RU2792146C2 - Dexamethasone conjugate with synthetic statistical polypeptide - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to the field of chemistry of high-molecular compounds, pharmaceuticals and medicine, namely, dexamethasone conjugates with synthetic amphiphilic polypeptides and polymer particles based on them, which are promising for the creation of new anti-inflammatory drugs for the treatment of eye diseases, in particular, macular edema and uveitis. The conjugate is dexamethasone covalently bound via a linker with a synthetic statistical polypeptide, and forms polymer particles in an aqueous medium. In one of the variants of the invention, the conjugate is modified with polysaccharides.

EFFECT: conjugation of dexamethasone with synthetic polypeptides promotes its prolonged controlled release in the vitreal fluid of the eye.

1 cl, 12 dwg, 2 tbl, 2 ex

Description

Translated fromRussian

Область, к которой относится изобретениеThe field to which the invention relates

Заявляемое изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, фармацевтики и медицины, а именно, к конъюгатам дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами и полимерным частицам на их основе, которые обеспечивают контролируемое пролонгированное высвобождение дексаметазона в витреальной жидкости глаза, а также способам их получения.The claimed invention relates to the field of chemistry of macromolecular compounds, pharmaceuticals and medicine, namely, to dexamethasone conjugates with synthetic amphiphilic polypeptides and polymer particles based on them, which provide a controlled prolonged release of dexamethasone in the vitreal fluid of the eye, as well as methods for their preparation.

Предшествующий уровень техники.prior art.

Дексаметазон представляет собой синтетический глюкокортикостероид, оказывающий противовоспалительное и иммунодепрессивное действие. Он широко используется для лечения широкого спектра глазных заболеваний, включая заболевания переднего отрезка (кератит, блефарит, аллергический конъюнктивит, передний увеит и сухость глаз), так воспаления заднего отрезка глаза (промежуточный увеит, хориоидит, панувеит и макулярный отек), а также применяется для уменьшения воспаления после различных офтальмологических операций [1].Dexamethasone is a synthetic glucocorticosteroid with anti-inflammatory and immunosuppressive effects. It is widely used to treat a wide range of ocular conditions, including anterior segment diseases (keratitis, blepharitis, allergic conjunctivitis, anterior uveitis, and dry eye), posterior segment inflammation (intermediate uveitis, choroiditis, panuveitis, and macular edema), and is also used to treat reducing inflammation after various ophthalmic surgeries [1].

Существует ряд лекарственных форм дексаметазона для лечения глаз, включая глазные капли, мази, пероральные таблетки, внутриглазные инъекции и интравитреальные имплантаты.There are a number of dosage forms of dexamethasone for eye treatment, including eye drops, ointments, oral tablets, intraocular injections, and intravitreal implants.

Эффективное лечение дексаметазоном требует поддержания терапевтической концентрации в необходимой области.Effective treatment with dexamethasone requires maintaining the therapeutic concentration in the required area.

При местном применении препаратов (например, глазные капли), лекарственное вещество может достичь переднего отрезка глаза, однако, оно быстро удаляется из глаза, а его биодоступность очень низка - менее 3% введенной дозы достигает внутриглазной жидкости [2], что обусловлено низкой проницаемостью препарата через эпителий роговицы [3]. Кроме того, короткий период полу выведения дексаметазона (около 3-6 часов) [4] затрудняет поддержание эффективной концентрации и требует частого введения препарата. Ожидается, что только 0.001% лекарственной дозы вещества, используемого в виде глазных каплей, достигнет заднего сегмента глаза [1].With local application of drugs (for example, eye drops), the drug can reach the anterior segment of the eye, however, it is quickly removed from the eye, and its bioavailability is very low - less than 3% of the administered dose reaches the intraocular fluid [2], due to the low permeability of the drug through the corneal epithelium [3]. In addition, the short half-life of dexamethasone (about 3-6 hours) [4] makes it difficult to maintain an effective concentration and requires frequent administration of the drug. It is expected that only 0.001% of the drug dose of the substance used in the form of eye drops will reach the posterior segment of the eye [1].

Для лечения заднего сегмента глаза могут быть использованы пероральное или внутривенное введение дексаметазона, но биодоступность препарата низка (1-2%) вследствие наличия гематоофтальмического и гематоретинального барьеров. Использование таких форм требует применения высоких доз, что приводит к серьезным системным побочным эффектам, связанных с накоплением лекарственного вещества в других органах [5].For the treatment of the posterior segment of the eye, oral or intravenous administration of dexamethasone can be used, but the bioavailability of the drug is low (1-2%) due to the presence of the blood-ophthalmic and blood-retinal barriers. The use of such forms requires the use of high doses, which leads to serious systemic side effects associated with the accumulation of the drug in other organs [5].

Интравитреальные инъекции эффективны для лечения заднего сегмента глаза, однако, вследствие короткого периода его полужизни в стекловидном теле, инъекции необходимо повторять часто для поддержания терапевтического уровня лекарственного средства. В свою очередь, необходимость многочисленных инъекций в глаз оказывается травмирующим фактором для пациента [1].Intravitreal injections are effective for treating the posterior segment of the eye, however, due to its short half-life in the vitreous body, injections must be repeated frequently to maintain therapeutic drug levels. In turn, the need for multiple injections into the eye is a traumatic factor for the patient [1].

Использование систем доставки лекарственных веществ дает множество преимуществ, таких как повышение растворимости и биодоступности, увеличение концентрации в целевом органе [6], повышение стабильности к химический или ферментативной деградации, увеличение эффективности вещества и снижение побочных эффектов и системной токсичности [7, 8]. Кроме того, за счет контролируемого высвобождения лекарства системы доставки позволяют обеспечить поддержание желаемой концентрации для достижения необходимого терапевтического эффекта.The use of drug delivery systems provides many advantages, such as increased solubility and bioavailability, increased concentration in the target organ [6], increased stability to chemical or enzymatic degradation, increased drug efficacy, and reduced side effects and systemic toxicity [7, 8]. In addition, due to the controlled release of drugs, delivery systems can ensure that the desired concentration is maintained to achieve the desired therapeutic effect.

Интравитреальные имплантаты Ozurdex® для доставки десаметазона, состоящие из биодеградируемого сополимера молочной и гликолевой кислот (50:50), эффективны, но их применение ограничивается высокой стоимостью, а также включают ряд потенциальных побочных эффектов, таких как повышенное внутриглазное давление, кератит и катарактогенез [9, 10].Ozurdex® intravitreal implants for desamethasone delivery, consisting of a biodegradable copolymer of lactic and glycolic acids (50:50), are effective, but their use is limited by high cost, and also include a number of potential side effects, such as increased intraocular pressure, keratitis and cataractogenesis [9 , 10].

Неотъемлемое преимущество использования нано- и микрочастиц по сравнению с имплантатами является меньший размер иглы, необходимой для интравитреального введения частиц, что снизит травматичность операции. Ozurdex® требует использования аппликаторного устройства с диаметром иглы 0.7 мм, что значительно больше, чем требуется для инъекций растворов. Кроме того, при использовании частиц можно вводить точное количество дексаметазона, необходимое каждому пациенту, регулируя концентрацию вводимых частиц.An inherent advantage of using nano- and microparticles compared to implants is the smaller size of the needle required for intravitreal injection of particles, which will reduce the invasiveness of the operation. Ozurdex® requires the use of an applicator device with a needle diameter of 0.7 mm, which is significantly larger than that required for solution injections. In addition, when using particles, it is possible to administer the exact amount of dexamethasone needed by each patient by adjusting the concentration of particles administered.

В заявке RU 2660585 C2 описан липосомальный дексаметазон для лечения офтальмологических заболеваний и способ его получения. Он состоит из смеси липидной массы, включающей фосфолипид или смесь фосфолипидов (с холестерином или без него) и раствора дексаметазона натрия фосфата или дексаметазона. В известном изобретении фармацевтическая композиция по данному изобретению содержит от около 50% до около 90% дексаметазона натрия фосфата, не ассоциированного с липидами [11]. Не ассоциированный с липидами дексаметазона натрия фосфат хорошо растворим в водных средах и легко выводится из жидкой части стекловидного тела (время полужизни - около 3,5 ч). Таким образом, 50-90% вводимой дозы дексаметазона сразу попадет в глазную жидкость.RU 2660585 C2 describes a liposomal dexamethasone for the treatment of ophthalmic diseases and a method for its preparation. It consists of a lipid mass mixture comprising a phospholipid or a mixture of phospholipids (with or without cholesterol) and a solution of dexamethasone sodium phosphate or dexamethasone. In a known invention, the pharmaceutical composition according to this invention contains from about 50% to about 90% dexamethasone sodium phosphate, not associated with lipids [11]. Dexamethasone sodium phosphate, which is not associated with lipids, is highly soluble in aqueous media and is easily excreted from the liquid part of the vitreous body (half-life is about 3.5 hours). Thus, 50-90% of the administered dose of dexamethasone will immediately enter the ocular fluid.

Из уровня техники известны способы получения также других систем доставки дексаметазона для лечения офтальмологических заболеваний, содержащих инкапсулированный дексаметазон [12, 13]. Авторы предлагают использовать разработанные системы доставки для местного применения. Вследствие того, что лекарственное вещество инкапсулировано в частицу за счет физических взаимодействий, профиль высвобождения дексаметазона в таких системах характеризуется быстрым начальным высвобождением вещества («burst release»). В приведенных работах доля высвободившегося дексаметазона за 6 часов составила более 40%, что не позволит обеспечить поддержание необходимой контролируемой терапевтической концентрации в течение продолжительного времени.In the prior art, methods are also known for obtaining other dexamethasone delivery systems for the treatment of ophthalmic diseases containing encapsulated dexamethasone [12, 13]. The authors propose to use the developed delivery systems for local use. Due to the fact that the drug substance is encapsulated in the particle due to physical interactions, the release profile of dexamethasone in such systems is characterized by a rapid initial release of the substance ("burst release"). In the above works, the proportion of released dexamethasone in 6 hours was more than 40%, which will not allow maintaining the required controlled therapeutic concentration for a long time.

