост в м со-пептонном бульоне. Удельна  скорость роста при 37°С 1,3 . После 24 ч роста происходит сильное равномерное помутнение, имеетс  характерный запах.Growth in m-peptone broth. Specific growth rate at 37 ° C 1.3. After 24 hours of growth, a strong uniform cloudiness occurs, and there is a characteristic odor.

Физиолого-биологические признаки.Physiological and biological signs.

Отношение к источникам углерода: хорошо растет на сахарозе, глюкозе, фруктозе , лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, глицерине, манните с образованием кислоты и газа.Relation to carbon sources: grows well on sucrose, glucose, fructose, lactose, mannose, galactose, xylose, glycerin, mannitol with the formation of acid and gas.

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме аммони , солей азотной кислоты, а также азот некоторых органических соединений.Relation to nitrogen sources: absorbs nitrogen in the form of ammonium, salts of nitric acid, as well as nitrogen of some organic compounds.

Желатину не разжижает. Рост на молоке хороший с коагул цией молока.Gelatin does not dilute. Growth on milk is good with milk coagulation.

Индол не образует.Indole does not form.

Устойчив к стрептомицину, L-треонину и L-гомосерину,Resistant to streptomycin, L-threonine and L-homoserine,

Стимул тором роста  вл етс  L-изо- лейцин. При росте в присутствии L-треонина аминоацетон не образует.The growth promoter is L-isoleucine. With growth in the presence of L-threonine, aminoacetone does not form.

Факультативный анаэроб.Optional anaerobic.

Растет на м со-пептонном бульоне при 37°С и ниже. Оптимальна  температура 37 - 38°С.It grows in m-peptone broth at 37 ° C and below. The optimum temperature is 37 - 38 ° C.

Растет на жидких средах, имеющих рН от 6 до 8. Оптимальное значение рН 7,0.It grows in liquid media having a pH of from 6 to 8. The optimum pH value is 7.0.

Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную гибридную плазмиду pVIC 40 (молекул рна  масса 9.7 МД), обеспечивающую устойчивость к стрептомицину и несущую гены треонинового оперона.The content of plasmids. The cells contain the multicopyne hybrid plasmid pVIC 40 (molecular weight 9.7 MD), which provides resistance to streptomycin and carries the genes for the threonine operon.

Стабильность плазмиды. Штамм E.coli ВКПМ В-3996 характеризуетс  повышенной способностью к сохранению плазмиды при росте без селективного давлени , направленного на поддержание плазмиды.The stability of the plasmid. The E. coli strain VKPM B-3996 is characterized by an increased ability to preserve the plasmid while growing without selective pressure to maintain the plasmid.

Оценку стабильности признаков штамма, определ емого плазмидой, проводили у предлагаемого (плазмида pVIC 40) и известного (плазмида pYN 7) штаммов. Клетки обоих штаммов выращивали в присутствии соответствующего антибиотика до ранней стационарной фазы и засевали среду Лурма, лишенную антибиотиков, с исходным титром 5. После 48 ч культивировани  полученными клетками вновь засевали такую же среду до исходного титра 50 и вновь инкубировали 48 ч. Каждый пассаж соответствовал 20 генераци м. После указанных пассажей клетки высевали на агаре Луриа и выросшие колонии провер ли на устойчм- вость к стрептомицину и пенициллину (табл.1).An assessment of the stability of the characteristics of the strain determined by the plasmid was carried out on the proposed (plasmid pVIC 40) and known (plasmid pYN 7) strains. The cells of both strains were grown in the presence of an appropriate antibiotic to an early stationary phase, and Lurm medium devoid of antibiotics was seeded with an initial titer of 5. After 48 hours of culture, the resulting cells were seeded again with the same medium to the original titer 50 and re-incubated 48 hours. Each passage corresponded to 20 generation. After these passages, the cells were sown on Luria agar and the grown colonies were tested for resistance to streptomycin and penicillin (Table 1).

Из данных табл.1 видно, что плазмида pVIG 40 стабильно сохран етс  в клетках нового продуцента в неселективных услови-  х. В этих же услови х клетки известного штамма быстро утрачивают плазмиду.From the data of Table 1, it can be seen that the plasmid pVIG 40 is stably maintained in the cells of the new producer under non-selective conditions. Under the same conditions, cells of a known strain quickly lose a plasmid.

