RU2337957C2 - METHOD OF OBTAINING L-THREONINE OR L-ARGININE USING BACTERIUM, BELONGING TO GENUS Escherichia, IN WHICH GENE fdrA IS INACTIVATED - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry, biotechnology.

SUBSTANCE: invention represents method of obtaining L-threonine or L-arginine using bacterium belonging to genus Escherichia, modified in such way that in said bacterium gene fdrA is inactivated.

EFFECT: obtaining L-threonine or L-arginine with high degree of efficiency.

3 cl, 2 dwg, 3 tbl, 11 ex

Description

Translated fromRussian

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена fdrA в указанной бактерии ослаблена.The present invention relates to the microbiological industry, in particular to a method for producing an L-amino acid using a bacterium of the Enterobacteriaceae family, modified in such a way that the expression of the fdrA gene in this bacterium is weakened.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

Традиционно L-аминокислоты получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов. Как правило, микроорганизмы модифицируют для увеличения продукции L-аминокислот.Traditionally, L-amino acids are produced on an industrial scale by fermentation using strains of microorganisms isolated from natural sources, or their mutants. Typically, microorganisms are modified to increase the production of L-amino acids.

Для увеличения продукции L-аминокислот используются различные методики, включая трансформацию микроорганизма рекомбинантной ДНК (смотри, например, патент США 4278765). Другие методики для увеличения выхода продукта включают увеличение активностей ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или устранение чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой по типу обратной связи (смотри, например, заявку РСТ WO 95/16042 или патенты США 4346170; 5661012 и 6040160).Various techniques are used to increase L-amino acid production, including transformation of a microorganism of recombinant DNA (see, for example, US Pat. No. 4,278,765). Other methods for increasing product yield include increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids, and / or eliminating the sensitivity of the target enzyme to inhibition by the amino acid produced by feedback (see, for example, PCT application WO 95/16042 or US patents 4346170; 5661012 and 6040160 )

Еще один путь для увеличения продукции L-аминокислот - ослабление экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты, генов, обеспечивающих выведение предшественников целевой L-аминокислоты из пути биосинтеза указанной L-аминокислоты, генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфата, генов, кодирующих токсины, клеточные факторы и т.д.Another way to increase the production of L-amino acids is to weaken the expression of one or more genes involved in the degradation of the target L-amino acid, genes that remove the precursors of the target L-amino acid from the biosynthesis pathway of the specified L-amino acid, genes involved in the redistribution of carbon fluxes, nitrogen and phosphate, genes encoding toxins, cellular factors, etc.

FtsH, мембранный белок Escherichia coli, задействован в нескольких клеточных процессах, включая интеграцию мембранных белков, транслокацию секретируемых белков и деградацию некоторых нестабильных белков. Доминантные негативные мутации ftsH вызывают аномальльную транслокацию цитоплазматического домена модельного мембранного белка и нарушение экспорта белка. Показано, что белок FdrA (fdrA-ftsH dominant rescue, рассчитанная молекулярная масса 58465 Да) играет роль в супрессии таких доминантных негативных мутаций ftsH (Akiyama Y., Ito K., Mol Gen Genet., Nov 15; 249(2):202-208 (1995)).FtsH, an Escherichia coli membrane protein, is involved in several cellular processes, including membrane protein integration, translocation of secreted proteins, and the degradation of certain unstable proteins. Dominant negative ftsH mutations cause abnormal translocation of the cytoplasmic domain of the model membrane protein and impaired protein export. The FdrA protein (fdrA-ftsH dominant rescue, calculated molecular weight 58465 Da) was shown to play a role in suppressing such dominant negative ftsH mutations (Akiyama Y., Ito K., Mol Gen Genet., Nov 15; 249 (2): 202 -208 (1995)).

В настоящее время нет сообщений, описывающих использование инактивации гена fdrA для получения L-аминокислот.There are currently no reports describing the use of the inactivation of the fdrA gene to produce L-amino acids.

Описание изобретенияDescription of the invention

Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием этих штаммов.The objectives of the present invention are to increase the productivity of strains producing L-amino acids and provide a method for producing L-amino acids using these strains.

Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что инактивация гена fdrA может привести к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.The above goals were achieved by establishing the fact that inactivation of the fdrA gene can lead to increased production of L-amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-leucine, L-histidine, L-glutamic acid, L -phenylalanine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.The present invention provides a bacterium of the Enterobacteriaceae family that is capable of increased production of amino acids such as L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-leucine, L-histidine, L-glutamic acid, L-phenylalanine, L-tryptophan, L Proline and L-Arginine.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена fdrA в указанной бактерии ослаблена.The aim of the present invention is the provision of bacteria producing L-amino acids of the Enterobacteriaceae family, modified so that the expression of the fdrA gene in the specified bacteria is weakened.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой ослабление экспрессии указанного гена fdrA осуществлено путем инактивации указанного гена fdrA.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above, wherein expression of said fdrA gene is attenuated by inactivation of said fdrA gene.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said bacterium belongs to the genus Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein said L-amino acid is selected from the group consisting of aromatic L-amino acids and non-aromatic L-amino acids.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein the aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.Another objective of the present invention is the provision of the bacteria described above, while the non-aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:Another objective of the present invention is the provision of a method for producing L-amino acids, which includes:

- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде- growing the bacteria described above in a nutrient medium for the purpose of production and accumulation of L-amino acids in a nutrient medium

- и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.- and the allocation of the specified L-amino acids from the culture fluid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматических L-аминокислот и неароматических L-аминокислот.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said L-amino acid is selected from the group consisting of aromatic L-amino acids and non-aromatic L-amino acids.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L- глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said non-aromatic L-amino acid is selected from the group consisting of L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine , L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine.

Более детально настоящее изобретение описано ниже.In more detail, the present invention is described below.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

1. Бактерия согласно настоящему изобретению1. The bacterium according to the present invention

Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия гена fdrA в указанной бактерии ослаблена.The bacterium of the present invention is an L-amino acid producing bacterium of the Enterobacteriaceae family, modified in such a way that expression of the fdrA gene in said bacterium is weakened.

Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.According to the present invention, “L-amino acid producing bacterium” means a bacterium capable of producing and secreting an L-amino acid into a culture medium when the bacterium of the present invention is grown in said culture medium.

Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах, по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.As used herein, the term “L-amino acid producing bacterium” also means a bacterium that is capable of producing L-amino acid and causes the accumulation of L-amino acid in fermentation medium in large quantities, compared with the natural or parent E. coli strain, such as strain E .coli K-12, and preferably means that the microorganism is able to accumulate in the medium the target L-amino acid in an amount of not less than 0.5 g / l, more preferably not less than 1.0 g / l. The term “L-amino acid” includes L-alanine, L-arginine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine, L-histidine, L-isoleucine , L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-valine.

Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.The term “aromatic L-amino acid” includes L-phenylalanine, L-tyrosine and L-tryptophan. The term “non-aromatic L-amino acid” includes L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-glycine, L-serine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartate, L-glutamine, L-glutamic acid, L-proline and L-arginine. Most preferred are L-threonine, L-lysine, L-cysteine, L-leucine, L-histidine, L-glutamic acid, L-phenylalanine, L-tryptophan, L-proline and L-arginine.

Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=l&srchmode=l&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea, предпочтительна.The Enterobacteriaceae family includes bacteria belonging to the genera Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, etc. More specifically, bacteria classified as belonging to the Enterobacteriaceae family according to the taxonomy used in the NCBI database (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/ can be used. wgetorg? mode = Tree & id = 1236 & lvl = 3 & keep = l & srchmode = l & unlock). A bacterium belonging to the genus Escherichia or Pantoea is preferred.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington B.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia that can be used in the present invention is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington B.C., 1208, Table 1) can be included in the number of bacteria according to the present invention.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д.The term "bacterium belonging to the genus Pantoea" means that the bacterium belongs to the genus Pantoea in accordance with the classification known to the specialist in the field of microbiology. Recently, several Enterobacter agglomerans species have been classified as Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii or the like based on analysis of the 16S rRNA nucleotide sequence, etc.

Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена fdrA ослаблена» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белка FdrA по сравнению с немодифицированной бактерией или указанная бактерия не способна синтезировать белок FdrA.The term “bacterium is modified in such a way that the expression of the fdrA gene is weakened” means that said bacterium has been modified so that, as a result of the modification, such a bacterium contains a reduced amount of FdrA protein compared to an unmodified bacterium or the specified bacterium is unable to synthesize FdrA protein.

Термин «инактивация гена fdrA» означает, что указанный ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции данного гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена, введения missense/nonsense мутации (мутаций) или модификации прилегающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенюаторы, сайты связывания рибосомы и т.д.The term "inactivation of the fdrA gene" means that the specified gene is modified in such a way that such a modified gene encodes a completely inactive protein. It is also possible that natural expression of a modified DNA region is not possible due to deletion of a given gene or part of it, shift of the reading frame of a given gene, introduction of missense / nonsense mutations (mutations) or modification of regions adjacent to a gene that include sequences that control gene expression, such like promoters, enhancers, attenuators, ribosome binding sites, etc.

Уровень экспрессии гена может оцениваться измерением количества транскрибируемой с гена мРНК с использованием различных хорошо известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную RT-ПЦР и т.п. Количество белка, кодируемого данным геном, может быть измерено хорошо известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Western blot analysis) и т.п.The level of gene expression can be estimated by measuring the amount of mRNA transcribed from the gene using various well-known methods, including Northern blotting, quantitative RT-PCR, etc. The amount of protein encoded by this gene can be measured by well-known methods, including SDS-PAGE electrophoresis followed by Western blot analysis, etc.