Для контролирования скорости высвобождения дексаметазона используют подход, основанный на ковалентном связывании дексаметазона с полимером [14, 15]. В работе [16] описан конъюгат дексаметазона с полипептидом, который является наиболее близким к заявленному изобретению и принят в качестве прототипа. Конъюгат полипептид-дексаметазон состоит из проникающего в клетку пептида и дексаметазона, связанных энзим-чувствительным пептидным линкером. В свою очередь, дексаметазон связан с энзим-чувствительным линкером гидразоновой связью. Высвобождение лекарственного вещества происходило в виде дексаметазона, связанного с аргинином, однако, скорость данного процесса не изучена. Кроме того, синтез самого пептида является дорогостоящим и достаточно трудоемким.To control the release rate of dexamethasone, an approach based on the covalent binding of dexamethasone to a polymer is used [14, 15]. In [16] describes the conjugate of dexamethasone with a polypeptide, which is the closest to the claimed invention and is taken as a prototype. The polypeptide-dexamethasone conjugate consists of a cell-penetrating peptide and dexamethasone linked by an enzyme-sensitive peptide linker. In turn, dexamethasone is linked to an enzyme-sensitive linker by a hydrazone bond. The release of the drug occurred in the form of dexamethasone bound to arginine, however, the rate of this process has not been studied. In addition, the synthesis of the peptide itself is expensive and rather laborious.

Разработка эффективной системы доставки дексаметазона остается актуальной задачей. Такая система доставки дексаметазона должна быть биосовместимой и биодеградируемой, способствовать увеличению времени жизни лекарственного вещества за счет контролируемого высвобождения лекарственного вещества с поддержанием необходимой концентрации в течение продолжительного периода времени.The development of an effective dexamethasone delivery system remains an urgent task. Such a dexamethasone delivery system should be biocompatible and biodegradable, help increase the lifetime of the drug substance due to the controlled release of the drug substance while maintaining the required concentration for a long period of time.

Заявляемое изобретение описывает конъюгат дексаметазона с амфифильным полипетидом, обеспечивающим контролируемый профиль высвобождения дексаметазона по сравнению с уже известными системами доставки дексаметазона. Контролируемое высвобождение лекарственное вещества достигается за счет его ковалентного связывания с полипептидом. Полипептиды, используемые в качестве системы доставки дексаметазона согласно изобретению, являются нетоксичными и деградируют до аминокислот в ферментативных условиях. В заявляемом изобретении было показано, что конъюгирование дексаметазона с полипептидом позволяет обеспечить контролируемое постепенное высвобождение дексаметазона в витреальной жидкости глаза.The claimed invention describes a conjugate of dexamethasone with an amphiphilic polypeptide that provides a controlled release profile of dexamethasone compared to already known dexamethasone delivery systems. Controlled release of the drug is achieved by its covalent binding to the polypeptide. The polypeptides used as the dexamethasone delivery system of the invention are non-toxic and degrade to amino acids under enzymatic conditions. In the claimed invention, it was shown that conjugation of dexamethasone with a polypeptide allows for a controlled gradual release of dexamethasone in the vitreal fluid of the eye.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технической задачей заявляемого изобретения является получение нетоксичных и способных к биодеградации конъюгатов лекарственного вещества дексаметазона, а также наноразмерных систем доставки противовоспалительного вещества дексаметазона на их основе, способствующих контролируемому продолжительному высвобождению дексаметазона в витреальной жидкости глаза и повышению эффективности его действия при интравитреальном введении.The technical objective of the claimed invention is to obtain non-toxic and biodegradable conjugates of the drug substance dexamethasone, as well as nanoscale delivery systems for the anti-inflammatory substance dexamethasone based on them, which contribute to the controlled prolonged release of dexamethasone in the vitreal fluid of the eye and increase the effectiveness of its action with intravitreal administration.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в создании новых конъюгатов дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами, образующих в водной среде полимерные наночастицы, которые способны обеспечить пролонгируемое действие дексаметазона за счет контролируемого высвобождения лекарственного вещества в витреальной жидкости с поддержанием необходимой концентрации в течение продолжительного периода времени.The technical result of the claimed invention consists in the creation of new conjugates of dexamethasone with synthetic amphiphilic polypeptides, which form polymeric nanoparticles in an aqueous medium, which are capable of providing a prolonged action of dexamethasone due to the controlled release of the drug substance in the vitreal fluid while maintaining the required concentration for a long period of time.

Указанный технический результат достигается тем, что в конъюгате дексаметазона с амфифильным синтетическим статистическим полипептидом со среднечисловой молекулярной массой от 5000 до 50000 в соответствии с заявленным изобретением синтетический амфифильный полипептид имеет общую формулу поли(X_n-co-Y_m), гдеThis technical result is achieved by the fact that in the conjugate of dexamethasone with an amphiphilic synthetic random polypeptide with a number average molecular weight of 5000 to 50000 in accordance with the claimed invention, the synthetic amphiphilic polypeptide has the general formula poly(X_n -co -Y_m ), where

X - заряженная полярная аминокислота,X is a charged polar amino acid,

Y - гидрофобная аминокислота,Y - hydrophobic amino acid,

n - число повторяющихся звеньев X,n is the number of repeating links X,

m - число повторяющихся звеньев Y,m - the number of repeating links Y,

дексаметазон связан с полипептидом через линкер, с массовой долей конъюгированного дексаметазона 0.5-30%, и конъюгат образует в водной среде полимерные частицы.dexamethasone is bound to the polypeptide through a linker, with a mass fraction of conjugated dexamethasone of 0.5-30%, and the conjugate forms polymer particles in an aqueous medium.

Кроме того, указанный технический результат достигается тем, что в конъюгате дексаметазона с синтетическим амфифильным полипептидом в качестве заряженной полярной аминокислоты X использована L-глутаминовая кислота, в качестве гидрофобной аминокислоты Y использован L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин, и мольное соотношение [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин] в полипептиде составляет 0.8-6.In addition, this technical result is achieved by the fact that in the conjugate of dexamethasone with a synthetic amphiphilic polypeptide, L-glutamic acid is used as a charged polar amino acid X, L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine is used as a hydrophobic amino acid Y, and the molar ratio [L-glutamic acid]/[L/DL/D-phenylalanine] in the polypeptide is 0.8-6.

Помимо этого, указанный технический результат достигается тем, что в конъюгате дексаметазона с синтетическим амфифильным полипептидом в качестве заряженной полярной аминокислоты X использован L-лизин, в качестве гидрофобной аминокислоты Y использован L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин, и мольное соотношение [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] в полипептиде составляет 0.7-10.In addition, the specified technical result is achieved by the fact that in the conjugate of dexamethasone with a synthetic amphiphilic polypeptide, L-lysine is used as a charged polar amino acid X, L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine is used as a hydrophobic amino acid Y, and the molar ratio [ L-lysine]/[L/DL/D-phenylalanine] in the polypeptide is 0.7-10.

Вместе с тем, указанный технический результат достигается тем, что конъюгат дексаметазона с синтетическим амфифильным полипептидом, в котором в качестве заряженной полярной аминокислоты X использован L-лизин, в качестве гидрофобной аминокислоты Y использован L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин, образующий в водной среде полимерные частицы, связан с полисахаридом, выбранном из группы гепарин, каррагинан и хондроитинсульфат, за счет электростатических взаимодействий между аминогруппами конъюгата и карбоксильными и сульфогруппами полисахарида, с массовым соотношением полисахарида к конъюгату, равным 1-2.At the same time, this technical result is achieved by the fact that the conjugate of dexamethasone with a synthetic amphiphilic polypeptide, in which L-lysine is used as a charged polar amino acid X, L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine is used as a hydrophobic amino acid Y, forming in an aqueous medium, polymer particles are associated with a polysaccharide selected from the group of heparin, carrageenan and chondroitin sulfate, due to electrostatic interactions between the amino groups of the conjugate and carboxyl and sulfo groups of the polysaccharide, with a mass ratio of polysaccharide to conjugate equal to 1-2.

Заявленное изобретение поясняется Фиг. 1 - Фиг. 12, на которых представлены:The claimed invention is illustrated in Fig. 1 - Fig. 12, which show:

Фиг. 1: Структура полипептидов поли((L-лизин)_n-со-(L-фенилалинин)_m) (А) и поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L-фенилалинин)_m) (В).Fig. 1: Polypeptide structure of poly((L-lysine)_n -co-(L-phenylalinine)_m ) (A) and poly((L-glutamic acid)_n -co-(L-phenylalinine)_m ) (B).

Фиг. 2: Структура полипептидов поли((L-лизин)_n-со-(DL-фенилалинин)_m) (А) и поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(D-фенилалинин)_m) (В).Fig. 2: Polypeptide structure of poly((L-lysine)_n -co-(DL-phenylalinine)_m ) (A) and poly((L-glutamic acid)_n -co-(D-phenylalinine)_m ) (B).

Фиг. 3: Структура конъюгата дексаметазона с полипептидом поли((L-лизин)_n-со-(DL-фенилалинин)_m).Fig. 3: Structure of the poly((L-lysine)_n -co-(DL-phenylalinine)_m polypeptide conjugate of dexamethasone.

Фиг. 4: Структура конъюгата дексаметазона с полипептидом поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(D-фенилалинин)_m).Fig. 4: Structure of the poly((L-glutamic acid)_n -co-(D-phenylalinine)_m polypeptide conjugate of dexamethasone.

Фиг. 5: Структура полимерной частицы на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин).Fig. 5: Structure of a polymer particle based on a dexamethasone conjugate with polypeptide poly(L-lysine-co-L/DL/D-phenylalanine).

Фиг. 6: Структура полимерной частицы на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-глутаминовая кислота-со-L/DL/D-фенилаланин).Fig. 6: Structure of a polymer particle based on a dexamethasone conjugate with a poly(L-glutamic acid-co-L/DL/D-phenylalanine) polypeptide.

Фиг. 7: Структура полимерной частицы на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин), поверхность которой покрыта гепарином.Fig. 7: Structure of a polymer particle based on a dexamethasone-polypeptide conjugate poly(L-lysine-co-L/DL/D-phenylalanine), the surface of which is coated with heparin.

Фиг. 8: Зависимость гидродинамического размера частиц на основе статистических сополимеров поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин) от времени инкубирования в среде, содержащей папаин (с_{папаина}=0.5 мг/мл).Fig. 8: Dependence of the hydrodynamic particle size based on random copolymers of poly(L-lysine-co-L/DL/D-phenylalanine) on the time of incubation in a medium containing papain (c_papain =0.5 mg/ml).

