RU2335296C1 - Pharmaceutical composition for prevention and treatment of neurologic diseases - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: pharmaceutical composition as a medical product includes low-sialyl forms of erythropoetin with the content of 6-8 remainders of sialine acids per protein molecule. The invention provides expansion of an arsenal of effective medical products for treatment of neurologic diseases.

EFFECT: expansion of an arsenal of effective medical products for treatment of neurologic diseases.

3 dwg, 2 tbl, 4 ex

Description

Translated fromRussian

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и фармацевтике и может быть использовано для профилактики и лечения неврологических заболеваний.The invention relates to medicine, biotechnology and pharmaceuticals and can be used for the prevention and treatment of neurological diseases.

Все неврологические заболевания условно подразделяются по двум основным признакам: функциональные нарушения, когда структурные элементы органа еще не пострадали, и органические поражения, когда страдает сама структура. Если функциональные расстройства могут быть полностью восстановлены, то органические - только за счет новых элементов, старые уже повреждены. Наиболее известные органические заболевания нервной системы: болезнь Альцгеймера, Паркинсона, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, последствия инсультов, нейротравм и пр.All neurological diseases are conditionally divided into two main signs: functional disorders, when the structural elements of the organ have not yet been affected, and organic lesions, when the structure itself suffers. If functional disorders can be completely restored, then organic ones - only due to new elements, old ones are already damaged. The most famous organic diseases of the nervous system: Alzheimer's, Parkinson's disease, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, the effects of strokes, neurotrauma, etc.

Многие заболевания нервной системы, включая рассеянный склероз, характеризуются повреждениями нервной ткани в результате какого-либо инфекционного или аутоиммунного процесса (рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз), перенесенных нейроинфекций (клещевой энцефалит), нарушений мозгового кровообращения (инсульт), после травмы и пр., а также повреждениями проводящих путей (аксональных связей) между нейронами (аксонопатия).Many diseases of the nervous system, including multiple sclerosis, are characterized by damage to the nervous tissue as a result of any infectious or autoimmune process (multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis), previous neuroinfections (tick-borne encephalitis), cerebrovascular accidents (stroke), after an injury, etc. as well as damage to the conduction paths (axonal connections) between neurons (axonopathy).

Известно применение для лечения неврологических заболеваний лекарственного препарата КОРТЕКСИН. Согласно фармацевтической статье №99/136/14 от 09.07.1998 г. КОРТЕКСИН представляет собой комплексный препарат, состоящий из полипептидного комплекса (50%) и глицина (50%).It is known to use the drug CORTEXIN for the treatment of neurological diseases. According to pharmaceutical article No. 99/136/14 of July 9, 1998, CORTEXIN is a complex preparation consisting of a polypeptide complex (50%) and glycine (50%).

КОРТЕКСИН применяют для больных при черепно-мозговой травме, нарушениях мозгового кровообращения, вирусных и бактериальных нейроинфекциях, астенических состояниях, энцефалопатиях различного генеза, острых и хронических энцефалитах и энцефаломиелитах, эпилепсии, нарушениях памяти, мышления, сниженной способности к обучению, надсегментарных вегетативных расстройствах различных формах детского церебрального паралича, задержке психомоторного и речевого развития у детей.CORTEXIN is used for patients with traumatic brain injury, cerebrovascular accidents, viral and bacterial neuroinfections, asthenic conditions, encephalopathies of various origins, acute and chronic encephalitis and encephalomyelitis, epilepsy, memory impairment, thinking, reduced learning ability, various forms of learning cerebral palsy, delayed psychomotor and speech development in children.

КОРТЕКСИН обладает тканеспецифическим действием на кору головного мозга, оказывает церебропротекторное (защищает мозг), ноотропное (улучшает обменные процессы нейрона), противосудорожное действие, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, стимулирует репаративные процессы в головном мозге (восстановление структуры ткани). Механизм действия Кортексина связан с его метаболической (обмен веществ) активностью: препарат регулирует соотношение тормозных и возбуждающих аминокислот, уровень серотонита и дофамина (одни из множества важных белков, регулирующих в основном внутримозговые функции), оказывает гамкергическое действие, обладает антиоксидантной активностью и способностью восстанавливать биоэлектрическую активность головного мозга. При описании действия КОРТЕКСИНА приводится достаточно широкий спектр состояний, когда препарат оказывался эффективным.CORTEXIN has a tissue-specific effect on the cerebral cortex, has cerebroprotective (protects the brain), nootropic (improves the metabolic processes of the neuron), anticonvulsant effect, reduces the toxic effects of neurotropic substances, improves learning and memory, stimulates the reparative processes in the brain (restoration of tissue structure) . The mechanism of action of Cortexin is associated with its metabolic (metabolism) activity: the drug regulates the ratio of inhibitory and excitatory amino acids, the level of serotonite and dopamine (one of the many important proteins that regulate mainly intracerebral functions), has a hamkergic effect, has antioxidant activity and the ability to restore bioelectric brain activity. When describing the action of CORTEXIN, a fairly wide range of conditions is given when the drug was effective.

Однако эффекты КОРТЕКСИНА ограничены головным мозгом и не имеется данных о действии препарата на периферии, в частности на проводящие пути нервной системы, а именно на регенерацию аксонов. Кроме того, отсутствуют сведения об иммуномодулирующем действии КОРТЕКСИНА при аутоиммунных заболеваниях. Многие заболевания центральной нервной системы, в том числе рассеянный склероз имеют аутоиммунный механизм, а повреждение нейронов - следствие аутоиммунной атаки. Отсутствие точных биохимических характеристик препарата (действие препарата неопределенно вследствие того, что сам экстракт не может иметь формулы из-за его сложной структуры, а также в связи с вариабельностью биологических характеристик исходного сырья) не дает возможности его стандартизации. Препарат получается из потенциально небезопасного сырья (мозг крупного рогатого скота), сведения о проведении контроля на прионовую безопасность (отсутствие возбудителя губчатого энцефалита - «коровьего бешенства») отсутствуют (очевидно, этот контроль просто не производится).However, the effects of CORTEXIN are limited to the brain and there is no data on the effect of the drug on the periphery, in particular on the pathways of the nervous system, namely, axon regeneration. In addition, there is no information about the immunomodulating effect of CORTEXIN for autoimmune diseases. Many diseases of the central nervous system, including multiple sclerosis, have an autoimmune mechanism, and damage to neurons is a consequence of an autoimmune attack. The lack of accurate biochemical characteristics of the drug (the effect of the drug is vague due to the fact that the extract itself cannot have a formula due to its complex structure, and also due to the variability of the biological characteristics of the feedstock) does not allow standardization. The drug is obtained from potentially unsafe raw materials (the brain of cattle), there is no information on prion safety monitoring (the absence of the causative agent of spongiform encephalitis - “mad cow”) (obviously, this control is simply not performed).

