Oblasť technikyField of technology
Predkladaný vynález sa týka identifikácie prediktívnych biomarkerov v „malých“ biopsiách pacientov s nemalobunkovým pľúcnym karcinómom (NSCLC) na cielenú liečbu a imunoterapiu.The present invention relates to the identification of predictive biomarkers in "small" biopsies of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) for targeted therapy and immunotherapy.
Doterajší stav technikyState of the art
Celosvetovo je karcinóm pľúc jedným z najčastejších typov rakoviny. Navyše, v porovnaní s inými typmi rakoviny je aj jednou z hlavných príčin úmrtia onkologických pacientov. Primárne rozlišujeme karcinóm pľúc na malobunkový (ďalej SCLC) a nemalobunkový (NSCLC) karcinóm pľúc. NSCLC predstavuje približne 80 % až 85 % všetkých prípadov karcinómu pľúc.Lung cancer is one of the most common types of cancer worldwide. Moreover, compared to other types of cancer, it is also one of the leading causes of death in cancer patients. Lung cancer is primarily divided into small cell (SCLC) and non-small cell (NSCLC) lung cancer. NSCLC accounts for approximately 80% to 85% of all lung cancer cases.
Z tohto dôvodu sa biotická či skôr komplexná diagnostika nádorov pľúc dostáva do prioritného postavenia onkologickej medicíny, pričom zmeny v oblasti diagnostiky pľúcnych nádorov sprevádzajú aj podstatné pokroky v cielenej terapii. Je preto snaha nájsť prediktívne markery, ktoré by umožnili lepšie zacieliť liečbu a to nie len na jej začiatku ale tiež v priebehu vývoja ochorenia, kedy NSCLC mení svoje charakteristiky.For this reason, biotic or rather complex diagnostics of lung tumors is becoming a priority in oncological medicine, while changes in the field of lung tumor diagnostics are accompanied by significant advances in targeted therapy. Therefore, there is an effort to find predictive markers that would allow better targeting of treatment, not only at the beginning but also during the development of the disease, when NSCLC changes its characteristics.
Na diagnostiku, ktorá má následne dopad aj na výber liečby pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc (SCLC) je nevyhnutné odobratie bioptickej vzorky tkaniva nádoru a jej následné histologické vyšetrenie kvalifikovaným patológom. Keďže veľká časť pacientov s NSCLC je v čase diagnózy v takom štádiu ochorenia, ktoré neumožňuje radikálnu chirurgickú intervenciu, a tým ani získanie objemovo postačujúceho a menej sekundárne pozmeneného materiálu, ich diagnóza musí byť overovaná v tzv. malých biopsiách pomocou neustále sa vyvíjajúcich metód, medzi ktoré patrí napríklad punkcia nádoru, klasická bronchoskopia, endobronchiálna ultrazvukom navigovaná bronchoskopia (EBUS), ezofageálna ultrazvukom navigovaná biopsia z uzlín (EUS) a iné.For diagnosis, which subsequently has an impact on the choice of treatment for patients with non-small cell lung cancer (SCLC), it is necessary to take a biopsy sample of the tumor tissue and its subsequent histological examination by a qualified pathologist. Since a large proportion of patients with NSCLC are at a stage of the disease at the time of diagnosis that does not allow radical surgical intervention, and thus neither obtaining a sufficient volume and less secondarily altered material, their diagnosis must be verified in so-called small biopsies using constantly evolving methods, which include, for example, tumor puncture, classical bronchoscopy, endobronchial ultrasound-guided bronchoscopy (EBUS), esophageal ultrasound-guided biopsy of the nodes (EUS) and others.
Vzorky nádorového tkaniva získaného vyššie uvedenými metódami sú väčšinou drobné fragmenty, často pozmenené odberovými a inými artefaktami, čo predstavuje znevýhodnenie pre potrebné analýzy využívané v diagnostike.Tumor tissue samples obtained by the above methods are mostly small fragments, often altered by sampling and other artifacts, which represents a disadvantage for the necessary analyses used in diagnostics.