Фиг. 9: Высвобождение дексаметазона из частиц на основе конъюгатов дексаметазона с полипептидами поли(L-лизин-со-L/DL-фенилаланин) различного состава в 0.01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН 7.4), содержащем 0.9% NaCl.Fig. Figure 9: Dexamethasone release from particles based on dexamethasone conjugates with poly(L-lysine-co-L/DL-phenylalanine) polypeptides of various compositions in 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.9% NaCl.

Фиг. 10: Высвобождение дексаметазона из частиц на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-DL-фенилаланин), и этих частиц, поверхность которых покрыта гепарином, в 0.01 М натрий-фосфатном буферном растворе (рН 7.4), содержащем 0.9% NaCl.Fig. 10: Release of dexamethasone from particles based on dexamethasone conjugate with polypeptide poly(L-lysine-co-DL-phenylalanine) and these particles, the surface of which is coated with heparin, in 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.9% NaCl.

Фиг. 11: Высвобождение дексаметазона из частиц на основе конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-со-DL-фенилаланин) в смеси витреальная жидкость: 0.01 М натрий-фосфатный буферный раствор (рН 7.4), содержащий 0.9% NaCl (50:50 об.%).Fig. Figure 11: Release of dexamethasone from particles based on dexamethasone conjugate with polypeptide poly(L-lysine-co-DL-phenylalanine) in a mixture of vitreous liquid: 0.01 M sodium phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.9% NaCl (50:50 vol .%).

Фиг. 12: Часть¹Н ЯМР спектра конъюгата дексаметазона с полипептидом поли(L-лизин-co-DL-фенилаланин), используемая для расчета степени конъюгирования.Fig. 12: Part of the¹ H NMR spectrum of the poly(L-lysine-co-DL-phenylalanine) polypeptide conjugate of dexamethasone used to calculate the degree of conjugation.

Описание изобретенияDescription of the invention

ОпределенияDefinitions

Неприродные аминокислоты - некодируемые генетическим кодом аминокислоты.Non-natural amino acids are amino acids that are not encoded by the genetic code.

Полипептиды - молекулы, образованные последовательностью аминокислот, соединенных пептидной связью.Polypeptides are molecules formed by a sequence of amino acids connected by a peptide bond.

Амфифильные полимеры - полимеры, имеющие в своей структуре как гидрофильные, так и гидрофобные фрагменты (мономеры, звенья, радикалы).Amphiphilic polymers are polymers that have both hydrophilic and hydrophobic fragments (monomers, units, radicals) in their structure.

Конъюгат - синтезированная молекула, в которой ковалентно связаны разные по свойствам вещества.A conjugate is a synthesized molecule in which substances of different properties are covalently bound.

Получение амфифильных полипептидов.Preparation of amphiphilic polypeptides.

Для получения конъюгатов дексаметазона на первом этапе получали амфифильные сополимеры общей формулы поли(X_n-со-Y_m), гдеTo obtain dexamethasone conjugates, at the first stage, amphiphilic copolymers of the general formula poly(X_n -co-Y_m ) were obtained, where

X - заряженная полярная аминокислота, выбранная из группы L-лизин и L-глутаминовая кислота;X is a charged polar amino acid selected from the group L-lysine and L-glutamic acid;

Y - гидрофобная аминокислота, выбранная из группы L-фенилаланин, DL-фенилаланин или D-фенилаланин,Y is a hydrophobic amino acid selected from the group L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine,

n - число повторяющихся звеньев X,n is the number of repeating links X,

m - число повторяющихся звеньев Y.m - the number of repeating links Y.

Так, были получены полипептиды, структура которых может быть отображена как поли((L-лизин)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m) (поли(L-лизин-со-L/DL/D-фенилаланин), P(L-Lys-co-L/DL/D-Phe)), с мольным соотношением [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] = 0.7-10, где n - число повторяющихся звеньев L-лизина и m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина.So, polypeptides were obtained, the structure of which can be displayed as poly((L-lysine)_n -co-(L/DL/D-phenylalanine)_m ) (poly(L-lysine-co-L/DL/D-phenylalanine ), P(L-Lys-co-L/DL/D-Phe)), with a molar ratio of [L-lysine]/[L/DL/D-phenylalanine] = 0.7-10, where n is the number of repeating units L -lysine and m is the number of repeating units of L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine.

Кроме того, были получены полипептиды, структура которых может быть отображена как поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин_m) (поли((L-глутаминовая кислота)-со-L/DL/D-фенилаланин), P(L-Glu-co-L/DL/D-Phe), с мольным соотношением [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин], равным 0.8-6, где n - число повторяющихся звеньев L-глутаминовой кислоты и m - число повторяющихся звеньев L/DL/D-фенилаланина.In addition, polypeptides have been obtained whose structure can be displayed as poly((L-glutamic acid)_n -co-(L/DL/D-phenylalanine_m ) (poly((L-glutamic acid)-co-L/DL /D-phenylalanine), P(L-Glu-co-L/DL/D-Phe), with a molar ratio of [L-glutamic acid]/[L/DL/D-phenylalanine] equal to 0.8-6, where n is the number of repeating units of L-glutamic acid; and m is the number of repeating units of L/DL/D-phenylalanine.

Гидрофильные и гидрофобные звенья (аминокислоты) амфифильных полипептидов связаны между собой пептидной связью. Среднечисловая молекулярная масса (M_n) полимеров составляет 5-50 кДа, при этом дисперсность D образцов не превышает значения 1.4.The hydrophilic and hydrophobic units (amino acids) of amphiphilic polypeptides are interconnected by a peptide bond. The number-average molecular weight (M_n ) of the polymers is 5–50 kDa, while the fineness D of the samples does not exceed 1.4.

Синтез полипептидов проводили методом полимеризации с раскрытием цикла N-карбоксиангидридов α-аминокислот, который обеспечивает возможность регулировать длину цепи полимеров и гидрофобность сополимера в процессе синтеза, а также позволяет получать узкодисперсные сополимеры. На первой стадии были синтезированы защищенные полимеры поли((ε-карбоксибензил-L-лизин)-со-L/DL/D-фенилаланин) и поли((γ-бензил-L-глутамат)-со-L/DL/D-фенилаланин). В качестве инициатора полимеризации использовали н-гексиламин, полимеризацию проводили при мольном соотношении [мономеры]/[инициатор], равном 10-100. На второй стадии гидрофобный полипептид гидролизовали при температуре 22°С в смеси трифторуксусной кислоты и трифторметансульфокислоты.Synthesis of polypeptides was carried out by ring-opening polymerization of α-amino acid N-carboxyanhydrides, which makes it possible to control the length of the polymer chain and the hydrophobicity of the copolymer during synthesis, and also makes it possible to obtain narrowly dispersed copolymers. At the first stage, protected polymers poly((ε-carboxybenzyl-L-lysine)-co-L/DL/D-phenylalanine) and poly((γ-benzyl-L-glutamate)-co-L/DL/D- phenylalanine). n-hexylamine was used as the polymerization initiator, the polymerization was carried out at a [monomers]/[initiator] molar ratio of 10-100. In the second step, the hydrophobic polypeptide was hydrolyzed at 22° C. in a mixture of trifluoroacetic acid and trifluoromethanesulfonic acid.

Синтезированные полипептиды могут содержать статистическую последовательность природных аминокислот, и их структура может быть отображена как поли((L-лизин)_n-со-(L-фенилаланин)_m) (Фиг. 1А) и поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L-фенилаланин)_m) (Фиг. 1В).Synthesized polypeptides may contain a random sequence of natural amino acids, and their structure can be displayed as poly((L-lysine)_n -co-(L-phenylalanine)_m ) (Fig. 1A) and poly((L-glutamic acid)_n - co-(L-phenylalanine)_m ) (Fig. 1B).

Полипептид, кроме природных α-аминокислот, может также содержать неприродную D-аминокислоту, которая может повысить устойчивость полипептида к ферментативному гидролизу, предпочтительно, DL-фенилаланин или D-фенилаланин. Структура таких полипептидов может быть отображена как поли(L-лизин)_n-со-(DL-фенилаланин)_m), (Фиг. 2А) и поли(L-лизин)_n-со-(D-фенилаланин)_m), а также поли(L-глутаминовая кислота)_n-со-(DL-фенилаланин)_m) и поли(L-глутаминовая кислота)_n-co-(D-фенилаланин)_m) (Фиг. 2В).The polypeptide, in addition to natural α-amino acids, may also contain a non-natural D-amino acid, which can increase the resistance of the polypeptide to enzymatic hydrolysis, preferably DL-phenylalanine or D-phenylalanine. The structure of such polypeptides can be displayed as poly(L-lysine)_n -co-(DL-phenylalanine)_m ), (Fig. 2A) and poly(L-lysine)_n -co-(D-phenylalanine)_m ), and also poly(L-glutamic acid)_n -co-(DL-phenylalanine)_m ) and poly(L-glutamic acid)_n -co-(D-phenylalanine)_m ) (Fig. 2B).

Получение конъюгатов дексаметазона с полипептидами.Obtaining conjugates of dexamethasone with polypeptides.

Ковалентное присоединение дексаметазона к полипептидам общей формулы поли((L-лизин)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), содержащих первичные аминогруппы в своей структуре, проводили методом активированнных эфиров. Для этого получали активированный эфир дексаметазона гемисукцината реакцией дексаметазона гемисукцината с N-гидроксисукцинимидом и карбодиимидом, который затем вводили в реакцию с полимером, после чего полученный конъюгат очищали диализом. Степень модификации полимера дексаметазоном возрастала при увеличении доли L-лизина в полимере, что связано с увеличением количества доступных для связывания аминогрупп.Covalent attachment of dexamethasone to polypeptides of the general formula poly((L-lysine)_n -co-(L/DL/D-phenylalanine)_m ) containing primary amino groups in their structure was carried out by the activated ester method. To do this, an activated ester of dexamethasone hemisuccinate was obtained by reacting dexamethasone hemisuccinate with N-hydroxysuccinimide and carbodiimide, which was then reacted with a polymer, after which the resulting conjugate was purified by dialysis. The degree of polymer modification with dexamethasone increased with an increase in the proportion of L-lysine in the polymer, which is associated with an increase in the number of amino groups available for binding.

