RU2779301C2 - Lipase options and compositions in the form of microcapsules, containing such lipase options - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and is an option of initial lipase, while the option has lipase activity, its sequence is at least 60%, but less than 100% identical to SEQ ID NO: 2, and it provides for replacement corresponding to R118F. The present invention also relates to compositions or compositions in the form of microcapsules, containing a lipase option according to the present invention, and to liquid products containing a composition in the form of microcapsules according to the present invention, as well as to the use of the specified composition in the form of microcapsules for stabilization of lipase options according to the present invention.

EFFECT: invention allows for obtaining effective lipase and its use in detergent compositions.

16 cl, 12 tbl, 7 ex

Description

Translated fromRussian

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLINK TO SEQUENCE LISTING

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ посредством ссылки.The present application contains a sequence listing in machine readable form, which is incorporated herein by reference.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение относится к вариантам липазы, полинуклеотидам, кодирующим варианты, а также способам получения указанных вариантов. Настоящее изобретение также относится к композициям, и композициям в виде микрокапсул, содержащим вариант липазы по настоящему изобретению, и жидким продуктам, содержащим композицию в виде микрокапсул по настоящему изобретению.The present invention relates to lipase variants, polynucleotides encoding variants, as well as methods for obtaining these variants. The present invention also relates to compositions and microcapsule compositions containing the lipase variant of the present invention and liquid products containing the microcapsule composition of the present invention.

Описание уровня техникиDescription of the prior art

Липазы представляют собой важные биокатализаторы, которые, как было показано, являются пригодными для различных путей применения. ЛипазаThermomyces lanuginosus дикого типа (синонимHumicola lanuginosa), продаваемая под торговым названием LIPOLASE™, и ее варианты коммерчески применимы в качестве активного ингредиента в моющих композициях для удаления жирных пятен путем гидролизования триглицеридов с образованием жирных кислот.Lipases are important biocatalysts that have been shown to be useful in a variety of applications. Wild type Thermomyceslanuginosus lipase (syn. Humicola lanuginosa ) sold under the trade name LIPOLASE™ and variants thereof are commercially useful as an active ingredient in detergent compositions for removing grease stains by hydrolyzing triglycerides to form fatty acids.

Композиции моющих, чистящих средств и/или средств для ухода за тканью содержат активные ингредиенты, которые препятствуют способности липаз удалять жирные пятна. Множество известных вариантов липазыThermomyces lanuginosus с хорошей моющей эффективностью образуют жирные кислоты с короткой цепью, образующие запах, во время мытья и/или имеют кратковременную стабильность при хранении.Detergent, cleaning and/or fabric care compositions contain active ingredients that interfere with the ability of lipases to remove grease stains. Many known variants ofThermomyces lanuginosus lipase with good washing performance produce short-chain odor-producing fatty acids during washing and/or have short-term storage stability.

Таким образом, до сих пор существует необходимость и потребность в липазах с улучшенной моющей эффективностью, сниженной степенью образования запаха и/или улучшенной стабильностью при хранении/более длительным сроком годности/повышенной термостабильностью.Thus, there is still a need and desire for lipases with improved cleaning performance, reduced odor generation and/or improved storage stability/longer shelf life/increased thermal stability.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к вариантам исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность на по меньшей мере 60%, но менее чем на 100%, идентична последовательности SEQ ID NO: 2 и предусматривает одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T231R, N233R, T244E и P256T.The present invention relates to variants of the original lipase, while the variant has lipase activity, its sequence is at least 60%, but less than 100%, identical to the sequence of SEQ ID NO: 2 and contains one or more (for example, a number) substitutions in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T231R, N233R, T244E and P256T.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к композициям, содержащим вариант липазы по настоящему изобретению, а также к их применению для гидролиза липидного субстрата. Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим варианты по настоящему изобретению; конструкциям нуклеиновой кислоты, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды.The present invention further relates to compositions containing the lipase variant of the present invention, as well as their use for the hydrolysis of a lipid substrate. In addition, the present invention relates to polynucleotides encoding variants of the present invention; nucleic acid constructs, vectors, and host cells containing polynucleotides.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям в виде микрокапсул, где мембрана микрокапсулы получена путем сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 1 кДа, при этом микрокапсула содержит вариант липазы по настоящему изобретению.In one aspect, the present invention relates to microcapsule compositions wherein the microcapsule membrane is obtained by cross-linking a polybranched polyamine with a molecular weight greater than 1 kDa, wherein the microcapsule contains a lipase variant of the present invention.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композициям в виде микрокапсул, содержащим вариант липазы по настоящему изобретению, заключенный в камеру, образованную мембраной, причем эта мембрана получена путем сшивания (a) полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 800 Да и (b) алифатического или ароматического амина с молекулярным весом менее 300 Да; при этом весовое соотношение (a)/(b) находится в диапазоне от 0,1 до 1000.In a further aspect, the present invention relates to microcapsule compositions comprising a lipase variant of the present invention enclosed in a chamber formed by a membrane, the membrane being obtained by cross-linking (a) a polybranched polyamine with a molecular weight greater than 800 Da and (b) an aliphatic or aromatic an amine with a molecular weight of less than 300 Da; while the weight ratio (a)/(b) is in the range from 0.1 to 1000.

Наконец, настоящее изобретение относится к жидким продуктам, содержащим композицию в виде микрокапсул по настоящему изобретению.Finally, the present invention relates to liquid products containing the microcapsule composition of the present invention.

ОПРЕДЕЛЕНИЯDEFINITIONS

Липаза. Выражения "липаза", "фермент липаза", "липолитический фермент", "эстераза липидов", "липолитический полипептид" и "липолитический белок" относятся к ферменту класса EC3.1.1, как определено Номенклатурой Ферментов. Он может характеризоваться липазной активностью (триацилглицеринлипазы, EC3.1.1.3), активностью кутиназы (EC3.1.1.74), активностью стеринэстеразы (EC3.1.1.13) и/или активностью гидролазы воска-сложных эфиров (EC3.1.1.50). В контексте настоящего изобретения липазную активность определяют в соответствии с процедурой, описанной в примерах. В одном аспекте варианты по настоящему изобретению обладают по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% липазной активности полипептида SEQ ID NO: 2.Lipase. The expressions "lipase", "lipase enzyme", "lipolytic enzyme", "lipid esterase", "lipolytic polypeptide" and "lipolytic protein" refer to an enzyme of class EC3.1.1 as defined by the Enzyme Nomenclature. It can be characterized by lipase activity (triacylglycerol lipases, EC3.1.1.3), cutinase activity (EC3.1.1.74), sterol esterase activity (EC3.1.1.13) and/or wax ester hydrolase activity (EC3.1.1.50) . In the context of the present invention, lipase activity is determined in accordance with the procedure described in the examples. In one aspect, the variants of the present invention have at least 20%, for example, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50 %, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% or 100% of the lipase activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 2.

Аллельный вариант. Выражение "аллельный вариант" означает любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельное разнообразие возникает в естественных условиях вследствие мутации и может приводить в результате к полиморфизму в пределах популяций. Генные мутации могут быть молчащими (без изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды с измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.allelic variant. The expression "allelic variant" means any of two or more alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. Allelic diversity occurs naturally due to mutation and can result in polymorphism within populations. Gene mutations may be silent (no change in the encoded polypeptide) or may encode polypeptides with altered amino acid sequences. An allelic variant of a polypeptide is a polypeptide encoded by an allelic variant of a gene.

кДНК. Выражение "кДНК" означает молекулу ДНК, которую можно получить посредством обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической или прокариотической клетки. В кДНК отсутствуют последовательности интронов, которые могут присутствовать в соответствующей геномной ДНК. Исходный, первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, который подвергается процессингу в ходе ряда стадий, в том числе сплайсинга, до того, как станет зрелой сплайсированной мРНК.cDNA. The expression "cDNA" means a DNA molecule that can be obtained by reverse transcription from a mature spliced mRNA molecule derived from a eukaryotic or prokaryotic cell. The cDNA lacks intron sequences that may be present in the corresponding genomic DNA. The original, primary RNA transcript is an mRNA precursor that undergoes processing through a series of steps, including splicing, before becoming a mature spliced mRNA.

Кодирующая последовательность. Выражение "кодирующая последовательность" означает полинуклеотид, который прямо определяет аминокислотную последовательность варианта. Границы кодирующей последовательности обычно определяются открытой рамкой считывания, которая начинается со стартового кодона, такого как ATG, GTG или TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG или TGA. Кодирующая последовательность может представлять собой геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК или их сочетание.coding sequence. The expression "coding sequence" means a polynucleotide that directly defines the amino acid sequence of a variant. The boundaries of a coding sequence are usually defined by an open reading frame that starts with a start codon, such as ATG, GTG, or TTG, and ends with a stop codon, such as TAA, TAG, or TGA. The coding sequence may be genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, or a combination thereof.

Управляющие последовательности. Выражение "управляющие последовательности" означает последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению. Каждая управляющая последовательность может быть нативной (т. е. из того же гена) или чужеродной (т. е. из другого гена) относительно полинуклеотида, кодирующего вариант, или нативной или чужеродной относительно другой таковой. Такие управляющие последовательности включают, без ограничения, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Как минимум, управляющие последовательности включают в себя промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. В управляющих последовательностях могут быть предусмотрены линкеры с целью введения специфических сайтов рестрикции, способствующих лигированию управляющих последовательностей с кодирующим участком полинуклеотида, кодирующего вариант.Control sequences. The expression "control sequences" means nucleic acid sequences necessary for the expression of a polynucleotide encoding a variant of the present invention. Each control sequence may be native (ie, from the same gene) or foreign (ie, from a different gene) relative to the polynucleotide encoding the variant, or native or foreign to another. Such control sequences include, without limitation, a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence, and a transcription terminator. At a minimum, control sequences include a promoter and transcriptional and translational stop signals. Linkers may be provided in the control sequences to introduce specific restriction sites to facilitate ligation of the control sequences to the coding region of the polynucleotide encoding the variant.

Экспрессия. Выражение "экспрессия" включает любой этап, задействованный в продуцировании варианта, в том числе без ограничения транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.Expression. The expression "expression" includes any step involved in the production of a variant, including, without limitation, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.

Вектор экспрессии. Выражение "вектор экспрессии" означает линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, и функционально связана с управляющими последовательностями, которые обеспечивают ее экспрессию.Expression vector. The expression "expression vector" means a linear or circular DNA molecule that contains a polynucleotide encoding a variant and is operably linked to control sequences that allow its expression.

Фрагмент. Выражение "фрагмент" означает полипептид, у которого отсутствуют одна или несколько (например, некоторое количество) аминокислот с амино и/или карбоксильного конца полипептида; причем фрагмент обладает липазной активностью. В одном аспекте фрагмент содержит по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, но менее 100% из числа аминокислот 1-269 SEQ ID NO: 2.Fragment. The expression "fragment" means a polypeptide that lacks one or more (eg, some) amino acids from the amino and/or carboxyl terminus of the polypeptide; moreover, the fragment has lipase activity. In one aspect, the fragment contains at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% but less than 100% of amino acids 1-269 of SEQ ID NO: 2.

Условия высокой жесткости. Выражение "условия высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 65°C.conditions of high severity. The expression "high stringency conditions" means, for probes of at least 100 nucleotides in length, pre-hybridization and hybridization at 42° C. in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/ml cut and denatured DNA from salmon milt and 50% formamide according to with standard Southern blot procedures within 12-24 hours. The carrier material is finally washed three times, each time for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 65°C.

Клетка-хозяин. Выражение "клетка-хозяин" означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции или подобным процедурам с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. Выражение "клетка-хозяин" охватывает любого потомка родительской клетки, который не является идентичным родительской клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации.Host cell. The expression "host cell" means any cell type that is susceptible to transformation, transfection, transduction, or similar procedures using a nucleic acid construct or expression vector containing a polynucleotide of the present invention. The term "host cell" encompasses any descendant of a parent cell that is not identical to the parent cell due to mutations that occur during replication.

Улучшенное свойство. Выражение "улучшенное свойство" означает характеристику, связанную с вариантом, которая является улучшенной в сравнении с исходной липазой. Такие улучшенные свойства включают без ограничения стабильность моющего средства, стабильность в моющем средстве в присутствии протеазы, стабильность протеазы, химическую стабильность, стабильность к окислению, pH-стабильность, стабильность в условиях хранения и термостабильность.Improved property. The expression "improved property" means a characteristic associated with a variant that is improved over the parent lipase. Such improved properties include, without limitation, detergent stability, protease stability in detergent, protease stability, chemical stability, oxidation stability, pH stability, storage stability, and thermal stability.

Выделенный. Выражение "выделенный" означает вещество в форме или в окружении, которые не встречаются в естественных условиях. Неограничивающие примеры выделенных веществ включают в себя (1) любое не встречающееся в естественных условиях вещество, (2) любое вещество, в том числе без ограничения любой фермент, вариант, нуклеиновую кислоту, белок, пептид или кофактор, которые по меньшей мере частично отделены от одной, или нескольких, или всех встречающихся в естественных условиях составляющих, с которыми они связаны в естественных условиях; (3) любое вещество, модифицированное человеком, по сравнению с таким веществом, встречающимся в природе; или (4) любое вещество, модифицированное путем увеличения количества вещества по сравнению с другими компонентами, с которыми оно связано в естественных условиях (например, несколько копий гена, кодирующего вещество; применение более сильного промотора, чем промотор, связанный в естественных условиях с геном, кодирующим вещество). Выделенное вещество может присутствовать в образце ферментативного бульона.Dedicated. The term "isolated" means a substance in a form or environment that does not occur naturally. Non-limiting examples of isolated substances include (1) any non-naturally occurring substance, (2) any substance, including without limitation any enzyme, variant, nucleic acid, protein, peptide, or cofactor that is at least partially separated from one, or more, or all of the naturally occurring constituents with which they are naturally associated; (3) any human-modified substance as compared to such a naturally occurring substance; or (4) any substance modified by increasing the amount of the substance compared to other components with which it is naturally associated (for example, multiple copies of the gene encoding the substance; the use of a stronger promoter than the promoter naturally associated with the gene, coding substance). The isolated substance may be present in the fermentation broth sample.

Условия низкой жесткости. Выражение "условия низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 50°C.Low severity conditions. The expression "low stringency conditions" means, for probes of at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42°C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/ml cut and denatured DNA from salmon milt and 25% formamide according to with standard Southern blot procedures within 12-24 hours. The carrier material is finally washed three times, each time for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 50°C.

Зрелый полипептид. Выражение "зрелый полипептид" означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т. д. В одном аспекте зрелый полипептид образован аминокислотами 1-269 SEQ ID NO: 2. В данной области техники известно, что клетка-хозяин может продуцировать смесь двух или более различных зрелых полипептидов (т. е. с различными C-концевыми и/или N-концевыми аминокислотами), экспрессируемых одним и тем же полинуклеотидом.mature polypeptide. The expression "mature polypeptide" means a polypeptide in its final form after translation and any post-translational modifications such as N-terminal processing, C-terminal truncation, glycosylation, phosphorylation, etc. In one aspect, a mature polypeptide is formed by amino acids 1-269 SEQ ID NO: 2. It is known in the art that a host cell can produce a mixture of two or more different mature polypeptides (i.e., with different C-terminal and/or N-terminal amino acids) expressed by the same polynucleotide .

Последовательность, кодирующая зрелый полипептид. Выражение "последовательность, кодирующая зрелый полипептид" означает полинуклеотид, который кодирует зрелый полипептид, обладающий липазной активностью. В одном аспекте последовательность, кодирующая зрелый полипептид, образована нуклеотидами 1-807 SEQ ID NO: 1.The sequence encoding the mature polypeptide. The term "sequence encoding a mature polypeptide" means a polynucleotide that encodes a mature polypeptide having lipase activity. In one aspect, the mature polypeptide coding sequence is formed from nucleotides 1-807 of SEQ ID NO: 1.

Условия умеренной жесткости. Выражение "условия умеренной жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 55°C.Conditions of moderate hardness. The term "moderate stringency conditions" means, for probes of at least 100 nucleotides in length, pre-hybridization and hybridization at 42° C. in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/ml cut and denatured DNA from salmon milt and 35% formamide according to with standard Southern blot procedures within 12-24 hours. The carrier material is finally washed three times, each time for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 55°C.

Условия умеренно высокой жесткости. Выражение "условия умеренно высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 35% формамиде в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 60°C.Conditions of moderately high rigidity. The term "moderately stringent conditions" means, for probes of at least 100 nucleotides in length, pre-hybridization and hybridization at 42° C. in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/mL cut and denatured DNA from salmon milt, and 35% formamide in according to standard Southern blotting procedures within 12-24 hours. The carrier material is finally washed three times, each time for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 60°C.

Мутант. Выражение "мутант" означает полинуклеотид, кодирующий вариант.Mutant. The expression "mutant" means a polynucleotide encoding a variant.

Конструкция нуклеиновой кислоты. Выражение "конструкция нуклеиновой кислоты" означает одно- или двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, выделенную из встречающегося в естественных условиях гена, или модифицированную с тем, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот в таком порядке, который в иных случаях не может существовать в естественных условиях, или являющуюся синтетической, которая содержит одну или несколько управляющих последовательностей.The structure of the nucleic acid. The term "nucleic acid construct" means a single- or double-stranded nucleic acid molecule isolated from a naturally occurring gene, or modified to contain nucleic acid segments in an order that would not otherwise occur naturally, or being synthetic, which contains one or more control sequences.

Функционально связанный. Выражение "функционально связанный" означает конфигурацию, в которой управляющая последовательность размещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотида так, что управляющая последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности.Functionally related. The expression "operably linked" means a configuration in which the control sequence is placed at an appropriate position relative to the coding sequence of the polynucleotide such that the control sequence controls the expression of the coding sequence.

Исходная форма или исходная липаза. Выражение "исходная форма" или "исходная липаза" означает липазу, которая может быть изменена для получения вариантов фермента по настоящему изобретению. Исходная липаза может представлять собой встречающийся в естественных условиях полипептид (дикого типа) или его вариант или фрагмент.The original form or original lipase. The expression "original form" or "original lipase" means a lipase that can be modified to obtain variants of the enzyme of the present invention. The parent lipase may be a naturally occurring polypeptide (wild type) or a variant or fragment thereof.

Идентичность последовательностей. Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром "идентичность последовательностей".Sequence identity. The relationship between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences is described by the parameter "sequence identity".

В контексте настоящего изобретения идентичность последовательностей для двух аминокислотных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al., 2000,Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продолжение гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, помеченные как "наиболее длинный идентичный участок" (полученные с применением опции - nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:In the context of the present invention, sequence identity for two amino acid sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. 48: 443-453), which is implemented in the Needle program from the EMBOSS software package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al. , 2000,Trends Genet. 16: 276-277), preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are the gap opening penalty of 10, the gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 replacement matrix (EMBOSS version of BLOSUM62). The Needle output labeled "longest identical span" (obtained using the -nobrief option) is used as percent identity and is calculated as follows:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).(identical residuals x 100)/(length of the align section - total number of gaps in the align section).

В контексте настоящего изобретения идентичность последовательностей для двух последовательностей дезоксирибонуклеотидов определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), который реализован в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, помеченные как "наиболее длинный идентичный участок" (полученные с применением опции - nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:In the context of the present invention, sequence identity for two deoxyribonucleotide sequences is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, supra), which is implemented in the Needle program from the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000, supra), preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are the gap opening penalty of 10, the gap extension penalty of 0.5, and the EDNAFULL replacement matrix (NCBI NUC4.4 version for EMBOSS). The Needle output labeled "longest identical span" (obtained using the -nobrief option) is used as percent identity and is calculated as follows:

(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).(identical deoxyribonucleotides x 100)/(length of alignment region - total number of gaps in alignment region).

Стабильность. Стабильность варианта липазы по настоящему изобретению может быть выражена как остаточная активность или остаточная эффективность указанной липазы в течение или после воздействия различных условий испытания, как, например, хранение в моющей композиции, при различных температурах, при различных pH, в присутствии разных компонентов, таких как протеаза, химические вещества и/или окислительные вещества (стрессогенные условия), или во время использования в процессе мытья. Стабильность варианта липазы можно измерить относительно известной активности или эффективности исходной липазы, например липазы, показанной под SEQ ID NO: 2, или, в качестве альтернативы, относительно известной активности или эффективности варианта липазы, если его изначально добавляли в моющую композицию, необязательно хранящуюся охлажденной или замороженной, или относительно варианта липазы, хранящегося охлажденным или замороженным (нестрессогенные условия).Stability. The stability of a lipase variant of the present invention can be expressed as the residual activity or residual effectiveness of said lipase during or after exposure to various test conditions, such as storage in a detergent composition, at various temperatures, at various pH, in the presence of various components, such as protease, chemicals and/or oxidizing agents (stressful conditions), or during use in the washing process. The stability of a lipase variant can be measured against the known activity or potency of the parent lipase, e.g. the lipase shown under SEQ ID NO: 2, or alternatively against the known activity or potency of the lipase variant if it was originally added to the detergent composition, optionally stored refrigerated or frozen, or relative to the lipase variant stored refrigerated or frozen (non-stress conditions).

Подпоследовательность. Выражение "подпоследовательность" означает полинуклеотид, у которого отсутствуют один или несколько (например, некоторое количество) нуклеотидов с 5' и/или 3' конца кодирующей последовательности зрелого полипептида; причем подпоследовательность кодирует фрагмент, обладающий липазной активностью. В одном аспекте подпоследовательность содержит по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95%, но менее 100% из числа нуклеотидов 1-807 SEQ ID NO: 1.Subsequence. The expression "subsequence" means a polynucleotide that lacks one or more (eg, a number) of nucleotides from the 5' and/or 3' end of the coding sequence of the Mature polypeptide; wherein the subsequence encodes a fragment having lipase activity. In one aspect, the subsequence contains at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% but less than 100% of nucleotides 1-807 of SEQ ID NO: 1.

Вариант. Выражение "вариант" означает полипептид, обладающий липазной активностью, содержащий изменение, т. е. замену, вставку и/или делецию в одном или нескольких (например, некотором количестве) положениях. Замена означает замещение аминокислоты, занимающей определенное положение, другой аминокислотой; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей определенное положение; а вставка означает добавление аминокислоты рядом с и непосредственно после аминокислоты, занимающей определенное положение. Варианты по настоящему изобретению обладают по меньшей мере 20%, например, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 100% липазной активности полипептида SEQ ID NO: 2.Option. The expression "variant" means a polypeptide having lipase activity containing a change, ie, a substitution, insertion and/or deletion at one or more (eg, a certain number) positions. Substitution means the substitution of an amino acid occupying a particular position with another amino acid; deletion means the removal of an amino acid occupying a certain position; and insertion means the addition of an amino acid next to and immediately after the amino acid in a particular position. The embodiments of the present invention have at least 20%, for example, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95% or at least 100% of the lipase activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 2.

Условия очень высокой жесткости. Выражение "условия очень высокой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 50% формамиде в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 70°C.Very harsh conditions. The expression "very stringent conditions" means, for probes of at least 100 nucleotides in length, pre-hybridization and hybridization at 42°C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/ml cut and denatured DNA from salmon milt and 50% formamide in according to standard Southern blotting procedures within 12-24 hours. The carrier material is finally washed three times, each time for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 70°C.

Условия очень низкой жесткости. Выражение "условия очень низкой жесткости" означает для зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов предварительную гибридизацию и гибридизацию при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 микрограммах/мл разрезанной и денатурированной ДНК из молок лососевых и 25% формамиде в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-блоттинга в течение 12-24 часов. Материал-носитель в заключение промывают три раза, каждый раз в течение 15 минут с применением 2X SSC, 0,2% SDS при 45°C.Very low severity conditions. The expression "very low stringency conditions" means, for probes of at least 100 nucleotides in length, prehybridization and hybridization at 42°C in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 micrograms/ml cut and denatured DNA from salmon milt and 25% formamide in according to standard Southern blotting procedures within 12-24 hours. The carrier material is finally washed three times, each time for 15 minutes using 2X SSC, 0.2% SDS at 45°C.

Липаза дикого типа. Выражение липаза “дикого типа” означает липазу, экспрессируемую встречающимся в естественных условиях микроорганизмом, таким как бактерия, дрожжи или нитчатый гриб, обнаруживаемые в природе.Wild-type lipase. The expression "wild-type" lipase means a lipase expressed by a naturally occurring microorganism such as a bacterium, yeast or filamentous fungus found in nature.

Условные обозначения для указания вариантовConventions to indicate options

В контексте настоящего изобретения полипептид, раскрытый под SEQ ID NO: 2, применяется для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой липазе. Аминокислотную последовательность другой липазы выравнивают с SEQ ID NO: 2, и на основании выравнивания номер положения аминокислоты, соответствующий любому аминокислотному остатку в полипептиде, раскрытом в SEQ ID NO: 2, определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al., 2000,Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продолжение гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS).In the context of the present invention, the polypeptide disclosed under SEQ ID NO: 2 is used to determine the corresponding amino acid residue in another lipase. The amino acid sequence of another lipase is aligned with SEQ ID NO: 2, and based on the alignment, the amino acid position number corresponding to any amino acid residue in the polypeptide disclosed in SEQ ID NO: 2 is determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970,J Mol. Biol. 48: 443-453), which is implemented in the Needle program from the EMBOSS software package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al. , 2000,Trends Genet. 16: 276-277), preferably version 5.0.0 or later. The parameters used are the gap opening penalty of 10, the gap extension penalty of 0.5, and the EBLOSUM62 replacement matrix (EMBOSS version of BLOSUM62).

Идентификацию соответствующего аминокислотного остатка в другой липазе можно определить путем выравнивания последовательностей нескольких полипептидов с использованием нескольких компьютерных программ, в том числе без ограничения MUSCLE (сравнение нескольких последовательностей по log‐ожиданию; версия 3.5 или более поздняя; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (версия 6.857 или более поздняя; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katohet al., 2009,Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010,Bioinformatics 26: 1899-1900) и EMBOSS EMMA, в которой применяется ClustalW (1.83 или более поздняя; Thompsonet al., 1994,Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), с применением их соответствующих параметров по умолчанию.The identification of the corresponding amino acid residue in another lipase can be determined by aligning the sequences of several polypeptides using several computer programs, including but not limited to MUSCLE (Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation; version 3.5 or later; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (version 6.857 or later; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katohet al. , 2009,Methods in Molecular Biology537: 39-64 ; Katoh and Toh, 2010,Bioinformatics26: 1899-1900 ) and EMBOSS EMMA, which uses ClustalW (1.83 or later ; Thompsonet al. , 1994,Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), using their respective default settings.

Если другой фермент отличается от полипептида SEQ ID NO: 2 так, что с помощью традиционного сравнения на основании последовательностей невозможно обнаружить их родство (Lindahl and Elofsson, 2000,J. Mol. Biol. 295: 613-615), можно применять другие алгоритмы попарного сравнения последовательностей. Большей чувствительности поиска на основании последовательности можно достичь с применением программ поиска, которые применяют вероятностные представления семейств полипептидов (профилей) для поиска по базам данных. Например, программа PSI-BLAST создает профили посредством итеративного процесса поиска по базам данных и способна обнаруживать отдаленные гомологи (Atschulet al., 1997,Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Еще большей чувствительности можно достичь, если семейство или суперсемейство для данного полипептида имеет одного или несколько представителей в базах данных структуры белков. Программы, например GenTHREADER (Jones, 1999,J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881), используют информацию из ряда источников (PSI-BLAST, данные прогнозирования вторичной структуры, профили структурного выравнивания и потенциалы сольватации) в качестве данных, вводимых в нейронную сеть, с помощью которой предсказывают структурную укладку запрашиваемой последовательности. Подобным образом, способ по Goughet al., 2000,J. Mol. Biol. 313: 903-919, можно применять для выравнивания последовательности с неизвестной структурой с моделями суперсемейств, присутствующими в базе данных SCOP. Эти выравнивания можно, в свою очередь, применять для создания моделей гомологии для полипептида, и точность таких моделей можно оценивать с помощью ряда инструментов, разработанных для этой цели.If another enzyme differs from the polypeptide of SEQ ID NO: 2 in such a way that conventional sequence-based comparison cannot detect their relationship (Lindahl and Elofsson, 2000,J. Mol. Biol. 295: 613-615), other pairwise algorithms can be used. sequence comparisons. Greater sensitivity of sequence-based searches can be achieved using search programs that use probabilistic representations of polypeptide families (profiles) to search databases. For example, the PSI-BLAST program creates profiles through an iterative database search process and is able to detect distant homologues (Atschulet al. , 1997,Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Even greater sensitivity can be achieved if the family or superfamily for a given polypeptide has one or more members in protein structure databases. Programs such as GenTHREADER (Jones, 1999,J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) use information from a number of sources (PSI-BLAST, secondary structure prediction data, structural alignment profiles and solvation potentials) as input to a neural network that predicts the structural folding of the requested sequence. Similarly, the method of Goughet al. , 2000,J. Mol. Biol. 313: 903-919 can be used to align a sequence of unknown structure with superfamily models present in the SCOP database. These alignments can in turn be used to generate homology models for the polypeptide, and the accuracy of such models can be assessed using a number of tools designed for this purpose.

Для белков с известной структурой доступны несколько инструментов и ресурсы для отыскания и создания структурных выравниваний. Например, суперсемейства белков в SCOP были выравнены по структуре, и результаты этих выравниваний находятся в открытом доступе, а также доступны для загрузки. Структуры двух или более белков можно выравнять с применением ряда алгоритмов, таких как выравнивание на основе матрицы расстояний (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) или комбинаторного удлинения (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), и выполнение этих алгоритмов можно дополнительно применять для составления запросов по представляющей интерес структуре в базах данных структуры с целью нахождения возможных структурных гомологов (например, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).For proteins with a known structure, several tools and resources are available for finding and creating structural alignments. For example, the protein superfamilies in SCOP have been structurally aligned and the results of these alignments are publicly available and also available for download. The structures of two or more proteins can be aligned using a number of algorithms such as distance matrix alignment (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) or combinatorial extension (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747 ), and the execution of these algorithms can further be used to query the structure of interest against structure databases to find possible structural homologues (eg, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

При описании вариантов по настоящему изобретению описанная ниже номенклатура адаптирована для простоты упоминания. Используется принятое IUPAC однобуквенное или трехбуквенное сокращение для аминокислот.In describing embodiments of the present invention, the nomenclature described below has been adapted for ease of reference. The IUPAC accepted one-letter or three-letter abbreviation for amino acids is used.

Замены. В отношении аминокислотной замены применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, заменяющая аминокислота. Соответственно, замена треонина в положении 226 на аланин обозначается как "Thr226Ala" или "T226A". Несколько мутаций разделяют знаками сложения ("+"), например, "Gly205Arg+Ser411Phe" или "G205R+S411F" представляют замены в положениях 205 и 411 глицина (G) на аргинин (R) и серина (S) на фенилаланин (F), соответственно.Replacements. For amino acid substitutions, the following nomenclature applies: parent amino acid, position replacing amino acid. Accordingly, the replacement of a threonine at position 226 with an alanine is referred to as "Thr226Ala" or "T226A". Several mutations are separated by addition signs ("+"), for example, "Gly205Arg+Ser411Phe" or "G205R+S411F" represent substitutions at positions 205 and 411 of glycine (G) for arginine (R) and serine (S) for phenylalanine (F) , respectively.

Делеции. В отношении делеции аминокислоты применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно, делеция глицина в положении 195 обозначается как "Gly195*" или "G195*". Несколько делеций разделяют знаками сложения ("+"), например, "Gly195* + Ser411*" или "G195* + S411*".Deletions. The following nomenclature applies to an amino acid deletion: original amino acid, position, *. Accordingly, a glycine deletion at position 195 is referred to as "Gly195*" or "G195*". Multiple deletions are separated by addition signs ("+"), for example "Gly195* + Ser411*" or "G195* + S411*".

Вставки. В отношении вставки аминокислоты применяется следующая номенклатура: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, вставка лизина после глицина в положении 195 обозначается "Gly195GlyLys" или "G195GK". Вставку нескольких аминокислот обозначают [исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота № 1, вставленная аминокислота № 2 и т. д]. Например, вставка лизина и аланина после глицина в положении 195 обозначается как "Gly195GlyLysAla" или "G195GKA".Inserts. With respect to amino acid insertion, the following nomenclature applies: original amino acid, position, original amino acid, inserted amino acid. Accordingly, the insertion of a lysine after the glycine at position 195 is designated "Gly195GlyLys" or "G195GK". An insertion of several amino acids is referred to as [original amino acid, position, original amino acid, inserted amino acid #1, inserted amino acid #2, etc.]. For example, the insertion of lysine and alanine after the glycine at position 195 is referred to as "Gly195GlyLysAla" or "G195GKA".

В таких случаях вставленный(ые) аминокислотный(ые) остаток(и) нумеруют путем добавления строчных букв к номеру положения аминокислотного остатка, предшествующего вставленному(ым) аминокислотному(ым) остатку(ам). Следовательно, в вышеуказанном примере последовательность будет иметь следующий вид.In such cases, the inserted(s) amino acid(s) residue(s) are numbered by adding lower case letters to the position number of the amino acid residue preceding the inserted(s) amino acid(s) residue(s). Therefore, in the above example, the sequence would be as follows.

Исходная форма:Initial form:Вариант:Option:195195195 195a 195b195 195a 195b G GG - K - AG-K-A

Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения, разделяют знаками сложения ("+"), например, "Arg170Tyr+Gly195Glu" или "R170Y+G195E" представляют замену аргинина и глицина в положениях 170 и 195 на тирозин и глутаминовую кислоту, соответственно.Multiple changes. Variants containing multiple changes are separated by addition signs ("+"), for example, "Arg170Tyr+Gly195Glu" or "R170Y+G195E" represent the replacement of arginine and glycine at positions 170 and 195 with tyrosine and glutamic acid, respectively.

Разные изменения. Когда различные изменения могут вводиться в какое-либо положение, различные изменения разделяют запятой,например, "Arg170Tyr, Glu" или "R170Y, E" представляет замену аргинина в положении 170 на тирозин или глутаминовую кислоту. Следовательно, "Tyr167Gly, Ala+Arg170Gly, Ala" обозначает следующие варианты:Miscellaneous changes. When different changes can be introduced at any position, the different changes are separated by a comma,for example "Arg170Tyr, Glu" or "R170Y, E" represents the replacement of arginine at position 170 with tyrosine or glutamic acid. Therefore, "Tyr167Gly, Ala+Arg170Gly, Ala" means the following options:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" и "Tyr167Ala+Arg170Ala"."Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" and "Tyr167Ala+Arg170Ala".

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Раскрыты варианты исходной липазы, при этом варианты обладают липазной активностью, их последовательности на по меньшей мере 60%, но менее чем на 100%, идентичны SEQ ID NO: 2, например, полученной изThermomyces lanuginosus.Variants of the original lipase are disclosed, wherein the variants have lipase activity, their sequences are at least 60% but less than 100% identical to SEQ ID NO: 2, for example, obtained fromThermomyces lanuginosus .

ВариантыOptions

Настоящее изобретение предусматривает вариант исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность на по меньшей мере 60%, но менее чем на 100%, идентична последовательности SEQ ID NO: 2 и предусматривает одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T231R, N233R, T244E, и P256T.The present invention provides a variant of the parent lipase, wherein the variant has lipase activity, is at least 60% but less than 100% sequence identical to SEQ ID NO: 2, and includes one or more (e.g., a number) substitutions in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T231R, N233R, T244E, and P256T.

Предпочтительно вариант липазы на по меньшей мере 60%, но менее чем на 100%, идентичен последовательности SEQ ID NO: 2 и предусматривает одну или несколько замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, и P256T. Предпочтительно вариант дополнительно содержит одну или обе замены в положениях, соответствующих T231R и/или N233R.Preferably, the lipase variant is at least 60% but less than 100% identical to the sequence of SEQ ID NO: 2 and contains one or more substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, and P256T. Preferably, the variant further comprises one or both substitutions at positions corresponding to T231R and/or N233R.

Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем G23S. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем D27N. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем A40l. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем F51I, L. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем E56R. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем D57N. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем V60E, K. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем K98I. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем N101D. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем R118F. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем G163S. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем Y220F. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем T244E. Предпочтительный вариант предусматривает замену в положении, соответствующем P256T.The preferred option is to replace in a G23S position. The preferred option is to replace in position corresponding to D27N. The preferred option is to replace in a position corresponding to A40l. The preferred option is to replace at the F51I, L position. The preferred option is to replace at the E56R position. The preferred option is to replace in position corresponding to D57N. The preferred option is to replace at the V60E, K position. The preferred option is to replace at the K98I position. The preferred option is to replace in a position corresponding to N101D. The preferred option is to replace in a position corresponding to R118F. The preferred option is to replace in a position corresponding to G163S. The preferred option is to replace in a Y220F position. The preferred option is to replace in a position corresponding to T244E. The preferred option is to replace in a P256T position.

Предпочтительный вариант предусматривает одну или несколько замен в положениях, соответствующих F51I, L, E56R и/или R118F.The preferred embodiment includes one or more substitutions at positions corresponding to F51I, L, E56R and/or R118F.

В предпочтительном варианте осуществления вариант по настоящему изобретению предусматривает любой из следующих наборов замен:In a preferred embodiment, an embodiment of the present invention provides for any of the following sets of substitutions:

G23S+T231R+N233R;G23S+T231R+N233R;

D27N+T231R+N233R;D27N+T231R+N233R;

A40I+T231R+N233R;A40I+T231R+N233R;

F51I+T231R+N233R;F51I+T231R+N233R;

F51L+T231R+N233R;F51L+T231R+N233R;

E56R+T231R+N233R;E56R+T231R+N233R;

D57N+T231R+N233R;D57N+T231R+N233R;

V60E+T231R+N233R;V60E+T231R+N233R;

V60K+T231R+N233R;V60K+T231R+N233R;

K98I+T231R+N233R;K98I+T231R+N233R;

N101D+T231R+N233R;N101D+T231R+N233R;

R118F+T231R+N233R;R118F+T231R+N233R;

G163S+T231R+N233R;G163S+T231R+N233R;

Y220F+T231R+N233R;Y220F+T231R+N233R;

T231R+N233R+T244E;T231R+N233R+T244E;

T231R+N233R+P256T.T231R+N233R+P256T.

В одном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, и P256T.In one embodiment, the variant provides for substitutions at positions corresponding to T231R+N233R and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

В предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены, соответствующие E56R+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, и P256T.In a preferred embodiment, the variant provides substitutions corresponding to E56R+T231R+N233R and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

В предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, и P256T.In a preferred embodiment, the embodiment includes substitutions at positions corresponding to R118F+T231R+N233R and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

В более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, и P256T.In a more preferred embodiment, the embodiment includes substitutions at positions corresponding to E56R+R118F+T231R+N233R and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K , K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

В еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In an even more preferred embodiment, the embodiment includes substitutions at positions corresponding to E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example, a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.In an even more preferred embodiment, the embodiment includes substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R, and one or more (for example, a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E and P256T.

В еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In an even more preferred embodiment, the embodiment includes substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example, a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В другом более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих G23S+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, и P256T.In another more preferred embodiment, the variant provides for substitutions at positions corresponding to G23S+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R, and one or more (for example, a number) substitutions at positions corresponding to D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих D27N+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In a further even more preferred embodiment, the variant provides for substitutions at positions corresponding to D27N+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, A40I, D57N , V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих A40I+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E и P256T.In a further even more preferred embodiment, the embodiment provides for substitutions at positions corresponding to A40I+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, D57N, V60E , K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E and P256T.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих D27N+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In a further even more preferred embodiment, the variant provides for substitutions at positions corresponding to D27N+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, A40I, D57N , V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих A40I+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In a further even more preferred embodiment, the variant provides substitutions at positions corresponding to A40I+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, D57N , V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In a further even more preferred embodiment, the embodiment provides substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I , V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, G163S, Y220F, и T244E. В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60EK, N101D, Y220F, и T244E.In further preferred embodiments, the embodiment provides for substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I , V60E, K, N101D, G163S, Y220F, and T244E. In a further even more preferred embodiment, the embodiment provides substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S , D27N, A40I, V60EK, N101D, Y220F, and T244E.

В дополнительном еще более предпочтительном варианте осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D и Y220F.In a further even more preferred embodiment, the embodiment provides substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D and Y220F.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In further preferred embodiments, the embodiment provides substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S , D27N, A40I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, G163S, Y220F, и T244E. В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, G163S, Y220F, и T244E.In further preferred embodiments, the embodiment includes substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding G23S, D27N, A40I, G163S, Y220F, and T244E. In further preferred embodiments, the embodiment includes substitutions at positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N , A40I, V60E, K, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

В частности предпочтительные варианты осуществления включают варианты, имеющие замены в положениях, соответствующих одному из следующих наборов замен:Particularly preferred embodiments include variants having substitutions at positions corresponding to one of the following sets of substitutions:

R118F+T231R+N233R+P256T;R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+R118F+T231R+N233R;A40I+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+D57N+R118F+T231R+N233R;E56R+D57N+R118F+T231R+N233R;

E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E:G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E:

G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T.G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T.

Вариант липазы по настоящему изобретению характеризуется последовательностью, которая на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% идентична, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99%, но менее чем на 100%, идентична исходной липазе.The lipase variant of the present invention is characterized by a sequence that is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% , at least 90%, at least 95% identical, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% but less than 100% , identical to the original lipase.

В предпочтительном варианте осуществления вариант по настоящему изобретению характеризуется последовательностью, которая на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% идентична, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99%, но менее чем на 100%, идентична SEQ ID NO: 2. In a preferred embodiment, a variant of the present invention is characterized by a sequence that is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least at least 85%, at least 90%, at least 95% identical, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100% identical to SEQ ID NO: 2.

Вариант по настоящему изобретению может иметь 1-40, 1-30, 1-20, например 1-12, например 1-11, например 1-10, например 1-9, например 1-8, например 1-7, например 1-6, например 1-5, например 1-4, например 1-3 или например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 замен.The variant of the present invention may have 1-40, 1-30, 1-20, such as 1-12, such as 1-11, such as 1-10, such as 1-9, such as 1-8, such as 1-7, such as 1 -6, for example 1-5, for example 1-4, for example 1-3 or for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19, or 20 replacements.

Вариант по настоящему изобретению по сравнению с исходной липазой может иметь одно или несколько из следующих свойств: улучшенная моющая эффективность, сниженная степень образования запаха, улучшенная стабильность при хранении, более длительный срок годности и/или повышенная термостабильность.The variant of the present invention, compared to the parent lipase, may have one or more of the following properties: improved wash performance, reduced odor generation, improved storage stability, longer shelf life, and/or improved thermal stability.

Вариант липазы по настоящему изобретению может дополнительно предусматривать одну или несколько дополнительных замен в одном или нескольких (например, некотором количестве) других положений.The lipase variant of the present invention may further include one or more additional substitutions at one or more (eg, a number) of other positions.

Изменения аминокислот могут быть незначительными, то есть являться консервативными аминокислотными заменами или вставками, которые не оказывают значительного влияния на укладку и/или активность белка; небольшими делециями, как правило, размером 1-30 аминокислот; небольшими удлинениями на амино- или карбокси-конце, такими как метиониновый остаток на амино-конце; небольшим линкерным пептидом размером до 20-25 остатков; или небольшим удлинением, которое облегчает очистку путем изменения суммарного заряда, или другой функциональной группой, такой как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.Amino acid changes may be minor, that is, conservative amino acid substitutions or insertions that do not significantly affect protein folding and/or activity; small deletions, usually 1-30 amino acids in size; small extensions at the amino or carboxy terminus, such as a methionine residue at the amino terminus; a small linker peptide up to 20-25 residues in size; or a slight extension that facilitates purification by changing net charge, or another functional group such as a polyhistidine site, antigenic epitope, or binding domain.

Примерами консервативных замен являются замены в пределах групп основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые в целом не изменяют специфическую активность, известны из уровня техники и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, в The Proteins, Academic Press, New York. Обычные замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.Examples of conservative substitutions are substitutions within the groups of basic amino acids (arginine, lysine and histidine), acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine and valine), aromatic amino acids (phenylalanine , tryptophan and tyrosine) and small amino acids (glycine, alanine, serine, threonine and methionine). Amino acid substitutions that generally do not alter specific activity are known in the art and are described, for example, by H. Neurath and R.L. Hill, 1979, in The Proteins, Academic Press, New York. Common substitutions are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/ Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly.

В качестве альтернативы, изменения аминокислот имеют такую природу, что физико-химические свойства полипептидов изменяются. Например, изменения аминокислот могут улучшать термостабильность полипептида, изменять субстратную специфичность, изменять оптимальное значение pH и т.п.Alternatively, amino acid changes are of such a nature that the physicochemical properties of the polypeptides are changed. For example, amino acid changes can improve the thermostability of a polypeptide, change substrate specificity, change the optimum pH, and the like.

Существенные аминокислоты в полипептиде можно идентифицировать в соответствии с процедурами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последней методике отдельные мутации, заключающиеся в замене на аланин, вводят по каждому остатку в молекуле, и полученные в результате мутантные молекулы исследуют в отношении липазной активности для идентификации аминокислотных остатков, которые являются определяющими для активности молекулы. См. также Hiltonet al., 1996,J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный сайт для ферментативного или другого биологического взаимодействия можно также определить с помощью физического анализа структуры, которую определяют с помощью таких методик, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, дифракция электронов или фотоаффинное мечение в сочетании с мутацией аминокислот предполагаемого контактирующего сайта. См., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smithet al., 1992,J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaveret al., 1992,FEBS Lett. 309: 59-64. Об идентичности существенных аминокислот можно также сделать заключение на основании выравнивания с родственным полипептидом.Essential amino acids in a polypeptide can be identified according to procedures known in the art, such as site-directed mutagenesis or alanine-scanning mutagenesis (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). In the latter technique, individual alanine mutations are introduced at each residue in the molecule, and the resulting mutant molecules are examined for lipase activity to identify amino acid residues that are critical to the activity of the molecule. See also Hiltonet al. , 1996,J. Biol. Chem. 271:4699-4708. The active site for enzymatic or other biological interaction can also be determined by physical analysis of the structure, which is determined using techniques such as nuclear magnetic resonance, crystallography, electron diffraction, or photoaffinity labeling in combination with amino acid mutation of the putative contact site. See, for example, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smithet al. , 1992,J. Mol. Biol. 224:899-904; Wlodaveret al. , 1992,FEBS Lett. 309:59-64. Essential amino acid identity can also be inferred from alignment with a related polypeptide.

Варианты могут состоять из или содержать по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от количества аминокислот из SEQ ID NO: 2.Variants may consist of or contain at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least at least 85%, at least 90%, or at least 95% of the amount of amino acids from SEQ ID NO: 2.

Исходная липазаParent lipase

Исходная липаза может быть выбрана из группы, состоящей из:The parent lipase may be selected from the group consisting of:

a) полипептида, последовательность которого на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% идентична, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 2;a) a polypeptide whose sequence is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least at least 90%, at least 95% identical, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 2;

b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости, условиях средней жесткости, условиях умеренно высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1 или (ii) последовательностью полной длины, комплементарной (i);b) a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under low stringency, medium stringency, moderately high stringency, high stringency, or very high stringency conditions to (i) the polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1 or (ii) the full length sequence , complementary to (i);

c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98%, на по меньшей мере 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 1; иc) a polypeptide encoded by a polynucleotide whose sequence is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% , at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical to SEQ ID NO: one; and

d) фрагмента полипептида SEQ ID NO: 2.d) a polypeptide fragment of SEQ ID NO: 2.

В одном аспекте настоящего изобретения последовательность исходной липазы идентична обладающему липазной активностью полипептиду с SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100%.In one aspect of the present invention, the sequence of the parent lipase is identical to the lipase-active polypeptide of SEQ ID NO: 2 by at least 60%, e.g., at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100%.

В одном аспекте аминокислотная последовательность исходной формы отличается не более чем 40 аминокислотами,например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, или 40 от полипептида с SEQ ID NO: 2.In one aspect, the amino acid sequence of the original form differs by no more than 40 amino acids,e.g. 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40 from the SEQ polypeptide ID NO: 2.

В другом аспекте исходная форма содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.In another aspect, the parent form contains or consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте исходная форма представляет собой фрагмент полипептида SEQ ID NO: 2, содержащий по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от количества аминокислот из SEQ ID NO: 2.In another aspect, the parent form is a polypeptide fragment of SEQ ID NO: 2 containing at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75 %, at least 80%, at least 85%, at least 90%, or at least 95% of the amount of amino acids from SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления исходная форма представляет собой аллельный вариант полипептида SEQ ID NO: 2.In another embodiment, the parent form is an allelic variant of the polypeptide of SEQ ID NO: 2.

В другом аспекте исходная липаза кодируется полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях очень низкой жесткости, условиях низкой жесткости, условиях умеренной жесткости, условиях умеренно высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью полной длины, комплементарной (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).In another aspect, the parent lipase is encoded by a polynucleotide that hybridizes under very low stringency conditions, low stringency conditions, moderate stringency conditions, moderately high stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions to (i) the polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (ii) a full length sequence complementary to (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

Полинуклеотид SEQ ID NO: 1 или его подпоследовательность, а также полипептид SEQ ID NO: 2 или его фрагмент можно использовать для конструирования зондов на основе нуклеиновой кислоты для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей исходную форму у штаммов разных родов или видов, в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. В частности, такие зонды можно применять для гибридизации с геномной ДНК или кДНК представляющей интерес клетки в соответствии со стандартными процедурами Саузерн-блоттинга с целью идентификации и выделения их соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче полной последовательности, но должны иметь длину по меньшей мере 15, например, по меньшей мере 25, по меньшей мере 35 или по меньшей мере 70 нуклеотидов. Зонд на основе нуклеиновой кислоты предпочтительно имеет длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, например, имеет длину по меньшей мере 200 нуклеотидов, по меньшей мере 300 нуклеотидов, по меньшей мере 400 нуклеотидов, по меньшей мере 500 нуклеотидов, по меньшей мере 600 нуклеотидов, по меньшей мере 700 нуклеотидов, по меньшей мере 800 нуклеотидов или по меньшей мере 900 нуклеотидов. Можно применять как ДНК-, так и РНК-зонды. Зонды, как правило, метят для выявления соответствующего гена (например, 32P, 3H, 35S, биотином или авидином). Такие зонды охватываются настоящим изобретением.A polynucleotide of SEQ ID NO: 1 or a subsequence thereof, as well as a polypeptide of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof can be used to construct probes based on nucleic acid for identification and cloning of DNA encoding the original form in strains of different genera or species, in accordance with the methods well known in the art. In particular, such probes can be used to hybridize to the genomic DNA or cDNA of the cell of interest according to standard Southern blot procedures to identify and isolate their respective gene. Such probes can be significantly shorter than the full sequence, but must be at least 15, eg at least 25, at least 35, or at least 70 nucleotides in length. The nucleic acid probe is preferably at least 100 nucleotides in length, e.g., at least 200 nucleotides in length, at least 300 nucleotides in length, at least 400 nucleotides in length, at least 500 nucleotides in length, at least 600 nucleotides in length, at least at least 700 nucleotides, at least 800 nucleotides, or at least 900 nucleotides. Both DNA and RNA probes can be used. Probes are typically labeled to identify the appropriate gene (eg 32P, 3H, 35S, biotin or avidin). Such probes are covered by the present invention.

Библиотеку геномной ДНК или кДНК, полученную из таких прочих штаммов, можно подвергнуть скринингу в отношении ДНК, которая гибридизируется с зондами, описанными выше, и кодирует исходную форму. Геномную или другую ДНК из таких прочих штаммов можно разделить посредством электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или других методик разделения. ДНК из библиотек или разделенную ДНК можно перенести на нитроцеллюлозу или другой подходящий материал-носитель и иммобилизовать на них. С целью идентификации клона или ДНК, которые гибридизируются c SEQ ID NO: 1 или ее подпоследовательностью, материал-носитель применяется в Саузерн-блоттинге.A library of genomic DNA or cDNA derived from such other strains can be screened for DNA that hybridizes with the probes described above and encodes the original form. Genomic or other DNA from such other strains can be separated by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis or other separation techniques. DNA from libraries or separated DNA can be transferred to nitrocellulose or other suitable carrier material and immobilized thereon. In order to identify a clone or DNA that hybridizes to SEQ ID NO: 1 or a subsequence thereof, a carrier material is used in Southern blotting.

В контексте настоящего изобретения гибридизация означает, что полинуклеотид гибридизируется с меченым зондом на основе нуклеиновой кислоты, соответствующим (i) SEQ ID NO: 1; (ii) кодирующей полипептид последовательности SEQ ID NO: 1; (iii) последовательности полной длины, комплементарной ей; или (iv) ее подпоследовательности; в условиях от очень низкой до очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми зонд на основе нуклеиновой кислоты гибридизируется в этих условиях, можно выявить с помощью, например, пленки для рентгенографии или любых других средств для выявления, известных в данной области.In the context of the present invention, hybridization means that a polynucleotide hybridizes with a labeled nucleic acid probe corresponding to (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1; (iii) a full length sequence complementary to it; or (iv) a subsequence thereof; in conditions from very low to very high stiffness. Molecules to which the nucleic acid probe hybridizes under these conditions can be detected using, for example, X-ray film or any other detection means known in the art.

В одном аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой кодирующую полипептид последовательность SEQ ID NO: 1. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты составляют по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от количества нуклеотидов из SEQ ID NO: 1. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотид, который кодирует полипептид SEQ ID NO: 2, его полипептид или его фрагмент. В другом аспекте зонд на основе нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO: 1.In one aspect, the nucleic acid probe is the polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1. In another aspect, the nucleic acid probe is at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65 %, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90% or at least 95% of the number of nucleotides from SEQ ID NO: 1. In another aspect a nucleic acid probe is a polynucleotide that encodes a polypeptide of SEQ ID NO: 2, a polypeptide thereof, or a fragment thereof. In another aspect, the nucleic acid probe is SEQ ID NO: 1.

В другом варианте осуществления исходная форма кодируется полинуклеотидом, последовательность которого идентична кодирующей полипептид последовательности SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100%.In another embodiment, the parent form is encoded by a polynucleotide whose sequence is at least 60% identical to the polypeptide-encoding sequence of SEQ ID NO: 1, e.g., at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100%.

Полипептид может представлять собой гибридный полипептид, в котором участок одного полипептида слит с N-концом или C-концом участка другого полипептида.The polypeptide may be a hybrid polypeptide in which a portion of one polypeptide is fused to the N-terminus or C-terminus of a portion of another polypeptide.

Исходная липаза может представлять собой слитый полипептид или расщепляемый слитый полипептид, в котором другой полипептид слит с N-концом или C-концом полипептида согласно настоящему изобретению. Слитый полипептид получают путем слияния полинуклеотида, кодирующего другой полипептид, с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению. Методики получения слитых полипептидов известны из уровня техники и включают лигирование кодирующих последовательностей, кодирующих полипептиды, с тем, чтобы они находились в рамке и чтобы экспрессия слитого полипептида находилась под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора. Слитые полипептиды можно также конструировать с применением интеиновой технологии, в которой слитые полипептиды создаются постртрансляционно (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).The parent lipase may be a fusion polypeptide or a cleavable fusion polypeptide in which another polypeptide is fused to the N-terminus or C-terminus of the polypeptide of the present invention. A fusion polypeptide is obtained by fusing a polynucleotide encoding another polypeptide with a polynucleotide according to the present invention. Techniques for producing fusion polypeptides are known in the art and include ligating the coding sequences encoding the polypeptides so that they are in-frame and that the expression of the fusion polypeptide is under the control of the same promoter(s) and terminator. Fusion polypeptides can also be constructed using intein technology, in which fusion polypeptides are created post-translationally (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Слитый полипептид может дополнительно содержать сайт расщепления между двумя полипептидами. После секреции слитого белка сайт расщепляется с высвобождением двух полипептидов. Примеры сайтов расщепления включают без ограничения сайты, раскрытые в Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetinaet al., 2000,J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilsonet al., 1997,Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; и Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins:Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; и Stevens, 2003,Drug Discovery World 4: 35-48.The fusion polypeptide may further comprise a cleavage site between the two polypeptides. After secretion of the fusion protein, the site is cleaved to release two polypeptides. Examples of cleavage sites include, without limitation, those disclosed in Martin et al., 2003, J. Ind. microbiol.Biotechnol. 3:568-576; Svetinaet al., 2000,J. Biotechnol. 76:245-251; Rasmussen-Wilsonet al., 1997,Appl. Environ. microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; and Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins:Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; and Stevens, 2003,Drug Discovery World 4: 35-48.

Исходную липазу можно получить из микроорганизмов любого рода. В контексте настоящего изобретения выражение "полученный из", которое применяется в данном документе применительно к определенному источнику, будет означать, что исходная форма, кодируемая полинуклеотидом, продуцируется источником или штаммом, в который был введен полинуклеотид из источника. В одном аспекте исходная форма секретируется за пределы клетки.The parent lipase can be obtained from microorganisms of any kind. In the context of the present invention, the expression "obtained from" as used herein in relation to a specific source will mean that the original form encoded by the polynucleotide is produced by the source or by the strain into which the polynucleotide from the source has been introduced. In one aspect, the original form is secreted outside the cell.

Исходная форма может представлять собой бактериальную липазу. Например, исходная форма может представлять собой полипептид грамположительных бактерий, такой как липазаBacillus,Clostridium,Enterococcus,Geobacillus,Lactobacillus,Lactococcus,Oceanobacillus,Staphylococcus,Streptococcus,Streptomyces илиThermobifida или полипептид грамотрицательных бактерий, такой как липазаCampylobacter,E. coli,Flavobacterium,Fusobacterium,Helicobacter,Ilyobacter,Neisseria,Pseudomonas,Salmonella, илиUreaplasma.The parent form may be a bacterial lipase. For example, the parent form may be a Gram-positive bacterial polypeptide such asBacillus ,Clostridium ,Enterococcus ,Geobacillus ,Lactobacillus ,Lactococcus ,Oceanobacillus ,Staphylococcus ,Streptococcus ,Streptomyces , orThermobifida lipase or a Gram-negative bacterial polypeptide such asCampylobacter ,E. coli ,Flavobacterium lipase ,Fusobacterium ,Helicobacter ,Ilyobacter ,Neisseria ,Pseudomonas ,Salmonella , orUreaplasma .

В одном аспекте исходная форма представляет собой липазуBacillus alkalophilus,Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus brevis,Bacillus circulans,Bacillus clausii,Bacillus coagulans,Bacillus firmus,Bacillus lautus,Bacillus lentus,Bacillus licheniformis,Bacillus megaterium,Bacillus pumilus,Bacillus stearothermophilus,Bacillus subtilis, илиBacillus thuringiensis.In one aspect, the parent form is a lipaseof Bacillus alkalophilus ,Bacillus amyloliquefaciens ,Bacillus brevis ,Bacillus circulans ,Bacillus clausii ,Bacillus coagulans ,Bacillus firmus ,Bacillus lautus ,Bacillus lentus ,Bacillus licheniformis ,Bacillus megaterium ,Bacillus pumilis,Bacillusstearacothermus , orBacillus thuringiensis .

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазуStreptococcus equisimilis,Streptococcus pyogenes,Streptococcus uberis, илиStreptococcus equi subsp.Zooepidemicus.In another aspect, the parent form is a lipase fromStreptococcus equisimilis ,Streptococcus pyogenes ,Streptococcus uberis , orStreptococcus equi subsp.zooepidemicus .

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазуStreptomyces achromogenes,Streptomyces avermitilis,Streptomyces coelicolor,Streptomyces griseus, илиStreptomyces lividans.In another aspect, the parent form is aStreptomyces achromogenes ,Streptomyces avermitilis ,Streptomyces coelicolor ,Streptomyces griseus , orStreptomyces lividans lipase .

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазуThermobifida alba или Thermobifida fusca (ранее известных какThermomonaspora fusca).In another aspect, the parent form is aThermobifida alba or Thermobifida fusca (formerly known asThermomonaspora fusca) lipase .

Исходная форма может представлять собой липазу гриба. Например, исходная форма может представлять собой липазу дрожжей, такую как липазаCandida,Kluyveromyces,Pichia,Saccharomyces,Schizosaccharomyces, илиYarrowia; или липазу нитчатого гриба, такую как липазаAcremonium,Agaricus,Alternaria,Aspergillus,Aureobasidium,Botryospaeria,Ceriporiopsis,Chaetomidium,Chrysosporium,Claviceps,Cochliobolus,Coprinopsis,Coptotermes,Corynascus,Cryphonectria,Cryptococcus,Diplodia,Exidia,Filibasidium,Fusarium,Gibberella,Holomastigotoides,Humicola,Irpex,Lentinula,Leptospaeria,Magnaporthe,Melanocarpus,Meripilus,Mucor,Myceliophthora,Neocallimastix,Neurospora,Paecilomyces,Penicillium,Phanerochaete,Piromyces,Poitrasia,Pseudoplectania,Pseudotrichonympha,Rhizomucor,Schizophyllum,Scytalidium,Talaromyces,Thermoascus,Thielavia,Tolypocladium,Trichoderma,Trichophaea,Verticillium,Volvariella, илиXylaria.The parent form may be a fungal lipase. For example, the parent form may be a yeast lipase such asCandida ,Kluyveromyces ,Pichia ,Saccharomyces ,Schizosaccharomyces , orYarrowia lipase; или липазу нитчатого гриба, такую как липазаAcremonium ,Agaricus ,Alternaria ,Aspergillus ,Aureobasidium ,Botryospaeria ,Ceriporiopsis ,Chaetomidium ,Chrysosporium ,Claviceps ,Cochliobolus ,Coprinopsis ,Coptotermes ,Corynascus ,Cryphonectria ,Cryptococcus ,Diplodia ,Exidia ,Filibasidium ,Fusarium ,Gibberella ,Holomastigotoides ,Humicola ,Irpex ,Lentinula ,Leptospaeria ,Magnaporthe ,Melanocarpus ,Meripilus ,Mucor ,Myceliophthora ,Neocallimastix ,Neurospora ,Paecilomyces ,Penicillium ,Phanerochaete ,Piromyces ,Poitrasia ,Pseudoplectania ,Pseudotrichonympha ,Rhizomucor ,Schizophyllum ,Scytalidium ,Talaromyces ,Thermoascus ,Thielavia ,Tolypocladium ,Trichoderma ,Trichophaea ,Verticillium ,Volvariella , orXylaria .

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазуSaccharomyces carlsbergensis,Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyces diastaticus,Saccharomyces douglasii,Saccharomyces kluyveri,Saccharomyces norbensis, илиSaccharomyces oviformis.In another aspect, the parent form is aSaccharomyces carlsbergensis ,Saccharomyces cerevisiae ,Saccharomyces diastaticus ,Saccharomyces douglasii ,Saccharomyces kluyveri ,Saccharomyces norbensis , orSaccharomyces oviformis lipase .

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазуAcremonium cellulolyticus,Aspergillus aculeatus,Aspergillus awamori,Aspergillus foetidus,Aspergillus fumigatus,Aspergillus japonicus,Aspergillus nidulans,Aspergillus niger,Aspergillus oryzae,Chrysosporium inops,Chrysosporium keratinophilum,Chrysosporium lucknowense,Chrysosporium merdarium,Chrysosporium pannicola,Chrysosporium queenslandicum,Chrysosporium tropicum,Chrysosporium zonatum,Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis,Fusarium crookwellense,Fusarium culmorum,Fusarium graminearum,Fusarium graminum,Fusarium heterosporum,Fusarium negundi,Fusarium oxysporum,Fusarium reticulatum,Fusarium roseum,Fusarium sambucinum,Fusarium sarcochroum,Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum,Fusarium torulosum,Fusarium trichothecioides,Fusarium venenatum,Humicola grisea,Humicola insolens,Humicola lanuginosa,Irpex lacteus,Mucor miehei,Myceliophthora thermophila,Neurospora crassa,Penicillium funiculosum,Penicillium purpurogenum,Phanerochaete chrysosporium,Thielavia achromatica,Thielavia albomyces,Thielavia albopilosa,Thielavia australeinsis,Thielavia fimeti,Thielavia microspora,Thielavia ovispora,Thielavia peruviana,Thielavia setosa,Thielavia spededonium,Thielavia subthermophila,Thielavia terrestris,Trichoderma harzianum,Trichoderma koningii,Trichoderma longibrachiatum,Trichoderma reesei, илиTrichoderma viride.Вдругом аспекте исходная форма представляет собой липазу Acremonium cellulolyticus ,Aspergillus aculeatus ,Aspergillus awamori ,Aspergillus foetidus ,Aspergillus fumigatus ,Aspergillus japonicus ,Aspergillus nidulans ,Aspergillus niger ,Aspergillus oryzae ,Chrysosporium inops ,Chrysosporium keratinophilum ,Chrysosporium lucknowense ,Chrysosporium merdarium ,Chrysosporium pannicola ,Chrysosporium queenslandicum ,Chrysosporium tropicum ,Chrysosporium zonatum ,Fusarium bactridioides ,Fusarium cerealis ,Fusarium crookwellense ,Fusarium culmorum ,Fusarium graminearum ,Fusarium graminum ,Fusarium heterosporum ,Fusarium negundi ,Fusarium oxysporum ,Fusarium reticulatum ,Fusarium roseum ,Fusarium sambucinum ,Fusarium sarcochroum ,Fusarium sporotrichioides ,Fusarium sulphureum ,Fusarium torulosum ,Fusarium trichothecioides ,Fusarium venenatum ,Humicola grisea ,Humicola insolens ,Humicola lanuginosa ,Irpex lacteus ,Mucor miehei ,Myceliophthora thermophila ,Neurospora crassa ,Penicillium funiculosum ,Penicillium purpurogenum ,Phanerochaete chrysosporium ,Thielavia achromatica ,Thielavia albomyces ,Thielavia albopilosa ,Thielavia australeinsis ,Thielavia fimeti ,Thielavia microspora ,Thielavia ovispora ,Thielavia peruviana ,Thielavia setosa ,Thielavia spededonium ,Thielavia subthermophila ,Thielavia terrestris ,Trichoderma harzianum ,Trichoderma koningii ,Trichoderma longibrachiatum ,Trichoderma reesei , orTrichoderma viride .

В другом аспекте исходная форма представляет собой липазуThermomyces lanuginosus,например, в частности, липазу SEQ ID NO: 2.In another aspect, the parent form is a lipaseThermomyces lanuginosus,for example, in particular, lipase SEQ ID NO: 2.

