RU2298793C1 - Method for determining and separating fatty acids - Google Patents

Abstract

FIELD: biological engineering.

SUBSTANCE: method involves treating blood with chloroform and methanol mixture taken in ratio of 2:1, carrying out lipid hydrolysis and methylation in sulfuric acid and methanol solution at 80°C within 3 h, cooling, processing methylated sample with hexane-containing solution, drying in nitrogen flow and carrying out fatty acids gas chromatography determination and separation on polar liquid diglycol succinate phase covering surface of 50 m long column of external diameter 0.32 mm, at chromatographic oven columns temperature equal to 140°C. Column is repeatedly washed out with chloroform, methanol, acetone and hexane before introducing diglycol succinate. Diglycol succinate is distributed over internal wall of capillary column using dynamic method so that diglycol succinate layer thickness makes 0.5 mcm. Then the column is purged with nitrogen during 5-6 h 3 days long at capillary column thermostat temperature equal to 200°C.

EFFECT: increased sensitivity in determining and separating fatty acids in biological fabrics.

2 dwg, 3 tbl

Description

Translated fromRussian

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения состава жирных кислот (ЖК) в биологических тканях организма.The invention relates to medicine and is intended to determine the composition of fatty acids (FA) in the biological tissues of the body.

Известен способ оценки спектра ЖК (патент РФ №2237245, G 01 N 33/48, бюл. №27, 27.09.2004 г.), включающий экстрагирование липидов хлороформ-метанольной смесью, гидролиз и метилирование липидов во влажной камере в течение 6 часов с разделением ЖК с помощью полярной жидкой фазы 20% диэтиленгликольсукцината (ДЭГС) на хроматоне N-AW-DMCS при температуре термостата стеклянной колонки 180°С. Однако этот способ имеет недостаточную чувствительность регистрации жирных кислот при их низком содержании в тканях организма.A known method for assessing the spectrum of FA (RF patent No. 2237245, G 01 N 33/48, bull. No. 27, 09/27/2004), including the extraction of lipids with a chloroform-methanol mixture, hydrolysis and methylation of lipids in a humid chamber for 6 hours separation of the liquid crystal using a polar liquid phase of 20% diethylene glycol succinate (DEGS) on an N-AW-DMCS chromaton at a glass column thermostat temperature of 180 ° C. However, this method has insufficient sensitivity of registration of fatty acids with their low content in body tissues.

Задача изобретения: повышение чувствительности определения и разделения ЖК.Object of the invention: increasing the sensitivity of the determination and separation of the LCD.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС, после промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС: жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, после этого проводят продувку колонки азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, гидролиз и метилирование проводят в течение 3 часов с разделением жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината, нанесенного на капиллярную колонку, при температуре колонки термостата 140°С.The task is carried out due to the fact that they use a capillary column with an external diameter of 0.32 mm and a length of 50 m, before applying DEGS to the inner wall of the capillary tube, the latter is repeatedly washed with organic solvents: chloroform, methanol, acetone and hexane, for better fixing of the DEGS film after washing, use the dynamic method of applying DEGS: the liquid phase of DEGS is pumped through a capillary tube using dry nitrogen, the solvent is evaporated and removed by purging the column with nitrogen, the layer thickness DEGS is 0.5 μm, after which the column is purged with nitrogen for 5-6 hours for 3 days at a capillary column thermostat temperature of 200 ° С, hydrolysis and methylation are carried out for 3 hours with separation of fatty acids in the polar liquid phase of diethylene glycol succinate, deposited on a capillary column, at a thermostat column temperature of 140 ° C.