Известно лекарственное вещество того же назначения по отношению к заявленному изобретению - эритропоэтин (далее - ЭПО) - гормон организма млекопитающих, в том числе человека, продуцируемый интерстициальными клетками почек и регулирующий эритропоэз у млекопитающих. Циркулирующий в крови гликопротеидный гормон ЭПО обеспечивает контроль дифференцировки клеток эритроидного ряда, т.е. представляет собой высокоспецифичный природный индуктор эритропоэза.It is known a medicinal substance of the same purpose with respect to the claimed invention - erythropoietin (hereinafter - EPO) - a hormone of the body of mammals, including humans, produced by interstitial cells of the kidneys and regulating erythropoiesis in mammals. The glycoprotein hormone EPO circulating in the blood provides control of the differentiation of erythroid cells, i.e. It is a highly specific natural inducer of erythropoiesis.

В 1986-1987 гг. были проведены клинические испытания рекомбинантного ЭПО (РЭПО), продуцируемого клетками млекопитающих (Eschbach J.W., Egrie J.C., Dowing M.R., et al., N.Eng.J.Med., 316. 73-78, 1987; Jelkmann W., Curr. Pharmaceut. Biotechnol., 1, 11-31, 2000), и он с успехом был введен в клиническую практику для коррекции анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью в 1989 г., и утвердился в качестве золотого стандарта высокоспецифического лечения данного заболевания. В настоящее время РЭПО широко применяется для лечения больных в областях, связанных со стимуляцией гемо- и эритропоэза.In 1986-1987 clinical trials of recombinant EPO (REPO) produced by mammalian cells (Eschbach JW, Egrie JC, Dowing MR, et al., N. Eng. J. Med., 316. 73-78, 1987; Jelkmann W., Curr. Pharmaceut. Biotechnol., 1, 11-31, 2000), and it has been successfully introduced into clinical practice for the correction of anemia associated with chronic renal failure in 1989, and has established itself as the gold standard for the highly specific treatment of this disease. Currently, REPO is widely used to treat patients in areas related to the stimulation of hemo- and erythropoiesis.

РЭПО обладает высокой специфичностью и действует в очень низких концентрациях при практически полном отсутствии побочных эффектов. Рекомбинантный ЭПО почти полностью идентичен природному гормону и представляет собой семейство близкородственных белков с одинаковой полипептидной цепью, включающей 165 аминокислот, ковалентно связанных с четырьмя разветвленными олигосахаридными цепями, составляющими около 40% общей массы молекулы 30400 Д. Олигосахаридные цепи терминально сиалированы, причем степень модификации, достигающая 14 остатков сиаловых кислот на молекулу ЭПО, служит доминирующим фактором, ответственным за проявление гематопоэтической активности in vivo (Strickland T.W., U.S. Patent, 5856298, 5 Jan., 1999).REPO is highly specific and acts at very low concentrations with almost no side effects. Recombinant EPO is almost completely identical to natural hormone and is a family of closely related proteins with the same polypeptide chain, including 165 amino acids covalently linked to four branched oligosaccharide chains, comprising about 40% of the total molecular weight of 30400 D. The oligosaccharide chains are terminally sialylated, with a degree of modification reaching 14 sialic acid residues per EPO molecule, is the dominant factor responsible for the in vivo hematopoietic activity (Strickland TW, U . S. Patent, 5856298, 5 Jan., 1999).

В настоящее время установлено (Grasso G., Sfacteria A., Cerami A., Brines M., Neuroscientist, 10, 93-98, 2004), что РЭПО способен предотвращать спазм сосудов, развитие воспалительного процесса и индукцию апоптоза не только у кроветворных клеток, но и у многих других типов клеток - нейронов, кардиомиоцитов и пр. Показано (Jelkmann W., Current Pharmaceut. Biotechnol., 6, 65-79, 2005), что молекулы РЭПО могут преодолевать гематоэнцефалический барьер и уменьшать площадь некротического поражения коры головного мозга при инсультах, стимулировать частичную регенерацию аксонов. На моделях рассеянного склероза продемонстрирована (Sattier M.B., Merkler D., Maier К., Stadelman С., Enhreich H., Bahr M., Diem R., Cell. Death. Differ., 11, Suppl. 2, S181-92, 2004.) способность РЭПО уменьшать демиелинизацию и повреждение аксонов. Нейротропное действие РЭПО показано также для нейронов спинного мозга (церебральная ишемия, компрессия спинного мозга, ишиаз) и периферических нервных клеток. В связи с выявленными новыми свойствами РЭПО рассматривается в качестве перспективного препарата для лечения широкого спектра неврологических заболеваний, характеризующихся аксонопатией.It has now been established (Grasso G., Sfacteria A., Cerami A., Brines M., Neuroscientist, 10, 93-98, 2004) that REPO is able to prevent vascular spasm, the development of the inflammatory process and the induction of apoptosis not only in hematopoietic cells , but also in many other types of cells - neurons, cardiomyocytes, etc. It has been shown (Jelkmann W., Current Pharmaceut. Biotechnol., 6, 65-79, 2005) that REPO molecules can cross the blood-brain barrier and reduce the area of necrotic lesion of the cerebral cortex brain stroke, stimulate the partial regeneration of axons. Demonstrated on models of multiple sclerosis (Sattier MB, Merkler D., Maier K., Stadelman C., Enhreich H., Bahr M., Diem R., Cell. Death. Differ. 11, Suppl. 2, S181-92, 2004.) The ability of REPO to reduce demyelination and axon damage. The neurotropic effect of REPO is also indicated for spinal cord neurons (cerebral ischemia, spinal cord compression, sciatica) and peripheral nerve cells. In connection with the revealed new properties, REPO is considered as a promising drug for the treatment of a wide range of neurological diseases characterized by axonopathy.

Как известно, рекомбинантный человеческий эритропоэтин имеет несколько изоформ. Клетки, производящие рекомбинантный эритропоэтин, синтезируют приблизительно 15 различных изоформ, отличающихся содержанием сиаловых кислот от 0 до 14 молекул на молекулу эритропоэтина. Смесь изоформ разделяется на фракции по содержанию сиаловых кислот.Фракция, содержащая изоформы (6 шт.) со средним количеством сиаловых кислот не менее 10 молекул на молекулу эритропоэтина, составляет фракцию высокосиалированного эритропоэтина (ВЭПО), который и используется в настоящее время для лечения анемии. До настоящего времени интересы производителей направлены на производство и сохранение клеточных линий, секретирующих (выделяющих) ЭПО, обладающий большим эффектом в отношении стимуляции гемо-эритропоэза. Это, в частности, достигается за счет увеличения содержания в ЭПО сиаловых кислот, заряда молекулы и продолжительности ее жизни в организме. Низкосиалированные формы ЭПО (НЭПО), являющиеся в существующих технологиях отходами производства, удаляются в процессе очистки препарата для повышения его эффективности при лечении анемий.As is known, recombinant human erythropoietin has several isoforms. Recombinant erythropoietin producing cells synthesize approximately 15 different isoforms, differing in sialic acid content from 0 to 14 molecules per erythropoietin molecule. The mixture of isoforms is divided into fractions according to the content of sialic acids. A fraction containing isoforms (6 pcs.) With an average amount of sialic acids of at least 10 molecules per molecule of erythropoietin forms the fraction of highly sialic erythropoietin (VEPO), which is currently used to treat anemia. Until now, the interests of manufacturers are focused on the production and preservation of cell lines secreting (secreting) EPO, which has a great effect on the stimulation of hemo-erythropoiesis. This, in particular, is achieved by increasing the content of sialic acids in the EPO, the charge of the molecule, and its lifespan in the body. Low-sialylated forms of EPO (NEPO), which are production waste in existing technologies, are removed during the purification of the drug to increase its effectiveness in the treatment of anemia.