Конъюгат дексаметазона с синтетическим полипептидом, в соответствии с заявленным изобретением, представляет собой дексаметазон, ковалентно связанный с амфифильным полипептидом, имеющим общую формулу поли((L-лизин)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), с мольным соотношением [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] = 0.7-10, где n - число повторяющихся звеньев L-лизина и m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина, через линкер и соединенный с линкером сложноэфирной связью.The conjugate of dexamethasone with a synthetic polypeptide, in accordance with the claimed invention, is dexamethasone covalently linked to an amphiphilic polypeptide having the general formula poly((L-lysine)_n -co-(L/DL/D-phenylalanine)_m ), with a molar ratio [L-lysine]/[L/DL/D-phenylalanine] = 0.7-10, where n is the number of repeating units of L-lysine and m is the number of repeating units of L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine, via a linker and connected to the linker by an ester bond.

Структура полученных конъюгатов может быть отображена общей формулой поли((L-лизин)_n-k-со-Z_k-со-(L/DL/D)-фенилаланин)_m), где Z - L-лизин, ковалентно связанный с дексаметазоном через сукцинатный линкер, n-k - число повторяющихся звеньев L-лизина, k - число повторяющихся звеньев Z, m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина (Фиг. 3).The structure of the resulting conjugates can be displayed by the general formula poly((L-lysine)_nk -co-Z_k -co-(L/DL/D)-phenylalanine)_m ), where Z is L-lysine covalently linked to dexamethasone through the succinate linker, nk is the number of repeating units of L-lysine, k is the number of repeating units of Z, m is the number of repeating units of L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine (Fig. 3).

Ковалентное присоединение дексаметазона к полипептидам общей формулы поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), содержащих карбоксильные группы в своей структуре, проводили в три этапа. На первом этапе проводили активацию карбоксильных групп полимера с последующей реакцией активированного эфира с линкером, содержащим одну свободную аминогруппу и одну защищенную аминогруппу. В наиболее предпочтительных вариантах изобретения линкер представляет собой N-трет-бутилоксикарбонил-1,2-этилендиамин (N-Boc-этилендиамин). На втором этапе удаляли Boc-защитную группу, полимер очищали диализом и лиофильно высушивали. После этого, на последнем этапе, осуществляли ковалентное связывание образовавшегося полимера с дексаметазона гемисукцинатом методом активированных эфиров, после чего полученный конъюгат очищали диализом.Covalent attachment of dexamethasone to polypeptides of the general formula poly((L-glutamic acid)_n -co-(L/DL/D-phenylalanine)_m ) containing carboxyl groups in their structure was carried out in three stages. At the first stage, the polymer carboxyl groups were activated, followed by the reaction of the activated ester with a linker containing one free amino group and one protected amino group. In the most preferred embodiments of the invention, the linker is N-tert-butyloxycarbonyl-1,2-ethylenediamine (N-Boc-ethylenediamine). In the second step, the Boc-protecting group was removed, the polymer was purified by dialysis and freeze-dried. After that, at the last stage, the covalent binding of the resulting polymer with dexamethasone hemisuccinate was carried out by the method of activated esters, after which the resulting conjugate was purified by dialysis.

Конъюгат дексаметазона с синтетическим полипептидом, в соответствии с заявленным изобретением, представляет собой, кроме того, дексаметазон, ковалентно связанный с амфифильным полипептидом, имеющим общую формулу поли((L-глутаминовая кислота)_n-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), с мольным соотношением [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин] = 0.8-6, где n - число повторяющихся звеньев L-глутаминовой кислоты и m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина, через линкер и соединенный с линкером сложноэфирной связью.The conjugate of dexamethasone with a synthetic polypeptide, in accordance with the claimed invention, is, in addition, dexamethasone covalently linked to an amphiphilic polypeptide having the general formula poly((L-glutamic acid)_n -co-(L/DL/D-phenylalanine)_m ), with a molar ratio of [L-glutamic acid]/[L/DL/D-phenylalanine] = 0.8-6, where n is the number of repeating units of L-glutamic acid and m is the number of repeating units of L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine via a linker and ester-linked to the linker.

Структура полученных конъюгатов может быть отображена общей формулой поли((L-глутаминовая кислота)_n-k-со-Z_k-со-(L/DL/D-фенилаланин)_m), где Z - глутаминовая кислота, ковалентно связанная с дексаметазоном через линкер, n-k - число повторяющихся звеньев L-глутаминовой кислоты, k - число повторяющихся звеньев Z, m - число повторяющихся звеньев L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина (Фиг. 4).The structure of the resulting conjugates can be represented by the general formula poly((L-glutamic acid)_nk -co-Z_k -co-(L/DL/D-phenylalanine)_m ), where Z is glutamic acid covalently linked to dexamethasone via a linker, nk is the number of repeating units of L-glutamic acid, k is the number of repeating units of Z, m is the number of repeating units of L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine (Fig. 4).

Расчет количества связавшегося дексаметазона проводили по данным хроматографического анализа образца после его щелочного гидролиза. В качестве альтернативного способа расчета степени модификации полимера дексаметазоном использовали данные, полученные методом¹Н ЯМР-спектроскопии. Данные, полученные двумя методами, находятся в согласовании друг с другом.The calculation of the amount of bound dexamethasone was carried out according to the data of the chromatographic analysis of the sample after its alkaline hydrolysis. As an alternative method for calculating the degree of modification of the polymer by dexamethasone, data obtained by¹ H NMR spectroscopy were used. The data obtained by the two methods are in agreement with each other.

Конъюгаты дексаметазона с амфифильными полипептидами по изобретению содержат 0.5-30% дексаметазона по массе.Dexamethasone amphiphilic polypeptide conjugates of the invention contain 0.5-30% dexamethasone by weight.

Получение полимерных частиц.Obtaining polymer particles.

Системы контролируемого высвобождения дексаметазона представляют собой полимерные наночастицы на основе конъюгата дексаметазона с амфифильными полипептидами сред нечисловой молекулярной массы от 5 до 50 кДа, формируемые путем самопроизвольной сборки амфифильных конъюгатов в водных средах с образованием сферических частиц, имеющих гидродинамический диаметр 100-400 нм. При этом гидрофобные фрагменты (фенилаланин, дексаметазон) амфифильных молекул полимера преимущественно обращены внутрь полимерной частицы, образуя ее внутреннее гидрофобное ядро, а гидрофильный фрагмент (аминогруппы L-лизина или карбоксильные группы L-глутаминовой кислоты) преимущественно окружает гидрофобную мембрану и направлен наружу в водную среду, стабилизируя внутреннее гидрофобное ядро.Dexamethasone controlled release systems are polymeric nanoparticles based on a dexamethasone conjugate with amphiphilic polypeptides with a number average molecular weight of 5 to 50 kDa, formed by spontaneous assembly of amphiphilic conjugates in aqueous media to form spherical particles with a hydrodynamic diameter of 100–400 nm. In this case, the hydrophobic fragments (phenylalanine, dexamethasone) of the amphiphilic polymer molecules are predominantly turned inside the polymer particle, forming its inner hydrophobic core, and the hydrophilic fragment (amino groups of L-lysine or carboxyl groups of L-glutamic acid) mainly surrounds the hydrophobic membrane and is directed outward into the aqueous medium. , stabilizing the inner hydrophobic core.

Согласно изобретению структура частицы, образованной конъюгатами дексаметазона и амфифильными полипептидами на основе L-лизина, может быть представлена как это показано на Фиг. 5.According to the invention, the structure of a particle formed by dexamethasone conjugates and L-lysine amphiphilic polypeptides can be represented as shown in FIG. 5.

Кроме того, согласно изобретению структура частицы, образованной конъюгатами дексаметазона и амфифильными полипептидами на основе L-глутаминовой кислоты, может быть представлена как показано на Фиг. 6.Furthermore, according to the invention, the structure of a particle formed by dexamethasone conjugates and L-glutamic acid amphiphilic polypeptides can be represented as shown in FIG. 6.

Основная сущность изобретения состоит в том, что конъюгаты дексаметазона с амфифильными статистическими полипептидами содержат гидрофобную часть, состоящую из звеньев гидрофобной аминокислоты, выбранной из группы из группы L-фенилаланин, DL-фенилаланин и D-фенилаланин и гидрофильную часть, состоящую из фрагментов L-лизина или L-глутаминовой кислоты. Такая структура сополимера обеспечивает его свойства и свойства образуемых амфифильными полимерами частиц:The main essence of the invention is that the conjugates of dexamethasone with amphiphilic random polypeptides contain a hydrophobic part, consisting of units of a hydrophobic amino acid selected from the group from the group L-phenylalanine, DL-phenylalanine and D-phenylalanine and a hydrophilic part, consisting of fragments of L-lysine or L-glutamic acid. This structure of the copolymer provides its properties and the properties of particles formed by amphiphilic polymers:

- критическая концентрация агрегации зависит от состава и структуры полимера и лежит в пределах 4-18 мг/л;- the critical concentration of aggregation depends on the composition and structure of the polymer and lies in the range of 4-18 mg/l;

- гидродинамический диаметр частиц зависит от состава и структуры сополимера и лежит в пределах 100-400 нм, при этом индекс полидисперсности частиц не превышает значения 0.35;- the hydrodynamic diameter of the particles depends on the composition and structure of the copolymer and lies in the range of 100-400 nm, while the polydispersity index of the particles does not exceed 0.35;

- амфифильные полимеры и частицы на их основе по изобретению являются нетоксичными и обладают способностью к биодеградации;- amphiphilic polymers and particles based on them according to the invention are non-toxic and have the ability to biodegrade;

- скорость биодеградации частиц по изобретению зависит от состава сополимера, при этом введение D-аминокислоты увеличивает стабильность частиц к ферментативному расщеплению;- the rate of biodegradation of the particles according to the invention depends on the composition of the copolymer, while the introduction of D-amino acids increases the stability of the particles to enzymatic degradation;

- структура частиц на основе амфифильных полимеров по изобретению обеспечивает возможность функционализации поверхности частиц различными лигандами за счет реакционноспособных аминогрупп или карбоксильных групп на поверхности частиц;- the structure of the particles based on amphiphilic polymers according to the invention allows the functionalization of the surface of the particles with various ligands due to reactive amino groups or carboxyl groups on the surface of the particles;

- структура частиц на основе амфифильных полимеров по изобретению, содержащих L-лизин в своей структуре, обеспечивает возможность покрытия частиц полисахаридами, несущими карбоксильные и сульфогруппы, за счет электростатического взаимодействия данных групп и аминогрупп на поверхности частиц;- the structure of particles based on amphiphilic polymers according to the invention, containing L-lysine in their structure, provides the possibility of coating particles with polysaccharides bearing carboxyl and sulfo groups, due to the electrostatic interaction of these groups and amino groups on the surface of the particles;

- количество ковалентно связанного дексаметазона лежит в пределах 0.5-30 мас.%.- the amount of covalently bound dexamethasone is in the range of 0.5-30 wt.%.

