RU2447083C1 - NOVEL FUNCTIONALLY ACTIVE, HIGHLY PURE, STABLE CONJUGATE OF INTERFERON α WITH POLYETHYLENE GLYCOL, REPRESENTED BY ONE PEG- NαH-IFN POSITIONAL ISOMER, WITH IMPROVED IMMUNOGENICITY, WITH PROLONGED BIOLOGICAL ACTION, SUITABLE FOR MEDICAL APPLICATION, AND IMMUNOLOGICAL AGENT BASED THEREON - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to obtaining PEGylated interferon alpha (IFN-alpha), and can be used in medicine. A conjugate of IFN-alpha with monomethoxypolyethylene glycol, bonded to N-terminal IFN-cysteine alpha of general formula

, is obtained, where: n is a whole number from 454 to 1000; m is a whole number ≥4; NαH-IFN is interferon-α-2b, having interferon alpha activity.

EFFECT: obtained conjugate has IFN-alpha activity and prolonged biological action, which enables its use in pharmaceutical compositions and as a medicinal agent for preventing or treating viral and oncological diseases and diseases accompanied by primary or secondary immunodeficiency states.

23 cl, 9 dwg, 6 tbl, 20 ex

Description

Translated fromRussian

Настоящее изобретение относится к фармацевтике и медицине, а именно к новым физиологически активным конъюгатам интерферона, в частности к новым коньюгатам интерферона с полиэтиленгликолем, которые могут быть использованы в медицине, например, для лечения вирусных, иммунных и онкологических заболеваний.The present invention relates to pharmaceuticals and medicine, in particular to new physiologically active interferon conjugates, in particular to new interferon conjugates with polyethylene glycol, which can be used in medicine, for example, for the treatment of viral, immune and oncological diseases.

Интерфероны (ИФН) - это группа биологически активных белков или гликопротеидов, продуцируемых различными клетками в ответ на вирусную инфекцию или при воздействии на клетки некоторых химических и биологических веществ (Isaacs&Lindeman, 1957; Pestka et al., 2007). Связывание ИФН с клеточными рецепторами приводит к индукции синтеза целого ряда внутриклеточных белков, которые опосредуют противовирусное, иммуномодулирующее и антипролиферативное действие ИФН (Pestka et al., 2004; Bekisz, 2004).Interferons (IFN) are a group of biologically active proteins or glycoproteins produced by various cells in response to a viral infection or when certain chemical and biological substances are exposed to cells (Isaacs & Lindeman, 1957; Pestka et al., 2007). The binding of IFN to cellular receptors leads to the induction of the synthesis of a number of intracellular proteins that mediate the antiviral, immunomodulatory and antiproliferative effects of IFN (Pestka et al., 2004; Bekisz, 2004).

Гены различных ИФН человека были клонированы и экспрессированы в бактериальных и животных клетках, в результате были получены и очищены многие рекомбинантные ИФН (Pestka et al., 2004; Pestka, 2007). Лекарственные препараты, содержащие рекомбинантные ИФН, применяются в клинической практике для лечения целого ряда вирусных, онкологических и иммунных заболеваний (Pestka et al., 2004; Chevaliez&Pawlotsky, 2009).The genes of various human IFNs were cloned and expressed in bacterial and animal cells; as a result, many recombinant IFNs were obtained and purified (Pestka et al., 2004; Pestka, 2007). Medicines containing recombinant IFNs are used in clinical practice to treat a range of viral, oncological and immune diseases (Pestka et al., 2004; Chevaliez & Pawlotsky, 2009).

В настоящее время препараты на основе ИФН применяются в клинической практике для лечения целого ряда вирусных, онкологических и иммунных заболеваний (Pestka et al., 2004). Наиболее широкое использование препараты ИФН получили для лечения вирусных гепатитов (Chevaliez&Pawlotsky, 2009), представляющих одну из наиболее серьезных социальных проблем. В настоящее время в мире насчитывается около 350 млн хронически больных гепатитом В и 170 млн больных гепатитом С (Marcellin, 2009). Заболевание гепатитом С в большинстве случаев приобретает хроническое течение с формированием тяжелых исходов - цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (Modi&Liang, 2008). По данным ВОЗ, с 1961 года в США и странах Западной Европы хронические гепатиты и циррозы печени, как причина смерти, переместились с 10 на 5 место (Marcellin, 2009). Известно также применение препаратов, содержащих ИФН-α, для лечения ряда лейкозов и солидных опухолей, в том числе рецедивирующей меланомы (Bukowski et al., 2002; Decantris et al., 2002; Qintas-Cardama et al., 2006).Currently, IFN-based drugs are used in clinical practice to treat a range of viral, oncological and immune diseases (Pestka et al., 2004). Ifn drugs were most widely used for the treatment of viral hepatitis (Chevaliez & Pawlotsky, 2009), which represent one of the most serious social problems. Currently, there are about 350 million chronically ill hepatitis B patients and 170 million hepatitis C patients worldwide (Marcellin, 2009). In most cases, hepatitis C disease acquires a chronic course with the formation of severe outcomes - liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (Modi & Liang, 2008). According to the WHO, since 1961, chronic hepatitis and cirrhosis of the liver, as a cause of death, have moved from 10th to 5th place in the USA and Western Europe (Marcellin, 2009). It is also known to use preparations containing IFN-α for the treatment of a number of leukemia and solid tumors, including relapsing melanoma (Bukowski et al., 2002; Decantris et al., 2002; Qintas-Cardama et al., 2006).

Эффективность действия препаратов нативных ИФН ограничена быстрым всасыванием из подкожных тканей, большим объемом распределения, относительно низкой стабильностью, коротким периодом полувыведения, высокой иммуногенностью и токсичностью (Wills, 1990). В результате, в течение нескольких часов после введения наблюдается быстрое падение концентрации ИФН в плазме крови, при этом интерферон не определяется в плазме уже через 24 ч после инъекции (Chatelut et al., 1999). Снижение концентрации интерферона создает условия для возобновления репликации вируса и увеличения концентрации вирусных частиц (Lam et al., 1997). Поэтому возникает необходимость частых введений препарата для достижения эффективных терапевтических концентраций в плазме крови, что приводит к возникновению дозозависимых побочных эффектов. Вследствие указанных особенностей монотерапия хронического гепатита С (ХГС) ИФН-α2b в течение 12 мес приводила к устойчивому вирусологическому ответу всего у 15-20% пациентов, у больных с генотипом Iв и высокой вирусологической нагрузкой эффективность препарата не наблюдалась вовсе (Mc Hutchinson et al., 1998).The efficacy of native IFN drugs is limited by rapid absorption from subcutaneous tissues, large distribution volume, relatively low stability, short half-life, high immunogenicity and toxicity (Wills, 1990). As a result, within a few hours after administration, a rapid decrease in the concentration of IFN in the blood plasma is observed, while interferon is not detected in the plasma 24 hours after the injection (Chatelut et al., 1999). A decrease in the concentration of interferon creates the conditions for the resumption of virus replication and an increase in the concentration of viral particles (Lam et al., 1997). Therefore, there is a need for frequent injections of the drug to achieve effective therapeutic plasma concentrations, which leads to dose-related side effects. Due to these features, monotherapy of chronic hepatitis C (CGS) IFN-α2b for 12 months led to a stable virological response in only 15-20% of patients; in patients with genotype Ib and high virological load, the drug was not observed at all (Mc Hutchinson et al. , 1998).

Терапевтическая эффективность ИФН может быть повышена при использовании препаратов пролонгированного действия, в частности - «ПЭГилированных» ИФН (Manns et al., 2001; Hadziyannis et al., 2004; Zeuzem et al., 2001).The therapeutic efficacy of IFN can be enhanced by the use of sustained release drugs, in particular “PEGylated” IFN (Manns et al., 2001; Hadziyannis et al., 2004; Zeuzem et al., 2001).

Получение ПЭГилированных ИФН заключается в химическом связывании молекулы интерферона с полимером - монометоксиполиэтиленгликолем (мПЭГ), состоящим из повторяющихся субъединиц этиленоксида с метокси-группой на одном конце и гидроксильной группой - на другом. Молекула мПЭГ может иметь различную молекулярную массу и стереохимическую структуру (линейная или разветвленная). Для проведения реакции ПЭГилирования гидроксильную группу на конце мПЭГ активируют различными реактивными функциональными группами. Активированный мПЭГ может ковалентно связываться с белком в одном или в нескольких местах, что зависит от природы активированной группы и условий реакции (Zaiipsky&Hums, 1997; Roberts et al., 2002).The preparation of PEGylated IFN consists in the chemical binding of an interferon molecule to a polymer, monomethoxypolyethylene glycol (mPEG), consisting of repeating subunits of ethylene oxide with a methoxy group at one end and a hydroxyl group at the other. The mPEG molecule may have a different molecular weight and stereochemical structure (linear or branched). To carry out the PEGylation reaction, the hydroxyl group at the end of the MPEG is activated by various reactive functional groups. Activated MPEG can covalently bind to a protein in one or more places, depending on the nature of the activated group and the reaction conditions (Zaiipsky & Hums, 1997; Roberts et al., 2002).

ПЭГилирование ИФН приводит к улучшению фармакокинетики, увеличению времени полувыведения из крови, снижению колебаний концентрации в крови, снижению иммуногенности и токсичности, увеличению активности in vivo (при снижении активности in vitro); увеличению стабильности (Glue et al., 2000; Reddy et al., 2001).PEGylation of IFN leads to an improvement in pharmacokinetics, an increase in the half-life of blood, a decrease in blood concentration fluctuations, a decrease in immunogenicity and toxicity, an increase in in vivo activity (with a decrease in in vitro activity); increased stability (Glue et al., 2000; Reddy et al., 2001).

Снижение активности в системе in vitro напрямую зависит от молекулярной массы используемого ПЭГ. Присоединение небольших молекул ПЭГ с молекулярной массой ≤5000 Да вызывает незначительные изменения активности in vitro (Grace et al., 2005). Фармакодинамические и фармакокинетические свойства ПЭГилированных белков, содержащих ПЭГ с такой массой, и немодифицированных белков практически не различаются. Присоединение ПЭГ с большей молекулярной массой и множественными участками приводит к значительному снижению биоактивности in vitro, в результате неэффективного связывания с рецептором, однако в этом случае наблюдается улучшение фармакокинетических и фармакодинамических свойств ПЭГилированных белков (Delgado et al., 1992), что в результате приводит к увеличению биологической активности in vivo (Bailon&Berthold, 1998). Форма ПЭГ также оказывает влияние на биоактивность и фармакокинетические свойства - коньюгат с линейным ПЭГ распространяется на больший объем, чем с ПЭГ, имеющим разветвленную структуру (Caliceti et al., 2003).The decrease in activity in the in vitro system directly depends on the molecular weight of the PEG used. The addition of small PEG molecules with a molecular mass of ≤5000 Da causes minor changes in in vitro activity (Grace et al., 2005). The pharmacodynamic and pharmacokinetic properties of PEGylated proteins containing PEG with such a mass, and unmodified proteins practically do not differ. The addition of PEG with a higher molecular weight and multiple sites leads to a significant decrease in in vitro bioactivity as a result of ineffective binding to the receptor, however, in this case, the pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of PEGylated proteins are improved (Delgado et al., 1992), which results in an increase in biological activity in vivo (Bailon & Berthold, 1998). The form of PEG also has an effect on bioactivity and pharmacokinetic properties - a conjugate with linear PEG extends to a larger volume than with a PEG with a branched structure (Caliceti et al., 2003).

Противовирусная активность и биологические свойства коньюгатов ПЭГ-ИФН в значительной степени зависят также от используемых активированных мПЭГ, функциональные группы которых различаются по способности модифицировать различные аминокислотные остатки белка и по типу образуемых с белком химических связей (Roberts et al., 2002). При получении ПЭГилированных белков наиболее широкое применение нашли активированные мПЭГи, способные связываться со свободными аминогруппами белков (сукцинимидилкарбонатные, сукцинимидилсукцинатные, трезилатные, триазиновые, гидроксисукцинимидные эфиры, ацетальальдегиды и др.).The antiviral activity and biological properties of PEG-IFN conjugates also largely depend on the activated MPEG used, whose functional groups differ in their ability to modify various amino acid residues of the protein and in the type of chemical bonds formed with the protein (Roberts et al., 2002). In the preparation of pegylated proteins, activated mPEGs that can bind to the free amino groups of proteins (succinimidyl carbonate, succinimidyl succinate, trasylate, triazine, hydroxysuccinimide esters, acetaldehyde, etc.) found the widest application.

Из уровня техники известны различные коньюгаты ПЭГ-ИФН.Various PEG-IFN conjugates are known in the art.