Будет понятно, что в отношении вышеупомянутых видов настоящее изобретение охватывает как совершенную, так и несовершенную стадии, а также другие таксономические эквиваленты, например, анаморфы, вне зависимости от названия вида, под которым они известны. Специалисты в данной области легко поймут идентичность соответствующих эквивалентов.It will be understood that, with respect to the aforementioned species, the present invention covers both perfect and imperfect stages, as well as other taxonomic equivalents, such as anamorphs, regardless of the species name by which they are known. Those skilled in the art will readily recognize the identity of the respective equivalents.

Штаммы этих видов являются легкодоступными неограниченному кругу лиц в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection) (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Коллекция патентованных культур Службы сельскохозяйственных исследований (Agricultural Research Service Patent Culture Collection), Северный региональный исследовательский центр (Northern Regional Research Center) (NRRL).Strains of these species are readily available to the public in a number of culture collections such as the American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), and the Patent Culture Collection. Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Исходную липазу можно идентифицировать и получать из других источников, в том числе микроорганизмов, выделенных из природной среды (например,почвы, компостов, воды и т. д.), или образцов ДНК, полученных непосредственно из природных материалов (например,почвы, компостов, воды и т. д.), с использованием вышеупомянутых зондов. Методики выделения микроорганизмов и ДНК непосредственно из естественных мест обитания хорошо известны в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий исходную форму, можно затем получить подобным образом путем скрининга библиотеки геномной ДНК или кДНК другого микроорганизма или образца смешанной ДНК. После того как полинуклеотид, кодирующий исходную форму, был выявлен зондом(ами), полинуклеотид можно выделить или клонировать с использованием методик, которые хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).The parent lipase can be identified and obtained from other sources, including microorganisms isolated from the natural environment (for example,soil, compost, water, etc.), or DNA samples obtained directly from natural materials (for example,soil, compost, water, etc.) using the aforementioned probes. Techniques for isolating microorganisms and DNA directly from natural habitats are well known in the art. The polynucleotide encoding the original form can then be similarly obtained by screening a genomic DNA or cDNA library of another microorganism or a mixed DNA sample. Once the polynucleotide encoding the original form has been detected by the probe(s), the polynucleotide can be isolated or cloned using techniques that are well known to one of skill in the art (see, for example, Sambrook et al., 1989, supra).

Получение вариантовGetting Options

Настоящее изобретение также относится к способам получения вариантов липаз по настоящему изобретению, предусматривающим: (a) введение замен в положения, соответствующие G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, K98I, R118F, G163S, T231R, N233R, Y220F, T244E, и P256T; (b) выбор варианта, который обладает липазной активностью и характеризуется наличием одного из необходимых свойств, указанных выше, по сравнению с исходной липазой; и (c) выделение варианта.The present invention also relates to processes for the preparation of lipase variants of the present invention comprising: (a) introducing substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, K98I, R118F, G163S, T231R, N233R, Y220F, T244E, and P256T; (b) selecting a variant that has lipase activity and is characterized by the presence of one of the necessary properties indicated above, compared with the original lipase; and (c) variant highlighting.

Варианты можно получить с использованием любой процедуры мутагенеза, известной из уровня техники, такой как сайт-направленный мутагенез, конструирование синтетических генов, конструирование полусинтетических генов, случайный мутагенез, шаффлинг и т. д.Variants can be generated using any mutagenesis procedure known in the art, such as site-directed mutagenesis, synthetic gene engineering, semi-synthetic gene engineering, random mutagenesis, shuffling, etc.

Сайт-направленный мутагенез представляет собой методику, в которой одну или несколько (например, некоторое количество) мутаций вводят в один или несколько определенных сайтов в полинуклеотиде, кодирующем исходную липазу.Site-directed mutagenesis is a technique in which one or more (eg, a number) mutations are introduced at one or more specific sites in a polynucleotide encoding a parent lipase.

Сайт-направленный мутагенез можно проводить in vitro с помощью ПЦР, включающей использование олигонуклеотидных праймеров, содержащих необходимую мутацию. Сайт-направленный мутагенез можно также осуществлять in vitro путем кассетного мутагенеза, включающего расщепление рестрикционным ферментом по сайту в плазмиде, содержащей полинуклеотид, кодирующий исходную липазу, и последующего лигирования олигонуклеотида, содержащего мутацию, в полинуклеотид. Обычно рестрикционный фермент, который расщепляет плазмиду и олигонуклеотид, является одним и тем же, обеспечивающим возможность лигирования друг с другом липких концов плазмиды и вставки. См., например, Scherer and Davis, 1979,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955 и Bartonet al., 1990,Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.Site-directed mutagenesis can be carried out in vitro using PCR, including the use of oligonucleotide primers containing the desired mutation. Site-directed mutagenesis can also be carried out in vitro by cassette mutagenesis, which involves restriction enzyme digestion at a site in a plasmid containing a polynucleotide encoding the parent lipase and subsequent ligation of the oligonucleotide containing the mutation into the polynucleotide. Typically, the restriction enzyme that cleaves the plasmid and the oligonucleotide is the same, allowing the sticky ends of the plasmid and insert to be ligated to each other. See, for example, Scherer and Davis, 1979,Proc. Natl. Acad. sci. USA 76: 4949-4955 and Bartonet al. , 1990,Nucleic Acids Res. 18:7349-4966.

Сайт-направленный мутагенез можно также проводить in vivo с помощью способов, известных из уровня техники. См.,например, US2004/0171154; Storiciet al., 2001,Nature Biotechnol. 19: 773-776; Krenet al., 1998,Nat. Med. 4: 285-290 и Calissano and Macino, 1996,Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.Site directed mutagenesis can also be carried out in vivo using methods known in the art. See,for example , US2004/0171154; Storiciet al. , 2001,Nature Biotechnol. 19:773-776; Krenet al. , 1998,Nat. Med. 4: 285-290 and Calissano and Macino, 1996,Fungal Genet. Newslett. 43:15-16.

Любую процедуру сайт-направленного мутагенеза можно использовать в настоящем изобретении. Доступны многие коммерческие наборы, которые можно использовать для получения вариантов.Any procedure for site-directed mutagenesis can be used in the present invention. Many commercial kits are available that can be used to generate variants.

Конструирование синтетического гена включает в себя in vitro синтез молекулы полинуклеотида, предназначенной для кодирования представляющего интерес полипептида. Синтез гена можно осуществлять с использованием ряда методик, таких как мультиплексная технология на основе микрочипов, описанная Tianet al. (2004,Nature 432: 1050-1054), и подобных технологий, где олигонуклеотиды синтезируют и собирают на фотопрограммируемых микропотоковых чипах.Construction of a synthetic gene involves the in vitro synthesis of a polynucleotide molecule designed to encode a polypeptide of interest. Gene synthesis can be performed using a number of techniques such as the microarray multiplex technology described by Tianet al. (2004,Nature 432: 1050-1054), and similar technologies where oligonucleotides are synthesized and assembled on photoprogrammable microflow chips.

Одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или вставок можно осуществить и исследовать при помощи известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или шаффлинга с последующей соответствующей процедурой скрининга, как, например, таковых, раскрытых в Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO95/17413 или WO95/22625. Другие способы, которые можно применять, включают ПЦР с использованием неточной полимеразы, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; патент США № 5223409; WO 92/06204) и направленный на участок мутагенез (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).One or more amino acid substitutions, deletions and/or insertions can be made and analyzed using known methods of mutagenesis, recombination and/or shuffling followed by an appropriate screening procedure, such as those disclosed in Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241 : 53-57; Bowie and Sauer, 1989,Proc. Natl. Acad. sci. USA 86: 2152-2156; WO95/17413 or WO95/22625. Other methods that can be used include PCR using imprecise polymerase, phage display (e.g., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; US Pat. No. 5,223,409; WO 92/06204), and site-directed mutagenesis (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Способы мутагенеза/шаффлинга можно объединить с автоматизированными способами скрининга с высокой пропускной способностью для выявления активности клонированных подвергнутых мутагенезу полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Подвергнутые мутагенезу молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно извлечь из клеток-хозяев и быстро секвенировать с применением стандартных способов, известных в данной области техники. Эти способы обеспечивают возможность быстрого определения важности отдельных аминокислотных остатков в полипептиде.Mutagenesis/shuffling methods can be combined with high throughput automated screening methods to detect the activity of cloned mutagenesis polypeptides expressed by host cells (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Mutagenesis DNA molecules that encode active polypeptides can be extracted from host cells and rapidly sequenced using standard methods known in the art. These methods provide the ability to rapidly determine the importance of individual amino acid residues in a polypeptide.

Конструирование полусинтетического гена проводят путем объединения аспектов конструирования синтетических генов, и/или сайт-направленного мутагенеза, и/или случайного мутаганеза, и/или шаффлинга. Полусинтетическая конструкция характеризуется способом, в котором используются фрагменты полинуклеотида, которые синтезируются, в сочетании с методиками ПЦР. Определенные участки генов можно, таким образом, синтезировать de novo, в то время как другие участки можно амплифицировать с использованием сайт-специфических мутагенных праймеров, тогда как остальные участки можно подвергнуть ПЦР с использованием неточной полимеразы или ПЦР амплификации без использования неточной полимеразы. Подпоследовательности полинуклеотидов можно затем подвергнуть шаффлингу.Construction of a semi-synthetic gene is carried out by combining aspects of synthetic gene construction and/or site-directed mutagenesis and/or random mutagenesis and/or shuffling. The semi-synthetic construct is characterized by a method that uses polynucleotide fragments that are synthesized in combination with PCR techniques. Certain regions of genes can thus be synthesized de novo, while other regions can be amplified using site-specific mutagenic primers, while other regions can be subjected to PCR using an imprecise polymerase or PCR amplification without using an imprecise polymerase. The polynucleotide subsequences can then be shuffled.

ПолинуклеотидыPolynucleotides

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим варианты липазы по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способу получения варианта липазы, включающему: (a) культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, подходящих для экспрессии варианта, и (b) выделение варианта.The present invention also provides isolated polynucleotides encoding the lipase variants of the present invention. In some aspects, the present invention relates to a nucleic acid construct comprising a polynucleotide of the present invention. In some aspects, the present invention relates to an expression vector containing a polynucleotide of the present invention. In some aspects, the present invention relates to a host cell containing a polynucleotide of the present invention. In some aspects, the present invention provides a method for producing a lipase variant, comprising: (a) culturing a host cell of the present invention under conditions suitable for expression of the variant, and (b) isolating the variant.

Конструкции нуклеиновой кислотыNucleic acid constructs

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими управляющими последовательностями, которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, подходящих для управляющих последовательностей.The present invention also relates to nucleic acid constructs comprising a polynucleotide encoding a variant of the present invention operably linked to one or more control sequences that direct expression of the coding sequence in a suitable host cell under conditions suitable for the control sequences.

С полинуклеотидом можно производить манипуляции рядом способов для обеспечения экспрессии варианта. Манипуляция с полинуклеотидом до его вставки в вектор может быть желательной или необходимой в зависимости от вектора экспрессии. Методики модификации полинуклеотидов, в которых применяют способы рекомбинантных ДНК, хорошо известны в данной области техники.The polynucleotide can be manipulated in a number of ways to allow expression of the variant. Manipulation of the polynucleotide prior to insertion into the vector may be desirable or necessary depending on the expression vector. Polynucleotide modification techniques that use recombinant DNA techniques are well known in the art.

Управляющая последовательность может представлять собой промотор, полинуклеотид, который узнается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида. Промотор содержит последовательности, регулирующие транскрипцию, которые опосредуют экспрессию варианта. Промотор может представлять собой любой полинуклеотид, который проявляет транскрипционную активность в клетке-хозяине, в том числе мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, гомологичные либо гетерологичные по отношению к клетке-хозяину.The control sequence may be a promoter, a polynucleotide that is recognized by a host cell to express the polynucleotide. The promoter contains transcriptional control sequences that mediate the expression of the variant. A promoter can be any polynucleotide that exhibits transcriptional activity in a host cell, including mutant, truncated, and hybrid promoters, and can be derived from genes encoding extracellular or intracellular polypeptides that are homologous or heterologous to the host cell.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в бактериальной клетке-хозяине являются промоторы, полученные из гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), гена пенициллиназы Bacillus licheniformis (penP), гена мальтогенной амилазы Bacillus stearothermophilus (amyM), гена левансахаразы Bacillus subtilis (sacB), генов xylA и xylB Bacillus subtilis, гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), lac-оперона E. coli, trc-промотора E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), гена агаразыStreptomyces coelicolor (dagA) и гена прокариотической бета-лактамазы (Villa-Kamaroffet al., 1978,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), а такжеtac-промотор (DeBoeret al., 1983,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Дополнительные промоторы описаны в "Useful proteins from recombinant bacteria" в Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; и в Sambrook et al., 1989, выше. Примеры тандемных промоторов раскрыты в WO 99/43835.Examples of suitable promoters for directing transcription of the nucleic acid constructs of the present invention in a bacterial host cell are promoters derived from the Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase gene (amyQ), the Bacillus licheniformis alpha-amylase gene (amyL), the Bacillus licheniformis penicillinase gene (penP), Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene (amyM), Bacillus subtilis levansucrase gene (sacB), Bacillus subtilis xylA and xylB genes, Bacillus thuringiensis cryIIIA gene (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), E. coli lac operon , the E. coli trc promoter (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), theStreptomyces coelicolor agarase gene (dagA ), and the prokaryotic beta-lactamase gene (Villa-Kamaroffet al. , 1978,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), as well as thetac promoter (DeBoeret al. , 1983,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Additional promoters are described in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; and in Sambrook et al., 1989, supra. Examples of tandem promoters are disclosed in WO 99/43835.

Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией конструкций нуклеиновых кислот по настоящему изобретению в клетке-хозяине, являющейся клеткой нитчатого гриба, являются промоторы, полученные из генов ацетамидазы Aspergillus nidulans, нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, кислотостабильной альфа-амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger или Aspergillus awamori (glaA), такаамилазы Aspergillus oryzae, щелочной протеазы Aspergillus oryzae, триозофосфатизомеразы Aspergillus oryzae, трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum (WO 96/00787), амилоглюкозидазы Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn Fusarium venenatum (WO 00/56900), липазы Rhizomucor miehei, аспартатпротеиназы Rhizomucor miehei, бета-глюкозидазы Trichoderma reesei, целлобиогидролазы I Trichoderma reesei, целлобиогидролазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы I Trichoderma reesei, эндоглюканазы II Trichoderma reesei, эндоглюканазы III Trichoderma reesei, эндоглюканазы IV Trichoderma reesei, эндоглюканазы V Trichoderma reesei, ксиланазы I Trichoderma reesei, ксиланазы II Trichoderma reesei, бета-ксилозидазы Trichoderma reesei, а также промотор NA2-tpi (модифицированный промотор из гена нейтральной альфа-амилазы Aspergillus, в котором нетранслируемая лидерная последовательность была заменена на нетранслируемую лидерную последовательность из гена триозофосфатизомеразы Aspergillus; неограничивающие примеры включают в себя модифицированные промоторы из гена нейтральной альфа-амилазы Aspergillus niger, в которых нетранслируемая лидерная последовательность была заменена на нетранслируемую лидерную последовательность из гена триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae); а также мутантные, усеченные и гибридные промоторы, полученные из них.Examples of suitable promoters for directing transcription of the nucleic acid constructs of the present invention in a filamentous fungal host cell are those derived from the genes for Aspergillus nidulans acetamidase, Aspergillus niger neutral alpha-amylase, Aspergillus niger acid-stable alpha-amylase, Aspergillus niger glucoamylase, or Aspergillus awamori (glaA), Aspergillus oryzae takaamylase, Aspergillus oryzae alkaline protease, Aspergillus oryzae triosephosphate isomerase, Fusarium oxysporum trypsin-like protease (WO 96/00787), Fusarium venenatum amyloglucosidase (WO 00/56900), Daria Fusarium venenatum, WO 00/5690 Quinn Fusarium venenatum (WO 00/56900), Rhizomucor miehei lipases, Rhizomucor miehei aspartate proteinases, Trichoderma reesei beta-glucosidase, Trichoderma reesei cellobiohydrolase I, Trichoderma reesei cellobiohydrolase II, Trichoderma reesei endoglucanase, Trichoderma reesei endoglucanase II, Trichoderma reesei endoglucanase III, Trichoderma reesei endoglucanase IV, Trichoderma reesei endoglucanase V, Trichoderma reesei xylanase I, Trichoderma reesei xylanase II, Trichoderma reesei beta-xylosidase, and the NA2-tpi promoter (a modified promoter from the Aspergillus neutral alpha-amylase gene in which the untranslated leader sequence has been replaced to an untranslated leader sequence from the Aspergillus triose phosphate isomerase gene; non-limiting examples include modified promoters from the Aspergillus niger neutral alpha-amylase gene in which the untranslated leader sequence has been changed to an untranslated leader sequence from the triose phosphate isomerase gene of Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae); as well as mutant, truncated and hybrid promoters derived from them.

Для дрожжей-хозяев пригодные промоторы получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), галактокиназы Saccharomyces cerevisiae (GAL1), алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), триозофосфатизомеразы Saccharomyces cerevisiae (TPI), металлотионеина Saccharomyces cerevisiae (CUP1) и 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные промоторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны в Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.For yeast hosts, useful promoters are derived from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactokinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (ADH1, ADH2/GAP), Saccharomyces cerevisiae triosephosphate isomerase (TPI), metallothionein Saccharomyces cerevisiae (CUP1) and Saccharomyces cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase. Other suitable promoters for yeast host cells are described in Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

Управляющая последовательность может также представлять собой терминатор транскрипции, который распознается клеткой-хозяином с терминацией транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана с 3’-концом полинуклеотида, кодирующего вариант. Можно использовать любой терминатор, функционирующий в клетке-хозяине.The control sequence may also be a transcription terminator that is recognized by the host cell to terminate transcription. The terminator sequence is operably linked to the 3' end of the polynucleotide encoding the variant. Any terminator that is functional in the host cell can be used.

Предпочтительные терминаторы для бактериальных клеток-хозяев получают из генов щелочной протеазы Bacillus clausii (aprH), альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL) и рибосомной РНК Escherichia coli (rrnB).Preferred terminators for bacterial host cells are derived from the Bacillus clausii alkaline protease (aprH), Bacillus licheniformis alpha-amylase (amyL), and Escherichia coli ribosomal RNA (rrnB) genes.

Предпочтительные терминаторы для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, получают из генов антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, глюкоамилазы Aspergillus niger, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger, такаамилазы Aspergillus oryzae и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum.Preferred terminators for filamentous fungal host cells are derived from the genes for Aspergillus nidulans anthranilate synthase, Aspergillus niger glucoamylase, Aspergillus niger alpha-glucosidase, Aspergillus oryzae takaamylase, and Fusarium oxysporum trypsin-like protease.

Предпочтительные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae, цитохрома C Saccharomyces cerevisiae (CYC1) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные терминаторы для дрожжевых клеток-хозяев описаны в Romanos et al., 1992, выше.Preferred terminators for yeast host cells are derived from the Saccharomyces cerevisiae enolase, Saccharomyces cerevisiae cytochrome C (CYC1) and Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes. Other suitable terminators for yeast host cells are described in Romanos et al., 1992, supra.

Управляющая последовательность может также представлять собой участок, стабилизирующий мРНК, расположенный ниже промотора и выше кодирующей последовательности гена, который повышает экспрессию гена.The control sequence may also be an mRNA stabilizing region downstream of the promoter and upstream of the coding sequence of the gene that increases gene expression.

Примеры подходящих участков, стабилизирующих мРНК, получают из гена cryIIIA Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) и гена SP82 Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).Examples of suitable mRNA stabilizing regions are derived from the Bacillus thuringiensis cryIIIA gene (WO 94/25612) and the Bacillus subtilis SP82 gene (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

Управляющая последовательность может также представлять собой лидерную последовательность, нетранслируемый участок мРНК, важный для трансляции в клетке-хозяине. Лидерная последовательность функционально связана с 5’-концом полинуклеотида, кодирующего вариант. Можно применять любую лидерную последовательность, функционирующую в клетке-хозяине.The control sequence may also be a leader sequence, an untranslated region of mRNA essential for translation in the host cell. The leader sequence is operably linked to the 5' end of the polynucleotide encoding the variant. Any leader sequence that is functional in the host cell can be used.

Предпочтительные лидерные последовательности для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, получают из генов такаамилазы Aspergillus oryzae и триозофосфатизомеразы Aspergillus nidulans.Preferred leader sequences for filamentous fungal host cells are derived from the Aspergillus oryzae takaamylase and Aspergillus nidulans triose phosphate isomerase genes.

Подходящие лидерные последовательности для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов енолазы Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-фосфоглицераткиназы Saccharomyces cerevisiae, альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и алкогольдегидрогеназы/глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).Suitable leader sequences for yeast host cells are derived from the Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-phosphoglycerate kinase, Saccharomyces cerevisiae alpha factor, and Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase/glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (ADH2/GAP) genes.

Управляющая последовательность может также представлять собой последовательность полиаденилирования, последовательность, функционально связанную с 3’-концом последовательности, кодирующей вариант, и при транскрипции распознается клеткой-хозяином как сигнал к присоединению полиаденозиновых остатков к транскрибируемой мРНК. Можно применять любую последовательность полиаденилирования, функционирующую в клетке-хозяине.The control sequence may also be a polyadenylation sequence, a sequence operably linked to the 3' end of the variant-coding sequence and upon transcription is recognized by the host cell as a signal for the addition of polyadenosine residues to the transcribed mRNA. Any polyadenylation sequence that is functional in the host cell can be used.

Предпочтительные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, получают из генов антранилатсинтазы Aspergillus nidulans, глюкоамилазы Aspergillus niger, альфа-глюкозидазы Aspergillus niger, такаамилазы Aspergillus oryzae и трипсиноподобной протеазы Fusarium oxysporum.Preferred polyadenylation sequences for filamentous fungal host cells are derived from the genes for Aspergillus nidulans anthranilate synthase, Aspergillus niger glucoamylase, Aspergillus niger alpha-glucosidase, Aspergillus oryzae takaamylase, and Fusarium oxysporum trypsin-like protease.

Пригодные последовательности полиаденилирования для клеток-хозяев, относящихся к дрожжам, описаны в Guo and Sherman, 1995,Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.Suitable polyadenylation sequences for yeast host cells are described in Guo and Sherman, 1995,Mol. Cellular Biol. 15:5983-5990.

Управляющая последовательность может также представлять собой сигнальный пептид, кодирующий участок, который кодирует сигнальный пептид, связанный с N-концом варианта, и направляет вариант по клеточному секреторному пути. 5'-конец кодирующей последовательности полинуклеотида может по своей природе содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, связанную в естественных условиях в трансляционной рамке считывания с сегментом кодирующей последовательности, которая кодирует вариант. В качестве альтернативы, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной относительно кодирующей последовательности. Чужеродная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, может быть необходимой в тех случаях, когда кодирующая последовательность в естественных условиях не содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид. В качестве альтернативы, чужеродной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, можно просто заменить последовательность, кодирующую сигнальный пептид в естественных условиях, с целью повышения секреции варианта. Однако можно использовать любую последовательность, кодирующую сигнальный пептид, которая направляет экспрессируемый вариант по секреторному пути в клетке-хозяине.The control sequence may also be a signal peptide encoding a region that encodes a signal peptide linked to the N-terminus of the variant and directs the variant through the cellular secretory pathway. The 5' end of the coding sequence of a polynucleotide may inherently contain a sequence encoding a signal peptide naturally linked in a translational reading frame to a segment of the coding sequence that encodes the variant. Alternatively, the 5' end of the coding sequence may contain a sequence encoding a signal peptide that is foreign to the coding sequence. A foreign sequence encoding a signal peptide may be necessary in cases where the coding sequence does not naturally contain a sequence encoding a signal peptide. Alternatively, a foreign signal peptide coding sequence can simply be substituted for the naturally occurring signal peptide coding sequence to increase secretion of the variant. However, any signal peptide encoding sequence that directs the expressed variant to a secretory pathway in the host cell can be used.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для бактериальных клеток-хозяев представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов мальтогенной амилазы Bacillus NCIB 11837, субтилизина Bacillus licheniformis, бета-лактамазы Bacillus licheniformis, альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus, нейтральных протеаз Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) и prsA Bacillus subtilis. Дополнительные сигнальные пептиды описаны в Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.Effective signal peptide coding sequences for bacterial host cells are signal peptide coding sequences derived from Bacillus NCIB 11837 maltogenic amylase, Bacillus licheniformis subtilisin, Bacillus licheniformis beta-lactamase, Bacillus stearothermophilus alpha-amylase, Bacillus stearothermophilus neutral proteases ( nprT, nprS, nprM) and prsA Bacillus subtilis. Additional signal peptides are described in Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Эффективные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, для клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, представляют собой последовательности, кодирующие сигнальный пептид, полученные из генов нейтральной амилазы Aspergillus niger, глюкоамилазы Aspergillus niger, такаамилазы Aspergillus oryzae, целлюлазы Humicola insolens, эндоглюканазы V Humicola insolens, липазы Humicola lanuginosa и аспартатпротеиназы Rhizomucor miehei.Effective signal peptide coding sequences for filamentous fungal host cells are signal peptide coding sequences derived from the genes for Aspergillus niger neutral amylase, Aspergillus niger glucoamylase, Aspergillus oryzae takaamylase, Humicola insolens cellulase, Humicola insolens endoglucanase V, Humicola lanuginosa lipase and Rhizomucor miehei aspartate proteinase.

Пригодные сигнальные пептиды для дрожжевых клеток-хозяев получают из генов альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae и инвертазы Saccharomyces cerevisiae. Другие пригодные последовательности, кодирующие сигнальный пептид, описаны в Romanos et al., 1992, выше.Suitable signal peptides for yeast host cells are derived from the Saccharomyces cerevisiae alpha factor and Saccharomyces cerevisiae invertase genes. Other suitable signal peptide encoding sequences are described in Romanos et al., 1992, supra.

Управляющая последовательность может также представлять собой кодирующую последовательность пропептида, которая кодирует пропептид, расположенный на N-конце варианта. Получаемый в результате полипептид известен как профермент или прополипептид (или, в некоторых случаях, зимоген). Прополипептид обычно неактивен и может быть превращен в активный полипептид путем каталитического или автокаталитического отщепления пропептида от прополипептида. Последовательность, кодирующую пропептид, можно получить из генов щелочной протеазы Bacillus subtilis (aprE), нейтральной протеазы Bacillus subtilis (nprT), лакказы Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), аспартатпротеиназы Rhizomucor miehei и альфа-фактора Saccharomyces cerevisiae.The control sequence may also be a propeptide coding sequence that encodes a propeptide located at the N-terminus of the variant. The resulting polypeptide is known as a proenzyme or propolypeptide (or, in some cases, a zymogen). The propolypeptide is usually inactive and can be converted to an active polypeptide by catalytic or autocatalytic cleavage of the propeptide from the propolypeptide. The propeptide coding sequence can be derived from the genes for Bacillus subtilis alkaline protease (aprE), Bacillus subtilis neutral protease (nprT), Myceliophthora thermophila laccase (WO 95/33836), Rhizomucor miehei aspartate proteinase, and Saccharomyces cerevisiae alpha factor.

В случае, если присутствуют последовательности как сигнального пептида, так и пропептида, последовательность пропептида расположена возле N-конца варианта, а последовательность сигнального пептида расположена возле N-конца последовательности пропептида.In case both signal peptide and propeptide sequences are present, the propeptide sequence is located near the N-terminus of the variant, and the signal peptide sequence is located near the N-terminus of the propeptide sequence.

Также может быть желательным добавление регуляторных последовательностей, которые регулируют экспрессию варианта относительно роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных систем являются таковые, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, в том числе на наличие регуляторного соединения. Регуляторные системы в прокариотических системах включают в себя системы операторов lac, tac и trp. У дрожжей можно применять систему ADH2 или систему GAL1. У нитчатых грибов можно применять промотор гена глюкоамилазы Aspergillus niger, промотор гена така-альфа-амилазы Aspergillus oryzae и промотор гена глюкоамилазы Aspergillus oryzae. Другими примерами регуляторных последовательностей являются таковые, которые обеспечивают возможность амплификации гена. В эукариотических системах эти регуляторные последовательности включают в себя ген дигидрофолатредуктазы, амплифицируемый в присутствии метотрексата, и гены металлотионеинов, амплифицируемые в присутствии тяжелых металлов. В этих случаях полинуклеотид, кодирующий вариант, будет функционально связан с регулирующей последовательностью.It may also be desirable to add regulatory sequences that regulate the expression of the variant relative to the growth of the host cell. Examples of regulatory systems are those that cause gene expression to be turned on or off in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Regulatory systems in prokaryotic systems include the lac, tac, and trp operator systems. In yeast, the ADH2 system or the GAL1 system can be used. In filamentous fungi, the Aspergillus niger glucoamylase gene promoter, the Aspergillus oryzae taca-alpha-amylase gene promoter, and the Aspergillus oryzae glucoamylase gene promoter can be used. Other examples of regulatory sequences are those that allow gene amplification. In eukaryotic systems, these regulatory sequences include the dihydrofolate reductase gene, which is amplified in the presence of methotrexate, and the metallothionein genes, which are amplified in the presence of heavy metals. In these cases, the polynucleotide encoding the variant will be operably linked to a control sequence.

Векторы экспрессииExpression vectors

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, промотор и сигналы остановки транскрипции и трансляции. Различные нуклеотидные и управляющие последовательности можно объединить вместе с получением рекомбинантного вектора экспрессии, который может включать в себя один или несколько соответствующих сайтов рестрикции для обеспечения возможности вставки или замещения полинуклеотида, кодирующего вариант, по таким сайтам. В качестве альтернативы, полинуклеотид можно экспрессировать посредством вставки полинуклеотида или конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, в подходящий вектор для экспрессии. При создании вектора экспрессии кодирующую последовательность располагают в векторе таким образом, чтобы кодирующая последовательность была функционально связана с подходящими управляющими последовательностями для экспрессии.The present invention also relates to recombinant expression vectors containing a polynucleotide encoding a variant of the present invention, a promoter, and transcription and translation stop signals. Various nucleotide and control sequences can be combined together to produce a recombinant expression vector that can include one or more appropriate restriction sites to allow insertion or substitution of a variant-encoding polynucleotide at such sites. Alternatively, a polynucleotide can be expressed by inserting the polynucleotide or nucleic acid construct containing the polynucleotide into a suitable expression vector. When creating an expression vector, the coding sequence is positioned in the vector such that the coding sequence is operably linked to the appropriate control sequences for expression.

Рекомбинантный вектор экспрессии может представлять собой любой вектор (например, плазмиду или вирус), который можно удобным образом подвергнуть технологиям рекомбинантной ДНК и который может способствовать экспрессии полинуклеотида. Выбор вектора, как правило, будет зависеть от совместимости вектора с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен вектор. Вектор может представлять собой линейную или замкнутую кольцевую плазмиду.The recombinant expression vector can be any vector (eg, plasmid or virus) that can be conveniently subjected to recombinant DNA techniques and that can facilitate expression of the polynucleotide. The choice of vector will generally depend on the compatibility of the vector with the host cell into which the vector is to be introduced. The vector may be a linear or closed circular plasmid.

Вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т. е. вектор, который существует в виде внехромосомного объекта, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмиду, внехромосомный элемент, минихромосому или искусственную хромосому. Вектор может содержать любые средства для обеспечения саморепликации. В качестве альтернативы, вектор может быть таким, который при введении в клетку-хозяина интегрируется в геном и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он интегрировался. Более того, можно применять один вектор или плазмиду или два или более векторов или плазмид, которые в совокупности содержат общую ДНК, которую необходимо ввести в геном клетки-хозяина, или транспозон.The vector may be an autonomously replicating vector, i.e. a vector that exists as an extrachromosomal entity whose replication is independent of chromosomal replication, such as a plasmid, an extrachromosomal element, a minichromosome, or an artificial chromosome. The vector may contain any means to ensure self-replication. Alternatively, the vector may be one that, when introduced into a host cell, integrates into the genome and replicates along with the chromosome(s) into which it has integrated. Moreover, one vector or plasmid, or two or more vectors or plasmids, which together contain a common DNA to be introduced into the host cell genome, or a transposon, can be used.

Вектор предпочтительно содержит один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют легко проводить отбор трансформированных, трансфицированных, трансдуцированных или подобных клеток. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофность для ауксотрофов и т. п.The vector preferably contains one or more selectable markers that allow easy selection of transformed, transfected, transduced or similar cells. A selectable marker is a gene whose product provides resistance to biocides or viruses, resistance to heavy metals, prototrophy for auxotrophs, etc.

Примерами бактериальных селектируемых маркеров являются dal-гены Bacillus licheniformis или Bacillus subtilis или маркеры, которые придают устойчивость к антибиотикам, как например, устойчивость к ампициллину, хлорамфениколу, канамицину, неомицину, спектиномицину или тетрациклину. Подходящие маркеры для дрожжевых клеток-хозяев включают в себя без ограничения ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селектируемые маркеры для применения в клетке-хозяине, являющейся клеткой нитчатого гриба, включают в себя, без ограничения, amdS (ацетамидазу), argB (орнитинкарбамоилтрансферазу), bar (фосфинотрицинацетилтрансферазу), hph (гигромицинфосфотрансферазу), niaD (нитратредуктазу), pyrG (оротидин-5’-фосфатдекарбоксилазу), sC (сульфатаденилтрансферазу) и trpC (антранилатсинтазу), а также их эквиваленты. Для применения в клетке Aspergillus предпочтительными являются гены amdS и pyrG Aspergillus nidulans или Aspergillus oryzae и ген bar Streptomyces hygroscopicus.Examples of bacterial selectable markers are the dal genes of Bacillus licheniformis or Bacillus subtilis or markers that confer resistance to antibiotics, such as resistance to ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, neomycin, spectinomycin or tetracycline. Suitable markers for yeast host cells include, but are not limited to, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, and URA3. Selectable markers for use in a filamentous fungal host cell include, but are not limited to, amdS (acetamidase), argB (ornithine carbamoyltransferase), bar (phosphinothricin acetyltransferase), hph (hygromycin phosphotransferase), niaD (nitrate reductase), pyrG (orotidin- 5'-phosphate decarboxylase), sC (sulfate adenyl transferase) and trpC (anthranilate synthase), as well as their equivalents. For use in an Aspergillus cell, the amdS and pyrG genes of Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae and the bar gene of Streptomyces hygroscopicus are preferred.

Вектор предпочтительно содержит элемент(ы), который(ые) обеспечивает(ют) интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.The vector preferably contains element(s) that(s) provide(s) for integration of the vector into the genome of the host cell or autonomous replication of the vector in the cell, regardless of the genome.

Интеграция вектора в геном клетки-хозяина может зависеть от последовательности полинуклеотида, кодирующей вариант, или любого другого элемента вектора для интеграции в геном путем гомологичной или негомологичной рекомбинации. В качестве альтернативы, вектор может содержать дополнительные полинуклеотиды для управления интеграцией в геном клетки-хозяина в точном(ых) местоположении(ях) в хромосоме(ах) путем гомологичной рекомбинации. Для повышения возможности интеграции в точном местоположении интегрируемые элементы должны содержать достаточное количество нуклеиновых кислот, как например, от 100 до 10000 пар оснований, от 400 до 10000 пар оснований и от 800 до 10000 пар оснований, последовательность которых в высокой степени идентична соответствующей последовательности-мишени для увеличения вероятности гомологичной рекомбинации. Интегрируемые элементы могут представлять собой любую последовательность, гомологичную последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, интегрируемые элементы могут представлять собой некодирующие или кодирующие полинуклеотиды. С другой стороны, вектор можно интегрировать в геном клетки-хозяина путем негомологичной рекомбинации.Integration of the vector into the genome of the host cell may depend on the sequence of the polynucleotide encoding the variant or any other element of the vector for integration into the genome by homologous or non-homologous recombination. Alternatively, the vector may contain additional polynucleotides to direct integration into the host cell's genome at precise location(s) on the chromosome(s) by homologous recombination. In order to increase the possibility of integration at a precise location, the elements to be integrated should contain a sufficient amount of nucleic acids, such as 100 to 10,000 base pairs, 400 to 10,000 base pairs, and 800 to 10,000 base pairs, the sequence of which is highly identical to the corresponding target sequence. to increase the likelihood of homologous recombination. The elements to be integrated can be any sequence homologous to a target sequence in the genome of the host cell. In addition, the elements to be integrated may be non-coding or coding polynucleotides. On the other hand, the vector can be integrated into the genome of the host cell by non-homologous recombination.

Для автономной репликации вектор может дополнительно содержать точку начала репликации, что обеспечивает возможность автономной репликации вектора в рассматриваемой клетке-хозяине. Точка начала репликации может представлять собой любой репликатор плазмиды, опосредующий автономную репликацию, который функционирует в клетке. Выражение "точка начала репликации" или "репликатор плазмиды" означает полинуклеотид, который обеспечивает возможность репликации плазмиды или вектора in vivo.For autonomous replication, the vector may further comprise an origin of replication, which allows the vector to replicate autonomously in the host cell in question. The origin of replication can be any plasmid replicator that mediates autonomous replication that functions in the cell. The term "origin of replication" or "plasmid replicator" means a polynucleotide that allows a plasmid or vector to replicate in vivo.

Примерами бактериальных точек начала репликации являются точки начала репликации плазмид pBR322, pUC19, pACYC177 и pACYC184, обеспечивающие возможность репликации в E. coli, и pUB110, pE194, pTA1060 и pAMß1, обеспечивающие возможность репликации в Bacillus.Examples of bacterial origins of replication are the plasmid origins pBR322, pUC19, pACYC177 and pACYC184 allowing replication in E. coli and pUB110, pE194, pTA1060 and pAMß1 allowing replication in Bacillus.

Примерами точек начала репликации для применения в дрожжевой клетке-хозяине являются точки начала репликации 2-микронной плазмиды ARS1, ARS4, комбинация ARS1 и CEN3 и комбинация ARS4 и CEN6.Examples of origins of replication for use in a yeast host cell are the 2 micron plasmid origins ARS1, ARS4, a combination of ARS1 and CEN3, and a combination of ARS4 and CEN6.

Примерами точек начала репликации, пригодных в клетке нитчатого гриба, являются AMA1 и ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullenet al., 1987,Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). Выделение гена AMA1 и конструирование плазмид или векторов, содержащих ген, можно проводить в соответствии со способами, раскрытыми в WO 00/24883.Examples of origins of replication useful in a filamentous fungal cell are AMA1 and ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullenet al. , 1987,Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/ 24883). Isolation of the AMA1 gene and construction of plasmids or vectors containing the gene can be carried out according to the methods disclosed in WO 00/24883.

В клетку-хозяина для повышения продуцирования варианта можно ввести более чем одну копию полинуклеотида по настоящему изобретению. Увеличения числа копий полинуклеотида можно достичь путем интеграции по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем внедрения амплифицируемого селектируемого маркерного гена с полинуклеотидом, причем клетки, содержащие амплифицированные копии селектируемого маркерного гена и, следовательно, дополнительные копии полинуклеотида, можно отбирать путем культивирования клеток в присутствии подходящего средства для отбора.More than one copy of a polynucleotide of the present invention can be introduced into a host cell to increase variant production. An increase in the copy number of a polynucleotide can be achieved by integrating at least one additional copy of the sequence into the genome of the host cell, or by introducing an amplifiable selectable marker gene with the polynucleotide, wherein cells containing amplified copies of the selectable marker gene and therefore additional copies of the polynucleotide can be selected by culturing the cells in the presence of a suitable selection agent.

Процедуры, применяемые для лигирования описанных выше элементов для конструирования рекомбинантных векторов экспрессии по настоящему изобретению, хорошо известны специалисту в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, выше).The procedures used to ligate the elements described above to construct the recombinant expression vectors of the present invention are well known to those skilled in the art (see, for example, Sambrook et al., 1989, supra).

Клетки-хозяеваHost cells

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, функционально связанный с одной или несколькими управляющими последовательностями, которые управляют продуцированием варианта по настоящему изобретению. Конструкцию или вектор, содержащие полинуклеотид, вводят в клетку-хозяина так, чтобы конструкция или вектор сохранялись в виде интегрированного в хромосому элемента или в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, как описано ранее. Выражение "клетка-хозяин" охватывает любого потомка родительской клетки, который не является идентичным родительской клетке вследствие мутаций, происходящих в ходе репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от гена, кодирующего вариант, и его источника.The present invention also relates to recombinant host cells containing a polynucleotide encoding a variant of the present invention, operably linked to one or more control sequences that control the production of the variant of the present invention. The construct or vector containing the polynucleotide is introduced into the host cell such that the construct or vector is maintained as a chromosomal integrated element or as a self-replicating extrachromosomal vector as previously described. The term "host cell" encompasses any descendant of a parent cell that is not identical to the parent cell due to mutations that occur during replication. The choice of host cell will largely depend on the gene encoding the variant and its source.

Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, пригодную при рекомбинантном получении варианта, например, прокариота или эукариота.The host cell may be any cell suitable for recombinant production of the variant, eg, prokaryote or eukaryote.

Прокариотическая клетка-хозяин может представлять собой клетку любой грамположительной или грамотрицательной бактерии. Грамположительные бактерии включают без ограниченияBacillus,Clostridium,Enterococcus,Geobacillus,Lactobacillus,Lactococcus,Oceanobacillus,Staphylococcus,Streptococcus, иStreptomyces. Грамположительные бактерии включают без ограниченияCampylobacter,E. coli,Flavobacterium,Fusobacterium,Helicobacter,Ilyobacter,Neisseria,Pseudomonas,Salmonella, иUreaplasma.The prokaryotic host cell can be any Gram-positive or Gram-negative bacterium cell. Gram-positive bacteria include, without limitation,Bacillus ,Clostridium ,Enterococcus ,Geobacillus ,Lactobacillus ,Lactococcus ,Oceanobacillus ,Staphylococcus ,Streptococcus , andStreptomyces . Gram-positive bacteria include, without limitation,Campylobacter ,E. coli ,Flavobacterium ,Fusobacterium ,Helicobacter ,Ilyobacter ,Neisseria ,Pseudomonas ,Salmonella , andUreaplasma .

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клеткуBacillus, в том числе без ограничения клеткиBacillus alkalophilus,Bacillus amyloliquefaciens,Bacillus brevis,Bacillus circulans,Bacillus clausii,Bacillus coagulans,Bacillus firmus,Bacillus lautus,Bacillus lentus,Bacillus licheniformis,Bacillus megaterium,Bacillus pumilus,Bacillus stearothermophilus,Bacillus subtilis, иBacillus thuringiensis.The bacterial host cell can be anyBacillus cell, including, but not limited to,Bacillus alkalophilus ,Bacillus amyloliquefaciens ,Bacillus brevis ,Bacillus circulans ,Bacillus clausii ,Bacillus coagulans ,Bacillus firmus ,Bacillus lautus ,Bacillus lentus ,Bacillus licheniformis ,Bacillus megaterium ,Bacillus pumilus ,Bacillus stearothermophilus ,Bacillus subtilis , andBacillus thuringiensis .

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клеткуStreptococcus, в том числе без ограничения клеткиStreptococcus equisimilis,Streptococcus pyogenes,Streptococcus uberis, иStreptococcus equi subsp.Zooepidemicus.The bacterial host cell can be anyStreptococcus cell, including, but not limited to,Streptococcus equisimilis ,Streptococcus pyogenes ,Streptococcus uberis , andStreptococcus equi subsp.zooepidemicus .

Бактериальная клетка-хозяин может представлять собой любую клеткуStreptomyces, в том числе без ограничения клеткиStreptomyces achromogenes,Streptomyces avermitilis,Streptomyces coelicolor,Streptomyces griseus, иStreptomyces lividans.The bacterial host cell can be anyStreptomyces cell, including, but not limited to,Streptomyces achromogenes ,Streptomyces avermitilis ,Streptomyces coelicolor ,Streptomyces griseus , andStreptomyces lividans cells .

Введение ДНК в клеткуBacillus можно осуществлять посредством трансформации протопластов (см.,например, Chang and Cohen, 1979,Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), трансформации компетентных клеток (см.,например, Young and Spizizen, 1961,J. Bacteriol. 81: 823-829 или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971,J. Mol. Biol. 56: 209-221), электропорации (см., например, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) или конъюгации (см.,например, Koehler and Thorne, 1987,J. Bacteriol. 169: 5271-5278). Введение ДНК в клеткуE. coli можно осуществлять посредством трансформации протопластов (см.,например, Hanahan, 1983,J. Mol. Biol. 166: 557-580) или электропорации (см.,например, Doweret al., 1988,Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Введение ДНК в клетку Streptomyces можно осуществлять путем трансформации протопластов, электропорации (см., например, Gong et al., 2004, Folia Microbiol.(Praha) 49: 399-405), конъюгации (см.,например, Mazodieret al., 1989,J. Bacteriol. 171: 3583-3585) или трансдукции (см., например, Burkeet al., 2001,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). Введение ДНК в клетку Pseudomonas можно осуществлять путем электропорации (см., например, Choi et al., 2006, J. Microbiol.Methods 64: 391-397) или конъюгации (см.,например, Pinedo and Smets, 2005,Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). Введение ДНК в клетку Streptococcus можно осуществлять благодаря естественной компетентности (см., например, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), путем трансформации протопластов (см., например, Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), электропорации (см.,например, Buckleyet al., 1999,Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) или конъюгации (см., например, Clewell, 1981, Microbiol.Rev. 45: 409-436). Тем не менее, можно применять любой известный в данной области техники способ введения ДНК в клетку-хозяина.Introduction of DNA into the cellbacillus can be carried out through the transformation of protoplasts (see,for example, Chang and Cohen, 1979,Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformation of competent cells (see,for example, Young and Spizizen, 1961,J. Bacteriol. 81: 823-829 or Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971,J. Mol. Biol. 56: 209-221), electroporation (see e.g. Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) or conjugation (see,for example, Koehler and Thorne, 1987,J. Bacteriol. 169: 5271-5278). Introduction of DNA into the cellE. coli can be carried out through the transformation of protoplasts (see,e.g. Hanahan, 1983,J. Mol. Biol. 166: 557-580) or electroporation (see,e.g. Doweret al., 1988,Nucleic Acids Res. 16:6127-6145). The introduction of DNA into a Streptomyces cell can be done by protoplast transformation, electroporation (see, for example, Gong et al., 2004, Folia Microbiol.(Praha) 49: 399-405), conjugations (see,for example, Masodieret al., 1989,J. Bacteriol. 171: 3583-3585) or transductions (see, for example, Burkeet al., 2001,Proc. Natl. Acad. sci. USA 98: 6289-6294). Introduction of DNA into a Pseudomonas cell can be accomplished by electroporation (see, for example, Choi et al., 2006, J. Microbiol.Methods 64: 391-397) or conjugation (seefor example, Pinedo and Smets, 2005,Appl. Environ. microbiol. 71:51-57). Introduction of DNA into a Streptococcus cell can be accomplished through natural competence (see, for example, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect.Immun. 32: 1295-1297), by transformation of protoplasts (see e.g. Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), by electroporation (see,for example, Buckleyet al., 1999,Appl. Environ. microbiol. 65: 3800-3804) or conjugation (see, for example, Clewell, 1981, Microbiol.Rev. 45:409-436). However, any method known in the art for introducing DNA into a host cell can be used.

Клетка-хозяин может также быть эукариотической клеткой, такой как клетка млекопитающего, насекомого, растительная или грибная клетка.The host cell may also be a eukaryotic cell, such as a mammalian, insect, plant or fungal cell.

Клетка-хозяин может представлять собой грибную клетку. "Грибы", как применяется в данном документе, включают отделы Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota и Zygomycota, а также Oomycota и все митоспоровые грибы (как определено Hawksworth и соавт. в Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).The host cell may be a fungal cell. "Fungi" as used herein includes the divisions Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota and Zygomycota, as well as Oomycota and all mitosporous fungi (as defined by Hawksworth et al. in Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International , University Press, Cambridge, UK).

Грибная клетка-хозяин может представлять собой дрожжевую клетку. “Дрожжи” в контексте данного документа включают аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам (бластомицетам). Поскольку классификация дрожжей в будущем может измениться, в контексте настоящего изобретения дрожжи следует определять согласно описанному вBiology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors,Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).The fungal host cell may be a yeast cell. “Yeast” as used herein includes ascosporogenic yeasts (Endomycetales), basidiosporogenic yeasts and yeasts belonging to imperfect fungi (blastomycetes). Since the classification of yeasts may change in the future, in the context of the present invention, yeasts should be defined as described inBiology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors,Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

Клетка-хозяин, относящаяся к дрожжам, может быть клеткойCandida,Hansenula,Kluyveromyces,Pichia,Saccharomyces,Schizosaccharomyces, илиYarrowia, такой как клеткаKluyveromyces lactis,Saccharomyces carlsbergensis,Saccharomyces cerevisiae,Saccharomyces diastaticus,Saccharomyces douglasii,Saccharomyces kluyveri,Saccharomyces norbensis,Saccharomyces oviformis, илиYarrowia lipolytica.Клетка-хозяин, относящаяся к дрожжам, может быть клеткойCandida ,Hansenula ,Kluyveromyces ,Pichia ,Saccharomyces ,Schizosaccharomyces , илиYarrowia , такой как клеткаKluyveromyces lactis ,Saccharomyces carlsbergensis ,Saccharomyces cerevisiae ,Saccharomyces diastaticus ,Saccharomyces douglasii ,Saccharomyces kluyveri ,Saccharomyces norbensis ,Saccharomyces oviformis , orYarrowia lipolytica .

Грибная клетка-хозяин может представлять собой клетку нитчатого гриба. "Нитчатые грибы" включают все нитчатые формы подотделов Eumycota и Oomycota (как определено Hawksworth et al., 1995, выше). Нитчатые грибы, как правило, характеризуются клеточной стенкой мицелия, состоящей из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других сложных полисахаридов. Вегетативный рост происходит путем удлинения гиф, а катаболизм углерода является облигатно-аэробным. Напротив, вегетативный рост дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae, происходит путем почкования одноклеточного таллома, а катаболизм углерода может быть ферментативным.The fungal host cell may be a filamentous fungal cell. "Filamentous fungi" includes all filamentous forms of the subdivisions Eumycota and Oomycota (as defined by Hawksworth et al., 1995, supra). Filamentous fungi are typically characterized by a mycelial cell wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan, and other complex polysaccharides. Vegetative growth occurs by hyphae elongation, and carbon catabolism is obligate aerobic. In contrast, vegetative growth in yeasts such as Saccharomyces cerevisiae occurs by budding of a single-celled thallus, and carbon catabolism can be enzymatic.

Клетка-хозяин, относящаяся к нитчатым грибам, может представлять собой клеткуAcremonium,Aspergillus,Aureobasidium,Bjerkandera,Ceriporiopsis,Chrysosporium,Coprinus,Coriolus,Cryptococcus,Filibasidium,Fusarium,Humicola,Magnaporthe,Mucor,Myceliophthora,Neocallimastix,Neurospora,Paecilomyces,Penicillium,Phanerochaete,Phlebia,Piromyces,Pleurotus,Schizophyllum,Talaromyces,Thermoascus,Thielavia,Tolypocladium,Trametes, илиTrichoderma.A filamentous fungus host cell may be anAcremonium ,Aspergillus ,Aureobasidium ,Bjerkandera ,Ceriporiopsis ,Chrysosporium ,Coprinus ,Coriolus ,Cryptococcus ,Filibasidium ,Fusarium ,Penmicola ,Magnaporthe ,Mucor ,Myceliophthora ,Neocallilyces,Neurosicomastix, ,Phanerochaete ,Phlebia ,Piromyces ,Pleurotus ,Schizophyllum ,Talaromyces ,Thermoascus ,Thielavia ,Tolypocladium ,Trametes , orTrichoderma .

Например, клетка-хозяин, относящаяся к нитчатым грибам, может представлять собой клеткуAspergillus awamori,Aspergillus foetidus,Aspergillus fumigatus,Aspergillus japonicus,Aspergillus nidulans,Aspergillus niger,Aspergillus oryzae,Bjerkandera adusta,Ceriporiopsis aneirina,Ceriporiopsis caregiea,Ceriporiopsis gilvescens,Ceriporiopsis pannocinta,Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa,Ceriporiopsis subvermispora,Chrysosporium inops,Chrysosporium keratinophilum,Chrysosporium lucknowense,Chrysosporium merdarium,Chrysosporium pannicola,Chrysosporium queenslandicum,Chrysosporium tropicum,Chrysosporium zonatum,Coprinus cinereus,Coriolus hirsutus,Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis,Fusarium crookwellense,Fusarium culmorum,Fusarium graminearum,Fusarium graminum,Fusarium heterosporum,Fusarium negundi,Fusarium oxysporum,Fusarium reticulatum,Fusarium roseum,Fusarium sambucinum,Fusarium sarcochroum,Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum,Fusarium torulosum,Fusarium trichothecioides,Fusarium venenatum,Humicola insolens,Humicola lanuginosa,Mucor miehei,Myceliophthora thermophila,Neurospora crassa,Penicillium purpurogenum,Phanerochaete chrysosporium,Phlebia radiata,Pleurotus eryngii,Thielavia terrestris,Trametes villosa,Trametes versicolor,Trichoderma harzianum,Trichoderma koningii,Trichoderma longibrachiatum,Trichoderma reesei, илиTrichoderma viride.For example, a filamentous fungal host cell may beAspergillus awamori ,Aspergillus foetidus ,Aspergillus fumigatus ,Aspergillus japonicus ,Aspergillus nidulans ,Aspergillus niger ,Aspergillus oryzae ,Bjerkandera adusta ,Ceriporiopsis aneirina,Ceriporiopsis celvescinorigiea, ,Ceriporiopsis rivulosa ,Ceriporiopsis subrufa ,Ceriporiopsis subvermispora ,Chrysosporium inops ,Chrysosporium keratinophilum ,Chrysosporium lucknowense ,Chrysosporium merdarium ,Chrysosporium pannicola ,Chrysosporium queenslandicum ,Chrysosporium tropicum ,Chrysosporium zonatum ,Coprinus cinereus ,Coriolus hirsutus ,Fusarium bactridioides ,Fusarium cerealis ,Fusarium crookwellense ,Fusarium culmorum ,Fusarium graminearum ,Fusarium graminum ,Fusarium heterosporum ,Fusarium negundi ,Fusarium oxysporum ,Fusarium reticulatum ,Fusarium roseum ,Fusarium sambucinum ,Fusarium sarcochroum ,Fusarium sporot richioides ,Fusarium sulphureum ,Fusarium torulosum ,Fusarium trichothecioides ,Fusarium venenatum ,Humicola insolens ,Humicola lanuginosa ,Mucor miehei ,Myceliophthora thermophila ,Neurospora crassa ,Penicillium purpurogenum ,Phanerochaete chrysosporium ,Phlebia radiata ,Pleurotus eryngii ,Thielavia terrestris ,Trametes villosa ,Trametes versicolor ,Trichoderma harzianum ,Trichoderma koningii ,Trichoderma longibrachiatum ,Trichoderma reesei , orTrichoderma viride .

Грибные клетки можно трансформировать с помощью способа, включающего образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки способом, известным per se. Подходящие процедуры для трансформации клеток-хозяевAspergillus иTrichoderma описаны в EP238023, Yeltonet al., 1984,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, и Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Подходящие способы трансформации видов Fusarium описаны в Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, и WO96/00787. Дрожжи можно трансформировать с применением процедур, описанных Becker and Guarente,в Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Itoet al., 1983,J. Bacteriol. 153: 163 и Hinnenet al., 1978,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.Fungal cells can be transformed by a method including protoplast formation, protoplast transformation and cell wall regeneration in a manner known per se. Appropriate Procedures for Transforming Host CellsAspergillus andTrichoderma described in EP238023, Yeltonet al., 1984,Proc. Natl. Acad. sci. USA 81: 1470-1474, and Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Suitable methods for transforming Fusarium species are described in Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, and WO96/00787. Yeast can be transformed using the procedures described by Becker and Guarente,in Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Itoet al., 1983,J. Bacteriol. 153:163 and Hinnenet al., 1978,Proc. Natl. Acad. sci. USA 75:1920.

Способы полученияHow to get

Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта липазы по настоящему изобретению, включающим: (a) культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, подходящих для экспрессии варианта; и (b) извлечение варианта.The present invention also provides methods for producing a lipase variant of the present invention, comprising: (a) culturing a host cell of the present invention under conditions suitable for expression of the variant; and (b) extracting the variant.

Клетки-хозяева культивируют в питательной среде, подходящей для продукции варианта с использованием способов, известных из уровня техники. Например, клетку можно культивировать путем культивирования во встряхиваемой колбе или при мелкомасштабной или крупномасштабной ферментации (в том числе непрерывной, периодической, подпитываемой или твердофазной ферментации) в лабораторных или промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих возможность экспрессии и/или выделения варианта. Культивирование осуществляют в подходящей питательной среде, содержащей источники углерода и азота и неорганические соли, с применением процедур, известных в данной области техники. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть получены в соответствии с опубликованными составами (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Если вариант секретируется в питательную среду, вариант можно извлечь непосредственно из среды. Если вариант не секретируется, его можно извлечь из клеточных лизатов.Host cells are cultured in a nutrient medium suitable for variant production using methods known in the art. For example, a cell can be cultured by shake flask culture or by small scale or large scale fermentation (including continuous, batch, fed-batch or solid phase fermentation) in laboratory or industrial fermenters, carried out in a suitable medium and under conditions that allow expression and/or isolation. option. Cultivation is carried out in a suitable nutrient medium containing sources of carbon and nitrogen and inorganic salts, using procedures known in the art. Suitable media are available from commercial suppliers or can be obtained from published formulations (eg, catalogs of the American Type Culture Collection). If the variant is secreted into the culture medium, the variant can be recovered directly from the medium. If the variant is not secreted, it can be recovered from cell lysates.

Вариант можно выявить с использованием способов, известных из уровня техники, которые являются специфическими для вариантов. Эти способы выявления включают без ограничения применение специфичных антител, образование продукта ферментативной реакции или исчезновение субстрата фермента. Например, для определения активности варианта также можно использовать ферментный анализ, такой как анализ, описанный в примерах.A variant can be identified using methods known in the art that are specific to the variant. These detection methods include, without limitation, the use of specific antibodies, the formation of an enzyme reaction product, or the disappearance of an enzyme substrate. For example, an enzyme assay, such as the assay described in the examples, can also be used to determine the activity of a variant.

Вариант можно извлечь с использованием способов, известных из уровня техники. Например, вариант можно извлечь из питательной среды с помощью общепринятых процедур, в том числе без ограничения сбора, центрифугирования, фильтрования, экстракции, распылительной сушки, испарения или осаждения.The variant can be extracted using methods known in the art. For example, the variant can be recovered from the growth medium using conventional procedures, including, but not limited to, collection, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation, or precipitation.

Вариант можно очистить с помощью ряда процедур, известных из уровня техники, в том числе без ограничения хроматографии (например, ионообменной, аффинной, гидрофобной хроматографии, хроматофокусирования и гель-хроматографии), электрофоретических процедур (например, препаративного изоэлектрического фокусирования), дифференциальной растворимости (например, осаждение сульфатом аммония), SDS-PAGE или экстракции (см., например, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) с получением, по сути, чистых вариантов.The variant can be purified using a number of procedures known in the art, including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic chromatography, chromatography, and gel chromatography), electrophoretic procedures (e.g., preparative isoelectric focusing), differential solubility (e.g. , ammonium sulfate precipitation), SDS-PAGE, or extraction (see, for example, Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) to produce substantially pure variants.

В альтернативном аспекте вариант не извлекают, а вместо этого используют в качестве источника варианта клетку-хозяина по настоящему изобретению, экспрессирующую вариант.In an alternative aspect, the variant is not recovered, but instead a host cell of the present invention expressing the variant is used as the source of the variant.

КомпозицииCompositions

Настоящее изобретение также включает композиции, содержащие вариант липазы по настоящему изобретению.The present invention also includes compositions containing the lipase variant of the present invention.

В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей вариант исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность на по меньшей мере 60%, но менее чем на 100%, идентична SEQ ID NO: 2 и предусматривает одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, K98I, R118F, G163S, T231R, N233R, Y220F, T244E, и P256T.In some aspects, the present invention relates to a composition containing a variant of the original lipase, while the variant has lipase activity, its sequence is at least 60%, but less than 100% identical to SEQ ID NO: 2 and provides one or more (for example , a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, K98I, R118F, G163S, T231R, N233R, Y220F, T244E, and P256T.

В некоторых аспектах композиция предусматривает замены в положениях, соответствующих R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, K98I, G163S, Y220F, T244E, и P256T.In some aspects, the composition includes substitutions at positions corresponding to R118F+T231R+N233R and one or more (e.g., a number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, K98I, G163S, Y220F , T244E, and P256T.

В некоторых аспектах указанный вариант обладает улучшенной моющей эффективностью, сниженной степенью образования запаха и/или улучшенной стабильностью при хранении/более длительным сроком годности/повышенной термостабильностью.In some aspects, this option has improved cleaning performance, reduced odor and/or improved storage stability/longer shelf life/increased thermal stability.

Неограничивающий перечень компонентов композиции, проиллюстрированный далее в данном документе, является пригодным для применения в композициях и способах согласно данному документу, может быть желательно включен в некоторые варианты осуществления настоящего изобретения, например, для того, чтобы способствовать эффективности очищения или повысить таковую для обработки основы, подлежащей очищению, или для модификации эстетических характеристик композиции, как в случае с отдушками, красящими веществами, красителями или подобным. Количества любых таких компонентов, включенных в любые композиции, являются дополнением для любых материалов, упомянутых ранее для включения. Точная природа данных дополнительных компонентов и количества, в которых их включают, будут зависеть от физической формы композиции и природы очищающего процесса, для которого ее применяют. Хотя компоненты, упомянутые ниже, разделены на категории согласно общему названию в соответствии с конкретной функциональной возможностью, это не должно быть истолковано как ограничение, так как компонент может включать дополнительные функциональные возможности, что будет понятно специалисту в данной области.The non-limiting list of composition ingredients illustrated hereinafter, which are suitable for use in the compositions and methods of this document, may be desirably included in some embodiments of the present invention, for example, in order to promote cleaning efficiency or increase that for base treatment, to be cleaned, or to modify the aesthetic characteristics of the composition, as is the case with perfumes, colorants, dyes or the like. The amounts of any such components included in any compositions are in addition to any materials previously mentioned for inclusion. The precise nature of these additional components and the amounts in which they are included will depend on the physical form of the composition and the nature of the cleansing process for which it is used. Although the components mentioned below are categorized by common name according to specific functionality, this should not be construed as a limitation, as a component may include additional functionality as will be appreciated by one skilled in the art.

Если не указано иное, количества в процентах приведены по весу композиции (вес. %). Подходящие материалы компонентов включают без ограничения поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, хелатирующие средства, средства, ингибирующие перенос красителя, диспергирующие средства, ферменты и стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления глинистых загрязнений/средства против переосаждения, осветлители, подавители образования мыльной пены, красители, оттеночные красители, отдушки, системы доставки отдушки, средства, обеспечивающие эластичность структуры, мягчители тканей, носители, гидротропы, технологические добавки, растворители и/или пигменты. В дополнение к раскрытым выше, подходящие примеры других таких компонентов и уровни применения можно найти в US5576282, US6306812 и US6326348, включенных в данный документ посредством ссылки.Unless otherwise indicated, percentages are by weight of the composition (wt %). Suitable component materials include, but are not limited to, surfactants, detergents, chelating agents, dye transfer inhibitors, dispersants, enzymes and enzyme stabilizers, catalyst materials, bleach activators, hydrogen peroxide, hydrogen peroxide sources, preformed peracids, polymeric dispersants. agents, clay removers/anti-redeposition agents, brighteners, soap suds suppressors, colorants, tint dyes, perfumes, perfume delivery systems, texture stretching agents, fabric softeners, carriers, hydrotropes, processing aids, solvents and/or pigments. In addition to those disclosed above, suitable examples of other such components and application levels can be found in US5576282, US6306812 and US6326348, incorporated herein by reference.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение не содержит один или несколько из следующих вспомогательных материалов: поверхностно-активные вещества, мыла, моющие компоненты, хелатирующие средства, средства, ингибирующие перенос красителя, диспергирующие средства, дополнительные ферменты, стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты, полимерные диспергирующие средства, средства для удаления глинистых загрязнений/средства против переосаждения, осветлители, подавители образования мыльной пены, красители, отдушки, системы доставки отдушки, средства, обеспечивающие эластичность структуры, мягчители тканей, носители, гидротропы, технологические добавки, растворители и/или пигменты. Однако если присутствует один или несколько компонентов, такие один или несколько компонентов могут присутствовать, как подробно описано ниже.Thus, in some embodiments, the present invention does not contain one or more of the following auxiliary materials: surfactants, soaps, detergents, chelating agents, dye transfer inhibitors, dispersants, additional enzymes, enzyme stabilizers, catalytic materials, Bleach Activators, Hydrogen Peroxide, Hydrogen Peroxide Sources, Preformed Peracids, Polymeric Dispersants, Clay Stain Removers/Anti-Redeposit Agents, Clarifiers, Lather Controls, Colorants, Perfumes, Perfume Delivery Systems, Structural Elasticizers, Emollients fabrics, carriers, hydrotropes, processing aids, solvents and/or pigments. However, if one or more components are present, such one or more components may be present, as detailed below.

Поверхностно-активные вещества. Композиции по настоящему изобретению могут содержать поверхностно-активное вещество или систему поверхностно-активных веществ, где поверхностно-активное вещество может быть выбрано из неионогенных поверхностно-активных веществ, анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, амфолитических поверхностно-активных веществ, цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ, семиполярных неионогенных поверхностно-активных веществ и их смесей. Если поверхностно-активное вещество присутствует, оно, как правило, присутствует в количестве от 0,1 до 60 вес. %, от 0,2 до 40 вес. %, от 0,5 до 30 вес. %, от 1 до 50 вес. %, от 1 до 40 вес. %, от 1 до 30 вес. %, от 1 до 20 вес. %, от 3 до 10 вес. %, от 3 до 5 вес. %, от 5 до 40 вес. %, от 5 до 30 вес. %, от 5 до 15 вес. %, от 3 до 20 вес. %, от 3 до 10 вес. %, от 8 до 12 вес. %, от 10 до 12 вес. %, от 20 до 25 вес. % или от 25-60%.Surfactants. The compositions of the present invention may contain a surfactant or surfactant system, where the surfactant may be selected from nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, ampholytic surfactants, zwitterionic surfactants, semipolar nonionic surfactants and mixtures thereof. If a surfactant is present, it is typically present in an amount of 0.1 to 60 wt. %, from 0.2 to 40 wt. %, from 0.5 to 30 wt. %, from 1 to 50 wt. %, from 1 to 40 wt. %, from 1 to 30 wt. %, from 1 to 20 wt. %, from 3 to 10 wt. %, from 3 to 5 wt. %, from 5 to 40 wt. %, from 5 to 30 wt. %, from 5 to 15 wt. %, from 3 to 20 wt. %, from 3 to 10 wt. %, from 8 to 12 wt. %, from 10 to 12 wt. %, from 20 to 25 wt. % or from 25-60%.