- ковалентное связывание дексаметазона с полимерной частицей способствует солюбилизации гидрофобной молекулы, контролируемому высвобождению вещества за счет гидролиза сложноэфирной связи.- covalent binding of dexamethasone to the polymer particle contributes to the solubilization of the hydrophobic molecule, controlled release of the substance due to the hydrolysis of the ester bond.

Полимерные наночастицы из амфифильных полипептидов и их конъюгатов с дексаметазоном по изобретению были получены диализом раствора полимера в органическом растворителе против воды. Амфифильный полимер берут в таких количествах, чтобы в конечном растворе его концентрация была выше критической концентрации агрегации.Polymeric nanoparticles from amphiphilic polypeptides and their conjugates with dexamethasone according to the invention were obtained by dialysis of a polymer solution in an organic solvent against water. The amphiphilic polymer is taken in such quantities that its concentration in the final solution is higher than the critical concentration of aggregation.

Частицы на основе амфифильных полимеров по изобретению, содержащих лизин в своей структуре, содержат аминогруппы на поверхности частиц, что обеспечивает возможность присоединения различных отрицательно заряженных молекул на ее поверхности, включая полимеры. С целью экранирования положительного заряда частиц, обусловленного наличием L-лизина в их структуре, их поверхность дополнительно модифицировали полисахаридами, несущими карбоксильные и сульфогруппы, за счет электростатического взаимодействия данных групп и аминогрупп на поверхности частиц. Полисахариды предпочтительно выбирают из группы, включающей гепарин, каррагинан и хондроитинсульфат.Particles based on the amphiphilic polymers of the invention, containing lysine in their structure, contain amino groups on the surface of the particles, which allows the attachment of various negatively charged molecules on its surface, including polymers. In order to shield the positive charge of particles due to the presence of L-lysine in their structure, their surface was additionally modified with polysaccharides bearing carboxyl and sulfo groups due to the electrostatic interaction of these groups and amino groups on the particle surface. The polysaccharides are preferably selected from the group consisting of heparin, carrageenan and chondroitin sulfate.

Таким образом, согласно изобретению, структура частицы, образованной конъюгатами дексаметазона с амфифильными полипептидами на основе L-лизина, поверхность которой дополнительно покрыта полисахаридом, содержащем сульфогруппы, может быть представлена как показано на Фиг. 7.Thus, according to the invention, the structure of a particle formed by conjugates of dexamethasone with amphiphilic polypeptides based on L-lysine, the surface of which is additionally coated with a polysaccharide containing sulfo groups, can be represented as shown in FIG. 7.

Исследование биологических свойств частиц in vitro.Study of the biological properties of particles in vitro.

Использование полимерных нано- и микрочастиц in vivo накладывает определенные ограничения на выбор полимеров. Особенно важно, чтобы полимеры, выбранные для получения частиц, были биосовместимыми и обладали способностью к биодеградации, т.е. разлагались в физиологических средах до низкомолекулярных фрагментов и, таким образом, выводились из организма.The use of polymeric nano- and microparticles in vivo imposes certain restrictions on the choice of polymers. It is particularly important that the polymers chosen to form the particles are biocompatible and biodegradable, i. decomposed in physiological media to low molecular weight fragments and, thus, were excreted from the body.

Цитотоксичность полимерных частиц исследовали на эпителиальных клетках легких человека (BEAS-2B) и клетках почек эмбриона человека (НЕК 293). Полимерные наноразмерные частицы на основе поли((L-глутаминовой кислоты)-со-L/D/DL-фенилаланина), а также поли(L-лизина-со-L/D/DL-фенилаланина), покрытые отрицательно заряженным полисахаридом, являются нетоксичными в диапазоне концентраций 4-250 мкг/мл в исследуемой in vitro модели.The cytotoxicity of the polymer particles was studied on human lung epithelial cells (BEAS-2B) and human embryonic kidney cells (HEK 293). Polymer nanosized particles based on poly((L-glutamic acid)-co-L/D/DL-phenylalanine), as well as poly(L-lysine-co-L/D/DL-phenylalanine), coated with a negatively charged polysaccharide, are non-toxic in the concentration range of 4-250 µg/ml in the studied in vitro model.

Процесс биодеградации полимерных частиц был изучен в модельной системе, содержащей фермент папаин. Процесс биодеградации исследовали методом динамического рассеяния света, определяя изменение гидродинамического размера частиц в течение времени (Фиг. 8). В таблице 1 представлены характеристики исследуемых частиц, используемых для изучения процесса деградации.The process of biodegradation of polymer particles was studied in a model system containing the papain enzyme. The process of biodegradation was investigated by the method of dynamic light scattering, determining the change in hydrodynamic particle size over time (Fig. 8). Table 1 presents the characteristics of the studied particles used to study the degradation process.

Введение в структуру частицы фрагмента с повышенной устойчивостью к биодеградации (D-Phe), увеличивает стабильность частиц к ферментативной деградации, по сравнению с пептидами, содержащими только природные аминокислоты. Деградация полимерной частицы в данном случае сопровождается резким увеличением гидродинамического размера (агрегацией) (Фиг. 8).The introduction of a fragment with increased resistance to biodegradation (D-Phe) into the structure of the particle increases the stability of the particles to enzymatic degradation, compared to peptides containing only natural amino acids. The degradation of the polymer particle in this case is accompanied by a sharp increase in the hydrodynamic size (aggregation) (Fig. 8).

Исследование профиля высвобождения дексаметазонаDexamethasone Release Profile Study

Процесс высвобождения дексаметазона (DEX) из частиц различного состава на основе конъюгатов дексаметазона с полипептидом поли((L-глутаминовая кислота)-со-D-фенилаланин) (P(L-Glu-co-D-Phe)-DEX), а также поли(L-лизин-со-L/DL-фенилаланин) (P(L-Lys-co-DL/D-Phe)-DEX) и таких частиц, покрытых гепарином (P(Lys-co-DL-Phe)-DEX)-гепарин) (Таблица 2), исследовали в модельных физиологических условиях: натрий-фосфатном буферном растворе (Фиг. 9, 10) и его смеси с витреальной жидкостью (Фиг. 11).The process of releasing dexamethasone (DEX) from particles of various compositions based on conjugates of dexamethasone with polypeptide poly((L-glutamic acid)-co-D-phenylalanine) (P(L-Glu-co-D-Phe)-DEX), as well as poly(L-lysine-co-L/DL-phenylalanine) (P(L-Lys-co-DL/D-Phe)-DEX) and such particles coated with heparin (P(Lys-co-DL-Phe)- DEX)-heparin) (Table 2) was studied under model physiological conditions: sodium phosphate buffer solution (Fig. 9, 10) and its mixture with vitreal fluid (Fig. 11).

Высвобождение дексаметазона из частиц на основе его конъюгатов с амфифильными полипептидами обусловлено гидролизом сложноэфирных связей в конъюгате, образованных между дексаметазоном и линкером, и последующей диффузией дексаметазона из частицы. Время полного высвобождения дексаметазона из частиц на основе конъюгатов по изобретению в натрий-фосфатном буферном растворе составляло 168-336 ч. Введение в структуру полимера, образующего частицу, D-аминокислоты, а также увеличение доли L-лизина позволило снизить скорость высвобождения дексаметазона (Фиг. 9). Связывание частиц с полисахаридом также снижает скорость данного процесса (Фиг. 10). Время полного высвобождения дексаметазона из частиц на основе конъюгатов по изобретению в смеси натрий-фосфатный буферный раствор: витреальная жидкость (50:50 об.%) составляло 96-192 ч (Фиг. 11).The release of dexamethasone from particles based on its conjugates with amphiphilic polypeptides is due to the hydrolysis of ester bonds in the conjugate formed between dexamethasone and the linker, and subsequent diffusion of dexamethasone from the particle. The time for complete release of dexamethasone from particles based on conjugates according to the invention in a sodium phosphate buffer solution was 168-336 hours. The introduction of D-amino acids into the structure of the polymer forming the particle, as well as an increase in the proportion of L-lysine, made it possible to reduce the rate of dexamethasone release (Fig. 9). Binding of the particles to the polysaccharide also reduces the rate of this process (FIG. 10). The time to complete release of dexamethasone from particles based on the conjugates of the invention in a mixture of sodium phosphate buffer solution: vitreal liquid (50:50 vol.%) was 96-192 hours (Fig. 11).

В заявляемом изобретении лекарственное вещество высвобождается в виде свободного дексаметазона, в отличие от прототипа, в котором происходит высвобождение вещества в виде дексаметазона, связанного с аргинином.In the claimed invention, the drug substance is released in the form of free dexamethasone, in contrast to the prototype, in which the substance is released in the form of dexamethasone associated with arginine.

Практически линейное высвобождение позволит точно контролировать количество высвобождаемого препарата и поддерживать его не заданном уровне, что не достигается в аналогах - липосомальных препаратах.Almost linear release will allow you to accurately control the amount of the released drug and maintain it at a given level, which is not achieved in analogues - liposomal preparations.

Частицы, полученные по изобретению, имеют размер, не превышающий 400 нм и могут быть введены в глаз в виде коллоидного раствора через тонкую иглу, в отличие коммерчески доступного имплантата Ozurdex®.The particles obtained according to the invention have a size not exceeding 400 nm and can be introduced into the eye in the form of a colloidal solution through a thin needle, in contrast to the commercially available Ozurdex® implant.

Используемые сокращенияAbbreviations Used

ПримерыExamples

Ниже представлены примеры получения некоторых сополимеров, конъюгатов и частиц на их основе согласно изобретению. Все приведенные в материалах заявки примеры приведены для иллюстрации изобретения и не ограничивают формулу изобретения.Below are examples of obtaining some copolymers, conjugates and particles based on them according to the invention. All examples given in the application materials are given to illustrate the invention and do not limit the claims.