Известен коньюгат ПЭГ-ИФН-α2а с линейным ПЭГ с молекулярной массой 1-5000 Да (Патент U.S. No.5,382,657, 1995). Для конъюгации использовали этандиольные производные мПЭГ, реакцию проводили при рН=10 при комнатной температуре в течение 0,5-4 час. Для проведения реакции ПЭГилирования ИФН использовали 3-кратный избыток ПЭГ. В используемых условиях связывание ПЭГ с ИФН происходило через стерически доступные свободные аминогруппы различных лизинов (Lys-31, Lys133, Lys134, Lys23, Lys131, Lys121, Lys70, Lys83, Lys49 и Lys112) с образованием карбамидной связи (Monkarsh et al., 1997). Таким образом, полученный коньюгат ПЭГ-ИФН-α2а состоял из смеси позиционных изомеров, где каждый изомер содержал один ПЭГ. В сравнении с немодифицированным ИФН удельная противовирусная активность изомеров варьировала от 6% (для Lys1l2) до 40% (для Lys133). Суммарная удельная активность полученного коньюгата, состоящего из 11 изомеров, составляла 34% от немодифицированного ИФН. Активность полученных коньюгатов in vitro также зависела от молекулярной массы ПЭГ и варьировала от 45% (для ПЭГ - 2500 Да) до 25% (в случае ПЭГ - 10000 Да). Недостатками полученного коньюгата являются:Known conjugate PEG-IFN-α2a with linear PEG with a molecular weight of 1-5000 Yes (Patent U.S. No.5,382,657, 1995). For conjugation, ethanediol derivatives of MPEG were used; the reaction was carried out at pH = 10 at room temperature for 0.5–4 hours. For the PEGylation reaction of IFN, a 3-fold excess of PEG was used. Under the conditions used, the binding of PEG to IFN occurred through sterically accessible free amino groups of various lysines (Lys-31, Lys133, Lys134, Lys23, Lys131, Lys121, Lys70, Lys83, Lys49 and Lys112) with the formation of a urea bond (Monkarsh et al., 1997) . Thus, the resulting PEG-IFN-α2a conjugate consisted of a mixture of positional isomers, where each isomer contained one PEG. Compared with unmodified IFN, the specific antiviral activity of the isomers ranged from 6% (for Lys1l2) to 40% (for Lys133). The total specific activity of the obtained conjugate, consisting of 11 isomers, was 34% of unmodified IFN. The activity of the obtained conjugates in vitro also depended on the molecular weight of PEG and varied from 45% (for PEG - 2500 Da) to 25% (in the case of PEG - 10000 Da). The disadvantages of the resulting conjugate are:

1. Использование этандиол-активированных мПЭГ с низкой молекулярной массой (≤5000 Да), в результате чего фармакокинетические параметры полученного коньюгата ПЭГ-ИФН и немодифицированного ИФН различались незначительно, в связи с чем данный коньюгат не нашел применения в клинике.1. The use of ethanediol-activated MPEG with a low molecular weight (≤5000 Da), as a result of which the pharmacokinetic parameters of the resulting PEG-IFN conjugate and unmodified IFN did not differ significantly, and therefore this conjugate was not used in the clinic.

2. Образование большого количества позиционных изомеров с различной удельной активностью, в которых ПЭГ был связан с молекулой ИФН через свободные аминогруппы различных лизинов.2. The formation of a large number of positional isomers with different specific activity, in which PEG was bound to the IFN molecule via free amino groups of various lysines.

Известны коньюгаты ПЭГ-ИФН-α2b, полученные при конъюгации нативного ИФН-α2b с линейным (патент RU 2311930, 2004) или разветвленным (патент RU 2382048, 2008) производными мПЭГ с молекулярной массой 13000-17000 Да. Реакцию проводили при рН 9,5 в течение 60 часов (для линейного мПЭГ) или при рН 7,5 в течение 12 часов (для разветвленного мПЭГ), используя 50-100-кратный молярный избыток активированного ПЭГ. В результате были получены коньюгаты ПЭГ-ИФН, суммарная противовирусная активность которого варьировала от 29 до 38% от активности немодифицированного ИФН. Данных о стабильности связи, количестве позиционных изомеров и их удельной противовирусной активности не приведено. Недостатками полученных коньюгатов являются:Known conjugates of PEG-IFN-α2b obtained by conjugation of native IFN-α2b with linear (patent RU 2311930, 2004) or branched (patent RU 2382048, 2008) mPEG derivatives with a molecular weight of 13000-17000 Da. The reaction was carried out at pH 9.5 for 60 hours (for linear MPEG) or at pH 7.5 for 12 hours (for branched MPEG) using a 50-100-fold molar excess of activated PEG. As a result, PEG-IFN conjugates were obtained, the total antiviral activity of which varied from 29 to 38% of the activity of unmodified IFN. Data on the stability of the bond, the number of positional isomers and their specific antiviral activity are not given. The disadvantages of the obtained conjugates are:

1. Использование трезил-производных активированного мПЭГ с временем полужизни в водных растворах менее 20 мин. Ранее было показано, что при взаимодействии трезилат-производных ПЭГ с белками, помимо стабильных амидных связей через аминогруппы, образуются также нестабильные сульфаматные связи (Gais&Ruppert,1995).1. The use of tresyl derivatives of activated MPEG with a half-life in aqueous solutions of less than 20 minutes It has been previously shown that, in the interaction of tresylate derivatives of PEG with proteins, in addition to stable amide bonds through amino groups, unstable sulfamate bonds are also formed (Gais & Ruppert, 1995).

2. Связывание трезил-активированных ПЭГ с белками происходит через все стерически доступные свободные аминогрупп лизина (Roberts et al., 2002), что приводит к образованию нескольких позиционных изомеров.2. The binding of trisyl-activated PEG to proteins occurs through all sterically accessible free amino groups of lysine (Roberts et al., 2002), which leads to the formation of several positional isomers.

3. Проведение реакции ПЭГилирования ИФН при высоких значениях рН (рН=10) в течение длительного времени (60 час) может привести к изменению структуры ИФН.3. The PEGylation of IFN at a high pH (pH = 10) for a long time (60 hours) can lead to a change in the structure of IFN.

4. Значительный избыток активированного ПЭГ при проведении реакции ПЭГилирования ИФН (молярное соотношение ПЭГ/белок составляло 50-100/1) приводит к высокой стоимости полученного продукта.4. A significant excess of activated PEG during the PEGylation reaction of IFN (molar ratio of PEG / protein was 50-100 / 1) leads to a high cost of the obtained product.

Известен коньюгат ПЭГ-ИФН-α2b, полученный при связывании нативного ИФН-α2b с разветвленным триазиновым производным мПЭГ с молекулярной массой 7500-35000 Да (Патент RU 2298560, 2004), суммарная противовирусная активность которого составляла 6,4% от активности немодифицированного ИФН. Данных о стабильности связи, количестве позиционных изомеров и их удельной противовирусной активности не приведено.Known conjugate PEG-IFN-α2b obtained by binding of native IFN-α2b with a branched triazine derivative of MPEG with a molecular weight of 7500-35000 Da (Patent RU 2298560, 2004), the total antiviral activity of which amounted to 6.4% of the activity of unmodified IFN. Data on the stability of the bond, the number of positional isomers and their specific antiviral activity are not given.

Недостатками полученного коньюгата являются:The disadvantages of the resulting conjugate are:

1. Использование триазин-хлорид производных активированного мПЭГ, которые помимо свободных аминогрупп способны связываться с функциональными группами других аминокислот - серина, тирозина, треонина и гистидина, что приводит к появлению множества изомеров, часть из которых характеризуется нестабильной связью. Более того, триазиновые производные в настоящее время не используются из-за их высокой токсичности (Veronese&Pasut, 2005).1. The use of triazine chloride derivatives of activated MPEG, which, in addition to free amino groups, can bind to functional groups of other amino acids - serine, tyrosine, threonine and histidine, which leads to the appearance of many isomers, some of which are characterized by an unstable bond. Moreover, triazine derivatives are not currently used due to their high toxicity (Veronese & Pasut, 2005).

2. Низкая удельная активность коньюгата ПЭГ-ИФН.2. Low specific activity of the conjugate PEG-IFN.

Известен коньюгат ПЭГ-ИФН-α2а, полученый при коньгации ИФН-α2а с разветвленным ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа (патент RU 2180595, 1997). Для конъюгации использовали N-гидроксисукцинимид-эфир производное мПЭГ, избирательно взаимодействующий с доступными свободными аминогруппами белка с образованием стабильной амидной связи. Реакцию проводили при рН 9 при 4°С в течение 2 часов при соотношении мПЭГ/белок, равном трем. Реакцию останавливали и очистку полученного коньюгата проводили на сорбенте Fractogel EMD CM 650 (М). Выход очищенного коньюгата составлял 40-45%. В этом случае был получен коньюгат ИФН-ПЭГ, состоящий из 6 позиционных изомеров, каждый из которых был связан с одной молекулой ПЭГ стабильной связью через свободные аминогруппы лизинов - Lys31, Lys121, Lys 131, Lys 134, Lys 70 и Lys 83 (Bailon et al., 2001; Foser et al., 2003). Изомеры, связанные с ПЭГ, через лизины в положении 31, 121, 131 и 134, в сумме составляли 94%. Активность суммарного коньюгата, состоящего из 6 позиционных изомеров, составляла 1-7% от нативного ИФН-α2а (Bailon et al., 2001; Boulestin et al., 2006). Несмотря на низкую противовирусную активность in vitro, данный коньюгат по сравнению с немодифицированным ИФН обладал улучшенными фармакокинетическими свойствами (Silva et al., 2006, Boulestin et al., 2006), и в настоящее время используется в клинике под названием «Пегасис» (производство фирмы "Хоффманн-Ля Рош).Known conjugate PEG-IFN-α2a obtained by skating IFN-α2a with branched PEG with a molecular weight of 40 kDa (patent RU 2180595, 1997). For conjugation, an N-hydroxysuccinimide ester derivative of MPEG was used selectively to interact with available free amino groups of the protein to form a stable amide bond. The reaction was carried out at pH 9 at 4 ° C for 2 hours with a mPEG / protein ratio of three. The reaction was stopped and the resulting conjugate was purified on a Fractogel EMD CM 650 (M) sorbent. The yield of purified conjugate was 40-45%. In this case, an IFN-PEG conjugate was obtained consisting of 6 positional isomers, each of which was linked to one PEG molecule by a stable bond through the free amino groups of lysines — Lys31, Lys121, Lys 131, Lys 134,Lys 70, and Lys 83 (Bailon et al., 2001; Foser et al., 2003). The isomers associated with PEG, through lysines at position 31, 121, 131, and 134, totaled 94%. The activity of the total conjugate, consisting of 6 positional isomers, was 1-7% of the native IFN-α2a (Bailon et al., 2001; Boulestin et al., 2006). Despite the low antiviral activity in vitro, this conjugate, in comparison with unmodified IFN, had improved pharmacokinetic properties (Silva et al., 2006, Boulestin et al., 2006), and is currently used in a clinic called “Pegasys” (manufactured by "Hoffmann-La Roche).

Недостатками полученного коньюгата являются:The disadvantages of the resulting conjugate are:

1. Использование N-гидроксисукцинимид-эфир активированного ПЭГа, связывающегося со всеми стерически доступными аминогруппами, в результате полученный коньюгат представлял смесь из 6 изомеров, различающихся по удельной активности.1. The use of activated PEG N-hydroxysuccinimide ester, which binds to all sterically accessible amino groups; as a result, the resulting conjugate was a mixture of 6 isomers differing in specific activity.

2. Низкая противовирусная удельная активность полученного коньюгата in vitro.2. Low antiviral specific activity of the obtained conjugate in vitro.

Прототипом для настоящего изобретения является коньюгат ПЭГ-ИФН-α2b, описанный в патенте US 5,951,974, 1999. Для реакции ПЭГилирования использовали линейный мПЭГ, активированный сукцинимидил карбонатной группой (SC-mPEG) с молекулярной массой от 5000 до 12000 Да. По описанному методу был получен коньюгат ИФН с ПЭГ с молекулярной массой 12 кДа, который настоящее время применяется в клинике для лечения вирусных гепатитов - препарат «Пегинтрон» (фирма "Shering-Plough", США).The prototype for the present invention is the PEG-IFN-α2b conjugate described in US Pat. No. 5,951,974, 1999. A linear mPEG activated by succinimidyl carbonate group (SC-mPEG) with a molecular weight of 5000 to 12000 Da was used for the PEGylation reaction. According to the described method, a conjugate of IFN with PEG with a molecular weight of 12 kDa was obtained, which is currently used in the clinic for the treatment of viral hepatitis - the drug "Pegintron" (firm "Shering-Plow", USA).