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Для анализа используют 0,5 мл плазмы крови, эритроцитов, тромбоцитов. Выделение общих липидов плазмы крови осуществляют так же, как и в способе оценки жирных кислот (патент РФ №2237245, G 01 N 33/48, бюл. №27, 27.09.2004 г.), хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, объемом 10 мл по методу Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem, - 1957. - V.226. - P.497-509). После выпаривания нижнего слоя, содержащего экстрагированные липиды в хлороформе, в токе газообразного азота проводят этап метилирования с одновременным гидролизом липидов с целью получения летучих продуктов, анализируемых на газовом хроматографе. Для этого сухой липидный экстракт, разведенный в 0,5 мл хлороформа, переносят в виалы, снабженные герметически закрывающимися крышками, куда добавляют 2 мл метанола и 0,1 мл серной кислоты (особо чистой) и перемешивают. Пробы плотно закрывают крышками, помещают во влажную камеру и переносят в сушильный шкаф на 3 часа при температуре 80°С. Через 3 часа в охлажденную метилированную пробу добавляют 2 мл гексана и 1 мл дистиллированной воды. Пробу отстаивают в течение 30 мин, затем собирают верхний слой, содержащий метилированные эфиры жирных кислот в гексане, переносят в остроконечную колбу и высушивают досуха в токе газообразного азота на водяной бане при температуре 37°С.For analysis using 0.5 ml of blood plasma, red blood cells, platelets. The selection of total plasma lipids is carried out in the same way as in the method for evaluating fatty acids (RF patent No. 2237245, G 01 N 33/48, bull. No. 27, 09/27/2004), chloroform-methanol mixture in a ratio of 2: 1, volume 10 ml according to the method of Folch J., Lees M., Sloane Stanley GH (A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem, - 1957. - V.226. - P.497-509). After evaporation of the lower layer containing extracted lipids in chloroform, a methylation step is carried out in a stream of nitrogen gas with the simultaneous hydrolysis of lipids in order to obtain volatile products analyzed on a gas chromatograph. For this, a dry lipid extract, diluted in 0.5 ml of chloroform, is transferred to vials equipped with hermetically sealed lids, where 2 ml of methanol and 0.1 ml of sulfuric acid (especially pure) are added and mixed. Samples are tightly closed with lids, placed in a humid chamber and transferred to an oven for 3 hours at a temperature of 80 ° C. After 3 hours, 2 ml of hexane and 1 ml of distilled water are added to the cooled methylated sample. The sample is left to stand for 30 minutes, then the top layer containing methylated fatty acid esters in hexane is collected, transferred to a pointed flask and dried to dryness in a stream of nitrogen gas in a water bath at a temperature of 37 ° C.

Приготовление капиллярной колонки с полярной жидкой фазой диэтиленгликольсукцинат (ДЭГС): используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м. Перед нанесением ДЭГС на внутреннюю стенку капиллярной трубки последнюю многократно промывают органическими растворителями: хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, для лучшего закрепления пленки ДЭГС. После промывки используют динамический метод нанесения ДЭГС. При этом жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную трубку с помощью сухого азота. Затем растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм. После этого проводят продувку азотом в течение 5-6 часов на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С.Preparation of a capillary column with a polar liquid phase diethylene glycol succinate (DEGS): use a capillary column with an external diameter of 0.32 mm and a length of 50 m. Before applying DEGS to the inner wall of the capillary tube, the latter is repeatedly washed with organic solvents: chloroform, methanol, acetone and hexane, for better fixing of the DEGS film. After washing, use the dynamic method of applying DEGS. In this case, the liquid phase of DEGS is pumped through a capillary tube using dry nitrogen. Then the solvent is evaporated and removed by purging the column with nitrogen, the thickness of the DEGS layer is 0.5 μm. After that, a nitrogen purge is carried out for 5-6 hours for 3 days at a capillary column thermostat temperature of 200 ° C.

Для анализа метиловых эфиров жирных кислот общих липидов плазмы крови используют газовый хроматограф «Кристалл 2000 М». Для этого в образец добавляют 0,05 мл гексана, из полученного объема в инжектор хроматографа вносят 1 мкл пробы. Использовали режимы термостата колонки 140, 180 и 200°С. Идентификацию жирных кислот проводят с использованием стандартной смеси жирных кислот в концентрации 1 мкг/мл гексана по времени удерживания каждой жирной кислоты (производство стандартов метиловых эфиров жирных кислот фирмы «Serva», Германия).For the analysis of methyl esters of fatty acids of total blood plasma lipids, a Crystal 2000 M gas chromatograph is used. To do this, 0.05 ml of hexane is added to the sample, 1 μl of the sample is added to the chromatograph injector from the resulting volume. Column thermostat modes 140, 180, and 200 ° C were used. Fatty acids are identified using a standard mixture of fatty acids at a concentration of 1 μg / ml hexane according to the retention time of each fatty acid (production of standards of fatty acid methyl esters from Serva, Germany).