Takto získané tkanivo sa fixuje vo formalíne a zalieva sa do parafínového bloku (ďalej FFPE z angl. formalinfixedd paraffin-embedded). Ošetrené vzorky (FFPE) je možné skladovať aj desiatky rokov. Z parafínového bloku sa následne na špeciálnych mikrotómoch režú tenké rezy tkaniva na príslušné vyšetrenia. Z takto ošetrených tkanív (z FFPE tkaniva) je dokonca možná izolácia DNA a RNA a teda tieto vzorky je možné využiť na ich analýzu.The tissue obtained in this way is fixed in formalin and embedded in a paraffin block (hereinafter referred to as FFPE). Treated samples (FFPE) can be stored for decades. Thin sections of tissue are then cut from the paraffin block on special microtomes for the appropriate examinations. It is even possible to isolate DNA and RNA from tissues treated in this way (FFPE tissue), and therefore these samples can be used for their analysis.
Klasická bioptická diagnostika NSCLC je založená na histologickom vyšetrení tkaniva, ktoré je v súčasnosti doplnené panelom 4 až 6 imunohistochemických (IHC) vyšetrení, čo umožňuje identifikovať podtypy NSCLC (adenokarcinóm verzus skvamocelulárny karcinóm) a odlíšiť iné formy rakoviny pľúc. Imunohistochemická diagnostika využíva základné princípy reakcie antigén-protilátka s použitím farbiva, ktoré v histologickom preparáte presne vizualizuje miesto pozitívnej reakcie.The classic biopsy diagnosis of NSCLC is based on histological examination of tissue, which is currently supplemented by a panel of 4 to 6 immunohistochemical (IHC) examinations, which allows to identify subtypes of NSCLC (adenocarcinoma versus squamous cell carcinoma) and to differentiate other forms of lung cancer. Immunohistochemical diagnosis uses the basic principles of the antigen-antibody reaction using a dye that precisely visualizes the site of a positive reaction in the histological preparation.
Približne od začiatku 21. storočia sa dostáva do popredia záujmu špecializovaná diagnostika bioptického materiálu, ktorá je zameraná na identifikáciu prediktívnych biomarkerov NSCLC, a to biomarkerov cielenej biologickej liečby ako aj modernej imunoterapie. Tieto biomarkery zahŕňajú jednak dôkaz antigénov (špecifických proteínov v tkanive dokázateľných imunohistochemickým vyšetrením) ako aj dôkaz špecifických genetických alterácií nádorových buniek (mutácii, prestavby a pod.) buď priamo v tkanivovom reze, t. j. insitu, alebo laboratórnou analýzou nukleových kyselín (DNA, RNA) získaných izoláciou z rezov tkaniva. Prvým známym prediktívnym biomarkerom bola mutácia génu EGFR.Since the beginning of the 21st century, specialized diagnostics of biopsy material have been gaining attention, aimed at identifying predictive biomarkers of NSCLC, namely biomarkers of targeted biological therapy as well as modern immunotherapy. These biomarkers include both the detection of antigens (specific proteins in the tissue demonstrable by immunohistochemical examination) and the detection of specific genetic alterations of tumor cells (mutations, rearrangements, etc.) either directly in the tissue section, i.e. in situ, or by laboratory analysis of nucleic acids (DNA, RNA) obtained by isolation from tissue sections. The first known predictive biomarker was the EGFR gene mutation.
Aktivačné mutácie v kódovaní génu EGFR boli objavené v roku 2004 a vyskytujú sa predovšetkým u NSCLC. Následkom týchto mutácií je konštitutívna aktivácia kinázy proteínu EGFR a tieto mutácie prispievajú k onkogénnemu procesu. Mutácia génu EGFR sa v belošskej populácii vyskytuje približne v 15 - 20 % prípadov NSCLC. Postupne sa identifikovali ďalšie genetické mutácie génov (ALK, ROS1, RET, MET, HER2, BRAF, NTRK, KRAS a iné), ktoré sú zriedkavejšie. ALK mutácia bola objavená v roku 2007 a frekvencia ALK mutácie pri NSCLC je 3 až 5 %. ROS1 mutácie podnecujú vznik fúznych proteínov s vysokou onkogénnou aktivitou. Chromozómové prestavby ROS1 génu u pacientov s NSCLC boli objavené v roku 2007. Výskyt prestavieb génu ROS1 u pacientov s NSCLC je 2 %. V klinickej praxi sa bežne na vyšetrenie genetických alterácií používa metóda FISH (fluorescenčná in situ hybridizácia). Túto metodiku je možné uplatniť pri vyšetrovaní génov EGFR, ALK a ROS1. KRAS, alebo