Установлено, что полученный коньюгат ПЭГ-ИФН-α2b (препарат «Пегинтрон») состоит из 13 позиционных изомеров, каждый из которых содержит одну молекулу ПЭГ, присоединенную к различным участкам молекулы белка (Wang et al., 2000; Grace et al., 2001; Youngster et al., 2002). Было показано, что молекула ПЭГ была связана с интерфероном не только через свободные аминогруппы лизинов (Lys 31 Lys 49, Lys 83, Lys 121, Lys 131, Lys 133, Lys 134 и Lys 164) и N-концевого цистеина (Cys 1), но и через имидазольное кольцо гистидина (His 7, His 34), тирозина (Туr 129) и ОН-группу серина (Ser 163). Содержание отдельных изомеров варьировало от 0,8 (Туr 129) до 47% (His 34). Противовирусная активность суммарного препарата Пегинтрона, состоящего из 13 позиционных изомеров, составляла 28% от нативного белка. Удельная активность отдельных изомеров варьировала от 11 до 37% от нативного ИФН-α2b (Youngster et al., 2002). Наибольшая удельная активность была у основного изомера, сконьюгированного с ПЭГ через His 34, которая составляла 37% от нативного белка. Свободные аминогруппы ИФН были соединены с ПЭГ через стабильную связь, тогда как в основном изомере, составляющим примерно 47%, ПЭГ был соединен с имидазольным кольцом гистидина (His 34) через нестабильную (в водных растворах) карбаматную связь (Roberts et al., 2002).It was found that the obtained PEG-IFN-α2b conjugate (Pegintron preparation) consists of 13 positional isomers, each of which contains one PEG molecule attached to different sections of the protein molecule (Wang et al., 2000; Grace et al., 2001 ; Youngster et al., 2002). It was shown that the PEG molecule was associated with interferon not only through the free amino groups of lysines (Lys 31 Lys 49, Lys 83, Lys 121, Lys 131, Lys 133, Lys 134 and Lys 164) and N-terminal cysteine (Cys 1), but also through the imidazole ring of histidine (His 7, His 34), tyrosine (Tyr 129) and the OH group of serine (Ser 163). The content of individual isomers varied from 0.8 (Tur 129) to 47% (His 34). The antiviral activity of the total Pegintron preparation, consisting of 13 positional isomers, amounted to 28% of the native protein. The specific activity of individual isomers ranged from 11 to 37% of the native IFN-α2b (Youngster et al., 2002). The highest specific activity was in the main isomer conjugated to PEG via His 34, which amounted to 37% of the native protein. The free amino groups of IFN were coupled to PEG via a stable bond, while in the main isomer of approximately 47%, PEG was linked to the imidazole histidine ring (His 34) via an unstable (in aqueous solutions) carbamate bond (Roberts et al., 2002) .

Фармакокинетические параметры полученного коньюгата были лучше, чем у немодифицированного ИФН (Silva et al., 2006).The pharmacokinetic parameters of the resulting conjugate were better than those of unmodified IFN (Silva et al., 2006).

Недостатками полученного коньюгата являются:The disadvantages of the resulting conjugate are:

1. Использование сукцинимидил карбонат активированного ПЭГа связывающегося не только со свободными аминогруппами ИФН, но и с функциональными группами других аминокислот. В результате полученный коньюгат состоял из смеси 13 позиционных изомеров, различающихся по противовирусной удельной активности.1. The use of succinimidyl carbonate activated PEG that binds not only to the free amino groups of IFN, but also to the functional groups of other amino acids. As a result, the resulting conjugate consisted of a mixture of 13 positional isomers differing in antiviral specific activity.

2. Образование нестабильной имидазол-карбонатной (карбаматной) связи в основном (His-34) изомере коньюгата ПЭГ-ИФН приводит к тому, что при попадании в организм препарат «Пегинтрон» гидролизуется и высвобождается нативный ИФН, который оказывает биологическое действие. Таким образом, препарат «Пегинтрон» лучше всего расценивать как про-лекарство, которое после введения в организм расщепляется с образованием активного интерферона (Foster, 2004). Из-за нестабильности ПЭГ-ИФН в растворе лекарственная форма «Пегинтрона» хранится только в виде лиофильно-высушенного порошка.2. The formation of an unstable imidazole-carbonate (carbamate) bond in the main (His-34) isomer of the PEG-IFN conjugate leads to the fact that when the Pegintron preparation enters the body, the native IFN, which exerts a biological effect, is released. Thus, the Pegintron preparation is best regarded as a pro-drug that, after being introduced into the body, breaks down to form active interferon (Foster, 2004). Due to the instability of PEG-IFN in solution, the Pegintron dosage form is stored only as a freeze-dried powder.

Задача настоящего изобретения состояла в получении нового стабильного коньюгата ПЭГилированного ИФН, с активностью ИФН альфа, состоящего из одного позиционного изомера, с улучшенной стабильностью, со сниженной иммуногенностью, с улучшенными фармакокинетическими параметрами, с оптимальным сочетанием параметров молекулярной массы ПЭГ и противовирусной активности, пригодного для создания лекарственного препарата медицинского назначения, способствующего расширению арсенала лекарственных средств заданной направленности, фармацевтической композиции на основе полученного ПЭГ-ИФН.The objective of the present invention was to obtain a new stable conjugate of pegylated IFN, with the activity of IFN alpha, consisting of one positional isomer, with improved stability, with reduced immunogenicity, with improved pharmacokinetic parameters, with the optimal combination of molecular weight parameters of PEG and antiviral activity suitable for creating medicinal product for medical purposes, contributing to the expansion of the arsenal of drugs of a given focus, pharmaceutics eskoy composition based on the resulting PEG-IFN.

Поставленная задача решается созданием новой молекулы функционально активного коньюгата ПЭГ-ИФН с активностью интерферона-альфа, в котором линейная молекула ПЭГ с молекулярной массой от 10 до 40000 Да связана с молекулой ИФН-α стабильной связью строго через альфа-аминогруппу N-концевого цистеина так, что общая формула коньюгата ПЭГ-ИФН с линейным мПЭГ представляет собой следующее соединение (I):The problem is solved by creating a new molecule of a functionally active PEG-IFN conjugate with interferon-alpha activity, in which a linear PEG molecule with a molecular weight of 10 to 40,000 Da is connected to the IFN-α molecule by a stable bond strictly through the alpha-amino group of the N-terminal cysteine so, that the general formula of the PEG-IFN conjugate with linear mPEG is the following compound (I):

где n - целые значения от 227 до 10 000;where n are integer values from 227 to 10,000;

m - целое число ≥4;m is an integer ≥4;

IFN - природный или рекомбинантный полипептид, обладающий активностью ИФН-альфа.IFN is a natural or recombinant polypeptide having IFN-alpha activity.

В полученном коньюгате линейный ПЭГ с молекулярной массой 10000 - 40000 Да связан с альфа-аминогруппой N-концевой аминокислоты ИФН.In the resulting conjugate, a linear PEG with a molecular weight of 10,000 - 40,000 Da is bound to the alpha-amino group of the N-terminal amino acid of IFN.

Избирательность модификации ИФН строго по альфа-аминогруппе N-концевой аминокислоты достигается за счет использования альдегид-активированных мПЭГ общей формулы (II) и проведения реакции ПЭГилирования при рН≤6:The selectivity of IFN modification strictly according to the alpha-amino group of the N-terminal amino acid is achieved through the use of aldehyde-activated mPEGs of the general formula (II) and the PEGylation reaction at pH≤6:

где n - целые значения от 227 до 10000, так что молекулярная масса ПЭГ составляет примерно 10000-40000 Да;where n is an integer value from 227 to 10000, so that the molecular weight of the PEG is approximately 10000-40000 Yes;

m - целое число ≥4.m is an integer ≥4.

Оптимальное соотношение параметров молекулярной массы ПЭГ и противовирусной активности достигается за счет использования активированного мПЭГ (II) со значением m≥4.The optimal ratio of the parameters of the molecular weight of PEG and antiviral activity is achieved through the use of activated MPEG (II) with a value of m≥4.

Снижение иммуногенности, токсичности и улучшение фармакокинетических параметров достигается за счет увеличения молекулярной массы присоединенного ПЭГ.The decrease in immunogenicity, toxicity and improvement of pharmacokinetic parameters is achieved by increasing the molecular weight of the attached PEG.

Новым по сравнению с прототипом является:New in comparison with the prototype is:

1. Для получения коньюгата ПЭГ-ИФН использованы альдегидные производные активированных мПЭГ.1. To obtain the conjugate PEG-IFN used aldehyde derivatives of activated mPEG.

2. Структурная формула коньюгата ПЭГ-ИФН.2. The structural formula of the conjugate PEG-IFN.

3. Полученный коньюгат ПЭГ-ИФН представлен одним позиционным изомером.3. The resulting PEG-IFN conjugate is represented by one positional isomer.

4. Стабильная связь между молекулой ПЭГ и молекулой ИФН.4. A stable bond between the PEG molecule and the IFN molecule.

5. Увеличение молекулярной массы коньюгата ПЭГ-ИФН за счет размера присоединенного ПЭГ.5. The increase in molecular weight of the conjugate PEG-IFN due to the size of the attached PEG.

6. Улучшенные фармакокинетические параметры.6. Improved pharmacokinetic parameters.

Для получения заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН был использован рекомбинантный ИФН-α2b человека (производство ЗАО «Биокад») и бутир- или пентальалдегидные производные мПЭГ формулы (II) с молекулярной массой 20000 Да.To obtain the inventive PEG-IFN conjugate, recombinant human IFN-α2b was used (manufactured by Biocad CJSC) and butyric or pentalaldehyde mPEG derivatives of formula (II) with a molecular weight of 20,000 Da.

Реакцию коньюгирования проводили при рН ниже 6.0 в присутствии восстанавливающего агента при температуре, равной или ниже 20°С. Молярное соотношение ПЭГ/белок составляло 2,5-5/1. Контроль образования коньюгата ПЭГ-ИФН проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС) в восстанавливающих условиях и обратно-фазной высокоэффективной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Очистку моноПЭГ-ИФН от продуктов реакции, немодифицированного ИФН и от нежелательных форм ПЭГ-ИФН, содержащих две и более молекулы ПЭГ на молекулу белка, проводили при помощи хроматографии на катионообменных сорбентах. Элюцию моноПЭГ-ИФН проводили градиентом концентрации хлористого натрия от 0,05 до 0,2 М в буферном растворе с рН ниже 6. Очищенный препарат моноПЭГ-ИФН диализовали против 10-50 мМ буферного раствора с рН 4-5, добавляли соли, или полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпирролидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты и неионные детергенты и хранили в пластиковых или стеклянных флаконах с силиконизированной поверхностью при температуре 4±2°С.The conjugation reaction was carried out at a pH below 6.0 in the presence of a reducing agent at a temperature equal to or lower than 20 ° C. The PEG / protein molar ratio was 2.5-5 / 1. The formation of the PEG-IFN conjugate was monitored by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in the presence of sodium dodecyl sulfate (DDS) under reducing conditions and reverse phase high performance chromatography (RP-HPLC). The purification of mono-PEG-IFN from the reaction products of unmodified IFN and from undesirable forms of PEG-IFN containing two or more PEG molecules per protein molecule was carried out by chromatography on cation-exchange sorbents. Elution of monoPEG-IFN was carried out with a concentration gradient of sodium chloride from 0.05 to 0.2 M in a buffer solution with a pH below 6. The purified preparation of monoPEG-IFN was dialyzed against 10-50 mM buffer solution with a pH of 4-5, salts or polysaccharides were added or polyhydric alcohols, or polyvinylpyrrolidones, or monosaccharides, or amino sugars, or proteins, or amino acids and non-ionic detergents and were stored in plastic or glass vials with a siliconized surface at a temperature of 4 ± 2 ° C.

Для характеристики полученного коньюгата моноПЭГ-ИФН-α2b исследовали его чистоту, гомогенность, физико-химические, биологические и фармакокинетические параметры в сравнении с немодифицированным ИФН.To characterize the obtained monoPEG-IFN-α2b conjugate, its purity, homogeneity, physicochemical, biological, and pharmacokinetic parameters were studied in comparison with unmodified IFN.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурами графического изображения, где представлены:The present invention is illustrated by figures of a graphic image, which presents:

Фиг.1. Кинетика образования коньюгата ИФН-α2b при проведении реакции с использованием бутиральдегидного производного мПЭГ.Figure 1. Kinetics of the formation of conjugate IFN-α2b during the reaction using a butyraldehyde derivative of MPEG.

Фиг.2. Обратно-фазная ВЭЖХ коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b на колонке "Symmetry С18"(4,6×150 mm).Figure 2. Reverse-phase HPLC of the PEG-IFN-α2b conjugate on a Symmetry C18 column (4.6 × 150 mm).

Фиг.3. Электрофоретический анализ коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b в сравнении немодифицированным ИФН-α2b.Figure 3. Electrophoretic analysis of the conjugate PEG-IFN-α2b in comparison with unmodified IFN-α2b.

Фиг.4. MALDI масс-спектры немодифицированного ИФН-α2b и коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b.Figure 4. MALDI mass spectra of unmodified IFN-α2b and conjugate PEG-IFN-α2b.

Фиг.5. Локализация сайта ПЭГилирования в коньюгате ПЭГ-ИФН-α2b. Сравнение масс-спектров триптических пептидов немодифицированного ИФН-α2b (А) и коньюгата ПЭГ-рчИФН-α2 (В) в диапазоне m/z 1200-1400.Figure 5. Localization of the PEGylation site in the PEG-IFN-α2b conjugate. Comparison of the mass spectra of tryptic peptides of unmodified IFN-α2b (A) and conjugate PEG-rchIFN-α2 (B) in the range m / z 1200-1400.