Примеры методов ослабления экспрессии гена fdrA включают такие как мутации или делеции гена fdrA, при которых внутриклеточная активность белка, кодируемого геном fdrA, снижена или отсутствует по сравнению с немутированным или природным штаммом. Например, это может быть достигнуто использованием рекомбинации для того, чтобы инактивировать ген fdrA на хромосоме или модифицировать экспрессию регуляторных последовательностей, таких как промотор или последовательность Shine-Dalgarno (SD) (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier T.A. and Keasling J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)). Это также может быть достигнуто введением аминокислотной замены («миссенс»-мутация) в области хромосомы, кодирующей фермент; введением стоп-кодона («нонсенс»-мутация); введением или делецией одного или двух оснований для создания мутации сдвига рамки считывания; делецией области гена или всего гена (Qiu Z. and Goodman M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon D.H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)).Examples of methods for attenuating fdrA gene expression include those such as mutations or deletions of the fdrA gene, in which the intracellular activity of the protein encoded by the fdrA gene is reduced or absent compared to a non-mutated or naturally occurring strain. For example, this can be achieved by using recombination in order to inactivate the fdrA gene on the chromosome or modify expression of regulatory sequences, such as the promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence (PCT application WO 95/34672; Carrier TA and Keasling JD, Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)). This can also be achieved by introducing an amino acid substitution ("missense" mutation) in the region of the chromosome encoding the enzyme; introduction of a stop codon (“nonsense” mutation); the introduction or deletion of one or two bases to create a frameshift mutation; deletion of a region of a gene or the entire gene (Qiu Z. and Goodman MF, J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon DH et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000) )

Активность фермента также может быть уменьшена или удалена путем конструирования кодирующего мутантный фермент гена с неполной кодирующей областью, замены нормального гена на хромосоме на этот ген с использованием гомологичной рекомбинации, введения транспозона или IS фактора в ген.Enzyme activity can also be reduced or removed by constructing a gene encoding a mutant enzyme with an incomplete coding region, replacing a normal gene on the chromosome with this gene using homologous recombination, introducing a transposon or IS factor into the gene.

Например, следующие методы могут применяться для введения путем генной рекомбинации мутаций, вызывающих снижение или удаление активности вышеуказанного фермента. Часть последовательности целевого гена модифицируется, конструируется мутантный ген, с которого не синтезируется нормально функционирующий фермент, содержащая этот ген ДНК используется для трансформации бактерий семейства Enterobacteriaceae; конструируется мутантный ген для рекомбинации с геном хромосомы, производится замещение целевого гена хромосомы мутантным геном.For example, the following methods can be used to introduce mutations by gene recombination that cause a decrease or removal of the activity of the above enzyme. Part of the sequence of the target gene is modified, a mutant gene is constructed from which a normally functioning enzyme is not synthesized; this DNA gene is used to transform Enterobacteriaceae bacteria; a mutant gene is being constructed for recombination with a chromosome gene, and the target chromosome gene is replaced with a mutant gene.

Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методами с использованием линейной ДНК, такими как, например, метод, известный как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko K.A., Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645 (2000)), и метод с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6303383 или заявка Японии 05-007491А). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием гомологичной рекомбинации, как сказано выше, может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.Such gene substitution using homologous recombination can be carried out using linear DNA methods, such as, for example, a method known as "Red-dependent integration" or "Red-system integration" (Datsenko KA, Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645 (2000)), and a method using a plasmid whose replication is temperature sensitive (US Patent 6303383 or Japanese Application 05-007491A). Further, the introduction of a site-specific mutation by replacing a gene using homologous recombination, as mentioned above, can also be carried out using a plasmid with reduced replication ability in the host cell.

Ген fdrA (ftsHdominantrescue) кодирует белок FdrA (синонимы - b0518, YlbD). Ген fdrA (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 545904 по 547571 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990; SEQ ID NO:1) расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами allD и ylbE. Нуклеотидная последовательность гена fdrA и аминокислотная последовательность белка FdrA, кодируемого геном fdrA, приведены в Списке последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно.The fdrA gene (f tsHd ominantr escue) encodes the FdrA protein (synonyms - b0518, YlbD). The fdrA gene (nucleotides complementary to nucleotides numbered 545904 through 547571 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database; gi: 49175990; SEQ ID NO: 1) is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between allD and ylbE. The nucleotide sequence of the fdrA gene and the amino acid sequence of the FdrA protein encoded by the fdrA gene are shown in the Sequence Listing Numbers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.

Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена fdrA не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO:1, но также может включать и гомологичные ему гены. Таким образом, вариант белка, кодируемого геном fdrA, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2, при условии, что сохраняется способность белка FdrA до инактивации активировать морфогенетический путь.Since representatives of various genera and strains of the Enterobacteriaceae family may experience some variations in the nucleotide sequences, the concept of the inactivable fdrA gene is not limited to the gene listed in SEQ ID NO: 1, but may also include genes homologous to it. Thus, a variant of the protein encoded by the fdrA gene can be represented by a protein with a homology of at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95%, with respect to the complete amino acid sequence shown in SEQ ID NO : 2, provided that the ability of the FdrA protein to activate the morphogenetic pathway before inactivation is maintained.

Кроме того, ген fdrA может быть представлен вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Списке последовательностей под номером SEQ ID NO:1, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что указанный вариант кодирует функциональный белок FdrA до инактивации. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно она составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.In addition, the fdrA gene can be represented by a variant that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or with a probe that can be synthesized based on the specified nucleotide sequence, provided that the variant encodes a functional FdrA protein prior to inactivation. "Stringent conditions" include those conditions under which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. A practical example of harsh conditions is a one-time washing, preferably two or three times, at a salt concentration corresponding to standard washing conditions for Southern hybridization, for example 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS, at 60 ° C. The length of the probe can be selected depending on the hybridization conditions, usually it is from 100 bp up to 1 kb

Инактивация указанного гена может быть произведена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-расправленный мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации или/и мутагенез с образованием вставки/делеции (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:5978-83 and Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45), также называемый «Red-зависимая интеграция».Inactivation of the indicated gene can be performed by traditional methods, such as mutagenesis using UV radiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), site-expanded mutagenesis, gene destruction using homologous recombination and / or mutagenesis with the formation of an insertion / deletion (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 5978-83 and Datsenko KA and Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000 , 97: 12: 6640-45), also called “Red-Dependent Integration”.

Активность белка FdrA может быть определена по супрессии доминантных отрицательных мутаций ftsH с использованием метода, описанного, например, Akiyama Y., Ito К., Mol Gen Genet., Nov 15; 249(2):202-208 (1995). Поэтому уменьшение или отсутствие активности белка FdrA в бактерии согласно настоящему изобретению может быть определено при сравнении с клетками родительского немодифицированного штамма.The activity of the FdrA protein can be determined by suppressing the dominant negative ftsH mutations using the method described, for example, Akiyama Y., Ito K., Mol Gen Genet., Nov 15; 249 (2): 202-208 (1995). Therefore, the decrease or lack of activity of the FdrA protein in the bacteria according to the present invention can be determined by comparison with the cells of the parent unmodified strain.

Наличие или отсутствие гена fdrA в хромосоме бактерии может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена может оцениваться измерением количества транскрибируемой с гена мРНК с использованием различных хорошо известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную RT-ПЦР и т.п. Количество белка, кодируемого данным геном, может быть измерено хорошо известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Western blot analysis) и т.п.The presence or absence of the fdrA gene in the bacterial chromosome can be determined by well-known methods, including PCR, Southern blotting, etc. In addition, the level of gene expression can be estimated by measuring the amount of mRNA transcribed from the gene using various well-known methods, including Northern blotting, quantitative RT-PCR, etc. The amount of protein encoded by this gene can be measured by well-known methods, including SDS-PAGE electrophoresis followed by Western blot analysis, etc.

Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Methods for obtaining plasmid DNA, cutting and ligation of DNA, transformation, selection of oligonucleotides as primers and the like can be conventional methods well known to those skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Бактерия-продуцент L-аминокислотыL-amino acid producing bacterium

В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена fdrA ослаблена, может быть использована бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.As a bacterium according to the present invention, modified in such a way that expression of the fdrA gene is impaired, a bacterium capable of producing an aromatic or non-aromatic L-amino acid can be used.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации гена fdrA в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой ген fdrA уже инактивирован, способности к продукции L-аминокислот.The bacterium of the present invention can be obtained by inactivating the fdrA gene in a bacterium already capable of producing L-amino acids. On the other hand, a bacterium according to the present invention can be obtained by giving a bacterium in which the fdrA gene is already inactivated the ability to produce L-amino acids.

