Перекрестная ссылка на родственную заявкуCross reference to related application
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет из предварительной заявки на патент США 62/982,852, поданной 28 февраля 2020 г. Раскрытие этой приоритетной заявки полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.[0001] This application claims priority from U.S. Provisional Patent Application No. 62/982,852, filed February 28, 2020. The disclosure of that priority application is incorporated herein by reference in its entirety.
Перечень последовательностейList of sequences
[0002] Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. Электронная копия Перечня последовательностей, созданная 23 февраля 2021 г., называется 022675_WO062_SL.txt и имеет размер 43 951 байт.[0002] This application contains a Sequence Listing, which has been submitted electronically in ASCII format and is incorporated herein by reference in its entirety. The electronic copy of the Sequence Listing, created on February 23, 2021, is named 022675_WO062_SL.txt and is 43,951 bytes in size.
Предпосылки создания изобретенияPrerequisites for the creation of an invention
[0003] AXL, также известный как UFO, JTK11, Tyro7 или ARK, экспрессируется на подмножествах миелоидных клеток, включая макрофаги и дендритные клетки, и является членом ТАМ (Tyro3-Axl-Mer) семейства рецепторных тирозинкиназ (RTK). ТАМ RTK представляют собой чувствительные к фосфатидилсерину рецепторы, участвующие в поглощении апоптотических клеток фагоцитирующими клетками. Эти киназы важны для поддержания гомеостаза тканей и органов, подвергающихся постоянному воздействию и клеточному обновлению. Лигандом для AXL является Growth Arrest Specific 6 (GAS6), который функционирует как линкер между фосфатидилсерином на апоптотических клетках и AXL и облегчает поглощение клеточного дебриса в процессе, известном как эффероцитоз.[0003] AXL, also known as UFO, JTK11, Tyro7, or ARK, is expressed on subsets of myeloid cells including macrophages and dendritic cells and is a member of the TAM (Tyro3-Axl-Mer) family of receptor tyrosine kinases (RTKs). TAM RTKs are phosphatidylserine-sensitive receptors involved in the engulfment of apoptotic cells by phagocytic cells. These kinases are important for maintaining homeostasis in tissues and organs that are subject to constant stress and cellular turnover. The ligand for AXL is Growth Arrest Specific 6 (GAS6), which functions as a linker between phosphatidylserine on apoptotic cells and AXL and facilitates the engulfment of cellular debris in a process known as efferocytosis.
[0004] Аберрантно повышенная активность ТАМ тесно связана с прогрессией опухоли, эпителиально-мезенхимальным переходом, метастазированием и резистентностью к таргетной терапии. Было показано, что опосредованный AXL эффероцитоз переводит экспрессирующие AXL клетки в иммуносупрессивное состояние со сниженной способностью представлять антигены Т-клеткам и продуцировать провоспалительные цитокины. После вызванной GAS6 активации AXL обеспечивает сильный сигнал выживания опухолевым клеткам через сигнальный путь PI3K/AKT. Повышенная экспрессия GAS6 и AXL коррелирует с плохим прогнозом у онкологических больных.[0004] Aberrantly increased TAM activity is closely associated with tumor progression, epithelial-mesenchymal transition, metastasis, and resistance to targeted therapy. AXL-mediated efferocytosis has been shown to render AXL-expressing cells immunosuppressed with reduced ability to present antigens to T cells and produce proinflammatory cytokines. Following GAS6-induced activation, AXL provides a strong survival signal to tumor cells via the PI3K/AKT pathway. Increased GAS6 and AXL expression correlate with poor prognosis in cancer patients.
[0005] Ввиду критической роли AXL в прогрессировании рака существует потребность в новых и улучшенных противораковых терапиях, нацеленных на AXL.[0005] Given the critical role of AXL in cancer progression, there is a need for new and improved anticancer therapies targeting AXL.
Краткое изложение сущности изобретенияBrief summary of the invention
[0006] Настоящее изобретение относится к новым рекомбинантным антителам, нацеленным на AXL, а также к фармацевтическим композициям, содержащим одно или несколько таких антител, и к применению этих антител и фармацевтических композиций для лечения рака. Антитела и композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы в способе лечения рака у пациента; могут быть использованы для изготовления лекарственного средства для лечения рака у пациента; или могут быть применены в лечении рака у пациента. По сравнению с доступными в настоящее время способами лечения таких видов рака, включая лечение антителами, предполагают, что антитела и композиции, описанные в настоящей заявке, могут обеспечивать превосходный клинический ответ либо по отдельности, либо в сочетании с другим противораковым терапевтическим средством.[0006] The present invention relates to novel recombinant antibodies targeting AXL, as well as pharmaceutical compositions comprising one or more such antibodies, and to the use of these antibodies and pharmaceutical compositions for the treatment of cancer. The antibodies and compositions described herein can be used in a method of treating cancer in a patient; can be used to manufacture a medicament for the treatment of cancer in a patient; or can be used in the treatment of cancer in a patient. Compared to currently available methods of treating such cancers, including antibody treatment, it is expected that the antibodies and compositions described herein can provide a superior clinical response either alone or in combination with another anti-cancer therapeutic agent.
[0007] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает антитело против AXL или его антигенсвязывающую часть, которое конкурирует или перекрестно конкурирует за связывание или связывается с тем же эпитопом AXL человека, что и антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 или 22883. В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть определяется аминокислотными последовательностями шести CDR, вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей или тяжелой и легкой цепями указанного антитела.[0007] In some embodiments, the present invention provides an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof that competes or cross-competes for binding or binds to the same epitope of human AXL as antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, or 22883. In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof is defined by the amino acid sequences of the six CDRs, the variable domains of the heavy and light chains, or the heavy and light chains of the antibody.
[0008] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против AXL или его антигенсвязывающей части, где[0008] In some embodiments, the present invention provides an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, wherein
а) тяжелая цепь указанного антитела содержит:a) the heavy chain of the said antibody contains:
i) определяющие комплементарность области тяжелой цепи (H-CDR)-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5-7, соответственно;i) heavy chain complementarity determining regions (H-CDR)-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5-7, respectively;
ii) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;ii) a heavy chain variable domain (VH) comprising an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
iii) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;iii) VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
илиor
iv) тяжелая цепь (НС), содержащая аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 61; иiv) a heavy chain (HC) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and 61; and
б) легкая цепь указанного антитела содержит:b) the light chain of the said antibody contains:
i) определяющие комплементарность области легкой цепи (L-CDR)-1-3 содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8-10, соответственно;i) light chain complementarity determining regions (L-CDR)-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8-10, respectively;
ii) вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;ii) a light chain variable domain (VL) comprising an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
iii) VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;iii) VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
илиor
iv) легкая цепь (LC), содержащая аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 и 62.iv) a light chain (LC) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 and 62.
[0009] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против AXL или его антигенсвязывающей части, где[0009] In some embodiments, the present invention relates to an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, wherein
а) тяжелая цепь указанного антитела содержит:a) the heavy chain of the said antibody contains:
i) H-CDR-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 15-17, соответственно;i) H-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 15-17, respectively;
ii) VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13;ii) a VH comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13;
iii) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;iii) VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13;
илиor
iv) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13 и 61; иiv) NS comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13 and 61; and
б) легкая цепь указанного антитела содержит:b) the light chain of the said antibody contains:
i) L-CDR-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 18-20, соответственно;i) L-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 18-20, respectively;
ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14;ii) a VL comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
iii) VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;iii) VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14;
илиor
iv) LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14 и 62.iv) LC comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 14 and 62.
[0010] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против AXL или его антигенсвязывающей части, где[0010] In some embodiments, the present invention relates to an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, wherein
а) тяжелая цепь указанного антитела содержит:a) the heavy chain of the said antibody contains:
i) H-CDR-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 25-27, соответственно;i) H-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 25-27, respectively;
ii) VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23;ii) a VH comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
iii) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23;iii) VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
илиor
iv) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23 и 61; иiv) NS comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23 and 61; and
б) легкая цепь указанного антитела содержит:b) the light chain of the said antibody contains:
i) L-CDR-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 28-30, соответственно;i) L-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 28-30, respectively;
ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24;ii) a VL comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
iii) VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;iii) VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24;
илиor
iv) LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24iv) LC comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 24
и 62.and 62.
[ООН] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против AXL или его антигенсвязывающей части, где а) тяжелая цепь указанного антитела содержит:[UN] In some embodiments, the present invention relates to an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, wherein a) the heavy chain of said antibody comprises:
i) H-CDR-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 35-37, соответственно;i) H-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 35-37, respectively;
ii) VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33;ii) a VH comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33;
iii) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33;iii) VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33;
илиor
iv) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 33 и 61; иiv) NS comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 33 and 61; and
б) легкая цепь указанного антитела содержит:b) the light chain of the said antibody contains:
i) L-CDR-1-3 содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 38-40, соответственно;i) L-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 38-40, respectively;
ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34;ii) a VL comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;
iii) VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34;iii) VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34;
илиor
iv) LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34 и 62.iv) LC comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 34 and 62.
[0012] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против AXL или его антигенсвязывающей части, где[0012] In some embodiments, the present invention relates to an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, wherein
а) тяжелая цепь указанного антитела содержит:a) the heavy chain of the said antibody contains:
i) H-CDR-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 45-47, соответственно;i) H-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 45-47, respectively;
ii) VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43;ii) a VH comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
iii) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43;iii) VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43;
илиor
iv) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 43 и 61; иiv) NS comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 43 and 61; and
б) легкая цепь указанного антитела содержит:b) the light chain of the said antibody contains:
i) L-CDR-1-3 содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 48-50, соответственно;i) L-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 48-50, respectively;
ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44;ii) a VL comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
iii) VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44;iii) VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 44;
илиor
iv) LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 44 и 62.iv) LC comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 44 and 62.
[0013] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против AXL или его антигенсвязывающей части, где а) тяжелая цепь указанного антитела содержит:[0013] In some embodiments, the present invention relates to an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, wherein a) the heavy chain of said antibody comprises:
i) H-CDR-1-3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 55-57, соответственно;i) H-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 55-57, respectively;
ii) VH, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53;ii) a VH comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;
iii) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53;iii) VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53;
илиor
iv) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 53 и 61; иiv) NS comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 53 and 61; and
б) легкая цепь указанного антитела содержит:b) the light chain of the said antibody contains:
i) L-CDR-1-3 содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 58-60, соответственно;i) L-CDR-1-3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 58-60, respectively;
ii) VL, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54;ii) a VL comprising an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54;
iii) VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54;iii) VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54;
илиor
iv) LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 54 и 62.iv) LC comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 54 and 62.
[0014] В настоящем изобретении также предложены выделенные молекулы нуклеиновых кислот, векторы и клетки-хозяева, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или и то и другое, антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, описанных в настоящей заявке. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы получения антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, описанных в настоящей заявке, путем культивирования указанных клеток-хозяев, а также способы получения композиции антител путем смешивания антител или антигенсвязывающих частей, описанных в настоящей заявке.[0014] The present invention also provides isolated nucleic acid molecules, vectors, and host cells comprising nucleotide sequences encoding the heavy chain or an antigen-binding portion thereof, the light chain or an antigen-binding portion thereof, or both, of the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein. The present invention further provides methods for producing the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein by culturing said host cells, as well as methods for producing an antibody composition by mixing the antibodies or antigen-binding portions described herein.
[0015] Другие признаки, цели и преимущества изобретения очевидны из последующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание с указанием вариантов осуществления и аспектов изобретения дано только в качестве иллюстрации, а не ограничения. Различные изменения и модификации в пределах объема изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники из подробного описания.[0015] Other features, objects and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description. However, it should be understood that the detailed description, with indication of embodiments and aspects of the invention, is given only by way of illustration and not limitation. Various changes and modifications within the scope of the invention will become apparent to those skilled in the art from the detailed description.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
[0016] ФИГ. 1А - 1С представляют собой набор графиков, показывающих профили связывания указанных антител против AXL человека с внеклеточным доменом (ECD) AXL человека (фиг.1А) и яванского макака (фиг.1В), транзиторно экспрессируемым на клетках CHO-S. Псевдотрансфицированные клетки CHO-S использовали в качестве отрицательного контроля (Фиг. 1С). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n=3).[0016] FIGS. 1A-1C are a set of graphs showing the binding profiles of designated anti-human AXL antibodies to the extracellular domain (ECD) of human (FIG. 1A) and cynomolgus monkey (FIG. 1B) AXL transiently expressed on CHO-S cells. Mock-transfected CHO-S cells were used as a negative control (FIG. 1C). Data are presented as mean ± SEM (n=3).
[0017] ФИГ. 2 представляет собой график, показывающий пролиферацию клеток Н1299 после обработки антителами против AXL. Для дальнейшей характеристики отбирали антитела в боксах. Данные были нормализованы для необработанных контролей (без GAS6), с пролиферативным ответом в присутствии GAS6 на оси X и пролиферативным ответом в отсутствие GAS6 на оси Y. Пунктирные горизонтальные и вертикальные линии обозначают уровни пролиферации при добавлении GAS6 по сравнению с контролями без GAS6, нормализованными для каждой установки (+ или - GAS6) отдельно. Каждая точка данных представляет собой среднее значение трех технических повторов для каждой оси.[0017] FIG. 2 is a graph showing the proliferation of H1299 cells following treatment with anti-AXL antibodies. Antibodies in boxes were selected for further characterization. The data were normalized to untreated controls (no GAS6), with the proliferative response in the presence of GAS6 on the X-axis and the proliferative response in the absence of GAS6 on the Y-axis. The dashed horizontal and vertical lines represent the proliferation levels with the addition of GAS6 compared to controls without GAS6, normalized for each setting (+ or - GAS6) separately. Each data point represents the average of three technical replicates for each axis.
[0018] ФИГ. 3 представляет собой пару графиков, показывающих пролиферацию клеток H1299, обработанных указанными антителами, в присутствии (верхняя панель) или в отсутствие (нижняя панель) лиганда GAS6. Данные нормализованы к необработанному контролю, и каждая точка данных на кривых представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n=3).[0018] FIG. 3 is a pair of graphs showing the proliferation of H1299 cells treated with the indicated antibodies in the presence (upper panel) or absence (lower panel) of GAS6 ligand. The data are normalized to the untreated control, and each data point in the curves represents the mean ± SEM (n=3).
[0019] ФИГ. 4 представляет собой график, показывающий индуцированное GAS6 поглощение липосом клетками MDA-MB-468-AXL, обработанными указанными антителами. Данные нормализованы к контрольным группам, получавшим GAS6 (пунктирная линия), и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Каждая точка данных представляет собой среднее значение трех технических повторов.[0019] FIG. 4 is a graph showing GAS6-induced liposome uptake by MDA-MB-468-AXL cells treated with the indicated antibodies. Data are normalized to GAS6-treated control groups (dashed line) and are presented as mean ± SEM. Each data point is the average of three technical replicates.
[0020] ФИГ. 5А и 5В представляют собой пару графиков, показывающих влияние двух антител AXL (22995 и 23203_2) или обработки носителем на рост опухоли у мышей NOD.Scid, которым трансплантировали клетки рака молочной железы человека MDA-MB-231. Серая область обозначает период лечения. Данные представлены как среднее ± SEM. **** Р<0,0001.[0020] FIG. 5A and 5B are a pair of graphs showing the effects of two AXL antibodies (22995 and 23203_2) or vehicle treatment on tumor growth in NOD.Scid mice transplanted with MDA-MB-231 human breast cancer cells. The gray area represents the treatment period. Data are presented as mean ± SEM. **** P < 0.0001.
[0021] ФИГ. 6 представляет собой таблицу, в которой представлены результаты перекрестной конкуренции для указанных антител и лиганда AXL, GAS6, протестированные в классическом сэндвич-анализе с помощью SPR. Данные нормализовали, чтобы скорректировать различия в связывающей способности рекомбинантных AXL-ECD для каждого антитела на поверхности. Сэндвич-антитела показаны белым цветом, а блокирующие антитела - серым цветом.[0021] FIG. 6 is a table showing the cross-competition results for the indicated antibodies and the AXL ligand, GAS6, tested in a classical sandwich assay using SPR. The data were normalized to correct for differences in the binding capacity of the recombinant AXL-ECDs for each antibody on the surface. Sandwich antibodies are shown in white and blocking antibodies are shown in gray.
[0022] ФИГ. 7 представляет собой таблицу, отражающую ответы (нм) биослойной интерферометрии (BLI) для связывания указанных антител с захваченными химерными белками человека/мыши, нормализованные на связывание антитела с полноразмерным AXL-ECD человека для каждого антитела. Последовательность AXL мыши («MoAXL») была заменена последовательностью AXL человека для домена Ig1, Ig2, Fn1 или Fn2 («HuIg1», «HuIg2», «HuFn1» и «HuFn2» отмечены жирным шрифтом). Серый цвет означает отсутствие реакции связывания; отрицательные ответы обусловлены незначительной диссоциацией захваченного антигена с поверхности Penta-His. Данные взяты из одного репрезентативного эксперимента.[0022] FIG. 7 is a table showing the biolayer interferometry (BLI) responses (nm) for binding of the indicated antibodies to captured human/mouse chimeric proteins, normalized to the binding of the antibody to full-length human AXL-ECD for each antibody. The mouse AXL sequence ("MoAXL") was replaced with the human AXL sequence for the Ig1, Ig2, Fn1, or Fn2 domain ("HuIg1," "HuIg2," "HuFn1," and "HuFn2" are shown in bold). Gray indicates no binding response; negative responses are due to minor dissociation of the captured antigen from the Penta-His surface. Data are from one representative experiment.
Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention
[0023] В настоящем изобретении предложены новые антитела против AXL человека, которые можно использовать для ингибирования активности AXL у пациента, такого как больной раком. Если не указано иное, используемый в настоящей заявке термин «AXL» относится к AXL человека. Полипептидная последовательность AXL человека доступна под регистрационным номером UniProt Р30530 (UFO_HUMAN) (SEQ ID NO: 63), как показано ниже:[0023] The present invention provides novel antibodies against human AXL that can be used to inhibit AXL activity in a patient, such as a cancer patient. Unless otherwise indicated, the term "AXL" as used herein refers to human AXL. The polypeptide sequence of human AXL is available under UniProt accession number P30530 (UFO_HUMAN) (SEQ ID NO: 63), as shown below:
[0024] Термин «антитело» (Ab) или «иммуноглобулин» (Ig), используемый в данной заявке, относится к тетрамеру, содержащему две тяжелые (Н) цепи (около 50-70 кДа) и две легкие (L) цепи (около 25 кДа) соединены между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Каждая легкая цепь состоит из вариабельного домена легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Домены VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые «областями, определяющими комплементарность» (CDR), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми «каркасными областями» (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR (H-CDR здесь обозначает CDR тяжелой цепи, a L-CDR здесь обозначает CDR легкой цепи) и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Назначение номеров аминокислот и областей FR и CDR в тяжелой или легкой цепи может соответствовать определениям IMGT® (нумерация Ей; Lefranc и соавт., Dev Comp Immunol 27(1):55-77 (2003)); или определениям Кабата, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 и 1991)); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia и соавт., Nature 342:878-883 (1989); MacCallum и соавт., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996); или Honegger and Pliickthun, J. Mol. Biol. 309(3):657-70 (2001).[0024] The term "antibody" (Ab) or "immunoglobulin" (Ig) as used herein refers to a tetramer comprising two heavy (H) chains (about 50-70 kDa) and two light (L) chains (about 25 kDa) linked together by disulfide bonds. Each heavy chain consists of a heavy chain variable domain (VH) and a heavy chain constant region (CH). Each light chain consists of a light chain variable domain (VL) and a light chain constant region (CL). The VH and VL domains can be further subdivided into regions of hypervariability, termed "complementarity determining regions" (CDRs), interspersed with more conserved regions, termed "framework regions" (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs (H-CDR here denotes the heavy chain CDR, and L-CDR here denotes the light chain CDR) and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The assignment of amino acid numbers and regions of FRs and CDRs in the heavy or light chain may follow the IMGT® definitions (Ei numbering; Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27(1):55–77 (2003)); or the definitions of Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987 and 1991)); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901–917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878–883 (1989); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732–745 (1996); or Honegger and Pliickthun, J. Mol. Biol. 309(3):657–70 (2001).
[0025] Термин «рекомбинантное антитело» относится к антителу, которое экспрессируется из клетки или клеточной линии, содержащей нуклеотидную(ые) последовательность(и), кодирующую(ие) антитело, при этом указанная(ые) нуклеотидная(ые) последовательность(и) в природе не связаны с клеткой.[0025] The term "recombinant antibody" refers to an antibody that is expressed from a cell or cell line containing the nucleotide sequence(s) encoding the antibody, wherein said nucleotide sequence(s) are not naturally associated with the cell.
[0026] Термин «выделенный белок», «выделенный полипептид» или «выделенное антитело» относится к белку, полипептиду или антителу, которые в силу своего происхождения или источника происхождения (1) не связаны с естественными ассоциированными компонентами, которые сопровождают их в нативном состоянии, (2) не содержит других белков того же вида, (3) экспрессируется клеткой другого вида и/или (4) не встречается в природе. Таким образом, полипептид, синтезированный химическим путем или синтезированный в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в природе, будет «выделен» из связанных с ним природных компонентов. Белок также может быть практически свободен от природных ассоциированных компонентов путем выделения с использованием методов очистки белка, хорошо известных в данной области.[0026] The term "isolated protein," "isolated polypeptide," or "isolated antibody" refers to a protein, polypeptide, or antibody that, by virtue of its origin or source of origin, (1) is not associated with the naturally occurring associated components that accompany it in the native state, (2) does not contain other proteins of the same species, (3) is expressed by a cell of a different species, and/or (4) is not found in nature. Thus, a polypeptide that is chemically synthesized or synthesized in a cellular system different from the cell from which it naturally originates will be "isolated" from its associated naturally occurring components. A protein can also be substantially free of naturally occurring associated components by isolation using protein purification techniques well known in the art.
[0027] Термин «аффинность» относится к мере притяжения между антигеном и антителом. Внутренняя привлекательность антитела для антигена обычно выражается как константа равновесия аффинности связывания (KD) конкретного взаимодействия антитело-антиген. Говорят, что антитело специфически связывается с антигеном, когда KD составляет ≤ 1 мМ, например, ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ или ≤ 10 нМ. Константу аффинности связывания KD можно измерить, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (например, BIAcore™) с использованием системы IBIS МХ96 SPR от IBIS Technologies или платформы Carterra LSA SPR, или с помощью интерферометрии Bio-Layer Interferometry, например, с использованием системы Octet™ от ForteBio.[0027] The term "affinity" refers to a measure of attraction between an antigen and an antibody. The intrinsic attraction of an antibody for an antigen is typically expressed as the binding affinity equilibrium constant (KD ) of a particular antibody-antigen interaction. An antibody is said to specifically bind to an antigen when the KD is ≤ 1 mM, such as ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, or ≤ 10 nM. The binding affinity constant KD can be measured, for example, by surface plasmon resonance (e.g., BIAcore™) using the IBIS MX96 SPR system from IBIS Technologies or the Carterra LSA SPR platform, or by Bio-Layer Interferometry, such as using the Octet™ system from ForteBio.
[0028] Термин «эпитоп», используемый в настоящей заявке, относится к части (детерминанте) антигена, которая специфически связывается с антителом или родственной молекулой, такой как молекула биспецифического связывания. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или углеводов или Сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным». В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком (например, антигеном) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) расположены линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействия расположены между аминокислотными остатками белка, которые отделены друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. После того как желаемый эпитоп на антигене определен, можно получить антитела к этому эпитопу с использованием методов, хорошо известных в данной области. Например, антитело к линейному эпитопу может быть получено, например, путем иммунизации животного пептидом, имеющим аминокислотные остатки линейного эпитопа. Антитело к конформационному эпитопу может быть получено, например, путем иммунизации животного мини-доменом, содержащим соответствующие аминокислотные остатки конформационного эпитопа. Антитело к конкретному эпитопу также может быть получено, например, путем иммунизации животного интересующей молекулой-мишенью (например, AXL) или соответствующей ее частью с последующим скринингом на связывание с эпитопом.[0028] The term "epitope" as used herein refers to a portion (determinant) of an antigen that specifically binds to an antibody or related molecule, such as a bispecific binding molecule. Epitope determinants typically consist of chemically active surface groups of molecules, such as amino acid or carbohydrate or sugar side chains, and typically have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. An epitope may be "linear" or "conformational." In a linear epitope, all of the interaction points between a protein (e.g., an antigen) and an interacting molecule (such as an antibody) are located linearly along the primary amino acid sequence of the protein. In a conformational epitope, the interaction points are located between amino acid residues of the protein that are separated from each other in the primary amino acid sequence. Once the desired epitope on an antigen has been identified, antibodies to that epitope can be produced using methods well known in the art. For example, an antibody to a linear epitope can be obtained, for example, by immunizing an animal with a peptide having amino acid residues of a linear epitope. An antibody to a conformational epitope can be obtained, for example, by immunizing an animal with a minidomain containing the corresponding amino acid residues of a conformational epitope. An antibody to a specific epitope can also be obtained, for example, by immunizing an animal with a target molecule of interest (e.g., AXL) or a corresponding portion thereof, followed by screening for binding to the epitope.