Получение L-треонина с использованием нового штамма-продуцента осуществл - ют следующим образом. Культуру штамма E.coll ВКПМ В-3996 выращивают на агари- зованной среде Адамса со стрептомицином и суспензией клеток, выращенных таким же образом, засевают жидкую посевную или ферментационную среду. Эти среды содержат источник углерода, азота, необходимые минеральные соли, а также питательную добавку в виде гидролизатов белковых субстратов (присутствие этой добавки в фер- ментационной среде не об зательно). Выращивание посевного материала ведут в услови х рН-статировани  при рН 6,8 - 7,2, температуре 36 - 38°С с непрерывным аэрированием и перемешиванием. Приготовлен- ный таким образом посевной материал или суспензию клеток, смытых с агара, используют дл  засева ферментационной среды, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, а также питательную до- бавку в виде гидролизатов белковых субстратов (при низких дозах засева указанна  добавка позвол ет сократить продолжительность ферментации, при высоких дозах засева присутствие ее не об затель- но).Preparation of L-threonine using a new producer strain is carried out as follows. The culture of E.coll strain VKPM B-3996 is grown on Adams agar medium with streptomycin and a suspension of cells grown in the same way, is seeded with a liquid seed or fermentation medium. These media contain a source of carbon, nitrogen, necessary mineral salts, and a nutritional supplement in the form of hydrolyzates of protein substrates (the presence of this additive in the fermentation medium is not necessary). Growing inoculum is carried out in conditions of pH-setting at pH 6.8 - 7.2, temperature 36 - 38 ° C with continuous aeration and mixing. The inoculum thus prepared or the suspension of cells washed from the agar is used to inoculate a fermentation medium containing a source of carbon, nitrogen, mineral salts, as well as a nutritional supplement in the form of hydrolyzates of protein substrates (at low doses, sowing the specified substrate allows reduce the duration of fermentation, with high doses of seeding, its presence is not necessary).

Ферментацию осуществл ют в ферментерах , оснащенных системой рН-статиро- вани , при рН 6,8 - 7,2, температуре 36 38°С с непрерывным аэрированием и пере- мешиванием. В качестве рН-статирующего агента примен ют либо аммиачную воду, либо сбалансированную по углероду и азоту сахаро-аммиачную подпитку. Продолжительность ферментации зависит от дозы засева и степени обогащени  ферментационной среды ростовыми факторами и может составл ть 24 - 60 ч. К концу ферментации накапливаетс  70 - 85 г/л L-треонина. Удельный расход источника углерода на синтез 1 г L-треонина составл ет 2 - 2,3 г. Накопление аминоацетона Б культуралыюй жидкости отсутствует.Fermentation is carried out in fermenters equipped with a pH-static system, at a pH of 6.8 - 7.2, at a temperature of 36–38 ° C with continuous aeration and stirring. Either ammonia water or carbon-nitrogen balanced sugar ammonia feed is used as a pH-stating agent. The duration of fermentation depends on the seeding dose and the degree of enrichment of the fermentation medium with growth factors and may be 24 to 60 hours. By the end of the fermentation, 70 to 85 g / l of L-threonine accumulate. The specific consumption of the carbon source for the synthesis of 1 g of L-threonine is 2–2.3 g. There is no accumulation of aminoacetone B culture liquid.

Пример 1,Купьтуры штаммов ВКПМ В-3420 и ВКПМ В-3996 параллельно выращивают на агаризовачной среде Адамса, содержащей сахарозу (0,2%) м антибиотики (500 ад/мл пенициллина дл  известного штамма и 100 мкг/мл стрептомицина дл  предлагаемого штамма) Клетки, выращенные в течение 2 сут, суспендируют в физиологическом растворе и 10 мл суспензии с титром 10 исполкзуют дл  засева 500 мл посевной среды следующего состава, %: сахароза 4; аммоний сернокислый 0,5; калий фосфорнокислый 2-замещенный 0,2; магний сернокислый 7-водный 0,04; железо (II) сернокислое 7-водное 0,002; марганец (II) сернокислый 5-водный 0,002; автолизат дрожжей 0,2; вода остальное.Example 1, Cupids of VKPM B-3420 and VKPM B-3996 strains are grown in parallel on Adams agar medium containing sucrose (0.2%) m antibiotics (500 ad / ml penicillin for a known strain and 100 μg / ml streptomycin for the proposed strain) Cells grown for 2 days are suspended in physiological saline and 10 ml of suspension with a titer of 10 is used for planting 500 ml of inoculum with the following composition,%: sucrose 4; ammonium sulfate 0.5; potassium phosphate 2-substituted 0,2; 7-water magnesium sulfate 0.04; iron (II) 7-water sulphate 0.002; manganese (II) sulfate 5-water 0,002; yeast autolysate 0,2; water the rest.