Фиг.6. Динамика изменения концентрации неоптерина в сыворотке после однократного введения коньюгата ПЭГ-ИФН в различных дозах.6. The dynamics of changes in serum neopterin concentration after a single dose of PEG-IFN conjugate in various doses.

Фиг.7. Термостабильность коньюгата ПЭГ-ИФН-α2.7. Thermostability of the conjugate PEG-IFN-α2.

Фиг.8. Протеолитическая стабильность коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b при обработке трипсином.Fig. 8. Proteolytic stability of the conjugate PEG-IFN-α2b when treated with trypsin.

Фиг.9. Иммуногенность коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b в сравнении с немодифицированным ИФН-α2b.Fig.9. Immunogenicity of the conjugate PEG-IFN-α2b compared with unmodified IFN-α2b.

Фиг.10. Фармакокинетика коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b в сравнении с немодифицированным ИФН-α2b.Figure 10. Pharmacokinetics of the PEG-IFN-α2b conjugate compared with unmodified IFN-α2b.

Примеры конкретного выполнения способа получения ПЭГ-ИФН-α2b и исследования его свойств приведены ниже.Examples of specific performance of the method of obtaining PEG-IFN-α2b and study of its properties are given below.

Коньюгаты ПЭГ-ИФН-α2 формулы (I), являющиеся объектом настоящего изобретения, могут быть использованы для получения лекарственных средств для профилактики и/или лечения вирусных заболеваний, поскольку помимо высокой стабильности и сниженной иммуногенности обладают высоким значением противовирусной активности. Также фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента эффективное количество коньюгата формулы (I) и получаемые известными методами, применяемыми в фармацевтике, могут использоваться как отдельно, так и совместно с другими терапевтическими средствами (например, рибавирин) для профилактики и/или лечения вирусных заболеваний (хронический активный гепатит (в частности, гепатиты В и С) (Jay et al, 2006; Mc Hutchison et al, 2009). Объектом настоящего изобретения также является способ профилактики и/или лечения вирусных заболеваний, например гепатита С и гепатита В, включающий введение терапевтически эффективного количества заявляемого коньюгата формулы (I).The conjugates of PEG-IFN-α2 of the formula (I), which are the object of the present invention, can be used to obtain drugs for the prevention and / or treatment of viral diseases, because in addition to high stability and reduced immunogenicity, they have a high antiviral activity. Also, pharmaceutical compositions containing as an active ingredient an effective amount of a conjugate of the formula (I) and obtained by known methods used in pharmaceuticals can be used both individually and in combination with other therapeutic agents (e.g., ribavirin) for the prevention and / or treatment of viral diseases (chronic active hepatitis (in particular hepatitis B and C) (Jay et al, 2006; Mc Hutchison et al, 2009). The subject of the present invention is also a method for the prevention and / or treatment of viral diseases, Example hepatitis C and hepatitis B, which comprises administering a therapeutically effective amount of the claimed conjugate of formula (I).

Из уровня техники известно также использование ИФН-α и ПЭГилированных интерферонов-α в качестве иммуномодуляторов для лечения онкологических заболеваний, в частности волосатоклеточного лейкоза, папилломатоза гортани, меланомы, почечной карциномы, миелолейкозов, саркомы Капоши (Decatris et al., 2002; Bukowski et al., 2002; Qintas-Cardama et al., 2006; Loquai et al., 2008; Kaehler et al., 2010). На основании известного из уровня техники этиопатогенеза данных заболеваний и применения ИФН-α, а также из коньюгатов для их профилактики и/или лечения, объектами настоящего изобретения являются также лекарственные средства и фармацевтические композиции, содержащие заявляемый коньюгат ПЭГ-ИФН-α в эффективном количестве, обладающие антипролиферативным и иммуномодулирующим действием, которые могут применяться для профилактики и/или лечения онкологических заболеваний и заболеваний, сопровождающихся первичными или вторичными иммунодефицитными состояниями, а также объектом настоящего изобретения является способ профилактики и/или лечения онкологических заболеваний и заболеваний, сопровождающихся первичными или вторичными иммунодефицитными состояниями, включающий введение терапевтически эффективного количества коньюгата ПЭГ-ИФН-α формулы (I).The use of IFN-α and PEGylated interferon-α as immunomodulators for the treatment of cancer, in particular hairy cell leukemia, laryngeal papillomatosis, melanoma, renal carcinoma, myeloid leukemia, Kaposi’s sarcoma (Decatris et al., 2002; Bukowski et al. ., 2002; Qintas-Cardama et al., 2006; Loquai et al., 2008; Kaehler et al., 2010). Based on the known etiopathogenesis of these diseases and the use of IFN-α, as well as conjugates for their prevention and / or treatment, the present invention also relates to pharmaceutical preparations and pharmaceutical compositions containing the claimed conjugate PEG-IFN-α in an effective amount, possessing antiproliferative and immunomodulatory effects that can be used for the prevention and / or treatment of cancer and diseases accompanied by primary or secondary immunodeficiencies fitsitnymi states, and the present invention is a method for the prevention and / or treatment of cancer and diseases associated with primary or secondary immunodeficiency, comprising administering a therapeutically effective amount of conjugate PEG-IFN-α of formula (I).

Коньюгат формулы (I) с необязательным фармакологически приемлемым наполнителем, разбавителем и/или фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно или каким-либо другим подходящим способом, например, в виде капсул, сиропа, спрея, капель, инъекции или суппозитория. Путь введения варьируют в зависимости, например, от симптомов и возраста, частоту введения и интервал между введениями варьируют в зависимости от заболевания и его тяжести или от цели (терапевтическое или профилактическое использование), эффективное количество активного начала ПЭГ-ИФН-α выбирается с учетом вышеизложенных факторов.A conjugate of formula (I) with an optional pharmacologically acceptable excipient, diluent and / or pharmaceutically acceptable excipients is administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly or in any other suitable way, for example, in the form of capsules, syrup, spray, drops, injections or suppository. The route of administration varies, for example, depending on symptoms and age, the frequency of administration and the interval between administrations vary depending on the disease and its severity or on the purpose (therapeutic or prophylactic use), the effective amount of the active principle of PEG-IFN-α is selected taking into account the foregoing factors.

В качестве фармацевтически приемлемых вспомогательных компонентов, которые могут входить в фармацевтическую композицию с ПЭГ-ИФН-α2, могут быть использованы: буферные соли (например, ацетатный, цитратный, водород-карбонатный, фосфатный буферы), стабилизаторы (например, полисорбаты, ЭДТА, поливинилпирролидоны, декстраны, ЧСА, эфиры параоксибензойной кислоты, спирты (например, бензиловый спирт), фенолы, сорбиновая кислота), обеззараживающий компонент (например, бензиловый спирт), регулятор осмотического давления (например, хлорид натрия, хлорид калия, полиолы, например, глицерин, арабитол, сорбитол, маннитол, лактоза, декстран), сурфактанты (например, ЧСА, поливинилпирролидон, лецитин, Твин 80, полиоксиэтилен-полиоксипропилен сополимер, казеин), поверхностно-активные вещества (например, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, пропиленоксида и этиленоксида, сорбитанмонолаурат, сложный эфир сорбита, сложный эфир жирной кислоты полиглицирина, кокамид DEA лаурилсульфат, алканоламид, стеарит полиоксиэтилен пропилен гликоля, лауриновый эфир полиоксиэтилена, цетиловый эфир полиоксиэтилена, полисорбат, моностеарат глицерина, дистеарат глицерина, монопальмитат сорбита, сорбитанмоноолеат полиоксиэтилена, сорбитанмонолаурат полиоксиэтилена и моностеарат пропиленгликоля), антиоксиданты (например, Трилон Б, L-цистеин, сульфит натрия, аскорбат натрия, глутатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотриитол, цистеингидрохлорид моногидрат, аскорбиновая кислота) и разбавители (например, вода).As pharmaceutically acceptable auxiliary components that can be included in the pharmaceutical composition with PEG-IFN-α2, buffer salts (e.g., acetate, citrate, hydrogen-carbonate, phosphate buffers), stabilizers (e.g., polysorbates, EDTA, polyvinylpyrrolidones can be used) , dextrans, HSA, paraoxybenzoic acid esters, alcohols (e.g. benzyl alcohol), phenols, sorbic acid), a disinfecting component (e.g. benzyl alcohol), an osmotic pressure regulator (e.g. sodium chloride, chl potassium chloride, polyols, e.g. glycerin, arabitol, sorbitol, mannitol, lactose, dextran), surfactants (e.g. HSA, polyvinylpyrrolidone, lecithin,tween 80, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer, casein), surfactants (e.g. block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide, propylene oxide and ethylene oxide, sorbitan monolaurate, sorbitol ester, polyglycyrin fatty acid ester, cocamide DEA lauryl sulfate, alkanolamide, stearite polyoxyethylene propylene glycol, polyoxyethylene lauric ether, cetyl lyoxyethylene, polysorbate, glycerol monostearate, glycerol distearate, sorbitol monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monooleate and polyoxyethylene sorbitan monolaurate and propylene glycol monostearate), antioxidants (for example, Trilon B, L-cysteine, sodium sulfite, acrylhydrochloride, dicarboxylic acid dibenolate ascorbic acid) and diluents (e.g. water).

Пример 1Example 1

Получение коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b с использованием бутиральдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 20 кДаPreparation of PEG-IFN-α2b Conjugate Using a Butyraldehyde Derivative of MPEG with a Molecular Weight of 20 kDa

К 785 мл буферного раствора (100 мМ натрий-ацетата, 150 мМ натрия хлористого, рН 5,0), содержащего рекомбинантный ИФН-α2 в концентрациии 1,7 мг/мл, добавляли 16 мл 1М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 5 г сухого бутиральдегидного производного ПЭГ с молекулярной массой 20000 дальтон. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 22 часов при температуре 17±3°С. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС. Для этого к отобранной пробе добавляли 1/3 объема буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% ДДС, 0,005% бромфеноловый синий, и нагревали 3 мин на кипящей водяной бане. Пробы в объеме 5 мкл вносили в лунки подготовленных пластин ПААГ и проводили электрофорез в 12,5% ПААГ в присутствии ДДС. По окончании электрофореза гель окрашивали при помощи Кумасси R-250. Кинетика образования коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 представлена на фиг.1. В момент времени, когда содержание ПЭГ-ИФН составляло более 70%, реакционную смесь разводили в 10 раз 5 мМ натрий ацетатным буфером, рН 5,0.To 785 ml of a buffer solution (100 mM sodium acetate, 150 mM sodium chloride, pH 5.0) containing recombinant IFN-α2 at a concentration of 1.7 mg / ml, 16 ml of a 1M sodium cyanoborohydride solution was added, mixed and 5 g was added. dry butyraldehyde derivative of PEG with a molecular weight of 20,000 daltons. The mixture was thoroughly mixed and incubated for 22 hours at a temperature of 17 ± 3 ° C. At different time intervals, 50 μl aliquots were taken from the reaction mixture and the kinetics of the formation of the PEG-IFN-α2 conjugate were analyzed using the SDS page electrophoresis method in the presence of DDS. For this, 1/3 of the buffer containing 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 20% glycerol, 3% DDS, 0.005% bromphenol blue was added to the sample, and heated for 3 min in a boiling water bath. Samples in a volume of 5 μl were introduced into the wells of the prepared PAAG plates and electrophoresis was performed in 12.5% PAAG in the presence of DDS. At the end of electrophoresis, the gel was stained with Coomassie R-250. The kinetics of the formation of the conjugate PEG-IFN-α2 presented in figure 1. At the time when the PEG-IFN content was more than 70%, the reaction mixture was diluted 10 times with 5 mM sodium acetate buffer, pH 5.0.

Пример 2Example 2

Получение коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b с использованием бутиральдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 30 кДаObtaining conjugate PEG-IFN-α2b using butyraldehyde derivative MPEG with a molecular weight of 30 kDa

К 500 мл буферного раствора (50 мМ натрий-ацетата, 150 мМ натрия хлористого, рН 5,0), содержащего рекомбинантный ИФН-α2 в концентрациии 2,2 мг/мл, добавляли 10 мл 1М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 5 г сухого бутиральдегидного производного ПЭГ с молекулярной массой 30000 дальтон. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 28 часов при температуре 17±3°С. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС, как описано в п.1. В момент времени, когда содержание ПЭГ-ИФН составляло более 60%, реакционную смесь разводили в 5 раз 5 мМ натрий ацетатным буфером, рН 5,0.To 500 ml of a buffer solution (50 mM sodium acetate, 150 mM sodium chloride, pH 5.0) containing recombinant IFN-α2 at a concentration of 2.2 mg / ml, 10 ml of a 1M sodium cyanoborohydride solution was added, mixed and 5 g was added. dry butyraldehyde derivative of PEG with a molecular weight of 30,000 daltons. The mixture was thoroughly mixed and incubated for 28 hours at a temperature of 17 ± 3 ° C. At various time intervals, 50 μl aliquots were taken from the reaction mixture and the kinetics of the formation of the PEG-IFN-α2 conjugate were analyzed using the SDS page electrophoresis method in the presence of DDS, as described inparagraph 1. At the time when the PEG-IFN content was more than 60%, the reaction mixture was diluted 5 times with 5 mM sodium acetate buffer, pH 5.0.