В таблице 1 показана зависимость уровня регистрации ЖК от температуры колонки.Table 1 shows the dependence of the level of LCD registration on the column temperature.

Таблица 1
Зависимость уровня регистрации ЖК плазмы крови человека от температуры термостата колонки в предлагаемом способе.Table 1
The dependence of the level of registration of LCD human blood plasma from the temperature of the column thermostat in the proposed method.Название ЖКLCD nameСодержание ЖК выражено площадью, мм²The content of the LCD is expressed by area, mm²температура 180°C.temperature 180 ° C.температура 140°C.temperature 140 ° C.температура 200°С.temperature 200 ° C.ЛауриноваяLauric0,801±0,2150.801 ± 0.21511,93±5,62*11.93 ± 5.62 *Не определяетсяNot determinedМиристиноваяMyristine2,263±0,4922.263 ± 0.4920,001±0,0004**0.001 ± 0.0004 **Не определяетсяNot determinedПальмитиноваяPalmitic53,126±11,15953.126 ± 11.15969,68±14,31**69.68 ± 14.31 **40,6840.68ПальмитолеиноваяPalmitoleic0,016±0,0050.016 ± 0.00512,97±3,34*12.97 ± 3.34 *5,565.56СтеариноваяStearin6,851±1,3536.851 ± 1.35314,21±0,92***14.21 ± 0.92 ***1,341.34ОлеиноваяOleic9,177±1,9789.177 ± 1.97834,84±2,26***34.84 ± 2.26 ***36,9236.92ЛинолеваяLinoleic16,61±2,87316.61 ± 2.87326,94±1,56***26.94 ± 1.56 ***Не определяетсяNot determinedЛиноленоваяLinolenic0,627±0,3330.627 ± 0.3331,03±0,881.03 ± 0.88Не определяетсяNot determinedЭйкозеноваяEicosene0,991±0,3680.991 ± 0.3684,99±1,32*4.99 ± 1.32 *Не определяетсяNot determinedЭйкозотриеноваяEicosotriene1,165±0,2461.165 ± 0.24618,71±4,41**18.71 ± 4.41 **14,6714.67АрахидоноваяArachidonic0,801±0,3490.801 ± 0.3494,62±1,54*4.62 ± 1.54 *1,621,62ЭйкозопентаеноваяEicosopentaenoic6,511±2,0756.511 ± 2.07546,14±12,47*46.14 ± 12.47 *7,147.14ДокозогексаеноваяDocosahexaenoic1,055±0,4131,055 ± 0,4130,86±0,290.86 ± 0.295,95.9Общая площадьtotal area99,99599,995246,92246.92113,83113.83

Примечание:Note:

Как показывают результаты таблицы 1, температура 140°С термостата колонки наиболее оптимальна по сравнению с 200°С и 180°С для разделения и регистрации ЖК. Общий уровень при температуре 140°С, по сравнению с другими температурными режимами, в 2,2-2,5 раз соответственно выше (Табл.1, общая площадь)As the results of table 1 show, the temperature of 140 ° C of the column thermostat is most optimal compared to 200 ° C and 180 ° C for the separation and registration of LC. The overall level at a temperature of 140 ° C, compared with other temperature conditions, is 2.2-2.5 times higher, respectively (Table 1, total area)

На фиг.1. отображена хроматограмма ЖК на стеклянной колонке с диэтиленгликольсукцинатом на хроматоне N-AW-DMCS. При разделении и регистрации ЖК в количестве, эквивалентном их содержанию в 10 мкл плазмы или при разведении в 100 раз, показана идентификация 5 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, олеиновой и линолевой. Совсем не идентифицируются при данном разведении эйкозеновая, эйкозотриеновая, арахидоновая, эйкозопентаеновая и докозогексаеновая ЖК.In figure 1. the chromatogram of the LC on a glass column with diethylene glycol succinate on chromaton N-AW-DMCS is displayed. When separating and registering FAs in an amount equivalent to their content in 10 μl of plasma or diluting 100 times, the identification of 5 fatty acids is shown: lauric, myristic, palmitic, oleic and linoleic. At this dilution, eicosene, eicosotriene, arachidonic, eicosopentaenoic and docosahexaene FAs are not identified at all.