Подходящие анионные моющие поверхностно-активные вещества включают сульфатные и сульфонатные моющие поверхностно-активные вещества.Suitable anionic detergent surfactants include sulfate and sulfonate detergent surfactants.

Подходящие сульфонатные моющие поверхностно-активные вещества включают аклилбензолсульфонат, в одном аспекте C10-13алкилбензолсульфонат. Подходящий алкилбензолсульфонат (LAS) можно получить путем сульфирования коммерчески доступного линейного алкилбензола (LAB); подходящий LAB включает низший 2-фенил LAB, например Isochem® или Petrelab®, другие подходящие LAB включают высший 2-фенил LAB, например Hyblene®. Подходящее анионное моющее поверхностно-активное вещество представляет собой алкилбензолсульфонат, полученный путем катализированного процесса DETAL, хотя другие способы синтеза, такие как HF, также могут быть пригодными. В одном аспекте применяют магниевую соль LAS.Suitable sulfonate detergent surfactants include aclyl benzene sulfonate, in one aspect C10-13 alkyl benzene sulfonate. Suitable alkylbenzene sulfonate (LAS) can be obtained by sulfonation of commercially available linear alkylbenzene (LAB); suitable LAB includes lower 2-phenyl LAB, eg Isochem® or Petrelab®, other suitable LABs include higher 2-phenyl LAB, eg Hyblene®. A suitable anionic detergent surfactant is an alkyl benzene sulfonate obtained from the catalyzed DETAL process, although other synthetic methods such as HF may also be suitable. In one aspect, a magnesium salt of LAS is used.

Подходящие сульфатные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилсульфат, в одном аспекте C8-18алкилсульфат, или преимущественно C12алкилсульфат.Suitable sulfate detergent surfactants include alkyl sulfate, in one aspect C8-18 alkyl sulfate, or preferably C12 alkyl sulfate.

Другое подходящее сульфатное моющее поверхностно-активное вещество представляет собой алкилалкоксилированный сульфат, в одном аспекте алкилэтоксилированный сульфат, в одном аспекте C8-18алкилалкоксилированный сульфат, в другом аспекте, C8-18алкилэтоксилированный сульфат, как правило, алкилалкоксилированный сульфат характеризуется средней степенью алкоксилирования от 0,5 до 20 или от 0,5 до 10, как правило, алкилалкоксилированный сульфат представляет собой C8-18алкилэтоксилированный сульфат, характеризующийся средней степенью этоксилирования от 0,5 до 10, от 0,5 до 7, от 0,5 до 5 или от 0,5 до 3.Another suitable sulphate detergent surfactant is an alkyl alkoxylated sulfate, in one aspect an alkyl ethoxylated sulfate, in one aspect a C8-18 alkyl alkoxylated sulfate, in another aspect a C8-18 alkyl ethoxylated sulfate, typically an alkyl alkoxylated sulfate having an average degree of alkoxylation from 0.5 to 20 or 0.5 to 10, typically the alkyl alkoxylated sulfate is a C8-18 alkyl ethoxylated sulfate having an average degree of ethoxylation of 0.5 to 10, 0.5 to 7, 0.5 to 5, or 0.5 until 3.

Алкилсульфат, алкилалкоксилированный сульфат и алкилбензолсульфонаты могут быть линейными или разветвленными, замещенными или незамещенными.Alkyl sulfate, alkyl alkoxylated sulfate and alkyl benzene sulfonates may be linear or branched, substituted or unsubstituted.

Моющее поверхностно-активное вещество может быть разветвленным в середине цепи моющим поверхностно-активным веществом, в одном аспекте разветвленным в середине цепи анионным моющим поверхностно-активным веществом, в одном аспекте разветвленным в середине цепи алкилсульфатом и/или разветвленным в середине цепи алкилбензолсульфонатом, например, разветвленным в середине цепи алкилсульфатом. В одном аспекте разветвления в середине цепи представляют собой C1-4алкильные группы, как правило, метильные и/или этильные группы.The detergent surfactant can be a mid-branched detergent surfactant, in one aspect a mid-branched anionic detergent surfactant, in one aspect a mid-chain alkyl sulfate and/or a mid-branched alkyl benzene sulfonate, for example, mid-branched alkyl sulfate. In one aspect, the mid chain branches are C1-4 alkyl groups, typically methyl and/or ethyl groups.

Неограничивающие примеры анионных поверхностно-активных веществ включают сульфаты и сульфонаты, в частности, линейные алкилбензолсульфонаты (LAS), изомеры LAS, разветвленные алкилбензолсульфонаты (BABS), фенилалкансульфонаты, альфа-олефинсульфонаты (AOS), олефинсульфонаты, алкенсульфонаты, алкан-2,3-диилбис(сульфаты), гидроксиалкансульфонаты и дисульфонаты, алкилсульфаты (AS), такие как додецилсульфат натрия (SDS), сульфаты жирных спиртов (FAS), сульфаты первичных спиртов (PAS), эфирсульфаты спиртов (AES, или AEOS, или FES, также известные как этоксисульфаты спиртов или эфирсульфаты жирных спиртов); вторичные алкансульфонаты (SAS), сульфонаты парафина (PS), сульфонаты сложных эфиров, сложные эфиры глицерина и сульфонированных жирных кислот, метиловые сложные эфиры жирных альфа-сульфокислот (альфа-SFMe или SES), включая сульфонат сложного метилового эфира (MES), алкил- или алкенилянтарную кислоту, додеценил/тетрадеценил янтарную кислоту (DTSA), жирнокислотные производные аминокислот, сложные диэфиры и моноэфиры сульфоянтарной кислоты или мыло и их комбинации.Non-limiting examples of anionic surfactants include sulfates and sulfonates, particularly linear alkylbenzene sulfonates (LAS), LAS isomers, branched alkyl benzene sulfonates (BABS), phenylalkane sulfonates, alpha-olefin sulfonates (AOS), olefin sulfonates, alkene sulfonates, alkane-2,3-diylbis (sulfates), hydroxyalkane sulfonates and disulfonates, alkyl sulfates (AS), such as sodium dodecyl sulfate (SDS), fatty alcohol sulfates (FAS), primary alcohol sulfates (PAS), alcohol ether sulfates (AES, or AEOS, or FES, also known as ethoxy sulfates alcohols or fatty alcohol ethersulfates); secondary alkanesulfonates (SAS), paraffin sulfonates (PS), ester sulfonates, esters of glycerol and sulfonated fatty acids, methyl esters of fatty alpha sulfonic acids (alpha-SFMe or SES), including methyl ester sulfonate (MES), alkyl- or alkenylsuccinic acid, dodecenyl/tetradecenyl succinic acid (DTSA), fatty acid derivatives of amino acids, diesters and monoesters of sulfosuccinic acid, or soap, and combinations thereof.

Подходящие неионные моющие поверхностно-активные вещества выбраны из группы, состоящей из C8-C18алкилэтоксилатов, таких как NEODOL®; C6-C12алкилфенолалкоксилатов, где алкоксилатные звенья могут представлять собой этиленокси-звенья, пропиленокси-звенья или их смесь; продуктов реакции конденсации C12-C18спирта и C6-C12алкилфенола с блок-полимерами этиленоксид/пропиленоксид, такими как Pluronic®; разветвленных в середине цепи C14-C22спиртов; разветвленных в середине цепи C14-C22алкилалкоксилатов, как правило, характеризующихся средней степенью алкоксилирования от 1 до 30; алкилполисахаридов, в одном аспекте алкилполигликозидов; амидов жирных полигидроксикислот; поверхностно-активных веществ на основе блокированного эфиром поли(оксиалкилированного) спирта и их смесей.Suitable non-ionic detergent surfactants are selected from the group consisting of C8-C18 alkyl ethoxylates such as NEODOL®; C6-C12 alkylphenol alkoxylates, where the alkoxylate units may be ethyleneoxy units, propyleneoxy units, or a mixture thereof; condensation reaction products of C12-C18 alcohol and C6-C12 alkylphenol with ethylene oxide/propylene oxide block polymers such as Pluronic®; branched in the middle of the chain C14-C22 alcohols; mid-branched C14-C22 alkyl alkoxylates, typically characterized by an average degree of alkoxylation from 1 to 30; alkyl polysaccharides, in one aspect alkyl polyglycosides; polyhydroxy fatty acid amides; surfactants based on ether-blocked poly(oxyalkylated) alcohol and mixtures thereof.

Подходящие неионные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилполиглюкозид и/или алкилалкоксилированный спирт.Suitable non-ionic detergent surfactants include alkyl polyglucoside and/or alkyl alkoxylated alcohol.

В одном аспекте неионные моющие поверхностно-активные вещества включают алкилалкоксилированные спирты, в одном аспекте C8-18алкилалкоксилированный спирт, например, C8-18алкилэтоксилированный спирт, алкилалкоксилированный спирт может характеризоваться средней степенью алкоксилирования от 1 до 50, от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10. В одном аспекте алкилалкоксилированный спирт может представлять собой C8-18алкилэтоксилированный спирт, характеризующийся средней степенью этоксилирования от 1 до 10, от 1 до 7, более от 1 до 5 или от 3 до 7. Алкилалкоксилированный спирт может быть линейным или разветвленным и замещенным или незамещенным. Подходящие неионогенные поверхностно-активные вещества включают Lutensol®.In one aspect, the nonionic detergent surfactants include alkyl alkoxylated alcohols, in one aspect a C8-18 alkyl alkoxylated alcohol, e.g. 1 to 10. In one aspect, the alkyl alkoxylated alcohol may be a C8-18 alkyl ethoxylated alcohol having an average degree of ethoxylation of 1 to 10, 1 to 7, greater than 1 to 5, or 3 to 7. The alkyl alkoxylated alcohol may be linear or branched and substituted or unsubstituted. Suitable nonionic surfactants include Lutensol®.

Неограничивающие примеры неионогенных поверхностно-активных веществ включают этоксилаты спирта (AE или AEO), пропоксилаты спирта, пропоксилированные жирные спирты (PFA), алкоксилированные алкиловые сложные эфиры жирной кислоты, например этоксилированные и/или пропоксилированные алкиловые сложные эфиры жирной кислоты, алкилфенолэтоксилаты (APE), нонилфенолэтоксилаты (NPE), алкилполигликозиды (APG), алкоксилированные амины, моноэтаноламиды жирной кислоты (FAM), диэтаноламиды жирной кислоты (FADA), этоксилированные моноэтаноламиды жирной кислоты (EFAM), пропоксилированные моноэтаноламиды жирной кислоты (PFAM), амиды жирной полигидроксиалкилкислоты или N-ацил-N-алкил-производные глюкозамина (глюкамиды, GA или глюкамиды жирной кислоты, FAGA), а также продукты, доступные под торговыми названиями SPAN и TWEEN, и их комбинации.Non-limiting examples of nonionic surfactants include alcohol ethoxylates (AE or AEO), alcohol propoxylates, propoxylated fatty alcohols (PFA), alkoxylated fatty acid alkyl esters, e.g. ethoxylated and/or propoxylated fatty acid alkyl esters, alkylphenol ethoxylates (APEs), nonylphenol ethoxylates (NPE), alkyl polyglycosides (APG), alkoxylated amines, fatty acid monoethanolamides (FAM), fatty acid diethanolamides (FADA), ethoxylated fatty acid monoethanolamides (EFAM), propoxylated fatty acid monoethanolamides (PFAM), polyhydroxyalkyl fatty acid amides or N-acyl -N-alkyl derivatives of glucosamine (glucamides, GA or fatty acid glucamides, FAGA), as well as products available under the trade names SPAN and TWEEN, and combinations thereof.

Подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества включают соединения алкилпиридиния, алкильные соединения четвертичного аммония, алкильные соединения четвертичного фосфония, алкильные соединения третичного сульфония и их смеси.Suitable cationic detergent surfactants include alkyl pyridinium compounds, quaternary ammonium alkyl compounds, quaternary phosphonium alkyl compounds, tertiary sulfonium alkyl compounds, and mixtures thereof.

Подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой соединения четвертичного аммония, имеющие общую формулу (R)(R1)(R2)(R3)N+ X-, где R представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный C6-18алкильный или алкенильный фрагмент, R1 и R2 независимо выбраны из метильного или этильного фрагментов, R3 представляет собой гидроксильный, гидроксиметильный или гидроксиэтильный фрагмент, X представляет собой анион, который обеспечивает нейтральный заряд, подходящие анионы включают галиды, например хлорид; сульфат и сульфонат. Подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой хлориды моно-C6-18алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метил-четвертичного аммония. Наиболее подходящие катионные моющие поверхностно-активные вещества представляют собой хлорид моно-C8-10алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метил-четвертичного аммония, хлорид моно-C10-12алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метил-четвертичного аммония и хлорид моно-C10алкил-моно-гидроксиэтил-ди-метилчетвертичного аммония.Suitable cationic detergent surfactants are quaternary ammonium compounds having the general formula (R)(R1)(R2)(R3)N+ X-, where R is a linear or branched, substituted or unsubstituted C6-18 alkyl or alkenyl moiety, R1 and R2 are independently selected from a methyl or ethyl moiety, R3 is a hydroxyl, hydroxymethyl or hydroxyethyl moiety, X is an anion that provides a neutral charge, suitable anions include halides such as chloride; sulfate and sulfonate. Suitable cationic detergent surfactants are mono-C6-18 alkyl-mono-hydroxyethyl-di-methyl-quaternary ammonium chlorides. The most suitable cationic detergent surfactants are mono-C8-10 alkyl-mono-hydroxyethyl-di-methyl-quaternary ammonium chloride, mono-C10-12 alkyl-mono-hydroxyethyl-di-methyl-quaternary ammonium chloride, and mono-C10 alkyl chloride. -mono-hydroxyethyl-di-methylquaternary ammonium.

Неограничивающие примеры катионных поверхностно-активных веществ включают четвертичный алкилдиметилэтаноламин (ADMEAQ), цетилтриметиламмония бромид (CTAB), диметилдистеариламмония хлорид (DSDMAC) и алкилбензилдиметиламмоний, алкильные соединения четвертичного аммония, соединения алкоксилированного четвертичного аммония (AQA), сложный эфир четвертичных аммониевых соединений и их комбинации.Non-limiting examples of cationic surfactants include quaternary alkyldimethylethanolamine (ADMEAQ), cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), dimethyldistearylammonium chloride (DSDMAC) and alkylbenzyldimethylammonium, alkyl quaternary ammonium compounds, alkoxylated quaternary ammonium compounds (AQA), ester quaternary ammonium compounds, and combinations thereof.

Подходящие амфотерные/цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества включают аминоксиды и бетаины, такие как алкилдиметилбетаины, сульфобетаины или их комбинации. Нейтрализованные амином анионные поверхностно-активные вещества - анионные поверхностно-активные вещества по настоящему изобретению и вспомогательные анионные вторичные поверхностно-активные вещества, могут существовать в кислой форме, и указанную кислую форму можно нейтрализовать с образованием соли поверхностно-активного вещества, которая является необходимой для применения в моющих композициях по настоящему изобретению. Типичные средства для нейтрализации включают основание на основе противоиона металла, например гидроксиды, такие как NaOH или KOH. Дополнительные предпочтительные средства для нейтрализации анионных поверхностно-активных веществ по настоящему изобретению и вспомогательные анионные поверхностно-активные вещества или вторичные поверхностно-активные вещества в их кислых формах включают аммиак, амины или алканоламины. Алканоламины являются предпочтительными. Подходящие неограничивающие примеры включают моноэтаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин и другие линейные или разветвленные алканоламины, известные из уровня техники; например, наиболее предпочтительные алканоламины включают 2-амино-1-пропанол, 1-аминопропанол, моноизопропаноламин или 1-амино-3-пропанол. Нейтрализацию амином можно осуществлять в полной мере или частично, например, часть смеси анионных поверхностно-активных веществ можно нейтрализовать натрием или калием, а часть смеси анионных поверхностно-активных веществ можно нейтрализовать аминами или алканоламинами.Suitable amphoteric/zwitterionic surfactants include amine oxides and betaines such as alkyl dimethyl betaines, sulfo betaines, or combinations thereof. Amine-neutralized anionic surfactants - the anionic surfactants of the present invention and co-anionic secondary surfactants, may exist in an acidic form, and said acidic form may be neutralized to form a surfactant salt which is necessary for use in detergent compositions of the present invention. Typical neutralizing agents include a metal counterion base, such as hydroxides such as NaOH or KOH. Additional preferred anionic surfactant neutralizers of the present invention and anionic co-surfactants or secondary surfactants in their acidic forms include ammonia, amines or alkanolamines. Alkanolamines are preferred. Suitable non-limiting examples include monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine and other linear or branched alkanolamines known in the art; for example, the most preferred alkanolamines include 2-amino-1-propanol, 1-aminopropanol, monoisopropanolamine, or 1-amino-3-propanol. Neutralization with an amine can be carried out in whole or in part, for example, part of the mixture of anionic surfactants can be neutralized with sodium or potassium, and part of the mixture of anionic surfactants can be neutralized with amines or alkanolamines.

Неограничивающие примеры семиполярных поверхностно-активных веществ включают аминоксиды (AO), такие как алкилдиметиламиноксид.Non-limiting examples of semipolar surfactants include amine oxides (AO) such as alkyldimethylamine oxide.

Системы поверхностно-активных веществ, содержащие смеси одного или нескольких анионных и в дополнение к ним одного или нескольких неионогенных поверхностно-активных веществ необязательно с дополнительным поверхностно-активным веществом, таким как катионное поверхностно-активное вещество, могут быть предпочтительными. Предпочтительные весовые соотношения анионного поверхностно-активного вещества и неионогенного поверхностно-активного вещества составляют по меньшей мере 2:1 или по меньшей мере от 1:1 до 1:10.Surfactant systems containing mixtures of one or more anionic and in addition one or more nonionic surfactants, optionally with an additional surfactant such as a cationic surfactant, may be preferred. Preferred weight ratios of anionic surfactant and nonionic surfactant are at least 2:1 or at least 1:1 to 1:10.

В одном аспекте система поверхностно-активных веществ может содержать смесь изопреноидных поверхностно-активных веществ, представленных формулой A и формулой B:In one aspect, the surfactant system may comprise a mixture of isoprenoid surfactants represented by Formula A and Formula B:

где Y представляет собой CH2 или отсутствует, и Z может быть выбран таким образом, что полученное в результате поверхностно-активное вещество выбрано из следующих поверхностно-активных веществ: алкилкарбоксилатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полиалкокси-соединения, алкильного анионного полиалкоксисульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфоната сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе диметиламинооксида, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полигидрокси-соединения, алкильного поверхностно-активного вещества на основе фосфатного сложного эфира, алкилглицеринсульфонатного поверхностно-активного вещества, алкильного полиглюконатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полифосфатного сложного эфира, алкилфосфонатного поверхностно-активного вещества, алкильного полигликозидного поверхностно-активного вещества, алкильного моногликозидного поверхностно-активного вещества, алкильного дикликозидного поверхностно-активного вещества, алкильного сульфосукцинатного поверхностно-активного вещества, алкильного дисульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного дисульфонатного поверхностно-активного вещества, алкильного сульфосукцинаматного поверхностно-активного вещества, алкильного глюкамидного поверхностно-активного вещества, алкильного тауринатного поверхностно-активного вещества, алкильного саркозинатного поверхностно-активного вещества, алкильного глицинатного поверхностно-активного вещества, алкильного изотионатного поверхностно-активного вещества, алкильного диалканоламидного поверхностно-активного вещества, алкильного моноалканоламидного поверхностно-активного вещества, алкильного моноалканоламидсульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного дигликоль-амидного поверхностно-активного вещества, алкильного дигликоль-амидсульфатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфата сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфата эфира глицерина, поверхностно-активного вещества на основе сульфоната алкилметильного сложного эфира, алкильного поверхностно-активного вещества на основе эфира полиглицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сульфата эфира полиглицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сложного эфира сорбитана, алкильного поверхностно-активного вещества на основе аммониоалкансульфоната, алкильного поверхностно-активного вещества на основе амидопропилбетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе аллилированного четвертичного аммониевого соединения, алкильного поверхностно-активного вещества на основе моногидроксиалкил-диалкилированного четвертичного аммониевого соединения, алкильного поверхностно-активного вещества на основе дигидроксиалкилмоноалкильного четвертичного аммониевого соединения, поверхностно-активного вещества на основе алкилированного четвертичного соединения аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе триметиламмониевого четвертичного соединения аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе полигидроксалкилоксипропильного четвертичного соединения аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе четвертичного соединения аммония сложного эфира глицерина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе четвертичного соединения аммония гликольамина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе монометилдигидроксиэтил-четвертичного аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе диметилмоногидроксиэтил-четвертичного аммония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе триметиламмония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе имидазолина, алкен-2-ил-сукцинатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе a-сульфонированной карбоновой кислоты, алкильного поверхностно-активного вещества на основе алкильного сложного эфира a-сульфонированной карбоновой кислоты, альфа-олефинсульфонатного поверхностно-активного вещества, алкилфенолэтоксилатного поверхностно-активного вещества, алкилбензолсульфонатного поверхностно-активного вещества, поверхностно-активного вещества на основе алкилсульфобетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе гидроксисульфобетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе аммониокарбоксилатбетаина, алкильного поверхностно-активного вещества на основе сложного эфира сахарозы, алкильного алканоламидного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе ди(полиоксиэтилен)моноалкиламмония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе моно(полиоксиэтилен)диалкиламмония, алкильного поверхностно-активного вещества на основе бензилдиметиламмония, алкиламинопропионатного поверхностно-активного вещества, алкильного поверхностно-активного вещества на основе амидопропилдиметиламина или их смеси; и если Z представляет собой заряженный фрагмент, то заряд Z уравновешен зарядом подходящего металла или органического противоиона. Подходящие противоионы включают противоионы металлов, амин или алканоламин, например, C1-C6алканоламмоний. Более конкретно, подходящие противоионы включают Na+, Ca+, Li+, K+, Mg+, например, моноэтаноламин (MEA), диэтаноламин (DEA), триэтаноламин (TEA), 2-амино-l-пропанол, 1-аминопропанол, метилдиэтаноламин, диметилэтаноламин, моноизопропаноламин, триизопропаноламин, l-амино-3-пропанол или их смеси. В одном варианте осуществления композиции содержат от 5% до 97% одного или нескольких неизопреноидных поверхностно-активных веществ и одной или нескольких вспомогательных очищающих добавок; причем весовое соотношение поверхностно-активного вещества формулы A и поверхностно-активного вещества формулы B составляет от 50:50 до 95:5.where Y is CH2 or absent and Z can be selected such that the resulting surfactant is selected from the following surfactants: alkyl carboxylate surfactant, polyalkoxy alkyl surfactant, alkyl anionic polyalkoxy sulfate surfactant, glycerol ester sulfonate alkyl surfactant, dimethylamine oxide alkyl surfactant, polyhydroxy alkyl surfactant, phosphate ester alkyl surfactant, alkyl glycerol sulfonate surfactant, alkyl polygluconate surfactant, alkyl polyphosphate ester surfactant, alkyl phosphonate surfactant, alkyl polyglycose alkyl surfactant, alkyl monoglycoside surfactant, alkyl diglycoside surfactant, alkyl sulfosuccinate surfactant, alkyl disulfate surfactant, alkyl disulfonate surfactant, alkyl sulfosuccinamate surfactant, alkyl glucamide surfactant, alkyl taurinate surfactant, alkyl sarcosinate surfactant, alkyl glycinate surfactant, alkyl isothionate surfactant, alkyl dialkanolamide surfactant, alkyl monoalkanolamide surfactant, alkyl monoalkanolamide sulfate surfactant -active agent, alkyl diglycol amide surfactant, alkyl diglycol amide sulfate surface glycerol ester alkyl surfactant, glycerol ester alkyl surfactant, glycerol ester alkyl surfactant, glycerol ester alkyl surfactant, surfactant alkyl methyl ester sulfonate active agent, polyglycerol ether alkyl surfactant, polyglycerol sulfate ether alkyl surfactant, sorbitan ester alkyl surfactant, ammonioalkane sulfonate alkyl surfactant , alkyl surfactant based on amidopropyl betaine, alkyl surfactant based on allylated quaternary ammonium compound, alkyl surfactant based on monohydroxyalkyl dialkylirs quaternary ammonium compound, dihydroxyalkylmonoalkyl quaternary ammonium compound alkyl surfactant, alkylated quaternary ammonium compound surfactant, trimethylammonium quaternary alkyl surfactant, polyhydroxyalkyloxypropyl quaternary alkyl surfactant glycerol ester alkyl quaternary ammonium surfactant, glycolamine quaternary ammonium alkyl surfactant, monomethyldihydroxyethyl quaternary ammonium alkyl surfactant, dimethylmonohydroxyethyl quaternary alkyl surfactant ammonium, trimethylammonium alkyl surfactant, alkyl surfactant imidazoline based agents, alken-2-yl-succinate surfactant, α-sulfonated carboxylic acid alkyl surfactant, α-sulfonated carboxylic acid alkyl ester alkyl surfactant, alpha-olefin sulfonate surfactant -active agent, alkylphenol ethoxylate surfactant, alkylbenzenesulfonate surfactant, alkylsulfobetaine-based surfactant, hydroxysulfobetaine-based alkyl surfactant, ammoniocarboxylate-betaine-based alkyl surfactant, complex-based alkyl surfactant sucrose ester, alkyl alkanolamide surfactant, di(polyoxyethylene)monoalkylammonium alkyl surfactant, mono(polyoxyethylene)dialkylam alkyl surfactant monium, a benzyldimethylammonium alkyl surfactant, an alkylaminopropionate surfactant, an amidopropyldimethylamine alkyl surfactant, or mixtures thereof; and if Z is a charged moiety, then the charge of Z is balanced by the charge of the appropriate metal or organic counterion. Suitable counterions include metal counterions, an amine, or an alkanolamine, such as C1-C6 alkanolammonium. More specifically, suitable counterions include Na+, Ca+, Li+, K+, Mg+, e.g. , triisopropanolamine, l-amino-3-propanol or mixtures thereof. In one embodiment, the compositions contain from 5% to 97% of one or more non-isoprenoid surfactants and one or more cleaning aids; moreover, the weight ratio of the surfactant of formula A and surfactant of formula B is from 50:50 to 95:5.

Мыло. Композиции согласно данному документу могут содержать мыло. Не вдаваясь в теорию, может быть необходимо включить мыло, поскольку оно действует отчасти как поверхностно-активное вещество, а отчасти как моющий компонент и может быть пригодным для гашения пены и, кроме того, может благоприятно взаимодействовать с различными катионными соединениями композиции для повышения мягкости текстильного изделия, обработанного композициями по настоящему изобретению. Может быть применено любое мыло, известное из уровня техники для применения в стиральных порошках. В одном варианте осуществления композиции содержат от 0 вес. % до 20 вес. %, от 0,5 вес. % до 20 вес. %, от 4 вес. % до 10 вес. % или от 4 вес. % до 7 вес. % мыла.Soap. Compositions according to this document may contain soap. Without being bound by theory, it may be necessary to include soap as it acts partly as a surfactant and partly as a detergent and may be suitable for sudsing and, in addition, may interact favorably with various cationic compounds in the composition to improve textile softness. products treated with the compositions of the present invention. Any soap known in the art for use in laundry detergents may be used. In one embodiment, the compositions contain from 0 wt. % up to 20 wt. %, from 0.5 wt. % up to 20 wt. %, from 4 wt. % up to 10 wt. % or from 4 wt. % up to 7 wt. % soap.

Примеры мыла, пригодные согласно данному документу, включают мыла олеиновой кислоты, мыла пальмитиновой кислоты, мыла на основе жирных кислот пальмового ядра и их смеси. Типичные мыла представлены в форме смесей мыл жирной кислоты, характеризующихся разными длинами цепей и степенями замещения. Одна такая смесь представляет собой лишенную легких фракций жирную кислоту пальмового ядра.Examples of soaps useful herein include oleic acid soaps, palmitic acid soaps, palm kernel fatty acid soaps, and mixtures thereof. Typical soaps are in the form of mixtures of fatty acid soaps characterized by different chain lengths and degrees of substitution. One such mixture is a stripped palm kernel fatty acid.

В одном варианте осуществления мыло выбрано из свободной жирной кислоты. Подходящие жирные кислоты являются насыщенными и/или ненасыщенными и могут быть получены из природных источников, например сложных эфиров растительного или животного происхождения (например, масла пальмового ядра, пальмового масла, кокосового масла, масла бабассу, сафлорового масла, таллового масла, касторового масла, животного и рыбьего жира, топленого животного жира и их смесей), или получены синтетически (например, посредством окисления нефти или путем гидрирования монооксида углерода с помощью способа Фишера-Тропша).In one embodiment, the soap is selected from a free fatty acid. Suitable fatty acids are saturated and/or unsaturated and can be obtained from natural sources, such as esters of vegetable or animal origin (for example, palm kernel oil, palm oil, coconut oil, babassu oil, safflower oil, tall oil, castor oil, animal and fish oil, rendered animal fat and mixtures thereof), or obtained synthetically (for example, by oxidation of petroleum or by hydrogenation of carbon monoxide using the Fischer-Tropsch process).

Примеры подходящих насыщенных жирных кислот для применения в композициях по настоящему изобретению включают каприновую, лауриновую, миристиновую, пальмитиновую, стеариновую, арахиновую и бегеновую кислоту. Подходящие виды ненасыщенных жирных кислот включают пальмитолеиновую, олеиновую, линолевую, линоленовую и рицинолевую кислоту. Примерами предпочтительных жирных кислот являются насыщенная Cn-жирная кислота, насыщенные Ci2-Ci4-жирные кислоты и насыщенные или ненасыщенные Cn-Ci8-жирные кислоты и их смеси.Examples of suitable saturated fatty acids for use in the compositions of the present invention include capric, lauric, myristic, palmitic, stearic, arachidic and behenic acid. Suitable types of unsaturated fatty acids include palmitoleic, oleic, linoleic, linolenic and ricinoleic acid. Examples of preferred fatty acids are saturated Cn fatty acids, saturated Ci2-Ci4 fatty acids and saturated or unsaturated Cn-Ci8 fatty acids and mixtures thereof.

Весовое соотношение смягчающего ткань катионного вторичного поверхностно-активного вещества и жирной кислоты, если они присутствуют, составляет предпочтительно от приблизительно 1:3 до приблизительно 3: 1, более предпочтительно от приблизительно 1:1,5 до приблизительно 1,5:1, наиболее предпочтительно приблизительно 1:1.The weight ratio of fabric softening cationic secondary surfactant to fatty acid, if present, is preferably about 1:3 to about 3:1, more preferably about 1:1.5 to about 1.5:1, most preferably approximately 1:1.

Количества мыла и немыльных анионных поверхностно-активных веществ согласно данному документу представляют собой проценты по весу моющей композиции, определенные на основе кислой формы. Однако, как обычно понимают в данной области, анионные поверхностно-активные вещества и мыла на практике нейтрализуют с использованием оснований натрия, калия или алканоламмония, например гидроксида натрия или моноэтаноламина.The amounts of soap and non-soap anionic surfactants according to this document are percentages by weight of the detergent composition based on the acid form. However, as commonly understood in the art, anionic surfactants and soaps are in practice neutralized using sodium, potassium, or alkanolammonium bases, such as sodium hydroxide or monoethanolamine.

Гидротропы. Композиции по настоящему изобретению могут содержать один или несколько гидротропов. Гидротроп представляет собой соединение, которое солюбилизирует гидрофобные соединения в водных растворах (или, в противоположном случае, полярные соединения в неполярном окружении). Как правило, гидротропы имеют как гидрофобный, так и гидрофильный характер (так называемые амфифильные свойства, которые известны у поверхностно-активных веществ); тем не менее, молекулярная структура гидротропов обычно не способствует спонтанной аутоагрегации, см., например, обзор в Hodgdon and Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. У гидротропов не проявляется критическая концентрация, выше которой происходит аутоагрегация, что обнаруживается у поверхностно-активных веществ и липидов, образующих мицеллярные, ламеллярные или другие хорошо определенные мезофазы. Между тем, у многих гидротропов наблюдается процесс агрегации непрерывного типа, при этом размеры агрегатов растут по мере увеличения концентрации. Тем не менее, многие гидротропы изменяют фазовое поведение, стабильность и коллоидные свойства систем, содержащих вещества полярного и неполярного характера, в том числе смеси воды, масла, поверхностно-активных веществ и полимеров. Гидротропы обычно применяют в отраслях, начиная от фармацевтики, личной гигиены, пищевой промышленности и заканчивая применениями в технике. Применение гидротропов в моющих композициях дает, например, более концентрированные составы поверхностно-активных веществ (например, в процессе уплотнения жидких моющих средств путем удаления воды), не вызывая нежелательные явления, такие как разделение фаз или высокая вязкость.Hydrotropes. The compositions of the present invention may contain one or more hydrotropes. A hydrotrope is a compound that solubilizes hydrophobic compounds in aqueous solutions (or, alternatively, polar compounds in a non-polar environment). Typically, hydrotropes are both hydrophobic and hydrophilic in nature (the so-called amphiphilic properties that are known in surfactants); however, the molecular structure of hydrotropes generally does not favor spontaneous autoaggregation, see for example a review in Hodgdon and Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Hydrotropes do not show a critical concentration above which autoaggregation occurs, as found in surfactants and lipids that form micellar, lamellar, or other well-defined mesophases. Meanwhile, in many hydrotropes, the process of aggregation of a continuous type is observed, while the size of the aggregates grows with increasing concentration. However, many hydrotropes change the phase behavior, stability, and colloidal properties of systems containing polar and non-polar substances, including mixtures of water, oil, surfactants, and polymers. Hydrotropes are commonly used in industries ranging from pharmaceuticals, personal care, food processing to engineering applications. The use of hydrotropes in detergent compositions results in, for example, more concentrated surfactant formulations (eg in the process of compacting liquid detergents by removing water) without causing undesirable phenomena such as phase separation or high viscosity.

Моющее средство может содержать от 0 до 10 вес. %, например от 0 до 5 вес. %, от 0,5 до 5 вес. % или от 3% до 5 вес. % гидротропа. Для применения в моющих средствах можно применять любой гидротроп, известный в данной области техники. Неограничивающие примеры гидротропов включают бензолсульфонат натрия, п-толуолсульфонат натрия (STS), ксилолсульфонат натрия (SXS), кумолсульфонат натрия (SCS), цимолсульфонат натрия, аминоксиды, спирты и полигликолевые эфиры, гидроксинафтоат натрия, гидроксинафталинсульфонат натрия, этилгексилсульфат натрия и их комбинации.The detergent may contain from 0 to 10 wt. %, for example from 0 to 5 wt. %, from 0.5 to 5 wt. % or from 3% to 5 wt. % hydrotrope. For use in detergents, any hydrotrope known in the art can be used. Non-limiting examples of hydrotropes include sodium benzenesulfonate, sodium p-toluenesulfonate (STS), sodium xylenesulfonate (SXS), sodium cumenesulfonate (SCS), sodium cymolesulfonate, amine oxides, alcohols and polyglycol ethers, sodium hydroxynaphthoate, sodium hydroxynaphthalenesulfonate, sodium ethylhexyl sulfate, and combinations thereof.

Моющие компоненты. Композиции по настоящему изобретению могут содержать одно или несколько их моющих компонентов, вспомогательных моющих компонентов, систем моющих компонентов или их смесь. Если применяют моющий компонент, очищающая композиция, как правило, будет содержать от 0 до 65 вес. %, по меньшей мере 1 вес. %, от 2 до 60 вес. % или от 5 до 10 вес. % моющего компонента. В очищающей композиции для мытья посуды количество моющего компонента, как правило, составляет от 40 до 65 вес. % или от 50 до 65 вес. %. Композиция может, по сути, не содержать моющий компонент; "по сути не содержит" означает "намеренно не добавлен" цеолит и/или фосфат. Типичные цеолитные моющие компоненты включают цеолит A, цеолит P и цеолит MAP. Типичный фосфатный моющий компонент представляет собой триполифосфат натрия.detergent components. The compositions of the present invention may contain one or more of the builders, builder builders, builder systems, or a mixture thereof. If a detergent component is used, the cleaning composition will typically contain from 0 to 65 wt. %, at least 1 wt. %, from 2 to 60 wt. % or from 5 to 10 wt. % detergent component. In a dishwashing cleaning composition, the amount of detergent component is typically 40 to 65 wt. % or from 50 to 65 wt. %. The composition may, in fact, not contain a detergent component; "substantially free" means "not intentionally added" zeolite and/or phosphate. Typical zeolite builders include zeolite A, zeolite P, and zeolite MAP. A typical phosphate builder is sodium tripolyphosphate.

Моющий компонент и/или вспомогательный моющий компонент могут представлять собой, в частности, хелатирующее средство, которое образует растворимые в воде комплексы с Ca и Mg. Можно применять любой моющий компонент и/или вспомогательный моющий компонент, известные из уровня техники для применения в моющих средствах. Неограничивающие примеры моющих компонентов включают цеолиты, дифосфаты (пирофосфаты), трифосфаты, такие как трифосфат натрия (STP или STPP), карбонаты, такие как карбонат натрия, растворимые силикаты, такие как метасиликат натрия, слоистые силикаты (например, SKS-6 от Hoechst), этаноламины, такие как 2-аминоэтан-1-ол (MEA), иминодиэтанол (DEA) и 2,2',2''-нитрилотриэтанол (TEA), и карбоксиметилинулин (CMI) и их комбинации.The builder and/or builder may in particular be a chelating agent which forms water-soluble complexes with Ca and Mg. Any builder and/or detergent builder known in the art for use in detergents may be used. Non-limiting examples of builders include zeolites, diphosphates (pyrophosphates), triphosphates such as sodium triphosphate (STP or STPP), carbonates such as sodium carbonate, soluble silicates such as sodium metasilicate, layered silicates (e.g. SKS-6 from Hoechst) , ethanolamines such as 2-aminoethan-1-ol (MEA), iminodiethanol (DEA) and 2,2',2''-nitrilotriethanol (TEA), and carboxymethyl inulin (CMI), and combinations thereof.

Очищающая композиция может включать вспомогательный моющий компонент отдельно или в комбинации с моющим компонентом, например, цеолитным моющим компонентом. Неограничивающие примеры вспомогательных моющих компонентов включают гомополимеры полиакрилатов или их сополимеры, такие как поли(акриловая кислота) (PAA) или сополимер акриловой кислоты/малеиновой кислоты (PAA/PMA). Дополнительные неограничивающие примеры включают цитрат, хелатирующие средства, такие как аминокарбоксилаты, аминополикарбоксилаты, а также фосфонаты и алкил- или алкенилянтарную кислоту. Дополнительные конкретные примеры включают 2,2',2''-нитрилотриуксусную кислоту (NTA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), иминодиянтарую кислоту (IDS), этилендиамин-N, N'-диянтарную кислоту (EDDS), метилглициндиуксусную кислоту (MGDA), глутамовую кислоту-N, N-диуксусную кислоту (GLDA), 1-гидроксиэтан-1,1-диилбис(фосфоновую кислоту) (HEDP), этилендиаминтетракис(метилен)тетракис(фосфоновую кислоту) (EDTMPA), диэтилентриаминпентакис(метилен)пентакис(фосфоновую кислоту) (DTPMPA), N-(2-гидроксиэтил)иминодиуксусную кислоту (EDG), аспарагиновую кислоту-N-моноуксусную кислоту (ASMA), аспарагиновую кислоту-N, N-диуксусную кислоту (ASDA), аспарагиновую кислоту-N-монопропионовую кислоту (ASMP), иминодиянтарную кислоту (IDA), N-(2-сульфометил)-аспарагиновую кислоту (SMAS), N-(2-сульфоэтил)аспарагиновую кислоту (SEAS), N-(2-сульфометил)-глутаминовую кислоту (SMGL), N-(2-сульфоэтил) глутаминовую кислоту (SEGL), N-метилиминодиуксусную кислоту (MIDA), α-аланин-N, N-диуксусную кислоту (α-ALDA), серин-N, N-диуксусную кислоту (SEDA), изосерин-N, N-диуксусную кислоту (ISDA), фенилаланин-N, N-диуксусную кислоту (PHDA), антраниловую кислоту-N, N-диуксусную кислоту (ANDA), сульфаниловую кислоту-N, N-диуксусную кислоту (SLDA), таурин-N, N-диуксусную кислоту (TUDA) и сульфометил-N, N-диуксусную кислоту (SMDA), N-(гидроксиэтил)-этилидендиаминтриацетат (HEDTA), диэтанолглицин (DEG), диэтилентриамин-пента-(метиленфосфоновую кислоту) (DTPMP), аминотрис(метиленфосфоновую кислоту) (ATMP) и их комбинации и соли. Дополнительные иллюстративные моющие компоненты и/или вспомогательные моющие компоненты описаны, например, в WO09/102854, US5977053.The cleaning composition may include an auxiliary detergent component alone or in combination with a detergent component, for example, a zeolite detergent component. Non-limiting examples of builder aids include polyacrylate homopolymers or copolymers thereof such as poly(acrylic acid) (PAA) or acrylic acid/maleic acid copolymer (PAA/PMA). Additional non-limiting examples include citrate, chelating agents such as aminocarboxylates, aminopolycarboxylates, as well as phosphonates, and alkyl or alkenyl succinic acid. Additional specific examples include 2,2',2''-nitrilotriacetic acid (NTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), iminodisuccinic acid (IDS), ethylenediamine-N,N'-disuccinic acid (EDDS), methylglycine diacetic acid (MGDA), glutamic acid-N,N-diacetic acid (GLDA), 1-hydroxyethane-1,1-diylbis(phosphonic acid) (HEDP), ethylenediaminetetrakis(methylene)tetrakis(phosphonic acid) (EDTMPA), diethylenetriaminepentakis (methylene)pentakis(phosphonic acid) (DTPMPA), N-(2-hydroxyethyl)iminodiacetic acid (EDG), aspartic acid-N-monoacetic acid (ASMA), aspartic acid-N, N-diacetic acid (ASDA), aspartic acid-N-monopropionic acid (ASMP), iminodisuccinic acid (IDA), N-(2-sulfomethyl)-aspartic acid (SMAS), N-(2-sulfoethyl)aspartic acid (SEAS), N-(2-sulfomethyl) -glutamic acid (SMGL), N-(2-sulfoethyl)glutamic acid (SEGL), N-methyliminodiacetic acid (MIDA), α-alanine-N, N-diacetic acid (α-ALDA), serine-N, N-diacetic acid (SEDA), isoserine-N, N-diacetic acid (ISDA), phenylalanine-N, N-diacetic acid (PHDA ), anthranilic acid-N,N-diacetic acid (ANDA), sulfanilic acid-N,N-diacetic acid (SLDA), taurine-N,N-diacetic acid (TUDA), and sulfomethyl-N,N-diacetic acid (SMDA ), N-(hydroxyethyl)-ethylidene diamine triacetate (HEDTA), diethanol glycine (DEG), diethylenetriamine-penta-(methylenephosphonic acid) (DTPMP), aminotris(methylenephosphonic acid) (ATMP), and combinations and salts thereof. Additional illustrative detergent components and/or auxiliary detergent components are described, for example, in WO09/102854, US5977053.

Хелатирующие средства и ингибиторы роста кристаллов. Композиции согласно данному документу могут содержать хелатирующее средство и/или ингибитор роста кристаллов. Подходящие молекулы включают хелатирующие средства на основе меди, железа и/или марганца и их смеси. Подходящие молекулы включают DTPA (диэтилентриаминпентауксусную кислоту), HEDP (гидроксиэтандифосфоновую кислоту), DTPMP (диэтилентриаминпента(метиленфосфоновую кислоту)), гидрат динатриевой соли 1,2-дигидроксибензол-3,5-дисульфоновой кислоты, этилендиамин, диэтилентриамин, этилендиаминдиянтарную кислоту (EDDS), N-гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту (HEDTA), триэтилентетраамингексауксусную кислоту (TTHA), N-гидроксиэтилиминодиуксусную кислоту (HEIDA), дигидроксиэтилглицин (DHEG), этилендиаминтетрапропионовую кислоту (EDTP), карбоксиметилинулин и 2-фосфонобутан-1,2,4-трикарбоновую кислоту (Bayhibit® AM) и их производные. Как правило, композиция может содержать от 0,005 до 15 вес. % или от 3,0 до 10 вес. % хелатирующего средства или ингибитора роста кристаллов.Chelating agents and crystal growth inhibitors. Compositions according to this document may contain a chelating agent and/or a crystal growth inhibitor. Suitable molecules include copper, iron and/or manganese based chelating agents and mixtures thereof. Suitable molecules include DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid), HEDP (hydroxyethanediphosphonic acid), DTPMP (diethylenetriaminepenta(methylenephosphonic acid)), 1,2-dihydroxybenzene-3,5-disulfonic acid disodium salt hydrate, ethylenediamine, diethylenetriamine, ethylenediaminedisuccinic acid (EDDS), N-hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA), triethylenetetraaminehexaacetic acid (TTHA), N-hydroxyethyliminodiacetic acid (HEIDA), dihydroxyethylglycine (DHEG), ethylenediaminetetrapropionic acid (EDTP), carboxymethylinulin and 2-phosphonobutane-1,2,4-tricarboxylic acid (Bayhibit® AM) and their derivatives. Typically, the composition may contain from 0.005 to 15 wt. % or from 3.0 to 10 wt. % chelating agent or crystal growth inhibitor.

Отбеливающий компонент. Отбеливающий компонент, подходящий для включения в способы и композиции по настоящему изобретению, включает один или смесь более чем одного отбеливающего компонента. Подходящие отбеливающие компоненты включают катализаторы отбеливания, фотоотбеливатели, активаторы отбеливания, пероксид водорода, источники пероксида водорода, предварительно образованные перкислоты и их смеси. В общем, если применяют отбеливающий компонент, композиции по настоящему изобретению могут содержать от 0 до 30 вес. %, от 0,00001 до 90 вес. %, от 0,0001 до 50 вес. %, от 0,001 до 25 вес. % или от 1 до 20 вес. %. Примеры подходящих отбеливающих компонентов включаютwhitening ingredient. A whitening agent suitable for inclusion in the methods and compositions of the present invention comprises one or a mixture of more than one whitening agent. Suitable bleaching agents include bleaching catalysts, photobleaching agents, bleaching activators, hydrogen peroxide, hydrogen peroxide sources, preformed peracids, and mixtures thereof. In general, if a whitening component is used, the compositions of the present invention may contain from 0 to 30 wt. %, from 0.00001 to 90 wt. %, from 0.0001 to 50 wt. %, from 0.001 to 25 wt. % or from 1 to 20 wt. %. Examples of suitable whitening ingredients include

(1) предварительно образованные перкислоты: подходящие предварительно образованные перкислоты включают без ограничения соединения, выбранные из группы, состоящей из предварительно образованных пероксикислот или их солей, как правило, либо пероксикарбоновую кислоту или ее соль, либо пероксисульфоновую кислоту или ее соль.(1) preformed peracids: Suitable preformed peracids include, without limitation, compounds selected from the group consisting of preformed peroxyacids or salts thereof, typically either peroxycarboxylic acid or a salt thereof or peroxysulfonic acid or a salt thereof.

Предварительно образованная пероксикислота или ее соль предпочтительно представляют собой пероксикарбоновую кислоту или ее соль, как правило, имеющую химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:The preformed peroxyacid or salt thereof is preferably a peroxycarboxylic acid or salt thereof, generally having a chemical structure corresponding to the following chemical formula:

где R14 выбран из алкила, аралкила, циклоалкила, арила или гетероциклических групп; группа R14 может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; и Y представляет собой любой подходящий противоион, который обеспечивает нейтральный электрический заряд, предпочтительно Y выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно R14 представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный C6-9алкил. Предпочтительно пероксикислота или ее соль выбрана из пероксигексановой кислоты, пероксигептановой кислоты, пероксиоктановой кислоты, пероксинонановой кислоты, пероксидекановой кислоты, любой их соли или любой их комбинации. Особенно предпочтительными пероксикислотами являются фталимидо-перокси-алкановые кислоты, в частности, ε-фталимидо-перокси-гексановая кислота (PAP). Предпочтительно пероксикислота или ее соль характеризуется точкой плавления в диапазоне от 30°C до 60°C.where R14 is selected from alkyl, aralkyl, cycloalkyl, aryl or heterocyclic groups; the R14 group may be linear or branched, substituted or unsubstituted; and Y is any suitable counterion that provides a neutral electrical charge, preferably Y is selected from hydrogen, sodium or potassium. Preferably R14 is linear or branched, substituted or unsubstituted C6-9 alkyl. Preferably, the peroxyacid or salt thereof is selected from peroxyhexanoic acid, peroxyheptanoic acid, peroxyoctanoic acid, peroxynonanoic acid, peroxydecanoic acid, any salt thereof, or any combination thereof. Particularly preferred peroxy acids are phthalimido-peroxy-alkanoic acids, in particular ε-phthalimido-peroxy-hexanoic acid (PAP). Preferably, the peroxyacid or salt thereof has a melting point in the range of 30°C to 60°C.

Предварительно образованная пероксикислота или ее соль также могут представлять собой пероксисульфоновую кислоту или ее соль, как правило, имеющую химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:The preformed peroxyacid or salt thereof may also be peroxysulfonic acid or a salt thereof, generally having a chemical structure corresponding to the following chemical formula:

где R15 выбран из алкила, аралкила, циклоалкила, арила или гетероциклических групп; группа R15 может быть линейной или разветвленной, замещенной или незамещенной; и Z представляет собой любой подходящий противоион, который обеспечивает нейтральный электрический заряд, предпочтительно Z выбран из водорода, натрия или калия. Предпочтительно R15 представляет собой линейный или разветвленный, замещенный или незамещенный C6-9алкил. Предпочтительно такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению в количестве от 0,01 до 50 вес. % или от 0,1 до 20 вес. %.where R15 is selected from alkyl, aralkyl, cycloalkyl, aryl or heterocyclic groups; the R15 group may be linear or branched, substituted or unsubstituted; and Z is any suitable counterion that provides a neutral electrical charge, preferably Z is selected from hydrogen, sodium or potassium. Preferably R15 is linear or branched, substituted or unsubstituted C6-9 alkyl. Preferably, such whitening components may be present in the compositions of the present invention in an amount of from 0.01 to 50 wt. % or from 0.1 to 20 wt. %.

(2) Источники пероксида водорода включают, например, неорганические пергидратные соли, в том числе соли щелочных металлов, например натриевые соли пербората (обычно моно- или тетра-гидраты), перкарбонатные, персульфатные, перфосфатные, персиликатные соли и их смеси. В одном аспекте настоящего изобретения неорганические пергидратные соли, например соли, выбранные из группы, состоящей из натриевых солей пербората, перкарбоната и их смесей. При использовании неорганические пергидратные соли, как правило, присутствуют в количестве от 0,05 до 40 вес. % или от 1 до 30 вес. % от общей композиции и их, как правило, вводят в такие композиции в виде кристаллического твердого вещества, на которое может быть нанесено покрытие. Подходящие покрытия включают неорганические соли, такие как силикат щелочного металла, карбонатные или боратные соли или их смеси, или органические материалы, такие как растворимые в воде или диспергируемые полимеры, воски, масла или жирные мыла. Предпочтительно такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению в количестве от 0,01 до 50 вес. % или от 0,1 до 20 вес. %.(2) Sources of hydrogen peroxide include, for example, inorganic perhydrate salts, including alkali metal salts, such as sodium perborate salts (usually mono- or tetra-hydrates), percarbonate, persulfate, perphosphate, persilicate salts, and mixtures thereof. In one aspect of the present invention, inorganic perhydrate salts, for example salts selected from the group consisting of sodium salts of perborate, percarbonate and mixtures thereof. When used, inorganic perhydrate salts are typically present in an amount of 0.05 to 40 wt. % or from 1 to 30 wt. % of the total composition and are typically incorporated into such compositions as a crystalline solid that can be coated. Suitable coatings include inorganic salts such as alkali metal silicate, carbonate or borate salts or mixtures thereof, or organic materials such as water soluble or dispersible polymers, waxes, oils or fatty soaps. Preferably, such bleaching components may be present in the compositions of the present invention in an amount of from 0.01 to 50 wt. % or from 0.1 to 20 wt. %.

(3) Под выражением "активатор отбеливания" в данном документе понимают соединение, которое реагирует с пероксидом водорода с образованием перкислоты посредством пергидролиза. Перкислота, полученная таким образом, представляет собой активированный отбеливатель. Подходящие активаторы отбеливания для применения согласно данному документу включают активаторы, принадлежащие к классу сложных эфиров, амидов, имидов или ангидридов. Подходящими активаторами отбеливания являются активаторы, содержащие R-(C=O)-L, где R представляет собой алкильную группу, необязательно разветвленную, имеющую, если активатор отбеливания является гидрофобным, от 6 до 14 атомов углерода или от 8 до 12 атомов углерода и, если активатор отбеливания является гидрофильным, менее 6 атомов углерода или менее 4 атомов углерода; а L представляет собой уходящую группу. Примерами подходящих уходящих групп являются бензойная кислота и ее производные, в частности, бензолсульфонат. Подходящие активаторы отбеливания включают додеканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензолсульфонат, деканоилоксибензойную кислоту или ее соли, 3,5,5-триметилгексаноилоксибензолсульфонат, тетраaцетилэтилендиамин (TAED), 4-[(3,5,5-триметилгексаноил)окси]бензол-1-сульфонат натрия (ISONOBS), 4-(додеканоилокси)бензол-1-сульфонат (LOBS), 4-(деканоилокси)бензол-1-сульфонат, 4-(деканоилокси)бензоат (DOBS или DOBA), 4-(нонаноилокси)бензол-1-сульфонат (NOBS) и/или активаторы, раскрытые в WO98/17767. Семейство активаторов отбеливания раскрыто в EP624154, и наиболее предпочтительным в данном семействе является aцетилтриэтилцитрат (ATC). Преимущество ATC или короткоцепочечного триглицерида, такого как триацетин, заключается в том, что он является экологически безопасным. Кроме того, aцетилтриэтилцитрат и триацетин имеют хорошую гидролитическую стабильность в продукте при хранении и являются эффективными активаторами отбеливания. Наконец, ATC является многофункциональным, поскольку цитрат, высвобождаемый в ходе реакции пергидролиза, может действовать в качестве моющего компонента. Альтернативно, отбеливающая система может содержать пероксикислоты, например, амидного, имидного или сульфонового типа. Отбеливающая система может дополнительно содержать перкислоты, такие как 6-(фталимидо)пероксигексановая кислота (PAP). Подходящие активаторы отбеливания также раскрыты в WO98/17767. Поскольку можно использовать любой подходящий активатор отбеливания, в одном аспекте настоящего изобретения очищающая композиция по настоящему изобретению может содержать NOBS, TAED или их смеси. Перкислота и/или активатор отбеливания, если они присутствуют, как правило, присутствуют в композиции в количестве от 0,1 до 60 вес. %, от 0,5 до 40 вес. % или от 0,6 до 10 вес. % по весу ткани и композиции для ухода за домом. Одну или несколько гидрофобных перкислот или их предшественников можно применять в комбинации с одной или несколькими гидрофильными перкислотами или их предшественниками. Предпочтительно такие отбеливающие компоненты могут присутствовать в композициях по настоящему изобретению в количестве от 0,01 до 50 вес. % или от 0,1 до 20 вес. %.(3) The expression "bleaching activator" in this document means a compound that reacts with hydrogen peroxide to form peracid through perhydrolysis. The peracid thus obtained is an activated bleach. Suitable bleach activators for use herein include activators belonging to the class of esters, amides, imides, or anhydrides. Suitable bleach activators are those containing R-(C=O)-L, where R is an optionally branched alkyl group having, if the bleach activator is hydrophobic, 6 to 14 carbon atoms or 8 to 12 carbon atoms and, if the bleach activator is hydrophilic, less than 6 carbon atoms or less than 4 carbon atoms; and L is a leaving group. Examples of suitable leaving groups are benzoic acid and its derivatives, in particular benzenesulfonate. Suitable bleach activators include dodecanoyloxybenzenesulfonate, decanoyloxybenzenesulfonate, decanoyloxybenzoic acid or salts thereof, 3,5,5-trimethylhexanoyloxybenzenesulfonate, tetraacetylethylenediamine (TAED), 4-[(3,5,5-trimethylhexanoyl)oxy]benzene-1-sulfonate sodium (ISONOBS) , 4-(dodecanoyloxy)benzene-1-sulfonate (LOBS), 4-(decanoyloxy)benzene-1-sulfonate, 4-(decanoyloxy)benzoate (DOBS or DOBA), 4-(nonanoyloxy)benzene-1-sulfonate (NOBS ) and/or activators disclosed in WO98/17767. A family of bleach activators is disclosed in EP624154 and the most preferred within this family is acetyl triethyl citrate (ATC). The advantage of ATC or a short chain triglyceride such as triacetin is that it is environmentally friendly. In addition, acetyltriethylcitrate and triacetin have good hydrolytic stability in the product during storage and are effective bleach activators. Finally, ATC is multifunctional because the citrate released during the perhydrolysis reaction can act as a detergent. Alternatively, the bleaching system may contain peroxyacids, for example of the amide, imide, or sulfonic type. The bleaching system may further contain peracids such as 6-(phthalimido)peroxyhexanoic acid (PAP). Suitable bleach activators are also disclosed in WO98/17767. Since any suitable bleach activator may be used, in one aspect of the present invention, the cleaning composition of the present invention may contain NOBS, TAED, or mixtures thereof. The peracid and/or bleach activator, if present, are typically present in the composition in an amount of from 0.1 to 60 wt. %, from 0.5 to 40 wt. % or from 0.6 to 10 wt. % by weight of fabric and home care composition. One or more hydrophobic peracids or their precursors may be used in combination with one or more hydrophilic peracids or their precursors. Preferably, such whitening components may be present in the compositions of the present invention in an amount of from 0.01 to 50 wt. % or from 0.1 to 20 wt. %.

Количества источника пероксида водорода и перкислоты или активатора отбеливания могут быть выбраны таким образом, что молярное отношение доступного кислорода (из источника пероксида) к перкислоте составляет от 1:1 до 35:1 или даже от 2:1 до 10:1.The amounts of hydrogen peroxide source and peracid or bleach activator can be chosen such that the molar ratio of available oxygen (from peroxide source) to peracid is from 1:1 to 35:1, or even from 2:1 to 10:1.

(4) Диацилпероксиды. Предпочтительные диацилпероксидные виды отбеливающих средств включают диацилпероксиды, выбранные из диацилпероксидов общей формулы R1-C(O)-OO-(O)C-R2, в которой R1 представляет собой C6-C18алкильную, предпочтительно C6-C12алкильную группу, содержащую линейную цепь по меньшей мере из 5 атомов углерода и необязательно содержащую один или несколько заместителей (например, -N+ (CH3)3, -COOH или -CN) и/или один или несколько прерывающих фрагментов (например, -CONH- или -CH=CH-), вставленных между соседними атомами углерода алкильного радикала, а R2 представляет собой алифатическую группу, совместимую с пероксидным фрагментом, таким образом, что R1 и R2 вместе содержат в общем от 8 до 30 атомов углерода. В одном предпочтительном аспекте R1 и R2 представляют собой линейные незамещенные C6-C12алкильные цепи. Наиболее предпочтительно R1 и R2 являются идентичными. Диацилпероксиды, в которых и R1, и R2 представляют собой C6-C12алкильные группы, являются особенно предпочтительными. Предпочтительно по меньшей мере одна из, наиболее предпочтительно только одна из R-групп (R1 или R2) не содержит разветвлений или боковых колец в альфа-положении, или предпочтительно ни в альфа-положении, ни в бета-положении, или наиболее предпочтительно ни в одном из альфа-, или бета-, или гамма-положений. В одном следующем предпочтительном варианте осуществления DAP может быть асимметричным, так что предпочтительно гидролиз R1-ацильной группы является быстрым с образованием перкислот, но гидролиз R2-ацильной группы является медленным.(4) Diacyl peroxides. Preferred diacyl peroxide types of bleaches include diacyl peroxides selected from diacyl peroxides of the general formula R1-C(O)-OO-(O)C-R2, in which R1 is a C6-C18 alkyl, preferably a C6-C12 alkyl group containing a linear chain of at least of 5 carbon atoms and optionally containing one or more substituents (e.g. -N+ (CH3)3, -COOH or -CN) and/or one or more interrupting moieties (e.g. -CONH- or -CH=CH-) inserted between adjacent carbon atoms of the alkyl radical, and R2 is an aliphatic group compatible with the peroxide moiety, such that R1 and R2 together contain from 8 to 30 carbon atoms in total. In one preferred aspect, R1 and R2 are linear unsubstituted C6-C12 alkyl chains. Most preferably R1 and R2 are identical. Diacyl peroxides in which both R1 and R2 are C6-C12 alkyl groups are particularly preferred. Preferably at least one of, most preferably only one of the R groups (R1 or R2) contains no branches or side rings in the alpha position, or preferably neither in the alpha position nor in the beta position, or most preferably in neither one of the alpha, or beta, or gamma positions. In one further preferred embodiment, the DAP may be asymmetric, such that preferably the hydrolysis of the R1-acyl group is rapid to form peracids, but the hydrolysis of the R2-acyl group is slow.

Тетраацилпероксидные виды отбеливающих средств предпочтительно выбраны из тетраацилпероксидов общей формулы R3-C(O)-OO-C(O)-(CH2)n-C(O)-OO-C(O)-R3, в которой R3 представляет собой C1-C9алкил или C3-C7группу, а n представляет собой целое число от 2 до 12 или от 4 до 10 включительно.The tetraacyl peroxide types of bleaches are preferably selected from tetraacyl peroxides of the general formula R3-C(O)-OO-C(O)-(CH2)n-C(O)-OO-C(O)-R3 in which R3 is C1-C9 alkyl or a C3-C7 group, and n is an integer from 2 to 12 or from 4 to 10 inclusive.

Предпочтительно диацилпероксидный и/или тетраацилпероксидный вид отбеливающих средств присутствует в количестве, достаточном для обеспечения по меньшей мере 0,5 ppm, по меньшей мере 10 ppm или по меньшей мере 50 ppm по весу моющего раствора. В предпочтительном варианте осуществления вид отбеливающего средства присутствует в количестве, достаточном для обеспечения от 0,5 до 300 ppm, от 30 до 150 ppm по весу моющего раствора.Preferably, the diacyl peroxide and/or tetraacyl peroxide type of bleaching agent is present in an amount sufficient to provide at least 0.5 ppm, at least 10 ppm or at least 50 ppm by weight of the cleaning solution. In a preferred embodiment, the type of bleaching agent is present in an amount sufficient to provide 0.5 to 300 ppm, 30 to 150 ppm by weight of the cleaning solution.

Предпочтительно отбеливающий компонент содержит катализатор отбеливания (5 и 6).Preferably the bleach component contains a bleach catalyst (5 and 6).

(5) Предпочтительными являются органические (неметаллические) катализаторы отбеливания, включающие катализатор отбеливания, способный принимать атом кислорода от пероксикислоты и/или ее соли и переносить атом кислорода к окисляемому субстрату. Подходящие катализаторы отбеливания включают без ограничения иминиевые катионы и полиионы; иминиевые цвиттерионы; модифицированные амины; модифицированные аминоксиды; N-сульфонилимины; N-фосфонилимины; N-ацилимины; тиадиазолдиоксиды; перфторимины; циклические кетосахара и их смеси.(5) Organic (non-metallic) bleach catalysts are preferred, including a bleach catalyst capable of accepting an oxygen atom from a peroxy acid and/or a salt thereof and transferring an oxygen atom to an oxidizable substrate. Suitable bleach catalysts include, without limitation, iminium cations and polyions; iminium zwitterions; modified amines; modified amine oxides; N-sulfonylimines; N-phosphonylimines; N-acylimines; thiadiazole dioxides; perfluorimines; cyclic ketosaccharides and mixtures thereof.

Подходящие иминиевые катионы и полиионы включают без ограничения тетрафторборат N-метил-3,4-дигидроизохинолиния, полученный как описано в Tetrahedron (1992), 49(2), 423-38 (например, соединение 4, стр. 433); п-толуолсульфонат N-метил-3,4-дигидроизохинолиния, полученный как описано в US5360569 (например, колонка 11, пример 1); и п-толуолсульфонат N-октил-3,4-дигидроизохинолиния, полученный как описано в US5360568 (например, колонка 10, прим. 3).Suitable iminium cations and polyions include, but are not limited to, N-methyl-3,4-dihydroisoquinolinium tetrafluoroborate prepared as described in Tetrahedron (1992), 49(2), 423-38 (eg compound 4, page 433); N-methyl-3,4-dihydroisoquinolinium p-toluenesulfonate prepared as described in US5360569 (eg column 11, example 1); and N-octyl-3,4-dihydroisoquinolinium p-toluenesulfonate prepared as described in US5360568 (eg column 10, note 3).

Подходящие иминиевые цвиттерионы включают без ограничения N-(3-сульфопропил)-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль, полученную как описано в US5576282 (например, колонка 31, прим. II); N-[2-(сульфоокси)додецил]-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль, полученную как описано в US5817614 (например, колонка 32, прим. V); 2-[3-[(2-этилгексил)окси]-2-(сульфоокси)пропил]-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль, полученную как описано в WO05/047264 (например, стр. 18, прим. 8) и 2-[3-[(2-бутилоктил)окси]-2-(сульфоокси)пропил]-3,4-дигидроизохинолиний, внутреннюю соль.Suitable iminium zwitterions include, but are not limited to, N-(3-sulfopropyl)-3,4-dihydroisoquinolinium, an internal salt prepared as described in US5576282 (eg column 31, note II); N-[2-(sulfooxy)dodecyl]-3,4-dihydroisoquinolinium, internal salt, prepared as described in US5817614 (eg column 32, note V); 2-[3-[(2-ethylhexyl)oxy]-2-(sulfooxy)propyl]-3,4-dihydroisoquinolinium, internal salt prepared as described in WO05/047264 (e.g. page 18, note 8) and 2-[3-[(2-butyloctyl)oxy]-2-(sulfooxy)propyl]-3,4-dihydroisoquinolinium internal salt.