[0029] Можно определить, связывается ли антитело с тем же эпитопом, что и антитело против AXL в соответствии с настоящим изобретением, или конкурирует за связывание с ним, используя методы, известные в данной области, включая, помимо прочего, конкурентные анализы, связывание эпитопов и сканирование аланином. В некоторых вариантах осуществления антителу против AXL согласно настоящему изобретению дают связываться с AXL в условиях насыщения, а затем измеряют способность тестируемого антитела связываться с AXL. Если тестируемое антитело способно связываться с AXL одновременно с эталонным антителом против AXL, то тестируемое антитело связывается с другим эпитопом, чем эталонное антитело против AXL. Однако, если тестируемое антитело не способно одновременно связываться с AXL, тогда тестируемое антитело связывается с тем же эпитопом, перекрывающимся эпитопом или эпитопом, который находится в непосредственной близости от эпитопа, связанного антителом против AXL согласно настоящему изобретению. Этот эксперимент можно проводить с использованием, например, ELISA, RIA, BIACORE™, SPR, интерферометрии Bio-Layer или проточной цитометрии. Чтобы проверить, конкурирует ли перекрестно антитело против AXL с другим антителом против AXL, можно использовать метод конкуренции, описанный выше, в двух направлениях, т.е. определить, блокирует ли известное антитело тестируемое антитело, и наоборот. Такие перекрестно конкурентные эксперименты можно проводить, например, с использованием прибора IBIS МХ96 или Carterra LSA SPR или системы Octet™.[0029] It can be determined whether an antibody binds to the same epitope as an anti-AXL antibody of the present invention or competes for binding thereto using methods known in the art, including, but not limited to, competition assays, epitope binding, and alanine scanning. In some embodiments, an anti-AXL antibody of the present invention is allowed to bind to AXL under saturating conditions, and then the ability of the test antibody to bind to AXL is measured. If the test antibody is able to bind to AXL simultaneously with a reference anti-AXL antibody, then the test antibody binds to a different epitope than the reference anti-AXL antibody. However, if the test antibody is not able to bind to AXL simultaneously, then the test antibody binds to the same epitope, an overlapping epitope, or an epitope that is in close proximity to the epitope bound by the anti-AXL antibody of the present invention. This experiment can be performed using, for example, ELISA, RIA, BIACORE™, SPR, Bio-Layer interferometry or flow cytometry. To test whether an anti-AXL antibody cross-competes with another anti-AXL antibody, the competition assay described above can be used in two directions, i.e., to determine whether a known antibody blocks the test antibody and vice versa. Such cross-competition experiments can be performed using, for example, the IBIS MX96 or Carterra LSA SPR instrument or the Octet™ system.
[0030] Термин «человеческое антитело» относится к антителу, в котором последовательности вариабельного домена и константной области получены из последовательностей человека. Этот термин охватывает антитела с последовательностями, происходящими из генов человека, но модифицированными, например, для снижения иммуногенности, повышения аффинности и/или повышения стабильности. Кроме того, этот термин охватывает антитела, продуцируемые рекомбинантно в нечеловеческих клетках, которые могут придавать гликозилирование, нетипичное для клеток человека. Термин также охватывает антитела, продуцируемые в трансгенных нечеловеческих организмах с генами человеческих антител (например, крысы OmniRat®).[0030] The term "human antibody" refers to an antibody in which the variable domain and constant region sequences are derived from human sequences. This term includes antibodies with sequences derived from human genes but modified, for example, to reduce immunogenicity, increase affinity, and/or increase stability. In addition, this term includes antibodies produced recombinantly in non-human cells that may impart glycosylation that is not typical for human cells. The term also includes antibodies produced in transgenic non-human organisms with human antibody genes (e.g., OmniRat® rats).
[0031] Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») в данном контексте относится к одной или нескольким частям или фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, AXL человека или его частью). Показано, что определенные фрагменты полноразмерного антитела могут выполнять антигенсвязывающую функцию антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть», включают в себя (i) фрагмент Fab: одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHI; (ii) фрагмент F(ab')2: двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CHI; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb, состоящий из домена VH; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR), способную специфически связываться с антигеном. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить с помощью рекомбинантных методов с помощью синтетического линкера, что позволяет сделать их единой белковой цепью, в которой домены VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv)). Также в рамках настоящего изобретения представлены антигенсвязывающие молекулы, содержащие VH и/или VL. В случае VH молекула может также содержать одну или несколько областей СН1, шарнирную, СН2 или СН3. Предполагают, что такие одноцепочечные антитела охватываются термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой двухвалентные, биспецифические антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием слишком короткого линкера, который не позволяет спаривать два домена в одной цепи, тем самым заставляя домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающие участки.[0031] The term "antigen-binding portion" of an antibody (or simply "antibody portion"), as used herein, refers to one or more portions or fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., human AXL or a portion thereof). Certain fragments of a full-length antibody have been shown to perform the antigen-binding function of an antibody. Examples of binding fragments encompassed by the term "antigen-binding portion" include (i) a Fab fragment: a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CHI domains; (ii) an F(ab')2 fragment: a divalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CHI domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody; (v) a dAb fragment consisting of the VH domain; and (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) capable of specifically binding to an antigen. Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are encoded by separate genes, they can be joined by recombinant techniques using a synthetic linker to form a single protein chain in which the VL and VH domains are paired to form monovalent molecules (known as single-chain Fv (scFv)). Also provided within the scope of the present invention are antigen-binding molecules comprising VH and/or VL. In the case of VH, the molecule may also comprise one or more CH1, hinge, CH2, or CH3 regions. Such single-chain antibodies are intended to be encompassed by the term "antigen-binding portion" of an antibody. Other forms of single-chain antibodies, such as diabodies, are also encompassed. Diabodies are bivalent, bispecific antibodies in which the VH and VL domains are expressed on a single polypeptide chain, but using a linker that is too short to allow pairing of the two domains on one chain, thereby forcing the domains to pair with the complementary domains of another chain and creating two antigen-binding sites.
[0032] Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')2, могут быть получены из цельных антител с использованием обычных способов, таких как расщепление целых антител папаином или пепсином. Кроме того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезина можно получить с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящей заявке.[0032] Antibody portions, such as Fab and F(ab')2 fragments, can be obtained from whole antibodies using conventional methods, such as digestion of whole antibodies with papain or pepsin. In addition, antibodies, antibody portions, and immunoadhesin molecules can be produced using standard recombinant DNA techniques, such as described herein.
[0033] Класс (изотип) и подкласс антител против AXL можно определить любым способом, известным в данной области. Как правило, класс и подкласс антитела можно определить с использованием антител, специфичных для конкретного класса и подкласса антител. Такие антитела коммерчески доступны. Класс и подкласс можно определить с помощью ELISA или вестерн-блоттинга, а также с помощью других методов. Альтернативно, класс и подкласс можно определить путем секвенирования всей или части константной области тяжелых и/или легких цепей антител, сравнения их аминокислотных последовательностей с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов, и определения класса и подкласса антител.[0033] The class (isotype) and subclass of anti-AXL antibodies can be determined by any method known in the art. Typically, the class and subclass of an antibody can be determined using antibodies specific for a particular antibody class and subclass. Such antibodies are commercially available. The class and subclass can be determined by ELISA or Western blotting, as well as by other methods. Alternatively, the class and subclass can be determined by sequencing all or part of the constant region of the heavy and/or light chains of the antibodies, comparing their amino acid sequences with known amino acid sequences of various immunoglobulin classes and subclasses, and determining the class and subclass of the antibodies.
[0034] Если не указано иное, все номера аминокислотных остатков антител, указанные в данном описании, соответствуют нумерации по схеме IMGT (нумерация ЕС).[0034] Unless otherwise indicated, all amino acid residue numbers of antibodies referred to in this specification correspond to the IMGT numbering scheme (EU numbering).
Антитела против AXLAntibodies against AXL
[0035] Настоящее изобретение относится к антителам, направленным против AXL, и их антигенсвязывающим частям. В конкретном аспекте антитела, раскрытые в настоящей заявке, представляют собой человеческие антитела, полученные из трансгенных животных (например, крыс), которые способны продуцировать антитела, кодируемые реаранжированными генами антител человека. В некоторых вариантах осуществления антитела человека могут содержать определенные мутации, например, для замены мутаций, происходящих от праймеров, обратно на последовательность зародышевой линии (см., например, «скорректированные по Symplex» вариантные последовательности в таблице 1).[0035] The present invention relates to antibodies directed against AXL and antigen-binding portions thereof. In a particular aspect, the antibodies disclosed herein are human antibodies derived from transgenic animals (e.g., rats) that are capable of producing antibodies encoded by rearranged human antibody genes. In some embodiments, the human antibodies may contain certain mutations, e.g., to replace mutations derived from primers back to the germline sequence (see, e.g., the "Symplex-corrected" variant sequences in Table 1).
[0036] В некоторых вариантах осуществления антитела против AXL в соответствии с настоящим изобретением имеют мутации «LALA» (L234A/L235A) в области Fc. Эти мутации препятствуют связыванию антител с человеческим FcγR (гамма-рецепторами Fc). Такие антитела выгодны, потому что они имеют низкий уровень вторичных эффекторных функций и, следовательно, не истощают эффекторные Т-клетки и не нацеливаются на другие незлокачественные клетки.[0036] In some embodiments, the anti-AXL antibodies of the present invention have "LALA" mutations (L234A/L235A) in the Fc region. These mutations prevent the antibodies from binding to human FcγR (Fc gamma receptors). Such antibodies are advantageous because they have low levels of secondary effector functions and therefore do not deplete effector T cells or target other non-malignant cells.
[0037] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть конкурирует или перекрестно конкурирует за связывание с AXL человека с или связывается с тем же эпитопом AXL человека, что и антитело, содержащее:[0037] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof competes or cross-competes for binding to human AXL with or binds to the same epitope of human AXL as an antibody comprising:
а) тяжелую цепь (НС), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 61 и легкую цепь (LC), содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 и 62;a) a heavy chain (HC) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and 61 and a light chain (LC) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 and 62;
б) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14 и 62;b) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 14 and 62;
в) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24 и 62;c) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 24 and 62;
г) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 33 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34 и 62;d) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 33 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 34 and 62;
д) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 43 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 44 и 62; илиd) NS comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 43 and 61 and LC comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 44 and 62; or
е) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 53 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 54 и 62.e) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 53 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 54 and 62.
[0038] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи (H-CDR3) SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47 или 57.[0038] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has the heavy chain CDR3 (H-CDR3) amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, 17, 27, 37, 47, or 57.
[0039] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет CDR1-3 тяжелой цепи (H-CDR1-3), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5-7, 15-17, 25-27, 35-37, 45-47 или 55-57, соответственно.[0039] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has a heavy chain CDR1-3 (H-CDR1-3) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5-7, 15-17, 25-27, 35-37, 45-47, or 55-57, respectively.
[0040] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 или 53.[0040] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has a heavy chain variable domain (VH) amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, or 53.
[0041] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 или 53.[0041] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has a VH comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, or 53.
[0042] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL имеет аминокислотную последовательность VH, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 или 53; и последовательность аминокислот константной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61.[0042] In some embodiments, an anti-AXL antibody has a VH amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, or 53; and a heavy chain constant region amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61.
[0043] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL содержит аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 или 53 и аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 61.[0043] In some embodiments, an anti-AXL antibody comprises a VH amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, or 53 and a heavy chain constant region amino acid sequence of SEQ ID NO: 61.
[0044] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи (L-CDR3) SEQ ID NO: 10, 20, 30, 40, 50 или 60.[0044] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has the light chain CDR3 (L-CDR3) amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, 20, 30, 40, 50, or 60.
[0045] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет CDR1-3 легкой цепи (L-CDR1-3), содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8-10, 18-20, 28-30, 38-40, 48-50 или 58-60, соответственно.[0045] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has a light chain CDR1-3 (L-CDR1-3) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 8-10, 18-20, 28-30, 38-40, 48-50, or 58-60, respectively.
[0046] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44 или 54.[0046] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has a light chain variable domain (VL) amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, or 54.
[0047] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть имеет VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44 или 54.[0047] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has a VL comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, or 54.
[0048] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL имеет аминокислотную последовательность VL, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44 или 54; и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62.[0048] In some embodiments, the anti-AXL antibody has a VL amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, or 54; and a light chain constant region amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62.
[0049] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL содержит аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, или 54 и аминокислотную последовательность константной области легкой цепи SEQ ID NO: 62.[0049] In some embodiments, an anti-AXL antibody comprises a VL amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44, or 54 and a light chain constant region amino acid sequence of SEQ ID NO: 62.
[0050] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL содержит любую из описанных выше тяжелых цепей и любую из описанных выше легких цепей.[0050] In some embodiments, an anti-AXL antibody comprises any of the heavy chains described above and any of the light chains described above.
[0051] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть в соответствии с настоящим изобретением содержит аминокислотные последовательности H-CDR1-3 и L-CDR1-3:[0051] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention comprises the amino acid sequences H-CDR1-3 and L-CDR1-3:
а) SEQ ID NO: 5-10, соответственно;a) SEQ ID NO: 5-10, respectively;
б) SEQ ID NO: 15-20, соответственно;b) SEQ ID NO: 15-20, respectively;
в) SEQ ID NO: 25-30, соответственно;c) SEQ ID NO: 25-30, respectively;
г) SEQ ID NO: 35-40, соответственно;d) SEQ ID NO: 35-40, respectively;
д) SEQ ID NO: 45-50, соответственно; илиd) SEQ ID NO: 45-50, respectively; or
е) SEQ ID NO: 55-60, соответственно.e) SEQ ID NO: 55-60, respectively.
[0052] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть в соответствии с настоящим изобретением содержит VH и VL, которые на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичны (например, идентичны на 90%) с аминокислотными последовательностями:[0052] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention comprises a VH and VL that are 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical (e.g., 90% identical) to the amino acid sequences:
а) SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно;a) SEQ ID NO: 3 and 4, respectively;
б) SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно;b) SEQ ID NO: 13 and 14, respectively;
в) SEQ ID NO: 23 и 24, соответственно;c) SEQ ID NO: 23 and 24, respectively;
г) SEQ ID NO: 33 и 34, соответственно;d) SEQ ID NO: 33 and 34, respectively;
д) SEQ ID NO: 43 и 44, соответственно; илиd) SEQ ID NO: 43 and 44, respectively; or
е) SEQ ID NO: 53 и 54, соответственно.e) SEQ ID NO: 53 and 54, respectively.
[0053] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть в соответствии с настоящим изобретением содержит VH и VL, которые содержат аминокислотные последовательности:[0053] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention comprises a VH and VL that comprise the amino acid sequences:
а) SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно;a) SEQ ID NO: 3 and 4, respectively;
б) SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно;b) SEQ ID NO: 13 and 14, respectively;
в) SEQ ID NO: 23 и 24, соответственно;c) SEQ ID NO: 23 and 24, respectively;
г) SEQ ID NO: 33 и 34, соответственно;d) SEQ ID NO: 33 and 34, respectively;
д) SEQ ID NO: 43 и 44, соответственно; илиd) SEQ ID NO: 43 and 44, respectively; or
е) SEQ ID NO: 53 и 54, соответственно.e) SEQ ID NO: 53 and 54, respectively.
[0054] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL в соответствии с настоящим изобретением содержит:[0054] In some embodiments, an anti-AXL antibody of the present invention comprises:
а) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3a) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3
и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 и 62;and 61 and LC, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 and 62;
б) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 14 и 62;b) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 14 and 62;
в) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 24 и 62;c) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 23 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 24 and 62;
г) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 33 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 34 и 62;d) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 33 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 34 and 62;
д) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 43 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 44 и 62; илиd) NS comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 43 and 61 and LC comprising the amino acid sequences of SEQ ID NO: 44 and 62; or
е) НС, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 53 и 61 и LC, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 54 и 62.e) NS containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 53 and 61 and LC containing the amino acid sequences of SEQ ID NO: 54 and 62.
[0055] В настоящем изобретении также предложено антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, которые конкурируют или перекрестно конкурируют за связывание или связываются с тем же эпитопом, что и антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 или 22883.[0055] The present invention also provides an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof that competes or cross-competes for binding or binds to the same epitope as antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, or 22883.
[0056] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть в соответствии с настоящим изобретением содержит аминокислотные последовательности H-CDR1-3 и L-CDR1-3 антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 или 22883.[0056] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention comprises the amino acid sequences of H-CDR1-3 and L-CDR1-3 of antibody 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, or 22883.
[0057] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть в соответствии с настоящим изобретением содержит VH и VL, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны аминокислотной последовательности VH и VL, соответственно, антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 или 22883.[0057] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention comprises a VH and VL that are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequence of the VH and VL, respectively, of antibody 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, or 22883.
[0058] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть в соответствии с настоящим изобретением содержит VH и VL, которые представляют собой VH и VL, соответственно, антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, или 22883.[0058] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention comprises a VH and VL that are the VH and VL, respectively, of antibody 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, or 22883.
[0059] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL в соответствии с настоящим изобретением представляет собой антитело 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 или 22883, или антитело с той же аминокислотной последовательностью, что и указанное антитело.[0059] In some embodiments, an anti-AXL antibody of the present invention is antibody 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, or 22883, or an antibody with the same amino acid sequence as said antibody.
[0060] В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке и относящихся к последовательности, содержащей H-CDR3 антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3 или 23203_4, указанная H-CDR3 может быть заменена вариантом H-CDR3, в котором остаток серина (S) в положении 2 в последовательности CSSREYSSRWHFDYW (SEQ ID NO: 7) заменен аланином (А), так что последовательность H-CDR3 представляет собой CASREYSSRWHFDYW (SEQ ID NO: 65). Вариантный остаток выделен жирным/подчеркнутым шрифтом.[0060] In any of the embodiments described herein and relating to a sequence comprising an H-CDR3 of antibody 23203_1, 23203_2, 23203_3 or 23203_4, said H-CDR3 may be replaced by a variant H-CDR3 in which the serine (S) residue at position 2 in the sequence CSSREYSSRWHFDYW (SEQ ID NO: 7) is replaced by an alanine (A), such that the H-CDR3 sequence is CASREYSSRWHFDYW (SEQ ID NO: 65). The variant residue is highlighted in bold/underlined.
[0061] В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке и относящихся к последовательности, содержащей H-FR3 антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3 или 23203_4, указанный H-FR3 может быть заменен вариантом H-FR3, в котором остаток аспартата (D) в положении 32 в последовательности NYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY (SEQ ID NO: 66) заменен остатком глицина (G), так что последовательность H-FR3 представляет собой NYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAGTAVYY (SEQ ID NO: 67). Вариантный остаток выделен жирным/подчеркнутым шрифтом.[0061] In any of the embodiments described herein and relating to a sequence comprising H-FR3 of antibody 23203_1, 23203_2, 23203_3 or 23203_4, said H-FR3 may be replaced by a variant H-FR3 in which the aspartate (D) residue at position 32 in the sequence NYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY (SEQ ID NO: 66) is replaced by a glycine (G) residue, such that the H-FR3 sequence is NYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAAGTAVYY (SEQ ID NO: 67). The variant residue is highlighted in bold/underlined.
[0062] В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке, относящихся к VL 22995 (SEQ ID NO: 44), указанная последовательность может быть заменена любой последовательностью зародышевой линии IGKV/IGKJ человека. В некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность может содержать L-CDR1, L-CDR2 и L-CDR3 SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно, которые привиты к любой последовательности IGKV/IGKJ человека, тем самым заменяя исходную последовательность зародышевой линии.[0062] In any of the embodiments described herein relating to VL 22995 (SEQ ID NO: 44), said sequence may be replaced with any human IGKV/IGKJ germline sequence. In some embodiments, the replacement sequence may comprise L-CDR1, L-CDR2, and L-CDR3 of SEQ ID NOs: 48, 49, and 50, respectively, which are grafted onto any human IGKV/IGKJ sequence, thereby replacing the original germline sequence.
[0063] Класс антитела против AXL, полученного способами, описанными в настоящей заявке, может быть изменен или заменен другим классом или подклассом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая VL или VH, выделяется с использованием способов, хорошо известных в данной области, так что она не включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CL или СН, соответственно. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие VL или VH, затем оперативно связывают с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей CL или СН, соответственно, из другого класса молекулы иммуноглобулина. Это может быть достигнуто с использованием вектора или молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность CL или СН, как описано выше. Например, класс антитела против AXL, который изначально был IgM, может быть изменен на IgG. Кроме того, переключение классов можно использовать для преобразования одного подкласса IgG в другой, например, из IgG1 в IgG2. Константная область легкой цепи к может быть заменена, например, на константную область легкой цепи X или наоборот. Примерный способ получения антитела в соответствии с настоящим изобретением с желаемым изотипом Ig включает стадии выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела против AXL, и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела против AXL, получения вариабельного домена тяжелой цепи, лигирование кодирующей последовательности вариабельного домена тяжелой цепи с кодирующей последовательностью константной области тяжелой цепи желаемого изотипа, экспрессирования легкой цепи и тяжелой цепи, кодируемых лигированной последовательностью в клетке, и сбор антитела против AXL с желаемым изотипом.[0063] The class of an anti-AXL antibody produced by the methods described herein may be changed or replaced with another class or subclass. In some embodiments of the present invention, a nucleic acid molecule encoding a VL or VH is isolated using methods well known in the art such that it does not include nucleic acid sequences encoding CL or CH, respectively. The nucleic acid molecules encoding the VL or VH are then operably linked to a nucleic acid sequence encoding CL or CH, respectively, from another class of immunoglobulin molecule. This can be achieved using a vector or nucleic acid molecule that contains a CL or CH sequence, as described above. For example, the class of an anti-AXL antibody that was originally IgM can be changed to IgG. Additionally, class switching can be used to convert one IgG subclass to another, such as from IgG1 to IgG2 . The constant region of the light chain k can be replaced, for example, by the constant region of the light chain X or vice versa. An exemplary method for producing an antibody according to the present invention with a desired Ig isotype includes the steps of isolating a nucleic acid molecule encoding a heavy chain of an antibody against AXL and a nucleic acid molecule encoding a light chain of an antibody against AXL, obtaining a variable domain of the heavy chain, ligating the coding sequence of the variable domain of the heavy chain with the coding sequence of the constant region of the heavy chain of the desired isotype, expressing the light chain and the heavy chain encoded by the ligated sequence in a cell, and collecting the antibody against AXL with the desired isotype.
[0064] Антитело против AXL согласно настоящему изобретению может представлять собой молекулу IgG, IgM, IgE, IgA или IgD, но обычно относится к изотипу IgG, например, к подклассу IgG IgG1, IgG2a или IgG2b, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело относится к подклассу изотипа IgG1.[0064] An anti-AXL antibody of the present invention may be an IgG, IgM, IgE, IgA, or IgD molecule, but is typically of an IgG isotype, such as the IgG subclass IgG1 , IgG2a or IgG2b , IgG3 or IgG4 . In some embodiments, the antibody is of the IgG isotype subclass1 .
[0065] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL может содержать по меньшей мере одну мутацию в области Fc. Известен ряд различных мутаций Fc, где эти мутации изменяют эффекторную функцию антитела. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело против AXL содержит по меньшей мере одну мутацию в области Fc, которая снижает эффекторную функцию, например, мутации в одном или нескольких из положений 228, 233, 234 и 235, где положения аминокислот пронумерованы в соответствии со схемой нумерации IMGT®.[0065] In some embodiments, an anti-AXL antibody may comprise at least one mutation in the Fc region. A number of different Fc mutations are known, wherein the mutations alter the effector function of the antibody. For example, in some embodiments, an anti-AXL antibody comprises at least one mutation in the Fc region that reduces effector function, such as mutations at one or more of positions 228, 233, 234, and 235, wherein the amino acid positions are numbered according to theIMGT® numbering scheme.
[0066] В некоторых вариантах осуществления, например, когда антитело относится к подклассу IgG1, один или оба аминокислотных остатка в положениях 234 и 235 могут быть мутированы, например, с Leu на Ala (L234A/L235A). Эти мутации снижают эффекторную функцию области Fc антител IgG1. Положения аминокислот пронумерованы в соответствии со схемой нумерации IMGT.[0066] In some embodiments, for example, when the antibody is of theIgG1 subclass, one or both amino acid residues at positions 234 and 235 can be mutated, for example, from Leu to Ala (L234A/L235A). These mutations reduce the effector function of the Fc region of theIgG1 antibodies. The amino acid positions are numbered according to the IMGT numbering scheme.
[0067] В некоторых вариантах осуществления, например, когда антитело относится к подклассу IgG4, оно может содержать мутацию S228P, где положение аминокислот пронумеровано в соответствии со схемой нумерации IMGT®. Известно, что эта мутация уменьшает нежелательный обмен фрагментами Fab.[0067] In some embodiments, for example, when the antibody is of theIgG4 subclass, it may comprise a mutation S228P, where the amino acid position is numbered according to theIMGT® numbering scheme. This mutation is known to reduce unwanted exchange of Fab fragments.
[0068] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть связывается с AXL человека с KD приблизительно 5×10-8, 4×10-8, 3×10-8, 2×10-8, 1×10-8, 9×10-9, 8×10-9, 7×10-9, 6×10-9, 5×10-9, 4×10-9, 3×10-9, 2×10-9, 1×10-9, 9×10-10, 8×10-10, 7×10-10, 6×10-10, или 5×10-10 М или менее.[0068] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof binds to human AXL with a KD of about 5×10-8 , 4×10-8 , 3×10-8 , 2×10-8 , 1×10-8 , 9×10-9 , 8×10-9 , 7×10-9 , 6×10-9 , 5×10-9 , 4×10-9 , 3×10-9 , 2×10-9 , 1×10-9 , 9×10-10 , 8×10-10 , 7×10-10 , 6×10-10 , or 5×10-10 M or less.
[0069] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть связывается с AXL яванского макака с KD приблизительно 9×10-8, 8×10-8, 7×10-8, 6×10-8, 5×10-8, 4×10-8, 3×10-8, 2×10-8, 1×10-8, 9×10-9, 8×10-9, 7×10-9, 6×10-9 или 5×10-9 или менее.[0069] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof binds to cynomolgus monkey AXL with a KD of about 9×10-8 , 8×10-8 , 7×10-8 , 6×10-8 , 5×10-8 , 4×10-8 , 3×10-8 , 2×10-8 , 1×10-8 , 9×10-9 , 8×10-9 , 7×10-9 , 6×10-9 , or 5×10-9 or less.