Бактерия-продуцент L-треонинаL-threonine producing bacterium

Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е.coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е.coli FERM BP-3756 (патент США 5474918), штаммы Е.coli FERM BP-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е.coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобными им.Examples of the parent strain for producing the L-threonine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain TDH-6 / pVIC40 (VKPM B-3996) (US patents 5175107 and 5705371) , E. coli strain NRRL-21593 (US patent 5939307), E. coli strain FERM BP-3756 (US patent 5474918), E. coli strains FERM BP-3519 and FERM BP-3520 (US patent 5376538), strain E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetics, 14, 947-956 (1978)), E. coli strains VL643 and VL2055 (European patent application EP 1149911 A) and the like.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilνA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105, Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г.с инвентарным номером В-3996.Strain TDH-6 is deficient in the thrC gene, is able to assimilate sucrose, and contains the ilνA gene with a leaky mutation. The specified strain contains a mutation in the rhtA gene, which causes resistance to high concentrations of threonine and homoserine. Strain B-3996 contains the plasmid pVIC40, which was obtained by introducing into the vector derived from the RSF1010 vector the thrA * BC operon containing the mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which has a significantly reduced feedback sensitivity to threonine inhibition. Strain B-3996 was deposited on November 19, 1987 at the All-Union Scientific Center for Antibiotics (RF, 117105, Moscow, Nagatinskaya St., 3-A) with inventory number RIA 1867. The strain was also deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) ( RF, 117545, Moscow, 1st Road passage, 1) April 7, 1987 with accession number B-3996.

В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению может также использоваться Е.coli VKPM В-5318 (европейский патент ЕР 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным по изолейцину и содержит плазмиду pVIC40, в которой регуляторная область треонинового оперона замещена чувствительным к температуре С1 репрессором фага λ и PR промотором. Штамм VKPM В-5318 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 3 мая 1990 г.с инвентарным номером VKPM В-5318.E. coli VKPM B-5318 (European patent EP 0593792 B) can also be used as the parent strain for producing the L-threonine producing bacterium according to the present invention. Strain B-5318 is prototrophic for isoleucine and contains the plasmid pVIC40, in which the regulatory region of the threonine operon is replaced by a temperature-sensitive C1 phage λ repressor and PR promoter. The strain VKPM B-5318 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) on May 3, 1990 with accession number VKPM B-5318.

Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:Preferably, the bacterium of the present invention is further modified so as to have increased expression of one or more of the following genes:

- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;- mutant thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, resistant to threonine inhibition by feedback type;

- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;- thrB gene encoding homoserine kinase;

- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;- thrC gene encoding threonine synthase;

- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;- rhtA gene, presumably encoding a transmembrane protein;

- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, иthe asd gene encoding aspartate β-semialdehyde dehydrogenase, and

- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).- aspC gene encoding aspartate aminotransferase (aspartate transaminase).

Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi:49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е.coli K-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления экспрессии треонинового оперона желательно удалить из оперона область аттенюатора, который влияет на транскрипцию (заявка РСТ WO 2005/049808, заявка РСТ WO 2003/097839).The nucleotide sequence of the thrA gene encoding aspartokinase-homoserine dehydrogenase I from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 337 to 2799 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrA gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrL and thrB genes. The nucleotide sequence of the thrB gene encoding homoserine kinase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 2801 to 3733 in sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrB gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrA and thrC genes. The nucleotide sequence of the thrC gene encoding a threonine synthase from Escherichia coli is known (nucleotide numbers 3734 to 5020 in the sequence with accession number NC_000913.2 in the GenBank database, gi: 49175990). The thrC gene is located on the chromosome of E. coli K-12 strain between the thrB gene and the open uaaX reading frame. All three of these genes function as one threonine operon. To enhance the expression of the threonine operon, it is desirable to remove the region of the attenuator from the operon that affects transcription (PCT application WO 2005/049808, PCT application WO 2003/097839).

Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же, как и гены thrB и thrC, может быть получен в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.The mutant thrA gene encoding aspartokinase homoserine dehydrogenase I, which is resistant to threonine inhibition by feedback type, as well as the thrB and thrC genes, can be obtained as a single operon from the well-known plasmid pVIC40, which is represented in the producer strain E. coli VKPM B-3996. Plasmid pVIC40 is described in detail in US Pat. No. 5,705,371.

Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона gInHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении - 1 по отношению к старт кодону ATG (тезисы 17^thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology, тезисы 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, европейская заявка ЕР 1013765 A).The rhtA gene is located at the 18th minute of the E. coli chromosome near the gInHPQ operon, which encodes the components of the glutamine transport system, the rhtA gene is identical to ORF1 (ybiF gene, nucleotide numbers 764 to 1651 in sequence with accession number AAA218541 in the GenBank database, gi: 440181) , located between the genes pXB and ompX. The DNA region expressed to form the protein encoded by the ORF1 reading frame was named the rhtA gene (rht: resistance to homoserine and threonine). The rhtA23 mutation has also been shown to represent an A-to-G substitution at position-1 with respect to the start of the ATG codon (abstract 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, abstract 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology , San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, European application EP 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.The nucleotide sequence of the asd gene from E. coli is known (nucleotide numbers 3572511 to 3571408 in sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16131307) and can be obtained by PCR (polymerase chain reaction; link to White TJ et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) using primers synthesized based on the nucleotide sequence of the gene. Asd genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E.coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.Also, the nucleotide sequence of the aspC gene from E. coli is known (nucleotide numbers 983742 to 984932 in the sequence with accession number NC_000913.1 in the GenBank database, gi: 16128895) and can be obtained by PCR. AspC genes from other microorganisms can be obtained in a similar way.

Бактерия-продуцент L-лизинаL-lysine producing bacterium

Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (АЕС), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli АJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.Examples of bacteria producing L-lysine belonging to the genus Escherichia include mutants that are resistant to the L-lysine analogue. The L-lysine analogue inhibits the growth of bacteria belonging to the genus Escherichia, but this inhibition is completely or partially removed when L-lysine is also present in the medium. Examples of the L-lysine analogue include, but are not limited to, oxalysine, lysine hydroxyamate, S- (2-aminoethyl) -L-cysteine (AEC), γ-methyllysis, α-chlorocaprolactam, and so on. Mutants that are resistant to these lysine analogues can be obtained by treating bacteria belonging to the genus Escherichia with traditional mutagens. Specific examples of bacterial strains used to produce L-lysine include Escherichia coli strain AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; see US Pat. No. 4,346,170) and Escherichia coli strain VL611. In these microorganisms, aspartokinase is resistant to feedback inhibition by L-lysine.

Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli K-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM Р-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США 5827698).Strain WC196 can be used as a bacterium producer of L-lysine Escherichia coli. This bacterial strain was obtained by selection of the phenotype of resistance to AEC in strain W3110, derived from strain Escherichia coli K-12. The resulting strain was named Escherichia coli AJ13069 and was deposited at the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry), currently called the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organizational Depository for Patenting, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan ( National in Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), December 6, 1994 and received accession number FERM P -14690. Then, the strain was internationally deposited in accordance with the terms of the Budapest Treaty on September 29, 1995, and the strain received accession number FERM BP-5252 (US patent 5827698).

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США 6040160), фосфоенолпируваткарбоксилазу(ррс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd), никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (суо) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5830716), гена ybjE (заявка РСТ WО2005/073390), или комбинации этих генов.Examples of parent strains for producing L-lysine producing bacteria according to the present invention also include strains in which the expression of one or more genes encoding L-lysine biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of enzymes involved in the biosynthesis of L-lysine include, but are not limited to, dihydrodipicolinate synthase (dapA), aspartokinase (lysC), dihydrodipicolinate reductase (dapB), diaminopimelate carboxylase (lysA), diaminopromedolase ), aspartate semialdehyde dehydrogenase (asd), nicotinamide adenine dinucleotide transhydrogenase (pntAB) and aspartase (aspA) (European application EP 1253195 A). In addition, parental strains may have an increased level of expression of the gene involved in the respiration process (suo) (European application EP 1170376 A), the gene encoding nicotinamide nucleotranshydrogenase (pntAB) (US patent 5830716), the ybjE gene (PCT application WO2005 / 073390) or combinations of these genes.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5827698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).Examples of parental strains for producing L-lysine producing bacteria according to the present invention also include strains in which enzyme activity is reduced or absent which catalyze the formation of compounds other than L-lysine branching off from the main L-lysine biosynthesis pathway. Examples of enzymes that catalyze the formation of non-L-lysine compounds branching off from the main L-lysine biosynthesis pathway include homoserine dehydrogenase, lysine decarboxylase (US Pat. No. 5,827,698) and malate dehydrogenase (PCT application WO 2005/010175).

Бактерия-продуцент L-цистеинаL-cysteine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е.coli W3110, содержащий сверхэкспрессированные гены, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е.coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP11155571 А2); штамм Е.coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307 A1), и подобные им.Examples of parental strains used to produce L-cysteine-producing bacteria according to the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain JM15 transformed with various cysE alleles encoding inhibition resistant cysE feedback type serine acetyltransferase (US patent 6218168, patent application of the Russian Federation 2003121601); E. coli strain W3110 containing overexpressed genes encoding a protein capable of secretion of compounds toxic to the cell (US patent 5972663); E. coli strains containing cysteine desulfohydrase with reduced activity (Japanese patent JP11155571 A2); E. coli strain W3110 with increased activity of the positive transcriptional regulator of the cysteine regulon encoded by the cysB gene (international application PCT WO 0127307 A1), and the like.

Бактерия-продуцент L-лейцинаL-Leucine Producer Bacteria

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающие, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е.coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е.coli штамм Н-9068 (JP8-70879А2) и подобные им.Examples of parental strains used to produce the L-leucine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains resistant to leucine analogs, including, for example, β-2 -thienylalanine, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucine and 5,5,5-trifluoroleucine (Japanese Patent Laid-open 62-34397 and 8-70879), E. coli strains obtained using the genetic engineering methods described in PCT 96 / 06926; E. coli strain H-9068 (JP8-70879A2) and the like.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (европейская заявка ЕР 1239041 А2).The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-leucine. Examples of such genes include the leuABCD operon genes and are preferably represented by the mutant leuA gene encoding feedback feedback depleted L-leucine isopropyl malate synthase (US Pat. No. 6,333,342). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that export the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes include the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (European application EP 1239041 A2).