На фиг.2. отображена хроматограмма ЖК на капиллярной колонке с диэтиленгликольсукцинатом. При определении той же концентрации ЖК показана идентификация 10 жирных кислот: лауриновой, миристиновой, пальмитиновой, пальмитолеиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, арахидоновой, эйкозопентаеновой и докозогексаеновой. То есть по предлагаемому способу при данном разведении идентифицируется в 2 раза больше ЖК.In figure 2. the chromatogram of the LC on a capillary column with diethylene glycol succinate is displayed. When determining the same FA concentration, the identification of 10 fatty acids is shown: lauric, myristic, palmitic, palmitoleic, stearic, oleic, linoleic, arachidonic, eicosopentaenoic and docosahexaenoic. That is, the proposed method for this dilution identifies 2 times more FA.

В таблице 2 представлена сравнительная характеристика определения эквивалентных количеств жирных кислот в прототипе и предлагаемом способах, выраженная в площади каждого пика (мм²). Из таблицы видно, что количественный уровень регистрации ЖК, в сравнении с прототипом, возрос от 5,33 до 615,22 раз. В целом чувствительность предлагаемого нами способа возрастает в среднем в 34,95 раза.Table 2 presents a comparative description of the determination of equivalent amounts of fatty acids in the prototype and the proposed methods, expressed in the area of each peak (mm² ). The table shows that the quantitative level of registration of the LCD, in comparison with the prototype, increased from 5.33 to 615.22 times. In general, the sensitivity of our proposed method increases on average by 34.95 times.

Таблица 2
Сравнительная характеристика определения жирных кислот плазмы в существующем и предлагаемом способах (мм²)table 2
Comparative characteristics of the determination of plasma fatty acids in the existing and proposed methods (mm² )Название ЖКLCD nameПрототипPrototypeПредлагаемый способThe proposed methodСоотношение уровня регистрации жирных кислотFatty Acid Registration RatioЛауриноваяLauric0,012±0,0030.012 ± 0.0030,801±0,215*0.801 ± 0.215 *66,7566.75МиристиноваяMyristine0,012±0,0020.012 ± 0.0022,263±0,492**2.263 ± 0.492 **188,58188.58ПальмитиноваяPalmitic2,198±0,9572.198 ± 0.95753,126±11,15**53.126 ± 11.15 **24,1724.17ПальмитолеиноваяPalmitoleic0,003±0,0010.003 ± 0.0010,016±0,005*0.016 ± 0.005 *5,335.33СтеариноваяStearin0,015±0,0050.015 ± 0.0056,851±1,353**6.851 ± 1.353 **456,66456.66ОлеиноваяOleic0,250±0,1060.250 ± 0.1069,177±1,978**9.177 ± 1.978 **36,736.7ЛинолеваяLinoleic0,027±0,0170.027 ± 0.01716,611±2,873*16.611 ± 2.873 *615,22615.22ЛиноленоваяLinolenic0,003±0,0020.003 ± 0.0020,627±0,333**0.627 ± 0.333 **209209ЭйкозеноваяEicosene0,143±0,1420.143 ± 0.1420,991±0,318**0.991 ± 0.318 **6,936.93ЭйкозотриеноваяEicosotriene0,064±0,0270.064 ± 0.0271,165±0,246*1.165 ± 0.246 *18,218.2АрахидоноваяArachidonic0,080±0,0350.080 ± 0.0350,801±0,349*0.801 ± 0.349 *10,110.1ЭйкозопентаеноваяEicosopentaenoic0,035±0,0100.035 ± 0.0106,511±2,075*6.511 ± 2.075 *186,02186.02ДокозогексаеноваяDocosahexaenoic0,019±0,0060.019 ± 0.0061,055±0,413*1,055 ± 0,413 *55,5255.52Общая суммаtotal amount2,8612,86199,9999,9934,9534.95Примечание:
В таблице приведены средние данные по ЖК плазмы, взятой от 5 человек. Достоверность отличий предлагаемого способа от существующего р<0,05 - *; р<0,01 - **.Note:
The table shows the average data for LCD plasma taken from 5 people. The reliability of the differences of the proposed method from the existing p <0,05 - *; p <0.01 - **.

В таблице 3 показана возможность определения спектра ЖК предлагаемым способом в других тканях организма: эритроцитах, тромбоцитах.Table 3 shows the possibility of determining the spectrum of the FA of the proposed method in other body tissues: red blood cells, platelets.