[0070] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть ингибирует пролиферацию клеток H1299in vitro в концентрации приблизительно 1, 5, 10, 15, 20 или 25 мкг/мл или менее в присутствии GAS6 (например, когда GAS6 присутствует в концентрации приблизительно 1 мкг/мл).[0070] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof inhibits proliferation of H1299 cellsin vitro at a concentration of about 1, 5, 10, 15, 20, or 25 μg/mL or less in the presence of GAS6 (e.g., when GAS6 is present at a concentration of about 1 μg/mL).
[0071] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть не проявляет агонистической активности, например, в концентрации до приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, или 25 мкг/мл, при отсутствии GAS6.[0071] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof does not exhibit agonist activity, such as at a concentration of up to about 1, 5, 10, 15, 20, or 25 μg/mL, in the absence of GAS6.
[0072] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть ингибирует индуцированное GAS6 поглощение фосфатидилсеринсодержащих липосом, например, в концентрации приблизительно 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, или 6 мкг/мл или менее, в клетках MDA-MB-468-AXL, стабильно экспрессирующих экзогенный AXL.[0072] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof inhibits GAS6-induced uptake of phosphatidylserine-containing liposomes, such as at a concentration of about 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, or 6 μg/mL or less, in MDA-MB-468-AXL cells stably expressing exogenous AXL.
[0073] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть ингибирует рост опухолиin vivo, например, в концентрации приблизительно 10 мг/кг или 50 мг/кг.[0073] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof inhibits tumor growthin vivo , such as at a concentration of about 10 mg/kg or 50 mg/kg.
[0074] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть ингибирует связывание GAS6 с AXL человека.[0074] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof inhibits the binding of GAS6 to human AXL.
[0075] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть распознает другой эпитоп AXL человека, чем 10G5 и/или YW327.6S2.[0075] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof recognizes a different epitope of human AXL than 10G5 and/or YW327.6S2.
[0076] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть не связывается с AXL мыши.[0076] In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof does not bind to mouse AXL.
[0077] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть связывается с доменом Ig1 AXL человека. В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть связывается с доменом Ig2 AXL человека.[0077] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof binds to the Ig1 domain of human AXL. In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof binds to the Ig2 domain of human AXL.
[0078] В настоящем изобретении также рассматривают антитело против AXL или его антигенсвязывающую часть, описанные в настоящей заявке, с любой комбинацией вышеуказанных свойств.[0078] The present invention also contemplates an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein with any combination of the above properties.
[0079] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, описанные в настоящей заявке, имеют по меньшей мере одно (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или все 9) из следующих свойств:[0079] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein has at least one (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or all 9) of the following properties:
а) связывается с AXL человека с KD 3×10-8 М или менее;a) binds to human AXL with a KD of 3×10-8 M or less;
б) связывается с AXL яванского макака с KD 8×10-8 М или менее;b) binds to the AXL of cynomolgus macaque with a KD of 8×10-8 M or less;
в) не связывается с AXL мыши;c) does not bind to AXL mice;
г) связывается с доменом Ig1 или Ig2 AXL человека;d) binds to the Ig1 or Ig2 domain of human AXL;
д) ингибирует связывание GAS6 с AXL человека;d) inhibits the binding of GAS6 to human AXL;
е) ингибирует пролиферацию клеток H1299in vitro в присутствии GAS6 (например, когда антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть находится в концентрации 25 мкг/мл или менее и GAS6 находится в концентрации 1 мкг/мл);e) inhibits the proliferation of H1299 cellsin vitro in the presence of GAS6 (e.g., when the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof is at a concentration of 25 μg/ml or less and GAS6 is at a concentration of 1 μg/ml);
ж) не проявляет агонистической активности в отсутствие GAS6 (например, в концентрации до 25 мкг/мл);g) does not exhibit agonist activity in the absence of GAS6 (e.g. at concentrations up to 25 μg/ml);
з) ингибирует индуцированное GAS6 поглощение фосфатидилсеринсодержащих липосом в клетках MDA-MB-468-AXL, стабильно экспрессирующих экзогенный AXL (например, в концентрации 6 мкг/мл или менее); иh) inhibits GAS6-induced uptake of phosphatidylserine-containing liposomes in MDA-MB-468-AXL cells stably expressing exogenous AXL (e.g., at a concentration of 6 μg/mL or less); and
и) ингибирует рост опухолиin vivo (например, в концентрации 10 мг/кг или 50 мг/кг).i) inhibits tumor growthin vivo (e.g. at a concentration of 10 mg/kg or 50 mg/kg).
В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере свойствами а)-и). В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере свойствами а)-д) и ж)-и). В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере свойствами а), б), д), ж) и з). В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере свойствами а)-д), ж) и з). В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть обладают по меньшей мере свойствами а)-д), ж), а также и).In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has at least the properties a)-i). In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has at least the properties a)-e) and g)-i). In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has at least the properties a), b), e), g) and h). In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has at least the properties a)-e), g) and h). In some embodiments, the anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof has at least the properties a)-e), g) and i).
[0080] В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, описанные в настоящей заявке, могут ингибировать рост опухоли и/или вызывать регрессию роста опухолиin vivo. В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, описанные в настоящей заявке, могут замедлить или обратить вспять метастазирование у онкологического больного. В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, описанные в настоящей заявке, могут продлить жизнь онкологического больного. Также рассматривается любая комбинация вышеуказанных свойств.[0080] In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein can inhibit tumor growth and/or cause regression of tumor growthin vivo . In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein can slow or reverse metastasis in a cancer patient. In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein can prolong the survival of a cancer patient. Any combination of the above properties is also contemplated.
[0081] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению может быть частью более крупной молекулы иммуноадгезина, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или его части с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезина включают использование центральной области стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov и соавт., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) и использование цистеинового остатка, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для образования двухвалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov и соавт., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Другие примеры включают случаи, когда один или несколько CDR из антитела встраивают в молекулу либо ковалентно, либо нековалентно, чтобы сделать ее иммуноадгезином, который специфически связывается с представляющим интерес антигеном. В таких вариантах осуществления CDR могут быть встроены как часть более крупной полипептидной цепи, могут быть ковалентно связаны с другой полипептидной цепью или могут быть встроены нековалентно.[0081] In some embodiments, an antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention may be part of a larger immunoadhesin molecule formed by covalent or non-covalent association of the antibody or portion thereof with one or more other proteins or peptides. Examples of such immunoadhesin molecules include the use of a streptavidin core region to generate a tetrameric scFv molecule (Kipriyanov et al., Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 (1995)) and the use of a cysteine residue, a marker peptide, and a C-terminal polyhistidine tag to generate divalent and biotinylated scFv molecules (Kipriyanov et al., Mol. Immunol. 31:1047-1058 (1994)). Other examples include cases where one or more CDRs from an antibody are incorporated into the molecule either covalently or non-covalently to make it an immunoadhesin that specifically binds to an antigen of interest. In such embodiments, the CDRs may be incorporated as part of a larger polypeptide chain, may be covalently linked to another polypeptide chain, or may be incorporated non-covalently.
[0082] В другом аспекте может быть получено слитое антитело или иммуноадгезин, которое содержит все антитело против AXL согласно настоящему изобретению или его часть, связанные с другим полипептидом. В некоторых вариантах осуществления с полипептидом связаны только вариабельные домены антитела против AXL. В некоторых вариантах осуществления домен VH антитела против AXL связан с первым полипептидом, тогда как домен VL антитела против AXL связан со вторым полипептидом, который связывается с первым полипептидом таким образом, что домены VH и VL могут взаимодействовать друг с другом, образуя антигенсвязывающий участок. В некоторых вариантах осуществления домен VH отделен от домена VL линкером, так что домены VH и VL могут взаимодействовать друг с другом (например, одноцепочечные антитела). Затем антитело VH-линкер-VL связывают с представляющим интерес полипептидом. Кроме того, могут быть созданы слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела связаны друг с другом. Это выгодно, если нужно создать двухвалентное или поливалентное антитело на одной полипептидной цепи или если нужно создать биспецифическое антитело.[0082] In another aspect, a fusion antibody or immunoadhesin can be produced that comprises all or a portion of an anti-AXL antibody of the present invention linked to another polypeptide. In some embodiments, only the variable domains of the anti-AXL antibody are linked to the polypeptide. In some embodiments, the VH domain of the anti-AXL antibody is linked to a first polypeptide, while the VL domain of the anti-AXL antibody is linked to a second polypeptide that binds to the first polypeptide such that the VH and VL domains can interact with each other to form an antigen-binding site. In some embodiments, the VH domain is separated from the VL domain by a linker such that the VH and VL domains can interact with each other (e.g., single chain antibodies). The VH-linker-VL antibody is then linked to the polypeptide of interest. Fusion antibodies can also be created in which two (or more) single chain antibodies are linked to each other. This is advantageous if one wants to create a bivalent or polyvalent antibody on a single polypeptide chain or if one wants to create a bispecific antibody.
[0083] Для создания одноцепочечного антитела (scFv), фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, оперативно связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующий аминокислотную последовательность (Gly4 -Ser)3 (SEQ ID NO: 64), так что последовательности VH и VL могут быть экспрессированы как непрерывный одноцепочечный белок с доменами VL и VH, соединенными гибким линкером. См., например, Bird и соавт., Science 242:423-426 (1988); Huston и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); и McCafferty и соавт., Nature 348:552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть одновалентным, если используют только одиночные VH и VL; двухвалентным, если используют два VH и VL; или поливалентным, если используют более двух VH и VL. Могут быть созданы биспецифические или поливалентные антитела, которые специфически связываются с AXL человека и, например, с другой молекулой.[0083] To generate a single chain antibody (scFv), DNA fragments encoding VH and VL are operably linked to another fragment encoding a flexible linker, e.g., encoding the amino acid sequence (Gly4 -Ser)3 (SEQ ID NO: 64), such that the VH and VL sequences can be expressed as a continuous single chain protein with the VL and VH domains connected by the flexible linker. See, e.g., Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). A single chain antibody may be monovalent, if only a single VH and VL are used; bivalent, if two VH and VL are used; or multivalent, if more than two VH and VL are used. Bispecific or multivalent antibodies can be created that specifically bind to human AXL and, for example, another molecule.
[0084] В других вариантах осуществления другие модифицированные антитела могут быть получены с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело против AXL. Например, «каппа-тела» (111 и соавт., Protein Eng. 10:949-57 (1997)), «минитела» (Martin и соавт., EMBO J. 13:5303-9 (1994)), «диатела» (Holliger и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)) или «янусины» (Traunecker и соавт., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) и Traunecker и соавт., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) могут быть получены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов в соответствии с решениями описания.[0084] In other embodiments, other modified antibodies can be produced using nucleic acid molecules encoding an anti-AXL antibody. For example, "kappa bodies" (Ill et al., Protein Eng. 10:949–57 (1997)), "minibodies" (Martin et al., EMBO J. 13:5303–9 (1994)), "diabodies" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444–6448 (1993)) or "janusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655–3659 (1991) and Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51–52 (1992)) can be generated using standard molecular biology techniques according to characterization solutions.
[0085] Антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть согласно настоящему изобретению могут быть дериватизированы или связаны с другой молекулой (например, другим пептидом или белком). Как правило, антитела или их части дериватизируют таким образом, что связывание AXL не подвергается неблагоприятному влиянию дериватизации или мечения. Соответственно, предполагают, что антитела и части антител в соответствии с настоящим изобретением включают в себя как интактные, так и модифицированные формы человеческих антител против AXL, описанных в настоящей заявке. Например, антитело или часть антитела согласно настоящему изобретению могут быть функционально связаны (путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одним или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектирующий агент, фармацевтическое средство и/или белок или пептид, который может опосредовать ассоциацию антитела или части антитела с другой молекулой (такой как ядро стрептавидина или полигистидиновая метка).[0085] An anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof of the present invention may be derivatized or linked to another molecule (e.g., another peptide or protein). Typically, the antibodies or portions thereof are derivatized such that AXL binding is not adversely affected by the derivatization or labeling. Accordingly, the antibodies and portions of antibodies of the present invention are intended to include both intact and modified forms of the human anti-AXL antibodies described herein. For example, an antibody or antibody portion of the present invention may be operably linked (by chemical linkage, genetic fusion, non-covalent association, or otherwise) to one or more other molecular entities, such as another antibody (e.g., a bispecific antibody or diabody), a detecting agent, a pharmaceutical agent, and/or a protein or peptide that can mediate association of the antibody or antibody portion with another molecule (such as a streptavidin core or a polyhistidine tag).
[0086] Один тип дериватизированного антитела получают путем перекрестного связывания двух или более антител (одного или разных типов, например, для создания биспецифических антител). Подходящие сшивающие агенты включают те, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две отчетливо реакционноспособные группы, разделенные подходящим спейсером (например, м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны, например, от Pierce Chemical Company, Rockford, IL.[0086] One type of derivatized antibody is prepared by cross-linking two or more antibodies (of the same or different types, e.g., to create bispecific antibodies). Suitable cross-linking agents include those that are heterobifunctional, having two distinctly reactive groups separated by a suitable spacer (e.g., m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester) or homobifunctional (e.g., disuccinimidyl suberate). Such linkers are available, for example, from Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
[0087] Антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть также могут быть дериватизированы химической группой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), метальной или этильной группой или углеводной группой. Эти группы могут быть полезны для улучшения биологических характеристик антитела, например, для увеличения периода полужизни в сыворотке.[0087] An anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof may also be derivatized with a chemical group such as polyethyleneglycol (PEG), a methyl or ethyl group, or a carbohydrate group. These groups may be useful for improving the biological characteristics of the antibody, such as increasing serum half-life.
[0088] Антитело или его антигенсвязывающая часть в соответствии с настоящим изобретением также могут быть мечеными. Используемые в настоящей заявке термины «метка» или «меченый» относятся к встраиванию другой молекулы в антитело. В некоторых вариантах осуществления метка представляет собой поддающийся обнаружению маркер, например, встраивание меченой радиоактивным изотопом аминокислоты или присоединение к полипептиду биотинильных фрагментов, которые могут быть обнаружены с помощью меченого авидина (например, стрептавидин, содержащий флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которую можно обнаружить оптическими или колориметрическими методами). В некоторых вариантах осуществления метка или маркер могут быть терапевтическими, например, конъюгатом лекарственного средства или токсином. В данной области известны и могут быть использованы различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов. Примеры меток для полипептидов включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15N, 35S, 90Y, 99Тс, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, лантанидные люминофоры), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные маркеры, биотинильные группы, заданные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, участки связывания вторичных антител, домены связывания металлов, эпитопные метки), магнитные агенты, такие как хелаты гадолиния, токсины, такие как коклюшный токсин, таксол, цитохалазин В, грамицид D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. В некоторых вариантах осуществления метки прикреплены спейсерами arms различной длины для уменьшения возможных стерических затруднений.[0088] An antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention may also be labeled. As used herein, the terms "label" or "labeled" refer to the incorporation of another molecule into an antibody. In some embodiments, the label is a detectable marker, such as the incorporation of a radiolabeled amino acid or the attachment of biotinyl moieties to a polypeptide that can be detected using labeled avidin (e.g., streptavidin containing a fluorescent marker or enzymatic activity that can be detected by optical or colorimetric methods). In some embodiments, the label or marker may be therapeutic, such as a drug conjugate or a toxin. Various methods for labeling polypeptides and glycoproteins are known in the art and may be used. Examples of labels for polypeptides include, but are not limited to, the following: radioisotopes or radionuclides (e.g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), fluorescent labels (e.g., FITC, rhodamine, lanthanide phosphors), enzymatic labels (e.g., horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase), chemiluminescent markers, biotinyl groups, desired polypeptide epitopes recognized by a secondary reporter (e.g., paired leucine zipper sequences, secondary antibody binding sites, metal binding domains, epitope labels), magnetic agents such as gadolinium chelates, toxins such as pertussis toxin, taxol, cytochalasin B, gramicide D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoside, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracinatedione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol and puromycin and analogs or homologues thereof. In some embodiments, the labels are attached by spacers arms of varying lengths to reduce potential steric hindrance.
[0089] В некоторых вариантах осуществления антитела в соответствии с настоящим изобретением могут присутствовать в нейтральной форме (включая цвиттерионные формы) или в виде положительно или отрицательно заряженных частиц. В некоторых вариантах осуществления антитела могут образовывать комплекс с противоионом с образованием фармацевтически приемлемой соли.[0089] In some embodiments, antibodies of the present invention may be present in neutral form (including zwitterionic forms) or as positively or negatively charged particles. In some embodiments, antibodies may be complexed with a counterion to form a pharmaceutically acceptable salt.
Композиции антитела против AXLAnti-AXL antibody compositions
[0090] Настоящее изобретение также обеспечивает комбинированную терапию (например, композицию), которая содержит одно, два, три, четыре или большее количество антител против AXL или их антигенсвязывающих частей, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления комбинированная терапия (например, композиция) содержит два антитела против AXL или их антигенсвязывающие части. Комбинированная терапия может принимать форму, например, способа лечения с использованием указанных антител или антигенсвязывающих частей или фармацевтической композиции, содержащей указанные антитела или антигенсвязывающие части.[0090] The present invention also provides a combination therapy (e.g., a composition) that comprises one, two, three, four, or more of the anti-AXL antibodies or antigen-binding portions thereof described herein. In some embodiments, the combination therapy (e.g., a composition) comprises two anti-AXL antibodies or antigen-binding portions thereof. The combination therapy can take the form of, for example, a method of treatment using said antibodies or antigen-binding portions or a pharmaceutical composition comprising said antibodies or antigen-binding portions.
[0091] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую первое антитело против AXL или его антигенсвязывающую часть и второе антитело против AXL или его антигенсвязывающую часть, где первое и второе антитела представляют собой:[0091] In some embodiments, the present invention provides a composition comprising a first anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof and a second anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, wherein the first and second antibodies are:
- антитела 23203_1 и 23203_2, соответственно;- antibodies 23203_1 and 23203_2, respectively;
- антитела 23203_1 и 23203_3, соответственно;- antibodies 23203_1 and 23203_3, respectively;
- антитела 23203_1 и 23203_4, соответственно;- antibodies 23203_1 and 23203_4, respectively;
- антитела 23203_1 и 22995, соответственно;- antibodies 23203_1 and 22995, respectively;
- антитела 23203_1 и 22883, соответственно;- antibodies 23203_1 and 22883, respectively;
- антитела 23203_2 и 23203_3, соответственно;- antibodies 23203_2 and 23203_3, respectively;
- антитела 23203_2 и 23203_4, соответственно;- antibodies 23203_2 and 23203_4, respectively;
- антитела 23203_2 и 22995, соответственно;- antibodies 23203_2 and 22995, respectively;
- антитела 23203_2 и 22883, соответственно;- antibodies 23203_2 and 22883, respectively;
- антитела 23203_3 и 23203_4, соответственно;- antibodies 23203_3 and 23203_4, respectively;
- антитела 23203_3 и 22995, соответственно;- antibodies 23203_3 and 22995, respectively;
- антитела 23203_3 и 22883, соответственно;- antibodies 23203_3 and 22883, respectively;
- антитела 23203_4 и 22995, соответственно;- antibodies 23203_4 and 22995, respectively;
- антитела 23203_4 и 22883, соответственно; или- antibodies 23203_4 and 22883, respectively; or
- антитела 22995 и 22883, соответственно.- antibodies 22995 and 22883, respectively.
[0092] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит антитела или их антигенсвязывающие части, которые связываются с тем же эпитопом, что и указанные первое и второе антитела, или конкурируют за связывание с ними.[0092] In some embodiments, the composition comprises antibodies or antigen-binding portions thereof that bind to the same epitope as said first and second antibodies or compete for binding thereto.
[0093] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат аминокислотные последовательности H-CDR1-3 и L-CDR1-3 указанного первого антитела, и антитело или его антигенсвязывающую часть, которая содержит аминокислотные последовательности H-CDR1-3 и L-CDR1-3 указанного второго антитела.[0093] In some embodiments, the composition comprises an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises the amino acid sequences of H-CDR1-3 and L-CDR1-3 of said first antibody, and an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises the amino acid sequences of H-CDR1-3 and L-CDR1-3 of said second antibody.
[0094] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат VH и VL с аминокислотными последовательностями, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны аминокислотным последовательностям VH и VL, соответственно, указанного первого антитела, и антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат VH и VL с аминокислотными последовательностями, которые по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны аминокислотным последовательностям VH и VL, соответственно, указанного второго антитела.[0094] In some embodiments, the composition comprises an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises a VH and VL with amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequences of the VH and VL, respectively, of said first antibody, and an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises a VH and VL with amino acid sequences that are at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the amino acid sequences of the VH and VL, respectively, of said second antibody.
[0095] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат аминокислотные последовательности VH и VL указанного первого антитела, и антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат аминокислотные последовательности VH и VL указанного второго антитела.[0095] In some embodiments, the composition comprises an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises the VH and VL amino acid sequences of said first antibody, and an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises the VH and VL amino acid sequences of said second antibody.
[0096] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат аминокислотные последовательности НС и LC указанного первого антитела, и антитело или его антигенсвязывающую часть, которые содержат аминокислотные последовательности НС и LC указанного второго антитела.[0096] In some embodiments, the composition comprises an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises the HC and LC amino acid sequences of said first antibody, and an antibody or antigen-binding portion thereof that comprises the HC and LC amino acid sequences of said second antibody.
[0097] В некоторых вариантах осуществления указанная композиция может содержать одно, два или большее количество антител или их антигенсвязывающих частей, выбранных из группы, включающей в себя:[0097] In some embodiments, said composition may comprise one, two or more antibodies or antigen-binding portions thereof selected from the group consisting of:
а) антитело, содержащее H-CDR1-3, которые содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5-7, 15-17, 25-27, 35-37, 45-47 или 55-57, соответственно;a) an antibody comprising H-CDR1-3 that comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5-7, 15-17, 25-27, 35-37, 45-47 or 55-57, respectively;
б) антитело, последовательность VH которого по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 или 53;b) an antibody whose VH sequence is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 or 53;
в) антитело, VH которого содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 или 53;c) an antibody whose VH comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43 or 53;
г) антитело, НС которого содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 61, 13 и 61, 23 и 61, 33 и 61, 43 и 61 или 53 и 61;d) an antibody, the NS of which contains the amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 and 61, 13 and 61, 23 and 61, 33 and 61, 43 and 61, or 53 and 61;
д) антитело, содержащее L-CDR1-3, которые содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8-10, 18-20, 28-30, 38-40, 48-50 или 58-60, соответственно;d) an antibody comprising L-CDR1-3 that comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 8-10, 18-20, 28-30, 38-40, 48-50 or 58-60, respectively;
е) антитело, VL которого по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44 или 54;e) an antibody whose VL is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44 or 54;
ж) антитело, VL которого содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44 или 54;g) an antibody whose VL comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 14, 24, 34, 44 or 54;
з) антитело, LC которого содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4 и 62, 14 и 62, 24 и 62, 34 и 62, 44 и 62 или 54 и 62;c) an antibody whose LC comprises the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 and 62, 14 and 62, 24 and 62, 34 and 62, 44 and 62, or 54 and 62;
и) антитело, H-CDR1-3 и L-CDR1-3 которого содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5-10, 15-20, 25-30, 35-40, 45-50 или 55-60, соответственно;i) an antibody, the H-CDR1-3 and L-CDR1-3 of which comprise the amino acid sequences of SEQ ID NO: 5-10, 15-20, 25-30, 35-40, 45-50 or 55-60, respectively;
к) антитело, содержащее VH и VL, аминокислотные последовательности которых по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 3 и 4, 13 и 14, 23 и 24, 33 и 34, 43 и 44, или 53 и 54, соответственно;k) an antibody comprising VH and VL, the amino acid sequences of which are at least 90% identical to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, 13 and 14, 23 and 24, 33 and 34, 43 and 44, or 53 and 54, respectively;
л) антитело, содержащее VH и VL, которые содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3 и 4, 13 и 14, 23 и 24, 33 и 34, 43 и 44, или 53 и 54, соответственно; иl) an antibody comprising VH and VL that comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4, 13 and 14, 23 and 24, 33 and 34, 43 and 44, or 53 and 54, respectively; and
м) антитело, содержащее НС и LC, которые содержат аминокислотные последовательности 3 и 61, и 4 и 62; 13 и 61, и 14 и 62; 23 и 61, и 24 и 62; 33 и 61, и 34 и 62; 43 и 61, и 44 и 62; или 53 и 61, и 54 и 62; соответственно.m) an antibody comprising HC and LC that comprise amino acid sequences 3 and 61, and 4 and 62; 13 and 61, and 14 and 62; 23 and 61, and 24 and 62; 33 and 61, and 34 and 62; 43 and 61, and 44 and 62; or 53 and 61, and 54 and 62; respectively.
[0098] В некоторых вариантах осуществления композиция антител против AXL, описанная в настоящей заявке, может ингибировать рост опухоли и/или индуцировать регрессию роста опухолиin vivo. В некоторых вариантах осуществления композиция антител против AXL, описанная в настоящей заявке, может продлевать выживаемость больного раком.[0098] In some embodiments, the anti-AXL antibody composition described herein can inhibit tumor growth and/or induce regression of tumor growthin vivo . In some embodiments, the anti-AXL antibody composition described herein can prolong the survival of a cancer patient.
[0099] В настоящем изобретении также предложен способ получения композиции антител против AXL, описанный в настоящей заявке, включающий получение первого антитела против AXL или его антигенсвязывающей части и второго антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, а также смешивание двух антител или частей.[0099] The present invention also provides a method for producing an anti-AXL antibody composition described herein, comprising producing a first anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof and a second anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, and mixing the two antibodies or portions.