tiež K-RAS (Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene homolog), je proteín s GTP-ázovou aktivitou, ktorý je súčasťou signálnej kaskády EGFR. Zúčastňuje sa tak na prenose signálu od aktivovaného receptora do jadra. Aktivačná mutácie tohto génu teda vedie k stimulácii spomínanej signálnej dráhy nezávisle na stave EGFR.Activating mutations in the EGFR gene coding were discovered in 2004 and occur primarily in NSCLC. These mutations result in constitutive activation of the EGFR protein kinase and these mutations contribute to the oncogenic process. EGFR gene mutation occurs in approximately 15-20% of NSCLC cases in the Caucasian population. Gradually, other genetic mutations of genes (ALK, ROS1, RET, MET, HER2, BRAF, NTRK, KRAS and others) have been identified, which are rarer. ALK mutation was discovered in 2007 and the frequency of ALK mutation in NSCLC is 3-5%. ROS1 mutations induce the formation of fusion proteins with high oncogenic activity. Chromosomal rearrangements of the ROS1 gene in patients with NSCLC were discovered in 2007. The incidence of ROS1 gene rearrangements in patients with NSCLC is 2%. In clinical practice, the FISH (fluorescence in situ hybridization) method is commonly used to examine genetic alterations. This methodology can be applied to the investigation of EGFR, ALK and ROS1 genes. KRAS, or also K-RAS (Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene homolog), is a protein with GTPase activity, which is part of the EGFR signaling cascade. It is thus involved in the transmission of the signal from the activated receptor to the nucleus. Activating mutation of this gene therefore leads to the stimulation of the aforementioned signaling pathway independently of the EGFR status.
SK 50054-2023 A3SK 50054-2023 A3
Rakovinové bunky môžu exprimovať na svojom povrchu molekuly patriace do skupiny imunitných regulačných mechanizmov (kontrolných bodov), medzi ktoré patrí aj ligand PD-L1 pre receptor bunkovej smrti PD-1 (programmed cell death protein 1). PD-1 receptory sa nachádzajú na povrchu cytotoxických T-lymfocytov, PD-L1 sú ligandy pre tieto receptory a sú exprimované na povrchu nádorových buniek, respektíve aj na povrchu iných buniek v mikroprostredí nádoru. Laboratórne sa pozitivita PD-L1 ligandu na povrchu nádorových buniek zisťuje imunohistochemickým vyšetrením nádorového tkaniva. Ako pozitívny výsledok sa udáva prítomnosť PD-L1 vo viac než 1 % nádorových buniek, ako vysoko pozitívny výsledok sa udáva v aspoň 50 % nádorových buniek.Cancer cells can express molecules belonging to the group of immune regulatory mechanisms (checkpoints) on their surface, which also includes the PD-L1 ligand for the PD-1 cell death receptor (programmed cell death protein 1). PD-1 receptors are found on the surface of cytotoxic T-lymphocytes, PD-L1 is the ligand for these receptors and is expressed on the surface of tumor cells, or on the surface of other cells in the tumor microenvironment. In the laboratory, the positivity of PD-L1 ligand on the surface of tumor cells is determined by immunohistochemical examination of tumor tissue. A positive result is the presence of PD-L1 in more than 1% of tumor cells, and a highly positive result is reported in at least 50% of tumor cells.
V prípadoch viacerých alterácií platí, že sa najprv realizuje IHC analýza na dôkaz príslušného proteínu a až v prípade jeho pozitivity, v diagnostickom algoritme nasleduje príslušné molekulovo-genetické vyšetrenie. V súčasnosti to v praxi znamená, že na primárnom pracovisku prebieha klasická diagnostika (t. j. zrezanie FFPE bloku) a po jej skončení je FFPE materiál posielaný do príslušného centra, kde sa realizujú analýzy prediktívnych biomarkerov.In cases of multiple alterations, IHC analysis is first performed to prove the relevant protein and only in case of its positivity, the relevant molecular-genetic examination follows in the diagnostic algorithm. Currently, in practice, this means that classical diagnostics (i.e. cutting of the FFPE block) is performed at the primary workplace and after its completion, the FFPE material is sent to the relevant center, where predictive biomarker analyses are performed.