Однако эксперименты на животных показывают, что дозы РЭПО, используемые для лечения заболеваний головного мозга, должны быть существенно выше, чем при лечении анемии (Digicaylioglu M., Lipton S.A., Nayure, 412. 641-647, 2001). Фармакологические дозы ЭПО стимулируют продукцию гиперреактивных тромбоцитов, что может приводить к тромбозам (Brines M.L., Chezzi P., Keenan S., Agnello D., de Lanerolle N.C., Cerami C., Itri L.M., Cerami A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 10526-10531, 2000). Многократное введение РЭПО может также вызвать увеличение массы красных кровяных клеток. На моделях с использованием животных показано, что ЭПО - зависимое увеличение гематокрита может вызывать и амплифицировать повреждения мозга (Xenocostas A, Cheung W.K., Farrell F.X., et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22, 230, 2003).However, animal experiments show that the doses of REPO used to treat brain diseases should be significantly higher than in the treatment of anemia (Digicaylioglu M., Lipton S.A., Nayure, 412. 641-647, 2001). Pharmacological doses of EPO stimulate the production of hyperreactive platelets, which can lead to thrombosis (Brines ML, Chezzi P., Keenan S., Agnello D., de Lanerolle NC, Cerami C., Itri LM, Cerami A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 10526-10531, 2000). Repeated administration of REPO can also cause an increase in the mass of red blood cells. In animal models, it has been shown that EPO-dependent increase in hematocrit can cause and amplify brain damage (Xenocostas A, Cheung WK, Farrell FX, et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22, 230, 2003) .

С целью исключения гематопоэтического действия препарата, в результате обработки нейроминидазой были изучены защитные свойства формы эритропоэтина, полностью лишенной сиаловых кислот (асиалированный ЭПО), (Erbayraktar S., Grasso G., Sfacteria A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100. 6741-6746. 2003). Оказалось, что при очень коротком времени жизни в плазме и, как следствие, отсутствии эритроидной активности асиалированный ЭПО в фармакологических дозах проникает через гематоэнцефалический барьер, связывается с рецепторами ЭПО в коре и гиппокампе и обладает защитными свойствами, аналогичными сиалированному эритропоэтину (Brines М, Cerami A., Cerami С., U.S. Patent, 0034799 А1, 16 Feb., 2006). Недостатком подобного препарата для практического применения является очевидная технологическая сложность его получения и низкая стабильность в водных растворах.In order to exclude the hematopoietic effect of the drug, as a result of treatment with neurominidase, the protective properties of the erythropoietin form completely devoid of sialic acids (asialized EPO) were studied (Erbayraktar S., Grasso G., Sfacteria A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100.6741-6746. 2003). It turned out that with a very short plasma life and, as a result, the absence of erythroid activity, asialized EPO in pharmacological doses penetrates the blood-brain barrier, binds to EPO receptors in the cortex and hippocampus and has protective properties similar to sialylated erythropoietin (Brines M, Cerami A ., Cerami S., U.S. Patent, 0034799 A1, 16 Feb., 2006). The disadvantage of this drug for practical use is the obvious technological complexity of its preparation and low stability in aqueous solutions.

В водных растворах эритропоэтин является очень нестабильным веществом. Концентрация гормона в препаратах составляет десятки микрограммов на мл и он легко инактивируется за счет факторов окружающей среды, в том числе за счет адгезии к поверхности сосудов из стекла и пластика.In aqueous solutions, erythropoietin is a very unstable substance. The concentration of the hormone in the preparations is tens of micrograms per ml and it is easily inactivated due to environmental factors, including due to adhesion to the surface of vessels made of glass and plastic.

Известен препарат ЭПО «Эритростим» (ФС 42-3656-98), содержащий альбумин сыворотки крови человека в качестве стабилизатора. Недостатками препарата являются возможность контаминации инфекционными вирусами, аллергенность для лиц с повышенной чувствительностью к препаратам белков крови, высокая стоимость апирогенных препаратов человеческого альбумина.Known drug EPO "Erythrostim" (FS 42-3656-98), containing human serum albumin as a stabilizer. The disadvantages of the drug are the possibility of contamination with infectious viruses, allergenicity for individuals with increased sensitivity to blood protein preparations, and the high cost of pyrogen-free human albumin preparations.

Из известных препаратов близким по составу к предлагаемому является водный раствор высокосиалированного ЭПО, содержащий в качестве стабилизатора низкомолекулярный декстран с молекулярной массой 30000-60000 в концентрации 6-10 мас.%. Раствор содержит также хлористый натрий, цитрат натрия и лимонную кислоту для создания изотонии и рН 6,5-7,5. Количество ЭПО составляет 5-40 мкг на мл раствора. Раствор может быть получен добавлением цитрата натрия и лимонной кислоты к плазмозаменяющему раствору «Реополиглюкин».Of the known preparations, close in composition to the proposed one is an aqueous solution of highly salted EPO containing low molecular weight dextran with a molecular weight of 30000-60000 in a concentration of 6-10 wt.% As a stabilizer. The solution also contains sodium chloride, sodium citrate and citric acid to create isotonia and a pH of 6.5-7.5. The amount of EPO is 5-40 μg per ml of solution. The solution can be prepared by adding sodium citrate and citric acid to the Reopoliglukin plasma exchange solution.

Наиболее близким лекарственным препаратом аналогичного назначения, выбранным в качестве прототипа, является известная («Стабилизированный водный раствор эритропоэтина» RU 2128517 С1, 04.10. 1999) фармацевтическая композиция (далее - ФК), содержащая высокосиалированный ЭПО в качестве активного вещества и раствор низкомолекулярного декстрана (реополиглюкин) в качестве стабилизатора.The closest drug of similar purpose, selected as a prototype, is the well-known ("Stable aqueous solution of erythropoietin" RU 2128517 C1, 04.10. 1999) pharmaceutical composition (hereinafter - FC) containing highly sialylated EPO as an active substance and a solution of low molecular weight dextran (reopoliglukin ) as a stabilizer.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала эффективных лекарственных средств для неврологических заболеваний.The objective of the present invention is to expand the arsenal of effective drugs for neurological diseases.

Основной технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, заключается в реализации данного назначения: создании нового, более эффективного препарата для лечения неврологических заболеваний.The main technical result obtained by the implementation of the invention is the implementation of this purpose: the creation of a new, more effective drug for the treatment of neurological diseases.