Биспецифические связывающие молекулыBispecific binding molecules
[0100] В настоящем изобретении также предложена биспецифическая связывающая молекула, обладающая специфичностью связывания (например, включающая антигенсвязывающие части, такие как шесть CDR или VH и VL) антитела против AXL, описанного в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления биспецифическая связывающая молекула дополнительно обладает специфичностью связывания другого, отличного от AXL антитела (например, другого антитела против AXL, описанного в настоящей заявке) или антитела, которое нацелено на другой белок, такой как раковый антиген или другую молекулу клеточной поверхности, активность которой опосредует болезненное состояние, такое как рак. Такие биспецифические связывающие молекулы известны в данной области техники, и примеры различных типов биспецифических связывающих молекул приведены в настоящей заявке в другом месте.[0100] The present invention also provides a bispecific binding molecule having the binding specificity of (e.g., comprising antigen-binding portions such as six CDRs or VH and VL) an anti-AXL antibody described herein. In some embodiments, the bispecific binding molecule further has the binding specificity of another antibody other than AXL (e.g., another anti-AXL antibody described herein) or an antibody that targets another protein, such as a cancer antigen or another cell surface molecule whose activity mediates a disease state such as cancer. Such bispecific binding molecules are known in the art, and examples of various types of bispecific binding molecules are provided elsewhere herein.
Молекулы нуклеиновых кислот и векторыNucleic acid molecules and vectors
[0101] В настоящем изобретении также представлены молекулы нуклеиновых кислот и последовательности, кодирующие антитела против AXL или их антигенсвязывающие части, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления разные молекулы нуклеиновых кислот кодируют аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела против AXL или его антигенсвязывающей части. В других вариантах осуществления одна и та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей антитела против AXL или его антигенсвязывающей части.[0101] The present invention also provides nucleic acid molecules and sequences encoding the anti-AXL antibodies or antigen-binding portions thereof described herein. In some embodiments, different nucleic acid molecules encode the amino acid sequences of the heavy and light chains of an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof. In other embodiments, the same nucleic acid molecule encodes the amino acid sequences of the heavy and light chains of an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof.
[0102] Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает ее комплементарность, если не указано иное. Таким образом, следует понимать, что ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую конкретную последовательность, охватывает ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин «полинуклеотид», используемый в настоящей заявке, означает полимерную форму нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, либо модифицированную форму нуклеотида любого типа. Термин включает одно - и двухцепочечные формы.[0102] A reference to a nucleotide sequence includes its complementarity unless otherwise indicated. Thus, a reference to a nucleic acid having a particular sequence is understood to include its complementary strand with its complementary sequence. The term "polynucleotide" as used in this application means a polymeric form of nucleotides at least 10 bases in length, either ribonucleotides or deoxynucleotides, or a modified form of a nucleotide of any type. The term includes single- and double-stranded forms.
[0103] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или нуклеотидную последовательность, которая кодирует легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или и то, и другое, антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, описанной в настоящей заявке.[0103] In some embodiments, the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes a heavy chain or an antigen-binding portion thereof, or a nucleotide sequence that encodes a light chain or an antigen-binding portion thereof, or both, of an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein.
[0104] В настоящем изобретении также представлены нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичны одной или нескольким нуклеотидным последовательностям, приведенным в настоящей заявке, например, нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 и 52, или нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей в себя SEQ ID NO: 3, 4, 13, 14, 23, 24, 33, 34, 43, 44, 53 и 54. Термин «процентная идентичность последовательности» в контексте последовательностей нуклеиновых кислот относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Длина сравнения идентичности последовательностей может составлять по меньшей мере около девяти нуклеотидов, обычно по меньшей мере около 18 нуклеотидов, чаще по меньшей мере около 24 нуклеотидов, обычно по меньшей мере около 28 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 32 нуклеотида, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 36, 48 или более нуклеотидов. В данной области известен ряд различных алгоритмов, которые можно использовать для измерения идентичности нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотидные последовательности можно сравнивать с помощью FASTA, Gap или Bestfit, которые являются программами в пакете Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, которая включает, например, программы FASTA2 и FASTA3, обеспечивает выравнивание и процентную идентичность последовательностей областей наилучшего перекрытия между последовательностями запроса и поиска (см., например, Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:221-25% (1996); и Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); включенные в настоящую заявку посредством ссылки). Если не указано иное, используют параметры по умолчанию для конкретной программы или алгоритма. Например, процентная идентичность последовательностей между последовательностями нуклеиновых кислот может быть определена с использованием FASTA с параметрами по умолчанию (размер слова 6 и коэффициент NOPAM для оценочной матрицы) или с использованием пробела с параметрами по умолчанию, как предусмотрено в версии 6.1 GCG, включенной в настоящую заявку посредством ссылки.[0104] The present invention also provides nucleotide sequences that are at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% identical to one or more nucleotide sequences disclosed herein, such as a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51, and 52, or a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 4, 13, 14, 23, 24, 33, 34, 43, 44, 53, and 54. The term "percent sequence identity" in the context of sequences nucleic acid sequences refers to residues in two sequences that are the same when aligned for maximum correspondence. The length of a sequence identity comparison can be at least about nine nucleotides, typically at least about 18 nucleotides, more typically at least about 24 nucleotides, typically at least about 28 nucleotides, more preferably at least about 32 nucleotides, and preferably at least about 36, 48 or more nucleotides. A number of different algorithms are known in the art that can be used to measure nucleotide sequence identity. For example, polynucleotide sequences can be compared using FASTA, Gap, or Bestfit, which are programs in the Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, which includes, for example, the FASTA2 and FASTA3 programs, provides alignment and percent sequence identity of the regions of best overlap between query and search sequences (see, for example, Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:221-25% (1996); and Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); incorporated herein by reference). Unless otherwise stated, the default parameters for a particular program or algorithm are used. For example, percent sequence identity between nucleic acid sequences can be determined using FASTA with default parameters (word size of 6 and NOPAM factor for the scoring matrix) or using SPACE with default parameters as provided in GCG version 6.1, incorporated by reference herein.
[0105] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51 и 52. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и 2, 11 и 12, 21 и 22, 31 и 32, 41 и 42, или 51 и 52.[0105] In some embodiments, the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 2, 11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 42, 51, and 52. In some embodiments, the nucleic acid molecule comprises the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2, 11 and 12, 21 and 22, 31 and 32, 41 and 42, or 51 and 52.
[0106] В любом из приведенных выше вариантов осуществления могут быть выделены молекулы нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты, упоминаемые в настоящей заявке как «выделенные» или «очищенные», представляют собой нуклеиновые кислоты, которые (1) были отделены от нуклеиновых кислот геномной ДНК или клеточной РНК их источника происхождения; и/или (2) не встречаются в природе.[0106] In any of the above embodiments, nucleic acid molecules may be isolated. Nucleic acid molecules referred to herein as "isolated" or "purified" are nucleic acids that (1) have been separated from the genomic DNA or cellular RNA nucleic acids of their source of origin; and/or (2) are not naturally occurring.
[0107] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор, подходящий для экспрессии одной или обеих цепей антитела или его антигенсвязывающей части, которые описаны в настоящей заявке. Используемый в настоящей заявке термин «вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы упоминают в настоящей заявке как «рекомбинантные векторы экспрессии» (или просто «векторы экспрессии»).[0107] In another aspect, the present invention provides a vector suitable for expressing one or both chains of an antibody or an antigen-binding portion thereof as described herein. As used herein, the term "vector" means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is linked. In some embodiments, the vector is a plasmid, i.e., a circular, double-stranded piece of DNA into which additional DNA segments can be ligated. Moreover, some vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operably linked. Such vectors are referred to herein as "recombinant expression vectors" (or simply "expression vectors").
[0108] В настоящем изобретении предложены векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют тяжелую цепь, легкую цепь или как тяжелую, так и легкую цепи антитела против AXL, как описано в настоящей заявке, или его антигенсвязывающую часть. В некоторых вариантах осуществления вектор согласно настоящему изобретению содержит молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящей заявке. В настоящем изобретении также предложены векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды. Вектор может дополнительно содержать последовательность контроля экспрессии.[0108] The present invention provides vectors comprising nucleic acid molecules that encode a heavy chain, a light chain, or both a heavy and a light chain of an anti-AXL antibody as described herein, or an antigen-binding portion thereof. In some embodiments, a vector of the present invention comprises a nucleic acid molecule as described herein. The present invention also provides vectors comprising nucleic acid molecules encoding fusion proteins, modified antibodies, antibody fragments, and probes thereof. The vector may further comprise an expression control sequence.
[0109] Используемый в настоящей заявке термин «последовательность контроля экспрессии» означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Последовательности контроля экспрессии включают соответствующие последовательности инициации, терминации транскрипции, промотора и энхансера; эффективные сигналы обработки РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (например, консенсусная последовательность Козака); последовательности, повышающие стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Природа таких контрольных последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; у прокариот такие контрольные последовательности обычно включают промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие контрольные последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Предполагается, что термин «контрольные последовательности» включает, как минимум, все компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых выгодно, например, лидерные последовательности и последовательности-партнеры слияния.[0109] As used herein, the term "expression control sequence" refers to polynucleotide sequences that are necessary to effect the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated. Expression control sequences include appropriate transcription initiation, termination, promoter, and enhancer sequences; efficient RNA processing signals such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize cytoplasmic mRNA; sequences that enhance translation efficiency (e.g., a Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, optionally, sequences that enhance protein secretion. The nature of such control sequences varies depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and a transcription termination sequence; in eukaryotes, such control sequences typically include promoters and a transcription termination sequence. The term "control sequences" is intended to include, at a minimum, all components whose presence is required for expression and processing, and may also include additional components whose presence is advantageous, such as leader sequences and fusion partner sequences.
[0110] В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, описанная в настоящей заявке, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен VH антитела против AXL или его антигенсвязывающую часть, описанную в настоящей заявке, присоединенную в рамке считывания к нуклеотидной последовательности, кодирующей константную область тяжелой цепи из любого источника. Аналогично, молекула нуклеиновой кислоты, описанная в настоящей заявке, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую домен VL антитела против AXL, или его антигенсвязывающую часть, описанную в настоящей заявке, присоединенную внутри рамки считывания к нуклеотидной последовательности, кодирующей константную область легкой цепи из любого источника.[0110] In some embodiments, a nucleic acid molecule described herein comprises a nucleotide sequence encoding a VH domain of an anti-AXL antibody, or an antigen-binding portion thereof, as described herein, linked in frame to a nucleotide sequence encoding a heavy chain constant region from any source. Similarly, a nucleic acid molecule described herein can comprise a nucleotide sequence encoding a VL domain of an anti-AXL antibody, or an antigen-binding portion thereof, as described herein, linked in frame to a nucleotide sequence encoding a light chain constant region from any source.
[0111] В еще одном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL, могут быть «превращены» в гены полноразмерных антител. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены VH или VL, превращают в гены полноразмерных антител путем вставки в вектор экспрессии, уже кодирующий константные области тяжелой цепи (СН) или константные области легкой цепи (CL) соответственно, так что VH сегмент функционально связан с сегментом(ами) СН внутри вектора, и/или сегмент VL функционально связан с сегментом CL внутри вектора. В другом аспекте молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены VH и/или VL, превращают в гены полноразмерного антитела путем связывания, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей домен VH и/или VL, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или области CL с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полноразмерные тяжелые и/или легкие цепи, затем могут быть экспрессированы из клетки, в которую они были введены, и выделено антитело против AXL.[0111] In another aspect of the present invention, nucleic acid molecules encoding VH and/or VL can be "engineered" into full-length antibody genes. In some embodiments, nucleic acid molecules encoding VH or VL domains are generated into full-length antibody genes by insertion into an expression vector already encoding heavy chain constant regions (CH) or light chain constant regions (CL), respectively, such that the VH segment is operably linked to the CH segment(s) within the vector and/or the VL segment is operably linked to the CL segment within the vector. In another aspect, nucleic acid molecules encoding VH and/or VL domains are generated into full-length antibody genes by linking, e.g., ligating, a nucleic acid molecule encoding a VH and/or VL domain to a nucleic acid molecule encoding the CH and/or CL regions using standard molecular biology techniques. Nucleic acid molecules encoding full-length heavy and/or light chains can then be expressed from the cell into which they have been introduced and the anti-AXL antibody isolated.
[0112] В некоторых вариантах осуществления каркасная(ые) область(и) мутированы таким образом, что полученная(ые) каркасная(ые) область(и) имеют аминокислотную последовательность соответствующего гена зародышевой линии. Мутация может быть произведена в каркасной области или константной области, например, для увеличения времени полужизни антитела против AXL. См., например, публикацию WO 00/09560. Мутация в каркасной области или константной области также может быть осуществлена для изменения иммуногенности антитела и/или для создания сайта для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой. В соответствии с настоящим изобретением антитело может иметь мутации в любой одной или нескольких CDR или каркасных областях вариабельного домена или константной области.[0112] In some embodiments, the framework(s) are mutated such that the resulting framework(s) have the amino acid sequence of the corresponding germline gene. The mutation can be in the framework or constant region, for example, to increase the half-life of the AXL antibody. See, for example, WO 00/09560. The mutation in the framework or constant region can also be made to alter the immunogenicity of the antibody and/or to create a site for covalent or non-covalent binding to another molecule. According to the present invention, an antibody can have mutations in any one or more CDRs or framework regions of the variable domain or constant region.
Клетки-хозяева и способы получения антител и композиций антителHost cells and methods for producing antibodies and antibody compositions
[0113] Настоящее изобретение также обеспечивает способы получения композиций антител и антител и их антигенсвязывающих частей, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу получения антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, как описано в настоящем документе, включающему получение клетки-хозяина (например, рекомбинантной клетки-хозяина) содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или его антигенсвязывающую часть, и нуклеотидную последовательность, которая кодирует легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, описанных в настоящей заявке; культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части; и выделение полученного антитела или его антигенсвязывающей части. Антитела или антигенсвязывающие части, продуцируемые такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах, называют в настоящей заявке «рекомбинантными» антителами или антигенсвязывающими частями. Настоящее изобретение также обеспечивает клетки-потомки таких клеток-хозяев и антитела или антигенсвязывающие части, продуцируемые ими.[0113] The present invention also provides methods for producing antibody compositions and antibodies and antigen-binding portions thereof described herein. In some embodiments, the present invention provides a method for producing an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof as described herein, comprising providing a host cell (e.g., a recombinant host cell) comprising a nucleotide sequence encoding a heavy chain or an antigen-binding portion thereof and a nucleotide sequence that encodes a light chain or an antigen-binding portion thereof of an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein; culturing said host cell under conditions suitable for expression of the antibody or antigen-binding portion thereof; and isolating the resulting antibody or antigen-binding portion thereof. Antibodies or antigen-binding portions produced by such expression in such recombinant host cells are referred to herein as "recombinant" antibodies or antigen-binding portions. The present invention also provides progeny cells of such host cells and antibodies or antigen-binding portions produced therefrom.
[0114] Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») в данном контексте означает клетку, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. По определению рекомбинантная клетка-хозяин не встречается в природе. Настоящее изобретение обеспечивает клетки-хозяева, которые могут содержать, например, вектор, как описано в настоящей заявке. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, которые содержат, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть, или и то, и другое, антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, описанных в настоящей заявке. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную исследуемую клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку определенные модификации могут возникать в последующих поколениях либо из-за мутации, либо из-за влияния окружающей среды, такое потомство может фактически не быть идентичным родительской клетке, но все же включено в объем термина «клетка-хозяин», как он используется в настоящей заявке.[0114] The term "recombinant host cell" (or simply "host cell"), as used herein, means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced. By definition, a recombinant host cell is not found in nature. The present invention provides host cells that can comprise, for example, a vector as described herein. The present invention also relates to host cells that comprise, for example, a nucleotide sequence encoding a heavy chain or an antigen-binding portion thereof, a nucleotide sequence encoding a light chain or an antigen-binding portion thereof, or both, of an anti-AXL antibody or an antigen-binding portion thereof described herein. It should be understood that "recombinant host cell" and "host cell" mean not only the particular cell under study, but also the progeny of such a cell. Because certain modifications may arise in subsequent generations either due to mutation or environmental influences, such progeny may not actually be identical to the parent cell, but are still included within the scope of the term "host cell" as used in this application.
[0115] Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против AXL и их антигенсвязывающие части, и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, можно использовать для трансфекции подходящей клетки-хозяина млекопитающего, растения, бактерии или дрожжей. Трансформация может быть осуществлена любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают трансфекцию, опосредованную декстраном, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию, опосредованную полибреном, слияние протопластов, электропорацию, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки млекопитающих с помощью вирусных векторов.[0115] Nucleic acid molecules encoding anti-AXL antibodies and antigen-binding portions thereof, and vectors containing these nucleic acid molecules, can be used to transfect a suitable mammalian, plant, bacterial, or yeast host cell. Transformation can be accomplished by any known method of introducing polynucleotides into a host cell. Methods of introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, calcium phosphate precipitation, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, electroporation, encapsulation of the polynucleotide(s) in liposomes, and direct microinjection of DNA into nuclei. In addition, nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells using viral vectors.
[0116] Вполне вероятно, что антитела, экспрессируемые разными клеточными линиями или у трансгенных животных, будут иметь разные паттерны гликозилирования друг от друга. Однако все антитела, кодируемые молекулами нуклеиновых кислот, представленными в настоящем документе, или содержащие аминокислотные последовательности, представленные в настоящей заявке, являются частью настоящего изобретения, независимо от состояния гликозилирования антител и, в более общем смысле, независимо от наличия или отсутствия посттрансляционной модификация(й).[0116] It is likely that antibodies expressed in different cell lines or in transgenic animals will have different glycosylation patterns from each other. However, all antibodies encoded by the nucleic acid molecules provided herein or comprising the amino acid sequences provided herein are part of the present invention, regardless of the glycosylation state of the antibodies and, more generally, regardless of the presence or absence of post-translational modification(s).
Фармацевтические композицииPharmaceutical compositions
[0117] Другой аспект настоящего изобретения представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного ингредиента (или единственного активного ингредиента) антитело против AXL или его антигенсвязывающую часть, композицию антител или биспецифически связывающую молекулу согласно настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции предназначены для улучшения состояния, профилактики и/или лечения рака, например рака, описанного в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления рак находится в ткани, такой как кожа, легкое, кишечник, толстая кишка, яичник, головной мозг, предстательная железа, почка, мягкие ткани, система кроветворения, голова и шея, печень, кость, мочевой пузырь, молочная железа, желудок, матка, шейка матки и поджелудочная железа. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой меланому, рак головы и шеи, глиобластому, рак щитовидной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), рак поджелудочной железы, рак яичников, рак шейки матки, карциному маточной трубы, первичную перитонеальную карциному, рак эндометрия, уротелиальную карцинома, почечно-клеточную карциному, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак предстательной железы, мезотелиому, плоскоклеточный рак, саркому, хронический миелоидный лейкоз, малый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, малый лимфоцитарный лейкоз, миелодиспластический синдром или лимфому Ходжкина.[0117] Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient (or the only active ingredient) an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, an antibody composition, or a bispecific binding molecule of the present invention. The pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient. In some embodiments, the pharmaceutical compositions are for ameliorating, preventing, and/or treating cancer, such as the cancers described herein. In some embodiments, the cancer is in a tissue such as skin, lung, intestine, colon, ovary, brain, prostate, kidney, soft tissue, hematopoietic system, head and neck, liver, bone, bladder, breast, stomach, uterus, cervix, and pancreas. In some embodiments, the cancer is melanoma, head and neck cancer, glioblastoma, thyroid cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer), pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, fallopian tube carcinoma, primary peritoneal carcinoma, endometrial cancer, urothelial carcinoma, renal cell carcinoma, colorectal cancer, rectal cancer, prostate cancer, mesothelioma, squamous cell carcinoma, sarcoma, chronic myeloid leukemia, small lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, small lymphocytic leukemia, myelodysplastic syndrome, or Hodgkin's lymphoma.
[0118] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению будут содержать одно или несколько антител против AXL, антигенсвязывающих частей, композиций антител или биспецифических связывающих молекул согласно настоящему изобретению, например, одно или два антитела против AXL, антигенсвязывающие части или биспецифические связывающие молекулы. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит одно антитело против AXL согласно настоящему изобретению или его антигенсвязывающую часть. В другом аспекте композиция содержит два различных антитела против AXL согласно настоящему изобретению или их антигенсвязывающие части.[0118] The pharmaceutical compositions of the present invention will comprise one or more anti-AXL antibodies, antigen-binding portions, antibody compositions, or bispecific binding molecules of the present invention, such as one or two anti-AXL antibodies, antigen-binding portions, or bispecific binding molecules. In some embodiments, the composition comprises one anti-AXL antibody of the present invention or an antigen-binding portion thereof. In another aspect, the composition comprises two different anti-AXL antibodies of the present invention or antigen-binding portions thereof.
[0119] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере одно антитело против AXL или его антигенсвязывающую часть в соответствии с настоящим изобретением, например, антитело против AXL или его часть и одно или несколько дополнительных антител, нацеленных на один или несколько соответствующих рецепторов клеточной поверхности, например, один или несколько рецепторов, связанных с раком.[0119] In some embodiments, a pharmaceutical composition may comprise at least one anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof according to the present invention, such as an anti-AXL antibody or portion thereof and one or more additional antibodies targeted to one or more relevant cell surface receptors, such as one or more cancer-associated receptors.
[0120] Как правило, антитела, антигенсвязывающие части и биспецифические связывающие молекулы согласно настоящему изобретению подходят для введения в виде состава в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, например, как описано ниже.[0120] In general, the antibodies, antigen-binding portions, and bispecific binding molecules of the present invention are suitable for administration as a formulation in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients, for example as described below.
[0121] Термин «вспомогательное вещество» используют в настоящей заявке для описания любого ингредиента, отличного от соединения(й) согласно настоящему изобретению. Выбор вспомогательного вещества (веществ) будет в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения, влияние вспомогательного вещества на растворимость и стабильность и природа лекарственной формы. Используемый в настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» включает в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Некоторыми примерами фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ являются вода, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические средства, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Дополнительными примерами фармацевтически приемлемых веществ являются смачивающие агенты или незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела.[0121] The term "excipient" is used herein to describe any ingredient other than the compound(s) of the invention. The choice of excipient(s) will depend largely on factors such as the particular route of administration, the effect of the excipient on solubility and stability, and the nature of the dosage form. As used herein, the term "pharmaceutically acceptable excipient" includes any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and the like that are physiologically compatible. Some examples of pharmaceutically acceptable excipients are water, saline, phosphate buffered saline, dextrose, glycerol, ethanol, and the like, as well as combinations thereof. In many cases, it is preferable to include isotonic agents in the composition, for example, sugars, polyhydric alcohols such as mannitol, sorbitol, or sodium chloride. Additional examples of pharmaceutically acceptable substances include wetting agents or minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, preservatives, or buffers that enhance the shelf life or potency of the antibody.
[0122] Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением и способы их получения будут очевидны специалистам в данной области техники. Такие композиции и способы их получения можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 19-е издание (Mack Publishing Company, 1995). Фармацевтические композиции предпочтительно производят в соответствии с условиями GMP (надлежащей производственной практики).[0122] Pharmaceutical compositions according to the present invention and methods for their preparation will be apparent to those skilled in the art. Such compositions and methods for their preparation can be found, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th edition (Mack Publishing Company, 1995). The pharmaceutical compositions are preferably manufactured under GMP (good manufacturing practice) conditions.
[0123] Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть приготовлена, упакована или продана без упаковки, в виде разовой стандартной дозы или в виде множества разовых стандартных доз. Используемый в настоящей заявке термин «разовая доза» представляет собой дискретное количество фармацевтической композиции, содержащее заданное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозе активного ингредиента, которая будет введена субъекту, или подходящей части такой дозы, такой как, например, половина или одна треть такой дозы.[0123] The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared, packaged, or sold in bulk, as a single unit dose, or as a plurality of single unit doses. As used herein, the term "unit dose" is a discrete amount of the pharmaceutical composition containing a predetermined amount of the active ingredient. The amount of the active ingredient is typically equal to the dose of the active ingredient to be administered to the subject, or a suitable fraction of such a dose, such as, for example, one-half or one-third of such a dose.
[0124] Составы фармацевтической композиции, подходящие для парентерального введения, обычно содержат активный ингредиент в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как стерильная вода или стерильный изотонический солевой раствор. Такие составы могут быть приготовлены, упакованы или проданы в форме, пригодной для болюсного введения или для непрерывного введения. Препараты для инъекций могут быть приготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в контейнерах с несколькими дозами, содержащими консервант. Составы для парентерального введения включают, но не ограничиваются ими, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных носителях, пасты и т.п. Такие составы могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных ингредиентов, включая, но не ограничиваясь ими, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие средства. В некоторых вариантах осуществления состава для парентерального введения активный ингредиент предоставляется в сухой (т.е. порошкообразной или гранулированной) форме для восстановления подходящим носителем (например, стерильной апирогенной водой) перед парентеральным введением восстановленной композиции. Составы для парентерального введения также включают водные растворы, которые могут содержать вспомогательные вещества, такие как соли, углеводы и буферные средства (предпочтительно до рН от 3 до 9), но для некоторых применений они могут быть более подходящими в виде стерильного неводного раствора или в виде высушенной формы для использования в сочетании с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода. Типичные формы для парентерального введения включают в себя растворы или суспензии в стерильных водных растворах, например, водные растворы пропиленгликоля или декстрозы. При желании такие лекарственные формы могут быть соответствующим образом забуферены. Другие пригодные для парентерального введения композиции включают в себя те, которые содержат активный ингредиент в микрокристаллической форме или в липосомальном препарате.[0124] Formulations of a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration typically comprise the active ingredient in association with a pharmaceutically acceptable carrier, such as sterile water or sterile isotonic saline solution. Such formulations may be prepared, packaged, or sold in a form suitable for bolus administration or for continuous administration. Injectable preparations may be prepared, packaged, or sold in unit dosage form, for example, in ampoules or in multi-dose containers containing a preservative. Formulations for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous vehicles, pastes, and the like. Such formulations may further comprise one or more accessory ingredients, including, but not limited to, suspending, stabilizing, or dispersing agents. In some embodiments of a parenteral formulation, the active ingredient is provided in dry (i.e., powder or granular) form for reconstitution with a suitable vehicle (e.g., sterile, pyrogen-free water) prior to parenteral administration of the reconstituted composition. Parenteral formulations also include aqueous solutions which may contain excipients such as salts, carbohydrates and buffering agents (preferably to a pH of 3 to 9), but for some uses may be more suitable as a sterile non-aqueous solution or as a dried form for use in combination with a suitable vehicle such as sterile, pyrogen-free water. Typical parenteral formulations include solutions or suspensions in sterile aqueous solutions, such as aqueous propylene glycol or dextrose solutions. If desired, such dosage forms may be suitably buffered. Other compositions suitable for parenteral administration include those containing the active ingredient in microcrystalline form or in a liposomal preparation.