Подходящие модифицированные аминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения 1,2,3,4-тетрагидро-2-метил-1-изохинолинол, который может быть получен в соответствием с процедурами, описанными в Tetrahedron Letters (1987), 28(48), 6061-6064. Подходящие модифицированные аминоксидные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения натрия 1-гидрокси-N-окси-N-[2-(сульфоокси)децил]-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин.Suitable modified amine oxygen transfer catalysts include, without limitation, 1,2,3,4-tetrahydro-2-methyl-1-isoquinolinol, which can be prepared according to the procedures described in Tetrahedron Letters (1987), 28(48), 6061 -6064. Suitable modified amine oxide oxygen transfer catalysts include, but are not limited to, sodium 1-hydroxy-N-oxy-N-[2-(sulfooxy)decyl]-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline.

Подходящие N-сульфонилиминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения 3-метил-1,2-бензизотиазол-1,1-диоксид, полученный в соответствии с процедурой, описанной в Journal of Organic Chemistry (1990), 55(4), 1254-61.Suitable N-sulfonylimine oxygen transfer catalysts include, without limitation, 3-methyl-1,2-benzisothiazol-1,1-dioxide prepared according to the procedure described in Journal of Organic Chemistry (1990), 55(4), 1254-61 .

Подходящие N-фосфонилиминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения [R-(E)]-N-[(2-хлор-5-нитрофенил)метилен]-P-фенил-P-(2,4,6-триметилфенил)-фосфиновый амид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1994), (22), 2569-70.Suitable N-phosphonylimine oxygen transfer catalysts include, without limitation, [R-(E)]-N-[(2-chloro-5-nitrophenyl)methylene]-P-phenyl-P-(2,4,6-trimethylphenyl)-phosphine an amide, which can be prepared according to the procedures described in Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1994), (22), 2569-70.

Подходящие N-ацилиминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения [N(E)]-N-(фенилметилен)ацетамид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в Polish Journal of Chemistry (2003), 77(5), 577-590.Suitable N-acylimine oxygen transfer catalysts include, without limitation, [N(E)]-N-(phenylmethylene)acetamide, which can be prepared according to the procedures described in Polish Journal of Chemistry (2003), 77(5), 577-590 .

Подходящие тиадиазолдиоксидные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения 3-метил-4-фенил-1,2,5-тиадиазол-1,1-диоксид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в US5753599 (колонка 9, прим. 2).Suitable thiadiazole dioxide oxygen transfer catalysts include, but are not limited to, 3-methyl-4-phenyl-1,2,5-thiadiazole-1,1-dioxide, which can be prepared according to the procedures described in US5753599 (column 9, note 2).

Подходящие перфториминные катализаторы переноса кислорода включают без ограничения (Z)-2,2,3,3,4,4,4-гептафтор-N-(нонафторбутил)бутанимидоилфторид, который можно получить в соответствии с процедурами, описанными в Tetrahedron Letters (1994), 35(34), 6329-30.Suitable perfluoroimine oxygen transfer catalysts include, without limitation, (Z)-2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-N-(nonafluorobutyl)butanimidoyl fluoride, which can be prepared according to the procedures described in Tetrahedron Letters (1994) , 35(34), 6329-30.

Подходящие циклические катализаторы переноса кислорода на основе кетосахаров включают без ограничения 1,2:4,5-ди-O-изопропилиден-D-эритро-2,3-гексодиуро-2,6-пиранозу, полученную как описано в US6649085 (колонка 12, прим. 1).Suitable cyclic oxygen transfer catalysts based on ketosaccharides include, without limitation, 1,2:4,5-di-O-isopropylidene-D-erythro-2,3-hexodiuro-2,6-pyranose prepared as described in US6649085 (column 12, note 1).

Предпочтительно катализатор отбеливания содержит иминиевую и/или карбонильную функциональную группу и, как правило, способен к образованию оксазиридиниевой и/или диоксирановой функциональной группы при принятии атома кислорода, в частности, при принятии атома кислорода из пероксикислоты и/или ее соли. Предпочтительно катализатор отбеливания содержит оксазиридиниевую функциональную группу и/или способен к образованию оксазиридиниевой функциональной группы при принятии атома кислорода, в частности, при принятии атома кислорода из пероксикислоты и/или ее соли. Предпочтительно катализатор отбеливания содержит циклическую иминиевую функциональную группу, причем предпочтительно циклический фрагмент имеет размер кольца от пяти до восьми атомов (включая атом азота), предпочтительно шесть атомов. Предпочтительно катализатор отбеливания содержит арилиминиевую функциональную группу, предпочтительно би-циклическую арилиминиевую функциональную группу, предпочтительно 3,4-дигидроизохинолиниевую функциональную группу. Как правило, иминная функциональная группа представляет собой четвертичную иминную функциональную группу и, как правило, способна к образованию четвертичной оксазиридиниевой функциональной группы при принятии атома кислорода, в частности, при принятии атома кислорода из пероксикислоты и/или ее соли. В другом аспекте моющая композиция содержит отбеливающий компонент, имеющий logPo/w не более 0, не более -0,5, не более -1,0, не более -1,5, не более -2,0, не более -2,5, не более -3,0 или не более -3,5. Способ определения logPo/w более подробно описан ниже.Preferably, the bleach catalyst contains an iminium and/or carbonyl functional group and is generally capable of forming an oxaziridinium and/or dioxirane functional group upon acceptance of an oxygen atom, in particular upon acceptance of an oxygen atom from a peroxy acid and/or a salt thereof. Preferably, the bleach catalyst contains an oxaziridinium functional group and/or is capable of forming an oxaziridinium functional group upon acceptance of an oxygen atom, in particular upon acceptance of an oxygen atom from a peroxy acid and/or a salt thereof. Preferably, the bleach catalyst contains a cyclic iminium functional group, with preferably the cyclic fragment having a ring size of five to eight atoms (including a nitrogen atom), preferably six atoms. Preferably the bleach catalyst contains an aryliminium functional group, preferably a bi-cyclic aryliminium functional group, preferably a 3,4-dihydroisoquinolinium functional group. Generally, the imine functional group is a quaternary imine functional group and is generally capable of forming a quaternary oxaziridinium functional group upon acceptance of an oxygen atom, in particular upon acceptance of an oxygen atom from a peroxy acid and/or a salt thereof. In another aspect, the detergent composition contains a bleach component having a logPo/w of no more than 0, no more than -0.5, no more than -1.0, no more than -1.5, no more than -2.0, no more than -2, 5, not more than -3.0 or not more than -3.5. The method for determining logPo/w is described in more detail below.

Как правило, отбеливающий ингредиент способен к образованию видов отбеливающих средств, имеющих XSO от 0,01 до 0,30, от 0,05 до 0,25 или от 0,10 до 0,20. Способ определения XSO более подробно описан ниже. Например, отбеливающие ингредиенты, имеющие структуру изохинолиния, способны к образованию видов отбеливающих средств, которые имеют структуру оксазиридиния. В данном примере XSO соответствует оксазиридиниевым видам отбеливающих средств.Typically, the bleaching ingredient is capable of forming bleach species having an XSO of 0.01 to 0.30, 0.05 to 0.25, or 0.10 to 0.20. The method for determining XSO is described in more detail below. For example, whitening ingredients having an isoquinolinium structure are capable of forming types of whitening agents that have an oxaziridinium structure. In this example, XSO corresponds to oxaziridinium bleaches.

Предпочтительно катализатор отбеливания имеет химическую структуру, соответствующую следующей химической формуле:Preferably, the bleach catalyst has a chemical structure corresponding to the following chemical formula:

где n и m независимо равны от 0 до 4, предпочтительно n и m оба равны 0; каждый R1 независимо выбран из замещенного или незамещенного радикала, выбранного из группы, состоящей из водорода, алкила, циклоалкила, арила, конденсированного арила, гетероциклического кольца, конденсированного гетероциклического кольца, нитро, галогено, циано, сульфонато, алкокси, кето, карбонового и карбоалкокси радикалов; и любые два заместителя R1, присоединенные к соседним атомам, могут объединяться с образованием конденсированного арила, конденсированного карбоциклического или конденсированного гетероциклического кольца; каждый R2 независимо выбран из замещенного или незамещенного радикала, независимо выбранного из группы, состоящей из водорода, гидрокси, алкила, циклоалкила, алкарила, арила, аралкила, алкиленов, гетероциклического кольца, алкоксигрупп, арилкарбонильных групп, карбоксиалкильных групп и амидных групп; любой R2 может быть соединен вместе с любым другим R2 с образованием части общего кольца; любые R2, присоединенные к одному и тому же атому, могут объединяться с образованием карбонила; и любые два R2 могут объединяться с образованием замещенного или незамещенного конденсированного ненасыщенного фрагмента; R3 представляет собой замещенный или незамещенный C1-C20алкил; R4 представляет собой водород или фрагмент Qt-A, где Q представляет собой разветвленный или неразветвленный алкилен, t=0 или 1, и A представляет собой анионную группу, выбранную из группы, состоящей из OSO3-, SO3-, CO2-, OCO2-, OPO32-, OPO3H- и OPO2-; R5 представляет собой водород или фрагмент -CR11R12-Y-Gb-Yc-[(CR9R10)y-O]k-R8, где каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из O, S, N-H или N-R8; и каждый R8 независимо выбран из группы, состоящей из алкила, арила и гетероарила, причем указанные фрагменты являются замещенными или незамещенными и, будучи замещенными или незамещенными, указанные фрагменты имеют менее 21 атома углерода; каждый G независимо выбран из группы, состоящей из CO, SO2, SO, PO и PO2; R9 и R10 независимо выбраны из группы, состоящей из H и C1-C4алкила; R11 и R12 независимо выбраны из группы, состоящей из H и алкила, или, взятые вместе, могут соединяться с образованием карбонила; b=0 или 1; c может быть=0 или 1, но c должен быть=0, если b=0; y представляет собой целое число от 1 до 6; k представляет собой целое число от 0 до 20; R6 представляет собой H или алкильный, арильный или гетероарильный фрагмент; причем указанные фрагменты являются замещенными или незамещенными; и X, если присутствует, представляет собой подходящий противоион, уравновешивающий заряд, предпочтительно X присутствует, если R4 представляет собой водород, подходящий X включает без ограничения хлорид, бромид, сульфат, метосульфат, сульфонат, п-толуолсульфонат, боронтетрафторид и фосфат.where n and m are independently 0 to 4, preferably n and m are both 0; each R1 is independently selected from a substituted or unsubstituted radical selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, fused aryl, heterocyclic ring, fused heterocyclic ring, nitro, halo, cyano, sulfonato, alkoxy, keto, carboxylic, and carboalkoxy radicals ; and any two R1 substituents attached to adjacent atoms may combine to form a fused aryl, fused carbocyclic, or fused heterocyclic ring; each R2 is independently selected from a substituted or unsubstituted radical independently selected from the group consisting of hydrogen, hydroxy, alkyl, cycloalkyl, alkaryl, aryl, aralkyl, alkylenes, heterocyclic ring, alkoxy groups, arylcarbonyl groups, carboxyalkyl groups, and amide groups; any R2 may be joined together with any other R2 to form part of a common ring; any R2 attached to the same atom can combine to form a carbonyl; and any two R2 may combine to form a substituted or unsubstituted fused unsaturated moiety; R3 is substituted or unsubstituted C1-C20 alkyl; R4 is hydrogen or a Qt-A fragment, where Q is a branched or straight chain alkylene, t=0 or 1, and A is an anionic group selected from the group consisting of OSO3-, SO3-, CO2-, OCO2-, OPO32-, OPO3H- and OPO2-; R5 is hydrogen or -CR11R12-Y-Gb-Yc-[(CR9R10)y-O]k-R8, where each Y is independently selected from the group consisting of O, S, N-H, or N-R8; and each R8 is independently selected from the group consisting of alkyl, aryl, and heteroaryl, wherein said moieties are substituted or unsubstituted and, when substituted or unsubstituted, said moieties have less than 21 carbon atoms; each G is independently selected from the group consisting of CO, SO2, SO, PO and PO2; R9 and R10 are independently selected from the group consisting of H and C1-C4 alkyl; R11 and R12 are independently selected from the group consisting of H and alkyl, or taken together may combine to form a carbonyl; b=0 or 1; c can be=0 or 1, but c must be=0 if b=0; y is an integer from 1 to 6; k is an integer from 0 to 20; R6 is H or an alkyl, aryl or heteroaryl moiety; moreover, these fragments are substituted or unsubstituted; and X, if present, is a suitable charge-balancing counterion, preferably X is present when R4 is hydrogen, suitable X includes, but is not limited to, chloride, bromide, sulfate, methosulfate, sulfonate, p-toluenesulfonate, boron tetrafluoride, and phosphate.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения катализатор отбеливания имеет структуру, соответствующую приведенной ниже общей формулеIn one embodiment of the present invention, the bleach catalyst has a structure corresponding to the following general formula

где R13 представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от трех до 24 атомов углерода (включая ответвляющиеся атомы углерода), или линейную алкильную группу, содержащую от одного до 24 атомов углерода; предпочтительно R13 представляет собой разветвленную алкильную группу, содержащую от восьми до 18 атомов углерода, или линейную алкильную группу, содержащую от восьми до восемнадцати атомов углерода; предпочтительно R13 выбран из группы, состоящей из 2-пропилгептила, 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, н-додецила, н-тетрадецила, н-гексадецила, н-октадецила, изононила, изодецила, изотридецила и изопентадецила; предпочтительно R13 выбран из группы, состоящей из 2-бутилоктила, 2-пентилнонила, 2-гексилдецила, изотридецила и изопентадецила.where R13 represents a branched alkyl group containing from three to 24 carbon atoms (including branching carbon atoms), or a linear alkyl group containing from one to 24 carbon atoms; preferably R13 is a branched alkyl group of eight to 18 carbon atoms or a linear alkyl group of eight to eighteen carbon atoms; preferably R13 is selected from the group consisting of 2-propylheptyl, 2-butyloctyl, 2-pentylnonyl, 2-hexyldecyl, n-dodecyl, n-tetradecyl, n-hexadecyl, n-octadecyl, isononyl, isodecyl, isotridecyl and isopentadecyl; preferably R13 is selected from the group consisting of 2-butyloctyl, 2-pentylnonyl, 2-hexyldecyl, isotridecyl and isopentadecyl.

Предпочтительно отбеливающий компонент содержит источник перкислоты в дополнение к катализатору отбеливания, в частности, органическому катализатору отбеливания. Источник перкислоты может быть выбран из (a) предварительно образованной перкислоты; (b) перкарбонатной, перборатной или персульфатной соли (источника пероксида водорода) предпочтительно в комбинации с активатором отбеливания и (c) фермента пергидролазы и сложного эфира для образования перкислоты in situ в присутствии воды на стадии обработки текстиля или твердых поверхностей.Preferably the bleach component contains a peracid source in addition to the bleach catalyst, in particular an organic bleach catalyst. The peracid source may be selected from (a) preformed peracid; (b) a percarbonate, perborate or persulfate salt (a source of hydrogen peroxide) preferably in combination with a bleach activator; and (c) a perhydrolase enzyme and an ester to form peracid in situ in the presence of water in a textile or hard surface treatment step.

Перкислота и/или активатор отбеливания, если они присутствуют, как правило, присутствуют в композиции в количестве от 0,1 до 60 вес. %, от 0,5 до 40 вес. % или от 0,6 до 10 вес. % по весу композиции. Одну или несколько гидрофобных перкислот или их предшественников можно применять в комбинации с одной или несколькими гидрофильными перкислотами или их предшественниками.The peracid and/or bleach activator, if present, are typically present in the composition in an amount of from 0.1 to 60 wt. %, from 0.5 to 40 wt. % or from 0.6 to 10 wt. % by weight of the composition. One or more hydrophobic peracids or precursors thereof may be used in combination with one or more hydrophilic peracids or precursors thereof.

Количества источника пероксида водорода и перкислоты или активатора отбеливания может быть выбрано таким образом, что молярное отношение доступного кислорода (из источника пероксида) к перкислоте составляет от 1:1 до 35:1 или от 2:1 до 10:1.The amounts of hydrogen peroxide source and peracid or bleach activator can be chosen such that the molar ratio of available oxygen (from peroxide source) to peracid is from 1:1 to 35:1 or from 2:1 to 10:1.

(6) Содержащие металл катализаторы отбеливания. В отбеливающем компоненте может быть обеспечен каталитический комплекс металла. Один тип содержащего металл катализатора отбеливания представляет собой систему катализаторов, включающую катион переходного металла с определенной каталитической активностью отбеливания, например катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца, дополнительный катион металла, характеризующийся низкой каталитической активностью отбеливания или ее отсутствием, например катионы цинка или алюминия, и секвестрант, характеризующийся определенными константами стабильности для каталитических и вспомогательных катионов металлов, в частности, этилендиаминтетрауксусную кислоту, этилендиаминтетра(метиленфосфоновую кислоту) и их растворимые в воде соли. Такие катализаторы раскрыты в US4430243. Предпочтительные катализаторы раскрыты в WO09/839406, US6218351 и WO00/012667. Особенно предпочтительными являются катализатор на основе переходного металла или его лиганды, которые представляют собой соединенные мостиками полидентатные N-донорные лиганды.(6) Metal containing bleach catalysts. A metal catalytic complex may be provided in the bleach component. One type of metal containing bleach catalyst is a catalyst system comprising a transition metal cation with a specific bleach catalytic activity, such as copper, iron, titanium, ruthenium, tungsten, molybdenum, or manganese cations, an additional metal cation having low or no bleach catalytic activity, for example zinc or aluminum cations, and a sequestrant having certain stability constants for catalytic and auxiliary metal cations, in particular ethylenediaminetetraacetic acid, ethylenediaminetetra(methylenephosphonic acid) and their water-soluble salts. Such catalysts are disclosed in US4430243. Preferred catalysts are disclosed in WO09/839406, US6218351 and WO00/012667. Especially preferred are the transition metal catalyst or its ligands, which are bridged polydentate N-donor ligands.

При необходимости композиции согласно данному документу могут катализироваться с помощью соединения марганца. Такие соединения и уровни применения хорошо известны из уровня техники и включают, например, катализаторы на основе марганца, раскрытые в US5576282.If necessary, the compositions according to this document can be catalyzed using a manganese compound. Such compounds and levels of use are well known in the art and include, for example, the manganese-based catalysts disclosed in US5576282.

Катализаторы отбеливания на основе кобальта, применимые согласно данному документу, известны и раскрыты, например, в US5597936; US5595967. Такие катализаторы на основе кобальта могут быть легко получены с помощью известных процедур, таких как изложенные, например, в US5597936 и US5595967.Cobalt-based bleach catalysts useful according to this document are known and disclosed, for example, in US5597936; US5595967. Such cobalt-based catalysts can be readily prepared using known procedures such as those set forth in, for example, US5597936 and US5595967.

Композиции согласно данному документу в подходящем случае также могут включать комплекс переходного металла с лигандами, такими как биспидоны (US7501389) и/или макрополициклические жесткие лиганды, сокращенно обозначенные как "MRL". На практике, но не в качестве ограничения, композиции и способы согласно данному документу можно корректировать для обеспечения порядка по меньшей мере одной части на сто миллионов активных единиц MRL в водной моющей среде, и данная корректировка, как правило, будет обеспечивать от 0,005 до 25 ppm, от 0,05 до 10 ppm или от 0,1 до 5 ppm MRL в моющем растворе.The compositions of this document may also optionally include a transition metal complex with ligands such as bispidones (US7501389) and/or macropolycyclic rigid ligands, abbreviated "MRL". In practice, but not by way of limitation, the compositions and methods of this document can be adjusted to provide at least one part per hundred million active units of MRL in an aqueous wash medium, and this adjustment will typically provide from 0.005 to 25 ppm , 0.05 to 10 ppm or 0.1 to 5 ppm MRL in cleaning solution.

Подходящие переходные металлы в катализаторе отбеливания на основе переходных металлов по настоящему изобретению включают, например, марганец, железо и хром. Подходящие MRL включают 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6.6.2]гексадекан. Подходящие MRL на основе переходных металлов могут быть легко получены с помощью известных процедур, таких как изложенные, например, в US6225464 и WO00/32601.Suitable transition metals in the transition metal bleach catalyst of the present invention include, for example, manganese, iron and chromium. Suitable MRLs include 5,12-diethyl-1,5,8,12-tetraazabicyclo[6.6.2]hexadecane. Suitable MRLs based on transition metals can be readily obtained using known procedures such as those set forth in, for example, US6225464 and WO00/32601.

(7) Фотоотбеливатели. Подходящие фотоотбеливатели включают, например, сульфонированный фталоцианин цинка, сульфонированные фталоцианины алюминия, ксантеновые красители и их смеси. Предпочтительные отбеливающие компоненты для применения в композициях по настоящему изобретению включают источник пероксида водорода, активатор отбеливания и/или органическую пероксикислоту, необязательно полученную in situ в результате реакции источника пероксида водорода и активатора отбеливания, в комбинации с катализатором отбеливания. Предпочтительные отбеливающие компоненты включают катализаторы отбеливания, предпочтительно органические катализаторы отбеливания, как описано выше.(7) Photobleach. Suitable photobleaching agents include, for example, sulfonated zinc phthalocyanine, sulfonated aluminum phthalocyanines, xanthene dyes, and mixtures thereof. Preferred bleach components for use in the compositions of the present invention include a hydrogen peroxide source, a bleach activator, and/or an organic peroxyacid, optionally produced in situ by reaction of a hydrogen peroxide source and a bleach activator, in combination with a bleach catalyst. Preferred bleach components include bleach catalysts, preferably organic bleach catalysts, as described above.

Особенно предпочтительными отбеливающими компонентами являются катализаторы отбеливания, в частности органические катализаторы отбеливания.Particularly preferred bleach components are bleach catalysts, in particular organic bleach catalysts.

Иллюстративные отбеливающие системы также раскрыты, например, в WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 и WO2007/087242.Exemplary bleaching systems are also disclosed in, for example, WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 and WO2007/087242.

Окрашивающие средства для тканей. Композиция может содержать окрашивающее средство для тканей. Подходящие окрашивающие средства для тканей включают красители, конъюгаты краситель-глина и пигменты. Подходящие красители включают низкомолекулярные красители и полимерные красители. Подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящей из красителей, относящиеся к следующим классификационным группам по цветовому индексу (C.I.): Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet и Basic Red, или их смеси.Dyes for fabrics. The composition may contain a fabric coloring agent. Suitable fabric coloring agents include dyes, dye-clay conjugates and pigments. Suitable dyes include low molecular weight dyes and polymeric dyes. Suitable low molecular weight dyes include low molecular weight dyes selected from the group consisting of dyes belonging to the following color index (C.I.) classification groups: Direct Blue, Direct Red, Direct Violet, Acid Blue, Acid Red, Acid Violet, Basic Blue, Basic Violet and Basic Red, or mixtures thereof.

В другом аспекте подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящей из следующих номеров согласно цветовому индексу (Общество красильщиков и колористов, Бадфорд, Великобритания): Direct Violet 9, Direct Violet 35, Direct Violet 48, Direct Violet 51, Direct Violet 66, Direct Violet 99, Direct Blue 1, Direct Blue 71, Direct Blue 80, Direct Blue 279, Acid Red 17, Acid Red 73, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Violet 15, Acid Violet 17, Acid Violet 24, Acid Violet 43, Acid Red 52, Acid Violet 49, Acid Violet 50, Acid Blue 15, Acid Blue 17, Acid Blue 25, Acid Blue 29, Acid Blue 40, Acid Blue 45, Acid Blue 75, Acid Blue 80, Acid Blue 83, Acid Blue 90 и Acid Blue 113, Acid Black 1, Basic Violet 1, Basic Violet 3, Basic Violet 4, Basic Violet 10, Basic Violet 35, Basic Blue 3, Basic Blue 16, Basic Blue 22, Basic Blue 47, Basic Blue 66, Basic Blue 75, Basic Blue 159, и их смеси. В другом аспекте подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящие из следующих номеров согласно цветовому индексу (Общество красильщиков и колористов, Брадфорд, Великобритания): Acid Violet 17, Acid Violet 43, Acid Red 52, Acid Red 73, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Blue 25, Acid Blue 29, Acid Blue 45, Acid Blue 113, Acid Black 1, Direct Blue 1, Direct Blue 71, Direct Violet 51, и их смеси. В другом аспекте подходящие низкомолекулярные красители включают низкомолекулярные красители, выбранные из группы, состоящие из следующих номеров согласно цветовому индексу (Общество красильщиков и колористов, Брадфорд, Великобритания): Acid Violet 17, Direct Blue 71, Direct Violet 51, Direct Blue 1, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Blue 29, Acid Blue 113, или их смеси.In another aspect, suitable low molecular weight dyes include low molecular weight dyes selected from the group consisting of the following color index numbers (Society of Dyers and Colorists, Budford, UK): Direct Violet 9, Direct Violet 35, Direct Violet 48, Direct Violet 51, Direct Violet 66, Direct Violet 99, Direct Blue 1, Direct Blue 71, Direct Blue 80, Direct Blue 279, Acid Red 17, Acid Red 73, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Violet 15, Acid Violet 17, Acid Violet 24, Acid Violet 43, Acid Red 52, Acid Violet 49, Acid Violet 50, Acid Blue 15, Acid Blue 17, Acid Blue 25, Acid Blue 29, Acid Blue 40, Acid Blue 45, Acid Blue 75, Acid Blue 80, Acid Blue 83, Acid Blue 90 and Acid Blue 113, Acid Black 1, Basic Violet 1, Basic Violet 3, Basic Violet 4, Basic Violet 10, Basic Violet 35, Basic Blue 3, Basic Blue 16, Basic Blue 22, Basic Blue 47, Basic Blue 66, Basic Blue 75, Basic Blue 159, and mixtures thereof. In another aspect, suitable low molecular weight dyes include low molecular weight dyes selected from the group consisting of the following color index numbers (Society of Dyers and Colorists, Bradford, UK): Acid Violet 17, Acid Violet 43, Acid Red 52, Acid Red 73, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Blue 25, Acid Blue 29, Acid Blue 45, Acid Blue 113, Acid Black 1, Direct Blue 1, Direct Blue 71, Direct Violet 51, and mixtures thereof. In another aspect, suitable low molecular weight dyes include low molecular weight dyes selected from the group consisting of the following color index numbers (Society of Dyers and Colorists, Bradford, UK): Acid Violet 17, Direct Blue 71, Direct Violet 51, Direct Blue 1, Acid Red 88, Acid Red 150, Acid Blue 29, Acid Blue 113, or mixtures thereof.

Подходящие полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из полимеров, содержащих сопряженные хромогены (конъюгаты краситель-полимер) и полимеры с хромогенами, совместно полимеризованными в основную цепь полимера, и их смеси.Suitable polymeric dyes include polymeric dyes selected from the group consisting of polymers containing conjugated chromogens (dye-polymer conjugates) and polymers with chromogens copolymerized into the polymer backbone, and mixtures thereof.

В другом аспекте подходящие полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из субстантивных красящих веществ для ткани, продаваемых под названием Liquitint® (Milliken), конъюгатов краситель-полимер, образованных по меньшей мере из одного реактивного красителя и полимера, выбранного из группы, состоящей из полимеров, содержащих фрагмент, выбранный из группы, состоящей из гидроксильного фрагмента, фрагмента первичного амина, фрагмента вторичного амина, тиольного фрагмента и их смеси. В еще одном аспекте подходящие полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из Liquitint® Violet CT, карбоксиметилцеллюлозы (CMC), сопряженной с реактивным синим, реактивным фиолетовым или реактивным красным красителем, например CMC, сопряженной с C.I. Reactive Blue 19, продаваемой Megazyme, Уиклоу, Ирландия, под названием продукта AZO-CM-CELLULOSE, кодом продукта S-ACMC, полимерных красящих веществ на основе алкоксилированного трифенил-метана, полимерных красящих веществ на основе алкоксилированного тиофена и их смесей.In another aspect, suitable polymeric dyes include polymeric dyes selected from the group consisting of substantive textile dyes sold under the name Liquitint® (Milliken), dye-polymer conjugates formed from at least one reactive dye, and a polymer selected from the group , consisting of polymers containing a fragment selected from the group consisting of a hydroxyl fragment, a primary amine fragment, a secondary amine fragment, a thiol fragment, and mixtures thereof. In yet another aspect, suitable polymeric dyes include polymeric dyes selected from the group consisting of Liquitint® Violet CT, carboxymethyl cellulose (CMC) conjugated with reactive blue, reactive violet or reactive red dye, such as CMC conjugated with C.I. Reactive Blue 19 sold by Megazyme, Wicklow, Ireland under the product name AZO-CM-CELLULOSE, product code S-ACMC, alkoxylated triphenylmethane based polymeric colorants, alkoxylated thiophene based polymeric colorants and mixtures thereof.

Предпочтительные оттеночные красители включают белящие вещества, представленные в WO08/87497. Данные белящие вещества могут характеризоваться следующей структурой (I):Preferred tint dyes include the bleaching agents shown in WO08/87497. These whitening agents may have the following structure (I):

(I),

(I)

где R1 и R2 могут быть независимо выбраны изwhere R1 and R2 can be independently chosen from

a) [(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH],a) [(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH],

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где R'' выбран из группы, состоящей из H, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где x+y ≤ 5; где y ≥ 1; и где z=0-5;where R' is selected from the group consisting of H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH and mixtures thereof; where R'' is selected from the group consisting of H, CH2O(CH2CH2O)zH and mixtures thereof; where x+y ≤ 5; where y ≥ 1; and where z=0-5;

b) R1=алкил, арил или арилалкил, а R2 = [(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH],b) R1=alkyl, aryl or arylalkyl and R2=[(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH],

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где R" выбран из группы, состоящей из H, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где x+y ≤ 10; где y ≥ 1; и где z=0-5;where R' is selected from the group consisting of H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH and mixtures thereof; where R" is selected from the group consisting of H, CH2O(CH2CH2O)zH and mixtures thereof; where x+y ≤ 10; where y ≥ 1; and where z=0-5;

c) R1 = [CH2CH2(OR3)CH2OR4], а R2 = [CH2CH2(O R3)CH2O R4],c) R1 = [CH2CH2(OR3)CH2OR4], and R2 = [CH2CH2(O R3)CH2O R4],

где R3 выбран из группы, состоящей из H, (CH2CH2O)zH и их смесей; и где z=0-10;where R3 is selected from the group consisting of H, (CH2CH2O)zH and mixtures thereof; and where z=0-10;

где R4 выбран из группы, состоящей из (C1-C16)алкила, арильных групп и их смесей; иwhere R4 is selected from the group consisting of (C1-C16)alkyl, aryl groups and mixtures thereof; and

d) где R1 и R2 могут быть независимо выбраны из продукта присоединения амино к оксиду стирола, глицидилметиловому эфиру, изобутилглицидиловому эфиру, изопропилглицидиловому эфиру, трет-бутилглицидиловому эфиру, 2-этилгексилглицидиловому эфиру и глицидилгексадециловому эфиру с последующим добавлением от 1 до 10 алкиленоксидных фрагментов.d) where R1 and R2 can be independently selected from an amino addition product of styrene oxide, glycidyl methyl ether, isobutyl glycidyl ether, isopropyl glycidyl ether, t-butyl glycidyl ether, 2-ethylhexyl glycidyl ether and glycidyl hexadecyl ether followed by the addition of 1 to 10 alkylene oxide moieties.

Предпочтительное белящее вещество по настоящему изобретению может характеризоваться следующей структурой (II):The preferred whitening agent of the present invention may have the following structure (II):

(II),

(II)

где R' выбран из группы, состоящей из H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где R'' выбран из группы, состоящей из H, CH2O(CH2CH2O)zH и их смесей; где x+y ≤ 5; где y ≥ 1; и где z=0-5.where R' is selected from the group consisting of H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH and mixtures thereof; where R'' is selected from the group consisting of H, CH2O(CH2CH2O)zH and mixtures thereof; where x+y ≤ 5; where y ≥ 1; and where z=0-5.

Следующее предпочтительное белящее вещество по настоящему изобретению может характеризоваться следующей структурой (III):The next preferred whitening agent of the present invention may have the following structure (III):

(III),

(III)

причем, как правило, оно содержит смесь, содержащую в общем 5 EO-групп. Подходящими предпочтительными молекулами являются молекулы структуры I, имеющие следующие боковые группы из "части a", указанной выше.moreover, as a rule, it contains a mixture containing a total of 5 EO groups. Suitable preferred molecules are those of structure I having the following pendant groups from "part a" above.

ТАБЛИЦА 1TABLE 1

R1R1R2R2R'R'R"R"XXyyR'R'R"R"xxyyAAHHHH331oneHHHH001oneBBHHHH221oneHHHH1one1onec=bc=bHHHH1one1oneHHHH221oned=ad=aHHHH001oneHHHH331one

Следующие пригодные белящие вещества включают белящие вещества, описанные в US2008/34511 (Unilever). Предпочтительным средством является "Violet 13".Further suitable bleaching agents include those described in US2008/34511 (Unilever). The preferred agent is "Violet 13".

Подходящие конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из по меньшей мере одного катионного/основного красителя и смектитовой глины, и их смеси. В другом аспекте подходящие конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из одного катионного/основного красителя, выбранного из группы, состоящей из C.I. Basic Yellow 1-108, C.I. Basic Orange 1-69, C.I. Basic Red 1-118, C.I. Basic Violet 1-51, C.I. Basic Blue 1-164, C.I. Basic Green 1-14, C.I. Basic Brown 1-23, CI Basic Black 1-11, и глины, выбранной из группы, состоящей из монтмориллонитовой глины, гекторитной глины, сапонитной глины и их смесей. В еще одном аспекте подходящие конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из конъюгата монтмориллонита с Basic Blue B7 C.I. 42595, конъюгата монтмориллонита с Basic Blue B9 C.I. 52015, конъюгата монтмориллонита с Basic Violet V3 C.I. 42555, конъюгата монтмориллонита с Basic Green G1 C.I. 42040, конъюгата монтмориллонита с Basic Red R1 C.I. 45160, конъюгата монтмориллонита с C.I. Basic Black 2, конъюгата гекторита с Basic Blue B7 C.I. 42595, конъюгата гекторита с Basic Blue B9 C.I. 52015, конъюгата гекторита с Basic Violet V3 C.I. 42555, конъюгата гекторита с Basic Green G1 C.I. 42040, конъюгата гекторита с Basic Red R1 C.I. 45160, конъюгата гекторита с C.I. Basic Black 2, конъюгата сапонита с Basic Blue B7 C.I. 42595, конъюгата сапонита с Basic Blue B9 C.I. 52015, конъюгата сапонита с Basic Violet V3 C.I. 42555, конъюгата сапонита с Basic Green G1 C.I. 42040, конъюгата сапонита с Basic Red R1 C.I. 45160, конъюгата сапонита с C.I. Basic Black 2 и их смесей.Suitable dye-clay conjugates include dye-clay conjugates selected from the group consisting of at least one cationic/basic dye and smectite clay, and mixtures thereof. In another aspect, suitable dye-clay conjugates include dye-clay conjugates selected from the group consisting of a single cationic/basic dye selected from the group consisting of C.I. Basic Yellow 1-108, C.I. Basic Orange 1-69, C.I. Basic Red 1-118, C.I. Basic Violet 1-51, C.I. Basic Blue 1-164, C.I. Basic Green 1-14, C.I. Basic Brown 1-23, CI Basic Black 1-11, and a clay selected from the group consisting of montmorillonite clay, hectorite clay, saponite clay, and mixtures thereof. In another aspect, suitable dye-clay conjugates include dye-clay conjugates selected from the group consisting of montmorillonite conjugate with Basic Blue B7 C.I. 42595, montmorillonite conjugate with Basic Blue B9 C.I. 52015, montmorillonite conjugate with Basic Violet V3 C.I. 42555, montmorillonite conjugate with Basic Green G1 C.I. 42040, montmorillonite conjugate with Basic Red R1 C.I. 45160, montmorillonite conjugate with C.I. Basic Black 2, hectorite conjugate with Basic Blue B7 C.I. 42595, hectorite conjugate with Basic Blue B9 C.I. 52015, hectorite conjugate with Basic Violet V3 C.I. 42555, hectorite conjugate with Basic Green G1 C.I. 42040, hectorite conjugate with Basic Red R1 C.I. 45160, hectorite conjugate with C.I. Basic Black 2, saponite conjugate with Basic Blue B7 C.I. 42595, saponite conjugate with Basic Blue B9 C.I. 52015, saponite conjugate with Basic Violet V3 C.I. 42555, saponite conjugate with Basic Green G1 C.I. 42040, saponite conjugate with Basic Red R1 C.I. 45160, saponite conjugate with C.I. Basic Black 2 and their blends.

Подходящие пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из флавантрона, индантрона, хлорированного индантрона, содержащего от 1 до 4 атомов хлора, пирантрона, дихлорпирантрона, монобромдихлорпирантрона, дибромдихлорпирантрона, тетрабромпирантрона, диимида перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислоты, где имидные группы могут быть незамещенными или замещенными C1-C3алкилом, или фенилом, или гетероциклическим радикалом, и где фенил и гетероциклические радикалы могут дополнительно содержать заместители, которые не придают растворимость в воде, амидов антрапиримидинкарбоновой кислоты, виолантрона, изовиолантрона, диоксазиновых пигментов, фталоцианина меди, который может содержать до 2 атомов хлора на молекулу, полихлормедь фталоцианина или полибромхлормедь фталоцианина, содержащего до 14 атомов брома на молекулу, и их смесей.Suitable pigments include pigments selected from the group consisting of flavanthrone, indanthrone, chlorinated indanthrone having 1 to 4 chlorine atoms, pyranthrone, dichloropyranthrone, monobromodichloropyranthrone, dibromodichloropyranthrone, tetrabromopyranthrone, perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic acid diimide, where the imide groups may be unsubstituted or substituted with C1-C3 alkyl or phenyl or a heterocyclic radical, and where the phenyl and heterocyclic radicals may additionally contain substituents which do not confer water solubility, anthrapyrimidinecarboxylic acid amides, violanthrone, isoviolanthrone, dioxazine pigments, copper phthalocyanine , which can contain up to 2 chlorine atoms per molecule, polychlorocopper phthalocyanine or polybromocopper phthalocyanine containing up to 14 bromine atoms per molecule, and mixtures thereof.

В другом аспекте подходящие пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состоящей из ультрамаринового синего (C.I. Pigment Blue 29), ультрамаринового фиолетового (C.I. Pigment Violet 15) и их смесей.In another aspect, suitable pigments include pigments selected from the group consisting of ultramarine blue (C.I. Pigment Blue 29), ultramarine violet (C.I. Pigment Violet 15) and mixtures thereof.

Вышеупомянутые окрашивающие средства для тканей можно применять в комбинации (можно применять любую смесь окрашивающих средств для ткани). Подходящие окрашивающие средства для ткани более подробно раскрыты в US7208459. Предпочтительные количества красителя в композициях по настоящему изобретению составляют от 0,00001 до 0,5 вес. % или от 0,0001 до 0,25 вес. %. Предпочтительная концентрация красителей в воде для стадии обработки и/или очищения составляет от 1 ppb до 5 ppm, от 10 ppb до 5 ppm или от 20 ppb до 5 ppm. В предпочтительных композициях концентрация поверхностно-активного вещества будет составлять от 0,2 до 3 г/л.The above fabric coloring agents can be used in combination (any mixture of fabric coloring agents can be used). Suitable fabric coloring agents are disclosed in more detail in US7208459. Preferred amounts of dye in the compositions of the present invention range from 0.00001 to 0.5 wt. % or from 0.0001 to 0.25 wt. %. The preferred concentration of dyes in water for the processing and/or purification step is 1 ppb to 5 ppm, 10 ppb to 5 ppm, or 20 ppb to 5 ppm. In preferred compositions, the concentration of surfactant will be from 0.2 to 3 g/L.

Инкапсуляты. Композиция может содержать инкапсулят. В одном аспекте инкапсулят содержит ядро, оболочку, имеющую внутреннюю и внешнюю поверхность, причем указанная оболочка инкапсулирует указанное ядро.Encapsulates. The composition may contain an encapsulate. In one aspect, the encapsulate contains a core, a shell having an inner and outer surface, said shell encapsulating said core.

В одном аспекте указанного инкапсулята указанное ядро может содержать материал, выбранный из группы, состоящей из отдушек; осветлителей; красителей; средств, отпугивающих насекомых; кремнийорганических соединений; восков; вкусоароматических добавок; витаминов; смягчающих ткань средств; в одном аспекте средств по уходу за кожей, парафинов; ферментов; антибактериальных средств; отбеливающих средств; компонентов, придающих определенные сенсорные ощущения; и их смесей; и указанная оболочка может содержать материал, выбранный из группы, состоящей из полиэтиленов; полиамидов; поливиниловых спиртов, необязательно содержащих другие coмономеры; полистиролов; полиизопренов; поликарбонатов; сложных полиэфиров; полиакрилатов; аминопластов, в одном аспекте указанный аминопласт может включать полимочевины, полиуретан и/или полимочевиноуретан, и в одном аспекте указанная полимочевина может включать полиоксиметиленмочевину и/или меламин-формальдегид; полиолефинов; полисахаридов, в одном аспекте указанный полисахарид может включать альгинат и/или хитозан; желатина; шеллака; эпоксидных смол; виниловых полимеров; нерастворимых в воде неорганических веществ; кремнийорганического соединения и их смесей.In one aspect of said encapsulate, said core may contain a material selected from the group consisting of perfumes; clarifiers; dyes; insect repellents; organosilicon compounds; waxes; flavoring additives; vitamins; fabric softeners; in one aspect of skin care products, paraffins; enzymes; antibacterial agents; bleaching agents; components that impart certain sensory sensations; and their mixtures; and said shell may contain a material selected from the group consisting of polyethylenes; polyamides; polyvinyl alcohols optionally containing other comonomers; polystyrenes; polyisoprenes; polycarbonates; polyesters; polyacrylates; aminoplasts, in one aspect, said aminoplast may include polyureas, polyurethane, and/or polyureaurethane, and in one aspect, said polyurea may include polyoxymethylene urea and/or melamine-formaldehyde; polyolefins; polysaccharides, in one aspect said polysaccharide may include alginate and/or chitosan; gelatin; shellac; epoxy resins; vinyl polymers; water-insoluble inorganic substances; organosilicon compounds and mixtures thereof.

В одном аспекте указанного инкапсулята указанное ядро может содержать отдушку.In one aspect of said encapsulate, said core may contain a perfume.

В одном аспекте указанного инкапсулята указанная оболочка может содержать меламин-формальдегид и/или сшитый меламин-формальдегид.In one aspect of said encapsulate, said shell may contain melamine-formaldehyde and/or cross-linked melamine-formaldehyde.

В одном аспекте подходящие инкапсуляты могут содержать материал ядра и оболочку, причем указанная оболочка, по меньшей мере частично окружающая указанный материал ядра, раскрыта. По меньшей мере 75%, 85% или 90% указанных инкапсулятов могут характеризоваться пределом прочности, составляющим от 0,2 до 10 МПа, от 0,4 до 5 МПа, от 0,6 до 3,5 МПа или от 0,7 до 3 МПа, и утечкой полезного средства, составляющей от 0 до 30%, от 0 до 20% или от 0 до 5%.In one aspect, suitable encapsulates may comprise a core material and a shell, wherein said shell at least partially surrounding said core material is disclosed. At least 75%, 85% or 90% of said encapsulates may have a tensile strength of 0.2 to 10 MPa, 0.4 to 5 MPa, 0.6 to 3.5 MPa, or 0.7 to 3 MPa, and leakage of useful agent, comprising from 0 to 30%, from 0 to 20% or from 0 to 5%.

В одном аспекте, по меньшей мере 75%, 85% или 90% указанных инкапсулятов могут иметь размер частиц от 1 до 80 микрон, от 5 до 60 микрон, от 10 до 50 микрон или от 15 до 40 микрон.In one aspect, at least 75%, 85%, or 90% of said encapsulates may have a particle size of 1 to 80 microns, 5 to 60 microns, 10 to 50 microns, or 15 to 40 microns.

В одном аспекте по меньшей мере 75%, 85% или 90% указанных инкапсулятов могут иметь толщину стенки частицы от 30 до 250 нм, от 80 до 180 нм или от 100 до 160 нм.In one aspect, at least 75%, 85%, or 90% of said encapsulates may have a particle wall thickness of 30 to 250 nm, 80 to 180 nm, or 100 to 160 nm.

В одном аспекте, материал ядра указанных инкапсулятов может включать материал, выбранный из группы, состоящей из исходного материала отдушки, и/или необязательно материал, выбранный из группы, состоящей из растительного масла, в том числе чистых и/или смешанных растительных масел, включая касторовое масло, кокосовое масло, хлопковое масло, масло виноградных косточек, рапсовое, соевое масло, кукурузное масло, пальмовое масло, льняное масло, сафлоровое масло, оливковое масло, арахисовое масло, кокосовое масло, пальмоядровое масло, касторовое масло, лимонное масло и их смеси; сложных эфиров растительных масел, сложных эфиров, включая дибутиладипат, дибутилфталат, бутилбензиладипат, бензилоктиладипат, трикрезилфосфат, триоктилфосфат и их смеси; углеводородов с прямой или разветвленной цепью, включая такие углеводороды с прямой или разветвленной цепью, которые имеют точку кипения более приблизительно 80°C; частично гидрогенизированных терфенилов, диалкилфталатов, алкилбифенилов, включая моноизопропилбифенил, алкилированного нафталина, включая дипропилнафталин, петролейных эфиров, включая керосин, минерального масла и его смесей; ароматических растворителей, включая бензол, толуол и их смеси; силиконовых масел и их смесей.In one aspect, the core material of said encapsulates may include a material selected from the group consisting of perfume starting material and/or optionally a material selected from the group consisting of vegetable oil, including pure and/or blended vegetable oils, including castor oil. oil, coconut oil, cottonseed oil, grape seed oil, rapeseed oil, soybean oil, corn oil, palm oil, linseed oil, safflower oil, olive oil, peanut oil, coconut oil, palm kernel oil, castor oil, lemon oil, and mixtures thereof; vegetable oil esters; esters including dibutyl adipate, dibutyl phthalate, butyl benzyl adipate, benzyl octyl adipate, tricresyl phosphate, trioctyl phosphate, and mixtures thereof; straight or branched chain hydrocarbons, including those straight or branched chain hydrocarbons that have a boiling point greater than about 80° C.; partially hydrogenated terphenyls, dialkyl phthalates, alkyl biphenyls including monoisopropyl biphenyl, alkylated naphthalene including dipropyl naphthalene, petroleum ethers including kerosene, mineral oil and mixtures thereof; aromatic solvents including benzene, toluene and mixtures thereof; silicone oils and mixtures thereof.

В одном аспекте материал стенок указанных инкапсулятов может содержать подходящую смолу, в том числе продукт реакции альдегида и амина, подходящие альдегиды включают формальдегид. Подходящие амины включают меламин, мочевину, бензогуанамин, гликолурил и их смеси. Подходящие меламины включают метилoлмеламин, метилированный метилoлмеламин, иминомеламин и их смеси. Подходящие мочевины включают диметилoлмочевину, метилированную диметилoлмочевину, мочевину-резорцин и их смеси.In one aspect, the wall material of said encapsulates may contain a suitable resin, including the reaction product of an aldehyde and an amine, suitable aldehydes include formaldehyde. Suitable amines include melamine, urea, benzoguanamine, glycoluril, and mixtures thereof. Suitable melamines include methylolmelamine, methylated methylolmelamine, iminomelamin, and mixtures thereof. Suitable ureas include dimethylol urea, methylated dimethylol urea, resorcinol urea, and mixtures thereof.

В одном аспекте подходящие поглотители формальдегида можно применять с инкапсулятами, например в суспензии капсулы, и/или их можно добавлять в композицию до, во время или после добавления инкапсулятов в такую композицию. Подходящие капсулы могут быть получены с помощью следующих основных положений US2008/0305982 и/или US2009/0247449.In one aspect, suitable formaldehyde scavengers can be used with the encapsulates, for example in a capsule suspension, and/or they can be added to the composition before, during or after the addition of the encapsulates to such a composition. Suitable capsules can be obtained using the following guidelines US2008/0305982 and/or US2009/0247449.

В предпочтительном аспекте композиция также может содержать вспомогательное вещество для осаждения, предпочтительно состоящее из группы, состоящей из катионных или неионогенных полимеров. Подходящие полимеры включают катионные крахмалы, катионную гидроксиэтилцеллюлозу, поливинилформальдегид, смолу плодов рожкового дерева, маннаны, ксилоглюканы, смолу индийского финика, полиэтилентерефталат и полимеры, содержащие диметиламиноэтилметакрилат, необязательно с одним из мономеров, выбранных из группы, состоящей из акриловой кислоты и акриламида.In a preferred aspect, the composition may also contain a precipitation aid, preferably consisting of the group consisting of cationic or nonionic polymers. Suitable polymers include cationic starches, cationic hydroxyethyl cellulose, polyvinyl formaldehyde, locust bean gum, mannans, xyloglucans, tamarind gum, polyethylene terephthalate, and polymers containing dimethylaminoethyl methacrylate, optionally with one of the monomers selected from the group consisting of acrylic acid and acrylamide.

Отдушки. В одном аспекте композиция содержит отдушку, которая содержит один или несколько исходных материалов отдушки, выбранных из группы, состоящей из 1,1'-оксибис-2-пропанола; диэтилового сложного эфира 1,4-циклогександикарбоновой кислоты; (этоксиметокси)циклододекана; 1,3-нонандиола, моноацетата; 2-пропенилового сложного эфира (3-метилбутокси)уксусной кислоты; бета-метилциклододеканэтанола; 2-метил-3-[(1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)окси]-1-пропанола; оксациклогексадекан-2-она; альфа-метил-бензолметанолацетата; транс-3-этокси-1,1,5-триметилциклогексана; 4-(1,1-диметилэтил)циклогексанолацетата; додекагидро-3a,6,6,9a-тетраметилнафто[2,1-b]фурана; бета-метилбензолпропаналя; бета-метил-3-(1-метилэтил)бензолпропаналя; 4-фенил-2-бутанона; этилового сложного эфира 2-метилбутановой кислоты; бензальдегида; 1-метилэтилового сложного эфира 2-метилбутановой кислоты; дигидро-5-пентил-2(3H)фуранона; (2E)-1-(2,6,6-триметил-2-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; додеканаля; ундеканаля; 2-этил-альфа, альфа-диметилбензолпропаналя; деканaля; альфа, альфа-диметилбензолэтанолацетата; 2-(фенилметилен)октаналя; метилового сложного эфира 2-[[3-[4-(1,1-диметилэтил)фенил]-2-метилпропилиден]амино]бензойной кислоты; 1-(2,6,6-триметил-3-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; 2-пентилциклопентанона; метилового сложного эфира 3-оксо-2-пентилциклопентануксусной кислоты; 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида; 3-этокси-4-гидроксибензальдегида; 2-гептилциклопентанона; 1-(4-метилфенил)этанона; (3E)-4-(2,6,6-триметил-1-циклогексен-1-ил)-3-бутен-2-она; (3E)-4-(2,6,6-триметил-2-циклогексен-1-ил)-3-бутен-2-она; бензолэтанола; 2H-1-бензoпиран-2-она; 4-метоксибензальдегида; 10-ундеканаля; фенилметилового сложного эфира пропановой кислоты; бета-метилбензолпентанола; 1,1-диэтокси-3,7-диметил-2,6-октадиена; альфа, альфа-диметилбензолэтанола; (2E)-1-(2,6,6-триметил-1-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; фенилметилового сложного эфира уксусной кислоты; 2-пропенилового сложного эфира циклогексанпропановой кислоты; 2-пропенилового сложного эфира гексановой кислоты; 1,2-диметокси-4-(2-пропенил)бензола; оксима 1,5-диметил-бицикло[3.2.1]октан-8-она; 4-(4-гидрокси-4-метилпентил)-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; 3-бутен-2-ола; метилового сложного эфира 2-[[[2,4(или 3,5)-диметил-3-циклогексен-1-ил]метилен]амино]бензойной кислоты; 8-циклогексадецен-1-она; метилиoнона; 2,6-диметил-7-октен-2-ола; 2-метокси-4-(2-пропенил)фенола; (2E)-3,7-диметил-2,6-октадиен-1-ола; (3Z)-3-гексенилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; 2-тридеценнитрила; 4-(2,2-диметил-6-метиленциклогексил)-3-метил-3-бутен-2-она; тетрагидро-4-метил-2-(2-метил-1-пропенил)-2H-пирана; 2-пропенилового сложного эфира (2-метилбутокси)уксусной кислоты; 3-метилбутилового сложного эфира 2-гидроксибензойной кислоты; (Z)-1-(2,6,6-триметил-1-циклогексен-1-ил)-2-бутен-1-она; метилового сложного эфира 2-гексил-3-оксоциклопентанкарбоновой кислоты; 4-этил.-альфа.,альфа.-диметил-бензолпропаналя; 3-(4-гидрокси-4-метилпентил)-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; [3R-(3.альфа.,3a.бета.,7.бета.,8a.альфа.)]-1-(2,3,4,7,8,8a-гексагидро-3,6,8,8-тетраметил-1H-3a,7-метанoазулен-5-ил)-этанона; 6-бутилтетрагидро-2-метил-2H-пиран-2-она ундеканаля; 4-(1,1-диметилэтил)-.альфа.-метил-бензолпропаналя; 5-гептилдигидро-2(3H)-фуранона; метилового 2-[(7-гидрокси-3,7-диметилоктилиден)амино]-бензойной кислоты; фенилметилового сложного эфира 2-гидроксибензойной кислоты; 2-метоксинафталина; 2-гексил-2-циклопентен-1-она; 5-гексилдигидро-2(3H)-фуранона; этилового сложного эфира 3-метил-3-фенилоксиранкарбоновой кислоты; 1,3,3-триметил-2-оксабицикло[2.2.2]октана; .гамма.-метил-бензолпентанола; 3,7-диметил-3-октанола; 3,7-диметил-2,6-октадиеннитрила; 3,7-диметил-6-октен-1-ола; терпинеолацетата; дигидро-производного 2-метил-6-метилен-7-октен-2-ола; 3a,4,5,6,7,7a-гексагидро-4,7-метано-1H-инден-6-олпропаноата; 3-метил-2-бутен-1-олацетата; (Z)-3-гексен-1-олацетата; 2-этил-4-(2,2,3-триметил-3-циклопентен-1-ил)-2-бутен-1-ола; 4-(октагидро-4,7-метанo-5H-инден-5-илиден)-бутаналя; 3-2,4-диметил-циклогексен-1-карбоксальдегида; 1-(1,2,3,4,5,6,7,8-октагидро-2,3,8,8-тетраметил-2-нафталенил)-этанона; метилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; гексилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; 2-фенокси-этанола; пентилового сложного эфира 2-гидрокси-бензойной кислоты; 2,3-гептaндиона; 2-гексен-1-ола; 2,6-диметил-6-октен-2-ола; дамаскона (альфа, бета, гамма или дельта или их смесей), ацетата 3a,4,5,6,7,7a-гексагидро-4,7-метано-1H-инден-6-ола; 9-ундеценаля; 8-ундеценаля; изоциклоцитраля; 1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-октагидро-2,3,8,8-тетраметил-2-нафталенил)этанона; 3,5-диметил-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; 2,4-диметил-3-циклогексен-1-карбоксальдегида; 3,7-диметил-1,6-октадиен-3-ола; ацетата 3,7-диметил-1,6-октадиен-3-ола; лилиаля (п-т-буциналя) и циклопентанона, 2-[2-(4-метил-3-циклогексен-1-ил)пропил]- и 1-метил-4-(1-метилэтенил)циклогексена и их смесей.Perfumes. In one aspect, the composition contains a perfume that contains one or more perfume starting materials selected from the group consisting of 1,1'-oxybis-2-propanol; diethyl ester of 1,4-cyclohexanedicarboxylic acid; (ethoxymethoxy)cyclododecane; 1,3-nonanediol, monoacetate; 2-propenyl ester of (3-methylbutoxy)acetic acid; beta-methylcyclododecanethanol; 2-methyl-3-[(1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl)oxy]-1-propanol; oxacyclohexadecan-2-one; alpha-methyl benzenemethanol acetate; trans-3-ethoxy-1,1,5-trimethylcyclohexane; 4-(1,1-dimethylethyl)cyclohexanol acetate; dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphtho[2,1-b]furan; beta-methylbenzenepropanal; beta-methyl-3-(1-methylethyl)benzenepropanal; 4-phenyl-2-butanone; ethyl ester of 2-methylbutanoic acid; benzaldehyde; 1-methylethyl ester of 2-methylbutanoic acid; dihydro-5-pentyl-2(3H)furanone; (2E)-1-(2,6,6-trimethyl-2-cyclohexen-1-yl)-2-buten-1-one; dodecanal; undecanal; 2-ethyl-alpha, alpha-dimethylbenzenepropanal; dean; alpha, alpha-dimethylbenzeneethanol acetate; 2-(phenylmethylene)octanal; 2-[[3-[4-(1,1-dimethylethyl)phenyl]-2-methylpropylidene]amino]benzoic acid methyl ester; 1-(2,6,6-trimethyl-3-cyclohexen-1-yl)-2-buten-1-one; 2-pentylcyclopentanone; 3-oxo-2-pentylcyclopentaneacetic acid methyl ester; 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde; 3-ethoxy-4-hydroxybenzaldehyde; 2-heptylcyclopentanone; 1-(4-methylphenyl)ethanone; (3E)-4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-3-buten-2-one; (3E)-4-(2,6,6-trimethyl-2-cyclohexen-1-yl)-3-buten-2-one; benzeneethanol; 2H-1-benzopyran-2-one; 4-methoxybenzaldehyde; 10-undecanal; propanoic acid phenylmethyl ester; beta-methylbenzenepentanol; 1,1-diethoxy-3,7-dimethyl-2,6-octadiene; alpha, alpha-dimethylbenzeneethanol; (2E)-1-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2-buten-1-one; phenylmethyl ester of acetic acid; 2-propenyl ester of cyclohexanepropanoic acid; 2-propenyl ester of hexanoic acid; 1,2-dimethoxy-4-(2-propenyl)benzene; 1,5-dimethyl-bicyclo[3.2.1]octan-8-one oxime; 4-(4-hydroxy-4-methylpentyl)-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde; 3-buten-2-ol; 2-[[[2,4(or 3,5)-dimethyl-3-cyclohexen-1-yl]methylene]amino]benzoic acid methyl ester; 8-cyclohexadecen-1-one; methylionone; 2,6-dimethyl-7-octen-2-ol; 2-methoxy-4-(2-propenyl)phenol; (2E)-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol; (3Z)-3-hexenyl ester of 2-hydroxy-benzoic acid; 2-tridecennitrile; 4-(2,2-dimethyl-6-methylenecyclohexyl)-3-methyl-3-buten-2-one; tetrahydro-4-methyl-2-(2-methyl-1-propenyl)-2H-pyran; 2-propenyl ester of (2-methylbutoxy)acetic acid; 3-methylbutyl ester of 2-hydroxybenzoic acid; (Z)-1-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-2-buten-1-one; 2-hexyl-3-oxocyclopentanecarboxylic acid methyl ester; 4-ethyl.-alpha.,alpha.-dimethyl-benzenepropanal; 3-(4-hydroxy-4-methylpentyl)-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde; [3R-(3.alpha.,3a.beta.,7.beta.,8a.alpha.)]-1-(2,3,4,7,8,8a-hexahydro-3,6,8,8 -tetramethyl-1H-3a,7-methanoazulen-5-yl)-ethanone; 6-butyltetrahydro-2-methyl-2H-pyran-2-one undecanal; 4-(1,1-dimethylethyl)-.alpha.-methyl-benzenepropanal; 5-heptyldihydro-2(3H)-furanone; methyl 2-[(7-hydroxy-3,7-dimethyloctylidene)amino]-benzoic acid; phenylmethyl ester of 2-hydroxybenzoic acid; 2-methoxynaphthalene; 2-hexyl-2-cyclopenten-1-one; 5-hexyldihydro-2(3H)-furanone; ethyl ester of 3-methyl-3-phenyloxiranecarboxylic acid; 1,3,3-trimethyl-2-oxabicyclo[2.2.2]octane; .gamma.-methyl-benzene-pentanol; 3,7-dimethyl-3-octanol; 3,7-dimethyl-2,6-octadienenitrile; 3,7-dimethyl-6-octen-1-ol; terpineol acetate; a dihydro derivative of 2-methyl-6-methylene-7-octen-2-ol; 3a,4,5,6,7,7a-hexahydro-4,7-methano-1H-inden-6-olpropanoate; 3-methyl-2-buten-1-ol acetate; (Z)-3-hexene-1-ol acetate; 2-ethyl-4-(2,2,3-trimethyl-3-cyclopenten-1-yl)-2-buten-1-ol; 4-(octahydro-4,7-methano-5H-inden-5-ylidene)-butanal; 3-2,4-dimethyl-cyclohexene-1-carboxaldehyde; 1-(1,2,3,4,5,6,7,8-octahydro-2,3,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-ethanone; methyl ester of 2-hydroxy-benzoic acid; hexyl ester of 2-hydroxy-benzoic acid; 2-phenoxyethanol; pentyl ester of 2-hydroxy-benzoic acid; 2,3-heptanedione; 2-hexene-1-ol; 2,6-dimethyl-6-octen-2-ol; damascone (alpha, beta, gamma or delta or mixtures thereof), 3a,4,5,6,7,7a-hexahydro-4,7-methano-1H-inden-6-ol acetate; 9-undecenal; 8-undecenal; isocyclocitral; 1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-2,3,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethanone; 3,5-dimethyl-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde; 2,4-dimethyl-3-cyclohexene-1-carboxaldehyde; 3,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol; 3,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol acetate; lilial (p-t-bucinal) and cyclopentanone, 2-[2-(4-methyl-3-cyclohexen-1-yl)propyl]- and 1-methyl-4-(1-methylethenyl)cyclohexene and mixtures thereof.

В одном аспекте композиция может содержать инкапсулированную частицу отдушки, содержащую либо растворимое в воде гидроксильное соединение, либо меламин-формальдегид, либо модифицированный поливиниловый спирт. В одном аспекте инкапсулят содержит (a) по меньшей мере частично растворимую в воде твердую матрицу, содержащую одно или несколько растворимых в воде гидроксильных соединений, предпочтительно крахмал; и (b) парфюмерное масло, инкапсулированное с помощью твердой матрицы.In one aspect, the composition may contain an encapsulated perfume particle containing either a water-soluble hydroxyl compound, or melamine-formaldehyde, or a modified polyvinyl alcohol. In one aspect, the encapsulate contains (a) at least partially water-soluble solid matrix containing one or more water-soluble hydroxyl compounds, preferably starch; and (b) perfume oil encapsulated with a solid matrix.

В следующем аспекте отдушка может быть предварительно составлена в комплекс с полиамином, предпочтительно полиэтиленимином с целью образования основания шиффа.In a further aspect, the perfume may be pre-complexed with a polyamine, preferably polyethyleneimine, to form a Schiff base.

Полимеры. Композиция может содержать один или несколько полимеров. Примерами являются карбоксиметилцеллюлоза, поли(винил-пирролидон), поли(этиленгликоль), поли(виниловый спирт), поли(винилпиридин-N-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, например, полиакрилаты, coполимеры малеиновой и акриловой кислоты и coполимеры лаурилметакрилата и акриловой кислоты.Polymers. The composition may contain one or more polymers. Examples are carboxymethylcellulose, poly(vinylpyrrolidone), poly(ethylene glycol), poly(vinyl alcohol), poly(vinylpyridine-N-oxide), poly(vinylimidazole), polycarboxylates such as polyacrylates, maleic-acrylic acid copolymers and lauryl methacrylate copolymers. and acrylic acid.

Композиция может содержать один или несколько амфифильных очищающих полимеров, например, соединение, имеющее следующую общую структуру: бис((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-бис((C2H5O)(C2H4O)n), где n=от 20 до 30, и x=от 3 до 8, или его сульфатированные или сульфонированные варианты.The composition may contain one or more amphiphilic cleaning polymers, for example, a compound having the following general structure: bis((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-bis((C2H5O)(C2H4O )n), where n=20 to 30, and x=3 to 8, or sulfated or sulfonated variants thereof.

Композиция может содержать амфифильные алкоксилированные полимеры, очищающие топленый животный жир, которые уравновесили гидрофильные и гидрофобные свойства таким образом, что они удаляют частицы топленого животного жира с тканей и поверхностей. Конкретные варианты осуществления амфифильных алкоксилированных полимеров, очищающих топленый животный жир, по настоящему изобретению включают структуру ядра и множество алкоксилатных групп, прикрепленных к данной структуре ядра. Они могут содержать алкоксилированные полиалкиленимины, предпочтительно имеющие внутренний полиэтиленоксидный блок и внешний полипропиленоксидный блок.The composition may contain amphiphilic alkoxylated tallow cleansing polymers that balance hydrophilic and hydrophobic properties such that they remove tallow particles from tissues and surfaces. Specific embodiments of the amphiphilic alkoxylated tallow refining polymers of the present invention include a core structure and a plurality of alkoxylate groups attached to that core structure. They may contain alkoxylated polyalkylene imines, preferably having an internal polyethylene oxide block and an external polypropylene oxide block.