Пример 3Example 3

Получение коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b с использованием пропилальдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 40 кДаPreparation of PEG-IFN-α2b Conjugate Using a Propylaldehyde Derivative of MPEG with a Molecular Weight of 40 kDa

К 200 мл буферного раствора (50 мМ натрий-ацетата, 150 мМ натрия хлористого, рН 5,0), содержащего рекомбинантный ИФН-α2 в концентрациии 2,5 мг/мл, добавляли 4 мл 1М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 5 г сухого бутиральдегидного производного ПЭГ с молекулярной массой 40000 дальтон. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 17±3°С.Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС, как описано в п.1. В момент времени, когда содержание ПЭГ-ИФН составляло более 60%, реакционную смесь разводили в 5 раз 5 мМ натрий ацетатным буфером, рН 5,0.To 200 ml of a buffer solution (50 mM sodium acetate, 150 mM sodium chloride, pH 5.0) containing recombinant IFN-α2 at a concentration of 2.5 mg / ml, 4 ml of a 1M sodium cyanoborohydride solution was added, mixed and 5 g was added. dry butyraldehyde derivative of PEG with a molecular weight of 40,000 daltons. The mixture was thoroughly mixed and incubated at a temperature of 17 ± 3 ° C. At various time intervals, 50 μl aliquots were taken from the reaction mixture and the kinetics of PEG-IFN-α2 conjugate formation were analyzed using the SDS page electrophoresis method in the presence of DDS, as described in one. At the time when the PEG-IFN content was more than 60%, the reaction mixture was diluted 5 times with 5 mM sodium acetate buffer, pH 5.0.

Пример 4Example 4

Получение коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b с использованием пентальальдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 20 кДаPreparation of PEG-IFN-α2b Conjugate Using a Pentalaldehyde Derivative of MPEG with a Molecular Weight of 20 kDa

К 100 мл буферного раствора (100 мМ натрий-ацетата, 150 мМ натрия хлористого, рН 5,5), содержащего рекомбинантный ИФН-α2b в концентрациии 2,2 мг/мл, добавляли 2,05 мл 1М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 0,9 г сухого пентальдегидного производного ПЭГ с молекулярной массой 20000 дальтон. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение 24 часов при температуре 6±2°С. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования коньюгата ПЭГ-ИФН при помощи метода электрофореза в ПААГ, как описано в примере 1. В момент времени, когда содержание ПЭГ-ИФН составляло более 70%, реакционную смесь разводили в 10 раз 5 мМ натрий ацетатным буфером, рН 5,0.To 100 ml of buffer solution (100 mM sodium acetate, 150 mM sodium chloride, pH 5.5) containing recombinant IFN-α2b at a concentration of 2.2 mg / ml, 2.05 ml of 1M sodium cyanoborohydride solution was added, mixed and added 0.9 g of a dry pentaldehyde derivative of PEG with a molecular weight of 20,000 daltons. The mixture was thoroughly mixed and incubated for 24 hours at a temperature of 6 ± 2 ° C. At various time intervals, 50 μl aliquots were taken from the reaction mixture and the kinetics of PEG-IFN conjugate formation were analyzed using the PAGE method as described in Example 1. At the time when the PEG-IFN content was more than 70%, the reaction mixture was diluted 10times 5 mM sodium acetate buffer, pH 5.0.

Пример 5Example 5

Очистка коньюгата моноПЭГ-ИФН-α2b при помощи ионообменной хроматографии на катионообменном сорбентеPurification of MonoPEG-IFN-α2b Conjugate Using Ion Exchange Chromatography on a Cation Exchange Sorbent

Разбавленный раствор, полученный в примере 1, наносили на колонку с катиоонообменным сорбентом (СМ-сефароза, 300 мл), уравновешенным 5 мМ натрий ацетатным буфером, рН 5.0, (буфер А) со скоростью 5 мл/мин. Колонку с сорбентом промывали последовательно буфером А и буфером А, содержащим градиент концентрации NaCl от 0,05 до 0,2 М. Из каждой фракции отбирали аликвоты для анализа проб методом электрофореза в ПААГ, как описано в примере 1. Фракции, содержащие моноПЭГилированный коньюгат ПЭГ-ИФН-α2, объединяли, диализовали против 10 объемов 20 мМ натрий ацетатного буфера, содержащего 150 мМ натрия хлористого, проводили стерильную фильтрацию и хранили при температуре 4±2°С.The diluted solution obtained in Example 1 was applied to a column with a cation exchange sorbent (CM-Sepharose, 300 ml) balanced with 5 mM sodium acetate buffer, pH 5.0, (buffer A) at a rate of 5 ml / min. The sorbent column was washed sequentially with buffer A and buffer A containing a NaCl concentration gradient of 0.05 to 0.2 M. Aliquots were taken from each fraction for analysis of the samples by electrophoresis in PAGE, as described in Example 1. Fractions containing mono-PEGylated PEG conjugate -IFN-α2, combined, dialyzed against 10 volumes of 20 mM sodium acetate buffer containing 150 mM sodium chloride, sterile filtration was performed and stored at 4 ± 2 ° C.

Пример 6Example 6

Очистка коньюгата моноПЭГ-ИФН-α2b при помощи ионообменной хроматографии на катионообменном сорбентеPurification of MonoPEG-IFN-α2b Conjugate Using Ion Exchange Chromatography on a Cation Exchange Sorbent

Разбавленный раствор, полученный в примере 4, наносили на колонку с катиоонообменным сорбентом (SP-сефароза, 50 мл), уравновешенным 5 мМ натрий ацетатным буфером, рН 5.0, (буфер А) со скоростью 5 мл/мин. Колонку с сорбентом промывали последовательно буфером "А" и буфером А, содержащим градиент концентрации NaCl от 0,03 до 0,3 М. Из каждой фракции отбирали аликвоты для анализа проб методом электрофореза в ПААГ, как описано в примере 1. Фракции, содержащие моноПЭГилированный коньюгат ПЭГ-ИФН-α2, объединяли, диализовали против 10 объемов 20 мМ натрий ацетатного буфера, содержащего 150 мМ натрия хлористого, проводли стерильную фильтрацию и хранили при температуре 4±2°С.The diluted solution obtained in Example 4 was applied to a column with a cation exchange sorbent (SP-Sepharose, 50 ml) balanced with 5 mM sodium acetate buffer, pH 5.0, (buffer A) at a rate of 5 ml / min. The sorbent column was washed sequentially with buffer “A” and buffer A containing a NaCl concentration gradient of 0.03 to 0.3 M. Aliquots were taken from each fraction for analysis of samples by electrophoresis in SDS page, as described in Example 1. Fractions containing mono-PEGylated PEG-IFN-α2 conjugate was combined, dialyzed against 10 volumes of 20 mM sodium acetate buffer containing 150 mM sodium chloride, sterile filtration was performed and stored at 4 ± 2 ° С.

Пример 7Example 7

Анализ коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b при помощи метода обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографииPEG-IFN-α2b conjugate analysis using reverse phase high performance liquid chromatography

Коньюгат ПЭГ-ИФН-α2, полученный по п.5, разводили 20 мМ натрий-ацетатным буфером рН 5.0 до концентрации 0,1 мг/мл и 100 мкл полученной пробы вносили на колонку Symmetry С18 (4.6×150 mm). Исследование проводили на хроматографе «Breeze» фирмы "Waters" при 214 нм. Из результатов, представленных на фиг.2, следует, что по данным ОФ ВЭЖХ чистота заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 составляет более 99%.The PEG-IFN-α2 conjugate obtained according toclaim 5 was diluted with 20 mM sodium acetate buffer pH 5.0 to a concentration of 0.1 mg / ml and 100 μl of the obtained sample was added to a Symmetry C18 column (4.6 × 150 mm). The study was performed on a Waters Breeze chromatograph at 214 nm. From the results presented in figure 2, it follows that according to RP HPLC, the purity of the inventive conjugate PEG-IFN-α2 is more than 99%.

Пример 8Example 8

Определение уровня эндотоксиновEndotoxin level determination

Содержание бактериальных эндотоксинов (БЭ) в пробах коньюгата ПЭГ-ИФН-α2, приготовленных по п.5 и п.6, определяли in vitro с помощью ЛАЛ-теста (модификация гель-тромб тест) в соответствии с требованиями ОФС 42-0002-00. В работе использовали диагностический многокомпонентный набор фирмы «Associates of CAPE COD, Inc. ЛАЛ-реактив PYROTELL® с чувствительностью 0,03 ЕЭ/мл, контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ, 0,5 мкг во флаконе), воду для ЛАЛ-теста. Из результатов, представленных в табл.1, видно, что содержание БЭ в пробах коньюгата составляет менее 1,5 единиц эндотоксина (еЭ) на мг белка, что гораздо ниже уровня БЭ, допустимого для медицинских препаратов на основе рекомбинантных белков.The content of bacterial endotoxins (BE) in the PEG-IFN-α2 conjugate samples prepared according toclaim 5 andclaim 6 was determined in vitro using the LAL test (gel-thrombus test modification) in accordance with the requirements of the General Pharmacopoeia Monograph 42-0002-00 . In the work we used a diagnostic multicomponent kit of the company Associates of CAPE COD, Inc. PYROTELL® LAL reagent with a sensitivity of 0.03 EU / ml, control endotoxin standard (KSE, 0.5 μg in a vial), water for the LAL test. From the results presented in Table 1, it can be seen that the content of BE in the conjugate samples is less than 1.5 units of endotoxin (eE) per mg of protein, which is much lower than the level of BE allowed for medications based on recombinant proteins.

Табл.1Table 1Содержание бактериальных эндотоксинов в коньюгате ПЭГ-ИФН-α2The content of bacterial endotoxins in the conjugate PEG-IFN-α2Препарат коньюгата ПЭГ-ИФН-α2The drug conjugate PEG-IFN-α2Содержание эндотоксинов (еЭ/мг белка)The content of endotoxins (eE / mg protein)ПЭГ-ИФН-α2, полученный по п.5PEG-IFN-α2 obtained according toclaim 5≤1,5≤1.5ПЭГ-ИФН-α2, полученный по п.6PEG-IFN-α2 obtained according toclaim 6≤1,4≤1.4

Пример 9Example 9

Электрофоретический анализ коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b в сравнении с немодифицированным ИФН-α2bElectrophoretic analysis of the conjugate PEG-IFN-α2b in comparison with unmodified IFN-α2b

Пробу коньюгата ПЭГ-ИФН, полученную по п.5, анализировали методом электрофореза в ПААГ, как описано в п.1. Электрофорез проводили с нагрузкой на лунку 40 мкг белка в нередуцирующих условиях. Окраску белков в геле проводили красителем Кумасси R-250. Одновременно проводили электрофорез немодифицированного ИФН-α2. Коньюгат ПЭГ-ИФН был представлен одной полосой (фиг.3, трек 1). Из электрофореграмм коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 и немодифицированного ИФН-α2, представленных на фиг 3, видно, что коньюгат ПЭГ-ИФН-α имеет более высокую молекулярную массу, чем рчИФН-α (фиг.3, треки 1 и 2). Следует отметить, что методом ЭФ точное значение молекулярной массы для ПЭГилированных белков определить нельзя, так как присоединение гидрофильной молекулы ПЭГ к белку значительно увеличивает радиус Стокса образовавшегося комплекса. В результате продвижение комплекса ПЭГ-белок в геле замедляется и значение его молекулярной массы оказывается значительно выше, чем сумма молекулярных масс белка и ПЭГ.A sample of the PEG-IFN conjugate obtained according toclaim 5 was analyzed by SDS page electrophoresis as described inclaim 1. Electrophoresis was performed with a load of 40 μg of protein per well under non-reducing conditions. Protein gel was stained with Coomassie R-250 dye. At the same time, electrophoresis of unmodified IFN-α2 was performed. The conjugate PEG-IFN was represented by a single lane (figure 3, track 1). From the electrophoregrams of the PEG-IFN-α2 conjugate and the unmodified IFN-α2 shown in Fig. 3, it can be seen that the PEG-IFN-α conjugate has a higher molecular weight than rhIFN-α (Fig. 3, tracks 1 and 2). It should be noted that the exact molecular weight for PEGylated proteins cannot be determined by the EF method, since the addition of a hydrophilic PEG molecule to a protein significantly increases the Stokes radius of the complex formed. As a result, the progress of the PEG-protein complex in the gel slows down and its molecular weight is much higher than the sum of the molecular weights of the protein and PEG.