Терапевтическое применение антител и композиций в соответствии с настоящим изобретениемTherapeutic use of antibodies and compositions according to the present invention
[0125] В некоторых вариантах осуществления антитела против AXL и их антигенсвязывающие части, композиции антител против AXL и биспецифические связывающие молекулы согласно настоящему изобретению предназначены для применения при лечении рака, например, AXL-положительного рака. Рак может присутствовать в одной или нескольких тканях, таких как кожа, легкие, кишечник, толстая кишка, яичник, головной мозг, предстательная железа, почки, мягкие ткани, система кроветворения, голова и шея, печень, кости, мочевой пузырь, молочная железа, желудок, матка, шейки матки и поджелудочной железы.[0125] In some embodiments, the anti-AXL antibodies and antigen-binding portions thereof, anti-AXL antibody compositions, and bispecific binding molecules of the present invention are for use in the treatment of cancer, such as AXL-positive cancer. The cancer may be present in one or more tissues such as skin, lung, intestine, colon, ovary, brain, prostate, kidney, soft tissue, hematopoietic system, head and neck, liver, bone, bladder, breast, stomach, uterus, cervix, and pancreas.
[0126] В некоторых вариантах осуществления раковые заболевания, которые лечат антителами против AXL, антигенсвязывающими частями, композициями и биспецифическими связывающими молекулами согласно настоящему изобретению могут включать в себя, например, меланому (например, прогрессирующую или метастатическую меланому), базальноклеточный рак кожи, глиобластому, глиому, глиосаркому, астроцитому, менингиому, нейробластому, рак надпочечников, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак ротовой полости, рак слюнных желез, рак носоглотки, рак молочной железы, рак легких (например, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), мелкоклеточный рак легкого и плоско клеточный рак легкого), рак пищевода, рак желудочно-пищеводного перехода, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, первичный рак брюшины, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак желчных путей, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак яичников, рак маточной трубы, рак мочевого пузыря, рак верхних мочевыводящих путей, уротелиальный рак, почечно-клеточный рак, рак почки, рак мочеполовой системы, рак шейки матки, рак предстательной железы, фибросаркому, липосаркому, рабдомиосаркому, остеосаркому, гистиоцитому, рак поджелудочной железы, рак эндометрия, рак аппендикса, прогрессирующий рак клеток Меркеля, множественную миелому, саркомы, хориокарциному, эритролейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый моноцитарный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, хронический лимфолейкоз, острый лимфобластный лейкоз, тучноклеточный лейкоз, малую лимфоцитарную лимфому, лимфому Беркитта, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому, моноцитарную лимфому, HTLV-ассоциированный Т-клеточный лейкоз/лимфому, мезотелиому и солидные опухоли. Рак может находиться, например, на ранней, промежуточной, поздней, местно-распространенной или метастатической стадии и может быть рецидивирующим или резистентным к другим терапевтическим средствам (например, другим терапевтическим средствам против AXL) или стандартная терапия может отсутствовать.[0126] In some embodiments, cancers treated with the anti-AXL antibodies, antigen-binding portions, compositions, and bispecific binding molecules of the present invention can include, for example, melanoma (e.g., advanced or metastatic melanoma), basal cell carcinoma of the skin, glioblastoma, glioma, gliosarcoma, astrocytoma, meningioma, neuroblastoma, adrenal cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck, oral cancer, salivary gland cancer, nasopharyngeal cancer, breast cancer, lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer (NSCLC), small cell lung cancer, and squamous cell lung cancer), esophageal cancer, gastroesophageal junction cancer, gastric cancer, gastrointestinal cancer, primary peritoneal cancer, liver cancer, hepatocellular carcinoma, biliary tract cancer, colon cancer, rectal cancer, colorectal cancer, ovarian, fallopian tube cancer, bladder cancer, upper urinary tract cancer, urothelial cancer, renal cell carcinoma, kidney cancer, genitourinary cancer, cervical cancer, prostate cancer, fibrosarcoma, liposarcoma, rhabdomyosarcoma, osteosarcoma, histiocytoma, pancreatic cancer, endometrial cancer, appendiceal cancer, advanced Merkel cell carcinoma, multiple myeloma, sarcomas, choriocarcinoma, erythroleukemia, acute lymphoblastic leukemia, acute monocytic leukemia, acute promyelocytic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, mast cell leukemia, small lymphocytic lymphoma, Burkitt's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, monocytic lymphoma, HTLV-associated T-cell leukemia/lymphoma, mesothelioma and solid tumors. The cancer may be, for example, at an early, intermediate, advanced, locally advanced or metastatic stage and may be recurrent or resistant to other therapies (e.g. other anti-AXL therapies) or standard therapy may not be available.
[0127] В некоторых вариантах осуществления рак, который лечат антителами против AXL, антигенсвязывающими частями, композициями и/или биспецифическими связывающими молекулами в соответствии с настоящим изобретением может включать в себя, например, меланому, рак головы и шеи, глиобластому, рак щитовидной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной желез), рак поджелудочной железы, рак яичников, рак шейки матки, карциному фаллопиевых труб, первичную карциному брюшины, рак эндометрия, уротелиальную карциному, почечно-клеточную карциному, колоректальный рак, рак предстательной железы, мезотелиому, плоскоклеточную карциному, саркому, хронический миелоидный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, малый лимфолейкоз, миелодиспластический синдром и/или лимфому Ходжкина.[0127] In some embodiments, a cancer treated with the anti-AXL antibodies, antigen-binding portions, compositions, and/or bispecific binding molecules of the present invention can include, for example, melanoma, head and neck cancer, glioblastoma, thyroid cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer (e.g., triple-negative breast cancer), pancreatic cancer, ovarian cancer, cervical cancer, fallopian tube carcinoma, primary peritoneal carcinoma, endometrial cancer, urothelial carcinoma, renal cell carcinoma, colorectal cancer, prostate cancer, mesothelioma, squamous cell carcinoma, sarcoma, chronic myeloid leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, small lymphocytic leukemia, myelodysplastic syndrome, and/or Hodgkin's lymphoma.
[0128] Понятия «лечить» и «лечение» относятся к способу облегчения или отмены биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемое в настоящей заявке понятие «облегчать» заболевание, расстройство или состояние означает снижение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, ссылки в настоящей заявке на «лечение» включают ссылки на лечебное, паллиативное и профилактическое лечение.[0128] The terms "treat" and "treatment" refer to a method of alleviating or abrogating a biological disorder and/or at least one of its associated symptoms. As used herein, the term "alleviate" a disease, disorder, or condition means reducing the severity and/or frequency of symptoms of the disease, disorder, or condition. Furthermore, references in this application to "treatment" include references to curative, palliative, and prophylactic treatment.
[0129] Понятие «терапевтически эффективное количество» относится к количеству вводимого терапевтического средства, которое в некоторой степени облегчит один или несколько симптомов заболевания, подвергаемого лечению. Терапевтически эффективное количество противоракового терапевтического средства может, например, приводить к задержке роста опухоли, уменьшению размеров опухоли, повышению выживаемости, элиминации раковых клеток, замедлению или уменьшению прогрессирования заболевания, обращению метастазов или другим клиническим результатам, которых хотят достичь медицинские работники.[0129] The term "therapeutically effective amount" refers to the amount of a therapeutic agent administered that will alleviate to some extent one or more symptoms of the disease being treated. A therapeutically effective amount of an anti-cancer therapeutic agent may, for example, result in a delay in tumor growth, a reduction in tumor size, an increase in survival, the elimination of cancer cells, a slowing or reduction in disease progression, a reversal of metastases, or other clinical results desired by health care professionals.
[0130] Антитела против AXL или их антигенсвязывающие части, композиции антител или биспецифические связывающие молекулы, описанные в настоящем документе, можно вводить отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими лекарственными средствами или антителами (или в виде любой их комбинации). Фармацевтические композиции, способы и применения, описанные в настоящем документе, таким образом, также охватывают варианты комбинаций (совместного введения) с другими активными агентами, как подробно описано ниже.[0130] The anti-AXL antibodies or antigen-binding portions thereof, antibody compositions, or bispecific binding molecules described herein can be administered alone or in combination with one or more other drugs or antibodies (or any combination thereof). The pharmaceutical compositions, methods, and uses described herein thus also encompass combination (co-administration) options with other active agents, as described in detail below.
[0131] Используемые в настоящей заявке термины «совместное введение», «совместно введенный» и «в сочетании с» относятся к антителам против AXL и их антигенсвязывающим частям, композициям антител и биспецифическим связывающим молекулам согласно настоящему изобретению с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, означают и действительно относятся к и включают в себя следующее:[0131] As used herein, the terms "co-administration," "co-administered," and "in combination with" refer to the anti-AXL antibodies and antigen-binding portions thereof, antibody compositions, and bispecific binding molecules of the present invention with one or more other therapeutic agents, and mean and do refer to and include the following:
а) одновременное введение такой комбинации антител/ антигенсвязывающей части/композиции антител/биспецифической связывающей молекулы согласно настоящему изобретению и терапевтического средства (средств) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты объединены в одну дозированную форму, которая высвобождает указанные компоненты по существу в одно и то же время указанному пациенту,a) the simultaneous administration of such a combination of antibodies/antigen-binding portion/antibody composition/bispecific binding molecule according to the present invention and a therapeutic agent(s) to a patient in need of treatment, wherein such components are combined in a single dosage form that releases said components at substantially the same time to said patient,
б) по существу одновременное введение такой комбинации антител/антигенсвязывающей части/композиции антител/биспецифически связывающей молекулы согласно настоящему изобретению и терапевтического средства (средств) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты составлены отдельно друг от друга в отдельные лекарственные формы, которые принимаются указанным пациентом по существу в одно и то же время, после чего указанные компоненты высвобождаются указанному пациенту по существу в одно и то же время,b) substantially simultaneously administering such a combination of an antibody/antigen-binding portion/antibody composition/bispecific binding molecule according to the present invention and a therapeutic agent(s) to a patient in need of treatment, wherein such components are formulated separately from each other into separate dosage forms that are administered to said patient at substantially the same time, whereupon said components are released to said patient at substantially the same time,
в) последовательное введение такой комбинации антител/ антигенсвязывающей части/композиции антител/биспецифической связывающей молекулы по настоящему изобретению и терапевтического средства (средств) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты составлены отдельно друг от друга в отдельные лекарственные формы, которые последовательно принимаются указанным пациентом со значительным временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются указанному пациенту в существенно разное время; иc) sequentially administering such a combination of an antibody/antigen-binding portion/antibody composition/bispecific binding molecule of the present invention and a therapeutic agent(s) to a patient in need of treatment, wherein such components are formulated separately from each other into separate dosage forms that are sequentially administered to said patient with a significant time interval between each administration, whereupon said components are released to said patient at substantially different times; and
г) последовательное введение такой комбинации антитела/ антигенсвязывающей части/композиции антител/биспецифической связывающей молекулы по настоящему изобретению и терапевтического средства (средств) пациенту, нуждающемуся в лечении, когда такие компоненты составлены вместе в одной лекарственной форме, которая высвобождает указанные компоненты контролируемым образом, после чего они высвобождаются одновременно, последовательно и/или перекрывающимся образом в одно и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена либо одним и тем же, либо другим путем.d) sequential administration of such a combination of an antibody/antigen-binding portion/antibody composition/bispecific binding molecule of the present invention and a therapeutic agent(s) to a patient in need of treatment, wherein such components are formulated together in a single dosage form that releases said components in a controlled manner, whereafter they are released simultaneously, sequentially and/or overlappingly at the same and/or different times to said patient, wherein each part may be administered either by the same or a different route.
[0132] Антитела против AXL или их антигенсвязывающие части, композиции антител или биспецифические связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно вводить без дополнительного терапевтического лечения, то есть в качестве самостоятельной терапии (монотерапии). В качестве альтернативы, лечение антителами против AXL или их антигенсвязывающими частями, композициями антител или биспецифическими связывающими молекулами согласно настоящему изобретению может включать в себя по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированную терапию), например, иммуностимулирующее средство, противораковое средство (например, химиотерапевтическое средство, противоопухолевое средство, антиангиогенное средство или ингибитор тирозинкиназы), или вакцину (например, противоопухолевую вакцину).[0132] The anti-AXL antibodies or antigen-binding portions thereof, antibody compositions, or bispecific binding molecules of the present invention may be administered without additional therapeutic treatment, i.e., as a stand-alone therapy (monotherapy). Alternatively, treatment with the anti-AXL antibodies or antigen-binding portions thereof, antibody compositions, or bispecific binding molecules of the present invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy), such as an immunostimulatory agent, an anticancer agent (e.g., a chemotherapeutic agent, an antitumor agent, an antiangiogenic agent, or a tyrosine kinase inhibitor), or a vaccine (e.g., an antitumor vaccine).
[0133] В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающая часть, композиция антител или биспецифически связывающая молекула могут быть введены совместно или входить в состав с другим лекарственным препаратом/лекарственным средством для лечения рака. Дополнительное терапевтическое лечение может включать в себя, например, иммуностимулирующее средство, вакцину, химиотерапевтическое средство, противоопухолевое средство, средство против ангиогенеза, ингибитор тирозинкиназы и/или лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое лечение может включать в себя другое противораковое антитело.[0133] In some aspects, an antibody or antigen-binding portion thereof, antibody composition, or bispecific binding molecule may be co-administered or formulated with another drug/therapeutic agent for treating cancer. The additional therapeutic treatment may include, for example, an immunostimulatory agent, a vaccine, a chemotherapeutic agent, an anti-tumor agent, an anti-angiogenesis agent, a tyrosine kinase inhibitor, and/or radiation therapy. In some embodiments, the additional therapeutic treatment may include another anti-cancer antibody.
[0134] Фармацевтические изделия, содержащие антитело против AXL или его антигенсвязывающую часть, композицию антител или биспецифически связывающую молекулу, описанную в настоящей заявке и по меньшей мере одно другое средство (например, химиотерапевтическое, противоопухолевое или антиангиогенное средство), могут быть использованы в качестве комбинированного лечения для одновременного, раздельного или последовательного введения при лечении рака. Другое средство может представлять собой любое средство, подходящее для лечения конкретного рассматриваемого рака, например, средство, выбранное из группы, включающей в себя алкилирующие средства, например, производные платины, такие как цисплатин, карбоплатин и/или оксалиплатин; растительные алкалоиды, например, паклитаксел, доцетаксел и/или иринотекан; противоопухолевые антибиотики, например, доксорубицин (адриамицин), даунорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон, дактиномицин, блеомицин, актиномицин, лютеомицин и/или митомицин; ингибиторы топоизомеразы, такие как топотекан; антиметаболиты, например, фторурацил и/или другие фторпиримидины; FOLFOX; осимертиниб; циклофосфамид; антрациклин; дакарбазин; гемцитабин; или любую их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, композиция антител или биспецифическая связывающая молекула, описанные в настоящей заявке, восстанавливают чувствительность к другому средству.[0134] Pharmaceutical products comprising an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, an antibody composition, or a bispecific binding molecule described herein and at least one other agent (e.g., a chemotherapeutic, antineoplastic, or antiangiogenic agent) can be used as a combination therapy for simultaneous, separate, or sequential administration in the treatment of cancer. The other agent can be any agent suitable for the treatment of the particular cancer in question, such as an agent selected from the group consisting of alkylating agents, such as platinum derivatives such as cisplatin, carboplatin, and/or oxaliplatin; plant alkaloids, such as paclitaxel, docetaxel, and/or irinotecan; antineoplastic antibiotics, such as doxorubicin (adriamycin), daunorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone, dactinomycin, bleomycin, actinomycin, luteomycin and/or mitomycin; topoisomerase inhibitors, such as topotecan; antimetabolites, such as fluorouracil and/or other fluoropyrimidines; FOLFOX; osimertinib; cyclophosphamide; anthracycline; dacarbazine; gemcitabine; or any combination thereof. In some embodiments, an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, antibody composition, or bispecific binding molecule described herein restores sensitivity to another agent.
[0135] Антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, композиция антител или биспецифическая связывающая молекула согласно настоящему изобретению также могут быть использованы в комбинации с другими противораковыми терапевтическими средствами, такими как вакцины, цитокины, ингибиторы ферментов, иммуностимулирующие соединения и Т-клеточная терапия. В случае вакцины это может быть, например, белковая, пептидная или ДНК-вакцина, содержащая один или несколько антигенов, которые имеют отношение к излечиваемому раку, или вакцина, содержащая дендритные клетки вместе с антигеном. Подходящие цитокины включают, например, IL-2, IFN-гамма и GM-CSF. Примером типа ингибитора фермента, обладающего противораковой активностью, является ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), например, 1-метил-В-триптофан (1-D-MT). Также рассматривается адоптивная Т-клеточная терапия, которая относится к различным методам иммунотерапии, включающим расширение или создание собственных Т-клеток пациентов для распознавания и атаки их опухолей.[0135] The anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, antibody composition or bispecific binding molecule of the present invention can also be used in combination with other cancer therapeutics such as vaccines, cytokines, enzyme inhibitors, immunostimulatory compounds and T-cell therapy. In the case of a vaccine, this can be, for example, a protein, peptide or DNA vaccine comprising one or more antigens that are relevant to the cancer to be treated, or a vaccine comprising dendritic cells together with an antigen. Suitable cytokines include, for example, IL-2, IFN-gamma and GM-CSF. An example of a type of enzyme inhibitor having anti-cancer activity is an indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) inhibitor, such as 1-methyl-D-tryptophan (1-D-MT). Also under consideration is adoptive T-cell therapy, which refers to various immunotherapy techniques that involve expanding or creating patients' own T cells to recognize and attack their tumors.
[0136] Также предполагают, что антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, композиция антител или биспецифическая связывающая молекула согласно настоящему изобретению могут быть использованы в дополнительной терапии в сочетании с ингибиторами тирозинкиназы. Это синтетические молекулы с низкой молекулярной массой, в основном производные хиназолина, которые взаимодействуют с внутриклеточным тирозинкиназным доменом рецепторов и ингибируют лиганд-индуцированное фосфорилирование рецепторов, например, конкурируя за внутриклеточный участок связывания Mg-АТФ. В некоторых вариантах осуществления ингибитор тирозинкиназы представляет собой ингибитор AXL.[0136] It is also contemplated that an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, antibody composition, or bispecific binding molecule of the present invention may be used in adjunctive therapy in combination with tyrosine kinase inhibitors. These are low molecular weight synthetic molecules, generally quinazoline derivatives, that interact with the intracellular tyrosine kinase domain of receptors and inhibit ligand-induced phosphorylation of receptors, such as by competing for the intracellular Mg-ATP binding site. In some embodiments, the tyrosine kinase inhibitor is an AXL inhibitor.
[0137] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающая часть, композиция антител или биспецифическая связывающая молекула могут быть использованы в комбинации с лекарственным препаратом/лекарственным средством, которое опосредует активацию иммунной системы, включая, но не ограничиваясь этим, средство, которое модулирует экспрессию или активность A2AR, A1AR, A2BR, A3AR, ADA, ALP, BTLA, В7-Н3, В7-Н4, CTLA-4, CD27, CD28, CD39, CD40, CD47, CD55, CD73, CD122, CD137, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, CTLA-3, CEACAM (например, CEACAM-1 и/или CEACAM-5), EGFR, FLT3, FLT3L, GAL9, GITR, HVEM, LAG-3, LILRB1, LY108, LAIR1, ICOS, IDO, KIR, LAIR1, MET, NKG2A, PAP, PD-1/PD-L1/PD-L2, OX40, STING, TIGIT, TIM-3, TGFR-бета, TLR, TNFR2, VEGF, VEGFR, VISTA, LILRB2, CMTM6 и/или 2B4. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой низкомолекулярный ингибитор. В некоторых вариантах осуществления средство представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с одной из вышеуказанных молекул. Также предполагают, что антитело против AXL или его антигенсвязывающая часть, композиция антител, или биспецифическая связывающая молекула согласно настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с цитокином (например, IL-1, IL-2, IL-12, IL-15 или IL-21), ингибитором EGFR, ингибитором VEGF и т.д.[0137] In some embodiments, the antibody or antigen-binding portion thereof, antibody composition, or bispecific binding molecule can be used in combination with a drug/therapeutic agent that mediates activation of the immune system, including, but not limited to, an agent that modulates the expression or activity of A2AR, A1AR, A2BR, A3AR, ADA, ALP, BTLA, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, CD27, CD28, CD39, CD40, CD47, CD55, CD73, CD122, CD137, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, CTLA-3, CEACAM (e.g., CEACAM-1 and/or CEACAM-5), EGFR, FLT3, FLT3L, GAL9, GITR, HVEM, LAG-3, LILRB1, LY108, LAIR1, ICOS, IDO, KIR, LAIR1, MET, NKG2A, PAP, PD-1/PD-L1/PD-L2, OX40, STING, TIGIT, TIM-3, TGFR-beta, TLR, TNFR2, VEGF, VEGFR, VISTA, LILRB2, CMTM6 and/or 2B4. In some embodiments, the agent is a small molecule inhibitor. In some embodiments, the agent is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to one of the above molecules. It is also contemplated that an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, antibody composition, or bispecific binding molecule of the present invention can be used in combination with a cytokine (e.g., IL-1, IL-2, IL-12, IL-15, or IL-21), an EGFR inhibitor, a VEGF inhibitor, etc.
[0138] Настоящее изобретение также предусматривает использование последовательностей (например, шести CDR или последовательностей VH и VL) антитела против AXL или его антигенсвязывающей части, описанных в настоящей заявке, для получения химерного антигенного рецептора, который может быть использован в технологии CAR-T.[0138] The present invention also provides for the use of sequences (e.g., six CDRs or VH and VL sequences) of an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof described herein to produce a chimeric antigen receptor that can be used in CAR-T technology.
[0139] Понятно, что антитела и их антигенсвязывающие части, композиции антител и биспецифические связывающие молекулы в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в лечении, как описано в настоящей заявке, и/или могут быть использованы для изготовления лекарственного средства для лечения, описанного в настоящей заявке.[0139] It is understood that the antibodies and antigen-binding portions thereof, antibody compositions and bispecific binding molecules according to the present invention can be used in the treatment as described herein and/or can be used to manufacture a medicament for the treatment described herein.
Доза и путь введенияDosage and route of administration
[0140] Антитела или их антигенсвязывающие части, композиции антител или биспецифические связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно вводить в количестве, эффективном для лечения рассматриваемого состояния, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, подлежащее лечению, возраст, пол и масса тела пациента, а также от того, вводят ли антитела в качестве самостоятельного лечения или в сочетании с одним или несколькими дополнительными видами противоракового лечения.[0140] The antibodies or antigen-binding portions thereof, antibody compositions, or bispecific binding molecules of the present invention can be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e., at doses and for periods of time necessary to achieve the desired result. A therapeutically effective amount can vary depending on factors such as the particular condition being treated, the age, sex, and body weight of the patient, and whether the antibodies are administered as a single treatment or in combination with one or more additional anti-cancer treatments.
[0141] Режимы дозирования могут быть скорректированы для обеспечения оптимального желаемого ответа. Например, можно вводить один болюс, можно вводить несколько разделенных доз с течением времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с требованиями терапевтической ситуации. Особенно выгодно составлять парентеральные композиции в виде стандартной лекарственной формы для простоты введения и однородности дозировки. Единичная лекарственная форма, используемая в настоящей заявке, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация стандартных лекарственных форм в соответствии с настоящим изобретением, как правило, диктуется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик терапевтического средства и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который должен быть достигнут, и (б) ограничений, присущих данной области техники, составления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.[0141] Dosage regimens can be adjusted to provide the optimum desired response. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally decreased or increased as the therapeutic situation requires. It is especially advantageous to formulate parenteral compositions in dosage unit form for ease of administration and uniformity of dosage. Dosage unit form as used herein refers to physically discrete units suitable as unitary dosages for the patients/subjects to be treated, each unit containing a predetermined quantity of active compound calculated to produce the desired therapeutic effect in association with the required pharmaceutical carrier. The specification of dosage unit forms in accordance with the present invention will generally be dictated by and directly dependent on (a) the unique characteristics of the therapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved, and (b) the limitations inherent in the art in formulating such active compound for the treatment of sensitivity in individuals.