Na takomto pracovisku nasleduje opakované prerezávanie FFPE bloku na jednotlivé kroky identifikácie prediktívnych biomarkerov na indikáciu cielenej liečby individuálneho pacienta. Pričom platí princíp tzv. exkluzivity, čiže predpoklad, že na začiatku ochorenia je prítomná jedna riadiaca mutácia (drive mutation) a po jej identifikácii nie je potrebné hľadať tie ďalšie. Preto vyšetrenie začína analýzou vždy podľa výskytu danej zmeny (najprv analýza stavu EGRF, keď je výsledok negatívny tak nasleduje vyšetrenie č. 2, atď.). Dôsledkom je opakované prerezávanie maloobjemových FFPE blokov tkaniva, čo vedie k znižovaniu možnosti vyšetrovania ďalších a ďalších parametrov z dôvodu nedostatku tkaniva.In such a workplace, the FFPE block is repeatedly cut into individual steps to identify predictive biomarkers to indicate targeted treatment for an individual patient. The principle of so-called exclusivity applies, i.e. the assumption that at the beginning of the disease there is one driving mutation (drive mutation) and after its identification there is no need to look for the others. Therefore, the examination always begins with an analysis according to the occurrence of a given change (first, analysis of the EGRF status, if the result is negative, examination no. 2 follows, etc.). The consequence is repeated cutting of small-volume FFPE tissue blocks, which leads to a decrease in the possibility of investigating additional and additional parameters due to lack of tissue.
Problém nedostatočnej vzorky nádorového tkaniva odstránil nástup nových technológií a postupov metód masívneho paralelného sekvenovania (NGS), ktoré (s použitím relatívne obmedzeného počtu rezov z FFPE tkaniva na izoláciu RNA ako aj DNA) umožňuje naraz v jednej analýze vyšetrenie celej skupiny genetických alterácií. Nevýhodou NGS technológie je ekonomická a personálna náročnosť (najmä cena vyšetrenia, kvalifikovaný personál, potreba kvalitnej bioinformatiky) a časový faktor. Z tohto pohľadu existuje potreba postupu, ktorý by bol realizovateľný v „dennej praxi“ a nahrádzal by potrebu NGS.The problem of insufficient tumor tissue samples has been eliminated by the advent of new technologies and procedures of massively parallel sequencing (NGS) methods, which (using a relatively limited number of sections from FFPE tissue for isolation of RNA and DNA) allows the examination of a whole group of genetic alterations at once in a single analysis. The disadvantage of NGS technology is the economic and personnel requirements (especially the cost of the examination, qualified personnel, the need for high-quality bioinformatics) and the time factor. From this point of view, there is a need for a procedure that would be feasible in "daily practice" and would replace the need for NGS.
Z uvedeného opisu stavu techniky vyplýva, že vyšetrenie genetických mutácií v NSCLC by malo byť v dnešnej dobe štandardným vyšetrením v procese diagnostiky tohto ochorenia a má tiež význam aj z terapeutického hľadiska. Takáto genetická analýza poskytuje pacientom s NSCLC možnosť cielenej terapie. Preto je snahou predkladaného vynálezu nastoliť taký algoritmus vyšetrenia NSCLC, ktorý by umožnil spoľahlivý a rýchlo dostupný výsledok nezávisle od potreby implementácie NGS technológie.From the above description of the state of the art it follows that the examination of genetic mutations in NSCLC should be a standard examination in the process of diagnosing this disease nowadays and is also important from a therapeutic point of view. Such genetic analysis provides patients with NSCLC with the possibility of targeted therapy. Therefore, the aim of the present invention is to establish such an algorithm for the examination of NSCLC that would allow reliable and quickly available results independently of the need to implement NGS technology.
Podstata vynálezuThe essence of the invention
Uvedené nedostatky stavu techniky odstraňuje in vitro spôsob, ktorý umožňuje identifikovať prediktívne biomarkery na cielenú liečbu a imunoterapiu pacientov s nemalobunkovým pľúcnym karcinómom. Vyššie uvedený in vitro spôsob predstavuje spôsobom, ktorý šetrí bioptický materiál, nahrádza potrebu NGS a poskytuje výsledok v priebehu 3 pracovných dní. Súčasne, uvedený in vitro spôsob identifikácie prediktívnych biomarkerov podľa predkladaného vynálezu spĺňa požiadavku na optickú kontrolu histopatológom, ktorej výsledkom je informácia či v rezoch narezaných na molekulovo- genetické vyšetrenie je zastúpené dostatočné množstvo „viabilných“ nádorových buniek vyjadrené v percentuálnom pomere zo všetkých buniek v preparáte.The above-mentioned shortcomings of the state of the art are eliminated by an in vitro method that allows the identification of predictive biomarkers for targeted treatment and immunotherapy of patients with non-small cell lung cancer. The above-mentioned in vitro method represents a method that saves biopsy material, replaces the need for NGS and provides a result within 3 working days. At the same time, the above-mentioned in vitro method for identifying predictive biomarkers according to the present invention meets the requirement for optical control by a histopathologist, the result of which is information whether a sufficient number of "viable" tumor cells is represented in the sections cut for molecular genetic examination, expressed as a percentage of all cells in the preparation.