Бактерия-продуцент L-гистидинаL-histidine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е.coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е.coli NRRL В-12116 - В12121 (патент США 4388405); штаммы Е.coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е.coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е.coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобными им.Examples of parent strains used to produce L-histidine producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, L-histidine producing bacteria belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 24 (VKPM B-5945, patent RF 2003677); E. coli strain 80 (VKPM B-7270, RF patent 2119536); E. coli strains NRRL B-12116 - B12121 (US Pat. No. 4,388,405); E. coli strains H-9342 (FERM BP-6675) and H-9343 (FERM BP-6676) (US patent 6344347); E. coli strain H-9341 (FERM BP-6674) (European Patent 1085087); E. coli strain AI80 / pFM201 (US Pat. No. 6,258,554) and the like.

Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин, согласно настоящему изобретению также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-гистидина, включают АТФ-фосфорибозилтрансферазу (HisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (HisI), фосфорибозил-АТФ-фосфогидролазу (HisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (HisA), амидотрансферазу (HisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (HisC), гистидинолфосфатазу (HisB), гистидинолдегидрогеназу (HisD) и т.д.Examples of parent strains for the production of bacteria producing L-histidine according to the present invention also include strains in which the expression of one or more genes encoding L-histidine biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of enzymes involved in the biosynthesis of L-histidine include ATP-phosphoribosyltransferase (HisG), phosphoribosyl-AMP-cyclohydrolase (HisI), phosphoribosyl-ATP-phosphohydrolase (HisIE), phosphoribosylformimino-5-aminamide amide amide amide amide azide (His) amide amide amide amide amide amide amide azide histidinolphosphate aminotransferase (HisC), histidinolphosphatase (HisB), histidinol dehydrogenase (HisD), etc.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ 2003677 и 2119536).It is known that genes encoding L-histidine biosynthesis enzymes (hisG, hisBHAFI) are inhibited by L-histidine, therefore, the ability to produce L-histidine can also be significantly enhanced by introducing a feedback inhibition mutation into the ATP-gene phosphoriboside transferase (hisG) (RF patents 2003677 and 2119536).

Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е.coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E.coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710А), штамм Е.coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536), и т.д.Specific examples of strains with the ability to produce L-histidine include E. coli FERM-P 5038 and 5048, into which a vector containing DNA encoding the L-histidine biosynthesis enzyme (Japanese application 56-005099 A), strains E. coli, into which the rht gene is introduced, for exporting amino acids (European application EP 1016710A), strain E. coli 80, which is given resistance to sulfaguanidine, DL-1,2,4-triazole-3-alanine and streptomycin (VKPM B-7270 RF patent 2119536), etc.

Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислотыL-glutamic acid producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli VL334 thrC⁺ (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е.coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC⁺ (ВКПМ В-8961). Этот штамм обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.Examples of parental strains used to produce the L-glutamic acid producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain VL334 thrC⁺ (European patent EP 1172433). Strain E. coli VL334 (VKPM B-1641) is an auxotroph of L-isoleucine and L-threonine with mutations in the thrC and ilvA genes (US patent 4278765). The natural allele of the thrC gene was transferred to this strain by the general transduction method using bacteriophage P1 grown on cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7). The result was a strain, auxotroph for L-isoleucine, VL334thrC⁺ (VKPM B-8961). This strain has the ability to produce L-glutamic acid.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-глутаминовой кислоты, включают глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтетазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктониназу и глюкозофосфатизомеразу.Examples of parental strains used to produce L-glutamic acid producing bacteria according to the present invention include, but are not limited to, strains in which the expression of one or more genes encoding L-glutamic acid biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of the enzymes involved in the biosynthesis of L-glutamic acid include glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, glutamate synthetase, isocitrate dehydrogenase, aconitate hydratase, citrate synthase, phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate carboxylase, pyruvate dehydrogenase, pyruvate kinase, phosphoenolpyruvate synthase, enolase, phosphoglyceromutase, phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomerase, fructose, phosphofructoninase and glucose phosphatisomerase.

Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в европейских заявках ЕР 1078989А, ЕР 955368А и ЕР952221А.Examples of strains modified in such a way that the expression of the citrate synthetase gene, phosphoenolpyruvate carboxylase gene and / or glutamate dehydrogenase gene is enhanced include those described in European applications EP 1078989A, EP 955368A and EP952221A.

Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, согласно настоящему исследованию также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу, α-кетоглутаратдегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетаткиназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу и глутаматдекарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:Examples of parental strains for producing L-glutamic acid producing bacteria according to the present study also include strains in which enzyme activity is reduced or absent that catalyzes the synthesis of compounds other than L-glutamic acid branching from the main pathway of L-glutamic acid biosynthesis. Examples of such enzymes include isocitrate lyase, α-ketoglutarate dehydrogenase, phosphotransacetylase, acetate kinase, acetohydroxy acid synthase, acetolactate synthase, format acetyl transferase, lactate dehydrogenase and glutamate decarboxylase. Bacteria belonging to the genus Escherichia, lacking the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase or having reduced activity of α-ketoglutarate dehydrogenase, and methods for their preparation are described in US patents 5378616 and 5573945. Specifically, examples of such strains include the following strains:

Е.coli; W3110sucA::KmrE. coli; W3110sucA :: Kmr

E.coli АJ12624 (FERM BP-3853)E.coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E.coli AJ12628 (FERM BP-3854)E.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E.coli W3110sucA::Kmr - это штамм, полученный в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме E.coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.E.coli W3110sucA :: Kmr is a strain obtained by disrupting the α-ketoglutarate dehydrogenase gene (hereinafter referred to as the “sucA gene”) in the E.coli W3110 strain. In this strain, the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase is completely absent.

Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например, штамм AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США 5908768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5393671); штамм E.coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и подобные им.Other examples of L-glutamic acid producing bacteria include bacteria belonging to the genus Escherichia and resistant to aspartic acid antimetabolites and deficient in α-ketoglutarate dehydrogenase activity, for example, strain AJ13199 (FERM BP-5807), or US patent 5908768), or strain FERM P-12379, additionally having low activity for the cleavage of L-glutamic acid (US patent 5393671); E. coli strain AJ13138 (FERM BP-5565) (US patent 6110714) and the like.

Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишенны активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6331419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-El субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans АJ13356. Тем не менее, позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то, что штамм AJ13356 был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.Examples of the L-glutamic acid producing bacterium include mutant strains belonging to the genus Pantoea that are devoid of α-ketoglutarate dehydrogenase activity or have reduced α-ketoglutarate dehydrogenase activity and can be obtained as described above. Examples of such strains are Pantoea ananatis AJ13356 strain (US Pat. No. 6,331,419), Pantoea ananatis AJ13356 strain deposited at the National Institute of Biological Sciences and Human Technologies, Agency for Industrial Science and Technology, Department of International Trade and Industry (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (currently called the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organizational Depository for Patenting Purposes, Central 6, 1-1, Higashi 1-Cho me, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) February 19, 1998 and received accession number FERM P-16645. Then, the international deposit of this strain was made according to the conditions of the Budapest Treaty of January 11, 1999, and the strain received accession number FERM BP-6615. The strain Pantoea ananatis AJ13356 does not have α-KGDH activity as a result of the destruction of the αKGDH-El subunit (sucA) gene. The above strain, when isolated, was identified as Enterobacter agglomerans and deposited as Enterobacter agglomerans AJ13356 strain. However, it was later classified as Pantoea ananatis based on the 16S rRNA nucleotide sequence and other evidence. Although the strain AJ13356 was deposited in the above depository as Enterobacter agglomerans, for the purposes of this description it will be referred to as Pantoea ananatis.

Бактерия-продуцент L-фенилаланинаL-phenylalanine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКПМ В-8197); штамм HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген рhеА34 (патент США 5354672); мутантный штамм MWEC101-b (KR8903681); штаммы NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL В-12146 и NRRL В-12147 (патент США 4407952) и пободные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E.coli K-12 [W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как АJ12604 (FERM BP-3579) (Европейский патент ЕР488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 А1 соответственно).Examples of parent strains used to produce the L-phenylalanine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as strain AJ12739 (tyrA :: Tn10, tyrR) (VKPM B-8197); strain HW1089 (ATCC-55371) containing the gene pheA34 (US patent 5354672); mutant strain MWEC101-b (KR8903681); strains NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 and NRRL B-12147 (US patent 4407952) and the like. Also, bacteria belonging to the genus Escherichia, producers of L-phenylalanine, such as E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA) / pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K strain, can be used as parent strains. -12 [W3110 (tyrA) / pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA) / pPHATerm] (FERM BP-12662) and E. coli K-12 strain [W3110 (tyrA ) / pBR-aroG4, pACMAB], named as AJ12604 (FERM BP-3579) (European patent EP488424 B1). In addition, L-phenylalanine producing bacteria belonging to the genus Escherichia with increased activity of the proteins encoded by the yedA gene or yddG gene can also be used (US patent applications 2003/0148473 A1 and 2003/0157667 A1, respectively).