Посевной материал выращивают в течение 20 ч в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании (0,5 л/мин) и перемешивании со скоростью 1000 об/мин при 37°С. Значение рН автоматически поддерживают в пределах 6,9 + 0.2 аммиачной водой. Выращенным посевным материалом с титром 7 - 8-Ю9 в количестве 50 мл засевают ферментационные среды объемом 500 мл. Состав ферментационной среды такой же, как и состав посевной, но концентраци  сахарозы 3% и дополнительно внесен хлористый натрий (0,06%).Seeds are grown for 20 hours in laboratory fermenters with a capacity of 1.2 liters with aeration (0.5 l / min) and stirring at a speed of 1000 rpm at 37 ° C. The pH value is automatically maintained within 6.9 + 0.2 ammonia water. The grown seed with a titer of 7 - 8-U9 in the amount of 50 ml is inoculated with a fermentation medium with a volume of 500 ml. The composition of the fermentation medium is the same as the composition of the seed, but the concentration of sucrose is 3% and sodium chloride (0.06%) is added.

Ферментацию провод т в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании 0,5 л/мин воздуха и перемешивании со скоростью 1200 об/мин и при температуре культивировани  37°С. Значение рН поддерживают в пределах 6,9 +Ю,2 путем автоматической подачи сахаро-ам- миачной подпитки, представл ющей собой смесь 70%-ного раствора сахарозы с 25%- ной аммиачной водой в соотношении 3,6:1 по объему. Ферментацию провод т в течение 36ч. Результаты проведенного процесса показаны в табл.2.Fermentation is carried out in laboratory fermenters with a capacity of 1.2 liters with aeration of 0.5 l / min of air and stirring at a speed of 1200 rpm and at a cultivation temperature of 37 ° C. The pH value is maintained within the range of 6.9 + 10.2, by automatically feeding sucrose-ammonia feed, which is a mixture of 70% sucrose solution with 25% ammonia water in a ratio of 3.6: 1 by volume. The fermentation is carried out for 36h. The results of the process shown in table 2.

П р и м е р 2. Культуры штаммов Е. coli ВКПМ В-3420 и ВКПМ В-3996 выращивают аналогично примеру 1, но полученную клеточную суспензию развод т физиологическим раствором до титра 10 и 1 мл такой суспензии используют дл  засева 500 мл ферментационной среды, отличающейс  от указанной в примере 1 ферментационной среды повышенным до 0.5% содержаниемPRI mme R 2. Cultures of E. coli VKPM B-3420 and VKPM B-3996 strains were grown as in Example 1, but the resulting cell suspension was diluted with saline to a titer of 10, and 1 ml of this suspension was used for seeding 500 ml of fermentation medium different from the fermentation medium specified in Example 1 increased to 0.5% content

автолизата дрожжей (моделируетс  вариант засева производственного ферментера объемом 1000 м3 суспензией клеток, смытых с 1 кос ка). Ферментацию провод т в течение 50 ч в услови х, аналогичных указанным в примере 1. Результаты проведенного процесса показаны в табл.3.yeast autolysate (a seeding variant of a 1000 m3 production fermenter with a suspension of cells washed from 1 spit is simulated). The fermentation is carried out for 50 hours under conditions similar to those indicated in Example 1. The results of the process carried out are shown in Table 3.