Получение амфифильных полипептидов.Preparation of amphiphilic polypeptides.

Гидрофобный статистический сополимер, мономерами которого являются ε-карбоксибензил-L-лизин и DL-фенилаланин, получали следующим образом. В реакционный бюкс для полимеризации загружали расчетное количество N-карбоксиангидридов ε-карбоксибензил-L-лизина (M₁) и DL-фенилаланина (М₂) и органический растворитель (диоксан). После этого в бюкс, содержащий 4 мас.%, раствор мономеров, вносили инициатор н-гексиламин для достижения мольного соотношения [мономеры]/[инициатор], равного 10-100. После приготовления полимеризационную смесь продували аргоном в течение 1 ч. Затем реактор помещали в термостат, где поддерживали температуру 30°С. По истечении 48 ч полученный продукт осаждали пятикратным избытком диэтилового эфира. Осадок отделяли центрифугированием. После декантации осадок промывали избытком диэтилового эфира. Полученный полимер сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 24 ч.A hydrophobic random copolymer whose monomers are ε-carboxybenzyl-L-lysine and DL-phenylalanine was prepared as follows. The calculated amount of N-carboxyanhydrides of ε-carboxybenzyl-L-lysine (M₁ ) and DL-phenylalanine (M₂ ) and an organic solvent (dioxane) were loaded into the reaction bottle for polymerization. After that, the initiator n-hexylamine was added to the bottle containing a 4 wt.% solution of monomers to achieve a molar ratio of [monomers]/[initiator] equal to 10-100. After preparation, the polymerization mixture was purged with argon for 1 h. Then the reactor was placed in a thermostat, where the temperature was maintained at 30°C. After 48 hours, the resulting product was precipitated with a fivefold excess of diethyl ether. The precipitate was separated by centrifugation. After decantation, the precipitate was washed with an excess of diethyl ether. The resulting polymer was dried in air at room temperature for 24 h.

Амфифильный статистический сополимер, мономерными звеньями которого являются L-лизин и DL-фенилаланин, получали следующим образом. В круглодонную колбу помещали навеску сополимера поли(ε-карбоксибензил-L-лизин)-со-(DL-фенилаланин) и добавляли трифторуксусную кислоту в количестве 2 мл / 100 мг сополимера. Полученную смесь оставляли перемешиваться в течение 30-60 мин при охлаждении с помощью ледяной бани до растворения полимера. После этого к полученному раствору добавляли трифторметансульфокислоту в количестве 100 мкл / 100 мг полимера и оставляли при перемешивании в течение 4-6 ч, после чего в реакционную смесь добавляли диметилформамид. Очистку сополимеров от низкомолекулярных примесей проводили диализом через мембрану с отсекаемой молекулярной массой 1000 против воды в течение 48-96 ч. Полученный полимер лиофильно высушивали.An amphiphilic random copolymer whose monomer units are L-lysine and DL-phenylalanine was prepared as follows. A weighed portion of poly(ε-carboxybenzyl-L-lysine)-co-(DL-phenylalanine) copolymer was placed in a round bottom flask and trifluoroacetic acid was added in an amount of 2 ml/100 mg of copolymer. The resulting mixture was allowed to stir for 30-60 minutes while cooling with an ice bath to dissolve the polymer. After that, trifluoromethanesulfonic acid was added to the resulting solution in an amount of 100 μl / 100 mg of polymer and left under stirring for 4-6 hours, after which dimethylformamide was added to the reaction mixture. The copolymers were purified from low molecular weight impurities by dialysis through a membrane with a cut-off molecular weight of 1000 against water for 48–96 h. The resulting polymer was freeze-dried.

Получение конъюгатов дексаметазона с синтетическими полипептидами.Obtaining conjugates of dexamethasone with synthetic polypeptides.

Пример 1Example 1

К раствору дексаметазона гемисукцината в диметилсульфоксиде добавляли 1.05 мольный избыток N-гидроксисукцинимида (NHS) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC). Реакцию проводили при перемешивании в течение 4 ч при комнатной температуре. Полученный раствор прикапывали к раствору полимера поли(L-лизин-со-DL-фенилаланин) в диметилсульфоксиде (ДМСО) при перемешивании, в объеме, необходимом для достижения соотношения реагентов 50-1000 мкг дексаметазона гемисукцината/ 1 мг полимера и оставляли при перемешивании еще на 16 ч. Непрореагировавшие вещества удаляли диализом, после этого полимер лиофильно высушивали.A 1.05 molar excess of N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) was added to a solution of dexamethasone hemisuccinate in dimethyl sulfoxide. The reaction was carried out with stirring for 4 h at room temperature. The resulting solution was added dropwise to a solution of the polymer poly(L-lysine-co-DL-phenylalanine) in dimethyl sulfoxide (DMSO) with stirring, in the volume necessary to achieve a ratio of reagents of 50-1000 μg of dexamethasone hemisuccinate/1 mg of polymer and left under stirring for another 16 hours Unreacted substances were removed by dialysis, after which the polymer was freeze-dried.

Пример 2Example 2

К раствору полимера поли((L-глутаминовая кислота)-со-D-фенилаланин) в диметилсульфоксиде добавляли 0.4 эквивалента по отношению к количеству γ-карбоксильных групп полимера NHS и 0.2 эквивалента EDC. Реакцию активации проводили при комнатной температуре в течение 60 мин при перемешивании. После этого к раствору добавляли 0.12 эквивалентов N-Boc-этилендиамина и перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч. К полученному раствору при перемешивании добавляли трифторуксусную кислоту в объеме, необходимом для получения 50% раствора, и смесь оставляли на 4 часа при перемешивании. Непрореагировавшие вещества удаляли диализом, полимер лиофильно высушивали. После этого к раствору полученного полимера прикапывали активированный эфир дексамеазона сукцината, полученного как описано в примере 1, в объеме, необходимом для достижения соотношения реагентов 50-1000 мкг дексаметазона гемисукцината / 1 мг полимера и оставляли при перемешивании еще на 16 ч. Непрореагировавшие вещества удаляли диализом, после этого полимер лиофильно высушивали.To a solution of poly((L-glutamic acid)-co-D-phenylalanine) polymer in dimethyl sulfoxide was added 0.4 equivalents relative to the number of γ-carboxyl groups of the NHS polymer and 0.2 equivalents of EDC. The activation reaction was carried out at room temperature for 60 min with stirring. After that, 0.12 equivalents of N-Boc-ethylenediamine was added to the solution and stirred at room temperature for 24 hours. Trifluoroacetic acid was added to the resulting solution with stirring in the amount necessary to obtain a 50% solution, and the mixture was left for 4 hours with stirring. Unreacted substances were removed by dialysis, and the polymer was freeze-dried. After that, the activated ether of dexamethasone succinate, obtained as described in example 1, was added dropwise to the solution of the obtained polymer in the amount necessary to achieve a ratio of reagents of 50-1000 μg of dexamethasone hemisuccinate / 1 mg of polymer and left under stirring for another 16 hours. Unreacted substances were removed by dialysis , after which the polymer was freeze-dried.

Расчет степени модификации полимера дексаметазоном проводили по данным хроматографического анализа образца после его щелочного гидролиза. Реакцию гидролиза проводили при температуре 40°С в течение 24 часов при перемешивании. Количественное определение дексаметазона проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на приборе Shimadzu LC-20AD с УФ-детектированием при 237 нм, используя колонку Grace Smart C18 (размер частиц 5 мкм, размер колонки 4.6⋅150 мм). В качестве подвижной фазы использовали смесь вода:ацетонитрил в соотношении 70:30 по объему. Скорость потока подвижной фазы составляла 0.5 мл/мин.The degree of modification of the polymer with dexamethasone was calculated according to the data of the chromatographic analysis of the sample after its alkaline hydrolysis. The hydrolysis reaction was carried out at a temperature of 40°C for 24 hours with stirring. Dexamethasone was quantified by reverse-phase HPLC on a Shimadzu LC-20AD instrument with UV detection at 237 nm using a Grace Smart C18 column (particle size 5 µm, column size 4.6×150 mm). The mobile phase was a mixture of water:acetonitrile in a ratio of 70:30 by volume. The flow rate of the mobile phase was 0.5 ml/min.

В качестве альтернативного способа расчета степени модификации полимера дексаметазоном использовали данные, полученные методом¹Н ЯМР-спектроскопии. Спектры ЯМР регистрировали на приборе Bruker АС-400 на частоте 400.1 МГц при 25°С. Использовали растворы 5-15 мг образцов в 0.6 мл ДМСО-d6. Пик растворителя ДМСО-d6 при 2.52 м.д. в спектре¹Н-ЯМР использовался для калибровки химических сдвигов спектра.As an alternative method for calculating the degree of modification of the polymer by dexamethasone, data obtained by¹ H NMR spectroscopy were used. NMR spectra were recorded on a Bruker AC-400 instrument at a frequency of 400.1 MHz at 25°C. Solutions of 5-15 mg of samples in 0.6 ml of DMSO-d6 were used. Solvent peak DMSO-d6 at 2.52 ppm in the^1H -NMR spectrum was used to calibrate the chemical shifts of the spectrum.

На Фиг. 12 представлена область¹Н ЯМР спектра конъюгата дексаметазона с полимером P(Lys-co-DL-Phe)-2, используемая для расчета степени конъюгирования. Соотношение интегральных интенсивностей характеристических сигналов дексаметазона при δ=6.24 м.д. (д., J=11.6 Гц, 1Н), 5.05 (д, J=15.5 Гц, 1Н) и 4.80 (д, J=18.8 Гц, 1Н) и ароматических протонов Phe (δ=6.5-7.3 м.д.) использовались для расчета числа конъюгированных молекул дексаметазона.On FIG. 12 shows the¹ H NMR region of the P(Lys-co-DL-Phe)-2 polymer conjugate of dexamethasone used to calculate the degree of conjugation. The ratio of the integral intensities of the characteristic signals of dexamethasone at δ=6.24 ppm (d, J=11.6 Hz, 1H), 5.05 (d, J=15.5 Hz, 1H) and 4.80 (d, J=18.8 Hz, 1H) and Phe aromatic protons (δ=6.5-7.3 ppm) were used to calculate the number of conjugated dexamethasone molecules.