[0142] Таким образом, специалисту в данной области техники будет понятно, на основании представленного в настоящей заявке раскрытия, что доза и режим дозирования корректируют в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. То есть максимально переносимая доза может быть легко установлена, а также может быть определено эффективное количество, обеспечивающее поддающийся обнаружению терапевтический эффект у пациента, а также временные требования для введения каждого средства для обеспечения поддающегося обнаружению терапевтического эффекта у пациента. Соответственно несмотря на то, что в настоящей заявке приведены примеры определенных доз и режимов введения, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут быть предоставлены пациенту при использовании настоящего изобретения.[0142] Thus, one skilled in the art will appreciate, based on the disclosure provided herein, that the dose and dosage regimen are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic art. That is, the maximum tolerated dose can be readily determined, and an effective amount that provides a detectable therapeutic effect in a patient can also be determined, as well as the time requirements for administering each agent to provide a detectable therapeutic effect in a patient. Accordingly, although examples of certain doses and administration regimens are provided herein, these examples in no way limit the doses and administration regimens that can be provided to a patient using the present invention.
[0143] Следует отметить, что значения дозировки могут варьироваться в зависимости от типа и тяжести состояния, подлежащего облегчению, и могут включать в себя однократные или многократные дозы. Кроме того, следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы дозирования должны корректироваться с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным мнением лица, вводящего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны дозировок, указанные в настоящей заявке, являются примерными, только и не предназначены для ограничения объема или применения воплощенной композиции. Кроме того, режим дозирования композиций согласно настоящему изобретению может основываться на множестве факторов, включая тип заболевания, возраст, массу тела, пол, состояние здоровья пациента, тяжесть состояния, способ введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, режим дозирования может варьироваться в широких пределах, но его можно определить рутинно с использованием стандартных методов. Например, дозы можно корректировать на основе фармакокинетических или фармакодинамических параметров, которые могут включать в себя клинические эффекты, такие как токсические эффекты и/или лабораторные показатели. Таким образом, настоящее изобретение охватывает повышение дозы внутри пациента, как определено специалистом в данной области. Определение подходящих дозировок и схем хорошо известно в соответствующей области техники, и специалисту в данной области будет понятно, что они охватываются, как только будут предоставлены решения, раскрытые в настоящей заявке.[0143] It should be noted that dosage values may vary depending on the type and severity of the condition being treated, and may include single or multiple doses. It should also be understood that for any particular subject, specific dosage regimens should be adjusted over time according to the individual needs and professional judgment of the person administering or supervising the administration of the compositions, and that the dosage ranges set forth herein are exemplary only and are not intended to limit the scope or use of the embodied composition. In addition, the dosage regimen of the compositions of the present invention can be based on a variety of factors, including the type of disease, age, body weight, sex, health condition of the patient, severity of the condition, route of administration, and the particular antibody used. Thus, the dosage regimen can vary widely, but can be routinely determined using standard techniques. For example, doses can be adjusted based on pharmacokinetic or pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects such as toxic effects and/or laboratory parameters. Thus, the present invention encompasses intra-patient dose escalation as determined by one skilled in the art. Determination of appropriate dosages and regimens is well known in the relevant art, and one skilled in the art will understand that they are encompassed once the solutions disclosed in the present application are provided.
[0144] Эффективное количество для противоопухолевой терапии может быть измерено по его способности стабилизировать прогрессирование заболевания и/или ослаблять симптомы у пациента и предпочтительно обращать вспять прогрессирование заболевания, например, путем уменьшения размера опухоли. Способность антитела, антигенсвязывающей части, композиции антитела или биспецифической связывающей молекулы в соответствии с настоящим изобретением ингибировать рак можно оценить с помощью анализовin vitro, например, например, как описано в примерах, а также на подходящих животных моделях, которые предсказывают эффективность при опухолях человека. Подходящие режимы дозирования будут выбраны для обеспечения оптимального терапевтического ответа в каждой конкретной ситуации, например, при введении в виде однократного болюса или непрерывной инфузии с возможной корректировкой дозировки в зависимости от потребностей каждого случая.[0144] An effective amount for anti-tumor therapy can be measured by its ability to stabilize disease progression and/or alleviate symptoms in a patient, and preferably reverse disease progression, such as by reducing tumor size. The ability of an antibody, antigen-binding portion, antibody composition, or bispecific binding molecule of the present invention to inhibit cancer can be assessed usingin vitro assays, such as those described in the Examples, as well as in suitable animal models that are predictive of efficacy in human tumors. Suitable dosing regimens will be selected to provide an optimal therapeutic response in each specific situation, such as by administration as a single bolus or continuous infusion, with possible dosage adjustments depending on the needs of each case.
[0145] Антитела или их антигенсвязывающие части, композиции антител или биспецифические связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно вводить любым способом введения пептидов, белков или антител, принятым в данной области, и обычно они подходят для парентерального введения. Используемый в настоящей заявке термин «парентеральное введение» включает любой способ введения, характеризующийся физическим повреждением ткани субъекта и введением через повреждение в ткань, что обычно приводит к прямому введению в кровоток, в мышцу или в внутренний орган. Таким образом, парентеральное введение включает в себя, но не ограничивается этим, введение путем инъекции, введение через хирургический разрез, введение через проникающую в ткань нехирургическую рану и т.п.В частности, предполагается, что парентеральное введение включает подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, интрастернальную, внутрицистернальную, внутривенную, внутриартериальную, подоболочечную, внутриуретральную, внутричерепную, внутриопухолевую и интрасиновиальную инъекцию или инфузию, но не ограничивается ими. Конкретные варианты осуществления включают в себя внутривенный и подкожный пути введения.[0145] The antibodies or antigen-binding portions thereof, antibody compositions, or bispecific binding molecules of the present invention can be administered by any method of administering peptides, proteins, or antibodies recognized in the art, and are generally suitable for parenteral administration. As used herein, the term "parenteral administration" includes any method of administration characterized by physical injury to the tissue of a subject and administration through the injury into the tissue, which typically results in direct administration into the bloodstream, into a muscle, or into an internal organ. Thus, parenteral administration includes, but is not limited to, administration by injection, administration through a surgical incision, administration through a tissue-penetrating non-surgical wound, and the like. In particular, parenteral administration is contemplated to include, but is not limited to, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, intracisternal, intravenous, intraarterial, intrathecal, intraurethral, intracranial, intratumoral, and intrasynovial injection or infusion. Particular embodiments include intravenous and subcutaneous routes of administration.
Диагностические применения и композицииDiagnostic applications and compositions
[0146] Антитела и антигенсвязывающие части в соответствии с настоящим изобретением также можно использовать в диагностических способах (например,in vitro,ex vivo). Например, антитела и антигенсвязывающие части можно использовать для обнаружения и/или измерения уровня AXL в образце, взятом у пациента (например, образце ткани или образце жидкости организма, таком как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка, кишечная жидкость, слюна или моча). Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистологию. Настоящее изобретение дополнительно охватывает наборы (например, диагностические наборы), содержащие антитела и антигенсвязывающие части, описанные в настоящей заявке.[0146] The antibodies and antigen-binding portions of the present invention can also be used in diagnostic methods (e.g.,in vitro ,ex vivo ). For example, the antibodies and antigen-binding portions can be used to detect and/or measure the level of AXL in a sample taken from a patient (e.g., a tissue sample or a body fluid sample such as inflammatory exudate, blood, serum, intestinal fluid, saliva, or urine). Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescence assay, radioimmunoassay, and immunohistology. The present invention further encompasses kits (e.g., diagnostic kits) comprising the antibodies and antigen-binding portions described herein.
Производственные изделия и наборыProduction products and kits
[0147] Настоящее изобретения также обеспечивает производственные изделия, например, наборы, включающие одну или несколько емкостей (например, одноразовых или многоразовых емкостей), содержащих фармацевтическую композицию антитела против AXL или его антигенсвязывающую часть, композицию или биспецифически связывающую молекулу, описанные в настоящей заявке, необязательно дополнительную биологически активную молекулу (например, другое терапевтическое средство) и инструкции по применению. Антитело или его антигенсвязывающая часть, композиция или биспецифически связывающая молекула, и необязательно дополнительная биологически активная молекула могут быть упакованы отдельно в подходящую упаковку, такую как флакон или ампула, изготовленные из нереакционноспособного стекла или пластика. В некоторых вариантах осуществления флакон или ампула содержат концентрированный раствор (например, 2х, 5х, 10х или более) антитела или антигенсвязывающей части, композиции или биспецифически связывающей молекулы и необязательно, биологически активной молекулы. В некоторых вариантах осуществления производственные изделия, такие как наборы включают в себя медицинское устройство для введения антитела или его антигенсвязывающей части, композиции или биспецифически связывающей молекулы и/или биологически активной молекулы (например, шприц и иглу); и/или подходящий разбавитель (например, стерильная вода и нормальный физиологический раствор). Настоящее изобретение также включает способы изготовления указанных изделий.[0147] The present invention also provides articles of manufacture, such as kits, comprising one or more containers (e.g., single-use or reusable containers) containing a pharmaceutical composition of an anti-AXL antibody or antigen-binding portion thereof, composition, or bispecific binding molecule described herein, optionally an additional biologically active molecule (e.g., another therapeutic agent), and instructions for use. The antibody or antigen-binding portion thereof, composition, or bispecific binding molecule, and optionally an additional biologically active molecule can be separately packaged in a suitable container, such as a vial or ampoule made of non-reactive glass or plastic. In some embodiments, the vial or ampoule contains a concentrated solution (e.g., 2x, 5x, 10x, or more) of the antibody or antigen-binding portion, composition, or bispecific binding molecule, and optionally, a biologically active molecule. In some embodiments, articles of manufacture, such as kits, include a medical device for administering an antibody or antigen-binding portion thereof, a composition, or a bispecific binding molecule and/or a biologically active molecule (e.g., a syringe and needle); and/or a suitable diluent (e.g., sterile water and normal saline). The present invention also includes methods for making said articles.
[0148] Если иное не определено в данной заявке, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, обычно понятные специалистам в данной области техники. Типичные способы и материалы описаны ниже, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящей заявке, также могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения. В случае противоречия настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу.[0148] Unless otherwise defined in this application, scientific and technical terms used in connection with the present invention shall have the meanings commonly understood by those skilled in the art. Exemplary methods and materials are described below, although methods and materials similar or equivalent to those described herein can also be used in the practice or testing of the present invention. In case of conflict, the present description, including definitions, will control.
[0149] Как правило, номенклатура, используемая в связи с культурами клеток и тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой, аналитической химией, синтетической органической химией, медицинской и фармацевтической химией, а также химией белков и нуклеиновых кислот и гибридизацией, и описанные в настоящей заявке хорошо известны и широко используются в данной области техники. Ферментативные реакции и методы очистки осуществляют в соответствии со спецификациями производителя, как это обычно делается в данной области или как описано в настоящей заявке.[0149] In general, the nomenclature used in connection with cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, synthetic organic chemistry, medicinal and pharmaceutical chemistry, and protein and nucleic acid chemistry and hybridization, and described in the present application, are well known and widely used in the art. Enzymatic reactions and purification methods are carried out in accordance with the manufacturer's specifications, as is customary in the art or as described in the present application.
[0150] Кроме того, если иное не требуется по контексту, термины в единственном числе должны включать множественное число, а термины во множественном числе должны включать единственное число. Во всем данном описании и вариантах осуществления слова «иметь» и «содержать» или варианты, такие как «имеет», «имеющий», «содержит» или «содержащий», будут пониматься как подразумевающие включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел.[0150] Furthermore, unless the context otherwise requires, singular terms shall include the plural, and plural terms shall include the singular. Throughout this specification and embodiments, the words "have" and "comprise" or variations such as "has," "having," "comprises," or "comprising" shall be understood to imply the inclusion of the stated integer or group of integers, but not the exclusion of any other integer or group of integers.
[0151] Все публикации и другие ссылки, упомянутые в настоящей заявке, полностью включены в качестве ссылки. Хотя здесь процитирован ряд документов, это цитирование не является признанием того, что какой-либо из этих документов составляет часть общеизвестных сведений в данной области техники.[0151] All publications and other references cited in this application are incorporated by reference in their entirety. Although a number of documents are cited herein, such citation does not constitute an admission that any of these documents form part of the general knowledge in the art.
[0152] Для того, чтобы настоящее изобретение могло быть лучше понято, приведены следующие примеры. Эти примеры предназначены только для целей иллюстрации и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем настоящего изобретения.[0152] In order that the present invention may be better understood, the following examples are provided. These examples are intended for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the present invention in any way.
ПримерыExamples
Пример 1: Клонирование антител против AXL из В-клеток крысыExample 1: Cloning of anti-AXL antibodies from rat B cells
Материалы и способыMaterials and methods
[0153] Антитела против AXL человека выделяли из спектра антител, полученных от крыс OmniRat (Osborn и соавт., J Immunol. 190(4): 1481-90 (2013)), трансгенная линия крыс от Ligand Pharmaceuticals Inc., которая продуцирует антитела с полностью человеческими идиотипами. Клонирование генов антител, полученных от крыс из одноклеточных сортированных В-клеток, секретирующих антитела (ASC), проводили с помощью технологии обнаружения антител Symplex™ (Meijer и соавт., J Mol Biol 358(3):764-72 (2006)).[0153] Anti-human AXL antibodies were isolated from a repertoire of antibodies derived from OmniRat rats (Osborn et al., J Immunol. 190(4):1481–90 (2013)), a transgenic rat line from Ligand Pharmaceuticals Inc. that produces antibodies with fully human idiotypes. Cloning of antibody genes derived from single-cell sorted antibody-secreting B cells (ASCs) in rats was performed using Symplex™ antibody detection technology (Meijer et al., J Mol Biol 358(3):764–72 (2006)).
[0154] Конструкции спектра антител, полностью кодирующие иммуноглобулины человека в формате IgG1-LALA (см. ниже), трансфицировали в клетки HEK293. Клеточные супернатанты подвергали скринингу на связывание с AXL, экспрессированным на поверхности клеток СНО, с использованием проточной цитометрии в высокопроизводительном формате. AXL реакционноспособные клоны анализировали с помощью секвенирования ДНК и экстрагировали последовательности ДНК, кодирующие антитела. Выбранные клоны антител экспрессировали и функционально тестировали, как описано ниже.[0154] Antibody repertoire constructs encoding human immunoglobulins in the IgG1 -LALA format (see below) were transfected into HEK293 cells. Cell supernatants were screened for binding to AXL expressed on the surface of CHO cells using flow cytometry in a high-throughput format. AXL reactive clones were analyzed by DNA sequencing and antibody-encoding DNA sequences were extracted. Selected antibody clones were expressed and functionally tested as described below.
[0155] Миссенс-мутации в амино-концах тяжелых и легких цепей, которые были введены с использованием вырожденных праймеров при клонировании кодирующих антитела фрагментов кДНК с помощью Symplex™, корректировали до последовательности зародышевой линии. В таблице 1 показаны нуклеотидные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител с зародышевой линией, обозначенных 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 и 22883. Процесс коррекции включал коррекцию амино-концевой последовательности до зародышевой линии, а также оптимизацию использования кодонов. Мишени для сопоставления с последовательностями зародышевой линии человека идентифицировали путем поиска гомологии бластов для вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи.[0155] Missense mutations in the amino termini of the heavy and light chains that were introduced using degenerate primers during cloning of antibody-encoding cDNA fragments using Symplex™ were corrected to the germline sequence. Table 1 shows the nucleotide sequences of the heavy and light chain variable domains of the germline antibodies designated 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, and 22883. The correction process included correction of the amino-terminal sequence to the germline as well as optimization of codon usage. Targets for alignment to human germline sequences were identified by blast homology searches for the heavy chain and light chain variable regions.
[0156] Антитела 23203_1, 23203_2, 23203_3 и 23203_4 представляют собой четыре варианта одного родительского вариабельного домена тяжелой цепи, которые были сконструированы для снижения потенциальных рисков, связанных с последовательностью IGHV4-34 зародышевой линии (т.е. мотивом AVY HFR1 и участком Nglyc в HCDR2).[0156] Antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, and 23203_4 are four variants of a single parental heavy chain variable domain that were engineered to reduce potential risks associated with the IGHV4-34 germline sequence (i.e., the HFR1 AVY motif and the Nglyc site in HCDR2).
[0157] Белковые последовательности вариабельных доменов, константных областей и определяющих комплементарность областей (CDR) антител 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 и 22883 показаны в Таблице 2, Таблице 3 и Таблице 4, соответственно.[0157] The protein sequences of the variable domains, constant regions, and complementarity determining regions (CDRs) of antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, and 22883 are shown in Table 2, Table 3, and Table 4, respectively.
РезультатыResults
[0158] В таблице 1 представлены нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные домены антител 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 и 22883.[0158] Table 1 shows the nucleotide sequences encoding the variable domains of antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 and 22883.
[0159] В Таблице 2 показаны выведенные аминокислотные последовательности антител 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, 22883. CDR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.[0159] Table 2 shows the deduced amino acid sequences of antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, 22883. CDRs are shown in bold and underlined.
[0160] В Таблице 3 показаны аминокислотные последовательности константных областей тяжелой и легкой цепей (СН и CL, соответственно). «IgG1-LALA» относится к наличию мутаций «LALA» в тяжелой цепи (L234A/L235A, пронумерованы по схеме нумерации Кабата), которые, как известно, снижают эффекторную функцию области Fc антител IgG1 (Hezareh и соавт., J Virol. 75(24): 12161-68 (2001); Hessell и соавт., Nature 449(7158): 101-04 (2007)).[0160] Table 3 shows the amino acid sequences of the constant regions of the heavy and light chains (CH and CL, respectively). "IgG1 -LALA" refers to the presence of "LALA" mutations in the heavy chain (L234A/L235A, numbered according to the Kabat numbering scheme), which are known to reduce the effector function of the Fc region of IgG1 antibodies (Hezareh et al., J Virol. 75(24): 12161-68 (2001); Hessell et al., Nature 449(7158): 101-04 (2007)).
[0161] В таблице 4 показаны аминокислотные последовательности CDR тяжелой и легкой цепей антител 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 и 22883, где CDR определены в соответствии с системой IMGT. SEQ ID NO последовательностей указаны в скобках.[0161] Table 4 shows the amino acid sequences of the CDRs of the heavy and light chains of antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 and 22883, wherein the CDRs are defined according to the IMGT system. The SEQ ID NOs of the sequences are indicated in parentheses.
[0162] В таблице 5 показана информация SEQ ID NO для антител 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995 и 22883. Если не указано иное, последовательности представляют собой аминокислотные последовательности.[0162] Table 5 shows SEQ ID NO information for antibodies 23203_1, 23203_2, 23203_3, 23203_4, 22995, and 22883. Unless otherwise noted, sequences are amino acid sequences.
Пример 2: Измерение аффинности антител к AXL человека и яванского макакаExample 2: Measurement of the affinity of antibodies to human and cynomolgus monkey AXL
[0163] Этот пример показывает связывание антител против AXL с рекомбинантными внеклеточными доменами (ECD) AXL человека и яванского макака, что измеряется с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR).[0163] This example shows the binding of anti-AXL antibodies to recombinant human and cynomolgus monkey AXL extracellular domains (ECDs) as measured by surface plasmon resonance (SPR).
Материалы и способыMaterials and methods
[0164] Анализ кинетического связывания проводили методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием микроспоттера с непрерывным потоком (CFM, Wasatch Microfluidics, Солт-Лейк-Сити, США) в сочетании с прибором IBIS МХ96 SPR (IBIS Technologies, Нидерланды).[0164] Kinetic binding analysis was performed by surface plasmon resonance (SPR) using a continuous flow microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, USA) in combination with an IBIS MX96 SPR instrument (IBIS Technologies, The Netherlands).
[0165] Меченый His ECD AXL человека и яванского макака экспрессировали в клетках Expi293F и очищали с помощью хроматографии Ni-NTA. Кинетику связывания измеряли в условиях одновалентного антигена путем иммобилизации антител против AXL и выдерживания одновалентного антигена AXL в растворе. Антитела захватывали на G-a-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, Нидерланды) в течение 15 минут с использованием микроспоттера с непрерывным потоком Continuous Flow Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Солт-Лейк-Сити, США). После нанесения SensEye® помещали в биосенсор IBIS МХ96, а захваченные белки фиксировали на поверхности с помощью набора FixIT (Ssens BV, Нидерланды). Кинетический анализ выполняли, применяя серию кинетического титрования (Karlsson и соавт., Anal Biochem. 349(1): 136-47 (2006)) с инъекциями антигена при возрастающих концентрациях от 0,14 нМ до 100 нМ. Ассоциацию и диссоциацию антигена проводили в течение 15 минут. После каждой серии инъекций антигена поверхность регенерировали посредством 100 мМ Н3РО4, буфера для регенерации рН 3. Зарегистрированные реакции связывания были приспособлены к простой модели связывания Ленгмюра 1:1 с программным обеспечением Scrubber 2 для расчета констант скорости включения (kon или ka), скорости диссоциации (koff или kd) и аффинности (KD).[0165] His-tagged human and cynomolgus monkey AXL ECD was expressed in Expi293F cells and purified by Ni-NTA chromatography. Binding kinetics were measured under monovalent antigen conditions by immobilizing anti-AXL antibodies and incubating monovalent AXL antigen in solution. Antibodies were captured on a Ga-hu-IgG Fc SensEye® (Ssens BV, The Netherlands) for 15 min using a Continuous Flow Microspotter (CFM, Wasatch Microfluidics, Salt Lake City, USA). After application, SensEye® was loaded onto the IBIS MX96 biosensor and the captured proteins were fixed to the surface using the FixIT kit (Ssens BV, The Netherlands). Kinetic analysis was performed using a kinetic titration series (Karlsson et al., Anal Biochem. 349(1): 136–47 (2006)) with antigen injections at increasing concentrations from 0.14 nM to 100 nM. Antigen association and dissociation were allowed to proceed for 15 min. After each antigen injection series, the surface was regenerated with 100 mMH3PO4 , pH 3 regeneration buffer. The recorded binding reactions were fitted to a simple 1:1 Langmuir binding model with Scrubber 2 software to calculate the on-rate (kon or ka), off-rate (koff or kd), and affinity (KD ) constants.
РезультатыResults
[0166] Результаты измерений аффинности демонстрируют, что все антитела 22995, 22883 и 23203 и их версии связывают ECD AXL человека и яванского макака с различной аффинностью. Подробная кинетика связывания представлена в Таблице 6 ниже.[0166] The affinity measurement results demonstrate that all antibodies 22995, 22883, and 23203 and their versions bind human and cynomolgus monkey AXL ECD with varying affinities. The detailed binding kinetics are presented in Table 6 below.
Пример 3: Клонирование аналогов эталонных антител против AXLExample 3: Cloning of reference antibody analogues against AXL
[0167] В Таблице 7 представлена информация о трех антителах против AXL, использованных в качестве эталонов в примерах. Аналог 10G5 (BerGenBio) продуцировался как в IgG1, так и в IgG1-LALA, поэтому он указан в двух строках таблицы.[0167] Table 7 provides information on the three anti-AXL antibodies used as standards in the examples. Analog 10G5 (BerGenBio) was produced in both IgG1 and IgG1 -LALA, so it is listed in two rows of the table.
Материалы и способыMaterials and methods
[0168] Аминокислотные последовательности, кодирующие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей аналогов антител в Таблице 6, были получены из перечисленных патентов или патентных заявок. Белковые последовательности были обратно транслированы в последовательности ДНК с использованием кодонов человека. Соответствующие последовательности ДНК синтезировали и клонировали в экспрессионные векторы, содержащие константные области тяжелой или легкой цепи человека, что приводило к экспрессии полноразмерных цепей антител. Изотип человеческого антитела, выбранный для экспрессии, указан в столбце формата антитела. Клетки СНО трансфицировали полученными экспрессионными плазмидами с использованием стандартной системы экспрессии белка. Соответствующие супернатанты антител очищали с использованием стандартной колоночной хроматографии для очистки белка А.[0168] The amino acid sequences encoding the variable domains of the heavy and light chains of the antibody analogs in Table 6 were obtained from the listed patents or patent applications. The protein sequences were reverse translated into DNA sequences using human codons. The corresponding DNA sequences were synthesized and cloned into expression vectors containing the human heavy or light chain constant regions, resulting in expression of the full-length antibody chains. The human antibody isotype selected for expression is indicated in the antibody format column. CHO cells were transfected with the resulting expression plasmids using a standard protein expression system. The corresponding antibody supernatants were purified using standard protein A column chromatography.
Пример 4: Связываниеin vitro антител против AXL с клетками CHO-S, временно трансфицированными посредством AXL человека или яванского макакаExample 4:In vitro binding of anti-AXL antibodies to CHO-S cells transiently transfected with human or cynomolgus monkey AXL
Материалы и способыMaterials and methods
[0169] Шесть антител против AXL человека и аналогов эталонных антител оценивали с помощью проточной цитометрии на связываниеin vitro с внеклеточным доменом AXL человека или яванского макака, временно экспрессированным на клетках CHO-S. Для сравнения в оценку были включены эталонные аналоги антител. Все антитела инкубировали в серийных разведениях вместе с временно трансфицированными клетками CHO-S в течение 30 мин. при 4°С. После двух стадий промывки клетки инкубировали с конъюгированным AF647 вторичным антителом против человеческого IgG (H+L) в течение 30 мин. при 4°С. Заключительный этап промывки был выполнен перед получением клеток на скринере iQue Plus. Результаты были рассчитаны с помощью программного обеспечения GrafPad Prism. Результаты[0169] Six anti-human AXL antibodies and reference antibody analogs were assessed by flow cytometry forin vitro binding to the extracellular domain of human or cynomolgus monkey AXL transiently expressed on CHO-S cells. Reference antibody analogs were included for comparison. All antibodies were incubated in serial dilutions with transiently transfected CHO-S cells for 30 min at 4°C. After two wash steps, cells were incubated with AF647-conjugated anti-human IgG (H+L) secondary antibody for 30 min at 4°C. A final wash step was performed before cells were collected on the iQue Plus screener. Results were calculated using GrafPad Prism software. Results
[0170] Кривые доза-реакция связывания антитела с ECD AXL человека или яванского макака, экспрессированными на временно трансфицированных клетках CHO-S, показаны на Фиг. 1А - 1С. Все шесть антител против AXL человека связывают AXL как человека (Фиг. 1А), так и яванского макака (Фиг. 1В) с различной активностью и эффективностью. Для сравнения показаны два эталонных антитела. Ни одно из антител не связывается с псевдотрансфицированными клетками (Фиг. 1С).[0170] Dose-response curves of antibody binding to human or cynomolgus monkey AXL ECD expressed on transiently transfected CHO-S cells are shown in Figs. 1A-1C. All six anti-human AXL antibodies bind both human (Fig. 1A) and cynomolgus monkey (Fig. 1B) AXL with varying potency and efficiency. Two reference antibodies are shown for comparison. None of the antibodies bind to mock-transfected cells (Fig. 1C).