Бактерия-продуцент L-триптофанаL-tryptophan producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е.coli SV164 (pGH5), содержащий аллель гена serA, кодирующего фермент, не ингибируемый серином по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е. coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), лишенные активности триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO9708333, патент США 6319696), и подобные им.Examples of parent strains used to produce L-tryptophan producing bacteria of the present invention include, but are not limited to, L-tryptophan producing bacteria belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strains JP4735 / pMU3028 (DSM10122) and JP6015 / pMU91 (DSM10123) lacking the activity of tryptophanyl tRNA synthetase encoded by the mutant trpS gene (US patent 5756345); E. coli strain SV164 (pGH5) containing an allele of the serA gene encoding an enzyme not inhibited by serine in a feedback manner (US Pat. No. 6,180,373); E. coli strains AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) and AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) lacking tryptophanase activity (US patent 4371614); E. coli strain AGX17 / pGX50, pACKG4-pps, which enhances the ability to synthesize phosphoenolpyruvate (PCT application WO9708333, US patent 6319696), and the like.

Ранее было показано, что природная аллель гена yddG, кодирующего мембранный белок, не участвующий в путях биосинтеза ни одной из L-аминокислот, амплифицированная на многокопийном векторе в микроорганизме, придает этому микроорганизму устойчивость к L-фенилаланину и нескольким аналогам этой аминокислоты. Кроме того, введение в клетки бактерий-продуцентов L-фенилаланина или L-триптофана дополнительных копий гена yddG может положительно влиять на продукцию соответствующих аминокислот (международная заявка РСТ WO 03044192). Таким образом, желательно, чтобы бактерия-продуцент L-триптофана была далее модифицирована таким образом, что в этой бактерии усилена экспрессия открытой рамки считывания yddG.It was previously shown that the natural allele of the yddG gene, which encodes a membrane protein that is not involved in the biosynthesis of any of the L-amino acids, amplified on a multi-copy vector in a microorganism, gives this microorganism resistance to L-phenylalanine and several analogues of this amino acid. In addition, the introduction of additional copies of the yddG gene into the cells of bacteria producing L-phenylalanine or L-tryptophan can positively affect the production of the corresponding amino acids (PCT international application WO 03044192). Thus, it is desirable that the bacterium producing L-tryptophan be further modified so that expression of the open reading frame yddG is enhanced in this bacterium.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L- триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е.coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е.coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.Examples of parent strains used to produce L-tryptophan-producing bacteria according to the present invention also include strains in which the activity of one or more enzymes selected from the group consisting of anthranilate synthase, phosphoglycerate dehydrogenase and tryptophan synthase is increased. Both anthranilate synthase and phosphoglycerate dehydrogenase are subject to feedback inhibition by L-tryptophan and L-serine, so mutations can be introduced into these enzymes that reduce the sensitivity to feedback inhibition. Specific examples of strains with such a mutation include E. coli SV164, whose anthranilate synthase is not sensitive to feedback inhibition, and a transformant strain obtained by introducing the plasmid pGH5 into E. coli SV164 (PCT application WO 94/08031), which contains the mutant gene serA encoding phosphoglycerate dehydrogenase, which is not sensitive to feedback inhibition.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4371614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу (trpBA). Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).Examples of parental strains used to produce L-tryptophan-producing bacteria according to the present invention also include strains that have introduced a tryptophan operon containing a gene encoding anthranilate synthase that is not sensitive to feedback inhibition (Japanese application 57-71397 A, Japanese Patent Application 62-244382 A, U.S. Patent 4,371,614). In addition, the ability to produce L-tryptophan can be imparted by enhancing the expression of a gene (from the tryptophan operon) encoding tryptophan synthase (trpBA). Tryptophan synthase consists of two subunits α and β, which are encoded by trpA and trpB, respectively. In addition, the ability to produce L-tryptophan can be increased by enhancing the expression of the isocytratliase-malatesynthase operon (PCT application WO 2005/103275).

Бактерия-продуцент L-пролинаL-proline producing bacterium

Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).Examples of L-proline producing bacteria used as the parent strain of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 702ilvA (VKPM B-8012) deficient in the ilvA gene and capable of producing L-proline (European patent EP 1172433). The bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes involved in the biosynthesis of L-proline. Preferably, examples of such genes for L-proline producing bacteria include the proB gene encoding glutamate kinase with desensitized feedback regulation of L-proline (German patent 3127361). In addition, the bacterium of the present invention can be improved by enhancing the expression of one or more genes encoding proteins that secrete the L-amino acid from a bacterial cell. Examples of such genes are the b2682 and b2683 genes (ygaZH genes) (European Patent Application EP 1239041 A2).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е.coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al (The 15^thMiami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia and having the ability to produce L-proline include the following E. coli strains: NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (UK patent GB 2075056), VKPM B-8012 (RF patent application 2000124295), plasmid mutants described in German patent DE 3127361, plasmid mutants described in Bloom FR et al (The 15^th Miami winter symposium, 1983, p. 34), and the like.

Бактерия-продуцент L-аргининаL-arginine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (выложенная патентная заявка Японии 57-5693), и подобные им.Examples of parent strains used to produce the L-arginine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains belonging to the genus Escherichia, such as E. coli strain 237 (VKPM B-7925) and mutant derivatives thereof N-acetylglutamate synthase (RF patent application 2001112869), an arginine producing strain into which the argA gene encoding N-acetylglutamate synthetase (Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-5693) has been introduced and the like.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L- аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH) и карбамоилфосфатсинтетазу.Examples of parental strains used to produce L-arginine producing bacteria according to the present invention also include strains in which the expression of one or more genes encoding L-arginine biosynthesis enzymes is enhanced. Examples of L-arginine biosynthesis enzymes include N-acetylglutamylphosphate reductase (argC), ornithine acetyltransferase (argJ), N-acetyl glutamate kinase (argB), acetylornithine transaminase (argD), ornithinecarbamoyltransurase arginic acid, argN, argin, argin, argin, argin, carbamoylphosphate synthetase.

Бактерия-продуцент L-валинаL-valine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, желательно разрушить в опероне ген ilvA, с тем чтобы снизить активность треониндеаминазы.Examples of parental strains used to produce the L-valine producing bacterium of the present invention include, but are not limited to, strains modified to overexpress ilvGMEDA operon (US Pat. No. 5,998,178). It is desirable to remove the region of the ilvGMEDA operon that is necessary to attenuate expression so that the expression of the operon is not attenuated by the resulting L-valine. Further, it is desirable to destroy the ilvA gene in the operon in order to reduce the activity of threonine deaminase.

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина, согласно настоящему изобретению также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм E.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм E.coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411.Examples of parental strains used to produce L-valine producing bacteria according to the present invention also include mutant strains having a mutation of the aminoacyl tRNA synthetase (US Pat. No. 5,658,766). For example, E. coli strain VL1970, which has a mutation in the ileS gene encoding isoleucine-tRNA synthetase, can be used. The strain E.coli VL1970 was deposited in the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 113545, Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on June 24, 1988 with accession number VKPM B-4411.

Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота и/или с недостаточным количеством H⁺ -АТФазы (заявка РСТ WO 96/06926).Further, mutant strains that require lipoic acid and / or with insufficient H⁺ -ATPase (PCT application WO 96/06926) can also be used as parent strains.

Бактерия-продуцент L-изолейцинаL-isoleucine producing bacterium

Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-изолейцина, согласно настоящему изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969А), мутантные штаммы с устойчивость к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882А). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458А, патент Франции 0356739 и патент США 5998178).Examples of parent strains used to produce L-isoleucine producing bacteria according to the present invention include, but are not limited to, mutant strains resistant to 6-dimethylaminopurine (Japanese application 5-304969A), mutant strains resistant to isoleucine analogue, such as thiaisoleucine and isoleucine hydroxamate, and mutant strains additionally resistant to DL-ethionine and / or arginine hydroxamate (Japanese application 5-130882A). In addition, recombinant strains transformed with genes encoding proteins involved in the biosynthesis of L-isoleucine, such as threonine deaminase and acetohydroxate synthase (Japanese application 2-458A, French patent 0356739 and US patent 5998178) can also be used as parent strains.

2. Способ согласно настоящему изобретению2. The method according to the present invention

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing an L-amino acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium in order to produce and accumulate the L-amino acid in the culture medium and isolate the L-amino acid from the culture fluid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of the L-amino acid from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using bacteria.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives necessary for the growth of microorganisms. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose and sucrose, as well as various organic acids. Depending on the nature of the assimilation of the microorganism used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. As vitamins, thiamine, yeast extract, and the like can be used.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as mixing the culture fluid on a rocking chair, shaking with aeration, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. The pH of the medium is maintained in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture fluid.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the L-amino acid can be isolated and purified by ion exchange chromatography, concentration and / or crystallization.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На Фиг.1 изображены относительные положения праймеров fdrAL и fdrAR на плазмиде pACYC184, используемой для амплификации гена cat.Figure 1 shows the relative positions of the fdrAL and fdrAR primers on the pACYC184 plasmid used to amplify the cat gene.

На Фиг.2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный ген fdrA.Figure 2 shows the construction of a chromosomal DNA fragment containing the inactivated fdrA gene.

ПримерыExamples

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.

Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном fdrAExample 1. Construction of a strain with an inactivated fdrA gene

1. Делеция гена fdrA1. Deletion of the fdrA gene

Штамм, содержащий делецию гена fdrhA, был сконструирован с использованием методики, разработанной Datsenko К.А. и Warmer B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой методикой были синтезированы ПЦР-праймеры fdrAL (SEQ ID NO:3) и fdrAR (SEQ ID NO:4), гомологичные областям, прилегающим к гену fdrA и гену, сообщающему устойчивость к антибиотику, на плазмиде, используемой в качестве матрицы для ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР была использована плазмида pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер Х06403 в базе данных GenBank/EMBL). Использовался следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 с при 50°С, 40 с при 72°С; и последующие 25 циклов: 30 с при 95°С, 30 с при 54°С, 40 с при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.The strain containing the deletion of the fdrhA gene was constructed using the method developed by K. Datsenko and Warmer B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97 (12), 6640-6645), known as "Red-dependent Integration". In accordance with this technique, fdrAL (SEQ ID NO: 3) and fdrAR (SEQ ID NO: 4) PCR primers homologous to the regions adjacent to the fdrA gene and the antibiotic resistance reporting gene on the plasmid used as the template were synthesized for PCR. The plasmid pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (accession number X06403 in the GenBank / EMBL database) was used as a template for PCR. The following temperature profile for PCR was used: denaturation at 95 ° C for 3 min; the first two cycles: 1 min at 95 ° C, 30 s at 50 ° C, 40 s at 72 ° C; and the next 25 cycles: 30 s at 95 ° C, 30 s at 54 ° C, 40 s at 72 ° C; and final polymerization: 5 min at 72 ° C.

Полученный продукт ПЦР длиной 1152 п.н. (Фиг.1), очищенный в агарозном геле, может быть использован для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko К.А. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ длиной 2154 нуклеотида (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора Р_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.The resulting PCR product with a length of 1152 bp (Figure 1), purified on an agarose gel, can be used for electroporation into E. coli strain MG1655 (ATCC 700926) containing the plasmid pKD46 with a heat-sensitive replicon. Plasmid pKD46 (Datsenko K.A. and Wanner BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45) contains a phage λ DNA fragment of 2154 nucleotides in length (positions from 31088 to 33241 nucleotide sequence with inventory number J02459 in the GenBank database), and also contains the λ genes of the Red homologous recombination system (γ, β, exo genes) under the control of the_{araB inducer} P induced by arabinose. Plasmid pKD46 is required for integration of the PCR product into the chromosome of strain MG1655.

Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), развели в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD₆₀₀≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н₂О. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром и выращивали при 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.Electrocompetent cells were obtained as follows: an overnight culture of E. coli strain MG1655 was grown at 30 ° C in LB medium supplemented with ampicillin (100 mg / L), diluted 100 times by adding 5 ml of SOB medium (Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) containing ampicillin and L-arabinose (1 mM). The resulting culture was grown with stirring at 30 ° С until OD₆₀₀ ≈0.6 was reached, after which the cells were made electrocompetent by 100-fold concentration and three times washing with ice-cold deionized H₂ O. Electroporation was performed using 70 μl of cells and ≈100 ng of PCR product. After electroporation, cells were incubated in 1 ml of SOC medium (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) at 37 ° C for 2.5 hours, and then plated on L plates agar and grown at 37 ° C to select Cm^R recombinants. Then, to remove plasmid pKD46, 2 passages were performed on L-agar with Cm at 42 ° C and the obtained colonies were tested for sensitivity to ampicillin.

2. Подтверждение делеции гена fdrA с помощью ПЦР.2. Confirmation of the deletion of the fdrA gene by PCR.

Мутанты с делегированным геном fdrA, содержащие ген устойчивости к Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры fdrA1 (SEQ ID NO:5) и fdrA2 (SEQ ID NO:6) использовались для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 с при 94°С, 30 с при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма fdrA⁺ MG1655, составляет 1863 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔfdrA::cat, составляет 1275 п.н. (Фиг.2).Mutants with a delegated fdrA gene containing the Cm resistance gene were verified by PCR. Locus-specific primers fdrA1 (SEQ ID NO: 5) and fdrA2 (SEQ ID NO: 6) were used to verify deletion by PCR. The following temperature profile was used for PCR testing: denaturation at 94 ° C for 3 min; profile for 30 cycles: 30 s at 94 ° C, 30 s at 54 ° C, 1 min at 72 ° C; final step: 7 min at 72 ° C. The length of the PCR product obtained by the reaction using the parent strain fdrA⁺ MG1655 as a matrix of cells is 1863 bp The length of the PCR product obtained by the reaction using the mutant strain MG1655 ΔfdrA :: cat as a matrix of cells is 1275 bp (Figure 2).

Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-3996-ΔfdrAExample 2. The production of L-threonine strain E. coli B-3996-ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию треонина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat были перенесены в штамм-продуцент L-треонина Е.coli В-3996 (ВКПМ В-3996) с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего был получен штамм B-3996-ΔlrhA.To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on the production of threonine, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔfdrA :: cat described above were transferred to the E. coli B-3996 L-threonine producing strain (VKPM B-3996) using P1 transduction (Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), resulting in strain B-3996-ΔlrhA.

Оба штамма Е.coli В-3996 и B-3996-ΔfdrA выращивали в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы выращивали при 32°С в течение 18 часов на роторной качалке (250 об/мин) в пробирках размером 20х200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% глюкозой. Затем в ферментационную среду были внесены по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию проводили в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки выращивали в течение 65 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин).Both strains of E. coli B-3996 and B-3996-ΔfdrA were grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar. To obtain a seed culture, these strains were grown at 32 ° C for 18 hours on a rotary shaker (250 rpm) in 20x200 mm test tubes containing 2 ml of L-broth with 4% glucose. Then, 0.21 ml (10%) of the inoculum was added to the fermentation medium. Fermentation was carried out in 2 ml of minimal fermentation medium in test tubes measuring 20 × 200 mm. Cells were grown for 65 hours at 32 ° C with stirring (250 rpm).

После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью бумажной хроматографии, с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:1 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали, L-треонин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-треонина оценивали спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты 8 независимых пробирочных ферментаций приведены в Таблице 1.After growing, the amount of L-threonine accumulated in the medium was determined by paper chromatography using the mobile phase of the following composition: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A solution (2%) of ninhydrin in acetone was used for visualization. The spot containing L-threonine was excised, L-threonine was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl₂ , after which the amount of L-threonine was estimated spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm. The results of 8 independent in vitro fermentations are shown in Table 1.

Использовали следующий состав ферментационной среды (г/л):Used the following composition of the fermentation medium (g / l):

ГлюкозаGlucose80.080.0(NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄22.022.0NaClNaCl0.80.8KH₂PO₄KH₂ PO₄2.02.0MgSO₄·7H₂OMgSO₄ · 7H₂ O0.80.8FeSO₄·7Н₂ОFeSO₄ · 7H₂ O0.020.02MnSO₄·5H₂OMnSO₄ · 5H₂ O0.020.02Тиамин гидрохлоридThiamine hydrochloride0.00020.0002Дрожжевой экстрактYeast extract1.01.0СаСО₃CaCO₃30.030.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. СаСО₃ стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.Glucose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO_{3 was} dry heat sterilized at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0. The antibiotic was added to the medium after sterilization.

Как видно из Таблицы 1, штамм B-3996-ΔfdrA накапливал большее количество L-треонина по сравнению со штаммом В-3996.As can be seen from Table 1, strain B-3996-ΔfdrA accumulated a greater amount of L-threonine compared to strain B-3996.

Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е.coli АJ11442-ΔfdrAExample 3. Production of L-lysine by E. coli strain AJ11442-ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию лизина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е.coli WC196 (pCABD2) с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). pCABD2 - это плазмида, содержащая ген dapA, кодирующий мутантную дигидропиколинатсинтазу, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген lysC, кодирующий мутантную аспартокиназу III, устойчивую к ингибированию L-лизином по типу обратной связи, ген dapB, кодирующий дигидропиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (патент США 6040160).To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on lysine production, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 ΔfdrA :: cat can be transferred to the E. coli WC196 L-lysine producer strain (pCABD2) using P1 transduction (Miller JH ( 1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). pCABD2 is a plasmid containing the dapA gene encoding a mutant dihydropicolinate synthase that is resistant to feedback inhibition by L-lysine, the lysC gene encoding mutant aspartokinase III, resistant to feedback by L-lysine inhibition, the dapB gene encoding digiducidase ddh gene encoding diaminopimelate dehydrogenase (US patent 6040160).

Оба штамма Е.coli, родительский WC196(pCABD2) и полученный WC196(pCABD2) ΔfdrA::cat, могут выращиваться в L-среде, содержащей 20 мг/л стрептомицина, при 37°С, и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может производиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количества L-лизина и остаточной глюкозы в среде могут быть измерены известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель Sakura Seiki Co.). Затем для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу.Both strains of E. coli, the parent WC196 (pCABD2) and the obtained WC196 (pCABD2) ΔfdrA :: cat, can be grown in L medium containing 20 mg / L streptomycin at 37 ° C, and 0.3 ml of the resulting cultures can be added to 20 ml of fermentation medium containing the necessary antibiotics in 500 ml flasks. Cultivation can be carried out at 37 ° C for 16 hours using a reciprocating rocking chair with a stirring speed of 115 rpm. After growing, the amounts of L-lysine and residual glucose in the medium can be measured in a known manner (Biotech-analyzer AS210, manufacturer Sakura Seiki Co.). Then, for each of the strains, the yield of L-lysine in terms of glucose consumed can be calculated.