Алкоксилированные поликарбоксилаты, такие как полученные из полиакрилатов, пригодны согласно данному документу для обеспечения дополнительной эффективности удаления жиров и масел. Такие материалы раскрыты в WO91/08281 и PCT90/01815. С химической точки зрения данные материалы содержат полиакрилаты, имеющие одну этокси-боковую цепь на каждые 7-8 акрилатных звеньев. Боковые цепи имеют формулу -(CH2CH2O)m(CH2)nCH3, где m равен 2-3, и n равен 6-12. Боковые цепи связаны сложноэфирной связью с "основной цепью" полиакрилата с обеспечением "гребнеобразного" типа полимерной структуры. Молекулярный вес может варьировать, но, как правило, находится в диапазоне от 2000 до 50000. Такие алкоксилированные поликарбоксилаты могут составлять от 0,05 вес. % до 10 вес. % композиций согласно данному документу.Alkoxylated polycarboxylates, such as those derived from polyacrylates, are suitable according to this document to provide additional fat and oil removal efficiency. Such materials are disclosed in WO91/08281 and PCT90/01815. From a chemical point of view, these materials contain polyacrylates having one ethoxy side chain for every 7-8 acrylate units. The side chains have the formula -(CH2CH2O)m(CH2)nCH3 where m is 2-3 and n is 6-12. The side chains are ester-linked to the "backbone" of the polyacrylate to provide a "comb-like" type of polymer structure. The molecular weight may vary, but is generally in the range of 2,000 to 50,000. Such alkoxylated polycarboxylates may range from 0.05 wt. % up to 10 wt. % compositions according to this document.

Полученные из изопреноидов поверхностно-активные вещества по настоящему изобретению и их смеси с другими вторичными поверхностно-активными веществами и другими вспомогательными ингредиентами являются особенно пригодными для применения с амфилическим привитым coполимером, предпочтительно амфилический привитый coполимер содержит (i) основную цепь полиэтиленгликоля и (ii) по меньшей мере один боковой фрагмент, выбранный из поливинилацетата, поливинилового спирта и их смесей. Предпочтительным амфилическим привитым coполимером является Sokalan HP22, поставляемый BASF. Подходящие полимеры включают произвольные привитые coполимеры, предпочтительно coполимер полиэтиленоксида с привитым поливинилацетатом, имеющий основную цепь полиэтиленоксида и множественные поливинилацетатные боковые цепи. Молекулярный вес основной цепи полиэтиленоксида предпочтительно составляет 6000, а весовое соотношение полиэтиленоксида и поливинилацетата составляет от 40 до 60, и присутствует не более 1 точки прикрепления на 50 этиленоксидных звеньев.The isoprenoid-derived surfactants of the present invention and mixtures thereof with other secondary surfactants and other auxiliary ingredients are particularly suitable for use with an amphilic graft copolymer, preferably the amphilic graft copolymer comprises (i) a polyethylene glycol backbone and (ii) at least one side fragment selected from polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol and mixtures thereof. A preferred amphilic graft copolymer is Sokalan HP22 available from BASF. Suitable polymers include arbitrary graft copolymers, preferably a polyethylene oxide/polyvinyl acetate graft copolymer having a polyethylene oxide backbone and multiple polyvinyl acetate side chains. The molecular weight of the polyethylene oxide backbone is preferably 6000, and the weight ratio of polyethylene oxide to polyvinyl acetate is 40 to 60, and there is no more than 1 attachment point per 50 ethylene oxide units.

Карбоксилатный полимер. Композиция по настоящему изобретению также может включать один или несколько карбоксилатных полимеров, например, малеатный/акрилатный произвольный coполимер или полиакрилатный гомополимер. В одном аспекте карбоксилатный полимер представляет собой полиакрилатный гомополимер, имеющий молекулярный вес от 4000 до 9000 Да или от 6000 до 9000 Да.carboxylate polymer. The composition of the present invention may also include one or more carboxylate polymers, for example a maleate/acrylate random copolymer or a polyacrylate homopolymer. In one aspect, the carboxylate polymer is a polyacrylate homopolymer having a molecular weight of 4000 to 9000 Da, or 6000 to 9000 Da.

Грязеотталкивающий полимер. Композиция по настоящему изобретению также может включать один или несколько грязеотталкивающих полимеров, имеющих структуру, которая определена одной из следующих структур (I), (II) или (III):Dirt-resistant polymer. The composition of the present invention may also include one or more soil-repellent polymers having a structure defined by one of the following structures (I), (II) or (III):

(I) -[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d,(I) -[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d,

(II) -[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e,(II) -[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e,

(III) -[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f,(III) -[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f,

гдеwhere

a, b и c равны от 1 до 200;a, b and c are from 1 to 200;

d, e и f равны от 1 до 50;d, e and f are from 1 to 50;

Ar представляет собой 1,4-замещенный фенилен;Ar is 1,4-substituted phenylene;

sAr представляет собой 1,3-замещенный фенилен, замещенный SO3Me в положении 5;sAr is 1,3-substituted phenylene substituted with SO3Me at position 5;

Me представляет собой Li, K, Mg/2, Ca/2, Al/3, аммоний, моно-, ди-, три- или тетраалкиламмоний, где алкильные группы представляют собой C1-C18алкил или C2-C10гидроксиалкил или их смеси;Me is Li, K, Mg/2, Ca/2, Al/3, ammonium, mono-, di-, tri- or tetraalkyl ammonium, where the alkyl groups are C1-C18 alkyl or C2-C10 hydroxyalkyl or mixtures thereof;

R1, R2, R3, R4, R5 и R6 независимо выбраны из H или C1-C18n- или изоалкила; иR1, R2, R3, R4, R5 and R6 are independently selected from H or C1-C18n- or isoalkyl; and

R7 представляет собой линейный или разветвленный C1-C18алкил, или линейный или разветвленный C2-C30алкенил, или циклоалкильную группу с 5-9 атомами углерода, или C8-C30арильную группу, или C6-C30арилалкильную группу.R7 is a linear or branched C1-C18 alkyl, or a linear or branched C2-C30 alkenyl, or a C5-9 cycloalkyl group, or a C8-C30 aryl group, or a C6-C30 arylalkyl group.

Подходящими грязеотталкивающими полимерами являются грязеотталкивающие полимеры, являющиеся сложными полиэфирами, например полимеры Repel-o-tex, в том числе Repel-o-tex, SF-2 и SRP6, поставляемые Rhodia. Другие подходящие грязеотталкивающие полимеры включают полимеры Texcare, в том числе Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 и SRN325, поставляемые Clariant. Другими подходящими грязеотталкивающими полимерами являются полимеры Marloquest, например, Marloquest SL, поставляемые Sasol.Suitable stain repellant polymers are polyester stain repellant polymers such as Repel-o-tex polymers including Repel-o-tex, SF-2 and SRP6 available from Rhodia. Other suitable soil repellant polymers include Texcare polymers, including Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 and SRN325, available from Clariant. Other suitable soil repellent polymers are Marloquest polymers, such as Marloquest SL, available from Sasol.

Целлюлозный полимер. Композиция по настоящему изобретению также может включать один или несколько целлюлозных полимеров, в том числе выбранных из алкилцеллюлозы, алкилалкоксиалкилцеллюлозы, карбоксиалкилцеллюлозы, алкилкарбоксиалкилцеллюлозы. В одном аспекте целлюлозные полимеры выбраны из группы, состоящей из карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, метилгидроксиэтилцеллюлозы, метилкарбоксиметилцеллюлозы и их смесей. В одном аспекте карбоксиметилцеллюлоза характеризуется степенью замещения по карбоксиметильным группам от 0,5 до 0,9 и молекулярным весом от 100000 до 300000 Да.cellulose polymer. The composition of the present invention may also include one or more cellulosic polymers, including those selected from alkylcellulose, alkylalkoxyalkylcellulose, carboxyalkylcellulose, alkylcarboxyalkylcellulose. In one aspect, the cellulosic polymers are selected from the group consisting of carboxymethylcellulose, methylcellulose, methylhydroxyethylcellulose, methylcarboxymethylcellulose, and mixtures thereof. In one aspect, carboxymethyl cellulose is characterized by a degree of substitution on carboxymethyl groups from 0.5 to 0.9 and a molecular weight from 100,000 to 300,000 Da.

Ферменты. Композиция может содержать один или несколько ферментов, которые обеспечивают эффективность очищения и/или положительные эффекты при уходе за тканью. Примеры подходящих ферментов включают без ограничения гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, маннаназы, пектатлиазы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентозаназы, маланазы, ß-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазу, хондроитиназу, лакказу, хлорофиллазы, амилазы или их смеси. Типичная комбинация представляет собой смесь ферментов, которая может содержать, например, протеазу и липазу вместе с амилазой. Вышеупомянутые дополнительные ферменты, если они присутствуют в композиции, могут присутствовать в количествах от 0,00001 до 2 вес. %, от 0,0001 до 1 вес. % или от 0,001 до 0,5 вес. % белка-фермента по весу композиции.Enzymes. The composition may contain one or more enzymes that provide cleaning performance and/or fabric care benefits. Examples of suitable enzymes include, without limitation, hemicellulases, peroxidases, proteases, cellulases, xylanases, lipases, phospholipases, esterases, cutinases, pectinases, mannanases, pectate lyases, keratinases, reductases, oxidases, phenol oxidases, lipoxygenases, ligninases, pullulanases, tannases, pentosanases, malanases, ß-glucanases, arabinosidases, hyaluronidase, chondroitinase, laccase, chlorophyllases, amylases or mixtures thereof. A typical combination is a mixture of enzymes, which may contain, for example, a protease and a lipase together with an amylase. The above additional enzymes, if present in the composition, may be present in amounts from 0.00001 to 2 wt. %, from 0.0001 to 1 wt. % or from 0.001 to 0.5 wt. % enzyme protein by weight of the composition.

В целом, свойства выбранного(ых) фермента(ов) должны быть совместимыми с выбранным моющим средством (т. е. оптимум pH, совместимость с другими ферментативными и неферментативными ингредиентами и т. д.), при этом фермент(ы) должен(ны) присутствовать в эффективных количествах.In general, the properties of the selected enzyme(s) should be compatible with the selected detergent (i.e. optimum pH, compatibility with other enzymatic and non-enzymatic ingredients, etc.), and the enzyme(s) should ) be present in effective amounts.

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать целлюлазу. Пригодные целлюлазы включают таковые бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или мутанты белковой инженерии. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из родов Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например, целлюлазы грибов, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, раскрытые в US4435307, US5648263, US5691178, US5776757 и WO89/09259.In one aspect, preferred enzymes will include cellulase. Suitable cellulases include those of bacterial or fungal origin. Included are chemically modified or protein engineered mutants. Suitable cellulases include cellulases from the genera Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, for example fungal cellulases derived from Humicola insolens, Myceliophthora thermophila and Fusarium oxysporum disclosed in US4435307, US5648263, US5691178, US5776757 and WO2589.

Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, обладающие положительными эффектами сохранения цвета. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP0495257, EP0531372, WO96/11262, WO96/29397, WO98/08940. Другими примерами являются варианты целлюлаз, например, описанные в WO94/07998, EP0531315, US5457046, US5686593, US5763254, WO95/24471, WO98/12307 и PCT/DK98/00299.Particularly suitable cellulases are alkaline or neutral cellulases having positive color retention effects. Examples of such cellulases are those described in EP0495257, EP0531372, WO96/11262, WO96/29397, WO98/08940. Other examples are variants of cellulases, such as those described in WO94/07998, EP0531315, US5457046, US5686593, US5763254, WO95/24471, WO98/12307 and PCT/DK98/00299.

Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme™, и Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, и Puradax HA™ (Genencor International Inc.), и KAC-500(B)™ (Kao Corporation).Commercially available cellulases include Celluzyme™ and Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, and Puradax HA™ (Genencor International Inc.), and KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать протеазу. Подходящие протеазы включают протеазы бактериального, грибкового, растительного, вирусного или животного происхождения, например, растительного или микробного происхождения. Микробное происхождение является предпочтительным. Включены химически модифицированные или мутанты белковой инженерии. Это может быть щелочная протеаза, например, серин-протеаза или металлопротеаза. Серин-протеаза может быть, например, представителем семейства S1, таким как трипсин, или семейства S8, таким как субтилизин. Протеазы, относящиеся к металлопротеазам, могут, например, представлять собой термолизин, например из семейства M4, или другую металлопротеазу, например из семейств M5, M7 или M8.In one aspect, preferred enzymes will include a protease. Suitable proteases include proteases of bacterial, fungal, plant, viral or animal origin, eg plant or microbial origin. Microbial origin is preferred. Included are chemically modified or protein engineered mutants. This may be an alkaline protease, such as a serine protease or a metalloprotease. The serine protease may be, for example, a member of the S1 family, such as trypsin, or the S8 family, such as subtilisin. Proteases related to metalloproteases may, for example, be thermolysin, for example from the M4 family, or another metalloprotease, for example from the M5, M7 or M8 families.

Выражение "субтилазы" относится к подгруппе серин-протеазы в соответствии с Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Серин-протеазы представляют собой подгруппу протеаз, которая характеризуется наличием серина в активном центре, который образует ковалентный аддукт с субстратом. Субтилазы могут быть разделены на 6 подразделов, т.е. семейство субтилизина, семейство термитазы, семейство протеиназы K, семейство пептидазы-лантибиотика, семейство кексина и семейство пиролизина.The term "subtilase" refers to a subgroup of serine proteases according to Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 and Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Serine proteases are a subgroup of proteases characterized by the presence of a serine at the active site that forms a covalent adduct with the substrate. Subtilases can be divided into 6 subsections i.e. the subtilisin family, the termitase family, the proteinase K family, the lantibiotic peptidase family, the kexin family, and the pyrolysin family.

Примерами субтилаз являются субтилазы, полученные изBacillus, например,Bacillus lentus,B. alkalophilus,B. subtilis,B. amyloliquefaciens,Bacillus pumilus иBacillus gibsonii описанные в US7262042 и WO09/021867, и субтилизинlentus, субтилизинNovo, субтилизинCarlsberg,Bacillus licheniformis, субтилизинBPN', субтилизин309, субтилизин147 и субтилизин168, описанные в WO89/06279 и протеаза PD138, описанная в (WO93/18140). Другими пригодными протеазами могут быть протеазы, описанные в WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 и WO02/016547. Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеаза Fusarium, описанная в WO89/06270, WO94/25583 и WO05/040372, и протеазы хемотрипсины, полученные из Cellumonas, описанные в WO05/052161 и WO05/052146.ExamplesofsubtilasesaresubtilasesderivedfromBacillus,e.g._licheniformis , subtilisinBPN' , subtilisin309 , subtilisin147 and subtilisin168 described in WO89/06279 and the protease PD138 described in (WO93/18140). Other suitable proteases may be those described in WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 and WO02/016547. Examples of trypsin-like proteases are trypsin (eg, porcine or bovine origin) and Fusarium protease described in WO89/06270, WO94/25583 and WO05/040372 and chemotrypsin proteases derived from Cellumonas described in WO05/052161 and WO05/052146 .

Следующей предпочтительной протеазой является щелочная протеаза из Bacillus lentus DSM 5483, описанная, например, в WO95/23221, и ее варианты, которые описаны в WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 и EP1921148.A further preferred protease is the alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483, described in WO95/23221, for example, and variants thereof, which are described in WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 and EP1921148.

Примерами металлопротеаз являются нейтральная металлопротеаза, описанная в WO07/044993 (Genencor Int.), например, металлопротеазы, полученные из Bacillus amyloliquefaciens.Examples of metalloproteases are the neutral metalloprotease described in WO07/044993 (Genencor Int.), for example, metalloproteases derived from Bacillus amyloliquefaciens.

Примерами пригодных протеаз являются варианты, описанные в WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, в частности, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 и 274 при использовании нумерации согласно BPN'. Более предпочтительно варианты субтилазы могут содержать следующие мутации: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S, R, *97E, A98S, S99G, D,A, S99AD, S101G, M,R S103A, V104I, Y,N, S106A, G118V, R, H120D, N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (при использовании нумерации согласно BPN').Examples of suitable proteases are those described in WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/0016105 US Pat. 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 and 274 using BPN' numbering. More preferably, subtylase variants may contain the following mutations: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S, R, *97E, A98S, S99G, D,A, S99AD, S101G, M,R S103A, V104I Y N Q245R, N252K, T274A (when using numbering according to BPN').

Подходящие коммерчески доступные ферменты-протеазы включают продаваемые под торговыми названиями Alcalase®, Blaze®; DuralaseTm, DurazymTm, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® и Esperase®, все могут продаваться как Ultra® или Evity® (Novozymes A/S), продаваемые под торговым названием Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, PreferenzTm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, EffectenzTm, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean® и Optimase® (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist-Brocases N.V.), BLAP (последовательность, представленная на фигуре 29 в US5352604) и их варианты (Henkel AG) и KAP (субтилизин Bacillus alkalophilus) от Kao.Suitable commercially available protease enzymes include those sold under the trade names Alcalase®, Blaze®; DuralaseTM, DurazymTM, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® and Esperase®, all may be sold as Ultra® or Evity® (Novozymes A/S) marketed under the trade name Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, PreferenzTm, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, EffectenzTm, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean® and Optimase® (Danisco/DuPont), AxapemTM (Gist-Brocases N.V.), BLAP (sequence shown in Figure 29 in US5352604) and their variants (Henkel AG) and KAP (Bacillus alkalophilus subtilisin) from Kao.

В одном аспекте предпочтительные ферменты будут включать амилазу. Подходящие амилазы могут представлять собой альфа-амилазу или глюкоамилазу и могут быть бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные или мутанты белковой инженерии. Амилазы включают, например, альфа-амилазы, полученные из Bacillus, например, особого штамма Bacillus licheniformis, более подробно описанного в GB1296839.In one aspect, preferred enzymes will include amylase. Suitable amylases may be alpha-amylase or glucoamylase and may be of bacterial or fungal origin. Included are chemically modified or protein engineered mutants. Amylases include, for example, alpha-amylases derived from Bacillus, for example, a specific strain of Bacillus licheniformis, described in more detail in GB1296839.

Подходящие амилазы включают амилазы, имеющие SEQ ID NO: 3 в WO95/10603, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 3. Предпочтительные варианты раскрыты в WO94/02597, WO94/18314, WO97/43424 и SEQ ID NO: 4 в WO99/019467, например, варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, и 444.Suitable amylases include those having SEQ ID NO: 3 in WO95/10603, or variants thereof having 90% sequence identity to SEQ ID NO: 3. Preferred variants are disclosed in WO94/02597, WO94/18314, WO97/43424 and SEQ ID NO: 4 in WO99/019467, for example, variants with substitutions in one or more of the following positions: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197 , 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, and 444.

Различные подходящие амилазы включают амилазы, имеющие SEQ ID NO: 6 в WO02/010355, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 и замену в положении 193.Various suitable amylases include those having SEQ ID NO: 6 in WO02/010355, or variants thereof having 90% sequence identity to SEQ ID NO: 6. Preferred variants of SEQ ID NO: 6 are those having a deletion at positions 181 and 182 and replacement at position 193.

Другие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой гибридную альфа-амилазу, содержащую остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO: 6 в WO2006/066594, и остатки 36-483 альфа-амилазы B. licheniformis, приведенной в SEQ ID NO: 4 в WO2006/066594, или варианты, последовательность которых на 90% идентична ей. Предпочтительными вариантами данной гибридной альфа-амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 и Q264. Наиболее предпочтительными вариантами гибридной альфа-амилазы, содержащими остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO: 6 в WO2006/066594, и остатки 36-483 SEQ ID NO: 4, являются варианты, имеющие следующие замены:Other amylases that are suitable are a hybrid alpha-amylase containing residues 1-33 of the alpha-amylase derived from B. amyloliquefaciens set forth in SEQ ID NO: 6 of WO2006/066594 and residues 36-483 of alpha-amylase B licheniformis listed in SEQ ID NO: 4 in WO2006/066594 or variants with 90% sequence identity thereto. Preferred variants of this hybrid alpha-amylase are those having a substitution, deletion, or insertion at one or more of the following positions: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209, and Q264. The most preferred hybrid alpha-amylase variants containing residues 1-33 of the B. amyloliquefaciens-derived alpha-amylase shown in SEQ ID NO: 6 of WO2006/066594 and residues 36-483 of SEQ ID NO: 4 are those having the following substitutions:

M197T;M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; илиH156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; or

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

Следующие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 6 в WO99/019467, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 и K269. Особенно предпочтительными амилазами являются амилазы, предусматривающие делецию в положениях R181 и G182 или положениях H183 и G184.The following amylases that are suitable are the amylases having SEQ ID NO: 6 in WO99/019467, or variants thereof, the sequence of which is 90% identical to SEQ ID NO: 6. Preferred variants of SEQ ID NO: 6 are those having a substitution , deletion or insertion at one or more of the following positions: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 and K269. Particularly preferred amylases are those having a deletion at positions R181 and G182 or positions H183 and G184.

Дополнительными амилазами, которые можно применять, являются амилазы, имеющие SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 из WO96/023873, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, предусматривающие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 и 476. Более предпочтительными вариантами являются варианты, предусматривающие делецию в положениях 181 и 182 или положениях 183 и 184. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 являются те, которые предусматривают делецию в положениях 183 и 184 и замену в одном или нескольких положениях 140, 195, 206, 243, 260, 304 и 476.Additional amylases that can be used are the amylases having SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 of WO96/023873, or variants thereof, whose sequence is 90% identical to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 7 are options , which involve substitution, deletion, or insertion at one or more of the following positions: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304, and 476. positions 181 and 182, or positions 183 and 184. The most preferred amylase variants of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 7 are those that include a deletion at positions 183 and 184 and a substitution at one or more positions 140, 195, 206, 243, 260, 304 and 476.

Другие амилазы, которые можно применять, представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 в WO08/153815, SEQ ID NO: 10 в WO01/66712, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2 в WO08/153815 или последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 10 в WO01/66712. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 10 в WO01/66712 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 и 264.Other amylases that can be used are the amylases having SEQ ID NO: 2 in WO08/153815, SEQ ID NO: 10 in WO01/66712, or variants thereof, the sequence of which is 90% identical to SEQ ID NO: 2 in WO08/ 153815 or whose sequence is 90% identical to SEQ ID NO: 10 in WO01/66712. Preferred variants of SEQ ID NO: 10 in WO01/66712 are those having a substitution, deletion, or insertion at one or more of the following positions: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211, and 264.

Следующими подходящими амилазами являются амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 в WO09/061380, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие усечение C-конца и/или замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 и G475. Более предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: Q87E, R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E, R, N272E, R, S243Q, A,E, D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E и G475K, и/или делецию в положении R180 и/или S181 или T182 и/или G183. Наиболее предпочтительные варианты амилазы с SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие следующие замены:Further suitable amylases are the amylases having SEQ ID NO: 2 in WO09/061380, or variants thereof, the sequence of which is 90% identical to SEQ ID NO: 2. Preferred variants of SEQ ID NO: 2 are those having a C-terminal truncation and/ or a substitution, deletion, or insertion at one or more of the following positions: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 and G475. More preferred variants of SEQ ID NO: 2 are those having a substitution in one or more of the following positions: Q87E, R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E, R, N272E, R , S243Q, A,E, D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E and G475K, and/or a deletion at position R180 and/or S181 or T182 and/or G183. The most preferred amylase variants of SEQ ID NO: 2 are those having the following substitutions:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; илиS125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; or

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, где варианты усечены по C-концу и необязательно дополнительно предусматривают замену в положении 243 и/или делецию в положении 180 и/или положении 181.S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, where the variants are C-terminally truncated and optionally further include a substitution at position 243 and/or a deletion at position 180 and/or position 181.

Другие подходящие амилазы представляют собой альфа-амилазу, имеющую SEQ ID NO: 12 в WO01/66712, или вариант, последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 12. Предпочтительными вариантами амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений SEQ ID NO: 12 в WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Особенно предпочтительные амилазы включают варианты, предусматривающие делецию в D183 и G184 и имеющие замены R118K, N195F, R320K и R458K, и вариант, дополнительно имеющий замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 и A339, при этом наиболее предпочтительным является вариант, который дополнительно имеет замены во всех этих положениях.Other suitable amylases are alpha-amylase having SEQ ID NO: 12 in WO01/66712, or a variant whose sequence is at least 90% identical to SEQ ID NO: 12. Preferred amylase variants are those having a substitution, deletion, or insertion in one or more of the following provisions of SEQ ID NO: 12 in WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Particularly preferred amylases include variants having a deletion at D183 and G184 and having R118K, N195F, R320K and R458K substitutions, and a variant further having substitutions at one or more positions selected from the group: M9, G149, G182, G186, M202, T257 , Y295, N299, M323, E345, and A339, with the most preferred being the one that additionally has substitutions at all of these positions.

Другими примерами являются варианты амилазы, например, варианты, описанные в WO 2011/098531, WO 2013/001078 и WO 2013/001087.Other examples are amylase variants, such as those described in WO 2011/098531, WO 2013/001078 and WO 2013/001087.

Коммерчески доступные амилазы представляют собой DuramylTM, TermamylTM, Termamyl UltraTM, FungamylTM, BanTM, StainzymeTM, Stainzyme PlusTM, Amplify®, SupramylTM, NatalaseTM, Liquozyme X и BANTM (от Novozymes A/S), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200, Вена, Австрия, и RapidaseTM, PurastarTM/EffectenzTM, Powerase, Preferenz S100, Preferenx S110, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, и PURASTAR OXAM® (Danisco/DuPont), и KAM® (Kao).Commercially available amylases are DuramylTM, TermamylTM, Termamyl UltraTM, FungamylTM, BanTM, StainzymeTM, Stainzyme PlusTM, Amplify®, SupramylTM, NatalaseTM, Liquozyme X and BANTM (from Novozymes A/S), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200, Vienna, Austria, and RapidaseTM, PurastarTM/EffectenzTM, Powerase, Preferenz S100, Preferenx S110, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, and PURASTAR OXAM® (Danisco/DuPont), and KAM® (Kao).

Пригодные липазы и кутиназы включают таковые бактериального или грибкового происхождения. Включены химически модифицированные мутантные ферменты или мутантные ферменты, полученные с применением белковой инженерии. Примеры включают липазу из Thermomyces, например, из T. lanuginosus (ранее называемых Humicola lanuginosa), которая описана в EP258068 и EP305216, кутиназу из Humicola, например, H. Insolens (WO96/13580), липазу из штаммов Pseudomonas (некоторые из них в настоящее время переименованы в Burkholderia), например, P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), P. sp. штамма SD705 (WO95/06720 и WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), липазы GDSL-типа Streptomyces (WO10/065455), кутиназу из Magnaporthe grisea (WO10/107560), кутиназу из Pseudomonas mendocina (US5389536), липазу из Thermobifida fusca (WO11/084412, WO13/033318), липазу Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), липазу из Bacillus subtilis (WO11/084599) и липазу из Streptomyces griseus (WO11/150157) и S. pristinaespiralis (WO12/137147).Suitable lipases and cutinases include those of bacterial or fungal origin. Included are chemically modified mutant enzymes or protein engineered mutant enzymes. Examples include lipase from Thermomyces such as from T. lanuginosus (formerly Humicola lanuginosa) which is described in EP258068 and EP305216, cutinase from Humicola such as H. insolens (WO96/13580), lipase from strains of Pseudomonas (some of them in now renamed Burkholderia), e.g. P. alcaligenes or P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), P. sp. strain SD705 (WO95/06720 and WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), Streptomyces GDSL-type lipase (WO10/065455), cutinase from Magnaporthe grisea (WO10/107560), cutinase from Pseudomonas mendocina (US5389536), lipase from Thermobifida fusca (WO11/084412, WO13/033318), lipase from Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), lipase from Bacillus subtilis (WO11/084599) and lipase from Streptomyces griseus (WO11/150157) and S. pristinaespiralis (WO12/1371 ).

Другими примерами являются варианты липаз, такие как описанные в EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 и WO 09/109500.Other examples are lipase variants such as those described in EP 407225, WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96 /00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 and WO 09/109500.

Предпочтительные коммерческие продукты на основе липаз включают LipolaseTM, Lipex™; LipolexTM и LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (первоначально от Genencor) и Lipomax (первоначально от Gist-Brocades).Preferred commercial lipase products include Lipolase™, Lipex™; LipolexTM and LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originally from Genencor) and Lipomax (originally from Gist-Brocades).

Другими примерами являются липазы, иногда называемые ацилтрансферазами или пергидролазами, например, ацилтрансферазы с гомологией с липазой А Cиida antarctica (WO10/111143), ацилтрансфераза из Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), пергидролазы из семейства CE 7 (WO09/67279) и варианты пергидролазы M. smegmatis, в частности, вариант S54V, используемый в коммерческом продукте Gentle Power Bleach от Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 10/100028).Other examples are lipases, sometimes referred to as acyltransferases or perhydrolases, e.g., acyltransferases with homology to lipase A of Ciida antarctica (WO10/111143), acyltransferase from Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), perhydrolases from the CE 7 family (WO09/67279), and perhydrolase variants. M. smegmatis, specifically the S54V variant used in the commercial product Gentle Power Bleach from Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 10/100028).

В одном аспекте другие предпочтительные ферменты включают эдоглюканазы микробного происхождения, проявляющие эндо-бета-1,4-глюканазную активность (EC3.2.1.4), в том числе бактериальный полипептид, эндогенный по отношению к члену рода Bacillus, который имеет последовательность, по меньшей мере на 90%, 94%, 97% или 99% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 в US7141403, и их смеси. Подходящие эндоглюканазы продают под торговыми названиями Celluclean® и Whitezyme® (Novozymes).In one aspect, other preferred enzymes include microbial-derived edoglucanases exhibiting endo-beta-1,4-glucanase activity (EC3.2.1.4), including a bacterial polypeptide endogenous to a member of the genus Bacillus that has a sequence of at least least 90%, 94%, 97% or 99% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 in US7141403, and mixtures thereof. Suitable endoglucanases are sold under the tradenames Celluclean® and Whitezyme® (Novozymes).

Другие предпочтительные ферменты включают пектат-лиазы, продаваемые под торговыми названиями Pectawash®, Pectaway®, Xpect®, и маннаназы, продаваемые под торговыми названиями Mannaway® (Novozymes) и Purabrite® (Danisco/DuPont).Other preferred enzymes include pectate lyases sold under the trade names Pectawash®, Pectaway®, Xpect®, and mannanases sold under the trade names Mannaway® (Novozymes) and Purabrite® (Danisco/DuPont).

Фермент(ы) в моющем средстве может(могут) быть включен(ы) в моющую композицию путем добавления отдельных добавок, содержащих один или несколько ферментов, или путем добавления комбинированной добавки, содержащей все из этих ферментов. Моющую добавку согласно настоящему изобретению, т. е. отдельную добавку или комбинированную добавку, можно составить, например, в виде гранулята, жидкости, взвеси и т. д. Предпочтительные составы моющих добавок представляют собой грануляты, в частности непылящие грануляты, жидкости, в частности стабилизированные жидкости, или взвеси.The enzyme(s) in the detergent may be included(s) in the detergent composition by adding separate additives containing one or more enzymes, or by adding a combined additive containing all of these enzymes. The detergent additive according to the present invention, i.e. a single additive or a combined additive, can be formulated, for example, in the form of granules, liquids, slurries, etc. Preferred detergent additive formulations are granulates, in particular non-dusting granules, liquids, in particular stabilized liquids, or slurries.

Непылящие грануляты могут быть получены, например, как раскрыто в US4106991 и US4661452, и необязательно могут быть покрыты с помощью способов, известных из уровня техники. Примерами восковидных покрывающих материалов являются поли(этиленоксидные) продукты (полиэтиленгликоль, PEG) со средним молярным весом 1000-20000; этоксилированные нонилфенолы, содержащие 16-50 этиленоксидных звеньев; этоксилированные жирные спирты, в которых спирт содержит от 12 до 20 атомов углерода и в которых присутствует от 15 до 80 этиленоксидных звеньев; жирные спирты; жирные кислоты; а также моно-, и ди-, и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих покрывающих материалов, подходящих для нанесения с помощью методик с применением псевдоожиженного слоя, приведены в GB1483591. Жидкие ферментные препараты можно, например, стабилизировать путем добавления полиола, такого как пропиленгликоль, сахара или сахароспирта, молочной кислоты или борной кислоты в соответствии с общепризнанными способами. Защищенные ферменты можно получать в соответствии со способом, раскрытым в EP238216.Non-dusting granules can be obtained, for example, as disclosed in US4106991 and US4661452, and optionally can be coated using methods known from the prior art. Examples of waxy coating materials are poly(ethylene oxide) products (polyethylene glycol, PEG) with an average molar weight of 1000-20000; ethoxylated nonylphenols containing 16-50 ethylene oxide units; ethoxylated fatty alcohols in which the alcohol contains from 12 to 20 carbon atoms and in which 15 to 80 ethylene oxide units are present; fatty alcohols; fatty acid; as well as mono-, and di-, and triglycerides of fatty acids. Examples of film-forming coating materials suitable for application by fluidized bed techniques are given in GB1483591. Liquid enzyme preparations can, for example, be stabilized by adding a polyol such as propylene glycol, sugar or sugar alcohol, lactic acid or boric acid, in accordance with conventional methods. Protected enzymes can be obtained in accordance with the method disclosed in EP238216.

Средства, ингибирующие перенос красителя. Композиции по настоящему изобретению также могут включать одно или несколько средств, ингибирующих перенос красителя. Подходящие полимерные средства, ингибирующие перенос красителя, включают без ограничения полимеры поливинилпирролидона, полимеры полиамин-N-оксида, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси. Средства, ингибирующие перенос красителя, если они присутствуют в композиции, могут присутствовать в количествах от 0,0001 до 10 вес. %, от 0,01 до 5 вес. % или от 0,1 до 3 вес. %.Dye transfer inhibiting agents. The compositions of the present invention may also include one or more dye transfer inhibiting agents. Suitable polymeric dye transfer agents include, without limitation, polyvinylpyrrolidone polymers, polyamine N-oxide polymers, N-vinylpyrrolidone-N-vinylimidazole copolymers, polyvinyloxazolidones, and polyvinylimidazoles, or mixtures thereof. Dye transfer inhibiting agents, if present in the composition, may be present in amounts from 0.0001 to 10 wt. %, from 0.01 to 5 wt. % or from 0.1 to 3 wt. %.

Осветлители. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты, которые могут изменять насыщенность цвета изделия, которое очищают, например флюоресцентные осветлители.Clarifiers. The compositions of the present invention may also contain additional components that may alter the color saturation of the article being cleaned, such as fluorescent brighteners.

Композиция может содержать флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 в альфа-кристаллической форме, имеющий следующую структуру:The composition may contain a C.I. fluorescent brightener. 260 in alpha crystalline form, having the following structure:

В одном аспекте осветлитель представляет собой растворимый в холодной воде осветлитель, например флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 в альфа-кристаллической форме. В одном аспекте осветлитель преимущественно находится в альфа-кристаллической форме, что означает, что, как правило, по меньшей мере 50 вес. %, по меньшей мере 75 вес. %, по меньшей мере 90 вес. %, по меньшей мере 99 вес. % или даже, по сути, весь флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 находится в альфа-кристалличесткой форме.In one aspect, the clarifier is a cold water soluble clarifier, such as a fluorescent clarifier with C.I. 260 in alpha crystalline form. In one aspect, the clarifier is predominantly in alpha crystalline form, which means that, as a rule, at least 50 wt. %, at least 75 wt. %, at least 90 wt. %, at least 99 wt. % or even, in fact, the entire fluorescent clarifier with C.I. 260 is in alpha crystalline form.

Осветлитель, как правило, находится в форме тонкоизмельченных частиц, имеющих средневесовой размер первичной частицы от 3 до 30 микрометров, от 3 микрометров до 20 микрометров или от 3 до 10 микрометров.The clarifier is typically in the form of fine particles having a weight average primary particle size of 3 to 30 micrometers, 3 micrometers to 20 micrometers, or 3 to 10 micrometers.

Композиция может содержать флюоресцентный осветлитель с C.I. 260 в бета-кристаллической форме, и весовое соотношение (i) флюоресцентного осветлителя с C.I. 260 в альфа-кристаллической форме и (ii) флюоресцентного осветлителя с C.I. 260 в бета-кристаллической форме может составлять по меньшей мере 0,1 или по меньшей мере 0,6. Патентный документ BE680847 относится к способу получения флюоресцентного осветлителя с C.I 260 в альфа-кристаллической форме.The composition may contain a C.I. fluorescent brightener. 260 in beta crystalline form, and the weight ratio (i) of the fluorescent brightener with C.I. 260 in alpha crystalline form and (ii) a fluorescent brightener with C.I. 260 in beta crystalline form may be at least 0.1 or at least 0.6. Patent document BE680847 relates to a process for preparing a fluorescent brightener with C.I 260 in alpha crystalline form.

Коммерческие оптические осветлители, которые могут быть пригодными в настоящем изобретении, могут быть разделены на подгруппы, которые включают, но необязательно ограничиваются этим, производные стильбена, пиразолина, кумарина, карбоновой кислоты, метинцианинов, дибензотиофен-5,5-диоксида, азолов, гетероциклов с 5- и 6-членным кольцом и других различных веществ. Примеры таких осветлителей раскрыты в "The Production and Application of Fluorescent Brightening Agents", M. Zahradnik, опубликованном John Wiley & Sons, New York (1982). Конкретные неограничивающие примеры оптических осветлителей, которые являются пригодными в настоящих композициях, представляют собой средства, указанные в US4790856 и US3646015.Commercial optical brighteners that may be useful in the present invention may be divided into subgroups which include, but are not necessarily limited to, derivatives of stilbene, pyrazoline, coumarin, carboxylic acid, methincyanines, dibenzothiophene-5,5-dioxide, azoles, heterocycles with 5- and 6-membered ring and various other substances. Examples of such brighteners are disclosed in "The Production and Application of Fluorescent Brightening Agents", M. Zahradnik, published by John Wiley & Sons, New York (1982). Specific non-limiting examples of optical brighteners that are suitable in the present compositions are those specified in US4790856 and US3646015.

Следующий подходящий осветлитель имеет приведенную ниже структуру:The next suitable clarifier has the following structure:

Количества подходящего флюоресцентного осветлителя включают нижние значения количества от 0,01 вес. %, от 0,05 вес. %, от 0,1 вес. % или от 0,2 вес. % до верхних значений количества 0,5 вес. % или 0,75 вес. %.Amounts of suitable fluorescent clarifier include lower amounts from 0.01 wt. %, from 0.05 wt. %, from 0.1 wt. % or from 0.2 wt. % to the upper values of the amount of 0.5 wt. % or 0.75 wt. %.

В одном аспекте осветлитель может быть загружен в глину с образованием частицы. Силикатные соли. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать силикатные соли, например, силикат натрия или калия. Композиция может содержать от 0 вес. % до менее 10 вес. % силикатной соли, до 9 вес. %, или до 8 вес. %, или до 7 вес. %, или до 6 вес. %, или до 5 вес. %, или до 4 вес. %, или до 3 вес. %, или даже до 2 вес. % и от более 0 вес. %, или от 0,5 вес. %, или от 1 вес. % силикатной соли. Подходящей силикатной солью является силикат натрия.In one aspect, the clarifier may be loaded into the clay to form a particle. silicate salts. The compositions of the present invention may also contain silicate salts, for example sodium or potassium silicate. The composition may contain from 0 wt. % to less than 10 wt. % silicate salt, up to 9 wt. %, or up to 8 wt. %, or up to 7 wt. %, or up to 6 wt. %, or up to 5 wt. %, or up to 4 wt. %, or up to 3 wt. %, or even up to 2 wt. % and from more than 0 wt. %, or from 0.5 wt. %, or from 1 wt. % silicate salt. A suitable silicate salt is sodium silicate.

Диспергирующие средства. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать диспергирующие средства. Подходящие растворимые в воде органические материалы включают гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновая кислота содержит по меньшей мере два карбоксильных радикала, отделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода.dispersants. The compositions of the present invention may also contain dispersants. Suitable water-soluble organic materials include homo- or copolymer acids, or salts thereof, in which the polycarboxylic acid contains at least two carboxyl radicals separated from each other by no more than two carbon atoms.

Стабилизаторы ферментов. Ферменты для применения в композициях могут быть стабилизированы с помощью различных методик. Ферменты, применяемые согласно настоящему документу, могут быть стабилизированы при присутствии растворимых в воде источников ионов кальция и/или магния. Примерами общепринятых стабилизирующих средств являются, например, полиол, такой как пропиленгликоль или глицерин, сахар или сахароспирт, пептидный альдегид, молочная кислота, борная кислота или производное борной кислоты, например ароматический сложный эфир борной кислоты, или производное фенилбороновой кислоты, например 4-формилфенилбороновая кислота, и композицию можно составить, как описано, например, в WO92/19709 и WO92/19708. В случае водных композиций, содержащих протеазу, для улучшения стабильности можно дополнительно добавлять обратимый ингибитор протеазы, такой как соединение бора, в том числе борат, 4-формилфенилбороновую кислоту, фенилбороновую кислоту и ее производные, или соединения, такие как формиат кальция, формиат натрия и 1,2-пропандиол. Пептидный альдегид может иметь формулу B2-B1-B0-R, где R представляет собой водород, CH3, CX3, CHX2 или CH2X, где X представляет собой атом галогена; B0 представляет собой остаток фенилаланина с заместителем OH в пара-положении и/или в мета-положении; B1 представляет собой один остаток аминокислоты; и B2 состоит из одного или нескольких аминокислотных остатков, необязательно содержащих N-концевую защитную группу. Предпочтительные пептидные альдегиды включают без ограничения Z-RAY-H, Ac-GAY-H, Z-GAY-H, Z-GAL-H, Z-GAF-H, Z-GAV-H, Z-RVY-H, Z-LVY-H, Ac-LGAY-H, Ac-FGAY-H, Ac-YGAY-H, Ac-FGVY-H или Ac-WLVY-H, где Z представляет собой бензилоксикарбонил, Ac представляет собой ацетил.enzyme stabilizers. Enzymes for use in compositions can be stabilized using a variety of techniques. The enzymes used herein can be stabilized in the presence of water-soluble sources of calcium and/or magnesium ions. Examples of conventional stabilizing agents are, for example, a polyol such as propylene glycol or glycerol, sugar or sugar alcohol, peptide aldehyde, lactic acid, boric acid or a boric acid derivative, such as an aromatic ester of boric acid, or a phenylboronic acid derivative, such as 4-formylphenylboronic acid. , and the composition can be formulated as described in, for example, WO92/19709 and WO92/19708. In the case of aqueous compositions containing a protease, a reversible protease inhibitor such as a boron compound, including borate, 4-formylphenylboronic acid, phenylboronic acid and its derivatives, or compounds such as calcium formate, sodium formate and 1,2-propanediol. The peptide aldehyde may have the formula B2-B1-B0-R where R is hydrogen, CH3, CX3, CHX2 or CH2X where X is a halogen atom; B0 is a phenylalanine residue with an OH substituent in the para position and/or in the meta position; B1 is one amino acid residue; and B2 consists of one or more amino acid residues, optionally containing an N-terminal protecting group. Preferred peptide aldehydes include, without limitation, Z-RAY-H, Ac-GAY-H, Z-GAY-H, Z-GAL-H, Z-GAF-H, Z-GAV-H, Z-RVY-H, Z- LVY-H, Ac-LGAY-H, Ac-FGAY-H, Ac-YGAY-H, Ac-FGVY-H or Ac-WLVY-H, where Z is benzyloxycarbonyl, Ac is acetyl.

Растворители. Подходящие растворители включают воду и другие растворители, например, липофильные жидкости. Примеры подходящих липофильных жидкостей включают силоксаны, другие кремнийорганические соединения, углеводороды, простые эфиры гликолей, производные глицерина, такие как эфиры глицерина, перфторированные амины, перфторированные и гидрофторэфирные растворители, низколетучие нефторированные органические растворители, диольные растворители, другие экологически безопасные растворители и их смеси.Solvents. Suitable solvents include water and other solvents such as lipophilic liquids. Examples of suitable lipophilic liquids include siloxanes, other silicone compounds, hydrocarbons, glycol ethers, glycerol derivatives such as glycerol ethers, perfluorinated amines, perfluorinated and hydrofluoroether solvents, low volatile non-fluorinated organic solvents, diol solvents, other environmentally friendly solvents, and mixtures thereof.

Структурообразующее средство/загустители. Структурированные жидкости могут быть или внутренне структурированными, при этом структура образована первичными ингредиентами (например, материалом поверхностно-активного вещества), и/или наружно структурированными путем обеспечения структуры трехмерной матрицы с использованием вторичных ингредиентов (например, полимеров, глины и/или силикатного материала). Композиция может содержать структурообразующее средство в количестве от 0,01 до 5 вес. % или от 0,1 до 2,0 вес. %. Структурообразующее средство, как правило, выбрано из группы, состоящей из диглицеридов и триглицеридов, дистеарата этиленгликоля, микрокристаллической целлюлозы, материалов на основе целлюлозы, микроволокнистой целлюлозы, гидрофобно модифицированных набухающих в щелочных условиях эмульсий, таких как Polygel W30 (3VSigma), биополимеров, ксантановой камеди, геллановой камеди и их смесей. Подходящее структурообразующее средство включает гидрогенизированное касторовое масло и его неэтоксилированные производные. Подходящее структурообразующее средство раскрыто в US6855680. Такие структурообразующие средства имеют нитеобразную структурообразующую систему с диапазоном соотношений размеров. Другие подходящие структурообразующие средства и способы их получения описаны в WO10/034736.Structure builder/thickeners. Structured fluids can be either internally structured, with the structure formed by primary ingredients (e.g., surfactant material), and/or externally structured by providing a three-dimensional matrix structure using secondary ingredients (e.g., polymers, clay, and/or silicate material) . The composition may contain a structure-forming agent in an amount of from 0.01 to 5 wt. % or from 0.1 to 2.0 wt. %. The builder is generally selected from the group consisting of diglycerides and triglycerides, ethylene glycol distearate, microcrystalline cellulose, cellulose-based materials, microfiber cellulose, hydrophobically modified alkaline swellable emulsions such as Polygel W30 (3VSigma), biopolymers, xanthan gum , gellan gum and mixtures thereof. Suitable builders include hydrogenated castor oil and non-ethoxylated derivatives thereof. A suitable structurant is disclosed in US6855680. Such structurants have a filamentous structurant system with a range of size ratios. Other suitable structurants and methods for their preparation are described in WO10/034736.

Модификаторы. Композиция по настоящему изобретению может включать жирное соединение с высокой точкой плавления. Жирное соединение с высокой точкой плавления, пригодное согласно данному документу, имеет точку плавления 25°C или выше и выбрано из группы, состоящей из жирных спиртов, жирных кислот, производных жирных спиртов, производных жирных кислот и их смесей. Такие соединения с низкой точкой плавления не предназначены для включения в данный раздел. Неограничивающие примеры соединений с высокой точкой плавления можно найти в International Cosmetic Ingredient Dictionary, Fifth Edition, 1993, и CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992.modifiers. The composition of the present invention may include a fatty compound with a high melting point. The high melting point fatty compound useful herein has a melting point of 25° C. or higher and is selected from the group consisting of fatty alcohols, fatty acids, fatty alcohol derivatives, fatty acid derivatives, and mixtures thereof. Such low melting point compounds are not intended to be included in this section. Non-limiting examples of high melting point compounds can be found in International Cosmetic Ingredient Dictionary, Fifth Edition, 1993, and CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992.

Жирное соединение с высокой точкой плавления включено в композицию в количестве от 0,1 до 40 вес. %, от 1 до 30 вес. %, от 1,5 до 16 вес. %, от 1,5 до 8 вес. % с целью обеспечения таких положительных эффектов улучшенной модификации, как ощущение гладкости при нанесении на влажные волосы, ощущение мягкости и увлажненности на сухих волосах.Fatty compound with a high melting point is included in the composition in an amount of from 0.1 to 40 wt. %, from 1 to 30 wt. %, from 1.5 to 16 wt. %, from 1.5 to 8 wt. % in order to provide such positive effects of improved modification as a feeling of smoothness when applied to wet hair, a feeling of softness and moisture on dry hair.

Композиции по настоящему изобретению могут содержать катионный полимер. Концентрации катионного полимера в композиции, как правило, находятся в диапазоне от 0,05 до 3 вес. %, от 0,075 до 2,0 вес. % или от 0,1 до 1,0 вес. %. Подходящие катионные полимеры будут характеризоваться значениями плотности катионного заряда, составляющими по меньшей мере 0,5 мэкв/г, по меньшей мере 0,9 мэкв/г, по меньшей мере 1,2 мэкв/г, по меньшей мере 1,5 мэкв/г или менее 7 мэкв/г и менее 5 мэкв/г, при предполагаемом pH применения композиции, причем это значение pH, как правило, будет находиться в диапазоне от pH 3 до pH 9 или от pH 4 до pH 8. В данном документе "плотность катионного заряда" полимера относится к соотношению числа положительных зарядов полимера и молекулярного веса полимера. Средний молекулярный вес таких подходящих катионных полимеров обычно будет составлять от 10000 до 10 миллионов, от 50000 до 5 миллионов или от 100000 до 3 миллионов.The compositions of the present invention may contain a cationic polymer. The concentration of cationic polymer in the composition, as a rule, are in the range from 0.05 to 3 wt. %, from 0.075 to 2.0 wt. % or from 0.1 to 1.0 wt. %. Suitable cationic polymers will have cationic charge densities of at least 0.5 meq/g, at least 0.9 meq/g, at least 1.2 meq/g, at least 1.5 meq/g or less than 7 meq/g and less than 5 meq/g, at the intended pH of application of the composition, which pH will typically be in the range of pH 3 to pH 9 or pH 4 to pH 8. As used herein, "density "cationic charge" of a polymer refers to the ratio of the number of positive charges on the polymer to the molecular weight of the polymer. The average molecular weight of such suitable cationic polymers will typically be 10,000 to 10 million, 50,000 to 5 million, or 100,000 to 3 million.

Подходящие катионные полимеры для применения в композициях по настоящему изобретению содержат катионные азотсодержащие фрагменты, например, четвертичный аммоний или катионные протонированные амино-фрагменты. Можно применять любые анионные противоионы совместно с катионными полимерами, поскольку полимеры остаются растворимыми в воде, в композиции или в фазе коацервата композиции, и поскольку противоионы физически и химически совместимы с основными компонентами композиции или не ухудшают каким-либо другим нежелательным образом эффективность, стабильность или эстетические характеристики композиции. Неограничивающие примеры таких противоионов включают галиды (например, хлорид, фторид, бромид, йодид), сульфат и метилсульфат.Suitable cationic polymers for use in the compositions of the present invention contain cationic nitrogen containing moieties, for example quaternary ammonium or cationic protonated amino moieties. Any anionic counterions can be used in conjunction with cationic polymers, as long as the polymers remain soluble in water, in the composition, or in the coacervate phase of the composition, and as long as the counterions are physically and chemically compatible with the main components of the composition or do not impair in any other undesirable way the effectiveness, stability, or aesthetics. composition characteristics. Non-limiting examples of such counterions include halides (eg, chloride, fluoride, bromide, iodide), sulfate, and methyl sulfate.

Неограничивающие примеры таких полимеров описаны в 3-м издании CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary под редакцией Estrin, Crosley и Haynes (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. (1982)).Non-limiting examples of such polymers are described in the 3rd edition of the CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary, edited by Estrin, Crosley, and Haynes (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, D.C. (1982)).

Другие подходящие катионные полимеры для применения в композиции включают полисахаридные полимеры, катионные производные гуаровой камеди, содержащие четвертичный азот эфиры целлюлозы, синтетические полимеры, coполимеры этерифицированной целлюлозы, гуаровой камеди и крахмала. В случае применения катионные полимеры согласно данному документу являются либо растворимыми в композиции, либо растворимыми в фазе коацервата с координационными связями в композиции, образованной катионным полимером и анионным, амфотерным и/или цвиттер-ионным компонентом, представляющим собой поверхностно-активное вещество, описанным в данном документе ранее. Коацерваты с координационными связями катионного полимера также могут быть образованы другими заряженными материалами в композиции. Подходящие катионные полимеры описаны в US3962418; US3958581 и US2007/0207109.Other suitable cationic polymers for use in the composition include polysaccharide polymers, cationic guar gum derivatives, quaternary nitrogen containing cellulose ethers, synthetic polymers, copolymers of cellulose ester, guar gum and starch. When used, the cationic polymers of this document are either soluble in the composition or soluble in the coacervate phase with coordination bonds in the composition formed by the cationic polymer and the anionic, amphoteric and/or zwitterionic surfactant component described herein. document earlier. Coacervates with cationic polymer coordination bonds can also be formed by other charged materials in the composition. Suitable cationic polymers are described in US3962418; US3958581 and US2007/0207109.

Композиция по настоящему изобретению может включать неионогенный полимер в качестве модификатора. Согласно данному документу пригодными являются полиалкиленгликоли, имеющие молекулярный вес более 1000. Пригодными являются таковые, имеющие следующую общую формулу:The composition of the present invention may include a non-ionic polymer as a modifier. According to this document, polyalkylene glycols having a molecular weight greater than 1000 are suitable. Those having the following general formula are suitable:

где R95 выбран из группы, состоящей из H, метила и их смесей. Модификаторы, и в частности кремнийорганические соединения, могут быть включены в композицию. Модификаторы, пригодные в композициях по настоящему изобретению, как правило, содержат нерастворимую в воде, диспергируемую в воде нелетучую жидкость, которая образует эмульгированные жидкие частицы. Подходящими модификаторами для применения в композиции являются те модификаторы, которые обычно характеризуются как кремнийорганические соединения (например, силиконовые масла, катионные силиконы, ненаполненные силиконовые каучуки, силиконы с высоким показателем преломления и силиконовые смолы), органические модифицирующие масла (например, углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры) или их комбинации, или те модификаторы, которые каким-либо другим образом образуют жидкие диспергированные частицы в водной матрице поверхностно-активного вещества согласно данному документу. Такие модификаторы должны быть физически и химически совместимыми с основными компонентами композиции и не должны каким-либо другим нежелательным образом ухудшать стабильность, эстетические характеристики или эффективность композиции.where R95 is selected from the group consisting of H, methyl and mixtures thereof. Modifiers, and in particular organosilicon compounds, can be included in the composition. Modifiers useful in the compositions of the present invention typically comprise a water-insoluble, water-dispersible, non-volatile liquid that forms emulsified liquid particles. Suitable modifiers for use in the formulation are those modifiers commonly characterized as organosilicon compounds (eg silicone oils, cationic silicones, unfilled silicone rubbers, high refractive index silicones and silicone resins), organic builder oils (eg hydrocarbon oils, polyolefins and fatty esters) or combinations thereof, or those modifiers which otherwise form liquid dispersed particles in an aqueous matrix of a surfactant according to this document. Such modifiers must be physically and chemically compatible with the main components of the composition and must not in any other undesirable way impair the stability, aesthetic characteristics or effectiveness of the composition.

Концентрация модификатора в композиции должна быть достаточной для обеспечения необходимых положительных эффектов модификации. Такая концентрация может варьировать в зависимости от модификатора, необходимой эффективности модификации, среднего размера частиц модификатора, типа и концентрации других компонентов и других подобных факторов.The concentration of the modifier in the composition should be sufficient to provide the desired positive effects of the modification. Such a concentration may vary depending on the modifier, the desired modification efficiency, the average particle size of the modifier, the type and concentration of other components, and other similar factors.

Концентрация силиконового модификатора, как правило, находится в диапазоне от 0,01 до 10 вес. %. Неограничивающие примеры подходящих кремнийорганических модификаторов и необязательных суспендирующих средств для кремнийорганического соединения описаны в переизданном патенте США № 34584; US5104646; US5106609; US4152416; US2826551; US3964500; US4364837; US6607717; US6482969; US5807956; US5981681; US6207782; US7465439; US7041767; US7217777; US2007/0286837A1; US2005/0048549A1; US2007/0041929A1; GB849433; DE10036533, все из которых включены в данный документ посредством ссылки; Chemistry and Technology of Silicones, New York: Academic Press (1968); General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 и SE 76; Silicon Compounds, Petrarch Systems, Inc. (1984); и в Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 15, 2d ed., pp 204-308, John Wiley & Sons, Inc. (1989).The concentration of the silicone modifier is typically in the range of 0.01 to 10 wt. %. Non-limiting examples of suitable silicone modifiers and optional silicone suspending agents are described in US Patent Reissue No. 34584; US5104646; US5106609; US4152416; US2826551; US3964500; US4364837; US6607717; US6482969; US5807956; US5981681; US6207782; US7465439; US7041767; US7217777; US2007/0286837A1; US2005/0048549A1; US2007/0041929A1; GB849433; DE10036533, all of which are incorporated herein by reference; Chemistry and Technology of Silicones, New York: Academic Press (1968); General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 and SE 76; Silicon Compounds, Petrarch Systems, Inc. (1984); and in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 15, 2d ed., pp. 204-308, John Wiley & Sons, Inc. (1989).

Композиции по настоящему изобретению также могут содержать от 0,05 до 3 вес. % по меньшей мере одного органического модифицирующего масла в качестве модификатора, либо отдельно, либо в комбинации с другими модификаторами, например, кремнийорганическими соединениями (описанными в данном документе). Подходящие модифицирующие масла включают углеводородные масла, полиолефины и жирные сложные эфиры. Также подходящими для применения в композициях согласно данному документу являются модификаторы, описанные в US5674478 и US5750122 или в US4529586; US4507280; US4663158; US4197865; US4217914; US4381919 и US4422853.Compositions of the present invention may also contain from 0.05 to 3 wt. % of at least one organic modifier oil as a modifier, either alone or in combination with other modifiers, such as organosilicon compounds (described herein). Suitable builder oils include hydrocarbon oils, polyolefins, and fatty esters. Also suitable for use in compositions according to this document are the modifiers described in US5674478 and US5750122 or US4529586; US4507280; US4663158; US4197865; US4217914; US4381919 and US4422853.

Гигиена и неприятный запах. Композиции по настоящему изобретению также могут содержать одно или несколько из рицинолеата цинка, тимола, четвертичных аммониевых солей, например, Bardac®, полиэтилениминов (например, Lupasol® от BASF) и их комплексов с цинком, серебра и соединений серебра, в частности, соединений, предназначенных для медленного высвобождения Ag+, или дисперсий нано-серебра.Hygiene and bad smell. The compositions of the present invention may also contain one or more of zinc ricinoleate, thymol, quaternary ammonium salts, e.g. Bardac®, polyethyleneimines (e.g. Lupasol® from BASF) and their complexes with zinc, silver and silver compounds, in particular compounds, designed for the slow release of Ag+, or nano-silver dispersions.

Пробиотики. Композиции могут содержать пробиотики, например, описанные в WO09/043709.Probiotics. The compositions may contain probiotics, such as those described in WO09/043709.

Пенообразователи. Если необходимо сильное пенообразование, в композиции могут быть введены пенообразователи, такие как C10-C16алканоламиды или C10-C14алкилсульфаты, как правило, в количествах от 1 до 10 вес. %. C10-C14моноэтанол- и диэтаноламиды представляют типичный класс таких пенообразователей. Применение таких пенообразователей со вспомогательными поверхностно-активными веществами, характеризующимися сильным пенообразованием, такими как аминоксиды, бетаины и сультаины, приведенные выше, также является преимущественным. При необходимости можно добавлять растворимые в воде соли магния и/или кальция, например, MgCl2, MgSO4, CaCl2, CaSO4 и т.п., как правило, в количествах от 0,1 до 2 вес. % с обеспечением дополнительного количества мыльной пены и с повышением эффективности удаления жиров и масел.Foaming agents. If strong foaming is desired, blowing agents such as C10-C16 alkanolamides or C10-C14 alkyl sulfates can be incorporated into the compositions, typically in amounts of 1 to 10 wt. %. C10-C14 monoethanol- and diethanolamides represent a typical class of such blowing agents. The use of such blowing agents with strong foaming co-surfactants such as the amine oxides, betaines and sultaines mentioned above is also advantageous. If necessary, water-soluble salts of magnesium and/or calcium, for example, MgCl2, MgSO4, CaCl2, CaSO4, etc., can be added, usually in amounts from 0.1 to 2 wt. % to provide an additional amount of soap suds and to increase the efficiency of removing fats and oils.

Подавители образования мыльной пены. В композиции по настоящему изобретению можно вводить соединения для снижения или подавления образования мыльной пены. Подавление образования мыльной пены может иметь особое значение в так называемом "процессе очищения с высокой концентрацией", как описано в US4489455 и US4489574, и в стиральных машинах с конструкцией фронтальной загрузки. В качестве подавителей образования мыльной пены можно применять широкий круг материалов, и подавители образования мыльной пены хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Third Edition, Volume 7, p.430-447 (John Wiley & Sons, Inc., 1979). Примеры подавителей образования мыльной пены включают монокарбоновую жирную кислоту и ее растворимые соли, высокомолекулярные углеводороды, такие как парафин, сложные эфиры жирных кислот (например, триглицериды жирных кислот), сложные эфиры жирных кислот и одновалентных спиртов, алифатические C18-C40кетоны (например, стеарон), N-алкилированные аминотриазины, воскообразные углеводороды, предпочтительно имеющие точку плавления ниже приблизительно 100°C, силиконовые подавители образования мыльной пены и вторичные спирты. Подавители образования мыльной пены описаны в US2954347; US4265779; US4265779; US3455839; US3933672; US4652392; US4978471; US4983316; US5288431; US4639489; US4749740; US4798679; US4075118; EP89307851.9; EP150872 и DOS 2124526.Soap suds suppressors. Compounds may be incorporated into the compositions of the present invention to reduce or suppress suds. Suds suppression can be of particular importance in the so-called "high concentration cleaning process" as described in US4489455 and US4489574 and in front loading washing machines. A wide range of materials can be used as suds suppressors, and suds suppressors are well known to those skilled in the art. See, for example, Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Third Edition, Volume 7, p. 430-447 (John Wiley & Sons, Inc., 1979). Examples of suds inhibitors include a monocarboxylic fatty acid and its soluble salts, high molecular weight hydrocarbons such as paraffin, fatty acid esters (e.g. triglycerides of fatty acids), fatty acid esters of monovalent alcohols, aliphatic C18-C40 ketones (e.g. stearone) , N-alkylated aminotriazines, waxy hydrocarbons, preferably having a melting point below about 100° C., silicone suds suppressors, and secondary alcohols. Suds suppressors are described in US2954347; US4265779; US4265779; US3455839; US3933672; US4652392; US4978471; US4983316; US5288431; US4639489; US4749740; US4798679; US4075118; EP89307851.9; EP150872 and DOS 2124526.

Для любых моющих композиций, применяемых в автоматических стиральных машинах, мыльная пена не должна образовываться в той степени, когда она выходит за пределы стиральной машины. Подавители образования мыльной пены, если их используют, предпочтительно присутствуют в "подавляющем образование мыльной пены количестве". Под "подавляющим образование мыльной пены количеством" понимают, что специалист, занимающийся составлением композиции, может выбрать количество данного средства для контроля пенообразования, которое будет в достаточной степени контролировать образование мыльной пены, что дает в результате моющее средство для стирки белья с низким пенообразованием для применения в автоматических стиральных машинах.For any detergent compositions used in automatic washing machines, soap suds should not form to the extent that it exits the washing machine. Suds suppressors, if used, are preferably present in a "suds suppressing amount". By "suds suppressing amount" is meant that the formulater can select an amount of a given suds control agent that will sufficiently control suds to result in a low sudsing laundry detergent for use. in automatic washing machines.

Композиции согласно данному документу обычно будут содержать от 0 до 10 вес. % подавителя образования мыльной пены. При использовании в качестве подавителей мыльной пены монокарбоновые жирные кислоты и их соли, как правило, будут присутствовать в количествах до 5 вес. %. Предпочтительно используют от 0,5 до 3 вес. % жирного монокарбоксилатного подавителя образования мыльной пены. Силиконовые подавители образования мыльной пены, как правило, используют в количествах до 2,0 вес. %, хотя можно применять и большие количества. Моностеарилфосфатные подавители образования мыльной пены, как правило, используют в количествах в диапазоне от 0,1 до 2 вес. %. Углеводородные подавители мыльной пены, как правило, используют в количествах в диапазоне от 0,01 до 5,0 вес. %, хотя можно применять и большие количества. Спиртовые подавители образования мыльной пены, как правило, применяют в количестве от 0,2 до 3 вес. %.Compositions according to this document will usually contain from 0 to 10 wt. % suds suppressor. When used as suds suppressors, the monocarboxylic fatty acids and their salts will typically be present in amounts up to 5 wt. %. Preferably, 0.5 to 3 wt. % fatty monocarboxylate suds suppressor. Silicone suds suppressors are typically used in amounts up to 2.0 wt. %, although larger amounts can be used. Monostearyl phosphate suds suppressors are typically used in amounts ranging from 0.1 to 2 wt. %. Hydrocarbon suds suppressors are typically used in amounts ranging from 0.01 to 5.0 wt. %, although larger amounts can be used. Alcoholic suds suppressors are generally used in an amount of 0.2 to 3 wt. %.

Композиции согласно данному документу могут обладать очищающей активностью в широком диапазоне pH. В некоторых вариантах осуществления композиции обладают очищающей активностью в диапазоне от pH 4 до pH 11,5. В других вариантах осуществления композиции являются активными в диапазоне от pH 6 до pH 11, от pH 7 до pH 11, от pH 8 до pH 11, от pH 9 до pH 11 или от pH 10 до pH 11,5.Compositions according to this document may have cleaning activity over a wide pH range. In some embodiments, the compositions have cleaning activity ranging from pH 4 to pH 11.5. In other embodiments, the compositions are active in the range of pH 6 to pH 11, pH 7 to pH 11, pH 8 to pH 11, pH 9 to pH 11, or pH 10 to pH 11.5.

Композиции согласно данному документу могут обладать очищающей активностью в широком диапазоне температур, например, от 10°C или ниже до 90°C. Предпочтительно температура будет ниже 50°C, или 40°C, или даже 30°C. В некоторых вариантах осуществления оптимальный диапазон температур для композиций составляет от 10°C до 20°C, от 15°C до 25°C, от 15°C до 30°C, от 20°C до 30°C, от 25°C до 35°C, от 30°C до 40°C, от 35°C до 45°C или от 40°C до 50°C.Compositions according to this document may have cleaning activity over a wide range of temperatures, for example, from 10°C or below to 90°C. Preferably the temperature will be below 50°C, or 40°C, or even 30°C. In some embodiments, the optimum temperature range for the compositions is 10°C to 20°C, 15°C to 25°C, 15°C to 30°C, 20°C to 30°C, 25°C up to 35°C, 30°C to 40°C, 35°C to 45°C or 40°C to 50°C.