In vitro spôsob identifikácia prediktívnych biomarkerov podľa vynálezu má veľký význam aj z terapeutického hľadiska. V závislosti od terapeutického algoritmu umožňuje takáto genetická analýza poskytnúť pacientom s NSCLC alternatívu ku konvenčnej liečbe v podobe cielenej terapie.The in vitro method for identifying predictive biomarkers according to the invention is also of great importance from a therapeutic point of view. Depending on the therapeutic algorithm, such genetic analysis allows providing patients with NSCLC with an alternative to conventional treatment in the form of targeted therapy.
Spôsob podľa vynálezu je realizovaný na bioptických vzorkách pacientov s NSCLC získaných bronchoskopicky alebo punkciou. Po odobraní bioptického materiálu od pacientov s NSCLC je získané tkanivo fixované vo formalíne a zaliate do parafínového bloku, z ktorého sa na mikrotómoch narežú rezy tkaniva, ktoré sú podrobné genetickému a molekulovo- biologickému vyšetreniu.The method according to the invention is carried out on biopsy samples of patients with NSCLC obtained by bronchoscopy or puncture. After taking biopsy material from patients with NSCLC, the obtained tissue is fixed in formalin and embedded in a paraffin block, from which tissue sections are cut on microtomes, which are detailed for genetic and molecular biological examination.
In vitro spôsob identifikácie prediktívnych biomarkerov sa uskutočňuje na sériovo narezaných rezoch z FFPE vzorky tkaniva od NSCLC pacientov, z ktorej sa v prvom kroku izoluje DNA. Izolovaná DNA je podrobená RT-PCR analýze somatických mutácií v géne EGFR (mutačného stavu EGFR génu) a prípadne RT-PCR analýze somatických mutácii v géne BRAF. Na izoláciu DNA je postačujúcich 1 až 5 rezov z FFPE vzorky tkaniva. V druhom kroku sa izoluje RNA na GeneFusion PCR analýzu zahrnujúcu fúziu génov ALK, ROS1 a RET, skipping mutácie v exóne 14 génu MET. Na GeneFusion PCR analýzu je postačujúcich 1 až 3 rezy z FFPE vzorky tkaniva. V tomto kroku sa súčasne uskutočňuje, na 1 reze z FFPE vzorky, imunohistochemická analýza s využitímThe in vitro method for identifying predictive biomarkers is performed on serially cut sections of FFPE tissue samples from NSCLC patients, from which DNA is isolated in the first step. The isolated DNA is subjected to RT-PCR analysis of somatic mutations in the EGFR gene (mutational status of the EGFR gene) and, optionally, RT-PCR analysis of somatic mutations in the BRAF gene. 1 to 5 sections of the FFPE tissue sample are sufficient for DNA isolation. In the second step, RNA is isolated for GeneFusion PCR analysis including fusion of the ALK, ROS1 and RET genes, skipping mutations in exon 14 of the MET gene. 1 to 3 sections of the FFPE tissue sample are sufficient for GeneFusion PCR analysis. In this step, immunohistochemical analysis is simultaneously performed on 1 section of the FFPE sample using
SK 50054-2023 A3 farbenia hematoxylínom-eozínom na identifikáciu množstva a percentuálneho zastúpenia nádorových buniek v predchádzajúcich rezoch. V treťom kroku sa na 2 rezoch z FFPE vzorky realizuje FISH analýza fúzie ALK, prípadne ROSÍ génov, súčasne imunohistochemická analýza expresie ALK, ROSÍ a PD-L1 proteínov na 3 rezoch a detekcia mutácií génu KRAS na jednom reze, a farbenie hemotoxylínom-eozínom na 1 reze z FFPE vzorky na identifikáciu množstva a percentuálneho zastúpenia nádorových buniek v predchádzajúcich rezoch a súčasne na predikciu množstva a percentuálneho zastúpenia nádorových buniek v zostávajúcom materiáli FFPE. V prípade, že izolácia DNA v prvom kroku nebola úspešná alebo dostatočná na použitie DNA aj pri RTPCR analýze mutácií BRAF génu, opakovane sa z FFPE vzorky tkaniva nareže 1 až 5 rezov na druhú izoláciu DNA.SK 50054-2023 A3 hematoxylin-eosin staining to identify the amount and percentage of tumor cells in previous sections. In the third step, FISH analysis of the ALK or ROSÍ gene fusion is performed on 2 sections from the FFPE sample, simultaneously immunohistochemical analysis of ALK, ROSÍ and PD-L1 protein expression on 3 sections and detection of KRAS gene mutations on one section, and hematoxylin-eosin staining on 1 section from the FFPE sample to identify the amount and percentage of tumor cells in previous sections and simultaneously to predict the amount and percentage of tumor cells in the remaining FFPE material. In case the DNA isolation in the first step was not successful or sufficient to use the DNA also in the RTPCR analysis of BRAF gene mutations, 1 to 5 sections are repeatedly cut from the FFPE tissue sample for the second DNA isolation.