Состав ферментационной среды (г/л):The composition of the fermentation medium (g / l):

ГлюкозаGlucose4040(NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄2424K₂HPO₄K₂ HPO₄1.01.0MgSO₄·7H₂OMgSO₄ · 7H₂ O1.01.0FeSO₄·7H₂OFeSO₄ · 7H₂ O0.010.01MnSO₄·5H₂OMnSO₄ · 5H₂ O0.010.01Дрожжевой экстрактYeast extract2.02.0

рН доводят до 7.0 с помощью КОН и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO₄×7Н₂О стерилизуют отдельно. Также добавляют 30 г/л СаСО₃, предварительно простерилизованного сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.The pH was adjusted to 7.0 with KOH and the medium was autoclaved at 115 ° C for 10 minutes. Glucose and MgSO₄ × 7H₂ O are sterilized separately. Also add 30 g / l CaCO₃ , previously sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours.

Пример 4. Продукция L-цистеина штаммом Е.coli JM15(ydeD)-ΔfdrAExample 4. Production of L-cysteine by E. coli strain JM15 (ydeD) -ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-цистеина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина Е.coli JM15(ydeD) с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм JM15(ydeD)-ΔfdrA. Штамм Е.coli JM15(ydeD) является производным штамма Е.coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей ген ydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5972663).To assess the effect of fdrA gene inactivation on L-cysteine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔfdrA :: cat described above can be transferred to the E. coli JM15 L-cysteine producer strain (ydeD) using P1 transduction (Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), whereby strain JM15 (ydeD) -ΔfdrA can be obtained. The E. coli strain JM15 (ydeD) is a derivative of the E. coli strain JM15 (US patent 6218168), which can be transformed with DNA containing the ydeD gene encoding a membrane protein not involved in the biosynthesis of any of the L-amino acids (US patent 5972663 )

Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6218168.Fermentation conditions for evaluating L-cysteine production are described in detail in Example 6 of US Pat. No. 6,218,168.

Пример 5. Продукция L-лейцина штаммом Е.coli 57-ΔfdrAExample 5. The production of L-leucine strain E. coli 57-ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-лейцина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 57-pMW-ΔfdrA.To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on the production of L-leucine, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔfdrA :: cat described above can be transferred to the E. coli 57 L-leucine producer strain (VKPM B-7386, US patent 6124121) by P1 transduction (Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), whereby 57-pMW-ΔfdrA strain can be obtained.

Оба штамма Е.coli, 57 и 57-ΔfdrA, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% сахарозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут выращиваться в течение 48-72 часов при 32°С с перемешиванием (250 об/мин).Both strains of E. coli, 57 and 57-ΔfdrA, can be grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar. To obtain a seed culture, these strains can be grown on a rotary shaker (250 rpm) at 32 ° C for 18 hours in 20 × 200 mm test tubes containing 2 ml of L-broth with 4% sucrose. Then, 0.21 ml (10%) of the seed culture can be added to the fermentation medium. Fermentation can be carried out in 2 ml of minimal fermentation medium in test tubes measuring 20 × 200 mm. Cells can be grown for 48-72 hours at 32 ° C with stirring (250 rpm).

Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1).The amount of L-leucine can be measured using paper chromatography (mobile phase composition: butanol - acetic acid - water = 4: 1: 1).

Может быть использован следующий состав ферментационной среды (г/л) (рН 7.2):The following composition of the fermentation medium (g / l) (pH 7.2) can be used:

ГлюкозаGlucose60.060.0(NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄25.025.0К₂HPO₄K₂ HPO₄2.02.0MgSO₄·7H₂OMgSO₄ · 7H₂ O1.01.0ТиаминThiamine0.010.01СаСО₃CaCO₃25.025.0

Глюкозу и мел следует стерилизовать отдельно.Glucose and chalk should be sterilized separately.

Пример 6. Продукция L-гистидина штаммом Е.coli 80-ΔfdrAExample 6. Production of L-histidine by E. coli strain 80-ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-гистидина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е.coli 80 с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-7270.To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on L-histidine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔfdrA :: cat described above can be transferred to the E. coli 80 L-histidine producer strain using P1 transduction (Miller JH (1972 ) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain 80 is described in RF patent 2119536 and deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (Russia, 117545, Moscow, 1st Dorozhny passage, 1) with accession number VKPM B-7270.

Оба штамма Е.coli, родительский 80 и полученный 80-ΔfdrA, могут выращиваться в L-бульоне при 29°С в течение 6 часов. Затем 0.1 мл полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: n-бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.Both strains of E. coli, parent 80 and obtained 80-ΔfdrA, can be grown in L-broth at 29 ° C for 6 hours. Then 0.1 ml of the obtained cultures can be introduced into 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes, and the cultures can be grown at 29 ° C for 65 hours on a rotary shaker (350 rpm). After growing, the amount of histidine accumulated in the medium can be determined by paper chromatography. The mobile phase of the following composition can be used: n-butanol - acetic acid - water = 4: 1: 1 (v / v). A solution of ninhydrin (0.5%) in acetone can be used for visualization.

Состав ферментационной среды (рН 6.0) (г/л):The composition of the fermentation medium (pH 6.0) (g / l):

ГлюкозаGlucose100.0100.0Мамено(гидролизат соевых бобов)Mameno (soybean hydrolyzate)0.2 общего азота0.2 total nitrogenL-пролинL-proline1.01.0(NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄25.025.0КН₂PO₄KN₂ PO₄2.02.0MgSO₄·7H₂OMgSO₄ · 7H₂ O1.01.0FeSO₄·7H₂OFeSO₄ · 7H₂ O0.010.01MnSO₄MnSO₄0.010.01ТиаминThiamine0.0010.001БетаинBetaine2.02.0СаСО₃CaCO₃60.060.0

Глюкозу, пролин, бетаин и СаСО₃ стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.Glucose, proline, betaine and CaCO_{3 are} sterilized separately. The pH is adjusted to 6.0 before sterilization.

Пример 7. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC⁺-ΔfdrAExample 7. The production of L-glutamic acid strain E. coli VL334thrC⁺ -ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-глутаминовой кислоты ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е. coli VL334thrC⁺(ЕР 1172433) с помощью P1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм VL334thrC⁺-ΔfdrA.To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on the production of L-glutamic acid, DNA fragments of the chromosome of the above E. coli strain MG1655 ΔfdrA :: cat can be transferred to the E. coli L-glutamic acid producer strain VL334thrC⁺ (EP 1172433) using P1 -transduktsii (Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), whereby can be obtained a strain VL334thrC⁺ -ΔfdrA.

Оба штамма, родительский VL334thrC⁺ и полученный VL334thrC⁺-ΔfdrA, могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°С в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда должна содержать глюкозу - 60 г/л, сульфат аммония - 25 г/л, КН₂РО₄ - 2 г/л, MgSO₄ - 1 г/л, тиамин - 0.1 мг/мл, L-изолейцин - 70 мкг/мл и мел - 25 г/л (рН 7.2). Глюкозу и мел следует стерилизовать отдельно. Выращивание может производиться при 30°С в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол-уксусная кислота-вода = 4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl₂.Both strains, the parent VL334thrC⁺ and the resulting VL334thrC⁺ -ΔfdrA, can be grown on L-agar plates at 37 ° C for 18-24 hours. Further, one loop of cells can be transferred to tubes containing 2 ml of fermentation medium. The fermentation medium should contain glucose - 60 g / l, ammonium sulfate - 25 g / l, KH₂ PO₄ - 2 g / l, MgSO₄ - 1 g / l, thiamine - 0.1 mg / ml, L-isoleucine - 70 μg / ml and chalk - 25 g / l (pH 7.2). Glucose and chalk should be sterilized separately. Cultivation can be carried out at 30 ° C for 3 days with stirring. After growing, the amount of L-glutamic acid obtained can be determined using paper chromatography (mobile phase composition: butanol-acetic acid-water = 4: 1: 1), followed by staining with ninhydrin (1% solution in acetone) and further eluting the obtained compounds in 50% ethanol with 0.5% CdCl₂ .

Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е.coli AJ12739-ΔfdrAExample 8. The production of L-phenylalanine strain E. coli AJ12739-ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е.coli AJ12739 с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197.To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on L-phenylalanine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 ΔfdrA :: cat described above can be transferred to the E. coli L-phenylalanine producing strain AJ12739 using P1 transduction (Miller JH (1972 ) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain AJ12739 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545, Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) November 6, 2001 with accession number VKPM B-8197.

Оба штамма, родительский AJ12739 и полученный AJ12739-ΔfdrA, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне, 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут экспонироваться в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол:этилацетат: 25% водного аммиака:вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.Both strains, the parent AJ12739 and the obtained AJ12739-ΔfdrA, can be grown at 37 ° C for 18 hours in nutrient broth, 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 3 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes, and the cultures can be grown at 37 ° C for 48 hours on a rotary shaker. At the end of the fermentation, the amount of phenylalanine accumulated in the medium can be determined by thin layer chromatography (TLC). For this purpose, 10 × 15 cm TLC plates coated with a 0.11 mm layer of Sorbfil silica gel without a fluorescent indicator can be used (Sorbpolymer Joint-Stock Company, Krasnodar, Russia). Sorbfil plates can be exhibited in the mobile phase of the following composition: propan-2-ol: ethyl acetate: 25% aqueous ammonia: water = 40: 40: 7: 16 (v / v). A solution (2%) of ninhydrin in acetone can be used for visualization.