Таблица 3
Возможность определения жирных кислот предлагаемым способом в других тканях организма.Table 3
The ability to determine fatty acids of the proposed method in other tissues of the body.Название ЖКLCD nameРегистрируемый уровень ЖК в площади, мм²The registered level of the LCD in the area, mm²ЭритроцитыRed blood cellsТромбоцитыPlateletsЛауриноваяLauric26,40526,40516,4516.45МиристиноваяMyristine33,9933,9927,1327.13ПальмитиноваяPalmitic19,0819.0810,810.8ПальмитолеиноваяPalmitoleic0,980.980,010.01СтеариноваяStearin3,513,512,532,53ОлеиноваяOleic3,583,583,153.15ЛинолеваяLinoleic4,244.241,671,67ЛиноленоваяLinolenic1,701.701,41.4ЭйкозотриеноваяEicosotriene7,707.701,631,63АрахидоноваяArachidonic0,010.010,010.01ЭйкозопентаеноваяEicosopentaenoic2,242.241,691,69ДокозогексаеноваяDocosahexaenoic4,174.171,231.23Общая площадьtotal area107,605107,60567,767.7Примечание: Уровень ЖК определяется в пробах, содержащих 9,42·10⁷ эритроцитов, 75,2·10⁵ тромбоцитов, при температуре термостата колонки 140°С.Note: The level of FA is determined in samples containing 9.42 · 10⁷ red blood cells, 75.2 · 10⁵ platelets, at a column thermostat temperature of 140 ° C.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность определения и разделения ЖК в биологических тканях организма в среднем в 34,95 раз.Thus, the proposed method allows to increase the sensitivity of the determination and separation of FA in biological tissues of the body by an average of 34.95 times.

Claims (1)

Translated fromRussian

Способ определения и разделения жирных кислот в биологических тканях крови организма, включающий обработку крови хлороформметанольной смесью в соотношении 2:1, гидролиз и метилирование липидов в растворе серной кислоты и метанола при 80°С, охлаждение, обработку метилированной пробы гексансодержащим раствором, высушивание в токе азота и проведение газохроматографического определения и разделения жирных кислот на полярной жидкой фазе диэтиленгликольсукцината (ДЭГС), нанесенного на колонку, отличающийся тем, что гидролиз и метилирование липидов проводят в течение 3 ч, для газохроматографического определения и разделения жирных кислот используют капиллярную колонку с внешним диаметром 0,32 мм и длиной 50 м, которую перед нанесением на нее ДЭГС многократно промывают органическими растворителями хлороформом, метанолом, ацетоном и гексаном, ДЭГС наносят на внутреннюю стенку капиллярной колонки динамическим методом, при котором жидкую фазу ДЭГС прокачивают через капиллярную колонку с помощью сухого азота, растворитель испаряют и удаляют при продувке колонки азотом, где толщина слоя ДЭГС составляет 0,5 мкм, затем проводят продувку колонки азотом 5-6 ч на протяжении 3 суток при температуре термостата капиллярной колонки 200°С, а газохроматографическое определение и разделение жирных кислот осуществляют при температуре термостата колонки 140°С.A method for determining and separating fatty acids in biological tissues of the body’s blood, including treating blood with a chloroform methanol mixture in a ratio of 2: 1, hydrolysis and methylation of lipids in a solution of sulfuric acid and methanol at 80 ° C, cooling, processing a methylated sample with a hexane-containing solution, drying in a stream of nitrogen and gas chromatographic determination and separation of fatty acids in the polar liquid phase of diethylene glycol succinate (DEGS) supported on a column, characterized in that hydrolysis and methylation lipids are carried out for 3 hours, for gas chromatographic determination and separation of fatty acids, a capillary column with an external diameter of 0.32 mm and a length of 50 m is used, which before applying DEGS is repeatedly washed with organic solvents with chloroform, methanol, acetone and hexane, DEGS is applied to the inner wall of the capillary column by a dynamic method, in which the liquid phase of DEGS is pumped through the capillary column using dry nitrogen, the solvent is evaporated and removed by purging the column with nitrogen, where the thickness on DEGS layer is 0.5 microns, then subjected to a nitrogen purge column 5-6 hours for 3 days at a temperature capillary column thermostat 200 ° C, and the gas chromatographic separation and fatty acid is carried out at a column oven temperature of 140 ° C.

Images