Príklady uskutočnenia vynálezuExamples of embodiments of the invention
Nasledujúci príklad uskutočnenia vynález je uvádzaný na ilustráciu. Tento príklad by sa nemal vykladať tak, že vymedzuje rozsah predkladaného vynálezu. Predkladaný vynález je vymedzený len patentovými nárokmi.The following example of the invention is provided for illustration. This example should not be construed as limiting the scope of the present invention. The present invention is limited only by the claims.
Príklad 1Example 1
Bioptické vzorky pacienta s NSCLC boli získané bronchoskopicky. Získané tkanivo bolo fixované v 10 % formalíne. Vzorky sa špeciálnymi procesmi odvodnili a následne presýtili parafínom, aby sa dali spracovať do blokov za vzniku FFPE bloku tkaniva, z ktorého sa na mikrotómoch narezali rezy tkaniva hrúbky 3 až 5 mikrometrov. Z FFPE rezov tkaniva bola patológom histologický potvrdená diagnóza.Biopsy specimens from a patient with NSCLC were obtained bronchoscopically. The obtained tissue was fixed in 10% formalin. The samples were dehydrated using special processes and then embedded in paraffin to be processed into blocks to form FFPE tissue blocks, from which tissue sections of 3 to 5 micrometers in thickness were cut on microtomes. The diagnosis was confirmed histologically by a pathologist from the FFPE tissue sections.
Z FFPE bloku tkaniva nádoru sa na mikrotóme narezalo 1 až 5 rezov na izoláciu DNA a 1 až 3 rezy na izoláciu RNA, ďalej sa narezal 1 rez na imunohistochemickú analýzu výhodne s využitím farbenia hematoxylínomeozínom a stanovil sa percentuálny podiel nádorových buniek zo všetkých buniek v reze. Je výhodné, aby percentuálny podiel nádorových buniek zo všetkých buniek v reze predstavoval minimálne 5 % v závislosti od testovaného markeru.From the FFPE tumor tissue block, 1 to 5 sections were cut on a microtome for DNA isolation and 1 to 3 sections for RNA isolation, and 1 section was cut for immunohistochemical analysis, preferably using hematoxylin and eosin staining, and the percentage of tumor cells out of all cells in the section was determined. It is preferred that the percentage of tumor cells out of all cells in the section be at least 5%, depending on the marker tested.
Oblasť, kde sa nachádzajú malígne bunky sa odobrala z parafínového bloku punkčnou ihlou. Tkanivo sa odparafinovalo pomocou jeho premývania v xyléne a etanole. Po vysušení sa z tkaniva zbaveného parafínu izolovala DNA pomocou CE-IVD kitu cobas® DNA Sample preparation kit (Roche Molecular diagnostics) tzv. kolónkou metódou podľa odporúčania výrobcu. Meranie koncentrácie DNA sa uskutočňuje pomocou Qubit fluorometra a kitu Qubit dsDNA HS assay (obe ThermoFisher Scientific). Objem takto získanej DNA z 1 až 5 rezov sa pohyboval v rozmedzí 80 až 90 μΙ.The area containing malignant cells was removed from the paraffin block with a needle. The tissue was deparaffinized by washing it in xylene and ethanol. After drying, DNA was isolated from the deparaffinized tissue using the CE-IVD cobas® DNA Sample preparation kit (Roche Molecular diagnostics) using the so-called column method according to the manufacturer's recommendations. DNA concentration was measured using a Qubit fluorometer and a Qubit dsDNA HS assay kit (both ThermoFisher Scientific). The volume of DNA obtained in this way from 1 to 5 sections ranged from 80 to 90 μΙ.