Форма композицииComposition form

Композиции, описанные в данном документе, преимущественно используют, например, в способах применения для стирки белья, очищения твердых поверхностей, способах применения для мытья посуды, а также в косметических способах применения, например, для зубных протезов, зубов, волос и кожи. Композиции по настоящему изобретению, в частности, представляют собой твердые или жидкие композиции для очищения и/или обработки. В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, где форма композиции выбрана из группы, состоящей из обычной, плотной или концентрированной жидкости; геля; пасты; бруска мыла; обычного или уплотненного порошка; гранулированного твердого вещества; гомогенной или многослойной таблетки с двумя или большим числом слоев (в одинаковой или разных фазах); пакета, имеющего одну или несколько камер; формы с разовой дозой, состоящей из одной или нескольких камер; или любой их комбинации.The compositions described herein are advantageously used in, for example, laundry applications, hard surface cleaning, dishwashing applications, and cosmetic applications, for example, dentures, teeth, hair, and skin. The compositions of the present invention, in particular, are solid or liquid cleaning and/or treatment compositions. In one aspect, the present invention relates to a composition, where the form of the composition is selected from the group consisting of a regular, dense or concentrated liquid; gel; pastes; bar of soap; regular or compacted powder; granular solid; homogeneous or multilayer tablet with two or more layers (in the same or different phases); a package having one or more cameras; single dose forms consisting of one or more chambers; or any combination of them.

Форма композиции может физически отделять один компонент от другого в камерах, таких как водорастворимые пакеты, или в разных слоях таблетки. Таким образом можно избежать отрицательного взаимодействия между компонентами при хранении. Различные профили растворимости каждой из камер также могут обеспечивать задержку растворения выбранных компонентов в моющем растворе.The form of the composition may physically separate one component from another in chambers, such as water-soluble pouches, or in different layers of the tablet. In this way, negative interaction between the components during storage can be avoided. The different dissolution profiles of each of the chambers can also delay the dissolution of selected components in the cleaning solution.

Пакеты могут быть сформированы с одной или множеством камер. Они могут иметь любую форму, вид и материал, который является подходящим для удерживания композиции, например, без возможности высвобождения композиции из пакета до контакта с водой. Пакет сделан из водорастворимой пленки, которая охватывает внутренний объем. Указанный внутренний объем может быть разделен на камеры пакета. Предпочитаемыми пленками являются полимерные материалы, предпочтительно полимеры, которые имеют форму пленки или слоя. Предпочтительные полимеры, сополимеры или их производные выбраны из полиакрилатов и водорастворимых coполимеров акрилата, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, декстрина натрия, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов, наиболее предпочтительно coполимеров поливинилового спирта и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC). Предпочтительно, количество полимера в пленке, например PVA, составляет по меньшей мере приблизительно 60%. Предпочтительный средний молекулярный вес обычно составляет от приблизительно 20000 до приблизительно 150000. Пленки также могут состоять из смешанных композиций, содержащих гидролитически разлагаемые и водорастворимые смеси полимеров, например полилактида и поливинилового спирта (известных под торговым названием M8630, продаваемых MonoSol LLC, Индиана, США), с пластификаторами, такими как глицерин, этиленглицерин, пропиленгликоль, сорбит и их смеси. Пакеты могут содержать твердую очищающую композицию для стирки или часть компонентов и/или жидкую очищающую композицию или часть компонентов, разделенные водорастворимой пленкой. Камера для жидких компонентов может отличаться по составу от камер, содержащих твердые вещества (US2009/0011970 A1).Packets can be formed with one or multiple cameras. They may be of any shape, form and material that is suitable for holding the composition, for example, without the possibility of releasing the composition from the bag prior to contact with water. The bag is made of a water-soluble film that covers the internal volume. Said internal volume may be divided into chambers of the package. Preferred films are polymeric materials, preferably polymers, which are in the form of a film or layer. Preferred polymers, copolymers or derivatives thereof are selected from polyacrylates and water-soluble copolymers of acrylate, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium dextrin, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, maltodextrin, polymethacrylates, most preferably polyvinyl alcohol-hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) copolymers. Preferably, the amount of polymer in the film, such as PVA, is at least about 60%. The preferred average molecular weight is typically from about 20,000 to about 150,000. Films can also be composed of mixed compositions containing hydrolytically degradable and water-soluble mixtures of polymers, such as polylactide and polyvinyl alcohol (known under the trade name M8630, sold by MonoSol LLC, Indiana, USA), with plasticizers such as glycerin, ethylene glycerin, propylene glycol, sorbitol and mixtures thereof. The packages may contain a solid laundry cleaning composition or part of the components and/or a liquid cleaning composition or part of the components separated by a water-soluble film. The chamber for liquid components may differ in composition from chambers containing solids (US2009/0011970 A1).

Растворимая в воде пленка. Композиции по настоящему изобретению также могут быть инкапсулированы внутри растворимой в воде пленки. Предпочтительными материалами пленок предпочтительно являются полимерные материалы. Материал пленки можно получить, например, путем отливки, формовки выдуванием, экструзии или экструзии с раздувом полимерного материала, как известно из уровня техники. Предпочтительные полимеры, coполимеры или их производные, подходящие для применения в качестве материала пакета, выбраны из поливиниловых спиртов, поливинилпирролидона, полиалкиленоксидов, акриламида, акриловой кислоты, целлюлозы, эфиров целлюлозы, сложных эфиров целлюлозы, амидов целлюлозы, поливинилацетатов, поликарбоновых кислот и солей, полиаминокислот или пептидов, полиамидов, полиакриламида, coполимеров малеиновой и акриловой кислот, полисахаридов, в том числе крахмала и желатина, натуральных камедей, таких как ксантановая и каррагинановая. Более предпочтительные полимеры выбраны из полиакрилатов и растворимых в воде coполимеров акрилатов, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы натрия, декстрина, этилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, мальтодекстрина, полиметакрилатов и наиболее предпочтительно выбраны из поливиниловых спиртов, coполимеров поливиниловых спиртов и гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC) и их комбинаций. Предпочтительно количество полимера в материале пакета, например полимера PVA, составляет по меньшей мере 60 вес. %. Полимер может иметь любой средневесовой молекулярный вес, предпочтительно от приблизительно 1000 до 1000000, от приблизительно 10000 до 300000, от приблизительно 20000 до 150000. Смеси полимеров также можно применять в качестве материала пакета.Water soluble film. The compositions of the present invention may also be encapsulated within a water-soluble film. The preferred film materials are preferably polymeric materials. The film material can be obtained, for example, by casting, blow molding, extrusion or blown extrusion of a polymeric material, as is known in the art. Preferred polymers, copolymers or derivatives thereof suitable for use as a bag material are selected from polyvinyl alcohols, polyvinylpyrrolidone, polyalkylene oxides, acrylamide, acrylic acid, cellulose, cellulose ethers, cellulose esters, cellulose amides, polyvinyl acetates, polycarboxylic acids and salts, polyamino acids or peptides, polyamides, polyacrylamide, copolymers of maleic and acrylic acids, polysaccharides, including starch and gelatin, natural gums such as xanthan and carrageenan. More preferred polymers are selected from polyacrylates and water-soluble copolymers of acrylates, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, dextrin, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, maltodextrin, polymethacrylates, and most preferably selected from polyvinyl alcohols, polyvinyl alcohol-hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) copolymers, and combinations thereof. Preferably, the amount of polymer in the bag material, such as PVA polymer, is at least 60 wt. %. The polymer may have any weight average molecular weight, preferably from about 1,000 to 1,000,000, from about 10,000 to 300,000, from about 20,000 to 150,000. Blends of polymers can also be used as a pouch material.

Естественно, можно использовать различный материал пленки и/или пленки различной толщины при изготовлении камер по настоящему изобретению. Преимуществом при выборе разных пленок является то, что полученные в результате камеры могут проявлять разные характеристики растворимости или высвобождения.Naturally, different film materials and/or different film thicknesses can be used in the manufacture of the chambers of the present invention. An advantage in choosing different films is that the resulting chambers may exhibit different solubility or release characteristics.

Предпочтительными материалами пленки являются пленки PVA, известные под торговыми названиями MonoSol M8630, M8900, H8779, и описанные в US6166117 и US6787512, и пленки PVA с соответствующими характеристиками растворимости и способности к деформации.Preferred film materials are PVA films known under the trade names MonoSol M8630, M8900, H8779 and described in US6166117 and US6787512, and PVA films with appropriate solubility and deformability characteristics.

Материал пленки согласно данному документу также может содержать один или несколько дополнительных ингредиентов. Например, преимущественным может быть добавление пластификаторов, например, глицерина, этиленгликоля, диэтиленгликоля, пропиленгликоля, сорбита и их смесей. Другие добавки включают функциональные моющие добавки для доставки в воду для стирки, например, органические полимерные диспергирующие средства и т. д.The film material according to this document may also contain one or more additional ingredients. For example, it may be advantageous to add plasticizers such as glycerol, ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, sorbitol, and mixtures thereof. Other additives include functional detergent additives for delivery to the wash water, such as organic polymeric dispersants, etc.

Способы получения композицийMethods for preparing compositions

Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в любой подходящей форме и получены с помощью любого способа, выбранного специалистом, занимающимся составлением композиции, неограничивающие примеры которых описаны в примерах настоящей заявки и в US4990280; US20030087791A1; US20030087790A1; US20050003983A1; US20040048764A1; US4762636; US6291412; US20050227891A1; EP1070115A2; US5879584; US5691297; US5574005; US5569645; US5565422; US5516448; US5489392; US5486303, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Композиции по настоящему изобретению или полученные в соответствии с настоящим изобретением включают композицию для очищения и/или обработки, в том числе, но без ограничения, композиции для обработки тканей, твердых поверхностей и любых других поверхностей в области ухода за тканью и домом, в том числе области улучшения качества воздуха, включая освежители воздуха и системы ароматизации, средства ухода за машиной, средства для мытья посуды, средства для кондиционирования ткани (в том числе мягчения и/или освежения), моющее средство для стирки, добавку и/или средство ухода для стирки и полоскания, средство для очищения и/или обработки твердых поверхностей, в том числе средства для очищения пола и унитаза, средства для мытья в форме гранул или порошка для широкого применения или "для тяжелой работы", в особенности очищающие моющие средства; средства для мытья в форме жидкости, геля или пасты для широкого применения, в особенности типы жидкостей для так называемой тяжелой работы; жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды, предназначенные для легкой работы, в особенности средства сильнопенящегося типа; средства для машинного мытья посуды, в том числе различные таблетированные, гранулированные, жидкие и ополаскивающие типы для бытового и промышленного применения: шампуни для машин или ковров, средства для очищения ванной комнаты, в том числе средства для очищения унитаза; а также вспомогательные очищающие средства, такие как отбеливающие добавки и "средства для удаления пятен в форме стика", или типы для предварительной обработки, нанесенные на основу композиции, такие как салфетки для добавления в сушильную установку. Предпочтительными являются композиции и способы для очищения и/или обработки текстильных изделий и/или твердых поверхностей, наиболее предпочтительно текстильных изделий. Композиции предпочтительно представляют собой композиции, применяемые на стадии предварительной обработки или основной стадии стирки способа стирки, наиболее предпочтительно для применения на стадии стирки текстильного изделия.The compositions of the present invention may be formulated in any suitable form and obtained by any method chosen by the person skilled in the formulation of the composition, non-limiting examples of which are described in the examples of this application and in US4990280; US20030087791A1; US20030087790A1; US20050003983A1; US20040048764A1; US4762636; US6291412; US20050227891A1; EP1070115A2; US5879584; US5691297; US5574005; US5569645; US5565422; US5516448; US5489392; US5486303, all of which are incorporated herein by reference. Compositions of the present invention or prepared in accordance with the present invention include a composition for cleaning and/or treating, including, but not limited to, compositions for treating fabrics, hard surfaces and any other surfaces in the field of textile and home care, including areas of air quality improvement, including air fresheners and fragrance systems, car care products, dishwashing detergents, fabric conditioning agents (including softeners and/or fresheners), laundry detergent, additive and/or laundry care agent and rinses, hard surface cleaners and/or treatments, including floor and toilet cleaners, general purpose or "heavy duty" granule or powder detergents, especially cleaning detergents; detergents in the form of a liquid, gel or paste for general use, especially types of liquids for so-called hard work; liquid detergents for delicate fabrics; manual dishwashing detergents or dishwashing detergents intended for light work, especially those of the high-foaming type; machine dishwashing products, including various tablet, granular, liquid and rinse types for domestic and industrial use: car or carpet shampoos, bathroom cleaners, including toilet bowl cleaners; as well as cleaning auxiliaries such as bleach additives and "stick stain removers" or pre-treatment types applied to the base of the composition, such as wipes to be added to the dryer. Preferred are compositions and methods for cleaning and/or treating textiles and/or hard surfaces, most preferably textiles. The compositions are preferably those used in the pretreatment or main washing step of the washing process, most preferably for use in the washing step of the textile.

Применяемое в данном документе выражение "композиция для очищения и/или обработки ткани и/или твердых поверхностей" представляет собой подмножество композиций для очищения и обработки, которое включает, если не указано иное, средства для мытья в форме гранул или порошка для широкого применения или "для тяжелой работы", в особенности очищающие моющие средства; средства для мытья в форме жидкости, геля или пасты для широкого применения, в особенности типы жидкостей для так называемой тяжелой работы; жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручного мытья посуды или средства для мытья посуды, предназначенные для легкой работы, в особенности средства сильнопенящегося типа; средства для машинного мытья посуды, в том числе различные таблетированные, гранулированные, жидкие и ополаскивающие типы для бытового и промышленного применения; жидкие средства для очищения и дезинфекции, шампуни для машин или ковров, средства для очищения ванной комнаты, в том числе средства для чистки унитазов; композиции для кондиционирования тканей, в том числе мягчения и/или освежения, которые могут быть в форме жидкости, твердого вещества и/или салфетки с пропиткой мягчителем-антистатиком; а также вспомогательные очищающие средства, такие как добавки для осветления и "средства для удаления пятен в форме стика", или типы для предварительной обработки, нанесенные на основу композиции, такие как салфетки для добавления в сушильную установку. Все такие композиции, которые являются применимыми, могут находиться в стандартной, концентрированной или даже высококонцентрированной форме даже до такой степени, что такие композиции в определенном аспекте могут быть безводными.As used herein, the term "composition for cleaning and/or treating fabric and/or hard surfaces" is a subset of compositions for cleaning and treating, which includes, unless otherwise indicated, detergents in the form of granules or powder for general use or " for hard work", especially cleaning detergents; detergents in the form of a liquid, gel or paste for general use, especially types of liquids for so-called hard work; liquid detergents for delicate fabrics; manual dishwashing detergents or dishwashing detergents intended for light work, especially those of the high-foaming type; means for machine washing of dishes, including various tablet, granular, liquid and rinsing types for domestic and industrial use; liquid cleaners and disinfectants, car or carpet shampoos, bathroom cleaners, including toilet bowl cleaners; compositions for conditioning fabrics, including softening and/or refreshing, which may be in the form of a liquid, solid and/or wipe impregnated with an antistatic softener; as well as cleaning aids such as lightening additives and "stick stain removers" or pre-treatment types applied to the base of the composition such as wipes to be added to the dryer. All such compositions that are applicable may be in standard, concentrated, or even highly concentrated form, even to the extent that such compositions may in some aspect be anhydrous.

Способ примененияMode of application

Настоящее изобретение включает способ очищения какой-либо поверхности, в том числе обработки текстильного изделия или твердой поверхности или других поверхностей в области тканей и/или ухода за домом. Предполагается, что описанное очищение может происходить как в малом масштабе, как например, в частном домашнем хозяйстве, так и в крупном масштабе, как например, в промышленных и специализированных условиях. В одном аспекте настоящего изобретения способ включает стадию приведения в контакт поверхности, подлежащей обработке, на стадии предварительной обработки или основной стадии стирки способа стирки, наиболее предпочтительно для применения на стадии стирки текстильного изделия или альтернативно для применения в мытье посуды, включая как ручное, так и автоматизированное/механическое мытье посуды. В одном варианте осуществления настоящего изобретения вариант липазы и другие компоненты добавляют последовательно при осуществлении способа для очищения и/или обработки поверхности. В качестве альтернативы вариант липазы и другие компоненты добавляют одновременно.The present invention includes a method of cleaning any surface, including the treatment of a textile or hard surface or other surfaces in the field of fabrics and/or home care. It is contemplated that the described purification may take place both on a small scale, such as in the private household, and on a large scale, such as in industrial and specialized settings. In one aspect of the present invention, the method includes the step of bringing into contact the surface to be treated in a pre-treatment or main washing step of the washing process, most preferably for use in a textile washing step or alternatively for use in dishwashing, including both hand and automated/mechanical dishwashing. In one embodiment of the present invention, the lipase variant and other components are added sequentially during the process for cleaning and/or surface treatment. Alternatively, the lipase variant and the other components are added simultaneously.

Как применяется в данном документе, стирка включает без ограничения чистку и механическое перемешивание. Стирку можно проводить с пенной композицией, как описано в WO08/101958, и/или путем периодического применения давления (давление/вакуум) в качестве дополнения или в качестве альтернативы для чистки и механического перемешивания. Высушивание таких поверхностей или тканей можно проводить с помощью каких-либо обычных средств, применяемых либо в бытовых, либо промышленных условиях. Очищающие композиции по настоящему изобретению идеально подходят для применения в способах применения для стирки белья, а также мытья посуды. Соответственно, настоящее изобретение включает способ очищения объекта, в том числе без ограничения ткани, столовых приборов, ножевых изделий и кухонной посуды. Способ включает стадии приведения объекта, подлежащего очищению, в контакт с указанной очищающей композицией, содержащей по меньшей мере один вариант осуществления очищающей композиции по настоящей заявке, очищающую добавку или их смесь. Ткань может включать большинство любых тканей, поддающихся стирке, в нормальных условиях применения потребителем или в промышленности. Раствор может иметь pH от 8 до 10,5. Композиции можно использовать с концентрациями в растворе от 500 до 15000 ppm. Температуры воды, как правило, находятся в диапазоне от 5ºC до 90ºC. Соотношение воды и ткани, как правило, составляет от 1:1 до 30:1.As used herein, washing includes, but is not limited to, brushing and mechanical agitation. Laundry can be carried out with a foam composition as described in WO08/101958 and/or by intermittent application of pressure (pressure/vacuum) as a supplement or alternative to cleaning and mechanical agitation. Drying of such surfaces or fabrics can be carried out by any of the usual means used either in domestic or industrial environments. The cleaning compositions of the present invention are ideally suited for use in laundry and dishwashing applications. Accordingly, the present invention includes a method for cleaning an object, including, but not limited to, cloth, cutlery, cutlery, and kitchen utensils. The method includes the steps of bringing the object to be cleaned into contact with said cleansing composition comprising at least one embodiment of the cleansing composition of the present application, a cleaning additive, or a mixture thereof. The fabric may include most any fabrics that can be washed under normal consumer or industrial use. The solution may have a pH of 8 to 10.5. The compositions can be used in solution concentrations from 500 to 15,000 ppm. Water temperatures typically range from 5ºC to 90ºC. The water to fabric ratio is typically between 1:1 and 30:1.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу применения полипептида, по меньшей мере на 60% идентичного SEQ ID NO: 2, для получения композиции. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции для очищения объекта.In one aspect, the present invention relates to a method of using a polypeptide at least 60% identical to SEQ ID NO: 2, to obtain a composition. In one aspect, the present invention relates to the use of the composition for cleaning an object.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, включающему добавление полипептида, по меньшей мере на 60% идентичного SEQ ID NO: 2, и поверхностно-активного вещества. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу очищения поверхности, включающему приведение жирного пятна, присутствующего на поверхности, подлежащей очищению, в контакт с очищающей композицией. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу гидролиза жира, присутствующего в загрязнении и/или пятне на поверхности, включающему приведение загрязнения и/или пятна в контакт с очищающей композицией. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции в гидролизе сложного эфира карбоновой кислоты. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции в гидролизе, синтезе или переэтерификации сложного эфира. В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции для получения стабильного состава.In one aspect, the present invention relates to a method for preparing a composition comprising adding a polypeptide at least 60% identical to SEQ ID NO: 2 and a surfactant. In one aspect, the present invention relates to a method for cleaning a surface, comprising bringing a greasy stain present on a surface to be cleaned into contact with a cleaning composition. In one aspect, the present invention relates to a method for hydrolyzing fat present in a soil and/or stain on a surface, comprising contacting the soil and/or stain with a cleaning composition. In one aspect, the present invention relates to the use of the composition in the hydrolysis of a carboxylic acid ester. In one aspect, the present invention relates to the use of the composition in the hydrolysis, synthesis or interesterification of an ester. In one aspect, the present invention relates to the use of the composition to obtain a stable composition.

РастенияPlants

Настоящее изобретение также относится к растениям, например, трансгенному растению, части растения или клетке растения, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению с тем, чтобы вырабатывать и продуцировать вариант в извлекаемых количествах. Вариант можно извлечь из растения или части растения. В качестве альтернативы растение или часть растения, содержащие вариант, можно применять как таковые для улучшения качества пищи или корма, например, для улучшения пищевой ценности, вкусовой привлекательности и реологических свойств или для разрушения антипитательного фактора.The present invention also relates to plants, for example, a transgenic plant, plant part or plant cell, containing a polynucleotide of the present invention so as to produce and produce a variant in recoverable amounts. The variant can be extracted from a plant or part of a plant. Alternatively, the plant or plant part containing the variant can be used as such to improve the quality of the food or feed, for example to improve nutritional value, palatability and rheology, or to destroy an anti-nutritional factor.

Трансгенное растение может иметь две семядоли (двудольное) или одну семядолю (однодольное). Примерами однодольных растений являются злаковые растения, такие как мятлик (мятлик луговой, Poa), кормовая трава, такая как Festuca, Lolium, трава умеренной климатической зоны, такая как Agrostis, и зерновые растения, например, пшеница, разновидности овса, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза).A transgenic plant may have two cotyledons (dicot) or one cotyledon (monocot). Examples of monocotyledonous plants are cereal plants such as bluegrass (poa praine, Poa), forage grass such as Festuca, Lolium, temperate grass such as Agrostis, and cereal plants such as wheat, oat varieties, rye, barley, rice, sorghum and maize (corn).

Примерами двудольных растений являются табак, бобовые, такие как разновидности люпина, картофель, сахарная свекла, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейство Brassicaceae), такие как цветная капуста, рапс и близкородственный модельный организм Arabidopsis thaliana.Examples of dicotyledonous plants are tobacco, legumes such as lupine varieties, potatoes, sugar beets, peas, beans and soybeans, and cruciferous plants (Brassicaceae family) such as cauliflower, rapeseed and the closely related model organism Arabidopsis thaliana.

Примерами частей растения являются стебель, каллюс, листья, корень, плоды, семена и клубни, а также отдельные ткани, составляющие эти части, например, эпидермис, мезофилл, паренхима, сосудистые ткани, меристемы. Конкретные компартменты растительной клетки, такие как хлоропласты, апопласты, митохондрии, вакуоли, пероксисомы и цитоплазма, также рассматриваются как части растения. Более того, любая растительная клетка вне зависимости от тканевого происхождения рассматривается как часть растения. Подобным образом, части растения, такие как конкретные ткани и клетки, выделенные для облегчения осуществления настоящего изобретения, также считают частями растения, например, зародыши, эндоспермы, алейрон и семенные оболочки.Examples of plant parts are stem, callus, leaves, root, fruits, seeds and tubers, as well as individual tissues that make up these parts, such as epidermis, mesophyll, parenchyma, vascular tissues, meristems. Particular plant cell compartments such as chloroplasts, apoplasts, mitochondria, vacuoles, peroxisomes, and cytoplasm are also considered to be plant parts. Moreover, any plant cell, regardless of tissue origin, is considered as part of a plant. Similarly, plant parts, such as specific tissues and cells isolated to facilitate the practice of the present invention, are also considered plant parts, such as embryos, endosperms, aleurone, and seed coats.

В объем настоящего изобретения также включено потомство таких растений, частей растений и растительных клеток.Also included within the scope of the present invention are the progeny of such plants, plant parts and plant cells.

Трансгенное растение или клетка растения, экспрессирующие вариант, могут быть сконструированы в соответствии со способами, известными из уровня техники. Вкратце, растение или клетку растения конструируют путем включения одной или нескольких конструкций экспрессии, кодирующих вариант, в геном растения-хозяина или геном хлоропласта и размножения полученного в результате модифицированного растения или клетки растения с получением трансгенного растения или клетки растения.A transgenic plant or plant cell expressing the variant can be constructed according to methods known in the art. Briefly, a plant or plant cell is constructed by inserting one or more expression constructs encoding the variant into the host plant genome or chloroplast genome and propagating the resulting modified plant or plant cell to produce a transgenic plant or plant cell.

Конструкция экспрессии представляет собой подходящую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид, кодирующий вариант, функционально связанный с соответствующими регуляторными последовательностями, необходимыми для экспрессии полинуклеотида в выбранном растении или выбранной части растения. Более того, конструкция экспрессии может содержать селектируемый маркер, пригодный для идентификации клеток растений, в которые была интегрирована конструкция экспрессии и последовательности ДНК, необходимые для введения конструкции в указанное растение (последнее зависит от применяемого способа введения ДНК).An expression construct is a suitable nucleic acid construct that contains a polynucleotide encoding a variant operably linked to the appropriate regulatory sequences necessary for the expression of the polynucleotide in the selected plant or selected plant part. Moreover, the expression construct may contain a selectable marker useful for identifying plant cells into which the expression construct has been integrated and the DNA sequences necessary to introduce the construct into said plant (the latter depending on the DNA introduction method used).

Выбор регуляторных последовательностей, таких как промоторные и терминаторные последовательности и необязательно последовательности сигнального или транзитного пептидов, определяется, например, на основании того, когда, где и как желательна экспрессия варианта. Например, экспрессия гена, кодирующего вариант, может быть конститутивной, или индуцибельной, или может быть связанной с развитием, специфической к стадии или ткани, и продукт гена может быть нацелен на конкретную ткань или часть растения, как например, семена или листья. Регуляторные последовательности описаны, например, в Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.The choice of regulatory sequences, such as promoter and terminator sequences, and optionally signal or transit peptide sequences, is determined, for example, based on when, where, and how expression of the variant is desired. For example, expression of a gene encoding a variant may be constitutive or inducible, or may be developmental, stage or tissue specific, and the gene product may be targeted to a particular tissue or plant part, such as seeds or leaves. Regulatory sequences are described, for example, in Tague et al., 1988, Plant Physiology 86:506.

Для конститутивной экспрессии можно применять промотор 35S-CaMV, убиквитина 1 маиса или актина 1 риса (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensenet al., 1992,Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Специфические в отношении органа промоторы могут представлять собой, например, промотор из запасающих поглощающих тканей, таких как семена, клубни картофеля и плоды (Edwards and Coruzzi, 1990,Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), или из метаболических поглощающих тканей, таких как меристемы (Itoet al., 1994,Plant Mol. Biol. 24: 863-878), семяспецифический промотор, такой как промотор гена глутелина, проламина, глобулина или альбумина из риса (Wuet al., 1998,Plant Cell Physiol. 39: 885-889), промоторVicia faba из гена легумина B4 и гена неизвестного белка семени изVicia faba (Conradet al., 1998,J. Plant Physiol. 152: 708-711), промотор из белка масляных телец семени (Chenet al., 1998,Plant Cell Physiol. 39: 935-941), промотор гена запасного белка napA из Brassica napus или любой другой семяспецифический промотор, известный из уровня техники, например, как описано в WO 91/14772. Кроме того, промотор может представлять собой специфический в отношении листьев промотор, такой как промоторrbcs из риса или томата (Kyozukaet al., 1993,Plant Physiol. 102: 991-1000), промотор гена аденинметилтрансферазы вируса хлореллы (Mitra and Higgins, 1994,Plant Mol. Biol. 26: 85-93), промотор генаaldP из риса (Kagayaet al., 1995,Mol. Gen. Genet. 248: 668-674) или промотор, индуцируемый повреждением, такой как промоторpin2 картофеля (Xuet al., 1993,Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Подобным образом, промотор может индуцироваться абиотическими воздействиями, такими как температура, засуха или изменения солености, или индуцироваться экзогенно вносимыми веществами, которые активируют промотор, например, этанолом, эстрогенами, гормонами растений, такими как этилен, абсцизовая кислота и гиббереллиновая кислота, и тяжелыми металлами.For constitutive expression, the 35S-CaMV, maize ubiquitin 1, or rice actin 1 promoter can be used (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensenet al. , 1992,Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Organ-specific promoters can be, for example, a promoter from storage scavenging tissues such as seeds, potato tubers and fruits (Edwards and Coruzzi, 1990,Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), or from metabolic scavenging tissues. , such as meristems (Itoet al. , 1994,Plant Mol. Biol. 24: 863-878), a seed-specific promoter such as the glutelin, prolamin, globulin, or albumin gene promoter from rice (Wuet al. , 1998,Plant Cell Physiol. 39: 885-889),Vicia faba promoter from legumin B4 gene and unknown seed protein gene fromVicia faba (Conradet al. , 1998,J. Plant Physiol. 152: 708-711), promoter from seed oil body protein (Chenet al. , 1998,Plant Cell Physiol. 39: 935-941), the napA storage protein gene promoter from Brassica napus, or any other seed-specific promoter known in the art, for example as described in WO 91/14772. In addition, the promoter may be a leaf-specific promoter such as therbcs promoter from rice or tomato (Kyozukaet al. ,Plant Mol. Biol. 26: 85-93), thealdP gene promoter from rice (Kagayaet al. , 1995,Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), or a damage inducible promoter such as the potatopin2 promoter ( Xuet al. , 1993,Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Similarly, the promoter can be induced by abiotic influences such as temperature, drought, or changes in salinity, or induced by exogenously applied substances that activate the promoter, such as ethanol, estrogens, plant hormones such as ethylene, abscisic acid, and gibberellic acid, and heavy metals. .

Промоторный энхансерный элемент также можно применять для достижения более высоких уровней экспрессии варианта в растении. Например, промоторный энхансерный элемент может представлять собой интрон, который расположен между промотором и полинуклеотидом, кодирующим вариант. Например, Xu et al., 1993, выше, раскрывают применение первого интрона гена актина 1 риса для усиления экспрессии.A promoter enhancer element can also be used to achieve higher expression levels of a variant in a plant. For example, the promoter enhancer element may be an intron that is located between the promoter and the polynucleotide encoding the variant. For example, Xu et al., 1993, supra, disclose the use of the first intron of the rice actin 1 gene to enhance expression.

Селектируемый маркерный ген и любые другие части конструкции экспрессии могут быть выбраны из таковых, доступных в данной области.The selectable marker gene and any other parts of the expression construct may be selected from those available in the art.

Конструкцию нуклеиновой кислоты включают в геном растения в соответствии с общепринятыми методиками, известными из уровня техники, в том числе опосредованной Agrobacterium трансформацией, опосредованной вирусом трансформацией, микроинъекцией, бомбардировкой частицами, биолистической трансформацией и электропорацией (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).The nucleic acid construct is incorporated into the plant genome according to conventional techniques known in the art, including Agrobacterium-mediated transformation, virus-mediated transformation, microinjection, particle bombardment, biolistic transformation, and electroporation (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293 ; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

ОпосредованныйAgrobacterium tumefaciens перенос генов представляет собой способ создания трансгенных двудольных растений (для обзора см. Hooykas and Schilperoort, 1992,Plant Mol. Biol. 19: 15-38) и для трансформации однодольных растений, хотя другие способы трансформации можно применять для этих растений. Способ создания трансгенных однодольных растений представляет собой бомбардировку частицами (микроскопическими частицами золота или вольфрама, покрытыми трансформирующей ДНК) эмбриональных каллюсов или развивающихся эмбрионов (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994,Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Альтернативный способ трансформации однодольных растений основан на трансформации протопластов, как описано Omirullehet al., 1993,Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Дополнительные способы трансформации включают описанные в патентах США №№ 6395966 и 7151204 (оба из которых включены в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте).Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer is a method for generating transgenic dicot plants (for a review, see Hooykas and Schilperoort, 1992,Plant Mol. Biol. 19:15-38) and for transforming monocot plants, although other transformation methods can be used for these plants. A method for creating transgenic monocot plants is particle bombardment (microscopic particles of gold or tungsten coated with transforming DNA) of embryonic calluses or developing embryos (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994,Curr. Opin. Biotechnol. 5 : 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). An alternative method for transforming monocot plants is based on protoplast transformation, as described by Omirullehet al. , 1993,Plant Mol. Biol. 21:415-428. Additional transformation methods include those described in US Pat. Nos. 6,395,966 and 7,151,204 (both of which are incorporated herein by reference in their entirety).

После трансформации трансформанты со встроенной конструкцией экспрессии отбирают и регенерируют с получением целых растений в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Часто процедуру трансформации разрабатывают для селективного удаления генов, по которым ведется отбор, либо во время регенерации, либо в следующих поколениях путем применения, например, котрансформации двумя отдельными конструкциями T-ДНК или сайт-специфического вырезания гена, по которому ведется отбор, специфической рекомбиназой.After transformation, transformants with an inserted expression construct are selected and regenerated to produce whole plants according to methods well known in the art. Often, the transformation procedure is designed to selectively remove the genes for which selection is made, either during regeneration or in subsequent generations, by using, for example, co-transformation with two separate T-DNA constructs or site-specific excision of the gene for which selection is made with a specific recombinase.

Помимо непосредственной трансформации генотипа конкретного растения конструкцией по настоящему изобретению, трансгенные растения можно получить путем скрещивания растения, содержащего конструкцию, со вторым растением, у которого конструкция отсутствует. Например, конструкцию, кодирующую вариант, можно ввести в конкретный сорт растений путем скрещивания без необходимости когда-либо непосредственно трансформировать растение указанного сорта. Таким образом, настоящее изобретение охватывает не только растение, непосредственно регенерированное из клеток, которые были трансформированы в соответствии с настоящим изобретением, но также потомство таких растений. Как применяется в данном документе, потомство может относиться к потомкам любого поколения от родительского растения, полученного в соответствии с настоящим изобретением. Такое потомство может включать конструкцию ДНК, полученную в соответствии с настоящим изобретением. Скрещивание приводит в результате к введению трансгена в линию растений путем перекрестного опыления исходной линии с донорной линией растений. Неограничивающие примеры таких стадий описаны в US7151204.In addition to directly transforming the genotype of a particular plant with a construct of the present invention, transgenic plants can be obtained by crossing a plant containing the construct with a second plant lacking the construct. For example, a construct encoding a variant can be introduced into a particular plant cultivar by crossing without ever having to directly transform the plant of said cultivar. Thus, the present invention covers not only a plant directly regenerated from cells that have been transformed in accordance with the present invention, but also the progeny of such plants. As used herein, progeny may refer to the descendants of any generation from a parent plant produced in accordance with the present invention. Such progeny may include a DNA construct obtained in accordance with the present invention. Crossing results in the introduction of the transgene into the plant line by cross-pollinating the parent line with the donor plant line. Non-limiting examples of such steps are described in US7151204.

Растения можно получать посредством способа превращения путем возвратного скрещивания. Например, растения включают растения, называемые превращенным путем возвратного скрещивания генотипом, линией, инбредным растением или гибридом.Plants can be obtained by the method of transformation by backcrossing. For example, plants include plants referred to as a backcrossed genotype, line, inbred plant, or hybrid.

Генетические маркеры могут применяться для того, чтобы способствовать интрогрессии одного или нескольких трансгенов по настоящему изобретению из одного генетического окружения в другое. Отбор с помощью маркеров предоставляет преимущества по сравнению с традиционной селекцией в том, что его можно применять для того, чтобы избежать ошибок, вызванных фенотипической изменчивостью. Кроме того, генетические маркеры могут обеспечить данные, относящиеся к относительной степени содержания элитной зародышевой плазмы в отдельном потомке конкретного скрещивания. Например, если растение с желаемым признаком, которое в остальном не имеет агрономически желаемого генетического окружения, скрещивают с элитным родителем, генетические маркеры можно применять для отбора потомства, которое не только обладает представляющим интерес признаком, но также имеет сравнительно высокую долю желаемой зародышевой плазмы. Таким образом, количество поколений, необходимое для интрогрессии одного или нескольких признаков в конкретное генетическое окружение, сведено к минимуму.Genetic markers can be used to promote the introgression of one or more transgenes of the present invention from one genetic environment to another. Marker-assisted selection offers advantages over traditional selection in that it can be used to avoid errors due to phenotypic variation. In addition, genetic markers can provide data relating to the relative degree of elite germplasm in an individual progeny of a particular cross. For example, if a plant with a desired trait that does not otherwise have an agronomically desirable genetic environment is crossed to an elite parent, genetic markers can be used to select for offspring that not only possess the trait of interest, but also have a relatively high proportion of the desired germplasm. Thus, the number of generations required for the introgression of one or more traits into a particular genetic environment is minimized.

Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта по настоящему изобретению, включающим: (a) культивирование трансгенного растения или клетки растения, содержащих полинуклеотид, кодирующий вариант в условиях, благоприятных для получения варианта; и (b) извлечение варианта.The present invention also relates to methods for producing a variant of the present invention, including: (a) culturing a transgenic plant or plant cell containing a polynucleotide encoding the variant under conditions favorable for obtaining the variant; and (b) extracting the variant.

КОМПОЗИЦИЯ В ВИДЕ МИКРОКАПСУЛ, СОДЕРЖАЩАЯ ВАРИАНТ ЛИПАЗЫ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮCOMPOSITION IN THE FORM OF MICROCAPSULES CONTAINING A LIPASE VARIANT OF THE PRESENT INVENTION

В данном аспекте настоящее изобретение относится к композициям в виде микрокапсул, где мембрана микрокапсулы получена путем сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 1 кДа, при этом микрокапсула содержит вариант липазы по настоящему изобретению.In this aspect, the present invention relates to compositions in the form of microcapsules, where the membrane of the microcapsule is obtained by cross-linking a polybranched polyamine with a molecular weight of more than 1 kDa, while the microcapsule contains a lipase variant of the present invention.

Мембрана образована путем сшивания полиразветвленного полиамина, способного к отделению фермента от (анионных) поверхностно-активных веществ в моющем средстве, которые, как известно, оказывают пагубный эффект на стабильность ферментов.The membrane is formed by crosslinking a polybranched polyamine capable of separating the enzyme from the (anionic) surfactants in the detergent, which are known to have a detrimental effect on enzyme stability.

Критически важным параметром при применении инкапсулированных ферментов в моющих средствах является способность высвобождать фермент непосредственно после разбавления моющего средства в воде, как, например, при применении при стирке белья или мытье посуды. Микрокапсулы по настоящему изобретению обладают превосходными свойствами в этом отношении и способны высвобождать весь инкапсулированный фермент в течение минуты.A critical parameter in the use of encapsulated enzymes in detergents is the ability to release the enzyme immediately upon dilution of the detergent in water, such as in laundry or dishwashing applications. The microcapsules of the present invention are excellent in this respect and are able to release the entire encapsulated enzyme within a minute.

Микрокапсулы не требуют присутствия полимера ядра, способного высвобождать фермент после разбавления в воде. Кроме того, настоящее изобретение не требует, чтобы фермент(-ы) были в осажденной форме в ядре микрокапсулы, с целью контроля преждевременного высвобождения, как описано в WO 97/24177.The microcapsules do not require the presence of a core polymer capable of releasing the enzyme upon dilution in water. In addition, the present invention does not require that the enzyme(s) be in precipitated form in the microcapsule core in order to control premature release as described in WO 97/24177.

При инкапсулировании варианта липазы по настоящему изобретению и, необязательно, других ферментов в микрокапсуле с полупроницаемой мембраной, и при наличии более высокой водной активности внутри данных капсул (перед добавлением в жидкое моющее средство), чем в жидком моющем средстве, капсулы будут подвергаться (частично) разрушению при добавлении в моющее средство (вода вытекает наружу), при этом более концентрированный и более вязкий фермент остается внутри капсул. Разрушение мембраны также может приводить к уменьшенной проницаемости. Это также может быть дополнительно использовано путем добавления стабилизаторов/полимеров, в частности таких, которые не проникают через мембрану. Разрушение и полученное в результате повышение вязкости будет уменьшать/препятствовать диффузии неблагоприятных компонентов (например, поверхностно-активных веществ или секвестрантов) в капсулы и, таким образом, повышать стабильность при хранении фермента в жидком моющем средстве. Компоненты в жидком моющем средстве, которые чувствительны к действию фермента (например, компоненты, которые выступают в качестве субстрата для фермента), также защищены от распада, вызванного ферментом. Во время стирки жидкое моющее средство разводят водой, повышая таким образом водную активность. После этого вода диффундирует внутрь капсул (осмос). Капсулы будут набухать и мембрана будет либо становится проницаемой для фермента, так что он будет выходить из капсул, либо просто прорываться и таким способом высвобождать фермент. Концепция является очень эффективной для стабилизации ферментов относительно неблагоприятных компонентов в жидком моющем средстве и, наоборот, также защищает чувствительные к действию фермента компоненты в жидком моющем средстве от воздействия ферментов.By encapsulating the lipase variant of the present invention and optionally other enzymes in a microcapsule with a semi-permeable membrane, and having higher water activity within these capsules (prior to addition to liquid detergent) than in liquid detergent, the capsules will be subjected to (partially) break down when added to the detergent (water flows out), while the more concentrated and more viscous enzyme remains inside the capsules. Destruction of the membrane can also lead to reduced permeability. This can also be further exploited by the addition of stabilizers/polymers, in particular those which do not permeate the membrane. Breakdown and the resulting increase in viscosity will reduce/prevent the diffusion of unfavorable components (eg surfactants or sequestrants) into the capsules and thus increase the storage stability of the enzyme in the detergent liquid. Components in liquid detergent that are sensitive to the action of an enzyme (eg, components that act as a substrate for the enzyme) are also protected from degradation caused by the enzyme. During washing, the liquid detergent is diluted with water, thus increasing the water activity. The water then diffuses into the capsules (osmosis). The capsules will swell and the membrane will either become permeable to the enzyme so that it will come out of the capsules or simply break through and release the enzyme in this way. The concept is very effective in stabilizing enzymes against unfavorable components in liquid detergent and, conversely, also protects enzyme-sensitive components in liquid detergent from attack by enzymes.

Примеры моющих компонентов, которые чувствительны к действию ферментов и могут распадаться под их действием, включают (используемый фермент в скобках): ксантановую камедь (ксантаназа), полимеры со сложноэфирными связями (липаза), гидрогенизированное касторовое масло (липаза), отдушку (липаза), поверхностно-активные вещества на основе сульфонатов сложных метиловых эфиров (липаза), целлюлозу и производные целлюлозы (например, CMC) (целлюлаза), а также декстрин и циклодекстрин (амилаза).Examples of detergent components that are sensitive to and degraded by enzymes include (enzyme used in brackets): xanthan gum (xanthanase), ester polymers (lipase), hydrogenated castor oil (lipase), perfume (lipase), surfactants based on methyl ester sulfonates (lipase), cellulose and cellulose derivatives (eg CMC) (cellulase), as well as dextrin and cyclodextrin (amylase).

Кроме того, чувствительные моющие ингредиенты могут быть инкапсулированы и, таким образом, стабилизированы, в микрокапсулах по настоящему изобретению. Чувствительные моющие ингредиенты при хранении склонны к распаду. Такие моющие ингредиенты включают соединения для отбеливания, активаторы отбеливания, отдушки, полимеры, моющие компоненты, поверхностно-активные вещества и т. д.In addition, sensitive detergent ingredients can be encapsulated and thus stabilized in the microcapsules of the present invention. Sensitive detergent ingredients tend to degrade during storage. Such detergent ingredients include bleach compounds, bleach activators, perfumes, polymers, builders, surfactants, etc.

Как правило, микрокапсулы по настоящему изобретению можно использовать для разделения несовместимых компонентов/соединений в моющих средствах.Generally, the microcapsules of the present invention can be used to separate incompatible components/compounds in detergents.

Добавление микрокапсул в моющие средства можно применять для воздействия на внешний вид моющего продукта, такой как эффект непрозрачности (небольшие микрокапсулы) или эффект отчетливо видимых частиц (крупные микрокапсулы). Микрокапсулы также могут быть окрашены.The addition of microcapsules to detergents can be used to influence the appearance of the detergent product, such as an opaque effect (small microcapsules) or a clearly visible particle effect (large microcapsules). The microcapsules can also be colored.

Микрокапсулы можно применять для уменьшения уровней ферментной пыли в течение обработки и переработки ферментных продуктов.The microcapsules can be used to reduce enzyme dust levels during processing and processing of enzyme products.

Если не указано иное, все процентные содержания приведены в виде процента по весу (% вес/вес) по всей данной заявке.Unless otherwise indicated, all percentages are given as percent by weight (% w/w) throughout this application.

Микрокапсулаmicrocapsule

Микрокапсулы обычно получают путем образования капель воды в сплошной среде, которая является несмешиваемой с водой - т. е., обычно, путем получения эмульсии вода-в-масле и последующего образования мембраны путем межфазной полимеризации посредством добавления сшивающего средства. После окончательного отверждения капсулы можно собирать и далее прополаскивать и составлять с помощью способов, известных из уровня техники. Затем состав в виде капсул добавляют в моющее средство.Microcapsules are typically prepared by forming water droplets in a continuum that is immiscible with water—i.e., typically by making a water-in-oil emulsion and then forming a membrane by interfacial polymerization by adding a crosslinker. Once fully cured, the capsules can be collected and further rinsed and formulated using methods known in the art. The capsule formulation is then added to the detergent.

Нагрузка, основные составляющие мембраны и потенциальный дополнительный компонент, которые подлежат инкапсулированию, обнаружены в водной фазе. В сплошной среде обнаружены компоненты, которые стабилизируют капли воды с целью коалесценции (эмульгаторы, стабилизаторы эмульсий, поверхностно-активные вещества и т. д.), и через сплошную среду добавляют также сшивающее средство.The load, the main constituents of the membrane and a potential additional component to be encapsulated are found in the aqueous phase. Components are found in the continuum that stabilize water droplets for the purpose of coalescence (emulsifiers, emulsion stabilizers, surfactants, etc.), and a crosslinking agent is also added through the continuum.

Эмульсию можно получать с помощью любых способов, известных из уровня техники, например, с помощью механического перемешивания, способов стекания каплями, эмульгирования мембраны, микроструйной методики, обработки ультразвуком и т. д. В некоторых случаях простое смешивание фаз будет в результате автоматически обеспечивать эмульсию, что часто называется самоэмульгированием. Применение способов, обеспечивающих получение в результате узкого распределения размеров частиц, является преимуществом.The emulsion can be produced by any of the methods known in the art, such as mechanical agitation, dripping methods, membrane emulsification, microfluidic techniques, sonication, etc. In some cases, simply mixing the phases will automatically result in an emulsion, which is often referred to as self-emulsification. The use of methods that result in a narrow particle size distribution is an advantage.

Затем сшивающее(-ие) средство(-а) обычно добавляют в эмульсию либо непосредственно, либо, более часто, путем получения раствора сшивающего средства в растворителе, который растворим в непрерывной фазе. Эмульсию и сшивающее средство или его раствор можно смешивать с помощью обычных способов, применяемых в данной области техники, например, с помощью простого смешивания или с помощью тщательного контроля потоков эмульсии и раствора сшивающего средства через встроенный смеситель.The crosslinker(s) is then usually added to the emulsion either directly or, more often, by preparing a solution of the crosslinker in a solvent which is soluble in the continuous phase. The emulsion and the crosslinker or solution thereof can be mixed by conventional methods used in the art, for example by simple mixing or by carefully controlling the flow of the emulsion and the crosslinker solution through an inline mixer.

В некоторых случаях отверждение капсул необходимо для завершения образования мембраны. Отверждение зачастую представляет собой простое перемешивание капсул в течение некоторого времени для обеспечения завершения реакции межфазной полимеризации. В других случаях образование мембраны можно остановить путем добавления гасителя реакции.In some cases, curing of the capsules is necessary to complete the formation of the membrane. Curing is often simply agitation of the capsules for some time to ensure completion of the interfacial polymerization reaction. In other cases, membrane formation can be stopped by adding a reaction quencher.

Впоследствии капсулы могут быть модифицированы, например, путем осуществления реакции компонентов на мембране для препятствования или устранения слипания частиц в моющем средстве, как описано в WO 99/01534.Subsequently, the capsules can be modified, for example by reacting the components on the membrane to prevent or eliminate particle aggregation in the detergent, as described in WO 99/01534.

Полученные капсулы могут быть выделены или концентрированы с помощью способов, известных из уровня техники, например, с помощью фильтрации, центрифугирования, дистилляции или сцеживание дисперсии капсул.The resulting capsules can be isolated or concentrated using methods known in the art, for example by filtering, centrifuging, distilling or decanting the capsule dispersion.

Полученные в результате капсулы могут быть дополнительно составлены, например, с помощью добавления поверхностно-активных веществ с получением продукта с необходимыми свойствами для хранения, транспортировки и последующей обработки и добавления в моющее средство. Другие средства для состава в виде микрокапсул включают средства, модифицирующие реологические свойства, биоциды (например, Proxel), кислоту/основание для регулирования pH (которые также будут регулировать внутреннее пространство микрокапсул) и воду для регулирования водной активности.The resulting capsules can be further formulated, for example, by adding surfactants to obtain a product with the necessary properties for storage, transport and subsequent processing and addition to the detergent. Other microcapsule formulation agents include rheology modifying agents, biocides (eg Proxel), acid/base to adjust pH (which will also control the interior of the microcapsules) and water to control water activity.

Способ образования капсул может включать следующие стадии:The method for forming capsules may include the following steps:

- получение исходной воды и масляной фазы(фаз),- obtaining initial water and oil phase(s),

- образование эмульсии по типу вода-в-масле,- formation of a water-in-oil emulsion,

- образование мембраны путем межфазной полимеризации,- formation of a membrane by interfacial polymerization,

- необязательная пост-модификация,- optional post-modification,

- необязательное выделение и/или составление,- optional selection and/or compilation,

- добавление в моющее средство.- adding to detergent.

Способ может быть либо периодическим способом, либо непрерывным или полунепрерывным способом.The process may be either a batch process or a continuous or semi-continuous process.

Микрокапсула по настоящему изобретению представляет собой небольшую водную сферу с однородной мембраной вокруг нее. Материал внутри микрокапсулы называют ядром, внутренней фазой или наполнением, тогда как мембрану иногда называют оболочкой, покрытием или стенкой. Микрокапсулы по настоящему изобретению имеют значения диаметра от 0,5 мкм до 2 миллиметров. Предпочтительно средний диаметр микрокапсул находится в диапазоне от 1 мкм до 1000 мкм, более предпочтительно в диапазоне от 5 мкм до 500 мкм, еще более предпочтительно в диапазоне от 10 мкм до 500 мкм, еще более предпочтительно в диапазоне от 50 мкм до 500 мкм и наиболее предпочтительно в диапазоне от 50 мкм до 200 мкм. В качестве альтернативы, диаметр микрокапсул находится в диапазоне от 0,5 мкм до 30 мкм или в диапазоне от 1 мкм до 25 мкм. Диаметр микрокапсулы измеряют в масляной фазе после завершения полимеризации. Диаметр капсулы может изменяться в зависимости от водной активности окружающей химической среды.The microcapsule of the present invention is a small water sphere with a uniform membrane around it. The material inside the microcapsule is referred to as the core, internal phase, or fill, while the membrane is sometimes referred to as the shell, coating, or wall. The microcapsules of the present invention have diameters from 0.5 µm to 2 millimeters. Preferably, the average microcapsule diameter is in the range of 1 µm to 1000 µm, more preferably in the range of 5 µm to 500 µm, even more preferably in the range of 10 µm to 500 µm, even more preferably in the range of 50 µm to 500 µm, and most preferably in the range from 50 µm to 200 µm. Alternatively, the diameter of the microcapsules is in the range of 0.5 µm to 30 µm, or in the range of 1 µm to 25 µm. The microcapsule diameter is measured in the oil phase after completion of the polymerization. The diameter of the capsule may vary depending on the water activity of the surrounding chemical environment.

Микроинкапсулирование ферментов, применяемое в настоящем изобретении, можно осуществлять с помощью межфазной полимеризации, где два реагента в реакции полимеризации контактируют на межфазной границе и быстро реагируют. Основой данного способа является реакция полиамина с производным кислоты, обычно с галогенангидридом, которое выступает в качестве сшивающего средства. Полиамин предпочтительно в значительной степени растворим в воде (если находится в форме свободного основания). В соответствующих условиях на межфазной границе быстро образуются тонкие гибкие мембраны. Одним способом осуществления полимеризации является применение водного раствора фермента и полиамина, которые эмульгируются неводным растворителем (и эмульгатором), и добавление раствора, содержащего производное кислоты. Щелочное средство может присутствовать в растворе фермента для нейтрализации кислоты, образованной в ходе реакции. Полимерные (полиамидные) мембраны мгновенно образуются на межфазной границе капель эмульсии. Полимерная мембрана микрокапсулы обычно имеет катионную природу и, таким образом, связывается/образует комплекс с соединениями анионной природы.Microencapsulation of enzymes used in the present invention can be carried out using interfacial polymerization, where the two reactants in the polymerization reaction are in contact at the interface and react rapidly. The basis of this method is the reaction of a polyamine with an acid derivative, usually an acid halide, which acts as a crosslinking agent. The polyamine is preferably substantially soluble in water (when in free base form). Under appropriate conditions, thin flexible membranes rapidly form at the interface. One way to carry out the polymerization is to use an aqueous solution of an enzyme and a polyamine that are emulsified with a non-aqueous solvent (and an emulsifier) and add the solution containing the acid derivative. An alkaline agent may be present in the enzyme solution to neutralize the acid formed during the reaction. Polymeric (polyamide) membranes are instantly formed at the interfacial boundary of emulsion droplets. The polymeric membrane of the microcapsule is typically cationic in nature and thus binds/complexes with anionic compounds.

Диаметр микрокапсул определяют по размеру капель эмульсии, который контролируют, например, с помощью скорости перемешивания.The diameter of the microcapsules is determined by the size of the droplets of the emulsion, which is controlled, for example, by the stirring speed.

ЭмульсияEmulsion

Эмульсия представляет собой временную или постоянную дисперсию одной жидкой фазы во второй жидкой фазе. Вторую жидкость обычно называют непрерывной фазой. Поверхностно-активные вещества обычно применяют для облегчения образования и стабилизации эмульсий. Не все поверхностно-активные вещества в равной степени способны стабилизировать эмульсию. Тип и количество поверхностно-активного вещества необходимо выбирать в отношении оптимального применения эмульсии, в частности относительно получения и физической стабильности эмульсии и стабильности при разбавлении и дальнейшей переработке. Физическая стабильность относится к поддержанию эмульсией формы дисперсии. Процессы, такие как коалесценция, агрегация, поглощение стенками контейнера, осаждение и образование отстоя, представляют собой формы физической нестабильности, и их следует избегать. Примеры подходящих поверхностно-активных веществ описаны в WO 97/24177, стр. 19-21 и в WO 99/01534.An emulsion is a temporary or permanent dispersion of one liquid phase in a second liquid phase. The second liquid is usually referred to as the continuous phase. Surfactants are commonly used to facilitate the formation and stabilization of emulsions. Not all surfactants are equally capable of stabilizing an emulsion. The type and amount of surfactant must be selected in relation to the optimal application of the emulsion, in particular regarding the preparation and physical stability of the emulsion and stability during dilution and further processing. Physical stability refers to the maintenance of an emulsion in the form of a dispersion. Processes such as coalescence, aggregation, absorption by container walls, settling and sedimentation are forms of physical instability and should be avoided. Examples of suitable surfactants are described in WO 97/24177, pages 19-21 and WO 99/01534.

Эмульсии могут быть дополнительно классифицированы либо как простые эмульсии, в которых диспергированная жидкая фаза представляет собой простую гомогенную жидкость, либо как более сложная эмульсия, в которой диспергированная жидкая фаза представляет собой гетерогенную комбинацию жидких или твердых фаз, как, например, двойная эмульсия или множественная эмульсия. Например, могут быть образованы двойная эмульсия по типу вода-в-масле или многофазная эмульсия, где водная фаза сама по себе дополнительно содержит эмульгированную масляную фазу; данный тип эмульсии может быть определен как эмульсия по типу масло-в-воде-в-масле (o/w/o). В качестве альтернативы, может быть образована эмульсия по типу вода-в-масле, где водная фаза содержит диспергированную твердую фазу, которую часто называют суспензия-эмульсия. Могут быть описаны другие, более сложные эмульсии. Вследствие характерной сложности описания таких систем, термин эмульсия применяют для описания как простых, так и более сложных эмульсий без необходимого ограничения формы эмульсии или типа и числа присутствующих фаз.Emulsions can be further classified either as simple emulsions, in which the dispersed liquid phase is a simple homogeneous liquid, or as a more complex emulsion, in which the dispersed liquid phase is a heterogeneous combination of liquid or solid phases, such as double emulsion or multiple emulsion. . For example, a water-in-oil double emulsion or a multi-phase emulsion can be formed, wherein the aqueous phase itself further comprises an emulsified oil phase; this type of emulsion can be defined as an oil-in-water-in-oil (o/w/o) emulsion. Alternatively, a water-in-oil emulsion may be formed wherein the aqueous phase contains a dispersed solid phase, often referred to as a slurry-emulsion. Other, more complex emulsions may be described. Because of the inherent complexity of describing such systems, the term emulsion is used to describe both simple and more complex emulsions without necessarily limiting the form of the emulsion or the type and number of phases present.

ПолиаминPolyamine

Жесткость/гибкость и проницаемость мембраны в основном зависит от выбора полиамина. Полиамин по настоящему изобретению представляет собой полиразветвленный полиамин. Каждая ветвь, предпочтительно заканчивающаяся первичной аминогруппой, выступает в качестве точки связывания в сетке мембраны, обеспечивая таким образом благоприятные свойства настоящего изобретения. Полиразветвленный полиамин в соответствии с настоящим изобретением представляет собой полиамин, имеющий более двух точек разветвления и более двух реакционноспособных аминогрупп (способных вступать в реакцию со связывающим средством, т. е. первичные и вторичные аминогруппы). Полиразветвленный полиамин применяют в качестве исходного материала, если получают эмульсию - ее не образовывают in situ из других исходных материалов. Для получения приемлемых свойств настоящего изобретения полиразветвленная структура полиамина должна присутствовать в качестве исходного материала.The stiffness/flexibility and permeability of the membrane mainly depends on the choice of polyamine. The polyamine of the present invention is a polybranched polyamine. Each branch, preferably terminating in a primary amino group, acts as a binding point in the membrane network, thus providing the beneficial properties of the present invention. A polybranched polyamine according to the present invention is a polyamine having more than two branch points and more than two reactive amino groups (capable of reacting with the binder, i.e., primary and secondary amino groups). A polybranched polyamine is used as a starting material if an emulsion is obtained - it is not formed in situ from other starting materials. In order to obtain acceptable properties of the present invention, a polybranched polyamine structure must be present as a starting material.

Существует тесная связь между числом точек разветвления и числом первичных аминов, поскольку первичные амины всегда будут располагаться на конце ветви: линейный амин может предусматривать только два первичных амина. Для каждой точки разветвления, гипотетически введенной в такой линейный диамин, будет обеспечиваться один или несколько первичных аминов для введения в конец введенной ветви(-ей). В данном контексте первичную аминогруппу понимают как часть ветви, т. е. конечную точку ветви. Например, авторы настоящего изобретения рассматривают трис(2-аминоэтил)амин и 1,2,3-пропантриамин как молекулы с одной точкой разветвления. Для настоящего изобретения полиамин имеет по меньшей мере четыре первичных амина. Точки разветвления могут быть введены из цепи алифатического углеводорода, как в ранее приведенных примерах, или из ненасыщенных углеродных связей, как, например, в 3,3'-диаминобензидине, или из третичных аминогрупп, как в N, N,N',N'-тетракис-(2-аминоэтил)этилендиамине.There is a close relationship between the number of branching points and the number of primary amines, since the primary amines will always be located at the end of the branch: a linear amine can only have two primary amines. For each branch point hypothesized to be introduced into such a linear diamine, one or more primary amines will be provided to be introduced at the end of the introduced branch(s). In this context, the primary amino group is understood as part of the branch, ie the end point of the branch. For example, the authors of the present invention consider tris(2-aminoethyl)amine and 1,2,3-propanetriamine as molecules with a single branch point. For the present invention, the polyamine has at least four primary amines. Branching points can be introduced from the aliphatic hydrocarbon chain, as in the previous examples, or from unsaturated carbon bonds, as, for example, in 3,3'-diaminobenzidine, or from tertiary amino groups, as in N, N, N', N' -tetrakis-(2-aminoethyl)ethylenediamine.

Помимо числа точек разветвления было обнаружено, что компактность реакционноспособных аминогрупп имеет большое значение. Вещество, такое как, например, N, N,N',N'-тетракис-(12-аминододецил)этилендиамин, не является подходящим. Также для образования мембраны не является подходящим пептид или белок, такой как фермент. Таким образом, полиразветвленный полиамин не является пептидом или белком.In addition to the number of branching points, it has been found that the compactness of the reactive amino groups is of great importance. A substance such as, for example, N,N,N',N'-tetrakis-(12-aminododecyl)ethylenediamine is not suitable. Also, a peptide or protein such as an enzyme is not suitable for membrane formation. Thus, a polybranched polyamine is not a peptide or a protein.

В одном варианте осуществления реакционноспособные аминогруппы составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса полиразветвленного полиамина, как, например, более 20% или более 25%. Предпочтительно молекулярный вес полиразветвленного полиамина составляет по меньшей мере 1 кДа; более предпочтительно молекулярный вес полиразветвленного полиамина составляет по меньшей мере 1,3 кДа.In one embodiment, the reactive amino groups comprise at least 15% of the molecular weight of the polybranched polyamine, such as greater than 20% or greater than 25%. Preferably the molecular weight of the polybranched polyamine is at least 1 kDa; more preferably, the molecular weight of the polybranched polyamine is at least 1.3 kDa.

В предпочтительном варианте осуществления полиразветвленный полиамин представляет собой полиэтиленимин (PEI) и его модификации, имеющие более двух точек разветвления и более двух реакционноспособных аминогрупп; где реакционноспособные аминогруппы составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса PEI, как, например, более 20% или более 25%. Предпочтительно молекулярный вес PEI составляет по меньшей мере 1 кДа.In a preferred embodiment, the polybranched polyamine is polyethyleneimine (PEI) and modifications thereof having more than two branch points and more than two reactive amino groups; where reactive amino groups constitute at least 15% of the molecular weight of PEI, such as more than 20% or more than 25%. Preferably the molecular weight of PEI is at least 1 kDa.

Комбинации различных полиразветвленных полиаминов можно применять для получения микрокапсулы по настоящему изобретению.Combinations of various polybranched polyamines can be used to prepare the microcapsule of the present invention.

Полезные свойства (например, стабильность фермента при хранении, уменьшение вытекания фермента, уменьшение притока моющих ингредиентов) микрокапсулы по настоящему изобретению могут быть улучшены посредством добавления одного или нескольких низкомолекулярных аминов с молекулярным весом менее 1 кДа. Низкомолекулярный амин предпочтительно в значительной степени растворим в воде (если находится в форме свободного основания) и может представлять собой материал, такой как этилендиамин, гексаметилендиамин, гександиамин, диэтилентетрамин, этилентетрамин, диаминобензол, пиперазин, тетраметиленпентамин или, предпочтительно, диэтилентриамин (DETA). Низкомолекулярные амины можно добавлять в количестве до 50%, предпочтительно до 40%, до 30%, до 20%, до 10% или до 5% по весу общего содержания низкомолекулярного амина и полиразветвленного полиамина при получении микрокапсулы по настоящему изобретению.The beneficial properties (eg, enzyme storage stability, reduced enzyme leakage, reduced buildup of detergent ingredients) of the microcapsules of the present invention can be improved by adding one or more low molecular weight amines with a molecular weight of less than 1 kDa. The low molecular weight amine is preferably substantially soluble in water (if in free base form) and may be a material such as ethylenediamine, hexamethylenediamine, hexanediamine, diethylenetetramine, ethylenetetramine, diaminobenzene, piperazine, tetramethylenepentamine, or preferably diethylenetriamine (DETA). Low molecular weight amines can be added in an amount of up to 50%, preferably up to 40%, up to 30%, up to 20%, up to 10% or up to 5% by weight of the total content of low molecular weight amine and polybranched polyamine when obtaining a microcapsule of the present invention.

Сшивающее средствоcrosslinker

Сшивающее средство, применяемое в настоящем изобретении, представляет собой молекулу, имеющую по меньшей мере две группы/два сайта, способные вступать в реакцию с аминами с образованием ковалентных связей.The crosslinker used in the present invention is a molecule having at least two groups/two sites capable of reacting with amines to form covalent bonds.

Сшивающее средство предпочтительно является растворимым в масле и может находиться в форме ангидрида кислоты или галогенангидрида, предпочтительно хлорангидрида. Например, он может представлять собой адипоил хлорид, себакоил хлорид, хлорид додекандиовой кислоты, фталоил хлорид, терфталоил хлорид, изофталоил хлорид или тримесоил хлорид; но предпочтительно, сшивающее средство представляет собой терфталоил хлорид или тримесоил хлорид.The crosslinking agent is preferably oil soluble and may be in the form of an acid anhydride or an acid halide, preferably an acid chloride. For example, it may be adipoyl chloride, sebacoyl chloride, dodecanedioic acid chloride, phthaloyl chloride, terphthaloyl chloride, isophthaloyl chloride, or trimesoyl chloride; but preferably, the crosslinking agent is terphthaloyl chloride or trimesoyl chloride.

Фермент(-ы)Enzyme(s)

В одном варианте осуществления композиция или композиция в виде микрокапсул по настоящему изобретению может дополнительно содержать фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, амилазы, липазы, целлюлазы, маннаназы, пектиназы, ДНКазы, лакказы, пероксидазы, галогенпероксидазы, пергидролазы и их комбинации.In one embodiment, the microcapsule composition or composition of the present invention may further comprise an enzyme selected from the group consisting of protease, amylase, lipase, cellulase, mannanase, pectinase, DNase, laccase, peroxidase, halogen peroxidase, perhydrolase, and combinations thereof.