Данный технический результат достигается за счет того, что в известной фармацевтической композиции в качестве ее активного начала используются низкосиалированные формы эритропоэтина с содержанием 6-8 остатков сиаловых кислот на молекулу белка.This technical result is achieved due to the fact that in the known pharmaceutical composition, low sialylated forms of erythropoietin with a content of 6-8 sialic acid residues per protein molecule are used as its active principle.

В графических материалах на диаграммах представлено:In the graphic materials on the diagrams are presented:

Фиг.1 - выживаемость клеток TF1 в отсутствие G-CSF при добавлении 15 нг/мл НЭПО и ЭПО.Figure 1 - the survival of TF1 cells in the absence of G-CSF with the addition of 15 ng / ml NEPO and EPO.

Фиг.2 - влияние препаратов НЭПО и ЭПО в концентрации 3 нМ на экспрессию нейротрофических факторов в культивируемых клетках астроцитов коры больших полушарий мозга крысы после инкубации в течение 4 час (белый - контроль, черный - НЭПО, серый - ЭПО).Figure 2 - effect of NEPO and EPO preparations at a concentration of 3 nM on the expression of neurotrophic factors in cultured rat cortex astrocyte cells after incubation for 4 hours (white - control, black - NEPO, gray - EPO).

Фиг.3 - влияние препаратов НЭПО и ЭПО на экспрессию нейротрофический факторов в коре мозга крысы через 1 час после внутрибрюшинного введения препарата (100 мкг/кг веса).Figure 3 - the effect of drugs NEPO and EPO on the expression of neurotrophic factors in the cerebral cortex of rats 1 hour after intraperitoneal administration of the drug (100 μg / kg weight).

Смысл изобретения заключается в использовании изоформ эритропоэтина, обладающих низкой гематопоэтической активностью, но полностью сохраняющих способность взаимодействовать с нервными клетками.The meaning of the invention is the use of isoforms of erythropoietin with low hematopoietic activity, but fully retaining the ability to interact with nerve cells.

В предлагаемой фармацевтической композиции количество активного вещества составляет 50-500 мкг/мл или 0,005-0,05% от общей массы. Интервал содержания активного вещества обусловлен необходимым содержанием ЭПО в инъекционной форме препарата, т.е. его возможной минимальной и максимальной одноразовой дозой. Стабилизатором ЭПО в ФК может служить раствор низкомолекулярного декстрана (10%) - реополиглюкин, который использован для получения растворов низкосиалированной формы ЭПО в концентрации 50-500 мкг на мл раствора, либо другие синтетические стабилизирующие добавки, выбранные из группы, включающей полиэтиленгликоль, белки, сахара, аминокислоты и т.д. Реополиглюкин является разрешенным медицинским препаратом который благодаря высокому содержанию полисахаридов (10%) проявляет высокие стабилизирующие свойства с полным сохранением активности ЭПО. В результате, содержание активного препарата в растворах сохраняется в течение года при хранении в темном месте при 2-5°С.In the proposed pharmaceutical composition, the amount of active substance is 50-500 μg / ml or 0.005-0.05% of the total mass. The interval of active substance content is determined by the necessary EPO content in the injection form of the drug, i.e. its possible minimum and maximum single dose. The EPO stabilizer in FC can be a solution of low molecular weight dextran (10%) - reopoliglukin, which is used to obtain solutions of the low-sialized form of EPO at a concentration of 50-500 μg per ml of solution, or other synthetic stabilizing additives selected from the group comprising polyethylene glycol, proteins, sugars amino acids, etc. Reopoliglyukin is an approved medication which, due to its high polysaccharide content (10%), exhibits high stabilizing properties with full preservation of EPO activity. As a result, the content of the active drug in solutions is maintained for a year when stored in a dark place at 2-5 ° C.

Биологическая активность растворов была определена в тестах in vitro с использованием клеток TF-1 (фиг.1).The biological activity of the solutions was determined in vitro tests using TF-1 cells (FIG. 1).

Концентрацию низкосиалированного ЭПО в водных растворах после их получения и по истечении одного года хранения определяли спектрофотометрически, исходя из значения оптической плотности субстанции при 280 нм с коррекцией на светорассеяние при 400 нм, например:The concentration of low-sialylated EPO in aqueous solutions after their preparation and after one year of storage was determined spectrophotometrically based on the optical density of the substance at 280 nm with correction for light scattering at 400 nm, for example:

C=1,34(A₂₈₀-A₄₀₀),C = 1.34 (A₂₈₀ -A₄₀₀ ),

где с - рассчитываемая концентрация ЭПО,where c is the calculated concentration of EPO,

А₂₈₀ - значение поглощения при 280 нм,And₂₈₀ is the absorption value at 280 nm,

А₄₀₀ - значение поглощения при 400 нм,And₄₀₀ is the absorption value at 400 nm,

1,34 - коэффициент экстинкции низкосиалированного ЭПО (значение оптической плотности при 280 нм раствора с концентрацией 1 мг/мл).1.34 - extinction coefficient of low-sialylated EPO (optical density at 280 nm of a solution with a concentration of 1 mg / ml).

Анализ показал, что содержание препарата в водном растворе после хранения при 5°С составляет 97% от номинальной.The analysis showed that the content of the drug in the aqueous solution after storage at 5 ° C is 97% of the nominal.

Заявляемый препарат обладает низкой гематопоэтической активностью (порядка 10% от стандартного препарата ЭПО «Эритростим»). Исследование токсичности препарата показало, что дозы, характеризующие токсичность, не определяются: ЛД₅₀ для мышей составляет более чем 7 мг/кг, для крыс - более чем 9 мг/кг.The inventive drug has a low hematopoietic activity (about 10% of the standard drug EPO "Erythrostim"). A study of the toxicity of the drug showed that doses characterizing toxicity are not determined: LD₅₀ for mice is more than 7 mg / kg, for rats - more than 9 mg / kg.

Уменьшение содержания сиаловых кислот приводит к потере стабильности гормона in vivo, но не влияет на его активность in vitro. Уменьшение стабильности при лечении неврологических заболеваний является преимуществом вследствие того, что эффект препарата не аккумулируется и препарат, подействовав, разрушается обычным физиологическим путем.A decrease in the content of sialic acids leads to a loss of stability of the hormone in vivo, but does not affect its activity in vitro. The decrease in stability in the treatment of neurological diseases is an advantage due to the fact that the effect of the drug does not accumulate and the drug, having acted, is destroyed in the usual physiological way.

В таблице 1 приведены сравнительные характеристики РЭПО и его низкосиалированной формы, которая используется в заявленной фармацевтической композиции (ФК).Table 1 shows the comparative characteristics of REPO and its low-sialylated form, which is used in the claimed pharmaceutical composition (FC).