Пример 10Example 10

Определение молекулярной массы коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 в сравнении с немодифицированным ИФН-α2 методом масс-спектрометрииDetermination of the molecular weight of the conjugate PEG-IFN-α2 in comparison with unmodified IFN-α2 by mass spectrometry

1 мкл пробы коньюгата ПЭГ-ИФН, полученной по п.5, и 0,3 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich 10 мг×мл^-1 в 20% ацетонитриле в воде с 0.5% ТФУ) смешивали и высушивали на воздухе. Аналогичным способом готовили пробу немодифированного ИФН-α2.1 μl of a sample of the PEG-IFN conjugate obtained according toclaim 5, and 0.3 μl of a solution of 2,5-dihydroxybenzoic acid (Aldrich 10 mg × ml^-1 in 20% acetonitrile in water with 0.5% TFA) were mixed and dried in air . In a similar way, a sample of unmodified IFN-α2 was prepared.

Масс-спектры были получены на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER (Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов, в линейном режиме, погрешность измерения средней массы не превышает 10-15 Да.Mass spectra were obtained on an Ultraflex II BRUKER MALDI time-of-flight mass spectrometer (Germany) equipped with a UV laser (Nd). Mass spectra were obtained in the mode of positive ions, in the linear mode, the error in measuring the average mass does not exceed 10-15 Da.

Результаты по масс-спектрометрическому анализу немодифицированного рчИФН-α2 и коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 в диапазоне m/z от 10000 - 50000 приведены на фиг.4. Из фиг.4А видно, что масс-спектр рчИФН-α2 содержит основной пик, соответствующий однозарядному иону[M]⁺ с молекулярной массой 19295 Да.The results of mass spectrometric analysis of unmodified rhIFN-α2 and PEG-IFN-α2 conjugate in the m / z range from 10,000 to 50,000 are shown in Fig. 4. From figa shows that the mass spectrum of rhIFN-α2 contains the main peak corresponding to a singly charged ion [M]⁺ with a molecular weight of 19295 Da.

В масс-спектре коньюгата ПЭГ-ИФН-α2, приведенном на фиг.4 В, представлен размытый основной пик, соответствующий однозарядному иону [М]⁺ с молекулярной массой 40498 Да. Размытость пика связана с гетерогенностью препаратов монометоксиПЭГ. Для коньюгата ПЭГ-ИФН измеренное значение m/z в максимуме пика (40498 Да) совпадает с расчетными данными по сумме молекулярных масс ИФН-α2 (19295 Да) и присоединенного ПЭГ (20000 Да).The PEG-IFN-α2 conjugate mass spectrum shown in FIG. 4B shows the diffuse main peak corresponding to the singly charged [M]⁺ ion with a molecular weight of 40498 Da. Peak blur is associated with the heterogeneity of monomethoxyPEG preparations. For the PEG-IFN conjugate, the measured m / z value at the peak maximum (40498 Da) coincides with the calculated data on the sum of the molecular weights of IFN-α2 (19295 Da) and the attached PEG (20,000 Da).

Пример 11Example 11

Локализация сайта ПЭГилирования в коньюгате ПЭГ-ИФН-α2bLocalization of the PEGylation site in the PEG-IFN-α2b conjugate

К 5 мкл пробы коньюгата ПЭГ-ИФН, полученной по п.5, добавляли 5 мкл раствора модифицированного трипсина (Promega) в 0.05 М NH₄НСО₃ с концентрацией 15 мкг×мл^-1. Гидролиз проводили в течение 16 ч при 37°С, затем к раствору добавляли 10 мкл 0.5% ТФУ в 10% растворе ацетонитрила в воде и тщательно перемешивали. Аналогичным способом готовили пробу немодифированного ИФН. Полученные растворы использовали для получения MALDI-масс-спектров.To 5 μl of the PEG-IFN conjugate sample prepared according toclaim 5, 5 μl of a solution of modified trypsin (Promega) in 0.05 M NH₄ HCO₃ with a concentration of 15 μg × ml^{−1 was} added. The hydrolysis was carried out for 16 h at 37 ° С; then, 10 μl of 0.5% TFA in a 10% solution of acetonitrile in water was added to the solution and thoroughly mixed. In a similar way, a sample of unmodified IFN was prepared. The resulting solutions were used to obtain MALDI mass spectra.

Локализацию сайта связывания ПЭГ с молекулой ИФН определяли путем сравнения масс-спектров триптического гидролизата коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 и немодифицированного рчИФН-α2. В триптическом гидролизате коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 должен отсутствовать пептид, соответствующий участку белка, по которому произошла модификация. В табл.2 представлены масс-спектры экспериментальных триптических пептидов для немодифицированного ИФН-α и коньюгата ПЭГ-ИФН-α2. Из таблицы видно, что масс-спектры триптических пептидов немодифицированного ИФН-α2b практически совпадают с масс-спектрами триптических пептидов коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 (табл.2), но в триптическом переваре коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 отсутствует пептид с молекулярной массой 1313.649 присутствующий в триптическом переваре немодифицированного рчИФН-α2 (см. также фиг.5). Согласно анализу теоретических масс триптического гидролизата ИФН-α2 пик с m/z 1313,649 соответствует N-концевому пептиду белка (табл.2). Его отсутствие в триптическом переваре коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 свидетельствует о модификации N-концевого пептида, который, став тяжелее на массу ПЭГ, находится за пределами исследуемой области спектра. Связывание ПЭГ с молекулой ИФН произошло по единственной свободной аминогруппе, присутствующей в этом пептиде - по аминогруппе N-концевого цистеина.The localization of the PEG binding site with the IFN molecule was determined by comparing the mass spectra of the tryptic hydrolyzate of the PEG-IFN-α2 conjugate and unmodified rhIFN-α2. In the tryptic hydrolyzate of the PEG-IFN-α2 conjugate, there should be no peptide corresponding to the portion of the protein through which the modification occurred. Table 2 shows the mass spectra of experimental tryptic peptides for unmodified IFN-α and PEG-IFN-α2 conjugate. The table shows that the mass spectra of the tryptic peptides of unmodified IFN-α2b practically coincide with the mass spectra of the tryptic peptides of the PEG-IFN-α2 conjugate (Table 2), but there is no peptide with a molecular weight of 1313.649 in the tryptic digest of the PEG-IFN-α2 conjugate present in tryptic digest of unmodified rhIFN-α2 (see also FIG. 5). According to the analysis of the theoretical masses of the tryptic hydrolyzate of IFN-α2, the peak with m / z 1313.649 corresponds to the N-terminal protein peptide (Table 2). Its absence in the tryptic digest of the PEG-IFN-α2 conjugate indicates a modification of the N-terminal peptide, which, having become heavier by the mass of PEG, is outside the studied region of the spectrum. The binding of PEG to the IFN molecule occurred at the only free amino group present in this peptide - at the amino group of the N-terminal cysteine.

Табл.2Table 2Экспериментальные масс-спектры триптических пептидов коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 и немодифицированного ИФН-α2 в сравнении с теоретическими значениямиExperimental mass spectra of tryptic peptides of the conjugate PEG-IFN-α2 and unmodified IFN-α2 in comparison with theoretical valuesЭкспериментально обнаруженные пептиды [М+Н⁺]⁺Experimentally Discovered Peptides [M + H⁺ ]⁺Теоретические пептидыTheoretical peptidesИФН-α2bIFN-α2bКоньюгат ПЭГ-ИФНConjugate PEG-IFNМасса [М+Н⁺]⁺Weight [M + H⁺ ]⁺ПептидPeptideПоследовательностьSequence1313.6491313.649--1313.62661313.62661-121-12CDLPQTHSLGSRCDLPQTHSLGSR1232.7201232.7201232.6731232.6731232.69661232.696613-2213-22RTLMLLAQMRRTLMLLAQMR1076.5981076.5981076.5581076.5581076.59551076.595514-2214-22TLMLLAQMRTLMLLAQMR910.463910.463910.463910.463910.5066910.506624-3124-31ISLFSCLKISLFSCLK2225.9762225.9762225.9282225.9282225.99992225.999932-4932-49DRHDFGFPQEEFGNDRHDFGFPQEEFGN2459.2642459.2642459.2392459.2392459.30022459.300250-7050-70AETIPVLHEMIQQIFAETIPVLHEMIQQIF772.447772.447772.421772.421772.456772.45699-10699-106VIQGVGVTVIQGVGVT902.471902.471902.443902.443902.4941902.4941113-120113-120EDSILAVREdsilavr1030.5901030.5901030.5461030.5461030.58911030.5891113-121113-121EDSILAVRKEdsilavrk741.431741.431741.424741.424741.4042741.4042121-125121-125KYFQRKyfqr750.492750.492750.476750.476750.4760750.4760126-131126-131ITLYLKITLYLK1337.6951337.6951337.6511337.6511337.66701337.6670134-144134-144KYSPCAWEVVRKYSPCAWEVVR1209.5651209.5651209.5391209.5391209.57211209.5721135-144135-144YSPCAWEVVRYSPCAWEVVR1481.7831481.7831481.7351481.7351481.75941481.7594150-162150-162SFSLSTNLQESLRSFSLSTNLQESLR

Пример 12Example 12

Определение специфической противовирусной активности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2bDetermination of the specific antiviral activity of the conjugate PEG-IFN-α2b

В пробах, полученных по п.5 и по п.6, исследовали противовирусную специфическую активность согласно протоколу, описанному в Европейской фармакопее с использованием культуры перевиваемых клеток MBDK, чувствительных к интерферону альфа-типа и вируса везикулярного стоматита (VSV). В табл.3 представлены результаты исследования противовирусной активности. В качестве стандарта был использован международный референс стандарт. Из табл.3 видно что, несмотря на присоединение молекулы ПЭГ с молекулярной массой 20000 Да противовирусная активность полученных коньюгатов составляет 33-45% от активности немодифицированного ИФН-α2. Следует отметить, что коньюгат ПЭГ-ИФН, описанный в способе прототипе, содержащий ПЭГ с молекулярной массой 12000 Да, обладал более низкой активностью (28-30%).In the samples obtained according toclaim 5 andclaim 6, the antiviral specific activity was studied according to the protocol described in the European Pharmacopoeia using a culture of transplantable MBDK cells sensitive to alpha-type interferon and vesicular stomatitis virus (VSV). Table 3 presents the results of a study of antiviral activity. An international reference standard was used as the standard. From table 3 it is seen that, despite the addition of a PEG molecule with a molecular mass of 20,000 Da, the antiviral activity of the resulting conjugates is 33-45% of the activity of unmodified IFN-α2. It should be noted that the PEG-IFN conjugate described in the prototype method, containing PEG with a molecular weight of 12,000 Da, had a lower activity (28-30%).

Табл.3Table 3Удельная противовирусная активность коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 в сравнении с немодифицированным ИФН-α2Specific antiviral activity of the conjugate PEG-IFN-α2 compared with unmodified IFN-α2ПрепаратA drugСпецифическая противовирусная активностьSpecific antiviral activity(МЕ/мг)(IU / mg)% от активности немодифицированного ИФН-α2b% of the activity of unmodified IFN-α2bИФН-α2IFN-α22,1×10⁸2.1 × 10⁸100%one hundred%Коньюгат ПЭГ-ИФН-α2, полученный по п.5PEG-IFN-α2 conjugate obtained according toclaim 50,7×10⁸0.7 × 10⁸33%33%Коньюгат ПЭГ-ИФН-α2, полученный по п.6PEG-IFN-α2 conjugate obtained according toclaim 60,95×10⁸0.95 × 10⁸45%45%

Пример 13Example 13

Определение антипролиферативной активности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2bDetermination of antiproliferative activity of the conjugate PEG-IFN-α2b

Антипролиферативную активность коньюгатов ПЭГ-ИФН in vitro определяли на человеческих клетках линии Daudi (лимфома Беркитта), как описано в работе Borden, et al., 1982, с помощью колориметрического теста с МТТ (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide). В качестве стандарта был использован международный референс стандарт. (Interferon alpha-2b, human, rDNA, E.coli-derived 2nd WHO International Standard 1999 NIBSC Code №95/566). Клетки (2×10⁴) в 100 мкл среды RPMI 1540, содержащей 10%-ную сыворотку эмбриона теленка (ThermoHyclone, кат.№SH30088.03) и 2 мМ глутамина (Gibco, кат.№25030-081), добавляли в лунки планшетов для микротитрования. Серия разведений, содержащих различные концентрации конъюгата ПЭГ-ИФН, полученного по п.5 и п.6, и немодифицированного интерферона-альфа 2b, в серии двухкратных разведений, были добавлены в лунки в объеме 100 мкл. Планшеты инкубировали при 37°С в 5% СO₂ в течение 72 часов. По окончании инкубации к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Multiscan RC на длинах волн 570 и 620 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₂₀ - фон клеток. Относительные активность IFN-a2b и анализируемых коньюгатов PEG-IFN-альфа определяли, сравнивая дозы, вызывающие 50% снижение пролиферации, для стандартного и испытуемых препаратов.The in vitro antiproliferative activity of PEG-IFN conjugates was determined on human Daudi cells (Burkitt’s lymphoma), as described by Borden, et al., 1982, using a colorimetric assay with MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl ) -2,5-Diphenyltetrazolium Bromide). An international reference standard was used as the standard. (Interferon alpha-2b, human, rDNA, E. coli-derived 2nd WHO International Standard 1999 NIBSC Code No. 95/566). Cells (2 × 10⁴ ) in 100 μl of RPMI 1540 medium containing 10% serum of calf embryo (ThermoHyclone, cat. No. SH30088.03) and 2 mM glutamine (Gibco, cat. No. 25030-081) were added to the wells microtiter tablets. A series of dilutions containing various concentrations of the PEG-IFN conjugate obtained according toclaim 5 andclaim 6 and unmodified interferon alfa-2b, in a series of double dilutions, were added to the wells in a volume of 100 μl. The plates were incubated at 37 ° C in 5% CO₂ for 72 hours. At the end of the incubation, a MTT solution (5 mg / ml) in phosphate-buffered saline was added to the cells to a concentration of 0.5 mg / ml and incubated for 3 h under the same conditions. The medium was removed, 100 μl of DMSO was added to the cells, in which the formazan crystals formed in the cells were dissolved, and the optical density was measured on a Multiscan RC spectrophotometer at wavelengths of 570 and 620 nm, where A₅₇₀ is the absorption of formazan and A₆₂₀ is the background of the cells . The relative activity of IFN-a2b and the analyzed PEG-IFN-alpha conjugates was determined by comparing doses causing a 50% reduction in proliferation for standard and test drugs.