ПримерЗ. Культуру штамма ВКПМ В-3996 выращивают на агаризованной среде Адамса со стрептомицином, как показано в примере 1, затем клетки суспендируют в физрастворе и полученной суспензией засевают посевную среду, аналогичную приведенной в примере 1, но отличающуюс  заменой сахарозы на мелассу (4% по сахару ). Выращивание посевного материала ведут по примеру 1. Через 18 ч готовым посевным материалом засевают ферментационную среду, содержащую 4% мелассы (2 % по сахару), 1,5% сернокислого аммони  и минеральные соли, перечисленные в ферментационной среде примера 1. Дл  рН-статировани  в ходе ферментации используют мелассно-аммиачную подпитку, представл ющую собой смесь 30%-ного по сахару раствора мелассы с 25%-ной аммиачной водой в соотношении 12:1 по объему.Example The culture of the strain VKPM B-3996 is grown on Adams agar medium with streptomycin, as shown in Example 1, then the cells are suspended in saline solution and the resulting suspension is inoculated with a seed medium similar to that shown in Example 1, but differing in the substitution of sucrose for molasses (4% sugar) . The cultivation of the inoculum is carried out according to Example 1. After 18 hours, a fermentation medium containing 4% molasses (2% sugar), 1.5% ammonium sulphate and mineral salts listed in the fermentation medium of example 1 is seeded with the prepared seed. For pH-setting during fermentation, molasses-ammonia feed is used, which is a mixture of 30% sugar solution molasses with 25% ammonia water in a ratio of 12: 1 by volume.

Ферментацию провод т в течение 36 ч. К концу ферментации в культуральной жидкости накапливаетс  треонин в конДол  клеток известного и предлагаемого штаммов, утративших плазмиды при пассировании в среде ЛуриаFermentation is carried out for 36 hours. By the end of the fermentation, threonine accumulates in the culture fluid in the condol of cells of known and proposed strains that have lost plasmids when passaged in Luria medium.

Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов при культивировании на средах без антибиотиков в лабораторных ферментерахAccumulation of threonine and loss of plasmid in known and proposed strains when cultured on media without antibiotics in laboratory fermenters

центрации 44 г/л. Дол  клеток, утративших плазмиду, менее 1%.centration 44 g / l. The proportion of cells that have lost the plasmid is less than 1%.

Сравнение предлагаемого и известного штаммов в услови х небольшого числа клеточных генераций без антибиотика (пример 1) показывает одинаковую продуктивность штаммов (82 - 85 г/л).Comparison of the proposed and known strains under conditions of a small number of cell generations without an antibiotic (example 1) shows the same productivity of the strains (82 - 85 g / l).

Преимущества предлагаемого штамма про вл ютс  в услови х большого числаThe advantages of the proposed strain manifest themselves under the conditions of a large number of

клеточных генераций (пример 2), т.е. в услови х , моделирующих производственные в отсутствие антибиотика. В этом случае уровень накоплени  треонина предлагаемым штаммом в 1,5 раза выше, чем у известногоcell generations (example 2), i.e. in conditions simulating production in the absence of an antibiotic. In this case, the level of accumulation of threonine by the proposed strain is 1.5 times higher than that of the known

штамма (79 г/л треонина против 53 г/л). Это объ сн етс  тем, что значительна  дол  клеток известного штамма на обогащенных средах без антибиотиков утрачивает плазмиду , в то врем  как потери плазмиды уstrain (79 g / l of threonine versus 53 g / l). This is due to the fact that a significant proportion of cells of a known strain on enriched media without antibiotics loses the plasmid, while

предлагаемого штамма в этих услови х не отмечены.the proposed strain is not noted under these conditions.

Таким образом, предлагаемый штамм позвол ет в производственных услови х увеличивать выход L-треонина и упроститьThus, the proposed strain allows, under production conditions, to increase the yield of L-threonine and simplify

процесс за счет полного исключени  применени  антибиотика в процессе выращивани  посевного материала.process by eliminating the use of antibiotics in the process of growing seed.

Claims (1)

Translated fromRussian

Формула изобретени  Штамм бактерий Escherichia coll ВКПМClaims of Bacteria Strain Escherichia coll VKPMВ-3996-продуцент L-треонина.B-3996-producing L-threonine.Таблица 1Table 1Таблица 2table 2Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммовThe accumulation of threonine and the loss of plasmid in the known and proposed strainsпри культивировании на средах без антибиотиков в услови х, моделирующих поwhen cultivated on media without antibiotics in conditions that simulateчислу генераций производственные услови generation number production conditionsРедактор М.ПетроваEditor M.PetrovaТехред М.МоргенталTehred M. MorgenthalЗаказ 4130ТиражПодписноеOrder 4130 Circulation: SubscriptionВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-35, Раушска  наб., 4/5VNIIPI State Committee for Inventions and Discoveries at the State Committee on Science and Technology of the USSR 113035, Moscow. Zh-35, Raushska nab., 4/5Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101Production and Publishing Combine Patent, Uzhgorod, Gagarin st., 101Таблица 3Table 3Корректор v М.ДемчикCorrector v M. Demchik