Таблица 1Table 1 РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЭРИТРОПОЭТИНRECOMBINANT ERYTHROPOETINНИЗКОСИАЛИРОВАННАЯ ФОРМА РЭПОLOW REPOSED FORMФизические свойстваPhysical propertiesПрозрачный бесцветный раствор, слегка опалесцирующий при концентрациях более 2,5 мг/млTransparent colorless solution, slightly opalescent at concentrations greater than 2.5 mg / mlПрозрачный бесцветный раствор, слегка опалесцирующий при концентрациях более 2,5 мг/млTransparent colorless solution, slightly opalescent at concentrations greater than 2.5 mg / mlДСН/ПААГ - Вестерн-блотSDS / PAGE - Western BlotОдна нечеткая полоса около 36 кДаOne fuzzy band about 36 kDaОдна нечеткая полоса около 36 кДаOne fuzzy band about 36 kDaСодержание ДНКDNA content10 пкг на 10000 единиц ЭПО10 pkg per 10,000 units of EPO10 пкг на 10000 единиц ЭПО10 pkg per 10,000 units of EPOСодержание углеводовCarbohydrate content40%40%40%40%Содержание остатков сиаловых кислотThe content of sialic acid residues10-12 на молекулу10-12 per molecule6-8 на молекулу6-8 per moleculeИзоэлектрическое фокуусированиеIsoelectric Focusingpl 3.2-4.5pl 3.2-4.5pl 4,1-4.8pl 4.1-4.8

Содержание эндотоксиновEndotoxin content<20 единиц эндотоксина/1 мг ME ЭПО<20 units of endotoxin / 1 mg ME EPO<20 единиц эндотоксина/1 мг ЭПО<20 units of endotoxin / 1 mg EPOВЭЖХHPLCМенее 0,3% олигомерных формLess than 0.3% oligomeric formsМенее 0,3% олигомерных формLess than 0.3% oligomeric formsПримесные белки (ИФА)Impurity Proteins (ELISA)Менее 0,3%Less than 0.3%Менее 0,3%Less than 0.3%Удельная активность in vivoSpecific activity in vivoБолее 130000 ME/A₂₈₀Over 130,000 ME / A₂₈₀Менее 15000 ME/A₂₈₀Less than 15,000 ME / A₂₈₀N-концевая последовательностьN-terminal sequenceAla-Pro-Pro-Arg-Leu-ILe-(X)-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-TyrAla-Pro-Pro-Arg-Leu-ILe- (X) -Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-TyrAla-Pro-Pro-Arg-Leu-ILe-(X)-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-TyrAla-Pro-Pro-Arg-Leu-ILe- (X) -Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-TyrПептидная картаPeptide mapСоответствует международному стандартуConforms to the international standardСоответствует международному стандартуConforms to the international standard

Данные по активности высокосиалированного и низкосиалированного препарата, приведенные в таблице, получены нами в соответствии с рекомендациями ФС 42-3658-98 от 11.02.1999. Принципиально они соответствуют данным, приведенным в патенте US 5856298.The data on the activity of the highly salted and low-salted preparation given in the table were obtained by us in accordance with the recommendations of FS 42-3658-98 of 02/11/1999. In principle, they correspond to the data given in patent US 5856298.

Сравнительное исследование нейрофизиологической активности препаратов РЭПО и низкосиалированного ЭПО проводили в экспериментах in vitro и in vivo, изучая их влияние на регуляцию экспрессии нейротофических факторов NGF и BDNF. Нейротрофины - семейство регуляторных белков нервной ткани, которые синтезируются нейронами и клетками нейроглии, и способствуют дифференцировке и поддержанию жизнеспособности и функционирования периферических и центральных нейронов. При этом используется аутокринный и паракринный механизмы регуляции. Нейротрофины регулируют нейрональную дифференцировку, индуцируют ветвление дендритов (арборизацию) и рост аксонов (спрутинг) в направлении клеток-мишеней. В зрелой нервной системе нейротрофины регулируют как краткосрочную синаптическую передачу, так и долговременное потенцирование, участвуя таким образом в обеспечении пластичности нервной системы, необходимой для ее нормального функционирования. Регуляция экспрессии нейротрофинов и их рецепторов в мозге в настоящее время рассматривается как один из самых перспективных путей воздействия на ряд патологических состояний ЦНС, связанных с дегенерацией и гибелью нейронов. В то же время известные к настоящему времени соединения, способные регулировать экспрессию нейротрофинов в мозге, например антидепрессанты, обладают негативными побочными эффектами, ограничивающими их использование.A comparative study of the neurophysiological activity of REPO and low-sialylated EPO preparations was carried out in vitro and in vivo experiments, studying their effect on the regulation of the expression of neurotophic factors NGF and BDNF. Neurotrophins are a family of regulatory proteins of the nervous tissue, which are synthesized by neurons and neuroglia cells, and contribute to the differentiation and maintenance of the viability and functioning of peripheral and central neurons. In this case, autocrine and paracrine regulatory mechanisms are used. Neurotrophins regulate neuronal differentiation, induce branching of dendrites (arborization) and axon growth (sprouting) in the direction of target cells. In the mature nervous system, neurotrophins regulate both short-term synaptic transmission and long-term potentiation, thus participating in ensuring the plasticity of the nervous system necessary for its normal functioning. Regulation of the expression of neurotrophins and their receptors in the brain is currently considered as one of the most promising ways of influencing a number of pathological conditions of the central nervous system associated with degeneration and death of neurons. At the same time, currently known compounds capable of regulating the expression of neurotrophins in the brain, for example antidepressants, have negative side effects that limit their use.

Для культивируемых нейроглиальных клеток коры больших полушарий крысы показано, что в концентрации 3 нМ происходит статистически достоверная стимуляция экспрессии как BDNF, так и NGF в 2-5 раз по сравнению с контролем через 1 и 4 часа после введения препаратов. Наиболее высокая стимуляция экспрессии нейротрофического фактора BDNF через 4 часа после введения отмечена для низкосиалированной формы ЭПО, которая составила 340% от контроля (Фиг.2).For cultured rat neuroglial cells of the cerebral cortex, it was shown that at a concentration of 3 nM there was a statistically significant stimulation of the expression of both BDNF and NGF 2-5 times in comparison with the control 1 and 4 hours after drug administration. The highest stimulation of the expression of the neurotrophic factor BDNF 4 hours after administration was noted for the low-sialylated form of EPO, which amounted to 340% of the control (Figure 2).

Аналогичный результат был получен при исследовании влияния препаратов на экспрессию NGF и BDNF в коре головного мозга in vivo. Через час после введения РЭПО и его низкосиалированной формы происходит статистически достоверная стимуляция экспрессии обоих нейротрофинов в 2-3 раза (Фиг.3).A similar result was obtained by studying the effect of drugs on the expression of NGF and BDNF in the cerebral cortex in vivo. One hour after the introduction of REPO and its low-sialylated form, a statistically significant stimulation of the expression of both neurotrophins occurs 2-3 times (Figure 3).