В табл.4 представлены результаты исследования. Из табл.4 видно, что антипролиферативная активность полученных коньюгатов составляет 34-40% от активности немодифицированного ИФН-α2. Следует отметить, что коньюгат ПЭГ-ИФН, описанный в способе-прототипе, содержащий ПЭГ с молекулярной массой 12000 Да, обладал более низкой антипролиферативной активностью (28.9%, по данным Grace et al.,2005).Table 4 presents the results of the study. From table 4 it is seen that the antiproliferative activity of the obtained conjugates is 34-40% of the activity of unmodified IFN-α2. It should be noted that the PEG-IFN conjugate described in the prototype method, containing PEG with a molecular weight of 12,000 Da, had lower antiproliferative activity (28.9%, according to Grace et al., 2005).

Табл.4Table 4Антипролиферативная активность коньюгатов ПЭГ-ИФН-α2 в сравнении с немодифицированным ИФН-α2Antiproliferative activity of PEG-IFN-α2 conjugates in comparison with unmodified IFN-α2ПрепаратA drugАнтипролиферативная активностьAntiproliferative activity(МЕ/мг)(IU / mg)% от активности немодифицированного% of unmodified activityИФН-α2IFN-α23,2×10⁸3.2 × 10⁸100%one hundred%Коньюгат ПЭГ-ИФН-α2, полученный по п.5PEG-IFN-α2 conjugate obtained according toclaim 51,1×lO⁸1.1 × lO⁸34%34%Коньюгат ПЭГ-ИФН-α2, полученный по п.6PEG-IFN-α2 conjugate obtained according toclaim 61,3×10⁸1.3 × 10⁸40%40%

Пример 14Example 14

Определение иммуномодулирующей активности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b in vivoDetermination of immunomodulatory activity of the conjugate PEG-IFN-α2b in vivo

Чтобы охарактеризовать иммуномодулирующую активность коньюгата ПЭГ-ИФН, исследовалась его способность стимулировать синтез неоптерина в клетках иммунной системы. Неоптерин является маркером активации клеточного иммунитета (Murr et al., 2002). Индукция синтеза неоптерина в популяции моноцитов/макрофагов и изменение его концентрации в крови является показателем иммуномодулирующей активности исследуемого препарата. Коньюгат ПЭГ-ИФН, полученный по п.5, вводили однократно подкожно здоровым добровольцам в различных дозах (от 0.5 до 2.5 мкг/кг). Через различные интервалы времени после введения коньюгата проводили определение концентрации неоптерина в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА с использованием коммерческой тест-системы фирмы IBL, (Германия)). На Фиг.6 представлены экспериментальные данные, показывающие изменение концентрации неоптерина в сыворотке в ответ на введение коньюгата ПЭГ-ИФН. В зависимости от дозы введенного коньюгата концентрация неоптерина увеличивалась в 3-7 раз по сравнению с контролем. Из результатов следует, что введение препарата вызывало дозозависимое увеличение концентрации неоптерина в сыворотке, обусловленное иммуномодулирующей активностью заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН.In order to characterize the immunomodulating activity of the PEG-IFN conjugate, its ability to stimulate neopterin synthesis in the cells of the immune system was studied. Neopterin is a marker of activation of cellular immunity (Murr et al., 2002). Induction of neopterin synthesis in a population of monocytes / macrophages and a change in its concentration in the blood is an indicator of the immunomodulating activity of the studied drug. The PEG-IFN conjugate obtained according toclaim 5 was administered once subcutaneously to healthy volunteers in various doses (from 0.5 to 2.5 μg / kg). At various time intervals after the introduction of the conjugate, the concentration of neopterin in the blood serum was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA using a commercial test system from IBL (Germany)). Figure 6 presents experimental data showing a change in the concentration of neopterin in serum in response to the introduction of the conjugate PEG-IFN. Depending on the dose of conjugate administered, the neopterin concentration increased 3–7 times compared with the control. From the results it follows that the introduction of the drug caused a dose-dependent increase in the concentration of neopterin in the serum due to the immunomodulating activity of the inventive PEG-IFN conjugate.

Пример 15Example 15

Исследование термостабильности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2bThe study of thermal stability of the conjugate PEG-IFN-α2b

5 мл пробы коньюгата ПЭГ-ИФН, полученного по п.6, помещали в водяную баню при температуре (50±2)°С и через различные интервалы времени исследовали появление мутности в растворе белка, измеряя оптическую плотность при 340 нм. Аналогично проводили исследование термостабильности немодифицированного ИФН-α2. Образование нерастворимых агрегатов белка приводило к появлению мутности и к увеличению оптической плотности при 340 нм. На фиг.7 представлены результаты исследования. За период наблюдения (28 час) коньюгат ПЭГ-ИФН-α2 оставался стабильным, тогда как немодифицированный ИФН-α2b через 28 ч практически весь выпал в осадок.5 ml of the PEG-IFN conjugate sample obtained according toclaim 6 was placed in a water bath at a temperature of (50 ± 2) ° С and the appearance of turbidity in the protein solution was examined at various time intervals by measuring the optical density at 340 nm. A similar study was conducted of the thermal stability of unmodified IFN-α2. The formation of insoluble protein aggregates led to the appearance of turbidity and to an increase in optical density at 340 nm. Figure 7 presents the results of the study. During the observation period (28 hours), the PEG-IFN-α2 conjugate remained stable, while unmodified IFN-α2b almost completely precipitated after 28 hours.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о значительном увеличении термостабильности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 по сравнению с немодифицированным белком.Thus, the data obtained allow us to conclude that a significant increase in the thermal stability of the PEG-IFN-α2 conjugate is compared with unmodified protein.

Пример 16Example 16

Исследование протеолитической стабильности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b при обработке трипсиномThe study of the proteolytic stability of the conjugate PEG-IFN-α2b when treated with trypsin

К 1 мл коньюгата ПЭГ-ИФН, полученному по п.5, прибавляли 150 мкл М трис-HCl буфера, рН 8,5, 2 мкл 0,5 М раствора CaCI₂ и 15 мкл трипсина (Promega) с концентрацией 20 мкг/мл. Пробы инкубировали при 37°С. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты в 100 мкл и прибавляли 150 мкл 0,5% раствора трифторуксусной кислоты для остановки реакции. Аналогично готовили пробы, содержащие немодифицированный ИФН-α2. Далее пробы анализировали при помощи обратно-фазовой ВЭЖХ и определяли площадь основного пика. Результаты исследования, приведенные на фиг.8, показывают, что при обработке трипсином протеолитическая стабильность коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 выше, чем у немодифицированного ИФН-α2b.To 1 ml of PEG-IFN conjugate obtained according toclaim 5, 150 μl of M Tris-HCl buffer, pH 8.5, 2 μl of 0.5 M CaCI₂ solution and 15 μl of trypsin (Promega) with a concentration of 20 μg / ml were added. . Samples were incubated at 37 ° C. At certain time intervals, 100 μl aliquots were taken and 150 μl of a 0.5% trifluoroacetic acid solution was added to stop the reaction. Similarly, samples containing unmodified IFN-α2 were prepared. Next, the samples were analyzed using reverse phase HPLC and the area of the main peak was determined. The results of the study shown in Fig. 8 show that when trypsinized, the proteolytic stability of the PEG-IFN-α2 conjugate is higher than that of unmodified IFN-α2b.

Пример 17Example 17

Определение стабильности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b при храненииDetermination of the stability of the conjugate PEG-IFN-α2b during storage

Из пробы, полученной по п.5, отбирали аликвоты в стерильные пробирки с крышками, типа "Эппендорф". Концентрация белка в коньюгате ПЭГ-ИФН-α2 составляла 1 мг/мл. Пробы помещали в холодильник при температуре (6±2)°С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и анализировали специфическую противовирусную активность и гомогенность препарата при помощи ОФ ВЭЖХ и электрофореза (ЭФ) в ПААГ в присутствии ДДС в нередуцирующих условиях, как описано в п.1. Из данных табл.5 видно, что при хранении при температуре (6±2)°С коньюгат ПЭГ-ИФН-α2 стабилен в течение по крайней мере 24 месяцев.Aliquots were taken from the sample obtained according toclaim 5 into sterile tubes with caps, such as Eppendorf. The protein concentration in the PEG-IFN-α2 conjugate was 1 mg / ml. Samples were placed in a refrigerator at a temperature of (6 ± 2) ° С. At certain intervals, samples were taken and the specific antiviral activity and homogeneity of the preparation were analyzed using RP-HPLC and electrophoresis (EP) in PAGE in the presence of DDS under non-reducing conditions, as described inparagraph 1. From the data in Table 5 it is seen that when stored at a temperature of (6 ± 2) ° С, the conjugate PEG-IFN-α2 is stable for at least 24 months.

Табл. 5Tab. 5Стабильность коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b при температуре (6±2)°СThe stability of the conjugate PEG-IFN-α2b at a temperature of (6 ± 2) ° CПараметрыOptionsСрок хранения (месяцы)Shelf life (months)00336699121218eighteen2424Активность (МЕ/мл)Activity (IU / ml)0,7×10⁸0.7 × 10⁸0,75×10⁸0.75 × 10⁸0,7×10⁸0.7 × 10⁸0,75×10⁸0.75 × 10⁸0.72×10⁸0.72 × 10⁸0.7×10⁸0.7 × 10⁸0,75 ×10⁸0.75 × 10⁸Гомогенность, % (ОФ ВЭЖХ)Homogeneity,% (RP HPLC)99,6799.6799,2899.2899,6199.6199,3099.3099,699.699,2199.2199,3599.35Гомогенность, % (ЭФ в ПААГ)Homogeneity,% (EP in PAGE)≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98≥98

Пример 18Example 18

Исследование иммуногенности коньюгата ПЭГ-ИФН-α2bThe study of the immunogenicity of the conjugate PEG-IFN-α2b

Коньюгаты ПЭГ-ИФН, полученные по п.5 и по п.6, разводили до концентрации 5 млн МЕ/мл и вводили по 200 мкл (1 млн МЕ/мышь) внутримышечно мышам ICR с массой тела 20-22 г 1 раз в неделю, в течение 5 недель (5 групп по 5 мышей в группе). Параллельно готовили пробу немодифицированного ИФН и вводили аналогичным образом мышам также в дозе 1 млн. В конце пятой недели у животных отбирали кровь при помощи ретроорбитальной пункции. Сыворотку крови получали стандартным методом. Титр антител в сыворотках, полученных в результате иммунизации мышей немодифицированным ИФН и коньюгатами ПЭГ-ИФН, определяли при помощи прямого трердофазного иммуноферментного метода (ИФА). Для этого в лунки микропланшета вносили по 100 мкл раствора немодифицированного ИФН-α2 в концентрации 200 нг/100 мкл. Антисыворотки, полученные от разных групп животных, вносили в лунки планшета в серии из последовательных разведений в два раза. Для детекции образовавшегося иммунного комплекса использовали антимышиные иммуноглобулины, сконьюгированные с пероксидазой. Титр антисыворотки после введения немодифицированного ИФН составлял 1/1024. Титр антисывороток после введения коньюгатов ПЭГ-ИФН составлял 1/128. Результаты исследования представлены на фиг.9.PEG-IFN conjugates obtained according toclaim 5 andclaim 6 were diluted to a concentration of 5 million IU / ml and 200 μl (1 million IU / mouse) were administered intramuscularly to ICR mice weighing 20-22 g once a week , for 5 weeks (5 groups of 5 mice per group). In parallel, a sample of unmodified IFN was prepared and similarly administered to mice at a dose of 1 million as well. At the end of the fifth week, blood was collected from animals using retroorbital puncture. Blood serum was obtained by the standard method. The titer of antibodies in sera obtained by immunization of mice with unmodified IFN and PEG-IFN conjugates was determined using the direct enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). For this, 100 μl of a solution of unmodified IFN-α2 at a concentration of 200 ng / 100 μl was added to the wells of the microplate. Antisera obtained from different groups of animals were introduced into the wells of the tablet in a series of serial dilutions twice. Anti-mouse immunoglobulins conjugated with peroxidase were used to detect the formed immune complex. The titer of antiserum after administration of unmodified IFN was 1/1024. The titer of antisera after administration of PEG-IFN conjugates was 1/128. The results of the study are presented in Fig.9.