Фермент(-ы) в композиции или инкапсулированные в микрокапсулу по настоящему изобретению могут включать один или несколько ферментов, подходящих для включения в средства для стирки или мытья посуды (ферменты моющих средств), такие как протеаза (например, субтилизин или металлопротеаза), липаза, кутиназа, амилаза, карбогидраза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, арабиназа, галактаназа, ксантаназа, ксиланаза, ДНКаза, пергидролаза, оксидоредуктаза (например, лакказа, пероксидаза, пероксигеназа и/или галогенпероксидаза). Предпочтительными ферментами моющих средств являются протеаза (например, субтилизин или металлопротеаза), липаза, амилаза, лиаза, целлюлаза, пектиназа, маннаназа, ДНКаза, пергидролаза и оксидоредуктаза (например, лакказа, пероксидаза, пероксигеназа и/или галогенпероксидаза) или их комбинации. Более предпочтительными ферментами моющих средств являются протеаза (например, субтилизин или металлопротеаза), липаза, амилаза, целлюлаза, пектиназа и маннаназа или их комбинации.The enzyme(s) in the compositions or encapsulated in a microcapsule of the present invention may include one or more enzymes suitable for inclusion in laundry or dishwashing detergents (detergent enzymes), such as a protease (for example, subtilisin or metalloprotease), lipase, cutinase, amylase, carbohydrase, cellulase, pectinase, mannanase, arabinase, galactanase, xanthanase, xylanase, DNase, perhydrolase, oxidoreductase (eg laccase, peroxidase, peroxygenase and/or halogen peroxidase). Preferred detergent enzymes are protease (eg subtilisin or metalloprotease), lipase, amylase, lyase, cellulase, pectinase, mannanase, DNase, perhydrolase and oxidoreductase (eg laccase, peroxidase, peroxygenase and/or halogen peroxidase) or combinations thereof. More preferred detergent enzymes are protease (eg subtilisin or metalloprotease), lipase, amylase, cellulase, pectinase and mannanase, or combinations thereof.

Композиция или композиция в виде микрокапсул по настоящему изобретению может содержать более 0,1% (вес/вес) активного белка-фермента, в частности варианта липазы по настоящему изобретению; предпочтительно более 0,25%, более предпочтительно более 0,5%, более предпочтительно более 1%, более предпочтительно более 2,5%, более предпочтительно более 5%, более предпочтительно более 7,5%, более предпочтительно более 10%, более предпочтительно более 12,5%, более предпочтительно более 15%, еще более предпочтительно более 20% и наиболее предпочтительно более 25% (вес/вес) активного белка-фермента.The composition or composition in the form of microcapsules of the present invention may contain more than 0.1% (w/w) of active enzyme protein, in particular a lipase variant of the present invention; preferably more than 0.25%, more preferably more than 0.5%, more preferably more than 1%, more preferably more than 2.5%, more preferably more than 5%, more preferably more than 7.5%, more preferably more than 10%, more preferably more than 12.5%, more preferably more than 15%, even more preferably more than 20% and most preferably more than 25% (w/w) of the active enzyme protein.

Протеазы: протеазы для применения в настоящем изобретении представляют собой сериновые протеазы, такие как субтилизины, металлопротеазы и/или трипсин-подобные протеазы. Предпочтительно протеазы представляют собой субтилизины или металлопротеазы; более предпочтительно протеазы представляют собой субтилизины.Proteases: Proteases for use in the present invention are serine proteases such as subtilisins, metalloproteases and/or trypsin-like proteases. Preferably the proteases are subtilisins or metalloproteases; more preferably the proteases are subtilisins.

Сериновая протеаза представляет собой фермент, который катализирует гидролиз пептидных связей и в котором в активном центре присутствует имеющий существенное значение сериновый остаток (White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272). Субтилизины включают, предпочтительно состоят из, подгруппы I-S1 и I-S2, как определено Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 и Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Исходя из высоко консервативной структуры активного сайта серин-протеаз, субтилизин в соответствии с настоящим изобретением может быть функционально эквивалентным предлагаемой подгруппе, обозначенной субтилазы Siezen et al. (выше).A serine protease is an enzyme that catalyses the hydrolysis of peptide bonds and in which an essential serine residue is present at the active site (White, Handler and Smith, 1973 "Principles of Biochemistry," Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, pp. 271-272). Subtilisins include, preferably consist of, subgroups I-S1 and I-S2, as defined by Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 and Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Based on the highly conserved active site structure of serine proteases, the subtilisin of the present invention may be functionally equivalent to the proposed subgroup designated subtilase by Siezen et al. (above).

Субтилизин может быть животного, растительного или микробного происхождения, включая химически или генетически модифицированных мутантов (варианты, подвергнутые белковой инженерии), предпочтительным является щелочной микробный субтилизин. Примерами субтилизинов являются полученные из Bacillus, например субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин BPN', субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168 (описанный в WO 89/06279) и протеаза PD138 (WO 93/18140). Примеры описаны в WO 98/020115, WO 01/44452, WO 01/58275, WO 01/58276, WO 03/006602 и WO 04/099401. Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеаза Fusarium, описанная в WO 89/06270 и WO 94/25583. Другие примеры являются вариантами, описанными в WO 92/19729, WO 88/08028, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 98/34946, WO 2000/037599, WO 2011/036263, особенно варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, и 274.Subtilisin can be of animal, plant or microbial origin, including chemically or genetically modified mutants (protein engineered variants), alkaline microbial subtilisin is preferred. Examples of subtilisins are those derived from Bacillus, eg Novo subtilisin, Carlsberg subtilisin, BPN' subtilisin, subtilisin 309, subtilisin 147 and subtilisin 168 (described in WO 89/06279) and PD138 protease (WO 93/18140). Examples are described in WO 98/020115, WO 01/44452, WO 01/58275, WO 01/58276, WO 03/006602 and WO 04/099401. Examples of trypsin-like proteases are trypsin (eg of porcine or bovine origin) and the Fusarium protease described in WO 89/06270 and WO 94/25583. Other examples are variants described in WO 92/19729, WO 88/08028, WO 98/20115, WO 98/20116, WO 98/34946, WO 2000/037599, WO 2011/036263, especially variants with substitutions in one or more of the following provisions: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, and 274.

Металлопротеаза может быть животного, растительного или микробного происхождения, включая химически или генетически модифицированных мутантов (варианты, подвергнутые белковой инженерии), предпочтительным является щелочная микробная металлопротеаза. Примеры описаны в WO 2007/044993, WO 2012/110562 и WO 2008/134343.The metalloprotease can be of animal, plant or microbial origin, including chemically or genetically modified mutants (protein engineered variants), alkaline microbial metalloprotease is preferred. Examples are described in WO 2007/044993, WO 2012/110562 and WO 2008/134343.

Примеры коммерчески доступных субтилизинов включают Kannase™, Everlase™, Relase™, Esperase™, Alcalase™, Durazym™, Savinase™, Ovozyme™, Liquanase™, Coronase™, Polarzyme™, Pyrase™, трипсин поджелудочной NOVO (PTN), Bio-Feed™ Pro и Clear-Lens™ Pro; Blaze (все доступны от Novozymes A/S, Багсвард, Дания). Другие коммерчески доступные протеазы включают Neutrase™, Ronozyme™ Pro, Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Opticlean™, Properase™, Purafast™, Purafect™, Purafect Ox™, Purafact Prime™, Excellase™, FN2™, FN3™ и FN4™ (доступны от Novozymes, Genencor International Inc., Gist-Brocades, BASF или DSM). Другими примерами являются Primase™ и Duralase™. Blap R, Blap S и Blap X, доступные от Henkel, также являются примерами.Examples of commercially available subtilisins include Kannase™, Everlase™, Relase™, Esperase™, Alcalase™, Durazym™, Savinase™, Ovozyme™, Liquanase™, Coronase™, Polarzyme™, Pyrase™, NOVO pancreatic trypsin (PTN), Bio- Feed™ Pro and Clear-Lens™ Pro; Blaze (all available from Novozymes A/S, Bagsvard, Denmark). Other commercially available proteases include Neutrase™, Ronozyme™ Pro, Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Opticlean™, Properase™, Purafast™, Purafect™, Purafect Ox™, Purafact Prime™, Excellase™, FN2™, FN3™ and FN4™ (available from Novozymes, Genencor International Inc., Gist-Brocades, BASF, or DSM). Other examples are Primase™ and Duralase™. Blap R, Blap S and Blap X available from Henkel are also examples.

Лиазы. Лиаза может быть пектат-лиазой, полученной изBacillus, в частностиB. licheniformis илиB. agaradhaerens, или вариантом, полученным от любого из этих, например, который описан в US 6124127, WO 99/027083, WO 99/027084, WO 02/006442, WO 02/092741, WO 03/095638, коммерчески доступной пектат-лиазой является XPect; Pectawash и Pectaway (Novozymes A/S).Liase. The lyase may be a pectate lyase derived fromBacillus , in particularB. licheniformis orB. agaradhaerens , or a variant derived from any of these, such as that described in US 6124127, WO 99/027083, WO 99/027084, WO 02 /006442, WO 02/092741, WO 03/095638, the commercially available pectate lyase is XPect; Pectawash and Pectaway (Novozymes A/S).

Маннаназа. Маннаназа может быть щелочной маннаназой из семейства 5 или 26. Она может быть дикого типа из Bacillus или Humicola, в частностиB. agaradhaerens,B. licheniformis,B. halodurans,B. clausii илиH. insolens. Подходящие маннаназы описаны в WO 99/064619. Коммерчески доступной маннаназой является Mannaway (Novozymes A/S).Mannanaz. The mannanase may be an alkaline mannanase from family 5 or 26. It may be wild-type from Bacillus or Humicola, in particularB. agaradhaerens ,B. licheniformis ,B. halodurans ,B. clausii orH. insolens . Suitable mannanases are described in WO 99/064619. A commercially available mannanase is Mannaway (Novozymes A/S).

Целлюлазы: подходящие целлюлазы включают таковые бактериального или грибного происхождения. Включены химически модифицированные или мутанты белковой инженерии. Подходящие целлюлазы включают целлюлазы из родовBacillus,Pseudomonas,Humicola,Fusarium, Thielavia,Acremonium, например грибные целлюлазы, полученные изHumicola insolens,Myceliophthora thermophila иFusarium oxysporum, раскрытые в US 4435307, US 5648263, US 5691178, US 5776757 и WO 89/09259.Cellulases : Suitable cellulases include those of bacterial or fungal origin. Included are chemically modified or protein engineered mutants. Suitable cellulases include those from the generaBacillus ,Pseudomonas ,Humicola ,Fusarium ,Thielavia ,Acremonium , such as fungal cellulases derived fromHumicola insolens ,Myceliophthora thermophila andFusarium oxysporum , as disclosed in US 4435307, US 5648293, US 5691178, US 575 and US 575 09259.

Особенно подходящими целлюлазами являются щелочные или нейтральные целлюлазы, обладающие преимуществами сохранения цвета. Примерами таких целлюлаз являются целлюлазы, описанные в EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Другими примерами являются такие варианты целлюлаз, как описанные в WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 и PCT/DK98/00299.Particularly suitable cellulases are alkaline or neutral cellulases having color retention advantages. Examples of such cellulases are those described in EP 0495257, EP 0531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Other examples are variants of cellulases as described in WO 94/07998, EP 0531315, US 5457046, US 5686593, US 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 and PCT/DK98/00299.

Коммерчески доступные целлюлазы включают Celluzyme™ и Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ и Puradax HA™ (Genencor International Inc.) и KAC-500(B) ™ (Kao Corporation).Commercially available cellulases include Celluzyme™ and Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™ and Puradax HA™ (Genencor International Inc.) and KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

Помимо варианта липазы по настоящему изобретению композиция или композиция в виде микрокапсул может содержать другие липазы.In addition to the lipase variant of the present invention, the composition or microcapsule composition may contain other lipases.

Дргуие липазы и кутиназы. Подходящие липазы и кутиназы включают таковые бактериального или грибного происхождения. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии. Примеры включают липазу изThermomyces, например изT. lanuginosus (ранее называемыйHumicola lanuginosa), описанную в EP 258068 и EP 305216, кутиназу из Humicola, например H. insolens, описанную в WO 96/13580, липазу Pseudomonas, например изP. alcaligenes илиP. pseudoalcaligenes (EP 218272),P. cepacia (EP 331376),P. stutzeri (GB 1372034),P. fluorescens,Pseudomonassp. штамма SD 705 (WO 95/06720 и WO 96/27002),P. wisconsinensis (WO 96/12012), липазу Bacillus, например изB. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) илиB. pumilus (WO 91/16422).Other lipases and cutinases. Suitable lipases and cutinases include those of bacterial or fungal origin. Mutants are contemplated that are chemically modified or protein engineered. Examples include lipase fromThermomyces e.g. fromT. lanuginosus (formerlyHumicola lanuginosa ) described in EP 258068 and EP 305216, cutinase from Humicola e.g. H. insolens described in WO 96/13580, Pseudomonas lipase e.g. fromP. alcaligenes orP. pseudoalcaligenes (EP 218272),P. cepacia (EP 331376),P. stutzeri (GB 1372034),P. fluorescens ,Pseudomonas sp. strain SD 705 (WO 95/06720 and WO 96/27002),P. wisconsinensis (WO 96/12012), Bacillus lipase, for example fromB. subtilis (Dartois et al., 1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253- 360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) orB. pumilus (WO 91/16422).

Другие примеры являются вариантами липаз, таких как описанные в WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/060063, WO 2007/087508 и WO 2009/109500.Other examples are variants of lipases such as those described in WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783 , WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/060063, WO 2007/087508 and WO 2009/109500.

Другие коммерчески доступные ферменты-липазы включают Lipolase™, Lipolase Ultra™ и Lipex™; Lipex Evity 100L, Lecitase™, Lipolex™; Lipoclean™, Lipoprime™ (Novozymes A/S). Другие коммерчески доступные липазы включают Lumafast (Genencor Int Inc); Lipomax (Gist-Brocades/Genencor Int Inc) и липазуBacillus sp. от Solvay.Other commercially available lipase enzymes include Lipolase™, Lipolase Ultra™ and Lipex™; Lipex Evity 100L, Lecitase™, Lipolex™; Lipoclean™, Lipoprime™ (Novozymes A/S). Other commercially available lipases include Lumafast (Genencor Int Inc); Lipomax (Gist-Brocades/Genencor Int Inc) andBacillus sp. lipase. by Solvay.

Амилазы. Подходящие амилазы включают амилазы бактериального или грибного происхождения. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии. Например, амилазы предусматривают альфа-амилазы, полученные изBacillus, например специального штаммаBacillus licheniformis, более подробно описанного в GB 1296839.Amylase. Suitable amylases include those of bacterial or fungal origin. Mutants are contemplated that are chemically modified or protein engineered. For example, amylases include alpha-amylases derived fromBacillus , such as a special strain ofBacillus licheniformis , described in more detail in GB 1296839.

Примеры подходящих амилаз включают амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 из WO 95/10603, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 3. Предпочтительные варианты описаны в WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424 и SEQ ID NO: 4 из WO 99/019467, такие как варианты с заменами в одном или нескольких из следующих положений: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, и 444.Examples of suitable amylases include the amylases having SEQ ID NO: 2 of WO 95/10603 or variants thereof having 90% sequence identity to SEQ ID NO: 3. Preferred variants are described in WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97 /43424 and SEQ ID NO: 4 of WO 99/019467, such as variants with substitutions in one or more of the following positions: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181 , 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, and 444.

Различные подходящие амилазы включают амилазы, имеющие SEQ ID NO: 6 из WO 02/010355, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 и замену в положении 193.Various suitable amylases include those having SEQ ID NO: 6 of WO 02/010355, or variants thereof having 90% sequence identity to SEQ ID NO: 6. Preferred variants of SEQ ID NO: 6 are those having a deletion at positions 181 and 182 and replacement at position 193.

Другие амилазы, которые являются подходящими, представляют собой гибридную альфа-амилазу, содержащую остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенной в SEQ ID NO: 6 из WO 2006/066594, и остатки 36-483 альфа-амилазы B. licheniformis, приведенные в SEQ ID NO: 4 из WO 2006/066594, или варианты, обладающие 90% идентичностью их последовательности. Предпочтительными вариантами данной гибридной альфа-амилазы являются варианты, предусматривающие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 и Q264. Наиболее предпочтительные варианты гибридной альфа-амилазы, содержащие остатки 1-33 альфа-амилазы, полученной из B. amyloliquefaciens, приведенные под SEQ ID NO: 6 из WO 2006/066594, и остатки 36-483 из последовательности с SEQ ID NO: 4 представляют собой варианты, имеющие следующие замены:Other amylases that are suitable are a hybrid alpha-amylase containing residues 1-33 of an alpha-amylase derived from B. amyloliquefaciens given in SEQ ID NO: 6 of WO 2006/066594 and residues 36-483 of an alpha-amylase B. licheniformis listed in SEQ ID NO: 4 of WO 2006/066594 or variants having 90% sequence identity. Preferred variants of this hybrid alpha-amylase are those that include a substitution, deletion, or insertion at one or more of the following positions: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209, and Q264. The most preferred hybrid alpha-amylase variants containing residues 1-33 of B. amyloliquefaciens-derived alpha-amylase listed under SEQ ID NO: 6 of WO 2006/066594 and residues 36-483 of SEQ ID NO: 4 are are variants with the following substitutions:

M197T;M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; илиH156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; or

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S.

Дополнительные амилазы, которые являются подходящими, представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 6 из WO 99/019467, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 6. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 6 являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 и K269. Особенно предпочтительными амилазами являются амилазы, предусматривающие делецию в положениях R181 и G182 или положениях H183 и G184.Additional amylases that are suitable are the amylases having SEQ ID NO: 6 of WO 99/019467, or variants thereof, the sequence of which is 90% identical to SEQ ID NO: 6. Preferred variants of SEQ ID NO: 6 are those having substitution, deletion or insertion at one or more of the following positions: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 and K269. Particularly preferred amylases are those having a deletion at positions R181 and G182 or positions H183 and G184.

Дополнительными амилазами, которые можно применять, являются амилазы, имеющие SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 из WO 96/023873, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, предусматривающие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 и 476. Более предпочтительными вариантами являются варианты, имеющие делецию в положениях 181 и 182 или положениях 183 и 184. Наиболее предпочтительными вариантами амилазы SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 7 являются варианты, имеющие делецию в положениях 183 и 184 и замену в одном или нескольких из положений 140, 195, 206, 243, 260, 304 и 476.Additional amylases that may be used are the amylases having SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 of WO 96/023873, or variants thereof which are 90% sequence identical SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 7 are variants that involve substitution, deletion, or insertion at one or more of the following positions: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304, and 476. More preferred variants are those having a deletion at positions 181 and 182 or positions 183 and 184. The most preferred amylase variants of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 7 are those having a deletion at positions 183 and 184 and a substitution at one or more of the positions 140, 195, 206, 243, 260, 304 and 476.

Другие амилазы, которые можно применять, представляют собой амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 из WO 08/153815, SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2 из WO 08/153815 или на 90% идентична SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 10 из WO 01/66712 являются варианты, предусматривающие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 и 264.Other amylases that can be used are the amylases having SEQ ID NO: 2 of WO 08/153815, SEQ ID NO: 10 of WO 01/66712, or variants thereof whose sequence is 90% identical to SEQ ID NO: 2 of WO 08/153815 or 90% identical to SEQ ID NO: 10 of WO 01/66712. Preferred variants of SEQ ID NO: 10 of WO 01/66712 are those with a substitution, deletion, or insertion at one or more of the following positions: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211, and 264.

Дополнительными подходящими амилазами являются амилазы, имеющие SEQ ID NO: 2 из WO 09/061380, или их варианты, последовательность которых на 90% идентична SEQ ID NO: 2. Предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие усечение C-конца и/или замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 и G475. Более предпочтительными вариантами SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие замену в одном или нескольких из следующих положений: Q87E, R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E, R, N272E, R, S243Q, A,E, D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E и G475K, и/или делецию в положении R180 и/или S181 или T182 и/или G183. Наиболее предпочтительные варианты амилазы c SEQ ID NO: 2 являются варианты, имеющие следующие замены:Additional suitable amylases are those having SEQ ID NO: 2 of WO 09/061380, or variants thereof, the sequence of which is 90% identical to SEQ ID NO: 2. Preferred variants of SEQ ID NO: 2 are those having a C-terminal truncation and /or substitution, deletion or insertion at one or more of the following positions: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305 , R309, D319, Q320, Q359, K444 and G475. More preferred variants of SEQ ID NO: 2 are those having a substitution in one or more of the following positions: Q87E, R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E, R, N272E, R , S243Q, A,E, D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E and G475K, and/or a deletion at position R180 and/or S181 or T182 and/or G183. The most preferred amylase variants of SEQ ID NO: 2 are those having the following substitutions:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; илиS125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; or

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, где варианты усечены по C-концу и необязательно дополнительно предусматривают замену в положении 243 и/или делецию в положении 180 и/или положении 181.S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K, where the variants are C-terminally truncated and optionally further include a substitution at position 243 and/or a deletion at position 180 and/or position 181.

Другие подходящие амилазы представляют собой альфа-амилазу, имеющую SEQ ID NO: 12 в WO01/66712, или вариант, последовательность которого по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 12. Предпочтительными вариантами амилазы являются варианты, имеющие замену, делецию или вставку в одном или нескольких из следующих положений SEQ ID NO: 12 в WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Особенно предпочтительные амилазы включают варианты, предусматривающие делецию в D183 и G184 и имеющие замены R118K, N195F, R320K и R458K, и вариант, дополнительно имеющий замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 и A339, при этом наиболее предпочтительным является вариант, который дополнительно имеет замены во всех этих положениях.Other suitable amylases are alpha-amylase having SEQ ID NO: 12 in WO01/66712, or a variant whose sequence is at least 90% identical to SEQ ID NO: 12. Preferred amylase variants are those having a substitution, deletion, or insertion in one or more of the following provisions of SEQ ID NO: 12 in WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Particularly preferred amylases include variants having a deletion at D183 and G184 and having R118K, N195F, R320K and R458K substitutions, and a variant further having substitutions at one or more positions selected from the group: M9, G149, G182, G186, M202, T257 , Y295, N299, M323, E345, and A339, with the most preferred being the one that additionally has substitutions at all of these positions.

Другими примерами являются варианты амилазы, например, варианты, описанные в WO 2011/098531, WO 2013/001078 и WO 2013/001087.Other examples are amylase variants, such as those described in WO 2011/098531, WO 2013/001078 and WO 2013/001087.

Коммерчески доступными амилазами являются Stainzyme; Stainzyme Plus; Duramyl™, Termamyl™, Termamyl Ultra; Natalase, Fungamyl™ и BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ и PurastarTM/Effectenz™, Powerase и Preferenz S100 (от Genencor International Inc./DuPont).Commercially available amylases are Stainzyme; Stainzyme Plus; Duramyl™, Termamyl™, Termamyl Ultra; Natalase, Fungamyl™ and BAN™ (Novozymes A/S), Rapidase™ and Purastar™/Effectenz™, Powerase and Preferenz S100 (from Genencor International Inc./DuPont).

Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза). Подходящие дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) представляют собой любой фермент, который катализирует гидролитическое расщепление связей сложного фосфодиэфира в каркасе ДНК, разрушая таким образом ДНК. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительной является ДНКаза, получаемая из бактерии; в частности, предпочтительной является ДНКаза, которую можно получать из Bacillus; в частности, предпочтительной является ДНКаза, которую можно получать из Bacillus subtilis или Bacillus licheniformis. Примеры таких ДНКаз описаны в заявке на патент WO 2011/098579 или в PCT/EP2013/075922.Deoxyribonuclease (DNase). Suitable deoxyribonucleases (DNases) are any enzyme that catalyzes the hydrolytic cleavage of phosphodiester bonds in the DNA backbone, thereby degrading the DNA. In accordance with the present invention, a DNase derived from a bacterium is preferred; in particular, DNase is preferred, which can be obtained from Bacillus; in particular, DNase is preferred which can be obtained from Bacillus subtilis or Bacillus licheniformis. Examples of such DNases are described in patent application WO 2011/098579 or PCT/EP2013/075922.

Пергидролазы. Подходящие пергидролазы способны катализировать реакцию пергидролиза, которая приводит к получению перкислоты из субстрата, представляющего собой сложный эфир карбоновой кислоты (ацил), в присутствии источника пероксида (например, пероксида водорода). Хотя множество ферментов осуществляют данную реакцию при низких уровнях, при применении пергидролаз имеет место высокое соотношение пергидролиз:гидролиз, часто более 1. Подходящие пергидролазы могут быть растительного, бактериологического или грибного происхождения. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии.Perhydrolases. Suitable perhydrolases are capable of catalyzing a perhydrolysis reaction that results in the production of a peracid from a carboxylic acid ester (acyl) substrate in the presence of a peroxide source (eg, hydrogen peroxide). Although many enzymes carry out this reaction at low levels, high perhydrolysis:hydrolysis ratios, often greater than 1, occur when perhydrolases are used. Suitable perhydrolases may be of plant, bacteriological or fungal origin. Mutants are contemplated that are chemically modified or protein engineered.

Примеры пригодных пергидролаз включают встречающиеся в природе ферменты, представляющие собой пергидролазу Mycobacterium, или их варианты. Иллюстративный фермент получен из Mycobacterium smegmatis. Этот фермент, его ферментативные свойства, его структура и его варианты описаны в WO 2005/056782, WO 2008/063400, US 2008/145353 иExamples of suitable perhydrolases include naturally occurring Mycobacterium perhydrolase enzymes or variants thereof. An exemplary enzyme is derived from Mycobacterium smegmatis. This enzyme, its enzymatic properties, its structure and its variants are described in WO 2005/056782, WO 2008/063400, US 2008/145353 and

US2007167344.US2007167344.

Оксидазы/пероксидазы. Подходящие оксидазы и пероксидазы (или оксидоредуктазы) включают различные оксидазы сахаров, лакказы, пероксидазы и галогенпероксидазы.Oxidase/peroxidase. Suitable oxidases and peroxidases (or oxidoreductases) include various sugar oxidases, laccases, peroxidases and halogen peroxidases.

Подходящие пероксидазы включают те, которые включены в классификацию ферментов EC 1.11.1.7, как изложено Номенклатурным комитетом Международного союза биохимии и молекулярной биологии (IUBMB), или любой фрагмент, полученный из них, проявляющий пероксидазную активность.Suitable peroxidases include those included in the EC 1.11.1.7 enzyme classification as set out by the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), or any moiety derived from them that exhibits peroxidase activity.

Подходящие пероксидазы включают пероксидазы растительного, бактериологического или грибного происхождения. Предусматриваются мутанты, которые являются химически модифицированными или полученными с помощью белковой инженерии. Примеры пригодных пероксидаз включают пероксидазы изCoprinopsis, например, изC. cinerea (EP 179,486), и их варианты, описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257.Suitable peroxidases include peroxidases of plant, bacteriological or fungal origin. Mutants are contemplated that are chemically modified or protein engineered. Examples of suitable peroxidases include peroxidases fromCoprinopsis , for example fromC. cinerea (EP 179,486), and variants thereof, as described in WO 93/24618, WO 95/10602 and WO 98/15257.

Пероксидаза для применения в настоящем изобретении также включает фермент галогенпероксидазу, например хлорпероксидазу, бромпероксидазу и соединения, проявляющие хлорпероксидазную или бромпероксидазную активность. Галогенпероксидазы классифицируют в соответствии с их специфичностью относительно ионов галогена. Хлорпероксидазы (E.C. 1.11.1.10) катализируют образование гипохлорита из хлорид-ионов.The peroxidase for use in the present invention also includes the enzyme halogen peroxidase, for example chlorperoxidase, bromoperoxidase, and compounds exhibiting chloroperoxidase or bromoperoxidase activity. Halogen peroxidases are classified according to their specificity for halogen ions. Chloroperoxidases (E.C. 1.11.1.10) catalyze the formation of hypochlorite from chloride ions.

В одном варианте осуществления галогенпероксидаза представляет собой хлорпероксидазу. Предпочтительно галогенпероксидаза представляет собой ванадиевую галогенпероксидазу, т.е. содержащую ванадат галогенпероксидазу. В предпочтительном способе по настоящему изобретению содержащая ванадат галогенпероксидаза объединена с источником хлорид-иона.In one embodiment, the halide peroxidase is a chloroperoxidase. Preferably, the halogen peroxidase is a vanadium halogen peroxidase, i. e. containing vanadate halogen peroxidase. In a preferred method of the present invention, a vanadate-containing halide peroxidase is combined with a chloride ion source.

Галогенпероксидазы были выделены из множества различных грибов, в частности, из группы грибов демациевых гифомицетов, таких как Caldariomyces, например, C. fumago, Alternaria, Curvularia, например, C. verruculosa, и C. inaequalis, Drechslera, Ulocladium и Botrytis.Haloperoxidases have been isolated from many different fungi, in particular from the group of filamentous filamentous fungi such as Caldariomyces, eg C. fumago, Alternaria, Curvularia, eg C. verruculosa, and C. inaequalis, Drechslera, Ulocladium and Botrytis.

Галогенпероксидазы также были выделены из бактерий, таких как Pseudomonas, например P. pyrrocinia, иStreptomyces, напримерS. aureofaciens.Halogen peroxidases have also been isolated from bacteria such as Pseudomonas such as P. pyrrocinia andStreptomyces such asS. aureofaciens .

В предпочтительном варианте осуществления галогенпероксидазу можно получать из Curvularia sp., в частностиCurvularia verruculosa илиCurvularia inaequalis, как, например, C. inaequalis CBS 102.42, описанного в WO 95/27046; или C. verruculosa CBS 147.63, или C. verruculosa CBS 444.70, описанных в WO 97/04102; или из Drechslera hartlebii, описанного в WO 01/79459, Dendryphiella salina, описанного в WO 01/79458, Phaeotrichoconis crotalarie, описанного в WO 01/79461, или Geniculosporium sp., описанного в WO 01/79460.In a preferred embodiment, the halogen peroxidase can be obtained from Curvularia sp., in particularCurvularia verruculosa orCurvularia inaequalis , such as C. inaequalis CBS 102.42 described in WO 95/27046; or C. verruculosa CBS 147.63 or C. verruculosa CBS 444.70 described in WO 97/04102; or from Drechslera hartlebii as described in WO 01/79459, Dendryphiella salina as described in WO 01/79458, Phaeotrichoconis crotalarie as described in WO 01/79461 or Geniculosporium sp. as described in WO 01/79460.

Оксидаза по настоящему изобретению включает, в частности, любой фермент лакказу, включенный в классификацию ферментов EC 1.10.3.2, или любой фрагмент, полученный из него, проявляющий лакказную активность, или соединение, проявляющее подобную активность, например, катехолоксидазу (EC 1.10.3.1), o-аминофенолоксидазу (EC 1.10.3.4) или билирубиноксидазу (EC 1.3.3.5).The oxidase of the present invention includes, in particular, any laccase enzyme included in the EC 1.10.3.2 enzyme classification, or any fragment derived from it that exhibits laccase activity, or a compound that exhibits similar activity, for example, catechol oxidase (EC 1.10.3.1) , o-aminophenol oxidase (EC 1.10.3.4) or bilirubin oxidase (EC 1.3.3.5).

Предпочтительные ферменты лакказы представляют собой ферменты микробного происхождения. Ферменты могут быть получены из растений, бактерий или грибов (в том числе мицелиальных грибов и дрожжей).Preferred laccase enzymes are enzymes of microbial origin. Enzymes can be obtained from plants, bacteria or fungi (including filamentous fungi and yeasts).

Подходящие примеры ферментов из грибов включают лакказу, которую можно получить из штаммаAspergillus, Neurospora, например N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, например T. villosa и T. versicolor, Rhizoctonia, например R. solani, Coprinopsis, например C. cinerea, C. comatus, C. friesii и C. plicatilis, Psathyrella, например P. condelleana, Panaeolus, например P. papilionaceus, Myceliophthora, например M. thermophila, Schytalidium, например S. thermophilum, Polyporus, например P. pinsitus, Phlebia, например P. radiata (WO 92/01046), илиCoriolus, например C. hirsutus (JP 2238885).Suitable examples of enzymes from fungi include laccase, which can be obtained from a strain ofAspergillus, Neurospora, e.g. N. crassa, Podospora, Botrytis, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes, e.g. T. villosa and T. versicolor, Rhizoctonia, e.g. R. solani, Coprinopsis, e.g. C. cinerea, C. comatus, C. friesii and C. plicatilis, Psathyrella, e.g. P. condelleana, Panaeolus, e.g. P. papilionaceus, Myceliophthora, e.g. M. thermophila, Schytalidium, e.g. S. thermophilum, Polyporus , such as P. pinsitus, Phlebia, such as P. radiata (WO 92/01046), orCoriolus, such as C. hirsutus (JP 2238885).

Подходящие примеры ферментов из бактерий включают лакказу, которую можно получить из штамма Bacillus.Suitable examples of enzymes from bacteria include laccase, which can be obtained from a strain of Bacillus.

Лакказа, полученная изCoprinopsis илиMyceliophthora, является предпочтительной; в частности, лакказа, полученная изCoprinopsis cinerea, раскрытого в WO 97/08325; или изMyceliophthora thermophila, раскрытого в WO 95/33836.Lakcase derived fromCoprinopsis orMyceliophthora is preferred; in particular laccase derived fromCoprinopsis cinerea disclosed in WO 97/08325; or fromMyceliophthora thermophila disclosed in WO 95/33836.

Примеры других оксидаз включают без ограничения оксидазу аминокислоты, глюкозооксидазу, лактатоксидазу, гaлактозооксидазу, полиолоксидазу (например, WO2008/051491) и альдозоксидазу. Оксидазы и их соответствующие субстраты можно применять в качестве ферментных систем, генерирующих пероксид водорода, и, таким образом, в качестве источника пероксида водорода. Для нескольких ферментов, таких как пероксидазы, галогенпероксидазы и пергидролазы, требуется источник пероксида водорода. При исследовании EC 1.1.3._, EC 1.2.3._, EC 1.4.3._ и EC 1.5.3._ или подобных классов (в соответствии с Международным биохимическим союзом) другие примеры этих комбинаций оксидаз и субстратов легко узнаваемы специалистом в данной области.Examples of other oxidases include, without limitation, amino acid oxidase, glucose oxidase, lactate oxidase, galactose oxidase, polyol oxidase (eg WO2008/051491), and aldose oxidase. Oxidases and their respective substrates can be used as hydrogen peroxide generating enzyme systems and thus as a source of hydrogen peroxide. Several enzymes, such as peroxidases, halogen peroxidases, and perhydrolases, require a source of hydrogen peroxide. When examining EC 1.1.3._, EC 1.2.3._, EC 1.4.3._ and EC 1.5.3._ or similar classes (according to the International Biochemical Union), other examples of these combinations of oxidases and substrates are easily recognized by a specialist in this area.

Стабилизаторы фермента и/или модификаторы реологического свойстваEnzyme Stabilizers and/or Rheology Modifiers

Композиции или микрокапсулы также могут содержать стабилизаторы фермента, известные из уровня техники, например полиолы, полимеры, обратимые ингибиторы фермента, двухвалентные катионы, субстраты фермента, антиоксиданты и т. д. Предпочтительными являются водорастворимые стабилизаторы.The compositions or microcapsules may also contain enzyme stabilizers known in the art, such as polyols, polymers, reversible enzyme inhibitors, divalent cations, enzyme substrates, antioxidants, etc. Water-soluble stabilizers are preferred.

Добавление стабилизаторов с медленным растворением может использоваться для создания локальной среды внутри капсулы, которая является более "дружественной" в отношении инкапсулированного фермента/соединения, таким образом улучшая стабильность во время хранения.The addition of slow dissolving stabilizers can be used to create a local environment within the capsule that is more "friendly" to the encapsulated enzyme/compound, thus improving stability during storage.

Примерами обратимых ингибиторов протеазы являются бороновые кислоты, пептидные альдегиды и их производные и высокомолекулярные ингибиторы белкового типа (такие как ингибиторы BASI/RASI, см. WO 2009/095425). Пример ингибиторов металлопротеазы описан в WO 2008/134343. Ингибиторы протеазы описаны более подробно ниже под заголовком "Ингибиторы протеаз".Examples of reversible protease inhibitors are boronic acids, peptide aldehydes and their derivatives, and high molecular weight protein type inhibitors (such as BASI/RASI inhibitors, see WO 2009/095425). An example of metalloprotease inhibitors is described in WO 2008/134343. Protease inhibitors are described in more detail below under the heading "Protease inhibitors".

Стабилизирующие полимеры могут быть основаны, например, на поливинилпирролидоне, поливинилацетате, поливинилспирте и их сополимерах. Стабилизирующими полиолами могут быть более мелкие молекулы, такие как глицерин, сорбит, пропилен гликоль и т. д., но также более крупные молекулы, такие как полиэтиленгликоль, полисахариды и т. д.The stabilizing polymers may be based, for example, on polyvinylpyrrolidone, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol and their copolymers. Stabilizing polyols can be smaller molecules such as glycerol, sorbitol, propylene glycol, etc., but also larger molecules such as polyethylene glycol, polysaccharides, etc.

Из стабилизирующих двухвалентных катионов Ca2+, Mg2+ и Zn2+ хорошо известны в уровне техники. Таким образом, в одном варианте осуществления композиция по настоящему изобретению содержит источник ионов Ca2+, Mg2+ или Zn2+. Предпочтительно источником ионов Ca2+, Mg2+ или Zn2+ является слаборастворимая (с медленным растворением) соль Ca2+, Mg2+ или Zn2+. Слаборастворимая означает, что растворимость в чистой воде при 20°C составляет менее 5 г/л, 2 г/л, 1 г/л, 0,5 г/л, 0,2 г/л, 0,1 г/л или 0,05 г/л. Предпочтительными солями Ca2+, Mg2+ или Zn2+ являются карбонат кальция, карбонат магния, карбонат цинка, сульфат кальция, сульфит кальция, сульфит магния, сульфит цинка, фосфат кальция, дикальцийфосфат, фосфат магния, фосфат цинка, цитрат кальция, цитрат магния, цитрат цинка, оксалат кальция, оксалат магния, оксалат цинка, тартрат кальция, тартрат магния или тартрат цинка.Of the stabilizing divalent cations, Ca2+, Mg2+ and Zn2+ are well known in the art. Thus, in one embodiment, the composition of the present invention contains a source of Ca2+, Mg2+ or Zn2+ ions. Preferably, the Ca2+, Mg2+ or Zn2+ ion source is a slightly soluble (slow dissolving) salt of Ca2+, Mg2+ or Zn2+. Slightly soluble means that the solubility in pure water at 20°C is less than 5 g/l, 2 g/l, 1 g/l, 0.5 g/l, 0.2 g/l, 0.1 g/l, or 0.05 g/l. Preferred Ca2+, Mg2+ or Zn2+ salts are calcium carbonate, magnesium carbonate, zinc carbonate, calcium sulfate, calcium sulfite, magnesium sulfite, zinc sulfite, calcium phosphate, dicalcium phosphate, magnesium phosphate, zinc phosphate, calcium citrate, magnesium citrate, zinc citrate, oxalate calcium, magnesium oxalate, zinc oxalate, calcium tartrate, magnesium tartrate or zinc tartrate.

Кроме того, кислоты или основания с медленным растворением могут использоваться для создания локального pH внутри микрокапсулы, который является более "дружественным" в отношении инкапсулированного фермента/соединения.In addition, slow dissolving acids or bases can be used to create a local pH within the microcapsule that is more "friendly" to the encapsulated enzyme/compound.

Ферменты в большинстве случаев стабилизируются путем добавления их субстратов (например, белка для протеаз, крахмала для амилаз и т. д.). Антиоксиданты или восстановители могут применяться для уменьшения окисления ферментов, например тиосульфат, аскорбат и т. д. Суммарная необходимая доза таких стабилизаторов на грамм моющего средства значительно ниже по сравнению с добавлением стабилизаторов в непрерывной фазе моющего средства, поскольку они концентрируются во внутренней фазе капсулы и во многих случаях либо не будут диффундировать во время хранения, либо только медленно диффундировать, в зависимости от структуры и молекулярного веса стабилизатора. В частности, применение высокомолекулярных стабилизаторов (например, свыше 1 кДа или свыше 2 кДа, более предпочтительно свыше 5 кДа) даст улучшенную суммарную эффективность. Таким образом, предпочтительными являются высокомолекулярные ингибиторы, полимеры, полиолы, катионы, субстраты ферментов и антиоксиданты.Enzymes are in most cases stabilized by the addition of their substrates (eg protein for proteases, starch for amylases, etc.). Antioxidants or reducing agents can be used to reduce the oxidation of enzymes, such as thiosulfate, ascorbate, etc. The total required dose of such stabilizers per gram of detergent is much lower compared to the addition of stabilizers in the continuous phase of the detergent, since they are concentrated in the internal phase of the capsule and in in many cases will either not diffuse during storage or only slowly diffuse, depending on the structure and molecular weight of the stabilizer. In particular, the use of high molecular weight stabilizers (eg, greater than 1 kDa or greater than 2 kDa, more preferably greater than 5 kDa) will give improved overall performance. Thus, high molecular weight inhibitors, polymers, polyols, cations, enzyme substrates and antioxidants are preferred.

Фермент может быть защищен добавлением белка-"поглотителя". Компоненты, дестабилизирующие фермент путем взаимодействия с аминокислотными группами (например, аминами) белка, таким образом могут вступать в реакцию с добавленным белком-поглотителем или "жертвенным" белком. Предпочтительным является белок-поглотитель с достаточно большим молекулярным весом, чтобы оставаться внутри капсул.The enzyme may be protected by the addition of a "scavenger" protein. Components that destabilize the enzyme by interacting with amino acid groups (eg, amines) of the protein can thus react with the added scavenger or "sacrificial" protein. Preferred is an scavenger protein with a sufficiently large molecular weight to remain within the capsules.

Несколько иным способом улучшения стабильности фермента является добавление компонентов, модифицирующих реологические свойства, которые повышают вязкость внутренней фазы капсулы. Повышенная внутренняя вязкость замедлит диффузию дестабилизаторов ферментов в капсулы (и/или замедлит диффузию стабилизаторов ферментов из капсулы) и, таким образом, продлит срок службы фермента. Примерами таких модификаторов вязкости являются такие полимеры, как полиэтиленгликоль (PEG), полиэтилен оксид (PEO), гидрофильный полиуретан, поливинилпиролидон (PVP) и сополимеры PVP и винилацетата, крахмал, гиалуроновая кислота, такие водорастворимые производные целлюлозы, как карбоксиметилцеллюлоза, водорастворимые смолы, такие как гуммиарабик, камедь бобов рожкового дерева, гуаровая камедь или ксантановая камедь и т. д., и их комбинации или сополимеры. Наиболее предпочтительными являются неионогенные высокомолекулярные полимеры с молекулярным весом свыше 1 кДа или свыше 2 кДа, более предпочтительный свыше 5 кДа. Неионогенные полимеры являются предпочтительными, поскольку они в большинстве случаев являются более совместимыми с реакционно-способным мембранным полимером, чем ионные полимеры.A slightly different way to improve enzyme stability is to add rheological modifiers that increase the viscosity of the internal phase of the capsule. The increased internal viscosity will slow the diffusion of enzyme destabilizers into the capsule (and/or slow the diffusion of enzyme stabilizers out of the capsule) and thus prolong the life of the enzyme. Examples of such viscosity modifiers are polymers such as polyethylene glycol (PEG), polyethylene oxide (PEO), hydrophilic polyurethane, polyvinylpyrrolidone (PVP) and PVP-vinyl acetate copolymers, starch, hyaluronic acid, water-soluble cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose, water-soluble resins such as such as gum arabic, locust bean gum, guar gum or xanthan gum, etc., and combinations or copolymers thereof. Most preferred are non-ionic high molecular weight polymers with a molecular weight of over 1 kDa or over 2 kDa, more preferably over 5 kDa. Nonionic polymers are preferred because they are generally more compatible with the reactive membrane polymer than ionic polymers.

Высокая вязкость может быть достигнута либо путем получения капсул с применением водной фазы с высокой вязкостью, либо - более сложный способ - путем получения капсул, в которых повышение вязкости впервые возникает после получения эмульсии/капсул. Это "инициированное" повышение вязкости является предпочтительным, поскольку получение эмульсий с водной фазой с высокой вязкостью может быть затруднено. Инициированное повышение вязкости может быть проведено in situ при добавлении в моющее средство внутренней фазы капсулы, имеющей более высокую водную активность, чем моющее средство, к которому ее добавляют, таким образом вода будет диффундировать из капсул (но не модификатор реологических свойств), увеличивая вязкость внутренней фазы после добавления в моющее средство. Это также может быть использовано с применением диффузии соли или других низкомолекулярных компонентов, например, путем обеспечения компонента, который будет повышать вязкость, когда концентрация соли снижается при добавлении к моющему средству (например, полимера, который осаждается при исходном высоком содержании соли, но растворим при уменьшении концентрации соли благодаря диффузии соли при добавлении в моющее средство). Другим способом инициирования вязкости является использование компонентов, в которых вязкость зависит от pH. Для некоторых способов межфазной полимеризации (например, реакция амин-кислота-галоген) pH внутренней фазы будет изменяться во время инкапсулирования, в случае амин-кислота-галоген pH будет снижаться во время межфазной полимеризации. Это может использоваться для инициирования повышения вязкости. Множество модификаторов реологических свойств, таких как полиакрилаты, проявляют максимальную вязкость при конкретном pH или диапазоне pH. Carbopol 934 от Lubrizol и Texipol 63-258 от Scott-Bader являются примерами модификаторов реологических свойств, где вязкость значительно увеличивается при снижении pH с 11 до 8 или повышении pH с 4 до 8. Другим типом полимера с различной вязкостью при низком значении pH и высоком значении pH является частично гидролизованный полиакриламид. Еще одной возможностью является применение модификаторов реологических свойств, которые зависимы от температуры, таким образом получая эмульсию/инкапсулирование при одной температуре, а затем изменяя температуру для повышения вязкости. Также может быть использована вязкость, индуцированная светом или ультразвуком. Еще одним способом является применение модификаторов реологических свойств с истончением сдвига, так, что вязкость является низкой при высоком сдвиге, когда образуется эмульсия, и высокой при уменьшении сдвига.High viscosity can be achieved either by making capsules using a high viscosity aqueous phase or, more complexly, by making capsules in which the viscosity increase first occurs after the emulsion/capsules are made. This "triggered" viscosity increase is preferred because the production of high viscosity aqueous phase emulsions can be difficult. Initiated viscosity increase can be carried out in situ by adding to the detergent the internal phase of the capsule, which has a higher water activity than the detergent to which it is added, thus water will diffuse out of the capsules (but not the rheology modifier), increasing the viscosity of the internal phase after adding to the detergent. This can also be used using diffusion of salt or other low molecular weight components, for example by providing a component that will increase viscosity when the salt concentration is reduced when added to a detergent (for example, a polymer that precipitates at an initial high salt content but is soluble at decrease in salt concentration due to diffusion of salt when added to detergent). Another way to induce viscosity is to use components in which the viscosity is dependent on pH. For some interfacial polymerization processes (eg amine-acid-halogen reaction) the pH of the internal phase will change during encapsulation, in the case of amine-acid-halogen the pH will decrease during interfacial polymerization. This can be used to initiate an increase in viscosity. Many rheology modifiers, such as polyacrylates, exhibit maximum viscosity at a particular pH or pH range. Carbopol 934 from Lubrizol and Texipol 63-258 from Scott-Bader are examples of rheology modifiers where the viscosity increases significantly when the pH is lowered from 11 to 8 or the pH is raised from 4 to 8. Another type of polymer with different viscosities at low pH and high pH value is partially hydrolyzed polyacrylamide. Another possibility is to use rheology modifiers that are temperature dependent, thus getting the emulsion/encapsulation at one temperature and then varying the temperature to increase the viscosity. Viscosity induced by light or ultrasound can also be used. Another method is to use shear thinning rheology modifiers such that the viscosity is low at high shear when the emulsion is formed and high at shear reduction.

Другой методикой стабилизации является обеспечение осаждения фермента в капсулы во время хранения, например, путем добавления осаждающего реактива, такого как соль или полиэтиленгликоль (PEG). Такая же "инициированная стабилизация", как описано выше, может использоваться, например, путем добавления PEG, который после добавления в моющее средство концентрируется водой, диффундирующей до степени, при которой фермент осаждается. Таким образом, фермент может находиться в растворе во время обработки капсул, но осаждаться при добавлении в моющее средство.Another stabilization technique is to allow the enzyme to precipitate into capsules during storage, for example by adding a precipitating agent such as salt or polyethylene glycol (PEG). The same "triggered stabilization" as described above can be used, for example, by adding PEG, which, after being added to the detergent, is concentrated with water diffusing to the extent that the enzyme precipitates. Thus, the enzyme may be in solution during the processing of the capsules, but precipitate when added to the detergent.

Ферменты также могут быть использованы в осажденной или кристаллической форме при получении микрокапсул.Enzymes can also be used in precipitated or crystalline form in the preparation of microcapsules.

В специально предусмотренном варианте осуществления композиция в виде микрокапсул по настоящему изобретению представляет собой композицию, описанную в WO 2014/177709 (включен в данный документ посредством ссылки), содержащую вариант липазы по настоящему изобретению.In a specifically contemplated embodiment, the microcapsule composition of the present invention is the composition described in WO 2014/177709 (incorporated herein by reference) containing the lipase variant of the present invention.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям в виде микрокапсул, содержащим вариант липазы по настоящему изобретению, заключенный в камере, образованной мембраной, при этом мембрана получена путем сшивания (a) полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 800 Да и (b) алифатического или ароматического амина с молекулярным весом менее 300 Да; при этом весовое соотношение (a)/(b) находится в диапазоне от 0,1 до 1000.In another embodiment, the present invention relates to microcapsule compositions comprising a lipase variant of the present invention enclosed in a chamber formed by a membrane, wherein the membrane is obtained by cross-linking (a) a polybranched polyamine with a molecular weight greater than 800 Da and (b) an aliphatic or an aromatic amine with a molecular weight of less than 300 Da; while the weight ratio (a)/(b) is in the range from 0.1 to 1000.

Как указано выше, микрокапсулы могут дополнительно содержать фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, металлoпротеазы, субтилизина, амилазы, липазы, кутиназы, целлюлазы, маннаназы, пектиназы, ксантаназы, ДНКазы, лакказы, пероксидазы, галогенпероксидазы, пергидролазы и их комбинаций. Другие ферменты, указанные выше, также предусмотрены.As indicated above, the microcapsules may additionally contain an enzyme selected from the group consisting of protease, metalloprotease, subtilisin, amylase, lipase, cutinase, cellulase, mannanase, pectinase, xanthanase, DNase, laccase, peroxidase, halogen peroxidase, perhydrolase, and combinations thereof. Other enzymes mentioned above are also provided.

В одном варианте осуществления реакционноспособные аминогруппы полиразветвленного полиамина составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса. В одном варианте осуществления диаметр камеры составляет по меньшей мере 50 микрометров. В предпочтительном варианте осуществления камера содержит по меньшей мере 1% активного фермента по весу от всей камеры, в частности варианта липазы по настоящему изобретению. Как также указанно выше, микрокапсулы могут дополнительно включать спирт, такой как полиол.In one embodiment, the reactive amino groups of the polybranched polyamine comprise at least 15% of the molecular weight. In one embodiment, the chamber diameter is at least 50 micrometers. In a preferred embodiment, the chamber contains at least 1% active enzyme by weight of the entire chamber, in particular the lipase variant of the present invention. As also mentioned above, the microcapsules may further include an alcohol such as a polyol.

В предпочтительном варианте осуществления (a) представляет собой полиэтиленимин.In a preferred embodiment, (a) is polyethyleneimine.

В одном варианте осуществления (b) представляет собой этиленамин или алканоламин. В предпочтительном варианте осуществления (b) выбран из группы, состоящей из этилендиамина, диэтилентриамина, триэтилентетраамина, бис(3-аминопропил)амина, моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина, гексаметилендиамина, диаминобензола, пиперазина и тетраэтиленпентамина. В более предпочтительном варианте осуществления (b) выбран из группы, состоящей из диэтилентриамина, триэтилентетраамина, бис(3-аминопропил)амина, моноэтаноламина и диэтаноламина.In one embodiment, (b) is ethyleneamine or alkanolamine. In a preferred embodiment, (b) is selected from the group consisting of ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetraamine, bis(3-aminopropyl)amine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, hexamethylenediamine, diaminobenzene, piperazine and tetraethylenepentamine. In a more preferred embodiment, (b) is selected from the group consisting of diethylenetriamine, triethylenetetraamine, bis(3-aminopropyl)amine, monoethanolamine and diethanolamine.

В соответствии с настоящим изобретением камера микрoкапсулы содержит источник ионов Mg2+, Ca2+ или Zn2+, такой как слаборастворимая соль Mg2+, Ca2+ или Zn2+.In accordance with the present invention, the microcapsule chamber contains a source of Mg2+, Ca2+ or Zn2+ ions, such as a slightly soluble salt of Mg2+, Ca2+ or Zn2+.

В предпочтительном варианте осуществления мембрана получена с применением хлорангидрида в качестве сшивающего средства, такого как изофталоилхлорид, терефталоилхлорид или тримезоилхлорид.In a preferred embodiment, the membrane is prepared using an acid chloride as a crosslinker such as isophthaloyl chloride, terephthaloyl chloride or trimesoyl chloride.

В предпочтительном варианте осуществления мембрана получена с помощью межфазной полимеризации.In a preferred embodiment, the membrane is obtained by interfacial polymerization.

В специально предусмотренном варианте осуществления композиция в виде микрокапсул по настоящему изобретению представляет собой композицию, описанную в WO 2015/1144784 (включен в данный документ посредством ссылки), содержащую вариант липазы по настоящему изобретению.In a specifically contemplated embodiment, the microcapsule composition of the present invention is the composition described in WO 2015/1144784 (incorporated herein by reference) containing the lipase variant of the present invention.

ЖИДКИЕ ПРОДУКТЫLIQUID PRODUCTS

В последнем аспекте настоящее изобретение относится к жидким продуктам, содержащим композицию в виде микрокапсул по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления жидкий продукт содержит воду или по меньшей мере значительное количество воды.In the latter aspect, the present invention relates to liquid products containing the microcapsule composition of the present invention. In a preferred embodiment, the liquid product contains water, or at least a significant amount of water.

В следующих пунктах описаны варианты осуществления настоящего изобретения.The following paragraphs describe embodiments of the present invention .

1. Вариант исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность на по меньшей мере 60%, но менее чем на 100%, идентична SEQ ID NO: 2, и предусматривает одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T231R, N233R, T244E, и P256T.1. A variant of the parent lipase, wherein the variant has lipase activity, its sequence is at least 60% but less than 100% identical to SEQ ID NO: 2, and includes one or more (e.g., a number) substitutions in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T231R, N233R, T244E, and P256T.

2. Вариант по пункту 1, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, и P256T.2. A variant according to paragraph 1, where the variant provides for replacements in positions corresponding to T231R + N233R, and one or more (for example , a certain number) replacements in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

3. Вариант по пункту 1 или 2, предусматривающий замены, соответствующие любому из следующих наборов замен:3. An option according to paragraph 1 or 2, providing for replacements corresponding to any of the following sets of replacements:

G23S+T231R+N233R;G23S+T231R+N233R;

D27N+T231R+N233R;D27N+T231R+N233R;

A40I+T231R+N233R;A40I+T231R+N233R;

F51I+T231R+N233R;F51I+T231R+N233R;

F51L+T231R+N233R;F51L+T231R+N233R;

E56R+T231R+N233R;E56R+T231R+N233R;

D57N+T231R+N233R;D57N+T231R+N233R;

V60E+T231R+N233R;V60E+T231R+N233R;

V60K+T231R+N233R;V60K+T231R+N233R;

K98I+T231R+N233R;K98I+T231R+N233R;

N101D+T231R+N233R;N101D+T231R+N233R;

R118F+T231R+N233R;R118F+T231R+N233R;

G163S+T231R+N233R;G163S+T231R+N233R;

Y220F+T231R+N233R;Y220F+T231R+N233R;

T231R+N233R+T244E;T231R+N233R+T244E;

T231R+N233R+P256T.T231R+N233R+P256T.

4. Вариант по любому из пунктов 1-3, где вариант предусматривает замены, соответствующие E56R+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, и P256T.4. An option according to any one of paragraphs 1-3, where the option provides for replacements corresponding to E56R + T231R + N233R, and one or more (for example , a certain number) of replacements in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, R118F, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

5. Вариант по любому из пунктов 1-4, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, и P256T.5. An option according to any one of paragraphs 1-4, where the option provides for replacements in positions corresponding to R118F + T231R + N233R, and one or more (for example , a certain number) replacements in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, E56R, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

6. Вариант по любому из пунктов 1-5, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, и P256T.6. An option according to any one of paragraphs 1-5, where the option provides for replacements in positions corresponding to E56R+R118F+T231R+N233R, and one or more (for example , a number) replacements in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, T244E, and P256T.

7. Вариант по любому из пунктов 1-6, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.7. An option according to any one of paragraphs 1-6, where the option provides for replacements in positions corresponding to E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example , a certain number) replacements in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, F51I, L, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

8. Вариант по любому из пунктов 1-7, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.8. An option according to any of paragraphs 1-7, where the option provides for substitutions in positions corresponding to F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example , a certain number) substitutions in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

9. Вариант по любому из пунктов 1-8, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих G23S+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.9. An option according to any one of paragraphs 1-8, where the option provides for substitutions at positions corresponding to G23S+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example , a certain number) substitutions at positions corresponding to D27N, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

10. Вариант по любому из пунктов 1-9, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих D27N+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.10. An option according to any one of paragraphs 1-9, where the option provides for substitutions at positions corresponding to D27N + F51I, L + E56R + R118F + T231R + N233R + P256T, and one or more (for example , a certain number) substitutions at positions corresponding to G23S, A40I, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

11. Вариант по любому из пунктов 1-10, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих A40I+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.11. An option according to any one of paragraphs 1-10, where the option provides for substitutions at positions corresponding to A40I+F51I, L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example , a certain number) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, D57N, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

12. Вариант по любому из пунктов 1-11, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.12. An option according to any one of paragraphs 1-11, where the option provides for substitutions in the provisions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example , a certain number) substitutions in the provisions corresponding to G23S, D27N, A40I, V60E, K, K98I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

13. Вариант по любому из пунктов 1-12, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, G163S, Y220F, и T244E.13. An option according to any one of paragraphs 1-12, where the option provides for substitutions in the provisions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example , a number) substitutions in the provisions corresponding to G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

14. Вариант по любому из пунктов 1-13, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, Y220F, и T244E.14. An option according to any one of paragraphs 1-13, where the option provides for substitutions in the provisions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example , a certain number) substitutions in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, Y220F, and T244E.

15. Вариант по любому из пунктов 1-14, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+T244E+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, и Y220F.15. An option according to any one of paragraphs 1-14, where the option provides for replacements in the provisions corresponding to F51I, L + E56R + D57N + K98I + R118F + G163S + T231R + N233R + T244E + P256T, and one or more (for example , a certain number ) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, and Y220F.

16. Вариант по любому из пунктов 1-15, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, N101D, G163S, Y220F, и T244E.16. An option according to any one of paragraphs 1-15, where the option provides for substitutions in the positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example, a number of ) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

17. Вариант по любому из пунктов 1-16, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, G163S, Y220F, и T244E.17. An option according to any one of paragraphs 1-16, where the option provides for substitutions in the positions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+N101D+K98I+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example, a certain number) of substitutions in positions corresponding to G23S, D27N, A40I, V60E, K, N101D, G163S, Y220F, and T244E.

18. Вариант по любому из пунктов 1-17, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T, и одну или несколько (например, некоторое количество) замен в положениях, соответствующих G23S, D27N, A40I, G163S, Y220F, и T244E.18. An option according to any one of paragraphs 1-17, where the option provides for replacements in the provisions corresponding to F51I, L+E56R+D57N+V60E, K+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+P256T, and one or more (for example, some) substitutions at positions corresponding to G23S, D27N, A40I, G163S, Y220F, and T244E.

19. Вариант по любому из пунктов 1-18, где вариант предусматривает замены в положениях, соответствующих одному из следующих наборов замен:19. An option according to any one of paragraphs 1-18, where the option provides for substitutions at positions corresponding to one of the following sets of substitutions:

E56R+R118F+T231R+N233R;E56R+R118F+T231R+N233R;

R118F+T231R+N233R+P256T;R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+R118F+T231R+N233R;A40I+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+D57N+R118F+T231R+N233R;E56R+D57N+R118F+T231R+N233R;

E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+D57N+K98I+G163S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T;A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E:G23S+D27N+A40I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E:

G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;G23S+D27N+F51I+K98I+Y220F+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T;

G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T.G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T.

20. Вариант по любому из пунктов 1-19, который представляет собой вариант исходной липазы, выбранной из группы, состоящей из:20. The variant according to any one of paragraphs 1-19, which is a variant of the original lipase selected from the group consisting of:

a) полипептида, последовательность которого на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% идентична, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 2;a) a polypeptide whose sequence is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least at least 90%, at least 95% identical, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 2;

b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизируется в условиях низкой жесткости, условиях средней жесткости, условиях умеренно высокой жесткости, условиях высокой жесткости или условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей полипептид последовательностью SEQ ID NO: 1 или (ii) последовательностью полной длины, комплементарной (i);b) a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under low stringency, medium stringency, moderately high stringency, high stringency, or very high stringency conditions to (i) the polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1 or (ii) the full length sequence , complementary to (i);

c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, последовательность которого на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98%, на по меньшей мере 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 1; иc) a polypeptide encoded by a polynucleotide whose sequence is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% , at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99%, or 100% identical to SEQ ID NO: one; and

d) фрагмента полипептида SEQ ID NO: 2.d) a polypeptide fragment of SEQ ID NO: 2.

21. Вариант по любому из пунктов 1-20, где вариант характеризуется последовательностью, на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% идентичной, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99%, но менее чем на 100%, идентичной SEQ ID NO: 2.21. A variant according to any one of paragraphs 1-20, where the variant is characterized by a sequence of at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80% , at least 85%, at least 90%, at least 95% identical, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% , but less than 100% identical to SEQ ID NO: 2.

22. Вариант по любому из пунктов 1-21, где количество замен составляет 1-40, как, например, 1-30, как, например, 1-20, как, например, 1-12, как, например, 1-11, как, например, 1-10, как, например, 1-9, как, например, 1-8, как, например, 1-7, как, например, 1-6, как, например, 1-5, как, например, 1-4, как, например, 1-3 или 1, 2, 3 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 замен.22. The embodiment of any one of 1-21, wherein the number of substitutions is 1-40, such as 1-30, such as 1-20, such as 1-12, such as 1-11 like 1-10 like like 1-9 like like 1-8 like like 1-7 like like 1-6 like like 1-5 like eg 1-4, such as 1-3 or 1, 2, 3 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 replacements.

23. Вариант по любому из пунктов 1-22, где указанный вариант по сравнению с исходной липазой имеет одно или несколько следующих свойств: повышенную стабильность при хранении, повышенную термостабильность, улучшенную моющую эффективность и/или сниженную степень образования запаха.23. An embodiment according to any one of paragraphs 1-22, wherein said embodiment has one or more of the following properties compared to the parent lipase: increased storage stability, increased thermal stability, improved wash performance, and/or reduced odor generation.

24. Композиция, содержащая вариант по любому из пунктов 1-23.24. A composition containing a variant according to any one of paragraphs 1-23.

25. Композиция по пункту 25, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.25. The composition according to paragraph 25, additionally containing a surfactant.

26. Применение варианта по любому из пунктов 1-23 для гидролиза субстрата липазы.26. Use of the embodiment of any one of 1-23 to hydrolyze a lipase substrate.

27. Способ очистки поверхности, включающий приведение поверхности в контакт с вариантом по любому из пунктов 1-23.27. A method for cleaning a surface, which includes bringing the surface into contact with an option according to any one of paragraphs 1-23.

28. Способ гидролиза субстрата липазы, включающий обработку субстрата липазы вариантом липазы по любому из пунктов 1-23.28. A method for hydrolyzing a lipase substrate, comprising treating the lipase substrate with a lipase variant according to any one of 1-23.

29. Полинуклеотид, кодирующий вариант по любому из пунктов 1-23.29. A polynucleotide encoding a variant according to any one of items 1-23.

30. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид по пункту 29, где полинуклеотид функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием варианта липазы в рекомбинантной клетке-хозяине.30. A nucleic acid construct comprising the polynucleotide of claim 29, wherein the polynucleotide is operably linked to one or more regulatory sequences that control the production of a lipase variant in the recombinant host cell.

31. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по пункту 29 или конструкция нуклеиновой кислоты по пункту 30.31. An expression vector containing the polynucleotide of item 29 or the nucleic acid construct of item 30.

32. Клетка-хозяин, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по пункту 30 или вектор экспрессии по пункту 31.32. A host cell containing the nucleic acid construct of item 30 or the expression vector of item 31.

33. Способ получения варианта липазы, включающий:33. A method for producing a lipase variant, including:

a) культивирование клетки-хозяина по пункту 32 в условиях, подходящих для экспрессии варианта; иa) culturing the host cell according to paragraph 32 under conditions suitable for expression of the variant; and

b) выделение варианта.b) variant highlighting.

34. Композиция в виде микрокапсул, где мембрана микрокапсулы получена путем сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 1 кДа, при этом микрокапсула содержит вариант липазы по любому из пунктов 1-23.34. A microcapsule composition, wherein the microcapsule membrane is obtained by cross-linking a polybranched polyamine with a molecular weight of more than 1 kDa, wherein the microcapsule contains a lipase variant according to any one of paragraphs 1-23.

35. Композиция в виде микрокапсул по пункту 34, дополнительно содержащая фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, амилазы, липазы, целлюлазы, маннаназы, пектиназы, ДНКазы, лакказы, пероксидазы, галогенпероксидазы, пергидролазы и их комбинаций.35. The microcapsule composition of claim 34, further comprising an enzyme selected from the group consisting of protease, amylase, lipase, cellulase, mannanase, pectinase, DNase, laccase, peroxidase, halogen peroxidase, perhydrolase, and combinations thereof.

36. Композиция в виде микрокапсул по пункту 34 или 35, где реакционноспособные аминогруппы полиразветвленного полиамина составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса.36. The microcapsule composition of claim 34 or 35, wherein the reactive amino groups of the polybranched polyamine comprise at least 15% of the molecular weight.

37. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-36, где микрокапсулу получают при использовании хлорангидрида в качестве сшивающего средства.37. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 34-36, wherein the microcapsule is prepared using an acid chloride as a crosslinking agent.

38. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-37, где диаметр микрокапсулы составляет по меньшей мере 50 микрометров или больше.38. The microcapsule composition of any one of items 34-37, wherein the microcapsule diameter is at least 50 micrometers or greater.

39. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-38, где микрокапсула содержит по меньшей мере 1% по весу активного фермента, в частности варианта липазы по любому из пунктов 1-23.39. A microcapsule composition according to any one of paragraphs 34-38, wherein the microcapsule contains at least 1% by weight of an active enzyme, in particular a lipase variant according to any one of paragraphs 1-23.

40. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-39, которая дополнительно включает спирт, такой как полиол.40. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 34-39, which further comprises an alcohol, such as a polyol.

41. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-40, которая содержит менее 90% по весу воды.41. A microcapsule composition according to any one of paragraphs 34-40, which contains less than 90% by weight of water.

42. Композиция в виде микрокапсул по пункту 34 или 41, где протеаза представляет собой металлопротеазу или щелочную серин-протеазу, такую как субтилизин.42. The microcapsule composition of claim 34 or 41 wherein the protease is a metalloprotease or an alkaline serine protease such as subtilisin.

43. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-42, где микрокапсулу получают с помощью межфазной полимеризации с применением хлорангидрида в качестве сшивающего средства.43. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 34-42, wherein the microcapsule is obtained by interfacial polymerization using an acid chloride as a crosslinking agent.

44. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-43, где полиразветвленный полиамин представляет собой полиэтиленимин.44. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 34-43, wherein the polybranched polyamine is polyethyleneimine.

45. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-44, где микрокапсула содержит источник ионов Mg2+, Ca2+ или Zn2+, такой как слаборастворимая соль Mg2+, Ca2+ или Zn2+.45. A microcapsule composition according to any one of items 34-44, wherein the microcapsule contains a source of Mg2+, Ca2+ or Zn2+ ions, such as a slightly soluble salt of Mg2+, Ca2+ or Zn2+.

46. Композиция в виде микрокапсул, содержащая вариант липазы по любому из пунктов 1-23, заключенный в камеру, образованную мембраной, при этом мембрана получена путем сшивания (a) полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 800 Да и (b) алифатического или ароматического амина с молекулярным весом менее 300 Да; при этом весовое соотношение (a)/(b) находится в диапазоне от 0,1 до 1000.46. A microcapsule composition containing a lipase variant according to any one of paragraphs 1-23, enclosed in a chamber formed by a membrane, the membrane being obtained by cross-linking (a) a polybranched polyamine with a molecular weight of more than 800 Da and (b) an aliphatic or aromatic amine with a molecular weight of less than 300 Da; while the weight ratio (a)/(b) is in the range from 0.1 to 1000.

47. Композиция в виде микрокапсул по пункту 46, дополнительно содержащая фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, металлoпротеазы, субтилизина, амилазы, липазы, кутиназы, целлюлазы, маннаназы, пектиназы, ксантаназы, ДНКазы, лакказы, пероксидазы, галогенпероксидазы, пергидролазы и их комбинации.47. The microcapsule composition of claim 46, further comprising an enzyme selected from the group consisting of protease, metalloprotease, subtilisin, amylase, lipase, cutinase, cellulase, mannanase, pectinase, xanthanase, DNase, laccase, peroxidase, halogen peroxidase, perhydrolase, and their combinations.

48. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46 или 47, где реакционноспособные аминогруппы полиразветвленного полиамина составляют по меньшей мере 15% молекулярного веса.48. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 46 or 47, wherein the reactive amino groups of the polybranched polyamine comprise at least 15% of the molecular weight.

49. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-48, где диаметр камеры составляет по меньшей мере 50 микрометров.49. The microcapsule composition of any one of items 46-48, wherein the chamber diameter is at least 50 micrometers.

50. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-49, где камера содержит по меньшей мере 1% активного фермент по весу от всей камеры, в частности варианта липазы по любому из пунктов 1-23.50. A microcapsule composition according to any one of paragraphs 46-49, wherein the chamber contains at least 1% active enzyme by weight of the entire chamber, in particular the lipase variant according to any one of paragraphs 1-23.

51. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-50, которая дополнительно включает спирт, такой как полиол.51. The microcapsule composition of any one of items 46-50, which further comprises an alcohol, such as a polyol.

52. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-51, где (a) представляет собой полиэтиленимин.52. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 46-51, wherein (a) is polyethyleneimine.

53. Композиция по любому из пунктов 46-52, где (b) представляет собой этиленамин или алканоламин.53. The composition according to any one of paragraphs 46-52, where (b) is ethyleneamine or alkanolamine.

54. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-53, где (b) выбран из группы, состоящей из этилендиамина, диэтилентриамина, триэтилентетраамина, бис(3-аминопропил)амина, моноэтаноламина, диэтаноламина, триэтаноламина, гексаметилендиамина, диаминобензола, пиперазина и тетраэтиленпентамина.54. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 46-53, wherein (b) is selected from the group consisting of ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetraamine, bis(3-aminopropyl)amine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, hexamethylenediamine, diaminobenzene, piperazine, and tetraethylenepentamine.

55. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-54, где (b) выбран из группы, состоящей из диэтилентриамина, триэтилентетраамина, бис(3-аминопропил)амина, моноэтаноламина и диэтаноламина.55. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 46-54, wherein (b) is selected from the group consisting of diethylenetriamine, triethylenetetraamine, bis(3-aminopropyl)amine, monoethanolamine and diethanolamine.

56. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-55, где камера содержит источник ионов Mg2+, Ca2+ или Zn2+, такой как слаборастворимая соль Mg2+, Ca2+ или Zn2+.56. The microcapsule composition of any one of items 46-55, wherein the chamber contains a source of Mg2+, Ca2+ or Zn2+ ions, such as a slightly soluble salt of Mg2+, Ca2+ or Zn2+.

57. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 43-55, где мембрану получают при использовании хлорангидрида в качестве сшивающего средства, такого как изофталоилхлорид, терефталоилхлорид или тримезоилхлорид.57. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 43-55, wherein the membrane is prepared using an acid chloride as a crosslinking agent, such as isophthaloyl chloride, terephthaloyl chloride, or trimesoyl chloride.

58. Композиция в виде микрокапсул по любому из пунктов 46-57, где мембрану получают с помощью межфазной полимеризации.58. The microcapsule composition according to any one of paragraphs 46-57, wherein the membrane is produced by interfacial polymerization.

59. Жидкий продукт, содержащий композицию в виде микрокапсул по любому из пунктов 34-58.59. A liquid product containing the microcapsule composition of any one of paragraphs 34-58.

Настоящее изобретение дополнительно описывается следующими примерами, которые не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.The present invention is further described by the following examples, which should not be construed as limiting the scope of the present invention.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1. Анализ с использованием п-нитрофенила (pNP)Example 1 Analysis using p-nitrophenyl (pNP)

Гидролитическая активность липазы может быть определена с помощью кинетического анализа с применением сложныхп-нитрофенилацильных эфиров в качестве субстрата.The hydrolytic activity of the lipase can be determined by kinetic analysis usingp -nitrophenylacyl esters as a substrate.

100 мM исходного раствора в DMSO для каждого из субстратовп-нитрофенилбутират (C4),п-нитрофенилкапроат (C6),п-нитрофенилкапрат (C10),п-нитрофениллаурат (C12) ип-нитрофенилпальмитат (C16) (все от Sigma-Aldrich Danmark A/S, Kirkebjerg Allé 84, 2605 Brøndby; № по каталогу: C3: N-9876, C6: N-0502, C10: N-0252, C12: N-2002, C16: N-2752) разбавляли до конечной концентрации 1 мM 25 мM в буфере для анализа (50 мM Трис; pH 7,7; 0,4% Triton X-100).100 mM stock solution in DMSO for each of the substratesp -nitrophenyl butyrate (C4),p -nitrophenyl caproate (C6),p -nitrophenyl caprate (C10),p -nitrophenyl laurate (C12), andp -nitrophenyl palmitate (C16) (all from Sigma-Aldrich Danmark A/S, Kirkebjerg Allé 84, 2605 Brøndby; Cat #: C3: N-9876, C6: N-0502, C10: N-0252, C12: N-2002, C16: N-2752) were diluted to final concentration 1 mM 25 mM in assay buffer (50 mM Tris; pH 7.7; 0.4% Triton X-100).

Варианты липазы, исходная липаза и подходящие контроли,например Lipolase^TM (SEQ ID NO: 2) в 50 мM Hepes; pH 8,0; 10 ppm Triton X-100; +/-20 мM CaCl₂ добавляют к раствору субстрата в следующих конечных концентрациях белка: 0,01 мг/мл; 5×10^-3 мг/мл; 2,5×10^-4 мг/мл и 1,25×10^-4 мг/мл в 96-луночные планшеты NUNC (№ по каталогу 260836, Kamstrupvej 90, DK-4000, Roskilde). Буфер также запускается в качестве отрицательного контроля. Высвобождение п-нитрофенола путем гидролиза п-нитрофенилацила можно отслеживать при 405 нм в течение 5 минут с 10 секундными интервалами на Spectra max 190 (Molecular Devices GmbH, Bismarckring 39, 88400 Biberach an der Riss, Германия). Гидролитическую активность по отношению к одному или нескольким субстратам варианта можно сравнить с таковой исходной липазы.Lipase variants, original lipase and suitable controls,e.g. Lipolase^TM (SEQ ID NO: 2) in 50 mM Hepes; pH 8.0; 10 ppm Triton X-100; +/-20 mM CaCl₂ added to the substrate solution at the following final protein concentrations: 0.01 mg/ml; 5×10^-3 mg/ml; 2.5×10^-four mg/ml and 1.25×10^-four mg/mL into NUNC 96-well plates (cat. no. 260836, Kamstrupvej 90, DK-4000, Roskilde). The buffer is also run as a negative control. The release of p-nitrophenol by hydrolysis of p-nitrophenylacyl can be monitored at 405 nm for 5 minutes at 10 second intervals on a Spectra max 190 (Molecular Devices GmbH, Bismarckring 39, 88400 Biberach an der Riss, Germany). The hydrolytic activity towards one or more substrates of the variant can be compared to that of the parent lipase.

Пример 2. Конструирование вариантов с помощью сайт-направленного мутагенезаExample 2 Construction of Variants by Site-Directed Mutagenesis

Конструировали варианты липазыThermomyces lanuginosus (TLL) (SEQ ID NO: 2), подвергнутые сайт-направленному мутагенезу. Варианты получали путем традиционного клонирования фрагментов ДНК (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989), применяя ПЦР вместе с соответственно разработанными мутагенными олигонуклеотидами, посредством которых вводили необходимые мутации в итоговую последовательность.Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) variants (SEQ ID NO: 2) subjected to site-directed mutagenesis were constructed. Variants were generated by conventional cloning of DNA fragments (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989) using PCR along with appropriately designed mutagenic oligonucleotides that introduced the desired mutations into the final sequence.

Мутагенные олигонуклеотиды были разработаны так, чтобы соответствовать последовательности ДНК, которая фланкирует необходимый(-ые) сайт(-ы) мутации, отделенный парами оснований ДНК, определяющими вставки/делеции/замены, и приобретали у поставщика олигонуклеотидов, такого как Life Technologies.Mutagenic oligonucleotides were designed to match a DNA sequence that flanks the required mutation site(s) separated by DNA base pairs defining insertions/deletions/substitutions and purchased from an oligonucleotide supplier such as Life Technologies.

Чтобы протестировать варианты TLL, мутированную ДНК, кодирующую вариант, интегрировали в компетентный штаммA. oryzae путем гомологичной рекомбинации, ферментировали с применением стандартных протоколов (среда на основе дрожжевого экстракта, 3-4 дня, 30°C) и очищали с помощью хроматографии. Таким образом, были сконструированы и получены варианты, перечисленные в таблице ниже.To test TLL variants, mutated DNA encoding the variant was integrated into a competent strain ofA. oryzae by homologous recombination, fermented using standard protocols (yeast extract medium, 3-4 days, 30°C) and purified by chromatography. Thus, the variants listed in the table below were designed and obtained.

Варианты SEQ ID NO: 2.Options SEQ ID NO: 2.

G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256TG23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+P256TA40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256TA40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256TD27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244ED27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244EG23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256TG23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T

Пример 3. Относительная моющая эффективность (RP(мытье))Example 3 Relative Washing Efficiency (RP(wash))

Эксперименты, связанные с мытьем, проводили с применением анализа с автоматическим механическим стрессом (AMSA) с целью оценки моющей способности при стирке. Планшет для AMSA имеет число слотов для исследуемых растворов и крышку, прочно закрывающую образец после стирки, текстильный материал, подвергаемый стирке, напротив всех отверстий слотов. В течение периода стирки, планшет, исследуемые растворы, текстильный материал и крышку энергично встряхивали для приведения исследуемого раствора в контакт с текстильным материалом и создавали механический стресс в регулярном, периодическом колебательном образе действия. Дополнительные описания см. WO02/42740, в особенности параграф "Special method embodiments" на стр. 23-24.Washing experiments were carried out using automatic mechanical stress analysis (AMSA) to evaluate washing performance. The plate for AMSA has a number of slots for test solutions and a lid that firmly covers the sample after washing, the textile material being washed is opposite all slot openings. During the wash period, the plate, test solutions, textile material and lid were vigorously shaken to bring the test solution into contact with the textile material and mechanical stress was applied in a regular, periodic oscillatory manner. For additional descriptions, see WO02/42740, especially the paragraph "Special method embodiments" on pages 23-24.

Эксперименты в отношении стирки проводили при условиях эксперимента, указанных ниже.Washing experiments were carried out under the experimental conditions indicated below.

Моющее средство:Detergent:3,3 г/л моющего средства B или 0,8 г/л моющего средства J3.3 g/l detergent B or 0.8 g/l detergent JОбъем исследуемого раствораVolume of test solution160 мкл160 µlВремя стирки:Wash time:20 минут20 minutesТемпература:Temperature:30°C30°CДоза липазы:Lipase dose:0 ppm или 0,35 ppm0ppm or 0.35ppmИсследуемый материал:Material under study:хлопчатобумажное изделие EMPA221, загрязненное смесью сливки-аннато, полученное как описано в WO06/125437, за исключением замены куркумы на аннатто (Annatto: A-320-WS, Chr. Hansen A/S, Boege Alle´ 10-12, DK-2970, Hoersholm, Дания и EMPA221: EMPA, Lerchenfeldstrasse 5, CH-9014, St. Gallen, Швейцария)EMPA221 cotton product contaminated with cream-annatto mixture prepared as described in WO06/125437 except for replacing turmeric with annatto (Annatto: A-320-WS, Chr. Hansen A/S, Boege Alle´ 10-12, DK-2970 , Hoersholm, Denmark and EMPA221: EMPA, Lerchenfeldstrasse 5, CH-9014, St. Gallen, Switzerland)

Жесткость воды доводили до 15°dH или 6°dH путем добавления CaCl₂, MgCl₂ и NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺: HCO₃^-= 4:1:7,5 или 2:1:4,5).Water hardness was adjusted to 15°dH or 6°dH by adding CaCl₂ , MgCl₂ and NaHCO₃ (Ca²⁺ :Mg²⁺ : HCO₃^- = 4:1:7.5 or 2:1:4.5) .

Таблица 1 Композиция: Модельное моющее средство B (вес. %)Table 1 Composition: Model Detergent B (wt%)NaOH, пеллеты (>99%)NaOH, pellets (>99%)1,051.05Линейная алкилбензолсульфоновая кислота (LAS) (97%)Linear alkylbenzenesulfonic acid (LAS) (97%)7,207.20Лаурилсульфат натрия (SLES) (28%)Sodium lauryl sulfate (SLES) (28%)10,5810.58Соевая жирная кислота (>90%)Soy fatty acid (>90%)2,752.75Кокосовая жирная кислота (>99%)Coconut fatty acid (>99%)2,752.75Спиртоэтоксилат (AEO) с 8 моль EO; Lutensol TO 8 (~100%)Alcohol ethoxylate (AEO) with 8 mol EO; Lutensol TO 8 (~100%)6,606.60Триэтаноламин (100%)Triethanolamine (100%)3,333.33Цитрат Na, дегидратированный (100%)Na citrate, dehydrated (100%)2,002.00DTMPA; диэтилентриаминпентакис(метилен)пентакис(фосфоновая кислота), гептанатриевая соль (Dequest 2066 C) (~42% в виде Na7 соли)DTMPA; diethylenetriaminepentakis(methylene)pentakis(phosphonic acid), heptanasodium salt (Dequest 2066 C) (~42% as Na7 salt)0,480.48MPG (>98%)MPG (>98%)6,006.00EtOH, пропан-2-ол (90/10%)EtOH, propan-2-ol (90/10%)3,003.00Глицерин (>99,5%)Glycerin (>99.5%)1,711.71Формиат натрия (>95%)Sodium Formate (>95%)1,001.00PCA (40% в виде натриевой соли)PCA (40% as sodium salt)0,460.46Вода доWater up100100Таблица 2 Композиция: Модельное моющее средство J (вес. %)Table 2 Composition: Model Detergent J (wt%)гидроксид натрия (>99%)sodium hydroxide (>99%)0,500.50Линейная алкилбензолсульфоновая кислота (LAS) (97%)Linear alkylbenzenesulfonic acid (LAS) (97%)5,005.00алкилсульфат натрия (90%)sodium alkyl sulfate (90%)5,005.00AEOS, сульфат натрий(C12)алкилового эфира (70,5%)AEOS, sodium (C12) alkyl ether sulfate (70.5%)10,0010.00Кокосовая жирная кислота (>99%)Coconut fatty acid (>99%)1,001.00Спиртоэтоксилат (AEO) с 7 моль EO (99,5%)Alcohol ethoxylate (AEO) with 7 mol EO (99.5%)5,005.00MEA, моноэтаноламин (99,5%)MEA, monoethanolamine (99.5%)0,200.20MPG (>98%)MPG (>98%)3,003.00EtOH, пропан-2-ол (90/10%)EtOH, propan-2-ol (90/10%)1,501.50DTPA, диэтилентриаминпентауксусная кислота, пентанатриевая соль, (~40% в виде соли Na5)DTPA, diethylenetriaminepentaacetic acid, pentasodium salt, (~40% as Na5 salt)0,100.10цитрат натрия (>99%)sodium citrate (>99%)4,004.00формиат натрия (>99%)sodium formate (>99%)1,001.00Вода доWater up100100

После стирки текстильные материалы промывали в водопроводной воде и избыток воды удаляли из текстильных материалов с применением фильтровальной бумаги и непосредственно после этого текстильные материалы высушивали при 100°C в течение 15 минут.After washing, the textiles were washed in tap water, and excess water was removed from the textiles using filter paper, and immediately afterwards, the textiles were dried at 100° C. for 15 minutes.

Моющую способность измеряли по изменению цвета промытого загрязненного текстильного материала. Загрязнение представляло собой сливки, смешанные с аннатто. Аннатто содержит красящее вещество норбиксин, который действует как индикатор pH с изменением цвета в зависимости от pH. Активность липазы приводит к высвобождению свободных жирных кислот из ацилглицерола сливок, и это приводит к снижению pH и, следовательно, к изменению цвета индикатора pH норбиксина. Поэтому моющую эффективность липазы можно выразить как степень изменения цвета света, отраженного от стираемого загрязненного текстильного материала при освещении белым светом.Washing power was measured by the color change of the washed contaminated textile material. The contamination was cream mixed with annatto. Annatto contains the coloring agent norbixin, which acts as a pH indicator, changing color with pH. The activity of the lipase results in the release of free fatty acids from the acylglycerol of the cream, and this results in a decrease in pH and hence a discoloration of the norbixin pH indicator. Therefore, the washing efficiency of lipase can be expressed as the degree of color change of the light reflected from the washed soiled textile material when illuminated with white light.

Измерения цвета проводили с помощью профессионального планшетного сканера (EPSON EXPRESSION 11000XL, Atea A/S, Lautrupvang 6, 2750 Баллеруп, Дания), который применяли для фиксирования изображения вымытого загрязненного текстильного материала. Для получения значения интенсивности света со сканированных изображений, значения 24-битного пиксельного изображения преобразовывали в значения для красного, зеленого и синего цвета (RGB).Color measurements were taken with a professional flatbed scanner (EPSON EXPRESSION 11000XL, Atea A/S, Lautrupvang 6, 2750 Ballerup, Denmark) which was used to capture the image of the washed contaminated textile. To obtain the light intensity value from the scanned images, the 24-bit pixel image values were converted to red, green, and blue (RGB) values.

Изменение цвета из-за активности липазы измеряли как изменение отражающей способности зеленого света (G) относительно значения интенсивности света (Int), рассчитанное как:The color change due to lipase activity was measured as the change in green light reflectance (G) relative to the light intensity value (Int), calculated as:

Относительная моющая эффективность (RP(мытье)) липазы относительно контрольной липазы была рассчитана как:The relative washing efficiency (RP(wash)) of lipase relative to control lipase was calculated as:

RP(мытье) = (G/Int(исследуемая липаза) - G/Int(без фермента)) / (G/Int(эталонная липаза) - G/Int(без фермента)).RP(wash) = (G/Int(test lipase) - G/Int(no enzyme)) / (G/Int(reference lipase) - G/Int(no enzyme)).

Считается, что липаза демонстрирует улучшенную моющую эффективность, если она более эффективна, чем эталонная (RP(мытье)> 1). В контексте настоящего изобретения эталонный фермент представляет собой липазу, показанную под SEQ ID NO: 2.A lipase is considered to show improved washing performance if it is more effective than the reference (RP(wash) > 1). In the context of the present invention, the reference enzyme is the lipase shown under SEQ ID NO: 2.

Обнаружение запаха с помощью измерений с использованием твердофазного микроэкстракционного газового хроматографа.Odor detection by measurements using a solid phase microextraction gas chromatograph.

Высвобождение масляной кислоты (запаха) из промытых липазой лоскутов измеряли с помощью твердофазной микроэкстракционной газовой хроматографии (SPME-GC) с применением следующего способа.Butyric acid release (odor) from the lipase-washed patches was measured by solid phase microextraction gas chromatography (SPME-GC) using the following method.

Хлопчатобумажное изделие EMPA221, загрязненное смесью сливки-аннато, стирали как указано выше, и после стирки избыток воды удаляли из текстильного материала с применением фильтровальной бумаги и после этого ткань высушивали при 25°C в течение 2 часов. Каждое измерение с помощью SPME-GC проводили с четырьмя кусками простиранного и высушенного текстильного материала (5 мм в диаметре), которые переносили во флакон газового хроматографа (GC) и закрывали флакон. Образцы инкубировали при 30°C в течение 24 часов и затем нагревали до 140°C в течение 30 минут и хранили при 20°C-25°C в течение по меньшей мере 4 часов перед анализом. Анализы проводили на Varian 3800 GC, оснащенном колонкой Stabilwax- DA w/lntegra-Guard (30 м, 0,32 мм ID и 0,25 мкм df) и волокном Carboxen PDMS SPME (85 мкм). Отбор образцов из каждого флакона GC проводили при 50°C в течение 8 минут с использованием волокна SPME в свободном пространстве над кусками текстильного материала и отобранные соединения затем вводили в колонку (температура инжектора=250°C). Скорость потока колонки=2 мл гелий/минута. Градиент температуры термостата колонок: 0 минут=50°C, 2 минуты=50°C, 6 минут 45 секунд=240°C, 11 минут 45 секунд=240°C. Обнаружение проводили с применением детектора ионизации в пламени (FID), а время удерживания масляной кислоты идентифицировали с применением действующих стандартов.The EMPA221 cotton product soiled with cream-annatto mixture was washed as above, and after washing, excess water was removed from the textile material using filter paper, and then the fabric was dried at 25°C for 2 hours. Each measurement using SPME-GC was performed with four pieces of stretched and dried textile material (5 mm in diameter), which were transferred to a gas chromatograph (GC) vial and the vial was closed. Samples were incubated at 30°C for 24 hours and then heated to 140°C for 30 minutes and stored at 20°C-25°C for at least 4 hours before analysis. Analyzes were performed on a Varian 3800 GC equipped with a Stabilwax-DA w/Integra-Guard column (30 m, 0.32 mm ID and 0.25 µm df) and Carboxen PDMS SPME fiber (85 µm). Sampling of each GC vial was performed at 50° C. for 8 minutes using SPME fiber in the headspace over the textile pieces and the selected compounds were then injected into the column (injector temperature=250° C.). Column flow rate=2 ml helium/minute. Column oven temperature gradient: 0 minutes=50°C, 2 minutes=50°C, 6 minutes 45 seconds=240°C, 11 minutes 45 seconds=240°C. Detection was performed using a flame ionization detector (FID) and butyric acid retention time was identified using current standards.

Относительное высвобождение запаха (RP(запах)) липазы является соотношением между количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из лоскута, промытого липазой, и количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из эталонного лоскута, промытого липазой, затем оба значения корректировали с учетом количества высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из лоскута, не промытого липазой (холостая проба). Относительную эффективность в отношении запаха (RP(запах)) полипептида рассчитывали в соответствии с представленной ниже формулой:The relative odor release (RP(odor)) of lipase is the ratio between the amount of butyric acid released (peak area) from a lipase-washed flap and the amount of butyric acid released (peak area) from a lipase-washed reference flap, then both values were corrected for the amount released butyric acid (peak area) from a flap not washed with lipase (blank). The relative odor potency (RP(odor)) of a polypeptide was calculated according to the formula below:

RP(запах) = (запах(исследуемая липаза) - запах(без фермента)) / (запах(эталонная липаза) - запах(без фермента)).RP(odor) = (odor(test lipase) - odor(no enzyme)) / (odor(reference lipase) - odor(no enzyme)).

При этом запах представляет собой измеренную масляную кислоту (площадь пика), высвобожденную с поверхности текстильного материала.The odor is the measured butyric acid (peak area) released from the surface of the textile.

Соотношение преимущества и фактора риска (RP(мытье)/RP(запах)).Benefit versus risk ratio (RP(wash)/RP(smell)).

Соотношение преимущества и фактора риска (BRF), описывающее моющую эффективность (преимущество) по сравнению с высвобождением запаха (риском) можно определить как RP(мытье)/RP(запах). Если соотношение преимущества и фактора риска для липазы выше 1, то липаза имеет лучшую моющую эффективность относительно высвобожденного запаха по сравнению с эталонной липазой (SEQ ID NO: 2).The Benefit Risk Factor Ratio (BRF) describing cleaning performance (benefit) versus odor release (risk) can be defined as RP(wash)/RP(smell). If the benefit/risk ratio for the lipase is greater than 1, then the lipase has a better wash performance relative to the released odor compared to the reference lipase (SEQ ID NO: 2).

Конструкция с мутациями в белкеProtein mutation constructAMSA, модель J, RP
(мытье) 6°dH, 0,8 г/л)AMSA Model J RP
(wash) 6°dH, 0.8 g/l)AMSA, модель B, RP
(мытье) 6°dH, 3,3 г/л)AMSA Model B RP
(wash) 6°dH, 3.3 g/l)AMSA, модель B, RP
(мытье) 15°dH, 3,3 г/л)AMSA Model B RP
(wash) 15°dH, 3.3 g/l)AMSA,
модель J,
RP
(6°dH, 0,8 г/л) (запах)amsa,
model J,
RP
(6°dH, 0.8 g/l) (smell)AMSA,
модель J,
BRFamsa,
model J,
BRFSEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 21,001.001,001.001,001.001,001.001,001.00G23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+ P256TG23S+D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+ P256T6,886.882,792.791,411.413,973.971,741.74A40I+F51L+E56R+D57N+
K98I+R118F+G163S+
T231R+N233R+P256TA40I+F51L+E56R+D57N+
K98I+R118F+G163S+
T231R+N233R+P256T3,023.021,841.841,231.232,792.791,081.08G23S+D27N+A40I+F51I+ E56R+R118F+T231R+ N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+ E56R+R118F+T231R+ N233R+T244E+P256T1,551.551,781.781,191.192,842.840,550.55D27N+F51I+E56R+
R118F+T231R+N233R+
T244ED27N+F51I+E56R+
R118F+T231R+N233R+
T244E2,002.001,581.581,251.252,512.510,790.79G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+
R118F+Y220F+T231R+N233R+
T244E+P256TG23S+D27N+F51I+E56R+K98I+
R118F+Y220F+T231R+N233R+
T244E+P256T2,802.801,721.721,301.302,412.411,161.16

Пример 4. Анализ теплового развертывания белков (TSA, оценка теплового сдвига)Example 4 Protein Thermal Unfolding Analysis (TSA, Thermal Shift Estimation)

Тепловое развертывание белка вариантов с SEQ ID NO: 2 контролировали с помощью Sypro Orange (Invitrogen, S-6650) с использованием прибора для ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems; Step-One-Plus).Thermal protein unfolding of SEQ ID NO: 2 variants was monitored with Sypro Orange (Invitrogen, S-6650) using a real-time PCR instrument (Applied Biosystems; Step-One-Plus).

В 96-луночном белом ПЦР-планшете образец объемом 15 мкл (очищенный фермент, разбавленный в 100 мM EPPS, 0,01% Troton-X-100; pH 8,0) смешивали (1:1) со Sypro Orange (конц. = 10X; исходный раствор от поставщика=5000X) в воде.In a 96-well white PCR plate, a 15 µl sample (purified enzyme diluted in 100 mM EPPS, 0.01% Troton-X-100; pH 8.0) was mixed (1:1) with Sypro Orange (conc. = 10X; stock solution from supplier=5000X) in water.

Планшет запечатывали оптической ПЦР-пленкой. В устройстве для ПЦР устанавливали скорость сканирования при 76°C в час, начиная при 25°C и заканчивая при 96°C.The plate was sealed with optical PCR film. The PCR device was set to scan at 76°C per hour, starting at 25°C and ending at 96°C.

Флуоресценцию контролировали каждые 20 секунд, используя встроенный источник LED, генерирующий голубой свет, для определения возбуждения и ROX-фильтр (610 нм, эмиссия). Значения Tm рассчитывали как максимальное значение первой производной (dF/dK) (Gregory et al., 2009, J. Biomol. Screen. 14: 700).Fluorescence was monitored every 20 seconds using a built-in LED source generating blue light to determine excitation and a ROX filter (610 nm, emission). Tm values were calculated as the maximum value of the first derivative (dF/dK) (Gregory et al., 2009, J. Biomol. Screen. 14: 700).

Конструкция с мутациями в белкеProtein mutation constructTm (°C)Tm (°C)SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 174,774.7G23S+D27N+F51I +E56R+R118F+T231R+N233R+ P256TG23S+D27N+F51I +E56R+R118F+T231R+N233R+ P256T78,378.3A40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256TA40I+F51L+E56R+D57N+K98I+R118F+G163S+T231R+N233R+P256T78,878.8G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T81,081.0D27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244ED27N+F51I+E56R+R118F+T231R+N233R+T244E76,476.4G23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256TG23S+D27N+F51I+E56R+K98I+R118F+Y220F+T231R+N233R+T244E+P256T77,777.7

Пример 5. Конструирование вариантов с помощью сайт-направленного мутагенезаExample 5 Construction of Variants by Site-Directed Mutagenesis

Конструировали варианты липазыThermomyces lanuginosus (TLL) (SEQ ID NO: 2), подвергнутые сайт-направленному мутагенезу. Варианты получали путем традиционного клонирования фрагментов ДНК (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989), применяя ПЦР вместе с соответственно разработанными мутагенными олигонуклеотидами, посредством которых вводили необходимые мутации в итоговую последовательность.Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) variants (SEQ ID NO: 2) subjected to site-directed mutagenesis were constructed. Variants were generated by conventional cloning of DNA fragments (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989) using PCR along with appropriately designed mutagenic oligonucleotides that introduced the desired mutations into the final sequence.

Мутагенные олигонуклеотиды были разработаны так, чтобы соответствовать последовательности ДНК, которая фланкирует необходимый(-ые) сайт(-ы) мутации, отделенный парами оснований ДНК, определяющими вставки/делеции/замены, и приобретали у поставщика олигонуклеотидов, такого как Life Technologies. Чтобы протестировать варианты TLL, мутированную ДНК, кодирующую вариант, интегрировали в компетентный штаммA. oryzae путем гомологичной рекомбинации, ферментировали с применением стандартных протоколов (среда на основе дрожжевого экстракта, 3-4 дня, 30°C) и очищали с помощью хроматографии. Таким образом, были сконструированы и получены варианты, перечисленные в таблице ниже.Mutagenic oligonucleotides were designed to match a DNA sequence that flanks the required mutation site(s) separated by DNA base pairs defining insertions/deletions/substitutions and purchased from an oligonucleotide supplier such as Life Technologies. To test TLL variants, mutated DNA encoding the variant was integrated into a competent strain ofA. oryzae by homologous recombination, fermented using standard protocols (yeast extract medium, 3-4 days, 30°C) and purified by chromatography. Thus, the variants listed in the table below were designed and obtained.

Варианты SEQ ID NO: 2 G23S+T231R+N233ROptions SEQ ID NO: 2 G23S+T231R+N233RD27N+T231R+N233RD27N+T231R+N233RA40I+T231R+N233RA40I+T231R+N233RF51I+T231R+N233RF51I+T231R+N233RF51L+T231R+N233RF51L+T231R+N233RE56R+T231R+N233RE56R+T231R+N233RD57N+T231R+N233RD57N+T231R+N233RV60E+T231R+N233RV60E+T231R+N233RV60K+T231R+N233RV60K+T231R+N233RK98I+T231R+N233RK98I+T231R+N233RN101D+T231R+N233RN101D+T231R+N233RR118F+T231R+N233RR118F+T231R+N233RG163S+T231R+N233RG163S+T231R+N233RY220F+T231R+N233RY220F+T231R+N233RT231R+N233R+T244ET231R+N233R+T244ET231R+N233R+P256TT231R+N233R+P256TE56R+R118F+T231R+N233RE56R+R118F+T231R+N233RR118F+T231R+N233R+P256TR118F+T231R+N233R+P256TA40I+R118F+T231R+N233RA40I+R118F+T231R+N233RF51I+E56R+R118F+T231R+N233RF51I+E56R+R118F+T231R+N233RF51L+E56R+R118F+T231R+N233RF51L+E56R+R118F+T231R+N233RE56R+D57N+R118F+T231R+N233RE56R+D57N+R118F+T231R+N233RE56R+V60K+R118F+T231R+N233RE56R+V60K+R118F+T231R+N233RG23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256TG23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+N233R+T244E+P256T

Пример 6. Относительная моющая эффективность (RP(мытье))Example 6 Relative Washing Efficiency (RP(wash))

Эксперименты, связанные с мытьем, проводили с применением анализа с автоматическим механическим стрессом (AMSA) с целью оценки моющей способности при стирке. Планшет для AMSA имеет число слотов для исследуемых растворов и крышку, прочно закрывающую образец после стирки, текстильный материал, подвергаемый стирке, напротив всех отверстий слотов. В течение периода стирки, планшет, исследуемые растворы, текстильный материал и крышку энергично встряхивали для приведения исследуемого раствора в контакт с текстильным материалом и создавали механический стресс в регулярном, периодическом колебательном образе действия. Дополнительные описания см. WO 02/42740, особенно параграф "Special method embodiments" на стр. 23-24.Washing experiments were carried out using automatic mechanical stress analysis (AMSA) to evaluate washing performance. The plate for AMSA has a number of slots for test solutions and a lid that firmly covers the sample after washing, the textile material being washed is opposite all slot openings. During the wash period, the plate, test solutions, textile and lid were vigorously shaken to bring the test solution into contact with the textile and mechanical stress was applied in a regular, intermittent oscillating pattern. For additional descriptions, see WO 02/42740, especially the paragraph "Special method embodiments" on pages 23-24.

Эксперименты в отношении стирки проводили при условиях эксперимента, указанных ниже.Washing experiments were carried out under the experimental conditions indicated below.

Моющее средство:Detergent:3,3 г/л модельного моющего средства B или 0,8 г/л модельного моющего средства J3.3 g/l model detergent B or 0.8 g/l model detergent JОбъем исследуемого раствораVolume of test solution160 μL160µlВремя стирки:Wash time:20 минут20 minutesТемпература:Temperature:30°C30°CДоза липазы:Lipase dose:0 ppm или 0,35 ppm0ppm or 0.35ppmИсследуемый материал:Material under study:хлопчатобумажное изделие EMPA221, загрязненное смесью сливки-аннато, полученное как описано в WO 06/125437, за исключением замены куркумы на аннатто (Annatto: A-320-WS, Chr. Hansen A/S, Boege Alle´ 10-12, DK-2970, Hoersholm, Дания и EMPA221: EMPA, Lerchenfeldstrasse 5, CH-9014, St. Gallen, Швейцария)EMPA221 cotton product contaminated with cream-annatto mixture prepared as described in WO 06/125437 except for replacing turmeric with annatto (Annatto: A-320-WS, Chr. Hansen A/S, Boege Alle´ 10-12, DK- 2970, Hoersholm, Denmark and EMPA221: EMPA, Lerchenfeldstrasse 5, CH-9014, St. Gallen, Switzerland)

Жесткость воды доводили до 15°dH или 6°dH путем добавления CaCl₂, MgCl₂ и NaHCO₃ (Ca²⁺:Mg²⁺: HCO₃^-= 4:1:7,5 или 2:1:4,5).Water hardness was adjusted to 15°dH or 6°dH by adding CaCl₂ , MgCl₂ and NaHCO₃ (Ca²⁺ :Mg²⁺ : HCO₃^- = 4:1:7.5 or 2:1:4.5) .

Таблица 3 Композиция: Модельное моющее средство B (вес. %)Table 3 Composition: Model Detergent B (wt%)NaOH, пеллеты (>99%)NaOH, pellets (>99%)1,051.05Линейная алкилбензолсульфоновая кислота (LAS) (97%)Linear alkylbenzenesulfonic acid (LAS) (97%)7,207.20Лаурилсульфат натрия (SLES) (28%)Sodium lauryl sulfate (SLES) (28%)10,5810.58Соевая жирная кислота (>90%)Soy fatty acid (>90%)2,752.75Кокосовая жирная кислота (>99%)Coconut fatty acid (>99%)2,752.75Спиртоэтоксилат (AEO) с 8 моль EO; Lutensol TO 8 (~100%)Alcohol ethoxylate (AEO) with 8 mol EO; Lutensol TO 8 (~100%)6,606.60Триэтаноламин (100%)Triethanolamine (100%)3,333.33Цитрат Na, дегидратированный (100%)Na citrate, dehydrated (100%)2,002.00DTMPA; диэтилентриаминпентакис(метилен)пентакис(фосфоновая кислота), гептанатриевая соль (Dequest 2066 C) (~42% в виде Na7 соли)DTMPA; diethylenetriaminepentakis(methylene)pentakis(phosphonic acid), heptanasodium salt (Dequest 2066 C) (~42% as Na7 salt)0,480.48MPG (>98%)MPG (>98%)6,006.00EtOH, пропан-2-ол (90/10%)EtOH, propan-2-ol (90/10%)3,003.00Глицерин (>99,5%)Glycerin (>99.5%)1,711.71Формиат натрия (>95%)Sodium Formate (>95%)1,001.00PCA (40% в виде натриевой соли)PCA (40% as sodium salt)0,460.46Вода доWater up100100Таблица 4 Композиция: Модельное моющее средство J (вес. %)Table 4 Composition: Model Detergent J (wt%)гидроксид натрия (>99%)sodium hydroxide (>99%)0,500.50Линейная алкилбензолсульфоновая кислота (LAS) (97%)Linear alkylbenzenesulfonic acid (LAS) (97%)5,005.00алкилсульфат натрия (90%)sodium alkyl sulfate (90%)5,005.00AEOS, сульфат натрий(C12)алкилового эфира (70,5%)AEOS, sodium (C12) alkyl ether sulfate (70.5%)10,0010.00Кокосовая жирная кислота (>99%)Coconut fatty acid (>99%)1,001.00Спиртоэтоксилат (AEO) с 7 моль EO (99,5%)Alcohol ethoxylate (AEO) with 7 mol EO (99.5%)5,005.00MEA, моноэтаноламин (99,5%)MEA, monoethanolamine (99.5%)0,200.20MPG (>98%)MPG (>98%)3,003.00EtOH, пропан-2-ол (90/10%)EtOH, propan-2-ol (90/10%)1,501.50DTPA, диэтилентриаминпентауксусная кислота, пентанатриевая соль, (~40% в виде соли Na5)DTPA, diethylenetriaminepentaacetic acid, pentasodium salt, (~40% as Na5 salt)0,100.10цитрат натрия (>99%)sodium citrate (>99%)4,004.00формиат натрия (>99%)sodium formate (>99%)1,001.00Вода доWater up100100

После стирки текстильные материалы промывали в водопроводной воде и избыток воды удаляли из текстильных материалов с применением фильтровальной бумаги и непосредственно после этого текстильные материалы высушивали при 100°C в течение 15 минут.After washing, the textiles were washed in tap water, and excess water was removed from the textiles using filter paper, and immediately afterwards, the textiles were dried at 100° C. for 15 minutes.

Моющую способность измеряли по изменению цвета промытого загрязненного текстильного материала. Загрязнение представляло собой сливки, смешанные с аннатто. Аннатто содержит красящее вещество норбиксин, который действует как индикатор pH с изменением цвета в зависимости от pH. Активность липазы приводит к высвобождению свободных жирных кислот из ацилглицерола сливок, и это приводит к снижению pH и, следовательно, к изменению цвета индикатора pH норбиксина. Поэтому моющую эффективность липазы можно выразить как степень изменения цвета света, отраженного от стираемого загрязненного текстильного материала при освещении белым светом.Washing power was measured by the color change of the washed contaminated textile material. The contamination was cream mixed with annatto. Annatto contains the coloring agent norbixin, which acts as a pH indicator, changing color with pH. The activity of the lipase results in the release of free fatty acids from the acylglycerol of the cream and this results in a decrease in pH and hence a discoloration of the norbixin pH indicator. Therefore, the washing effectiveness of lipase can be expressed as the degree of color change of the light reflected from the washed soiled textile material when illuminated with white light.

Измерения цвета проводили с помощью профессионального планшетного сканера (EPSON EXPRESSION 11000XL, Atea A/S, Lautrupvang 6, 2750 Баллеруп, Дания), который применяли для фиксирования изображения вымытого загрязненного текстильного материала. Для получения значения интенсивности света со сканированных изображений, значения 24-битного пиксельного изображения преобразовывали в значения для красного, зеленого и синего цвета (RGB).Color measurements were taken with a professional flatbed scanner (EPSON EXPRESSION 11000XL, Atea A/S, Lautrupvang 6, 2750 Ballerup, Denmark) which was used to capture the image of the washed contaminated textile. To obtain the light intensity value from the scanned images, the 24-bit pixel image values were converted to red, green, and blue (RGB) values.

Изменение цвета из-за активности липазы измеряли как изменение отражающей способности зеленого света (G) относительно значения интенсивности света (Int), рассчитанное как:The color change due to lipase activity was measured as the change in green light reflectance (G) relative to the light intensity value (Int), calculated as:

Относительная моющая эффективность (RP(мытье)) липазы относительно контрольной липазы была рассчитана как:The relative washing efficiency (RP(wash)) of lipase relative to control lipase was calculated as:

RP(мытье) = (G/Int(исследуемая липаза) - G/Int(без фермента)) / (G/Int(эталонная липаза) - G/Int(без фермента)).RP(wash) = (G/Int(test lipase) - G/Int(no enzyme)) / (G/Int(reference lipase) - G/Int(no enzyme)).

Считается, что липаза демонстрирует улучшенную моющую эффективность, если она более эффективна, чем эталонная (RP(мытье)> 1). В контексте настоящего изобретения эталонный фермент представляет собой липазу, показанную под SEQ ID NO: 2.A lipase is considered to show improved washing performance if it is more effective than the reference (RP(wash) > 1). In the context of the present invention, the reference enzyme is the lipase shown under SEQ ID NO: 2.

Обнаружение запаха с помощью измерений с использованием твердофазного микроэкстракционного газового хроматографа.Odor detection by measurements using a solid phase microextraction gas chromatograph.

Высвобождение масляной кислоты (запаха) из промытых липазой лоскутов измеряли с помощью твердофазной микроэкстракционной газовой хроматографии (SPME-GC) с применением следующего способа.Butyric acid release (odor) from the lipase-washed patches was measured by solid phase microextraction gas chromatography (SPME-GC) using the following method.

Хлопчатобумажное изделие EMPA221, загрязненное смесью сливки-аннато, стирали как указано выше, и после стирки избыток воды удаляли из текстильного материала с применением фильтровальной бумаги и после этого ткань высушивали при 25°C в течение 2 часов. Каждое измерение с помощью SPME-GC проводили с четырьмя кусками простиранного и высушенного текстильного материала (5 мм в диаметре), которые переносили во флакон газового хроматографа (GC) и закрывали флакон. Образцы инкубировали при 30°C в течение 24 часов и затем нагревали до 140°C в течение 30 минут и хранили при 20°C-25°C в течение по меньшей мере 4 часов перед анализом. Анализы проводили на Varian 3800 GC, оснащенном колонкой Stabilwax- DA w/lntegra-Guard (30 м, 0,32 мм ID и 0,25 мкм df) и волокном Carboxen PDMS SPME (85 мкм). Отбор образцов из каждого флакона GC проводили при 50°C в течение 8 минут с использованием волокна SPME в свободном пространстве над кусками текстильного материала и отобранные соединения затем вводили в колонку (температура инжектора=250°C). Скорость потока колонки=2 мл гелий/минута. Градиент температуры термостата колонок: 0 минут=50°C, 2 минуты=50°C, 6 минут 45 секунд=240°C, 11 минут 45 секунд=240°C. Обнаружение проводили с применением детектора ионизации в пламени (FID), а время удерживания масляной кислоты идентифицировали с применением действующих стандартов.The EMPA221 cotton product soiled with cream-annatto mixture was washed as above, and after washing, excess water was removed from the textile material using filter paper, and then the fabric was dried at 25°C for 2 hours. Each measurement using SPME-GC was performed with four pieces of stretched and dried textile material (5 mm in diameter), which were transferred to a gas chromatograph (GC) vial and the vial was closed. Samples were incubated at 30°C for 24 hours and then heated to 140°C for 30 minutes and stored at 20°C-25°C for at least 4 hours before analysis. Analyzes were performed on a Varian 3800 GC equipped with a Stabilwax-DA w/Integra-Guard column (30 m, 0.32 mm ID and 0.25 µm df) and Carboxen PDMS SPME fiber (85 µm). Sampling of each GC vial was performed at 50° C. for 8 minutes using SPME fiber in the headspace over the textile pieces and the selected compounds were then injected into the column (injector temperature=250° C.). Column flow rate=2 ml helium/minute. Column oven temperature gradient: 0 minutes=50°C, 2 minutes=50°C, 6 minutes 45 seconds=240°C, 11 minutes 45 seconds=240°C. Detection was performed using a flame ionization detector (FID) and butyric acid retention time was identified using current standards.

Относительное высвобождение запаха (RP(запах)) липазы является соотношением между количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из лоскута, промытого липазой, и количеством высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из эталонного лоскута, промытого липазой, затем оба значения корректировали с учетом количества высвобожденной масляной кислоты (площадь пика) из лоскута, не промытого липазой (холостая проба). Относительную эффективность в отношении запаха (RP(запах)) рассчитывали в соответствии с представленной ниже формулой:The relative odor release (RP(odor)) of lipase is the ratio between the amount of butyric acid released (peak area) from a lipase-washed flap and the amount of butyric acid released (peak area) from a lipase-washed reference flap, then both values were corrected for the amount released butyric acid (peak area) from a flap not washed with lipase (blank). The relative odor potency (RP(odor)) was calculated according to the formula below:

RP(запах) = (запах(исследуемая липаза) - запах(без фермента)) / (запах(эталонная липаза) - запах(без фермента)).RP(odor) = (odor(test lipase) - odor(no enzyme)) / (odor(reference lipase) - odor(no enzyme)).

При этом запах представляет собой измеренную масляную кислоту (площадь пика), высвобожденную с поверхности текстильного материала.The odor is the measured butyric acid (peak area) released from the surface of the textile.

Соотношение преимущества и фактора риска (RP(мытье)/RP(запах)).Benefit versus risk ratio (RP(wash)/RP(smell)).

Соотношение преимущества и фактора риска (BRF), описывающее моющую эффективность (преимущество) по сравнению с высвобождением запаха (риском) можно определить как RP(мытье)/RP(запах). Если соотношение преимущества и фактора риска для липазы выше 1, то липаза имеет лучшую моющую эффективность относительно высвобожденного запаха по сравнению с эталонной липазой (SEQ ID NO: 2).The Benefit Risk Factor Ratio (BRF) describing cleaning performance (benefit) versus odor release (risk) can be defined as RP(wash)/RP(smell). If the benefit/risk ratio for the lipase is greater than 1, then the lipase has a better wash performance relative to the released odor compared to the reference lipase (SEQ ID NO: 2).

Конструкция с мутациями в белкеProtein mutation constructAMSA, модель J, RP(6°dH, 0,8 г/л)AMSA, model J, RP(6°dH, 0.8 g/l)AMSA, модель B, RP(6°dH, 3,3 г/л)AMSA Model B RP(6°dH, 3.3g/L)AMSA, модель B, RP(15°dH, 3,3 г/л)AMSA Model B RP(15°dH, 3.3g/L)AMSA,
модель J,
RP(6°dH, 0,8 г/л) (запах)amsa,
model J,
RP(6°dH, 0.8 g/l) (smell)SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 21,001.001,001.001,001.001,001.00T231R+N233RT231R+N233R5,505.502,062.064,834.8311,0011.00G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+
R118F+T231R+N233R+P256TG23S+D27N+F51I+E56R+V60E+
R118F+T231R+N233R+P256T2,932.931,221.221,461.462,412.41G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+
K98I+N101D+R118F+T231R+
N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+
K98I+N101D+R118F+T231R+
N233R+T244E+P256T1,051.051,381.381,261.261,781.78G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+
V60K+R118F+T231R+N233R+
T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+
V60K+R118F+T231R+N233R+
T244E+P256T2,662.661,431.431,791.793,183.18G23S+T231R+N233RG23S+T231R+N233R3,733.731,651.652,682.686,636.63D27N+T231R+N233RD27N+T231R+N233R3,973.971,721.724,094.095,085.08A40I+T231R+N233RA40I+T231R+N233R4,834.831,941.943,523.525,165.16F51I+T231R+N233RF51I+T231R+N233R4,824.821,941.943,803.806,456.45F51L+T231R+N233RF51L+T231R+N233R4,174.171,811.813,153.156,766.76E56R+T231R+N233RE56R+T231R+N233R3,753.751,561.562,592.595,525.52D57N+T231R+N233RD57N+T231R+N233R3,903.901,371.372,462.465,425.42V60E+T231R+N233RV60E+T231R+N233R1,871.871,461.461,331.335,765.76V60K+T231R+N233RV60K+T231R+N233R2,562.560,960.96-0,38-0.385,205.20K98I+T231R+N233RK98I+T231R+N233R4,804.802,052.054,564.563,993.99N101D+T231R+N233RN101D+T231R+N233R4,344.342,072.073,213.214,654.65R118F+T231R+N233RR118F+T231R+N233R4,304.302,102.103,243.2410,1210.12G163S+T231R+N233RG163S+T231R+N233R3,303.301,611.612,062.066,606.60Y220F+T231R+N233RY220F+T231R+N233R2,762.760,930.930,420.424,364.36T231R+N233R+T244ET231R+N233R+T244E2,552.551,041.040,080.085,215.21T231R+N233R+P256TT231R+N233R+P256T7,827.822,382.385,715.717,767.76E56R+R118F+T231R+N233RE56R+R118F+T231R+N233R4,964.961,771.772,972.9713,9713.97R118F+T231R+N233R+P256TR118F+T231R+N233R+P256T5,105.101,891.892,682.6812,2212.22A40I+R118F+T231R+N233RA40I+R118F+T231R+N233R2,112.111,221.221,061.065,685.68F51I+E56R+R118F+T231R+N233RF51I+E56R+R118F+T231R+N233R2,692.691,641.640,360.367,597.59F51L+E56R+R118F+T231R+N233RF51L+E56R+R118F+T231R+N233R3,323.321,671.671,521.527,467.46E56R+D57N+R118F+T231R+N233RE56R+D57N+R118F+T231R+N233R2,962.961,311.310,750.759,759.75E56R+V60K+R118F+T231R+N233RE56R+V60K+R118F+T231R+N233R3,143.141,211.211,231.2313,7313.73

Пример 7. Анализ теплового развертывания белков (TSA, оценка теплового сдвига)Example 7 Protein Thermal Unfolding Analysis (TSA, Thermal Shift Estimation)

Тепловое развертывание белка вариантов с SEQ ID NO: 2 контролировали с помощью Sypro Orange (Invitrogen, S-6650) с использованием прибора для ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems; Step-One-Plus).Thermal protein unfolding of the SEQ ID NO: 2 variants was monitored with Sypro Orange (Invitrogen, S-6650) using a real-time PCR instrument (Applied Biosystems; Step-One-Plus).

В 96-луночном белом ПЦР-планшете образец объемом 15 мкл (очищенный фермент, разбавленный в 100 мM EPPS, 0,01% Troton-X-100; pH 8,0) смешивали (1:1) со Sypro Orange (конц. = 10X; исходный раствор от поставщика=5000X) в воде.In a 96-well white PCR plate, a 15 µl sample (purified enzyme diluted in 100 mM EPPS, 0.01% Troton-X-100; pH 8.0) was mixed (1:1) with Sypro Orange (conc. = 10X; stock solution from supplier=5000X) in water.

Планшет запечатывали оптической ПЦР-пленкой. В устройстве для ПЦР устанавливали скорость сканирования при 76°C в час, начиная при 25°C и заканчивая при 96°C.The plate was sealed with optical PCR film. The PCR device was set to scan at 76°C per hour, starting at 25°C and ending at 96°C.

Флуоресценцию контролировали каждые 20 секунд, используя встроенный источник LED, генерирующий голубой свет, для определения возбуждения и ROX-фильтр (610 нм, эмиссия). Значения Tm рассчитывали как максимальное значение первой производной (dF/dK) (Gregory et al., 2009, J. Biomol. Screen. 14: 700).Fluorescence was monitored every 20 seconds using a built-in LED source generating blue light to determine excitation and a ROX filter (610 nm, emission). Tm values were calculated as the maximum value of the first derivative (dF/dK) (Gregory et al., 2009, J. Biomol. Screen. 14: 700).

Конструкция с мутациями в белкеProtein mutation constructTm (ºC)Tm (ºC)SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 272,672.6T231R+N233RT231R+N233R71,571.5G23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256TG23S+D27N+F51I+E56R+V60E+R118F+T231R+N233R+P256T77,377.3G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+
N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+K98I+N101D+R118F+T231R+
N233R+T244E+P256T79,879.8G23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+
N233R+T244E+P256TG23S+D27N+A40I+F51I+E56R+V60K+R118F+T231R+
N233R+T244E+P256T80,080.0G23S+T231R+N233RG23S+T231R+N233R72,672.6D27N+T231R+N233RD27N+T231R+N233R72,472.4A40I+T231R+N233RA40I+T231R+N233R74,074.0F51I+T231R+N233RF51I+T231R+N233R72,272.2F51L+T231R+N233RF51L+T231R+N233R71,971.9E56R+T231R+N233RE56R+T231R+N233R72,372.3D57N+T231R+N233RD57N+T231R+N233R72,172.1V60E+T231R+N233RV60E+T231R+N233R71,171.1V60K+T231R+N233RV60K+T231R+N233R71,671.6K98I+T231R+N233RK98I+T231R+N233R72,072.0N101D+T231R+N233RN101D+T231R+N233R72,372.3R118F+T231R+N233RR118F+T231R+N233R72,772.7G163S+T231R+N233RG163S+T231R+N233R71,971.9Y220F+T231R+N233RY220F+T231R+N233R70,070.0T231R+N233R+T244ET231R+N233R+T244E72,372.3T231R+N233R+P256TT231R+N233R+P256T75,275.2E56R+R118F+T231R+N233RE56R+R118F+T231R+N233R73,173.1R118F+T231R+N233R+P256TR118F+T231R+N233R+P256T75,775.7A40I+R118F+T231R+N233RA40I+R118F+T231R+N233R74,674.6F51I+E56R+R118F+T231R+N233RF51I+E56R+R118F+T231R+N233R74,274.2F51L+E56R+R118F+T231R+N233RF51L+E56R+R118F+T231R+N233R73,973.9E56R+D57N+R118F+T231R+N233RE56R+D57N+R118F+T231R+N233R72,672.6E56R+V60K+R118F+T231R+N233RE56R+V60K+R118F+T231R+N233R73,173.1

Объем описанного и заявленного в данном документе изобретения не должен ограничиваться конкретными аспектами, раскрытыми в данном документе, поскольку эти аспекты предполагаются как иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Предполагается, что любые эквивалентные аспекты находятся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к продемонстрированным и описанным в данном документе станут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Предполагается, что такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. В случае противоречия настоящее раскрытие, в том числе определения, будет иметь преобладающую силу.The scope of the invention described and claimed herein is not to be limited by the specific aspects disclosed herein, as these aspects are intended to be illustrative of certain aspects of the present invention. Any equivalent aspects are intended to be within the scope of the present invention. Indeed, various modifications of the present invention in addition to those shown and described herein will become apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are also intended to be within the scope of the appended claims. In the event of any conflict, this disclosure, including the definitions, shall govern.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

<110> Novozymes A/S<110> Novozymes A/S

<120> ВАРИАНТЫ ЛИПАЗЫ И КОМПОЗИЦИИ В ВИДЕ МИКРОКАПСУЛ, СОДЕРЖАЩИЕ<120> LIPASE VARIANTS AND MICROCAPSULE COMPOSITIONS CONTAINING

ТАКИЕ ВАРИАНТЫ ЛИПАЗЫ SUCH LIPASE VARIANTS

<130> 14608-WO-PCT<130> 14608-WO-PCT

<160> 2<160> 2

<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 807<211> 807

<212> ДНК<212> DNA

<213> Thermomyces lanuginosus<213> Thermomyces lanuginosus

<220><220>

<221> CDS<221> CDS

<222> (1)..(807)<222> (1)..(807)

<220><220>

<221> mat_peptide<221> mat_peptide

<222> (1)..()<222> (1)..()

<400> 1<400> 1

gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat 48gag gtc tcg cag gat ctg ttt aac cag ttc aat ctc ttt gca cag tat 48

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln TyrGlu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 151 5 10 15

tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96tct gca gcc gca tac tgc gga aaa aac aat gat gcc cca gct ggt aca 96

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly ThrSer Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30 20 25 30

aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc gag gta gag aag gcg gat 144aac att acg tgc acg gga aat gcc tgc ccc gag gta gag aag gcg gat 144

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala AspAsn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45 35 40 45

gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct gga gtg ggc gat gtc acc 192gca acg ttt ctc tac tcg ttt gaa gac tct gga gtg ggc gat gtc acc 192

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val ThrAla Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60 50 55 60

ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa ttg atc gtc ctc tct ttc 240ggc ttc ctt gct ctc gac aac acg aac aaa ttg atc gtc ctc tct ttc 240

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser PheGly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 8065 70 75 80

cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc ggg aat ctt aac ttc gac 288cgt ggc tct cgt tcc ata gag aac tgg atc ggg aat ctt aac ttc gac 288

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe AspArg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95 85 90 95

ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336ttg aaa gaa ata aat gac att tgc tcc ggc tgc agg gga cat gac ggc 336

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp GlyLeu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110 100 105 110

ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384ttc act tcg tcc tgg agg tct gta gcc gat acg tta agg cag aag gtg 384

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys ValPhe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125 115 120 125

gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432gag gat gct gtg agg gag cat ccc gac tat cgc gtg gtg ttt acc gga 432

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr GlyGlu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140 130 135 140

cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt gcc gga gca gac ctg cgt 480cat agc ttg ggt ggt gca ttg gca act gtt gcc gga gca gac ctg cgt 480

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu ArgHis Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160145 150 155 160

gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc 528gga aat ggg tat gat atc gac gtg ttt tca tat ggc gcc ccc cga gtc 528

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg ValGly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175 165 170 175

gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576gga aac agg gct ttt gca gaa ttc ctg acc gta cag acc ggc gga aca 576

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly ThrGly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190 180 185 190

ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624ctc tac cgc att acc cac acc aat gat att gtc cct aga ctc ccg ccg 624

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro ProLeu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205 195 200 205

cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca gag tac tgg atc aaa tct 672cgc gaa ttc ggt tac agc cat tct agc cca gag tac tgg atc aaa tct 672

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys SerArg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220 210 215 220

gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat atc gtg aag ata gaa ggc 720gga acc ctt gtc ccc gtc acc cga aac gat atc gtg aag ata gaa ggc 720

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu GlyGly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240225 230 235 240

atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg gat atc cct 768atc gat gcc acc ggc ggc aat aac cag cct aac att ccg gat atc cct 768

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile ProIle Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255 245 250 255

gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807gcg cac cta tgg tac ttc ggg tta att ggg aca tgt ctt 807

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys LeuAla His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265 260 265

<210> 2<210> 2

<211> 269<211> 269

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Thermomyces lanuginosus<213> Thermomyces lanuginosus

<400> 2<400> 2

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln TyrGlu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 151 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly ThrSer Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr

20 25 30 20 25 30

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala AspAsn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45 35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val ThrAla Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60 50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser PheGly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 8065 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe AspArg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp

85 90 95 85 90 95

Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp GlyLeu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly

100 105 110 100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys ValPhe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val

115 120 125 115 120 125

Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr GlyGlu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140 130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu ArgHis Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

145 150 155 160145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg ValGly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175 165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly ThrGly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190 180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro ProLeu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205 195 200 205

Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys SerArg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser

210 215 220 210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu GlyGly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly

225 230 235 240225 230 235 240

Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile ProIle Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro

245 250 255 245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys LeuAla His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265 260 265

<---<---

Claims (18)

Translated fromRussian

1. Вариант исходной липазы, при этом вариант обладает липазной активностью, его последовательность на по меньшей мере 60%, но менее чем на 100%, идентична SEQ ID NO: 2 и предусматривает замену, соответствующую R118F.1. A variant of the parent lipase, wherein the variant has lipase activity, its sequence is at least 60% but less than 100% identical to SEQ ID NO: 2 and includes a substitution corresponding to R118F.2. Вариант по п. 1, предусматривающий замену, соответствующую R118F+T231R+N233R.2. Option according to claim 1, providing a replacement corresponding to R118F + T231R + N233R.3. Вариант по любому из пп. 1 или 2, который представляет собой вариант исходной липазы, выбранной из группы, состоящей из полипептида, последовательность которого на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95% идентична, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 2.3. Option according to any one of paragraphs. 1 or 2, which is a variant of the parent lipase selected from the group consisting of a polypeptide whose sequence is at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% identical, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% or 100% identical to SEQ ID NO: 2.4. Вариант по любому из пп. 1-3, где вариант характеризуется последовательностью, на по меньшей мере 60%, на по меньшей мере 65%, на по меньшей мере 70%, на по меньшей мере 75%, на по меньшей мере 80%, на по меньшей мере 85%, на по меньшей мере 90%, на по меньшей мере 95%, на по меньшей мере 96%, на по меньшей мере 97%, на по меньшей мере 98% или на по меньшей мере 99%, но менее чем на 100%, идентичной SEQ ID NO: 2.4. Option according to any one of paragraphs. 1-3, where the variant is characterized by a sequence of at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85% , at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% but less than 100%, identical to SEQ ID NO: 2.5. Композиция для очистки поверхности, содержащая вариант по любому из пп. 1-4.5. Composition for cleaning the surface, containing the option according to any one of paragraphs. 1-4.6. Композиция по п. 5, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.6. Composition according to claim 5, additionally containing a surfactant.7. Применение варианта по любому из пп. 1-4 для гидролиза субстрата липазы.7. Application of the option according to any one of paragraphs. 1-4 for hydrolysis of the lipase substrate.8. Способ очистки поверхности, включающий приведение поверхности в контакт с вариантом по любому из пп. 1-4.8. The method of cleaning the surface, including bringing the surface into contact with the option according to any one of paragraphs. 1-4.9. Способ гидролиза субстрата липазы, включающий обработку субстрата липазы вариантом липазы по любому из пп. 1-4.9. A method for hydrolyzing a lipase substrate, comprising treating the lipase substrate with a lipase variant according to any one of paragraphs. 1-4.10. Полинуклеотид, кодирующий вариант по любому из пп. 1-4.10. Polynucleotide encoding a variant according to any one of paragraphs. 1-4.11. Конструкция нуклеиновой кислоты для экспрессии варианта липазы по любому из пп. 1-4, содержащая полинуклеотид по п. 10, где полинуклеотид функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют продуцированием варианта липазы в рекомбинантной клетке-хозяине.11. A nucleic acid construct for expression of a lipase variant according to any one of paragraphs. 1-4, containing a polynucleotide according to claim 10, where the polynucleotide is operably linked to one or more regulatory sequences that control the production of a lipase variant in the recombinant host cell.12. Вектор экспрессии для экспрессии варианта липазы по любому из пп. 1-4, содержащий полинуклеотид по п. 10 или конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 11.12. An expression vector for the expression of a lipase variant according to any one of paragraphs. 1-4 containing a polynucleotide according to claim 10 or a nucleic acid construct according to claim 11.13. Клетка-хозяин для экспрессии варианта липазы по любому из пп. 1-4, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по п. 11 или вектор экспрессии по п. 12.13. A host cell for expression of a lipase variant according to any one of paragraphs. 1-4 containing the nucleic acid construct of claim 11 or the expression vector of claim 12.14. Способ получения варианта липазы, включающий:14. A method for producing a lipase variant, including:a) культивирование клетки-хозяина по п. 13 в условиях, подходящих для экспрессии варианта; иa) culturing the host cell according to claim 13 under conditions suitable for expression of the variant; andb) выделение варианта.b) variant highlighting.15. Композиция в виде микрокапсул для использования в композиции по п. 5 или 6, где мембрана микрокапсулы получена путем сшивания полиразветвленного полиамина с молекулярным весом более 1 кДа, при этом микрокапсула содержит вариант липазы по любому из пп. 1-4.15. Composition in the form of microcapsules for use in the composition according to claim 5 or 6, where the microcapsule membrane is obtained by cross-linking a polybranched polyamine with a molecular weight of more than 1 kDa, while the microcapsule contains a lipase variant according to any one of paragraphs. 1-4.16. Жидкий продукт для использования в композиции по п. 5 или 6, содержащий композицию в виде микрокапсул по п. 15.16. A liquid product for use in a composition according to claim 5 or 6, containing a microcapsule composition according to claim 15.