Izolácii RNA prebiehala použitím kitu CE-IVD Idylla™ GeneFusion esej (Biocartis), do ktorého sa vkladajú narezané rezy tkaniva priamo bez predchádzajúcej deparafinizácie. Meranie koncentrácie RNA je zahrnuté v kite CE-IVD Idylla™ GeneFusion esej (Biocartis).RNA isolation was performed using the CE-IVD Idylla™ GeneFusion assay kit (Biocartis), into which the cut tissue sections are inserted directly without prior deparaffinization. RNA concentration measurement is included in the CE-IVD Idylla™ GeneFusion assay kit (Biocartis).
Na izolovanej DNA prebehla analýza somatických mutácii v géne EGFR a/alebo na analýza somatických mutácii v géne BRAF. Táto analýza bola vykonaná na RT-PCT analyzátore cobas z 480 (Roche Molecular diagnostics).The isolated DNA was analyzed for somatic mutations in the EGFR gene and/or for somatic mutations in the BRAF gene. This analysis was performed on the cobas z 480 RT-PCT analyzer (Roche Molecular diagnostics).
Na izolovanej RNA prebehla GeneFusion analýza fúzii ALK, ROSÍ a RET génov a analýza skipping mutácie vexóne 14 génu MET certifikovanou multigénovou RT-qPCR metódou na analyzátore Idylla (Biocartis).Isolated RNA was subjected to GeneFusion analysis of fusions of ALK, ROSÍ and RET genes and analysis of skipping mutations in exon 14 of the MET gene using a certified multigene RT-qPCR method on the Idylla analyzer (Biocartis).
Z vyššie spomínaného FFPE bloku tkaniva sa ďalej narežú 2 rezervy po 1 reze na FISH analýzu fúzie ALK a/alebo ROSÍ génov, 3 rezervy po 1 reze na imunohistochemickú analýzu (IHC) expresie ALK, ROSÍ aPD-Ll proteínov, 1 rez na dôkaz mutácie génu KRAS a 1 rez na imunohistochemickú analýzu výhodne s využitím farbenia hematoxylínom-eozínom.From the above-mentioned FFPE tissue block, 2 reserves are further cut, each with 1 section for FISH analysis of ALK and/or ROS1 gene fusion, 3 reserves are cut, each with 1 section for immunohistochemical analysis (IHC) of ALK, ROS1 and PD-L1 protein expression, 1 section for demonstration of KRAS gene mutation and 1 section for immunohistochemical analysis, preferably using hematoxylin-eosin staining.
Vnútorná kontrola FISH analýzy fúzie (prestavby) vyššie uvedených génov bola zabezpečená centromérovou sondou. Na IHC analýzu uvedených proteínov bola na každom preparáte vložená vnútorná „pozitívna kontrola (pre proteíny ALK a ROSÍ nádorové tkanivo známeho overeného „pozitívneho prípadu, pre expresiu PD-L1 proteínu tkanivo placenty a tonzily so známou „normálnou expresiou daného proteínu.Internal control of the FISH analysis of the fusion (rearrangement) of the above genes was provided by a centromere probe. For the IHC analysis of the above proteins, an internal "positive control" was included on each preparation (for ALK and ROS1 proteins, tumor tissue of a known verified "positive case, for PD-L1 protein expression, placenta and tonsil tissue with known "normal" expression of the given protein.
Opakovane sa nareže 1 až 5 rezov na druhú izoláciu DNA a to v prípade, že izolácia DNA nebola úspešná alebo dostatočná na RT-PCR analýzu somatických mutácii v géne BRAF.1 to 5 sections are repeatedly cut for a second DNA isolation in case the DNA isolation was not successful or sufficient for RT-PCR analysis of somatic mutations in the BRAF gene.