Таким образом, из полученных результатов следует, что иммуногенность полученных коньюгатов ПЭГ-ИФН-α2 в 8 раз ниже, чем у немодифицированного ИФН.Thus, it follows from the obtained results that the immunogenicity of the obtained PEG-IFN-α2 conjugates is 8 times lower than that of unmodified IFN.

Пример 19Example 19

Исследование фармакокинетики коньюгата ПЭГ-ИФН-α2bThe study of the pharmacokinetics of the conjugate PEG-IFN-α2b

Пробу коньюгата ПЭГ-ИФН, полученного по п.5, в дозе 1 млн ME вводили внутрибрюшинно мышам-самцам. Параллельно другой группе мышей вводили немодифицированный ИФН-α2. Через определенные промежутки времени у животных отбирали кровь при помощи ретроорбитальной пункции. Сыворотку крови получали стандартным методом. Наличие интерферона в сыворотке определяли по противовирусной активности. Результаты фармакокинетики представлены на фиг.10. Из результатов следует, что заявляемый коньюгат ПЭГ-ИФН-α2 обладает значительным пролонгированным эффектом. При введении нативного ИФН-α2 его содержание в крови животных достигало максимума через 1 ч после введения и затем очень быстро снижалось. При введении коньюгата ПЭГ-ИФН максимальное содержание ИФН в крови животных наблюдалось через 12 часов (фиг.10) и этот уровень сохранялся в течение 50 часов и только затем происходило медленное снижение содержания ИФН-α2 в течение 350 час.A sample of the PEG-IFN conjugate obtained according toclaim 5, at a dose of 1 million ME, was administered intraperitoneally to male mice. In parallel to another group of mice, unmodified IFN-α2 was administered. At certain intervals, blood was collected from animals using retroorbital puncture. Blood serum was obtained by the standard method. The presence of interferon in serum was determined by antiviral activity. The results of pharmacokinetics are presented in figure 10. From the results it follows that the inventive conjugate PEG-IFN-α2 has a significant prolonged effect. With the introduction of native IFN-α2, its content in the blood of animals reached a maximum 1 h after administration and then decreased very rapidly. With the introduction of the conjugate PEG-IFN, the maximum content of IFN in the blood of animals was observed after 12 hours (figure 10) and this level was maintained for 50 hours and only then there was a slow decrease in the content of IFN-α2 for 350 hours.

Площадь под кривой (AUC) для заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН более чем в 50 раз превышала соответствующее значение для немодифицированного ИФН. Нужно отметить, что для описанного в способе-прототипе коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b, связанного с ПЭГ с молекулярной массой 12000 Да, величина AUC превышала величину AUC для ИФН всего в 3-10 раз.The area under the curve (AUC) for the inventive PEG-IFN conjugate was more than 50 times the corresponding value for unmodified IFN. It should be noted that for the PEG-IFN-α2b conjugate described in the prototype method associated with PEG with a molecular weight of 12,000 Da, the AUC value exceeded the AUC value for the IFN by only 3-10 times.

Исходя из полученных результатов (фиг.10) были рассчитаны основные фармакокинетические параметры для заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН-α2. Результаты показали, что всасывание из места введения, объем распределения, клиренс коньюгата ПЭГ-ИФН значительно замедлены по сравнению с немодифицированным ИФН, что и обеспечило длительную циркуляцию заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН в крови (более 14 дней).Based on the results obtained (figure 10) were calculated the main pharmacokinetic parameters for the inventive conjugate PEG-IFN-α2. The results showed that absorption from the injection site, volume of distribution, clearance of the PEG-IFN conjugate was significantly slowed down in comparison with unmodified IFN, which ensured long-term circulation of the claimed PEG-IFN conjugate in the blood (more than 14 days).

Пример 20Example 20

Сравнительная характеристика заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b в сравнении с коньюгатом ПЭГ-ИФН-α2b, описанным в способе-прототипеComparative characteristics of the inventive conjugate PEG-IFN-α2b in comparison with the conjugate PEG-IFN-α2b described in the prototype method

Проведено сравнение структуры, основных физико-химических и фармакокинетических параметров заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН-α2b в сравнении с коньюгатом ПЭГ-ИФН-α2b, описанным в способе-прототипе (табл.6). Данные, представленные в табл.5, свидетельствуют о значительном улучшении свойств заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН в сравнении с коньюгатом из способа-прототипа.A comparison of the structure, the main physico-chemical and pharmacokinetic parameters of the inventive conjugate PEG-IFN-α2b in comparison with the conjugate PEG-IFN-α2b described in the prototype method (table 6). The data presented in table 5, indicate a significant improvement in the properties of the inventive conjugate PEG-IFN in comparison with the conjugate from the prototype method.

Табл. 6Tab. 6Основные физико-химические и фармакокинетические параметры заявляемого коньюгата ПЭГ-ИФН-α2 в сравнении с коньюгатом ПЭГ-ИФН-α2, описанном в способе прототипе (US 5,951.974)The main physico-chemical and pharmacokinetic parameters of the inventive conjugate PEG-IFN-α2 in comparison with the conjugate PEG-IFN-α2 described in the prototype method (US 5,951.974)ПараметрыOptionsКоньюгат ПЭГ-ИФНConjugate PEG-IFNЗаявляемый коньюгат ПЭГ-ИФНThe inventive conjugate PEG-IFNКоньюгат, описанный в способе-прототипе (US 5,951,974)The conjugate described in the prototype method (US 5,951,974)ИФНIFNИФН-α2bIFN-α2bИФН-α2bIFN-α2bСтруктура ПЭГPEG structureЛинейныйLinearЛинейныйLinearМолекулярная масса ПЭГ (кДа)Molecular Weight of PEG (kDa)20twenty1212Структурная формула коньюгата ПЭГ-ИФН*The structural formula of the conjugate PEG-IFN *

Удельная активность, % от нативного рчИФНSpecific activity,% ofnative rhIFN40402828Число позиционных изомеровThe number of positional isomers1one1313Тип связи ПЭГ с белкомType of bond PEG with proteinСтабильнаяStableНестабильная (для основного изомера, связанного с ПЭГ через His34)Unstable (for the main isomer bound to PEG via His34)Стабильность в водных растворахStability in aqueous solutionsСтабильныйStableНестабильныйUnstableФармакокинетические параметрыPharmacokinetic parametersОтношение AUC ПЭГ-ИФН/ИФНThe ratio of AUC PEG-IFN / IFN50fifty3-103-10* - Структурная формула коньгата ПЭГ-ИФН, полученного по способу-прототипу, дана по ссылке «WHO Drug Information», 2001, v.15, N.3-4, p.206.* - The structural formula of the pegate PEG-IFN obtained by the prototype method is given by reference "WHO Drug Information", 2001, v.15, N.3-4, p.206.

Claims (23)

Translated fromRussian

1. Стабильный конъюгат ПЭГилированного интерферона-α-2b, представляющий собой один позиционный изомер с монометоксиполиэтиленгликолем, присоединенным к N-концевому цистеину, формулы (I)

где n - целые значения от 454 до 1000;
m - целое число ≥4;
N^αH-IFN - интерферон-α-2b, обладающий активностью интерферона-альфа.1. A stable conjugate of pegylated interferon-α-2b, which is one positional isomer with monomethoxypolyethylene glycol attached to the N-terminal cysteine, of the formula (I)

where n are integer values from 454 to 1000;
m is an integer ≥4;
N^α H-IFN is interferon-α-2b with interferon-alpha activity.2. Конъюгат по п.1, в котором m представляет собой целое число, равное 4.2. The conjugate according to claim 1, in which m is an integer equal to 4.3. Конъюгат по п.1, в котором средняя молекулярная масса полиэтиленгликоля составляет от 10 до 40 кДа.3. The conjugate according to claim 1, in which the average molecular weight of polyethylene glycol is from 10 to 40 kDa.4. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью, содержащая конъюгат общей формулы (I) в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты.4. A pharmaceutical composition having antiviral, antiproliferative and immunomodulating activity, containing an conjugate of the general formula (I) in an effective amount and pharmaceutically acceptable auxiliary components.5. Фармацевтическая композиция по п.4 для применения в качестве лекарственного средства для лечения вирусных и онкологических заболеваний и заболеваний, сопровождающихся первичными или вторичными иммунодефицитными состояниями.5. The pharmaceutical composition according to claim 4 for use as a medicine for the treatment of viral and oncological diseases and diseases accompanied by primary or secondary immunodeficiency states.6. Фармацевтическая композиция по п.5, где вирусное заболевание представляет собой гепатит С или гепатит В.6. The pharmaceutical composition according to claim 5, where the viral disease is hepatitis C or hepatitis B.7. Фармацевтическая композиция по п.5, где онкологическое заболевание представляет собой миелолейкоз.7. The pharmaceutical composition according to claim 5, where the cancer is myeloid leukemia.8. Фармацевтическая композиция по п.5, где онкологическое заболевание представляет собой меланому.8. The pharmaceutical composition according to claim 5, where the cancer is a melanoma.9. Лекарственное средство, включающее конъюгат формулы (I), обладающее противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью.9. A medicament comprising a conjugate of the formula (I) having antiviral, antiproliferative and immunomodulatory activity.10. Лекарственное средство по п.9, включающее буфер, изотонирующий агент, стабилизатор и воду.10. The drug according to claim 9, comprising a buffer, an isotonizing agent, a stabilizer and water.11. Лекарственное средство по п.10, включающее натрия ацетата тригидрат, уксусную кислоту, натрия хлорид, полисорбат 80, ЭДТА, воду для инъекций.11. The drug of claim 10, including sodium acetate trihydrate, acetic acid, sodium chloride, polysorbate 80, EDTA, water for injection.12. Применение конъюгата формулы (I) для получения лекарственного средства, обладающего противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью.12. The use of a conjugate of formula (I) for the manufacture of a medicament having antiviral, antiproliferative and immunomodulatory activity.13. Применение по п.12 для получения лекарственного средства, обладающего противовирусной активностью в отношении гепатита С или гепатита В.13. The use according to claim 12 for the manufacture of a medicament having antiviral activity against hepatitis C or hepatitis B.14. Способ профилактики или лечения вирусных заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата формулы (I).14. A method of preventing or treating viral diseases, comprising administering a therapeutically effective amount of a conjugate of formula (I).15. Способ по п.14, где вирусное заболевание представляет собой гепатит С или гепатит В.15. The method according to 14, where the viral disease is hepatitis C or hepatitis B.16. Способ по п.14, включающий дополнительное введение терапевтически эффективного количества рибавирина.16. The method of claim 14, further comprising administering a therapeutically effective amount of ribavirin.17. Способ профилактики или лечения заболеваний, сопровождающихся первичными или вторичными иммунодефицитными состояниями, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата формулы (I).17. A method for the prevention or treatment of diseases accompanied by primary or secondary immunodeficiency conditions, comprising administering a therapeutically effective amount of a conjugate of formula (I).18. Способ профилактики или лечения онкологических заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата формулы (I).18. A method of preventing or treating cancer, comprising administering a therapeutically effective amount of a conjugate of formula (I).19. Способ по п.18, где онкологическое заболевание представляет собой миелолейкоз.19. The method of claim 18, wherein the cancer is myeloid leukemia.20. Способ по п.18, где онкологическое заболевание представляет собой меланому.20. The method of claim 18, wherein the cancer is melanoma.21. Контейнер для хранения, герметично запаянный в стерильных условиях и соответствующих хранению перед применением, включающий фармацевтическую композицию по п.4.21. A storage container hermetically sealed under sterile conditions and appropriate for storage before use, comprising the pharmaceutical composition of claim 4.22. Контейнер по п.21, где указанный контейнер представляет собой предварительно заполненный шприц, флакон или автоинжектор.22. The container according to item 21, where the specified container is a pre-filled syringe, vial or auto-injector.23. Набор, включающий контейнер по п.22 и инструкцию по применению, предназначенный для профилактики или лечения заболеваний, сопровождающихся первичными или вторичными иммунодефицитными состояниями, онкологических заболеваний, вирусных заболеваний.23. A kit comprising a container according to item 22 and instructions for use, intended for the prevention or treatment of diseases accompanied by primary or secondary immunodeficiency states, cancer, viral diseases.

Images