Пример 1 (изготовление лекарственной формы)Example 1 (manufacture of dosage form)

К реополиглюкину добавляют цитрат натрия и лимонную кислоту с доведением рН раствора до 6,5-7,5 и затем добавляют субстанцию низкосиалированной формы эритропоэтина. Полученный раствор подвергают стерилизующему фильтрованию с использованием фильтровальных элементов Millex (Millipore) 0,22 мкм. Полученные растворы помещают в ампулы из нейтрального стекла или стеклянные флаконы из дрота вместимостью 3-5 мл. Ампулы и флаконы закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.Sodium citrate and citric acid are added to reopolyglucin to adjust the pH of the solution to 6.5-7.5, and then a substance of a low-sialylated form of erythropoietin is added. The resulting solution was subjected to sterilizing filtration using 0.22 μm Millex (Millipore) filter elements. The resulting solutions are placed in neutral glass ampoules or glass bottles from a dracon with a capacity of 3-5 ml. Ampoules and vials are closed with rubber stoppers and rolled around with aluminum caps.

Пример 2Example 2

Для исследования цитопротекторной активности низкосиалированного ЭПО в сравнении с РЭПО использовали человеческую эритролейкозную клеточную линию TF-1, которая применяется для тестирования различных цитокинов (IL-3, IL-5, GM-CSF, ЕРО), NGF, TGF-B. Эти универсальные клетки могут быть использованы как в пролиферативном, так и в антиапоптотическом вариантах теста для определения биологической активности экзогенных клеточных регуляторов.To study the cytoprotective activity of low-sialylated EPO in comparison with REPO, we used the human erythroleukemic cell line TF-1, which is used to test various cytokines (IL-3, IL-5, GM-CSF, EPO), NGF, TGF-B. These universal cells can be used in both proliferative and anti-apoptotic versions of the test to determine the biological activity of exogenous cell regulators.

Клетки TF-1, как и другие клетки эритроидного ряда, содержат 2 типа эритропоэтиновых рецепторов (EpoR) - высокоаффинный (EpoR2) и низкоаффинный (EpoR1). Рецептор EpoR2 характерен только для эритроидных клеток. EpoR1 обнаружен в клетках различного происхождения: кардиомиоцитах, периферических нейронах, клетках головного мозга (нейроны, глиальные клетки, астроциты) и т.д. (Leist M., Chezzi P., Grasso G., Bianchini R.,et al., Science, 305, 239-242). Наличием низкоаффинных рецепторов (EpoR1) объясняется, по-видимому, антиапоптотическое действие Еро на неэритроидные клетки как in vitro, так и in vivo.TF-1 cells, like other cells of the erythroid series, contain 2 types of erythropoietin receptors (EpoR) - high affinity (EpoR2) and low affinity (EpoR1). The EpoR2 receptor is characteristic only of erythroid cells. EpoR1 is found in cells of various origins: cardiomyocytes, peripheral neurons, brain cells (neurons, glial cells, astrocytes), etc. (Leist M., Chezzi P., Grasso G., Bianchini R., et al., Science, 305, 239-242). The presence of low affinity receptors (EpoR1) apparently explains the antiapoptotic effect of EPO on non-erythroid cells both in vitro and in vivo.

Препараты ЭПО исследовали в пролиферативном тесте (MTS-test - CellTiter 96 Aqueous Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Цитопротекторная активность препаратов изучалась при удалении из среды культивирования GM-CSF.EPO preparations were investigated in a proliferative test (MTS-test - CellTiter 96 Aqueous Solution Cell Proliferation Assay, Promega). The cytoprotective activity of the drugs was studied when GM-CSF was removed from the culture medium.

Клетки TF-1 рассевали в 96-луночные платы по 10000 клеток на лунку в среде следующего состава: RPMI 1640, 10 mM HEPES, 20 тМ глюкоза, 2% FCS и инкубировали при 37°С, 5% CO₂ 3 суток с различными концентрациями препаратов. Количество живых клеток в лунках определяли после окрашивания MTS и анализа результатов считывания на Мультискане при 650 нм. Показано, что наблюдается линейная зависимость выживаемости клеток TF-1 в диапазоне концентраций обоих препаратов ЭПО от 0,05 до 5 МЕ/мл. При этом цитопротекторная активность низкосиалированного ЭПО на 30-50% выше, чем у его высокосиалированной формы (Фиг.1).TF-1 cells were scattered into 96-well plates at 10,000 cells per well in the following medium: RPMI 1640, 10 mM HEPES, 20 tM glucose, 2% FCS and incubated at 37 ° C, 5% CO_{2 for} 3 days with various concentrations preparations. The number of living cells in the wells was determined after staining with MTS and analysis of the reading results on a Multiscan at 650 nm. A linear dependence of TF-1 cell survival was shown to be in the concentration range of both EPO preparations from 0.05 to 5 IU / ml. Moreover, the cytoprotective activity of low-sialylated EPO is 30-50% higher than its highly sialylated form (Figure 1).

Пример 3Example 3

Первичную культуру клеток нейроглии получали согласно стандартной методике. Крыс линии Sprague-Dowly возраста 1-3 дня забивали с помощью углекислотной асфиксии (15 минут) и помещали на 1 минуту в 80% водный раствор этанола. Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4-7°С. Выделенный мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли кору больших полушарий, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса и переносили в среду MEM/F12 (1:1), содержащую 20% эмбриональной сыворотки коровы и 2 мМ L-глютамина. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически. Полученную клеточную суспензию один раз промывали средой того же состава с помощью центрифугирования при 200 g. Клетки засевали плотностью 200 тыс.клеток/см² на обработанные поли-L-лизином культуральные флаконы площадью 75 см². Культивирование клеток проводили в CO₂-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха, в среде MEM/F12, содержащей 15% эмбриональной сыворотки коровы, 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерона, 100 нМ путресцина и 30 нМ селенита натрия, 100 мкг/мл гентамицина. Культуральную среду меняли каждые 3-4 дня. Пересев клеток проводили после достижения монослоя в соотношении 1:3 (время достижения монослоя 1.5-2 недели).The primary culture of neuroglia cells was obtained according to standard methods. Sprague-Dowly rats 1-3 days old were scored with carbon dioxide asphyxiation (15 minutes) and placed for 1 minute in an 80% aqueous ethanol solution. Further, all operations were carried out under aseptic conditions at a temperature of 4-7 ° C. The isolated brain was placed in Hanks' solution and the cerebral cortex was isolated, freeing the tissue from the membranes. The isolated tissue was washed once with Hanks solution and transferred to MEM / F12 medium (1: 1) containing 20% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine. Tissue was dissociated into individual cells mechanically. The resulting cell suspension was washed once with medium of the same composition by centrifugation at 200 g. Cells were seeded with a density of 200 thousand cells / cm² on treated with poly-L-lysine culture bottles with an area of 75 cm² . The cells were cultured in a CO₂ incubator at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO₂ and 95% air, in MEM / F12 medium containing 15% fetal bovine serum, 6 g / L D-glucose, 2 mM L- glutamine, 25 mg / l insulin, 100 mg / l transferrin, 20 nM progesterone, 100 nM putrescine and 30 nM sodium selenite, 100 μg / ml gentamicin. The culture medium was changed every 3-4 days. Reseeding of cells was carried out after reaching the monolayer in a ratio of 1: 3 (the time to reach the monolayer was 1.5–2 weeks).