Priemyselná využiteľnosťIndustrial applicability
In vitro spôsob identifikácie prediktívnych biomarkerov u pacientov s nemalobunkovým pľúcnym karcinómom nachádza využitie pri diagnostike a cielenej liečbe zhubných nádorových ochorení a imunoterapiu.The in vitro method of identifying predictive biomarkers in patients with non-small cell lung cancer finds application in the diagnosis and targeted treatment of malignant tumors and immunotherapy.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SK50054-2023ASK500542023A3 (en) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | In vitro method for identifying predictive biomarkers for targeted therapy and immunotherapy of patients with non-small cell lung cancer |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SK50054-2023ASK500542023A3 (en) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | In vitro method for identifying predictive biomarkers for targeted therapy and immunotherapy of patients with non-small cell lung cancer |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK500542023A3true SK500542023A3 (en) | 2025-01-15 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK50054-2023ASK500542023A3 (en) | 2023-06-28 | 2023-06-28 | In vitro method for identifying predictive biomarkers for targeted therapy and immunotherapy of patients with non-small cell lung cancer |
| Country | Link |
|---|---|
| SK (1) | SK500542023A3 (en) |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Janiszewska et al. | In situ single-cell analysis identifies heterogeneity for PIK3CA mutation and HER2 amplification in HER2-positive breast cancer | |
| EP2279266B1 (en) | A method for detecting igf1r aberrations in circulating tumor cells using fish | |
| CA2825453C (en) | A method of analyzing chromosomal translocations and a system therefore | |
| JP2005503158A (en) | Dye-producing in situ hybridization method, kit and composition | |
| Demidova et al. | Immunohistochemistry, fluorescence in situ hybridization, and reverse transcription–polymerase chain reaction for the detection of anaplastic lymphoma kinase gene rearrangements in patients with non–small cell lung cancer: potential advantages and methodologic pitfalls | |
| CA3012657A1 (en) | Predictive diagnostic workflow for tumors using automated dissection, next generation sequencing, and automated slide stainers | |
| Roh | The utilization of cytologic fine-needle aspirates of lung cancer for molecular diagnostic testing | |
| US20130183710A1 (en) | Reference sample for quality control in molecular diagnosis | |
| Niu et al. | Anaplastic lymphoma kinase testing: IHC vs. FISH vs. NGS | |
| JP6873089B2 (en) | Methods and systems for identifying patient-specific driver mutations | |
| AU2012228424A1 (en) | A method of analyzing chromosomal translocations and a system therefore | |
| JP2009506303A (en) | Predictive methods for cancer chemotherapy | |
| Pavlakis et al. | Australian consensus statement for best practice ROS1 testing in advanced non-small cell lung cancer | |
| Ilié et al. | Prospective multicenter validation of the detection of ALK rearrangements of circulating tumor cells for noninvasive longitudinal management of patients with advanced NSCLC | |
| Merkelbach-Bruse et al. | Current diagnostic methods of HER-2/neu detection in breast cancer with special regard to real-time PCR | |
| Marchetti et al. | Validation of a new algorithm for a quick and easy RT-PCR-based ALK test in a large series of lung adenocarcinomas: Comparison with FISH, immunohistochemistry and next generation sequencing assays | |
| CN103382499A (en) | Specimen pretreatment method for reducing autofluorescence interference in fluorescence in situ hybridization method and reagent kit thereof | |
| SK500542023A3 (en) | In vitro method for identifying predictive biomarkers for targeted therapy and immunotherapy of patients with non-small cell lung cancer | |
| WO2024160270A1 (en) | Method for screening drug for tumor disease, program product, high-content imaging analysis system, and method for analyzing phase separation conditions | |
| CN105288659A (en) | Application of TENM1 gene and its expression product on diagnosis and treatment of papillary adenocarcinoma | |
| Kang et al. | Comparison of silver-enhanced in situ hybridization and fluorescence in situ hybridization for HER2 gene status in breast carcinomas | |
| Woroniecka | FISH diagnostics in plasma cell myeloma: recommendations and own experience | |
| JP2017523779A (en) | Methods for measuring drug response of patient-specific mutations | |
| Malapelle et al. | From traditional histology to next-generation pathology: a review of the workflow for the characterisation and molecular profiling of non-small cell lung cancer samples | |
| Pisapia et al. | RNA-Based Next-Generation Sequencing in Non-Small Cell Lung Cancer patients: data from Campania, Italy |