Пример 5: Скрининг функциональной активности антител против AXLin vitro в анализе пролиферации Н1299Example 5: Screening of functional activity of anti-AXL antibodiesin vitro in the H1299 proliferation assay
[0171] В этом примере описан функциональный скринингin vitro панели моноклональных антител против AXL с целью характеристики их функциональности в отсутствие или в присутствии лиганда GAS6. Антитела оценивали на их способность ингибировать индуцированную GAS6 пролиферацию, а также на их агонистическую активность в отсутствие GAS6 в экспрессирующей AXL линии раковых клеток Н1299. Аналоги эталонных антител были включены для сравнения.[0171] This example describes anin vitro functional screening of a panel of monoclonal antibodies against AXL to characterize their functionality in the absence or presence of GAS6 ligand. The antibodies were assessed for their ability to inhibit GAS6-induced proliferation, as well as their agonist activity in the absence of GAS6 in the AXL-expressing H1299 cancer cell line. Reference antibody analogs were included for comparison.
Материалы и способыMaterials and methods
[0172] Отобранные антитела против AXL оценивалиin vitro на их способность ингибировать пролиферацию экспрессирующей AXL линии раковых клеток Н1299. Клетки Н1299 высевали по 2500 клеток/лунку в 384-луночный планшет в среде RPMI 1640 Glutamax с добавлением 2% FBS и 1% P/S, и инкубировали в течение шести дней во влажном инкубаторе при 37°С с антителами в концентрации до 25 мкг/мл, без GAS6 или в присутствии GAS6 (RnD Systems) при 1 мкг/мл. Пролиферацию клеток количественно определяли с использованием реагента для пролиферации клеток WST-1 (Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Для сравнения были включены несколько конкурирующих аналогов (аналог Ах225 IgG1-LALA (Chugai), аналог YW327.6S2 IgG1-LALA (Genentech) и аналог 10G5 IgG1-LALA (BerGenBio)).[0172] Selected anti-AXL antibodies were assessedin vitro for their ability to inhibit proliferation of the AXL-expressing H1299 cancer cell line. H1299 cells were seeded at 2500 cells/well in a 384-well plate in RPMI 1640 Glutamax medium supplemented with 2% FBS and 1% P/S and incubated for six days in a humidified incubator at 37°C with antibodies at a concentration of up to 25 μg/ml, without GAS6, or in the presence of GAS6 (RnD Systems) at 1 μg/ml. Cell proliferation was quantified using the WST-1 Cell Proliferation Reagent (Roche) according to the manufacturer's instructions. Several competing analogues (Ax225 IgG1 -LALA analogue (Chugai), YW327.6S2 IgG1 -LALA analogue (Genentech) and 10G5 IgG1-LALA analogue (BerGenBio)) were included for comparison.
РезультатыResults
[0173] Результаты скрининга пролиферации показаны на Фиг. 2. Очевидно, что антитела можно разделить на основе функционального считывания. Из исследованных аналогов-конкурентов 10G5 IgG1-LALA (BerGenBio) и YW327.6S2 IgG1-LALA (Genentech) проявляли явную агонистическую активность, в то время как Ах225 IgG1-LALA (Chugai) не проявлял активности ни в отсутствие, ни в присутствии GAS6.[0173] The results of the proliferation screening are shown in Fig. 2. It is evident that the antibodies can be separated based on the functional readout. Of the competitor analogs tested, 10G5 IgG1 -LALA (BerGenBio) and YW327.6S2 IgG1 -LALA (Genentech) showed clear agonist activity, while Ax225 IgG1 -LALA (Chugai) showed no activity in either the absence or presence of GAS6.
[0174] Антитела, не проявляющие агонизма при отсутствии GAS6, были отобраны для дальнейшей функциональной характеристики с упором на редкие антитела, обладающие либо выраженным противодействием, либо усилением вызванной GAS6 пролиферации (обозначены пунктирной линией на фигуре).[0174] Antibodies that did not exhibit agonism in the absence of GAS6 were selected for further functional characterization, with a focus on rare antibodies that either strongly antagonized or enhanced GAS6-induced proliferation (denoted by the dotted line in the figure).
Пример 6: Функциональная активностьin vitro антител против AXL в анализе пролиферации Н1299Example 6:In vitro functional activity of anti-AXL antibodies in the H1299 proliferation assay
[0175] В этом примере описана функциональная оценкаin vitro шести моноклональных антител против AXL с целью демонстрации дозозависимой антагонистической активности. Антитела оценивали на их способность ингибировать индуцированную GAS6 пролиферацию, а также на их агонистическую активность в отсутствие GAS6 в клеточной линии H1299, экспрессирующей AXL. Аналоги эталонных антител были включены для сравнения.[0175] This example describes thein vitro functional evaluation of six anti-AXL monoclonal antibodies to demonstrate dose-dependent antagonist activity. The antibodies were assessed for their ability to inhibit GAS6-induced proliferation, as well as their agonist activity in the absence of GAS6 in the AXL-expressing H1299 cell line. Reference antibody analogs were included for comparison.
Материалы и способыMaterials and methods
[0176] Отобранные антитела против AXL более подробно оценивалиin vitro на их способность индуцировать пролиферацию экспрессирующей AXL линии раковых клеток H1299. Клетки H1299 высевали в среду RPMI 1640 Glutamax с добавлением 2% FBS и 1% P/S, и инкубировали в течение шести дней с двукратным титрованием указанных антител, начиная с 25 мкг/мл, или без GAS6, или в присутствии GAS6 (RnD Systems) при 1 мкг/мл. Пролиферацию клеток количественно определяли с использованием реагента для пролиферации клеток WST-1 (Roche) в соответствии с инструкциями производителя.[0176] The selected anti-AXL antibodies were further evaluatedin vitro for their ability to induce proliferation of the AXL-expressing H1299 cancer cell line. H1299 cells were seeded in RPMI 1640 Glutamax medium supplemented with 2% FBS and 1% P/S and incubated for six days with two-fold titrations of the indicated antibodies starting at 25 μg/ml, either without GAS6 or in the presence of GAS6 (RnD Systems) at 1 μg/ml. Cell proliferation was quantified using the WST-1 Cell Proliferation Reagent (Roche) according to the manufacturer's instructions.
РезультатыResults
[0177] Шесть антител против AXL оценивали на их способность ингибировать индуцированную GAS6 пролиферацию клеток линии H1299, экспрессирующих AXL, а также на их агонистическую активность при отсутствии GAS6 (Фиг. 3). Четыре антитела (23203_1, 23203_2, 23203_3 и 23203_4) проявляли дозозависимую антагонистическую активность, о чем свидетельствует их способность эффективно блокировать индуцированную GAS6 пролиферацию клеток Н1299 (верхняя панель) и отсутствие у них агонистической активности при отсутствии GAS6 (нижняя панель). Ни одно из других протестированных антител не было способно блокировать индуцированную GAS6 пролиферацию (верхняя панель). Аналог YW327.6S2 IgG1-LALA и аналоги Ах225 IgGp1-LALA были агонистами при отсутствии GAS6, о чем свидетельствует сильная индукция пролиферации (нижняя панель).[0177] Six anti-AXL antibodies were evaluated for their ability to inhibit GAS6-induced proliferation of AXL-expressing H1299 cells, as well as their agonist activity in the absence of GAS6 (Figure 3). Four antibodies (23203_1, 23203_2, 23203_3, and 23203_4) exhibited dose-dependent antagonist activity, as evidenced by their ability to potently block GAS6-induced H1299 cell proliferation (upper panel) and their lack of agonist activity in the absence of GAS6 (lower panel). None of the other antibodies tested were able to block GAS6-induced proliferation (upper panel). YW327.6S2 IgG1 -LALA analogue and Ax225 IgGp1 -LALA analogues were agonists in the absence of GAS6, as evidenced by strong induction of proliferation (lower panel).
Пример 7: Функциональная активностьin vitro антител против AXL в анализе поглощения липосомExample 7:In vitro functional activity of anti-AXL antibodies in a liposome uptake assay
[0178] В этом примере описывается функциональная оценкаin vitro шести моноклональных антител против AXL с целью демонстрации дозозависимой антагонистической активности.[0178] This example describes thein vitro functional evaluation of six anti-AXL monoclonal antibodies to demonstrate dose-dependent antagonist activity.
Материалы и способыMaterials and methods
[0179] Отобранные антитела против AXL и аналоги эталонных антител были более подробно оцененыin vitro на их способность ингибировать индуцированное GAS6 поглощение фосфатидилсеринсодержащих липосом в клетках MDA-MB-468-AXL, стабильно экспрессирующих экзогенный AXL. Липосомы готовили путем смешивания и гидратации молярных соотношений липидов РОРС (1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин; 43%), DOPS (1,2-диолеоил-8п-глицеро-3-фосфо-L-серин (натриевая соль); 11%), DOPE (1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин; 5%), холестерин (40%), DOPE-NBD (1,2-диолеоил--{ 12-[(7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил)амино]додеканоил}-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин; 1%) (Avanti Polar Lipids) с последующими циклами замораживания/оттаивания и экструзией через нуклеопорные фильтры (400 нм, Millipore), по существу, как описано (Ishimoto, Biochem. 127(3):411-7 (2000)). Клетки MDA-MB-468-AXL высевали в среду DMEM с 2% FBS и 1% P/S за день до анализа. На следующий день к клеткам добавляли GAS6 (R&D systems, 1 мкг/мл), липосомы (25 мкМ), антитела против AXL и эталонные антитела, а также контрольные антитела. Антитела титровали 4-кратно от 6 мкг/мл. Поглощение измеряли и анализировали с использованием платформы автоматизированного микроскопа IncuCyte.[0179] The selected anti-AXL antibodies and reference antibody analogs were further evaluatedin vitro for their ability to inhibit GAS6-induced uptake of phosphatidylserine-containing liposomes in MDA-MB-468-AXL cells stably expressing exogenous AXL. Liposomes were prepared by mixing and hydrating molar ratios of lipids POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine; 43%), DOPS (1,2-dioleoyl-8n-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt); 11%), DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; 5%), cholesterol (40%), DOPE-NBD (1,2-dioleoyl--{ 12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]dodecanoyl}-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; 1%) (Avanti Polar Lipids) followed by freeze/thaw cycles and extrusion through Nucleopore filters (400 nm, Millipore) were placed essentially as described (Ishimoto, Biochem. 127(3):411–7 (2000)). MDA-MB-468-AXL cells were seeded in DMEM with 2% FBS and 1% P/S the day before the assay. The following day, GAS6 (R&D systems, 1 μg/ml), liposomes (25 μM), anti-AXL and reference antibodies, and control antibodies were added to the cells. Antibodies were titrated 4-fold from 6 μg/ml. Absorbance was measured and analyzed using the IncuCyte automated microscope platform.
РезультатыResults
[0180] Результаты анализа поглощения липосом показаны на Фиг. 4. Очевидно, что ингибирующая функция антител зависит от концентрации и что все антитела ингибируют индуцированное GAS6 поглощение липосом, содержащих фосфатидилсерин, хотя и с различной активностью и эффективностью. Аналог YW327.6S2 IgG1-LALA (Genentech) проявляет антагонистическую активность, в то время как аналоги Ах225 IgG1-LALA (Chugai) и 10G5 IgG1-LALA (BerGenBio) не проявляют функциональности.[0180] The results of the liposome uptake assay are shown in Fig. 4. It is evident that the inhibitory function of the antibodies is concentration dependent and that all antibodies inhibit GAS6-induced uptake of phosphatidylserine-containing liposomes, although with varying potency and efficacy. The YW327.6S2 IgG1 -LALA analog (Genentech) exhibits antagonist activity, while the Ax225 IgG1 -LALA (Chugai) and 10G5 IgG1 -LALA (BerGenBio) analogs do not exhibit functionality.
Пример 8: Эффективностьin vivo антител против AXL в модели ксеногенной опухолиExample 8:In vivo efficacy of anti-AXL antibodies in a xenogeneic tumor model
[0181] Этот пример демонстрирует эффективностьin vivo антител 22995 и 23203_2 в модели ксеногенной опухоли.[0181] This example demonstrates thein vivo efficacy of antibodies 22995 and 23203_2 in a xenogeneic tumor model.
Материалы и способыMaterials and methods
[0182] 1×107 клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 инокулировали подкожно вместе с матригелем в бока 6-8-недельных самок мышей NOD.Scid. Опухоли измеряли штангенциркулем три раза в неделю в двух измерениях, и объем опухоли в мм3 рассчитывали по формуле: (ширина)2 × длина × 0,5. При среднем размере опухоли 40 мм3 мышей рандомизировали и начинали лечение. Мышей лечили три раза в неделю, всего шесть раз путем внутрибрюшинной инъекции буфера-лекарственной основы или одного из двух моноклональных антител 22995 или 23203_2 с последующим периодом наблюдения. Лечение антителами проводили в дозе 10 мг/кг или 50 мг/кг. Двусторонний ANOVA с тестом множественных сравнений Бонферрони был применен для сравнения объемов опухоли в каждый момент времени между группами лечения. Статистический анализ проводили с использованием GraphPad Prism версии 5.0 (GraphPad Software, Inc.).[0182] 1×107 human MDA-MB-231 breast cancer cells were inoculated subcutaneously with Matrigel into the flanks of 6- to 8-week-old female NOD.Scid mice. Tumors were measured with a caliper three times a week in two dimensions, and tumor volume inmm3 was calculated using the formula: (width)2 × length × 0.5. At an average tumor size of 40mm3, mice were randomized and treatment was started. Mice were treated three times a week for a total of six times by intraperitoneal injection of drug-vehicle buffer or one of two monoclonal antibodies 22995 or 23203_2, followed by an observation period. Antibody treatment was given at a dose of 10 mg/kg or 50 mg/kg. Two-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test was used to compare tumor volumes at each time point between treatment groups. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, Inc.).
РезультатыResults
[0183] На 20-й день после инокуляции при среднем размере опухоли 40 мм3, мышеи рандомизировали на пять групп по десять животных и начинали лечение. Результаты показали сильное противоопухолевое ингибирующее действие обоих моноклональных антител против AXL (22995 и 23203_2) в тестируемой модели опухоли (**** Р<0,0001) (Фиг. 5А и 5В).[0183] On day 20 post-inoculation, at a mean tumor size of 40mm3 , mice were randomized into five groups of ten animals and treatment was started. The results showed a strong anti-tumor inhibitory effect of both anti-AXL monoclonal antibodies (22995 and 23203_2) in the tested tumor model (**** P<0.0001) (Fig. 5A and 5B).
Пример 9: Биннинг эпитопов антител против AXLExample 9: Binning of anti-AXL antibody epitopes
[0184] В этом примере описан анализ перекрестной конкуренции антител против AXL 23203-1, 22995 и 22883 и аналогов 10G5 и YW327.6S2 IgG1-LALA, измеренной с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Неблокирующие отношения между антителами указывают на то, что они распознают разные эпитопы AXL.[0184] This example describes a cross-competition analysis of AXL antibodies 23203-1, 22995, and 22883 and 10G5 and YW327.6S2 IgG1 -LALA analogs measured by surface plasmon resonance (SPR). The non-blocking relationships between the antibodies indicate that they recognize different AXL epitopes.
Материалы и способыMaterials and methods
[0185] Изучение конкуренции парных антител проводили методом SPR на приборе IBIS-MX96 (IBIS, Нидерланды). Антитела против AXL наносили на G-a-hu-IgG Fc SensEye® путем захвата в течение 15 минут с помощью микроспоттера с непрерывным потоком, с последующим блокированием остаточных сайтов связывания герцептином (трастузумаб) и химическим перекрестным связыванием с помощью набора SensEye Fixlt (IBIS, Нидерланды). После подготовки сенсора был проведен анализ конкуренции антител с использованием классического сэндвич-анализа. Рекомбинантный антиген AXL-His ECD вводили в концентрации 100 нМ и захватывали массивом конъюгированных антител против AXL. Затем выполняли отдельные инъекции каждого из антител AXL, разведенных до 100 нМ в рабочем буфере, для установления паттернов конкуренции антител. Рекомбинантный лиганд AXL, GAS6 (100 нМ), был включен в качестве аналита для характеристики антител, блокирующих лиганд. Данные анализировали с помощью программы Epitope Binning 2.0 (Wasatch, США).[0185] Paired antibody competition studies were performed by SPR on an IBIS-MX96 instrument (IBIS, The Netherlands). Anti-AXL antibodies were applied to the SensEye® G-a-hu-IgG Fc by capture for 15 minutes using a continuous flow microspotter, followed by blocking of residual binding sites with Herceptin (trastuzumab) and chemical cross-linking using the SensEye Fixlt kit (IBIS, The Netherlands). After sensor preparation, antibody competition was analyzed using a classical sandwich assay. Recombinant AXL-His ECD antigen was injected at a concentration of 100 nM and captured with an array of conjugated anti-AXL antibodies. Separate injections of each AXL antibody, diluted to 100 nM in running buffer, were then performed to establish antibody competition patterns. Recombinant AXL ligand, GAS6 (100 nM), was included as an analyte to characterize ligand-blocking antibodies. Data were analyzed using Epitope Binning 2.0 software (Wasatch, USA).
РезультатыResults
[0186] На фиг. показаны нормализованные значения связывания указанных антител или лиганда AXL, GAS6, с ECD AXL, предварительно связанным с массивом иммобилизованных антител против AXL на поверхности биосенсора. Иммобилизованные антитела представлены в виде строк, а антитела в растворе -в виде столбцов. Неблокирующие (слоистые) антитела показаны белым цветом, а блокирующие антитела - серым.[0186] Figure 1 shows normalized binding values of the indicated antibodies or AXL ligand, GAS6, to the AXL ECD pre-bound to an array of immobilized anti-AXL antibodies on the surface of the biosensor. Immobilized antibodies are shown as rows and antibodies in solution are shown as columns. Non-blocking (layered) antibodies are shown in white and blocking antibodies are shown in gray.
[0187] Аналоги 10G5 и YW327.6S2, испытанные в обоих направлениях, оказались самоблокирующимися. Все протестированные антитела блокировали GAS6, за исключением контрольного антитела, о котором известно, что он не блокирует лиганд. Ни одно из протестированных антител 22995, 23203-1 и 22883 не конкурировало с аналогом YW327.6S2 IgG1-LALA, и только одно антитело, 22883, конкурировало с аналогом 10G5.[0187] Analogs 10G5 and YW327.6S2, tested in both directions, were self-blocking. All antibodies tested blocked GAS6 except the control antibody, which is known not to block the ligand. None of the antibodies tested, 22995, 23203-1, and 22883, competed with the YW327.6S2 IgG1-LALA analog, and only one antibody, 22883, competed with the 10G5 analog.
[0188] В заключение, данные показывают, что антитела 22995 и 23203-1 распознают другие эпитопы на ECD AXL, чем аналоги 10G5 и YW327.6S2 IgG1-LALA.[0188] In conclusion, the data show that antibodies 22995 and 23203-1 recognize different epitopes on the AXL ECD than the 10G5 and YW327.6S2 IgG1-LALA analogs.
Пример 10: Антитело против AXL, связывающееся с мутантами химерного домена AXLExample 10: Anti-AXL antibody binding to AXL chimeric domain mutants
[0189] В этом примере описано связывание антител против AXL с рекомбинантным химерным ECD AXL, где домены последовательности мышиного AXL были заменены на последовательность AXL человека. Связывание антител против AXL с химерными белками измеряли с помощью интерферометрии биослоев (BLI) для определения доменов AXL, связанных с антителами 23203-1, 22995, аналогом 10G5 и аналогом YW327.6S2 IgG1-LALA.[0189] This example describes the binding of anti-AXL antibodies to a recombinant chimeric AXL ECD, wherein the domains of the mouse AXL sequence have been replaced with the human AXL sequence. The binding of anti-AXL antibodies to the chimeric proteins was measured using biolayer interferometry (BLI) to determine the AXL domains bound to antibodies 23203-1, 22995, 10G5 analog, and YW327.6S2 IgG1-LALA analog.
Материалы и способыMaterials and methods
[0190] Белковые последовательности AXL человека и мыши загружали с UniProt (регистрационные номера Р30530 и Q80YQ3, соответственно). Химерные белки были получены путем замены Ig1-2 и Fn-1-2 в ECD AXL мыши человеческими аналогами, как показано на фиг.7. Меченые His конструкты AXL дикого типа и мутантные конструкции AXL человека были созданы с помощью стандартных методов синтеза генов, и белки были временно экспрессированы с использованием системы экспрессии ExpiCHO™. Связывание антител с захваченными химерными белками измеряли с помощью BLI с использованием прибора Octet QK384. Меченые His химерные белки улавливали из супернатанта предварительно уравновешенными биосенсорами Anti-Penta-HIS (HIS1K) (Sartorius) в течение 10 мин. Ассоциацию антител против AXL измеряли в течение 10 мин. в условиях насыщения. Сенсоры регенерировали в 10 мМ глицина, рН 1,5, в течение 5 с х 3. Данные анализировали в ForteBio Data Analysis 8.2 путем вычитания эталонных поверхностных уровней, и ответы определяли количественно в конце ассоциации антител.[0190] Human and mouse AXL protein sequences were downloaded from UniProt (accession numbers P30530 and Q80YQ3, respectively). Chimeric proteins were generated by replacing Ig1-2 and Fn-1-2 in the mouse AXL ECD with the human counterparts as shown in Fig. 7. His-tagged wild-type and mutant human AXL constructs were generated by standard gene synthesis methods and the proteins were transiently expressed using the ExpiCHO™ Expression System. Antibody binding to the captured chimeric proteins was measured by BLI using an Octet QK384 instrument. His-tagged chimeric proteins were captured from the supernatant with pre-equilibrated Anti-Penta-HIS (HIS1K) Biosensors (Sartorius) for 10 min. Anti-AXL antibody association was measured for 10 min under saturating conditions. Sensors were regenerated in 10 mM glycine, pH 1.5, for 5 s x 3. Data were analyzed in ForteBio Data Analysis 8.2 by subtraction of reference surface levels, and responses were quantified at the end of antibody association.
РезультатыResults
[0191] На Фиг. 7 показаны нормализованные ответы (нм) связывания указанных антител с захваченными химерными белками ECD AXL человека/мыши.[0191] Fig. 7 shows the normalized binding responses (nm) of the indicated antibodies to captured human/mouse ECD AXL chimeric proteins.