Получение полимерных частиц.Obtaining polymer particles.

Формирование наночастиц проводили диализом раствора амфифильного сополимера в органическом растворителе (диметилсульфоксид) через мембрану с отсекаемой молекулярной массой 1000 против воды в течение 48-96 ч. Затем образцы лиофильно высушивали и хранили при 4°С.The formation of nanoparticles was carried out by dialysis of a solution of an amphiphilic copolymer in an organic solvent (dimethyl sulfoxide) through a membrane with a cut-off molecular weight of 1000 against water for 48–96 h. Then, the samples were freeze-dried and stored at 4°C.

Определение гидродинамического диаметра, ζ-потенциала и индекса полидисперсности частиц проводили на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instrument Ltd., Malvern, Великобритания), при рассеивающем угле 173° и температуре 25°С.The hydrodynamic diameter, ζ-potential, and particle polydispersity index were determined on a Zetasizer Nano-ZS instrument (Malvern Instrument Ltd., Malvern, UK) at a scattering angle of 173° and a temperature of 25°C.

Критическую концентрацию агрегации (ККА) полипептидных частиц определяли методом кондуктометрии с использованием прибора SevenCompact Cond meter S230 (Mettler Toledo, США). Измерения электропроводности проводили при 25°С в воде в диапазоне концентраций полимера 2-62 мкг/мл. ККА определяли как пересечение двух линейных участков графика зависимости электрпроводности от конценрации полимера.The critical aggregation concentration (CCA) of polypeptide particles was determined by conductometry using a SevenCompact Cond meter S230 instrument (Mettler Toledo, USA). Electrical conductivity measurements were carried out at 25°C in water in the polymer concentration range of 2–62 µg/mL. CCA was determined as the intersection of two linear sections of the plot of electrical conductivity versus polymer concentration.

Получение частиц на основе конъюгата дексаметазона с амфифильным полипептидом, связанных с полисахаридом, проводили следующим образом. К раствору гепарина в воде при интенсивном перемешивании добавляли коллоидный раствор частиц в воде в количестве 1 мг частиц / 2 мг гепарина. Несвязавшийся гепарин удаляли ультрафильтрацией через мембрану с отсекаемой молекулярной массой 50000.Obtaining particles based on the conjugate of dexamethasone with amphiphilic polypeptide associated with the polysaccharide was carried out as follows. To a solution of heparin in water with vigorous stirring was added a colloidal solution of particles in water in the amount of 1 mg of particles / 2 mg of heparin. Unbound heparin was removed by ultrafiltration through a membrane with a cut-off molecular weight of 50,000.

Исследование биологических свойств частиц in vitro.Study of the biological properties of particles in vitro.

Процесс биодеградации частиц изучали в 0.01 М натрий-фосфатном буферном растворе рН 7.4 (ФБР), содержащем папаин в концентрации 50 мкг/мл. Определяли изменение гидродинамического диаметра частиц в течение 30 дней на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instrument Ltd., Malvern, Великобритания), при рассеивающем угле 173° и температуре 25°С.The biodegradation of particles was studied in 0.01 M sodium phosphate buffer solution pH 7.4 (PBS) containing papain at a concentration of 50 µg/mL. The change in hydrodynamic particle diameter was determined over 30 days on a Zetasizer Nano-ZS instrument (Malvern Instrument Ltd., Malvern, UK) at a scattering angle of 173° and a temperature of 25°C.

Исследование цитотоксичности полимерных частиц проводили с помощью анализа с использованием реагента CellTiter-Blue, основанного на способности живых клеток восстанавливать резаурин во флуоресцентный продукт резоруфин. Образование продукта, количество которого пропорционально количеству жизнеспособных клеток, контролировали флуориметрически (λ_погл=544 нм, λ_фл=590 нм). Эксперимент проводили в 96-луночных планшетах. В каждую лунку высевали 8000 клеток в 100 мкл культуральной среды, содержащей следующие растворы: 79 об.% базальной среды DMEM (Sigma-Aldrich GmbH, Германия) 10 об.% эмбриональной бычьей сыворотки (Biochrom GmbH, Германия) и раствор антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Biochrom GmbH, Германия) и культивировали в течение 24 ч. После этого культуральную среду удаляли и добавляли 200 мкл культуральной среды, содержащей частицы, концентрация которых составляла 4-1000 мкг/мл. Клетки инкубировали в течение 24 или 72 ч, после чего среду удаляли и вносили в каждую лунку 100 мкл раствора реагента СТВ в базальной среде (1:10 об.%). Клетки инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 1-3 ч при 37°С и проводили измерения флуоресценции раствора. Для коррекции фона из значений интенсивности флуоресценции растворов лунок, содержащих клетки, вычитали значения интенсивности флуоресценции растворов лунок, не содержащих клетки. Данные нормировали в процентах по отношению к контролю, т.е. интенсивности флуоресценции растворов лунок, содержащих клетки, инкубированных без тестируемых веществ. В пределах одного эксперимента анализ проводился на трех лунках.The study of the cytotoxicity of polymer particles was performed using analysis using the CellTiter-Blue reagent, based on the ability of living cells to reduce resaurin to the fluorescent product resorufin. The formation of the product, the amount of which is proportional to the number of viable cells, was controlled fluorimetrically (λ_absorb =544 nm, λ_fl =590 nm). The experiment was carried out in 96-well plates. 8000 cells were seeded in each well in 100 μl of culture medium containing the following solutions: 79 vol% DMEM basal medium (Sigma-Aldrich GmbH, Germany) 10 vol% fetal bovine serum (Biochrom GmbH, Germany) and a solution of antibiotics penicillin and streptomycin (Biochrom GmbH, Germany) and cultivated for 24 hours. After that, the culture medium was removed and 200 µl of culture medium containing particles was added, the concentration of which was 4-1000 µg/ml. The cells were incubated for 24 or 72 h, after which the medium was removed and 100 µl of a solution of the CTB reagent in basal medium (1:10 vol.%) was added to each well. Cells were incubated in CO₂ -incubator for 1-3 h at 37°C and measured the fluorescence of the solution. To correct the background, the values of the fluorescence intensity of solutions of wells without cells were subtracted from the fluorescence intensity values of the solutions of the wells containing cells. The data were normalized as a percentage relative to the control, i.e. fluorescence intensity of well solutions containing cells incubated without test substances. Within one experiment, the analysis was carried out on three wells.

Исследование профиля высвобождения дексаметазона.Examination of the release profile of dexamethasone.

Для исследования кинетики высвобождения дексаметазона коллоидный раствор частиц инкубировали при температуре 37°С в различных модельных средах: 0.01 М ФБР, рН 7.4, содержащий 0.9% NaCl; витреальная жидкость: 0.01 М ФБР, рН 7.4, содержащий 0.9% NaCl (50:50 об.%). Через определенные промежутки времени отбирали 40 мкл суспензии (1 мг/мл) и определяли количество высвободившегося дексаметазона методом ВЭЖХ как описано ранее.To study the dexamethasone release kinetics, a colloidal solution of particles was incubated at 37°C in various model media: 0.01 M PBS, pH 7.4, containing 0.9% NaCl; vitreous liquid: 0.01 M PBS, pH 7.4, containing 0.9% NaCl (50:50 vol.%). At certain intervals, 40 μl of the suspension (1 mg/ml) was taken and the amount of released dexamethasone was determined by HPLC as described previously.

Как показывают приведенные результаты апробации, заявленное изобретение позволяет получить конъюгаты дексаметазона различного состава, которые формируют в водной среде полимерные частицы с размером до 400 нм, которые просты в получении и имеют контролируемый пролонгированный профиль высвобождения дексаметазона с поддержанием необходимой концентрации в течение продолжительного периода времени, по сравнению с описанными родственными конъюгатами.As the test results show, the claimed invention makes it possible to obtain dexamethasone conjugates of various compositions that form polymer particles up to 400 nm in size in an aqueous medium, which are easy to obtain and have a controlled prolonged dexamethasone release profile maintaining the required concentration for a long period of time, compared to related conjugates described.

Системы доставки дексаметазона на основе конъюгатов дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами по заявляемому изобретению позволяют улучшить дозирование вещества за счет его постепенного высвобождения без начального взрывного высвобождения, характерного для инкапсулированных форм. Полимерные частицы, полученные по изобретению, могут быть введены в глаз в виде коллоидного раствора через тонкую иглу, в отличие коммерчески доступного имплантата Ozurdex®. Заявляемый способ отличается от коммерчески доступных технологий использованием конъюгатов дексаметазона с синтетическими амфифильными полипептидами для получения системы доставки дексаметазона. Использование полипептидов в качестве полимеров для получения полимерных частиц позволяет получить нетоксичные и способные к биодеградации полимерные частицы, продуктами разложения которых являются нетоксичные аминокислоты.Dexamethasone delivery systems based on conjugates of dexamethasone with synthetic amphiphilic polypeptides according to the claimed invention improve the dosing of the substance due to its gradual release without the initial explosive release characteristic of encapsulated forms. The polymer particles obtained according to the invention can be injected into the eye as a colloidal solution through a fine needle, in contrast to the commercially available Ozurdex® implant. The claimed method differs from commercially available technologies using dexamethasone conjugates with synthetic amphiphilic polypeptides to obtain a dexamethasone delivery system. The use of polypeptides as polymers for the production of polymer particles makes it possible to obtain non-toxic and biodegradable polymer particles, the degradation products of which are non-toxic amino acids.

Наличие в структуре полипептида D-аминокислоты, в свою очередь, существенно уменьшает чувствительность полимеров к ферментативному расщеплению, что позволяет варьировать скорость разложения таких систем варьированием состава исходных полимеров. Таким образом, предложенные соединения могут быть перспективны для получения новых противоспалительных препаратов для лечения глазных заболеваний, в частности, макулярного отека и увеита.The presence of a D-amino acid in the structure of the polypeptide, in turn, significantly reduces the sensitivity of polymers to enzymatic cleavage, which makes it possible to vary the rate of decomposition of such systems by varying the composition of the initial polymers. Thus, the proposed compounds may be promising for the production of new anti-inflammatory drugs for the treatment of eye diseases, in particular, macular edema and uveitis.

Список используемых источников информацииList of information sources used

1.