Для выделения тотальной РНК использовали полученные после третьего пересева клетки: плотностью 100 тыс/см² высевали на обработанные поли-L-лизином 6-луночные культуральные планшеты в указанной культуральной среде. После достижения клетками монослоя культуральную среду заменяли на бессывороточную (указанная среда без эмбриональной сыворотки коровы). После 48 ч инкубации в среду вводили стерильные растворы (40 мкл) тестируемых соединений до конечной концентрации 3 нМ (3 параллели на точку). В качестве контроля вводили равный объем 0.9% раствора NaCl в воде. Через указанные промежутки времени отбирали культуральную среду, клетки промывали холодным фосфатно-солевым буфером и выделяли тотальную РНК фенолхлороформным методом с использованием набора YeliowSolve (Клоноген, Россия) с использованием методики производителя. Чистоту и концентрацию РНК в полученных образцах проводили спектрофотометрически и в дальнейших экспериментах использовали образцы с соотношением А₂₆₀/А₂₈₀≥1.6.The cells obtained after the third reseeding were used to isolate total RNA: a density of 100 thousand / cm^{2 was} plated on 6-well culture plates treated with poly-L-lysine in the indicated culture medium. After the cells reached the monolayer, the culture medium was replaced with serum-free (this medium without cow fetal serum). After 48 hours of incubation, sterile solutions (40 μl) of the test compounds were introduced into the medium to a final concentration of 3 nM (3 parallels per point). As a control, an equal volume of a 0.9% solution of NaCl in water was introduced. At the indicated time intervals, the culture medium was taken, the cells were washed with cold phosphate-saline buffer, and total RNA was isolated by the phenol-chloroform method using the YeliowSolve kit (Klonogen, Russia) using the manufacturer's method. The purity and concentration of RNA in the obtained samples was carried out spectrophotometrically and in further experiments, samples with a ratio of A₂₆₀ / A₂₈₀ ≥1.6 were used.

Для проведения обратной транскрипции отбирали 1 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 час при 37°С в среде, содержащей 8 ед/мл Moloney Murine Leukemia Virus (М-MLV-)-обратную транскриптазу, 10 мМ дитиотрейтол, 800 мкМ dNTPs, случайные гексапраймеры (20 мкг/мл) и first-strand buffer (50 мМ Трис-HCl, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl₂) в объеме 25 мкл. После последующей инкубации 10 минут при 70°С образцы полученной кДНК хранили при -20°С.For reverse transcription, 1 μg of total RNA was selected and the reaction was performed for 1 hour at 37 ° C in a medium containing 8 units / ml Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV -) - reverse transcriptase, 10 mM dithiothreitol, 800 μm dNTPs, random hexaprimers (20 μg / ml) and first-strand buffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂ ) in a volume of 25 μl. After a subsequent incubation of 10 minutes at 70 ° C, samples of the obtained cDNA were stored at -20 ° C.

Оценку уровня экспрессии BDNF мРНК проводили с использованием количественной ПЦР в реальном времени (real-time quantitative PCR, система М×3000Р, Stratagene). Применяли высокоспецифичный dsДНК-связывающий краситель SYBR green I. Реакцию проводили в смеси объемом 25 мкл, содержащей 2 мкл кДНК образца или стандарта, или 2 мкл воды (негативная проба), 250 мкМ смеси дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфаты), 2.5 мМ MgCl₂,15 мМ Трис-HCl (рН 8.8), 50 мМ KCI, 0,5% глицерола, 0.1% Tween 20, интеркалирующий краситель SYBR Green I, 1 ед Taq ДНК-полимеразу с ингибирующими активность фермента антителами ("Синтол", Россия) и по 10 пмоль смысловых и антисмысловых праймеров ("Синтол", Россия; Таблица) при следующих условиях: старт - 5 минут при 95°С, затем 40 циклов, включающих плавление - 30 секунд при 95°С, отжиг - 30 сек при 68°С, элонгация - 30 секунд при 72°С с детекцией флуоресценции в конце каждого шага элонгации.The level of BDNF mRNA expression was estimated using real-time quantitative PCR (real-time quantitative PCR, M × 3000P system, Stratagene). A highly specific dsDNA binding dye SYBR green I was used. The reaction was carried out in a mixture of 25 μl containing 2 μl of cDNA of a sample or standard, or 2 μl of water (negative sample), 250 μM dNTP (deoxynucleoside triphosphates) mixture, 2.5 mM MgCl₂ , 15 mM Tris-HCl (pH 8.8), 50 mM KCI, 0.5% glycerol, 0.1% Tween 20, intercalating dye SYBR Green I, 1 unit of Taq DNA polymerase with inhibitory enzyme activity antibodies (Synthol, Russia) and 10 pmol of semantic and antisense primers (Syntol, Russia; Table) under the following conditions: start - 5 minutes at 95 ° C, then 40 cycles, Luciano melting - 30 seconds at 95 ° C, annealing - 30 sec at 68 ° C, elongation - 30 s at 72 ° C with fluorescence detection at the end of each elongation step.

Таблица 2table 2ГенGeneПоследовательности праймеров (прямой; обратный)Primer sequences (forward; reverse)бета-Актинbeta actin5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3'5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3 ' 5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3 'BDNFBdnf5'-AGCCTCCTCTGCTCTTTCTGCTGGA-3'5'-AGCCTCCTCTGCTCTTTCTGCTGGA-3 ' 5'-CTTTTGTCTATGCCCCTGCAGCCTT-3'5'-CTTTTGTCTATGCCCCTGCAGCCTT-3 'NGFNGF5'-TCAGTGTGTGGGTTGGAGAT-3'5'-TCAGTGTGTGGGTTGGAGAT-3 ' 5'-AGCCTGTTTGTCGTCTGTTG-3'5'-AGCCTGTTTGTCGTCTGTTG-3 '

Для подтверждения специфичности продуктов амплификации после окончания амплификации образцы охлаждали до 60°С и через 20 минут получали кривые плавления нагреванием до 95°С со скоростью 0.03°С/сек с непрерывной детекцией флуоресценции. Для получения калибровочных кривых смесь кДНК образцов последовательно разбавляли водой, свободной от ДНКаз, получали стандартные растворы с известной относительной концентрацией соответствующего продукта. С использованием программного обеспечения производителя определяли номер цикла, соответствующий максимальному ускорению процесса амплификации, получали калибровочную кривую числа данных циклов от относительной концентрации продукта и определяли относительную концентрацию в неизвестном образце с последующей нормализацией по бета-актину.To confirm the specificity of the amplification products, after the amplification was completed, the samples were cooled to 60 ° C and after 20 minutes melting curves were obtained by heating to 95 ° C at a rate of 0.03 ° C / s with continuous detection of fluorescence. To obtain calibration curves, the cDNA mixture of the samples was successively diluted with DNase-free water, and standard solutions with a known relative concentration of the corresponding product were obtained. Using the manufacturer's software, the cycle number corresponding to the maximum acceleration of the amplification process was determined, a calibration curve of the number of these cycles from the relative concentration of the product was obtained, and the relative concentration in the unknown sample was determined, followed by normalization by beta-actin.