Состав ферментационной среды (г/л):The composition of the fermentation medium (g / l):

ГлюкозаGlucose40.040.0(NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄16.016.0К₂HPO₄K₂ HPO₄0.10.1MgSO₄·7H₂OMgSO₄ · 7H₂ O1.01.0FeSO₄·7H₂OFeSO₄ · 7H₂ O0.010.01MnSO₄·5H₂OMnSO₄ · 5H₂ O0.010.01Тиамин HClThiamine HCl0.00020.0002Дрожжевой экстрактYeast extract2.02.0ТирозинTyrosine0.1250.125СаСО₃CaCO₃20.020.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.Glucose and magnesium sulfate are sterilized separately. CaCO_{3 is} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0.

Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е.coli SV164 (pGH5)-ΔfdrAExample 9. Production of L-tryptophan by E. coli strain SV164 (pGH5) -ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е.coli SV164 (pGH5) с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм SV164 (pGH5) подробно описан в патенте США 6180373 или Европейском патенте 0662143.To assess the effect of fdrA gene inactivation on L-tryptophan production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 described above ΔfdrA :: cat can be transferred to the E. coli L-tryptophan producing strain SV164 (pGH5) using P1 transduction (Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain SV164 (pGH5) is described in detail in US Pat. No. 6,180,373 or European Patent No. 0,662,143.

Оба штамма, полученный SV164(pGH5)-ΔfdrA и родительский SV164(pGH5), могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5) (20 мг/мл). 0.3 мл полученных культур могут быть внесены в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мг/мл) в пробирках размером 20×200 мм и могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 8. Компоненты ферментационной среды представлены в Таблице 2, но группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н следует стерилизовать отдельно, как и показано в Таблице, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.Both strains, obtained SV164 (pGH5) -ΔfdrA and parent SV164 (pGH5), can be grown with stirring at 37 ° C for 18 hours in 3 ml of nutrient broth with tetracycline (plasmid marker pGH5) (20 mg / ml). 0.3 ml of the obtained cultures can be introduced into 3 ml of fermentation medium containing tetracycline (20 mg / ml) in 20 × 200 mm test tubes and can be grown at 37 ° C for 48 hours on a rotary shaker at 250 rpm. After growing, the amount of tryptophan accumulated in the medium can be determined using TLC, as described in Example 8. The components of the fermentation medium are presented in Table 2, but the groups of components A, B, C, D, E, F and H should be sterilized separately, as shown in the Table to avoid unwanted interactions during sterilization.

Пример 10. Продукция L-пролина штаммом Е.coli 702ilvA-ΔfdrAExample 10. The production of L-proline strain E. coli 702ilvA-ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-пролина ДНК-фрагменты из хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-пролина Е.coli 702ilvA с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером ВКПМ В-8012.To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on L-proline production, DNA fragments from the chromosome of the E. coli MG1655 ΔfdrA :: cat strain described above can be transferred to the E. coli 702ilvA L-proline producer strain using P1 transduction (Miller JH ( 1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain 702ilvA was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545, Moscow, 1st Road passage, 1) with accession number VKPM B-8012.

Оба штамма Е.coli 702ilvA и 702ilvA-ΔfdrA могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может производиться в тех же условиях, как описано в Примере 7.Both strains of E. coli 702ilvA and 702ilvA-ΔfdrA can be grown for 18-24 hours at 37 ° C on plates with L-agar. Then fermentation using these strains can be carried out under the same conditions as described in Example 7.

Пример 11. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382-ΔfdrAExample 11. The production of L-arginine strain E. coli 382-ΔfdrA

Для оценки влияния инактивации гена fdrA на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔfdrA::cat переносили в штамм-продуцент L-аргинина Е.coli 382 с помощью Р1-трансдукции (Miller J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926.To assess the effect of inactivation of the fdrA gene on L-arginine production, DNA fragments of the chromosome of the E. coli strain MG1655 described above ΔfdrA :: cat were transferred to the E. coli 382 L-arginine producing strain using P1 transduction (Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY). Strain 382 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 117545, Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on April 10, 2000 with accession number VKPM V-7926.

Оба штамма, полученный 382-ΔfdrA и родительский 382, выращивали при 32°С в течение 18 часов в 2 мл LB-бульона, 0.3 мл полученных культур вносили в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм и культуры выращивали при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.Both strains, obtained 382-ΔfdrA and parent 382, were grown at 32 ° C for 18 hours in 2 ml of LB broth, 0.3 ml of the obtained cultures were introduced into 2 ml of fermentation medium in 20 × 200 mm tubes, and cultures were grown at 32 ° C for 48 hours on a rotary rocking chair.

После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол:уксусная кислота:вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали, L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl₂, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты 10 независимых пробирочных ферментаций приведены в Таблице 3.After growing, the amount of L-arginine accumulated in the medium was determined by paper chromatography, and the following composition of the mobile phase was used: butanol: acetic acid: water = 4: 1: 1 (v / v). A solution of ninhydrin (2%) in acetone was used for visualization. The spot containing L-arginine was excised, L-arginine was eluted with a 0.5% aqueous solution of CdCl₂ , after which the amount of L-arginine was determined spectrophotometrically at a wavelength of 540 nm. The results of 10 independent in vitro fermentations are shown in Table 3.

Состав ферментационной среды (г/л):The composition of the fermentation medium (g / l):

ГлюкозаGlucose48.048.0(NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄35.035.0КН₂PO₄KN₂ PO₄2.02.0MgSO₄·7Н₂ОMgSO₄ · 7H₂ O1.01.0Тиамин HClThiamine HCl0.00020.0002Дрожжевой экстрактYeast extract1.01.0L-изолейцинL-isoleucine0.10.1СаСО₃CaCO₃5.05.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО₃ стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.Glucose and magnesium sulfate are sterilized separately. CaCO_{3 is} sterilized by dry heat at 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0.

Как видно из Таблицы 3, штамм 382-ΔfdrA накапливал большее количество L-аргинина по сравнению со штаммом 382.As can be seen from Table 3, strain 382-ΔfdrA accumulated a greater amount of L-arginine compared to strain 382.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to the Best Mode for Carrying Out the Invention, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.Each of the above documents has a link, and all cited documents are part of the description of the present invention.

Таблица 1Table 1ШтаммStrainOD₅₄₀OD₅₄₀Количество L-треонина, г/лThe amount of L-threonine, g / lВ-3996B-399624.8±0.724.8 ± 0.722.4±0.922.4 ± 0.9B-3996-ΔfdrAB-3996-ΔfdrA23.8±1.323.8 ± 1.326.1±1.326.1 ± 1.3

Таблица 2table 2РастворыSolutionsКомпонентComponentКонечная концентрация, г/лFinal concentration, g / lАBUTКН₂PO₄KN₂ PO₄1.51.5 NaClNaCl0.50.5 (NH₄)₂SO₄(NH₄ )₂ SO₄1.51.5 L-метионинL-methionine0.050.05 L-фенилаланинL-phenylalanine0.10.1 L-тирозинL-tyrosine0.10.1 Mameno (общий N)Mameno (total N)0.070.07ВATГлюкозаGlucose40.040.0 MgSO₄×7H₂OMgSO₄ × 7H₂ O0.30.3СFROMCaCl₂CaCl₂0.0110.011DDFeSO₄×7H₂OFeSO₄ × 7H₂ O0.0750.075 Цитрат натрияSodium citrate1.01.0ЕENa₂MoO₄×2H₂ONa₂ MoO₄ × 2H₂ O0.000150.00015 Н₃ВО₃H₃ IN₃0.00250.0025 CoCl₂×6Н₂OCoCl₂ × 6H₂ O0.000070.00007 CuSO₄×5H₂OCuSO₄ × 5H₂ O0.000250.00025 MnCl₂×4H₂OMnCl₂ × 4H₂ O0.00160.0016 ZnSO₄×7H₂OZnSO₄ × 7H₂ O0.00030.0003FFТиамин HClThiamine HCl0.0050.005GGCaCO₃CaCO₃30.030.0HHПиридоксинPyridoxine0.030.03рН раствора А доводили до значения 7.1 при помощи NH₄OH.The pH of solution A was adjusted to 7.1 with NH₄ OH.

Таблица 3Table 3ШтаммStrainOD₅₄₀OD₅₄₀Количество L-аргинина, г/лThe amount of L-arginine, g / l38238218.6±5.018.6 ± 5.09.4±0.89.4 ± 0.8382-ΔfdrA382-ΔfdrA17.5±1.017.5 ± 1.010.5±0.810.5 ± 0.8

Claims (3)

Translated fromRussian

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-треонина или L-аргинина, модифицированная таким образом, что в указанной бактерии инактивирован ген fdrA.1. A bacterium belonging to the genus Escherichia is a producer of L-threonine or L-arginine, modified in such a way that the fdrA gene is inactivated in this bacterium.2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный ген fdrA инактивирован за счет делеции гена fdrA в хромосоме бактерии.2. The bacterium according to claim 1, characterized in that said fdrA gene is inactivated due to deletion of the fdrA gene in the bacterial chromosome.3. Способ получения L-треонина или L-аргинина, включающий выращивание бактерии по любому из пп.1 и 2 в питательной среде, вызывающее продукцию и накопление указанной L-аминокислоты в культуральной жидкости; выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.3. A method for producing L-threonine or L-arginine, comprising growing a bacterium according to any one of claims 1 and 2 in a nutrient medium, causing production and accumulation of said L-amino acid in the culture fluid; the allocation of the specified L-amino acids from the culture fluid.

Images