Villanueva, J.;

Villanueva, L.;

Navarro, M. Pharmaceutical technology can turn a traditional drug, dexamethasone into a first-line ocular medicine. A global perspective and future trends. Int. J. Pharm. 2017, 516, 342-351.1.

Villanueva, J.;

Villanueva, L.;

Navarro, M. Pharmaceutical technology can turn a traditional drug, dexamethasone into a first-line ocular medicine. A global perspective and future trends. Int. J Pharm. 2017, 516, 342-351.

2. Hughes, P.M.; Olejnik, O.; Chang-Lin, J.E.; Wilson, C.G. Topical and systemic drug delivery to the posterior segments. Adv. Drug Deliv. Rev. 2005, 57, 2010-2032.2. Hughes, P.M.; Oleinik, O.; Chang-Lin, J.E.; Wilson, C.G. Topical and systemic drug delivery to the posterior segments. Adv. drug deliv. Rev. 2005, 57, 2010-2032.

3. Behl, G.; Iqbal, J.; O'Reilly, N.J.; McLoughlin, P.; Fitzhenry, L. Synthesis and Characterization of Poly(2-hydroxyethylmethacrylate) Contact Lenses Containing Chitosan Nanoparticles as an Ocular Delivery System for Dexamethasone Sodium Phosphate. Pharm. Res. 2016, 33, 1638-1648.3. Behl, G.; Iqbal, J.; O'Reilly, N. J.; McLoughlin, P.; Fitzhenry, L. Synthesis and Characterization of Poly(2-hydroxyethylmethacrylate) Contact Lenses Containing Chitosan Nanoparticles as an Ocular Delivery System for Dexamethasone Sodium Phosphate. Pharm. Res. 2016, 33, 1638-1648.

4. Bhagat, R.; Zhang, J.; Farooq, S.; Li, X.Y. Comparison of the release profile and pharmacokinetics of intact and fragmented dexamethasone intravitreal implants in rabbit eyes. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2014, 30, 854-858.4. Bhagat, R.; Zhang, J.; Farooq, S.; Li, X.Y. Comparison of the release profile and pharmacokinetics of intact and fragmented dexamethasone intravitreal implants in rabbit eyes. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2014, 30, 854-858.

5. Kaur, I.P.; Kakkar, S. Nanotherapy for posterior eye diseases. J. Control. Release 2014, 193, 100-112.5 Kaur, I.P.; Kakkar, S. Nanotherapy for posterior eye diseases. J. Control. Release 2014, 193, 100-112.

6. Petros, R.A.; DeSimone, J.M. Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 2010, 9, 615-627.6. Petros, R.A.; DeSimone, J.M. Strategies in the design of nanoparticles for therapeutic applications. Nat. Rev. drug discov. 2010, 9, 615-627.

7. Alexis, F.; Pridgen, E.; Molnar, L.K.; Farokhzad, O.C. Factors Affecting the Clearance and Biodistribution of Polymeric Nanoparticles. Mol. Pharm. 2008, 5, 505-515.7. Alexis, F.; Bridgen, E.; Molnar, L.K.; Farokhzad, O.C. Factors Affecting the Clearance and Biodistribution of Polymeric Nanoparticles. Mol. Pharm. 2008, 5, 505-515.

8. Muller, P.Y.; Milton, M.N. The determination and interpretation of the therapeutic index in drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 2012, 11, 751-761.8 Muller, P. Y.; Milton, M.N. The determination and interpretation of the therapeutic index in drug development. Nat. Rev. drug discov. 2012, 11, 751-761.

9. Shah, A.R.; Xi, M.; Abbey, A.M.; Yonekawa, Y.; Faia, L.J.; Hassan, T.S.; Ruby, A.J.; Wolfe, J.D. Short-term efficacy of intravitreal dexamethasone implant in vitrectomized eyes with recalcitrant diabetic macular edema and prior anti-VEGF therapy. J. Ophthalmic Vis. Res. 2016, 11, 183-187.9. Shah, A.R.; Xi, M.; Abbey, A. M.; Yonekawa, Y.; Faia, L.J.; Hassan, T. S.; Ruby, A.J.; Wolfe, J.D. Short-term efficacy of intravitreal dexamethasone implant in vitrectomized eyes with recalcitrant diabetic macular edema and prior anti-VEGF therapy. J. Ophthalmic Vis. Res. 2016, 11, 183-187.

10. Jusufbegovic, D.; Schaal, S. Quiescent herpes simplex keratitis reactivation after intravitreal injection of dexamethasone implant. Retin. Cases Br. Reports 2017, 11, 296-297.10. Jusufbegovic, D.; Schaal, S. Quiescent herpes simplex keratitis reactivation after intravitreal injection of dexamethasone implant. Retin. Cases Br. Reports 2017, 11, 296-297.

11. Патент РФ №2660585 C2. Фармацевтическая композиция для уменьшения осложнений применения стероидных препаратов при лечении офтальмологических заболеваний; 2013.11. RF patent No. 2660585 C2. Pharmaceutical composition for reducing the complications of the use of steroid drugs in the treatment of ophthalmic diseases; 2013.

12. Xu, X.; Sun, L.; Zhou, L.; Cheng, Y.; Cao, F. Functional chitosan oligosaccharide nanomicelles for topical ocular drug delivery of dexamethasone. Carbohydr. Polym. 2020, 227, 115356.12. Xu, X.; Sun, L.; Zhou, L.; Cheng, Y.; Cao, F. Functional chitosan oligosaccharide nanomicelles for topical ocular drug delivery of dexamethasone. Carbohydr. Polym. 2020, 227, 115356.

13. Bongiovi, F.; Prima, G. Di; Palumbo, F.S.; Licciardi, M.; Pitarresi, G.; Giammona, G. Hyaluronic Acid-Based Micelles as Ocular Platform to Modutate the Loading, Release, and Corneal Permeation of Corticosteroids. 2017, 1700261, 1-13.13. Bongiovi, F.; Prima, G. Di; Palumbo, F.S.; Licciardi, M.; Pitarresi, G.; Giammona, G. Hyaluronic Acid-Based Micelles as Ocular Platform to Modutate the Loading, Release, and Corneal Permeation of Corticosteroids. 2017, 1700261, 1-13.

14. Zacchigna, M.; Cateni, F.; Di Luca, G.; Voinovich, D.; Perissutti, В.; Drioli, S.; Bonora, G.M. Synthesis of a new mPEG-dexamethasone conjugate and preliminary bioavailability studies in rabbits. J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2008, 18, 155-159.14. Zacchigna, M.; Cateni, F.; Di Luca, G.; Voinovich, D.; Perissutti, V.; Drioli, S.; Bonora, G.M. Synthesis of a new mPEG-dexamethasone conjugate and preliminary bioavailability studies in rabbits. J. DrugDeliv. sci. Technol. 2008, 18, 155-159.

15. Pang, Y.N.; Zhang, Y.; Zhang, Z.R. Synthesis of an enzyme-dependent prodrug and evaluation of its potential for colon targeting. World J. Gastroenterol. 2002, 8, 913-917.15. Pang, Y. N.; Zhang, Y.; Zhang, Z.R. Synthesis of an enzyme-dependent prodrug and evaluation of its potential for colon targeting. World J. Gastroenterol. 2002, 8, 913-917.

16. Bhattacharya, M.; Sadeghi, A.; Sarkhel, S.; Hagstrom, M.; Bahrpeyma, S.; Toropainen, E.; Auriola, S.; Urtti, A. Release of functional dexamethasone by intracellular enzymes: A modular peptide-based strategy for ocular drug delivery. J. Control. Release 2020, 327, 584-594 (прототип).16. Bhattacharya, M.; Sadeghi, A.; Sarkhel, S.; Hagstrom, M.; Bahrpeyma, S.; Toropainen, E.; Auriola, S.; Urtti, A. Release of functional dexamethasone by intracellular enzymes: A modular peptide-based strategy for ocular drug delivery. J. Control. Release 2020, 327, 584-594 (prototype).

Claims (8)

Translated fromRussian

Конъюгат дексаметазона с синтетическим статистическим полипептидом со среднечисловой молекулярной массой от 5000 до 50000, в котором синтетический полипептид является амфифильным и имеет общую формулу поли(X_n-со-Y_m), гдеDexamethasone conjugate with a synthetic random polypeptide with a number average molecular weight of 5,000 to 50,000, wherein the synthetic polypeptide is amphiphilic and has the general formula poly(X_n -co -Y_m ), whereX - заряженная полярная аминокислота, которую выбирают из L-лизина или L-глутаминовой кислоты,X is a charged polar amino acid which is selected from L-lysine or L-glutamic acid,Y - гидрофобная аминокислота, которую выбирают L-фенилаланина, DL-фенилаланина или D-фенилаланина,Y is a hydrophobic amino acid, which is chosen from L-phenylalanine, DL-phenylalanine or D-phenylalanine,n - число повторяющихся звеньев X,n is the number of repeating links X,m - число повторяющихся звеньев Y,m - the number of repeating links Y,и когда X представляет собой L-глутаминовую кислоту мольное соотношение [L-глутаминовая кислота]/[L/DL/D-фенилаланин] равно 0.8-6,and when X is L-glutamic acid, the molar ratio of [L-glutamic acid]/[L/DL/D-phenylalanine] is 0.8-6,когда X представляет собой L-лизин мольное соотношение [L-лизин]/[L/DL/D-фенилаланин] равно 0.7-10,when X is L-lysine, the molar ratio of [L-lysine]/[L/DL/D-phenylalanine] is 0.7-10,дексаметазон связан с полипептидом через линкер и соединен с линкером сложноэфирной связью, с массовой долей конъюгированного дексаметазона 0.5-30%, где конъюгат может быть связан с полисахаридом, выбранным из группы гепарин, каррагинан и хондроитинсульфат, за счет электростатических взаимодействий между аминогруппами конъюгата и карбоксильными и сульфогруппами полисахарида, с массовым соотношением полисахарида к конъюгату равным 1-2.dexamethasone is bound to the polypeptide through a linker and connected to the linker by an ester bond, with a mass fraction of conjugated dexamethasone of 0.5-30%, where the conjugate can be associated with a polysaccharide selected from the group of heparin, carrageenan and chondroitin sulfate, due to electrostatic interactions between the amino groups of the conjugate and carboxyl and sulfo groups of the polysaccharide, with a mass ratio of polysaccharide to conjugate equal to 1-2.

Images