В результате экспериментов проведено тестирование способности препаратов РЭПО и низкосиалированного ЭПО регулировать экспрессию наиболее изученных нейротрофинов BDNF (brain-derived neurotrophic factor) и NGF (nerve growth factor) в культивируемых астроцитах коры больших полушарий крысы. Для этого с использованием метода количественной ОТ-ПЦР в реальном времени (полимеразная цепная реакция продуктов обратной транскрипции) протестирована способность препаратов влиять на экспрессию на уровне мРНК генов BDNF и NGF в культивируемых астроцитах коры больших полушарий мозга крысы.As a result of the experiments, the ability of REPO and low-sialylated EPO preparations to regulate the expression of the most studied neurotrophins BDNF (brain-derived neurotrophic factor) and NGF (nerve growth factor) in cultured rat cerebral astrocytes was tested. For this, using the method of quantitative RT-PCR in real time (polymerase chain reaction of reverse transcription products), the ability of the drugs to influence the expression of BDNF and NGF genes at the cultured astrocytes of the cerebral cortex of the rat brain was tested.

В результате проведенных исследований было показано, что при введении культуральную среду обоих препаратов в концентрации 3 нМ обнаружено сильное изменение экспрессии как BDNF, так и NGF, составляющее 2-5 раз по сравнению с контролем. Такое увеличение экспрессии является длительным и наблюдается через 4 ч после введения (Фиг.2). Наиболее значительным и длительным эффектом на увеличение экспрессии BDNF обладает препарат низкосиалированного ЭПО. По сравнению с контролем экспрессия BDNF составила 340% (Фиг.2).As a result of the studies, it was shown that with the introduction of the culture medium of both drugs at a concentration of 3 nM, a strong change in the expression of both BDNF and NGF was detected, amounting to 2-5 times in comparison with the control. This increase in expression is long-lasting and is observed 4 hours after administration (Figure 2). The most significant and lasting effect on the increase in BDNF expression is possessed by the preparation of low sialylated EPO. Compared with the control, the expression of BDNF was 340% (Figure 2).

Пример 4Example 4

Для сравнительного исследования влияния препаратов РЭПО и низкосиалированной формы ЭПО на экспрессию NGF и BDNF в коре головного мозга in vivo использовали самцов крыс линии Вистар, массой 200 г.Изучаемые препараты однократно вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг массы животного. Контрольным животным вводили растворитель. В каждой группе было по четыре животных. Через 1 ч после введения препарата крыс забивали с помощью углекислотной асфиксии и сразу после этого выделяли фронтальную кору мозга. Ткань замораживали в жидком CO₂ и хранили при - 80°С. Выделение тотальной РНК, обратную транскрипцию и ПЦР, а также оценку уровня экспрессии нейротрофинов проводили аналогично описанному выше.For a comparative study of the effect of REPO preparations and the low-salted form of EPO on the expression of NGF and BDNF in the cerebral cortex in vivo, male Wistar rats weighing 200 g were used. The studied drugs were once administered intraperitoneally at a dose of 100 μg / kg of animal weight. The control animals were injected with a solvent. There were four animals in each group. 1 h after administration of the drug, rats were sacrificed using carbon dioxide asphyxiation and immediately after that the frontal cortex was isolated. The tissue was frozen in liquid CO₂ and stored at - 80 ° C. Isolation of total RNA, reverse transcription and PCR, as well as an assessment of the level of expression of neurotrophins, were performed as described above.

В результате проведенного исследования обнаружено, что через час после введения как РЭПО, так и низкосиалированного ЭПО, происходит статистически достоверная стимуляция экспрессии обоих нейротрофинов в 2-3 раза (фиг.3).As a result of the study, it was found that an hour after the administration of both REPO and low-sialylated EPO, there was a statistically significant stimulation of the expression of both neurotrophins 2-3 times (Fig. 3).

Таким образом, в результате проведенных исследований было показано, что при введении РЭПО и его низкосиалированного ЭПО, как in vitro так и in vivo, обнаружено сильное изменение экспрессии BDNF и NGF, составляющее 2-5 раз по сравнению с контролем. Такое увеличение экспрессии является длительным и наблюдается через как через 1 ч, так и через 4 ч после введения. Наиболее значительным и длительным эффектом на увеличение экспрессии BDNF обладает препарат низкосиалированного ЭПО.Thus, as a result of the studies, it was shown that with the introduction of REPO and its low-sialylated EPO, both in vitro and in vivo, a strong change in the expression of BDNF and NGF was detected, amounting to 2-5 times compared to the control. Such an increase in expression is long-lasting and is observed both after 1 h and 4 h after administration. The most significant and lasting effect on the increase in BDNF expression is possessed by the preparation of low sialylated EPO.

Поддержание жизнеспособности нейронов является NGF- и BDNF-зависимым процессом, осуществляемым нейроглиальными клетками. Можно предположить, что увеличение экспрессии NGF и BDNF под действием рекомбинантного эритропоэтина и его низкосиалированной формы является одним из основных молекулярных механизмов терапевтического действия гормона на центральную нервную систему. Поскольку BDNF обладает высокой нейропротекторной и нейротрофической активностью, то на основе низкосиалированного ЭПО возможно создание фармпрепарата, проявляющего активность при нейродегенеративных заболеваниях.Maintaining the viability of neurons is an NGF- and BDNF-dependent process carried out by neuroglial cells. It can be assumed that an increase in the expression of NGF and BDNF under the action of recombinant erythropoietin and its low-sialylated form is one of the main molecular mechanisms of the therapeutic effect of the hormone on the central nervous system. Since BDNF has high neuroprotective and neurotrophic activity, on the basis of low-sialylated EPO, it is possible to create a pharmaceutical product that is active in neurodegenerative diseases.

Активное вещество новой фармацевтической композиции (никосиалированный ЭПО) может быть создано на основе модификации существующей технологии получения рекомбинантного ЭПО (Зеленин М.Г., Крамерова И.А., Колобков С.Л., Филякина Н.С., Филатов И.А, RU 2089611 С1, 09.10.1995) путем:The active substance of the new pharmaceutical composition (nicosialized EPO) can be created on the basis of a modification of the existing technology for the production of recombinant EPO (Zelenin MG, Kramerova IA, Kolobkov SL, Filyakina NS, Filatov I.A. RU 2089611 C1, 10/09/1995) by:

- отбора из банка клеточных линий эффективных продуцентов ЭПО с повышенным содержанием низкосиалированных форм;- selection from the bank of cell lines of effective producers of EPO with a high content of low-sialylated forms;

- очистки и фракционирования пула ЭПО с целью более полного извлечения низкосиалированных изоформ.- purification and fractionation of the EPO pool in order to more fully recover low-sialized isoforms.

Claims (1)

Translated fromRussian

Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения неврологических заболеваний на основе низкосиалированных форм эритропоэтина с содержанием 6-8 остатков сиаловых кислот на молекулу белка.A pharmaceutical composition for the prevention and treatment of neurological diseases based on low-sialylated forms of erythropoietin containing 6-8 sialic acid residues per protein molecule.

Images