[0192] Все антитела связывали полноразмерный ECD AXL человека (HuAxl ECD), состоящий из двух доменов, подобных иммуноглобулинам (Ig1 и Ig2), за которыми следуют два домена, подобных фибронектину типа 3 (Fn1 и Fn2). Аналог YW327.6S2 перекрестно реагирует с мышиным AXL и связывает все химерные белки, демонстрируя, что белковые конструкции в целом функциональны (Ye и соавт., Oncogene 29:5254 5264 (2010)). И антитело 22995, и аналог 10G5 связывались с доменом Ig1 AXL, тогда как антитело 23203-1 связывалось с доменом Ig2.[0192] All antibodies bound the full-length human AXL ECD (HuAxl ECD), which consists of two immunoglobulin-like domains (Ig1 and Ig2) followed by two fibronectin type 3-like domains (Fn1 and Fn2). The YW327.6S2 analog cross-reacts with mouse AXL and binds all chimeric proteins, demonstrating that the protein constructs are generally functional (Ye et al., Oncogene 29:5254 5264 (2010)). Both antibody 22995 and analog 10G5 bound to the Ig1 domain of AXL, whereas antibody 23203-1 bound to the Ig2 domain.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> СЮМФОГЕН A/С<110> SUMPHOGEN A/S
<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ AXL И КОМПОЗИЦИИ<120> ANTIBODIES AGAINST AXL AND COMPOSITIONS
<130> 022675.WO062<130> 022675.WO062
<140><140>
<141><141>
<150> 62/982,852<150> 62/982,852
<151> 2020-02-28<151> 2020-02-28
<160> 67<160> 67
<170> PatentIn version 3.5<170> PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 357<211> 357
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 1<400> 1
caggtgcagc tgcaggagtc tggccctggc ctggtgaagc caagcgagac actgtctctg 60caggtgcagc tgcaggagtc tggccctggc ctggtgaagc caagcgagac actgtctctg 60
acctgtaccg tgtctggcgg ctctttttct ggatattact ggagctggat cagacagcca 120acctgtaccg tgtctggcgg ctctttttct ggatattact ggagctggat cagacagcca 120
cccggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacg ctggctccac caattacaac 180cccggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacg ctggctccac caattacaac 180
ccctctctga agagcagagt gaccatctct gtggatacct ccaagaacca gttctccctg 240ccctctctga agagcagagt gaccatctct gtggatacct ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgtcta gcgtgacagc cgctgataca gccgtgtact attgctcttc ccgcgagtac 300aagctgtcta gcgtgacagc cgctgataca gccgtgtact attgctcttc ccgcgagtac 300
tcctctcgtt ggcacttcga ctactggggc cagggcacac tggtgaccgt ctcgagt 357tcctctcgtt ggcacttcga ctactggggc cagggcacac tggtgaccgt ctcgagt 357
<210> 2<210> 2
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 2<400> 2
gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60
atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180
cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300
ggcacaaagg tggagatcaa g 321ggcacaaagg tggagatcaa g 321
<210> 3<210> 3
<211> 119<211> 119
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 3<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 151 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Gly TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly Glu Ile Asn His Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 8065 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys SerLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlySer Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115115
<210> 4<210> 4
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 4<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro LeuGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 5<210> 5
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 5<400> 5
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr TyrGly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 51 5
<210> 6<210> 6
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 6<400> 6
Ile Asn His Ala Gly Ser ThrIle Asn His Ala Gly Ser Thr
1 51 5
<210> 7<210> 7
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 7<400> 7
Cys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr TrpCys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp
1 5 10 151 5 10 15
<210> 8<210> 8
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 8<400> 8
Gln Gly Ile Ser Ser TyrGln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 51 5
<210> 9<210> 9
<211> 3<211> 3
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 9<400> 9
Ala Ala SerAla Ala Ser
11
<210> 10<210> 10
<211> 11<211> 11
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 10<400> 10
Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr PheCys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
1 5 101 5 10
<210> 11<210> 11
<211> 357<211> 357
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 11<400> 11
caggtgcagc tgcagcagtg gggcgctggc ctgctgaagc cttctgagac actgtctctg 60caggtgcagc tgcagcagtg gggcgctggc ctgctgaagc cttctgagac actgtctctg 60
acctgtgccg tgtatggcgg ctctttttcg ggctattact ggacctggat cagacagcct 120acctgtgccg tgtatggcgg ctctttttcg ggctattact ggacctggat cagacagcct 120
ccaggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaatcact ccggctctac caactacaat 180ccaggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaatcact ccggctctac caactacaat 180
ccatccctga agagcagagt gaccatctcc gtggatacct ccaagaatca gttttctctg 240ccatccctga agagcagagt gaccatctcc gtggatacct ccaagaatca gttttctctg 240
aagctgtcct ctgtgacagc tgctgatacc gccgtgtact attgctctag cagagagtac 300aagctgtcct ctgtgacagc tgctgatacc gccgtgtact attgctctag cagagagtac 300
tcctctagat ggcacttcga ttactggggc cagggcacac tggtgaccgt ctcgagt 357tcctctagat ggcacttcga ttactggggc cagggcacac tggtgaccgt ctcgagt 357
<210> 12<210> 12
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 12<400> 12
gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60
atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180
cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300
ggcacaaagg tggagatcaa g 321ggcacaaagg tggagatcaa g 321
<210> 13<210> 13
<211> 119<211> 119
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 13<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 151 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 8065 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys SerLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlySer Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115115
<210> 14<210> 14
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 14<400> 14
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro LeuGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 15<210> 15
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 15<400> 15
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr TyrGly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 51 5
<210> 16<210> 16
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 16<400> 16
Ile Asn His Ser Gly Ser ThrIle Asn His Ser Gly Ser Thr
1 51 5
<210> 17<210> 17
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 17<400> 17
Cys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr TrpCys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp
1 5 10 151 5 10 15
<210> 18<210> 18
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 18<400> 18
Gln Gly Ile Ser Ser TyrGln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 51 5
<210> 19<210> 19
<211> 3<211> 3
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 19<400> 19
Ala Ala SerAla Ala Ser
11
<210> 20<210> 20
<211> 11<211> 11
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 20<400> 20
Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr PheCys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
1 5 101 5 10
<210> 21<210> 21
<211> 357<211> 357
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 21<400> 21
caggtgcagc tgcagcagtg gggcgctggc ctgctgaagc cttctgagac actgtctctg 60caggtgcagc tgcagcagtg gggcgctggc ctgctgaagc cttctgagac actgtctctg 60
acctgtaccg tgtctggcgg ctctttttcc ggctattact ggacctggat caggcagcca 120acctgtaccg tgtctggcgg ctctttttcc ggctattact ggacctggat caggcagcca 120
cctggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacg ctggctccac caactacaat 180cctggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacg ctggctccac caactacaat 180
ccttccctga agtctagagt gaccatctcc gtggatacct ccaagaacca gttctccctg 240ccttccctga agtctagagt gaccatctcc gtggatacct ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgtcct ctgtgaccgc cgctgataca gccgtgtact attgctccag cagagagtac 300aagctgtcct ctgtgaccgc cgctgataca gccgtgtact attgctccag cagagagtac 300
tcctctagat ggcacttcga ctactggggc cagggcacac tggtgacagt ctcgagt 357tcctctagat ggcacttcga ctactggggc cagggcacac tggtgacagt ctcgagt 357
<210> 22<210> 22
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 22<400> 22
gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60
atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180
cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300
ggcacaaagg tggagatcaa g 321ggcacaaagg tggagatcaa g 321
<210> 23<210> 23
<211> 119<211> 119
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 23<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 151 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Gly TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly Glu Ile Asn His Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 8065 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys SerLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlySer Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115115
<210> 24<210> 24
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 24<400> 24
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro LeuGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 25<210> 25
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 25<400> 25
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr TyrGly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 51 5
<210> 26<210> 26
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 26<400> 26
Ile Asn His Ala Gly Ser ThrIle Asn His Ala Gly Ser Thr
1 51 5
<210> 27<210> 27
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 27<400> 27
Cys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr TrpCys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp
1 5 10 151 5 10 15
<210> 28<210> 28
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 28<400> 28
Gln Gly Ile Ser Ser TyrGln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 51 5
<210> 29<210> 29
<211> 3<211> 3
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 29<400> 29
Ala Ala SerAla Ala Ser
11
<210> 30<210> 30
<211> 11<211> 11
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 30<400> 30
Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr PheCys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
1 5 101 5 10
<210> 31<210> 31
<211> 357<211> 357
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 31<400> 31
caggtgcagc tgcagcagtg gggcgctggc ctgctgaagc cttctgagac actgtctctg 60caggtgcagc tgcagcagtg gggcgctggc ctgctgaagc cttctgagac actgtctctg 60
acctgtgccg tgtatggcgg ctctttttcc ggctattact ggacctggat caggcagcca 120acctgtgccg tgtatggcgg ctctttttcc ggctattact ggacctggat caggcagcca 120
cctggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacg ctggctccac caactacaat 180cctggcaagg gcctggagtg gatcggcgag atcaaccacg ctggctccac caactacaat 180
ccttccctga agtctagagt gaccatctcc gtggatacct ccaagaacca gttctccctg 240ccttccctga agtctagagt gaccatctcc gtggatacct ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgtcct ctgtgaccgc cgctgataca gccgtgtact attgctccag cagagagtac 300aagctgtcct ctgtgaccgc cgctgataca gccgtgtact attgctccag cagagagtac 300
tcctctagat ggcacttcga ctactggggc cagggcacac tggtgacagt ctcgagt 357tcctctagat ggcacttcga ctactggggc cagggcacac tggtgacagt ctcgagt 357
<210> 32<210> 32
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 32<400> 32
gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60gatatccagc tgacccagtc ccctagcttc ctgtctgctt ccgtgggcga tagagtgacc 60
atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120atcacatgta gagcctctca gggcatctcc tcttacctgg cttggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180ggcaaggctc ctaagctgct gatctatgct gcctctacac tgcagtctgg cgtgccatcc 180
cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240cggttcagcg gctctggcag cggcaccgag ttcacactga ccatctcctc tctgcagcca 240
gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300gaggatttcg ctacctacta ttgccagcag ctgaacagct accctctgac atttggcggc 300
ggcacaaagg tggagatcaa g 321ggcacaaagg tggagatcaa g 321
<210> 33<210> 33
<211> 119<211> 119
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 33<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 151 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45 35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly Glu Ile Asn His Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60 50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuSer Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 8065 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys SerLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln GlySer Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser SerThr Leu Val Thr Val Ser Ser
115115
<210> 34<210> 34
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 34<400> 34
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser TyrAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro LeuGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 35<210> 35
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 35<400> 35
Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr TyrGly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr
1 51 5
<210> 36<210> 36
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 36<400> 36
Ile Asn His Ala Gly Ser ThrIle Asn His Ala Gly Ser Thr
1 51 5
<210> 37<210> 37
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 37<400> 37
Cys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr TrpCys Ser Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp
1 5 10 151 5 10 15
<210> 38<210> 38
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 38<400> 38
Gln Gly Ile Ser Ser TyrGln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 51 5
<210> 39<210> 39
<211> 3<211> 3
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 39<400> 39
Ala Ala SerAla Ala Ser
11
<210> 40<210> 40
<211> 11<211> 11
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 40<400> 40
Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr PheCys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
1 5 101 5 10
<210> 41<210> 41
<211> 375<211> 375
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 41<400> 41
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcagc ctggtgcagc ccggcggctc tctgagactg 60gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcagc ctggtgcagc ccggcggctc tctgagactg 60
tcttgtgccg cttctggctt taccttctct tcatccgcta tgtcttgggt gcgccaagcc 120tcttgtgccg cttctggctt taccttctct tcatccgcta tgtcttgggt gcgccaagcc 120
ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtctacc atctccggca gcgattcttc cacctacgac 180ccaggcaagg gcctggagtg ggtgtctacc atctccggca gcgattcttc cacctacgac 180
gctgattccg tgaagggcag aagcacaatc tccagggaca attccaagaa caccctgtat 240gctgattccg tgaagggcag aagcacaatc tccagggaca attccaagaa caccctgtat 240
ctgcagatga actccctgag agctgatgac accgccgtgt attactgcgc taagaagggc 300ctgcagatga actccctgag agctgatgac accgccgtgt attactgcgc taagaagggc 300
gcttattgtt ccggcacaat ctgctacgat cccttcgact attggggcca gggcacactg 360gcttattgtt ccggcacaat ctgctacgat cccttcgact attggggcca gggcacactg 360
gtgaccgtct cgagt 375gtgaccgtct cgagt 375
<210> 42<210> 42
<211> 330<211> 330
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 42<400> 42
gatatcgtgc tgacccagtc tccagtgctg gccgtgtccc tgggccagag agctaccatc 60gatatcgtgc tgacccagtc tccagtgctg gccgtgtccc tgggccagag agctaccatc 60
tcttgcagag cttctcagtc cgtgtctatc agctccatca acctgatgca ttggtaccag 120tcttgcagag cttctcagtc cgtgtctatc agctccatca acctgatgca ttggtaccag 120
cagaagccag gccagcagcc aaagctgctg atctacagag ccagcaacct ggcttctggc 180cagaagccag gccagcagcc aaagctgctg atctacagag ccagcaacct ggcttctggc 180
atcccagcta gattctccgg ctctggcagc ggcacagatt tcaccctgac aatcgatcct 240atcccagcta gattctccgg ctctggcagc ggcacagatt tcaccctgac aatcgatcct 240
gtgcaggctg acgatatcgc cgcttattac tgccagcagt ccagagagtc tcctctgacc 300gtgcaggctg acgatatcgc cgcttattac tgccagcagt ccagagagtc tcctctgacc 300
tttggcggcg gcacaaaggt ggagatcaag 330tttggcggcg gcacaaaggt ggagatcaag 330
<210> 43<210> 43
<211> 125<211> 125
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 43<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser SerSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser
20 25 30 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Asp Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Ser ValSer Thr Ile Ser Gly Ser Asp Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Lys Gly Ala Tyr Cys Ser Gly Thr Ile Cys Tyr Asp Pro PheAla Lys Lys Gly Ala Tyr Cys Ser Gly Thr Ile Cys Tyr Asp Pro Phe
100 105 110 100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerAsp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125 115 120 125
<210> 44<210> 44
<211> 110<211> 110
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 44<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Leu Ala Val Ser Leu Gly GlnAsp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln
1 5 10 151 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser SerArg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser
20 25 30 20 25 30
Ile Asn Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro LysIle Asn Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35 40 45 35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala ArgLeu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
50 55 60 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp ProPhe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg GluVal Gln Ala Asp Asp Ile Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu
85 90 95 85 90 95
Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile LysSer Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110 100 105 110
<210> 45<210> 45
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 45<400> 45
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser AlaGly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Ala
1 51 5
<210> 46<210> 46
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 46<400> 46
Ile Ser Gly Ser Asp Ser Ser ThrIle Ser Gly Ser Asp Ser Ser Thr
1 51 5
<210> 47<210> 47
<211> 20<211> 20
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 47<400> 47
Cys Ala Lys Lys Gly Ala Tyr Cys Ser Gly Thr Ile Cys Tyr Asp ProCys Ala Lys Lys Gly Ala Tyr Cys Ser Gly Thr Ile Cys Tyr Asp Pro
1 5 10 151 5 10 15
Phe Asp Tyr TrpPhe Asp Tyr Trp
2020
<210> 48<210> 48
<211> 9<211> 9
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 48<400> 48
Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser Ile AsnGln Ser Val Ser Ile Ser Ser Ile Asn
1 51 5
<210> 49<210> 49
<211> 3<211> 3
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 49<400> 49
Arg Ala SerArg Ala Ser
11
<210> 50<210> 50
<211> 11<211> 11
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 50<400> 50
Cys Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Leu Thr PheCys Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Leu Thr Phe
1 5 101 5 10
<210> 51<210> 51
<211> 360<211> 360
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 51<400> 51
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcggc ctggtgcagc caggcggctc tctgagactg 60gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcggc ctggtgcagc caggcggctc tctgagactg 60
tcttgtgccg cttctggctt taccttctcc tcttacgcca tgtcttgggt gcggcaagcc 120tcttgtgccg cttctggctt taccttctcc tcttacgcca tgtcttgggt gcggcaagcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgtctgct atctccggcg gcggcgacta tacctactat 180cccggcaagg gcctggagtg ggtgtctgct atctccggcg gcggcgacta tacctactat 180
gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agcagggaca attccaagaa caccctgtac 240gccgacagcg tgaagggcag attcaccatc agcagggaca attccaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga actccctgag agctgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggaggag 300ctgcagatga actccctgag agctgaggat acagccgtgt actattgcgc caaggaggag 300
tgggagctga gaggcccatt tcggtattgg ggccagggca cactggtgac agtctcgagt 360tgggagctga gaggcccatt tcggtattgg ggccagggca cactggtgac agtctcgagt 360
<210> 52<210> 52
<211> 321<211> 321
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полинуклеотид"polynucleotide"
<400> 52<400> 52
gacatccaga tgacccagag cccttccacc ctgagcgcca gcgtcggaga tagagtgaca 60gacatccaga tgacccagag cccttccacc ctgagcgcca gcgtcggaga tagagtgaca 60
attacttgcc gtgccagcca gtccatttcc tcttggctgg cctggtacca gcagaagcct 120attacttgcc gtgccagcca gtccatttcc tcttggctgg cctggtacca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ctaagttcct gatctataaa gcttcttccc tggagtctgg agtcccatcc 180ggcaaggccc ctaagttcct gatctataaa gcttcttccc tggagtctgg agtcccatcc 180
aggttctccg gctctggatc cggaaccgag tttaccctga caatcagctc tctgcagccc 240aggttctccg gctctggatc cggaaccgag tttaccctga caatcagctc tctgcagccc 240
gacgattttg ccacatacta ttgtcagcag tataacgggt ttagttggac cttcgggcag 300gacgattttg ccacatacta ttgtcagcag tataacgggt ttagttggac cttcgggcag 300
ggcacaaaag tggagatcaa a 321ggcacaaaag tggagatcaa a 321
<210> 53<210> 53
<211> 120<211> 120
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 53<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 151 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser TyrSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45 35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser ValSer Ala Ile Ser Gly Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr CysLeu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95 85 90 95
Ala Lys Glu Glu Trp Glu Leu Arg Gly Pro Phe Arg Tyr Trp Gly GlnAla Lys Glu Glu Trp Glu Leu Arg Gly Pro Phe Arg Tyr Trp Gly Gln
100 105 110 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 115 120
<210> 54<210> 54
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 54<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val GlyAsp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 151 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser TrpAsp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu IleLeu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
35 40 45 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser GlyTyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln ProSer Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 8065 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gly Phe Ser TrpAsp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gly Phe Ser Trp
85 90 95 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysThr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 100 105
<210> 55<210> 55
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 55<400> 55
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr AlaGly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 51 5
<210> 56<210> 56
<211> 8<211> 8
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 56<400> 56
Ile Ser Gly Gly Gly Asp Tyr ThrIle Ser Gly Gly Gly Asp Tyr Thr
1 51 5
<210> 57<210> 57
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 57<400> 57
Cys Ala Lys Glu Glu Trp Glu Leu Arg Gly Pro Phe Arg Tyr TrpCys Ala Lys Glu Glu Trp Glu Leu Arg Gly Pro Phe Arg Tyr Trp
1 5 10 151 5 10 15
<210> 58<210> 58
<211> 6<211> 6
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 58<400> 58
Gln Ser Ile Ser Ser TrpGln Ser Ile Ser Ser Trp
1 51 5
<210> 59<210> 59
<211> 3<211> 3
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 59<400> 59
Lys Ala SerLys Ala Ser
11
<210> 60<210> 60
<211> 11<211> 11
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 60<400> 60
Cys Gln Gln Tyr Asn Gly Phe Ser Trp Thr PheCys Gln Gln Tyr Asn Gly Phe Ser Trp Thr Phe
1 5 101 5 10
<210> 61<210> 61
<211> 330<211> 330
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 61<400> 61
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser LysAla Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 151 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp TyrSer Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr SerPhe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr SerGly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln ThrLeu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 8065 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp LysTyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95 85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro CysArg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro ProPro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr CysLys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn TrpVal Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg GluTyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175 165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val LeuGlu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190 180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser AsnHis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys GlyLys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220 210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu GluGln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe TyrMet Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255 245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu AsnPro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe PheAsn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly AsnLeu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr ThrVal Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly LysGln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330 325 330
<210> 62<210> 62
<211> 107<211> 107
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 62<400> 62
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp GluArg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 151 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn PheGln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30 20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu GlnTyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45 35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp SerSer Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60 50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr GluThr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 8065 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser SerLys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu CysPro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105 100 105
<210> 63<210> 63
<211> 894<211> 894
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 63<400> 63
Met Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp CysMet Ala Trp Arg Cys Pro Arg Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys
1 5 10 151 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln AlaLeu Ala Leu Cys Gly Trp Ala Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala
20 25 30 20 25 30
Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala ArgGlu Glu Ser Pro Phe Val Gly Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg
35 40 45 35 40 45
Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu ProGly Leu Thr Gly Thr Leu Arg Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro
50 55 60 50 55 60
Pro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala AspPro Glu Val His Trp Leu Arg Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp
65 70 75 8065 70 75 80
Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp TrpSer Thr Gln Thr Gln Val Pro Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp
85 90 95 85 90 95
Ile Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp ThrIle Val Val Ser Gln Leu Arg Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr
100 105 110 100 105 110
Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val SerGly Gln Tyr Gln Cys Leu Val Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser
115 120 125 115 120 125
Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu GluGln Pro Gly Tyr Val Gly Leu Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu
130 135 140 130 135 140
Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser CysPro Glu Asp Arg Thr Val Ala Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys
145 150 155 160145 150 155 160
Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln AspGln Ala Gln Gly Pro Pro Glu Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp
165 170 175 165 170 175
Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser LeuAla Val Pro Leu Ala Thr Ala Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu
180 185 190 180 185 190
His Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala HisHis Val Pro Gly Leu Asn Lys Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His
195 200 205 195 200 205
Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val LeuAsn Ala Lys Gly Val Thr Thr Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu
210 215 220 210 215 220
Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr GluPro Gln Gln Pro Arg Asn Leu His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu
225 230 235 240225 230 235 240
Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu ThrLeu Glu Val Ala Trp Thr Pro Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr
245 250 255 245 250 255
His Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile GlnHis Cys Thr Leu Gln Ala Val Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Ile Gln
260 265 270 260 265 270
Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala SerAla Gly Glu Pro Asp Pro Pro Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser
275 280 285 275 280 285
Val Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr ProVal Pro Pro His Gln Leu Arg Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro
290 295 300 290 295 300
Tyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser TrpTyr His Ile Arg Val Ala Cys Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp
305 310 315 320305 310 315 320
Thr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly ProThr His Trp Leu Pro Val Glu Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro
325 330 335 325 330 335
Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val HisPro Glu Asn Ile Ser Ala Thr Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His
340 345 350 340 345 350
Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr ArgTrp Gln Glu Pro Arg Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg
355 360 365 355 360 365
Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile GlyLeu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly
370 375 380 370 375 380
Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val SerLeu Arg Gln Glu Val Thr Leu Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser
385 390 395 400385 390 395 400
Asn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly ProAsn Leu Thr Val Cys Val Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro
405 410 415 405 410 415
Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala GlnTrp Ser Leu Pro Val Pro Leu Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln
420 425 430 420 425 430
Pro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser TrpPro Val His Gln Leu Val Lys Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp
435 440 445 435 440 445
Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys ValPro Trp Trp Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val
450 455 460 450 455 460
Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr ArgLeu Ile Leu Ala Leu Phe Leu Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg
465 470 475 480465 470 475 480
Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val ValTyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val
485 490 495 485 490 495
Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala ThrArg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr
500 505 510 500 505 510
Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg AspLeu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp
515 520 525 515 520 525
Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly GluVal Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu
530 535 540 530 535 540
Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp SerGly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser
545 550 555 560545 550 555 560
Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr ArgIle Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg
565 570 575 565 570 575
Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu PheSer Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe
580 585 590 580 585 590
Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly SerAsp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser
595 600 605 595 600 605
Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met LysGlu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys
610 615 620 610 615 620
His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp GlnHis Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln
625 630 635 640625 630 635 640
Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp IlePro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile
645 650 655 645 650 655
Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg AspAla Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp
660 665 670 660 665 670
Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys ValLeu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val
675 680 685 675 680 685
Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr ArgAla Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg
690 695 700 690 695 700
Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu SerGln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser
705 710 715 720705 710 715 720
Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe GlyLeu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly
725 730 735 725 730 735
Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro GlyVal Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly
740 745 750 740 745 750
Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg LeuVal Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu
755 760 765 755 760 765
Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser ArgLys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg
770 775 780 770 775 780
Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu ArgCys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg
785 790 795 800785 790 795 800
Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu ProGlu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro
805 810 815 805 810 815
Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro GluAsp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu
820 825 830 820 825 830
Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp ProPro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro
835 840 845 835 840 845
Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala GlyLys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly
850 855 860 850 855 860
Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro AlaArg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala
865 870 875 880865 870 875 880
Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly AlaAsp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala
885 890 885 890
<210> 64<210> 64
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 64<400> 64
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 151 5 10 15
<210> 65<210> 65
<211> 15<211> 15
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
пептид"peptide"
<400> 65<400> 65
Cys Ala Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr TrpCys Ala Ser Arg Glu Tyr Ser Ser Arg Trp His Phe Asp Tyr Trp
1 5 10 151 5 10 15
<210> 66<210> 66
<211> 37<211> 37
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 66<400> 66
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp ThrAsn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1 5 10 151 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala AspSer Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30 20 25 30
Thr Ala Val Tyr TyrThr Ala Val Tyr Tyr
3535
<210> 67<210> 67
<211> 37<211> 37
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<221> источник<221> source
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический<223> /note="Description of the synthetic sequence: Synthetic
полипептид"polypeptide"
<400> 67<400> 67
Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp ThrAsn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1 5 10 151 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala GlySer Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Gly
20 25 30 20 25 30
Thr Ala Val Tyr TyrThr Ala Val Tyr Tyr
3535
<---<---
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/982,852 | 2020-02-28 |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2837590C1true RU2837590C1 (en) | 2025-04-02 |
| RU2837590C9 RU2837590C9 (en) | 2025-05-27 |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2506276C2 (en)* | 2007-11-12 | 2014-02-10 | УЗ ФАРМА ГмбХ | Anti-axl antibodies |
| WO2017009258A1 (en)* | 2015-07-10 | 2017-01-19 | Genmab A/S | Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment |
| US9624308B2 (en)* | 2012-11-05 | 2017-04-18 | Pierre Fabre Medicament | Antigen binding proteins |
| WO2017220695A1 (en)* | 2016-06-22 | 2017-12-28 | Bergen Teknologioverføring As | Anti-axl antagonistic antibodies |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2506276C2 (en)* | 2007-11-12 | 2014-02-10 | УЗ ФАРМА ГмбХ | Anti-axl antibodies |
| US9624308B2 (en)* | 2012-11-05 | 2017-04-18 | Pierre Fabre Medicament | Antigen binding proteins |
| WO2017009258A1 (en)* | 2015-07-10 | 2017-01-19 | Genmab A/S | Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment |
| WO2017220695A1 (en)* | 2016-06-22 | 2017-12-28 | Bergen Teknologioverføring As | Anti-axl antagonistic antibodies |
| Title |
|---|
| X YE et al. An anti-Axl monoclonal antibody attenuates xenograft tumor growth and enhances the effect of multiple anticancer therapies, Oncogene, 2010, v.29, pp.5254-5264.* |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6875385B2 (en) | Anti-PD-1 antibody and composition | |
| TWI752950B (en) | Anti-tim-3 antibodies and compositions | |
| TWI859319B (en) | Anti-cd73 antibodies and compositions | |
| JP2020500006A (en) | Anti-LAG-3 antibodies and compositions | |
| US12252539B2 (en) | Anti-FLT3 antibodies and compositions | |
| US12012450B2 (en) | Anti-NKG2A antibodies and compositions | |
| US11807688B2 (en) | Anti-AXL antibodies and compositions | |
| RU2837590C9 (en) | Anti-axl antibodies and compositions | |
| RU2837590C1 (en) | Anti-axl antibodies and compositions | |
| US20210214454A1 (en) | Anti-cd40 antibodies and compositions | |
| RU2836004C1 (en) | Antibodies and compositions against flt3 | |
| HK40081002A (en) | Anti-axl antibodies and compositions |