RU2232551C2 - Method for autotransplantation of skin cells - Google Patents

Abstract

FIELD: experimental medicine, surgery.

SUBSTANCE: suspension of cells and their clusters obtained immediately after mechanical and enzymatic skin desegregation should be applied onto recipient's sensitive element precovered with medium 199; then opened tissues of wound's bottom should be kept under the layer of this suspension mentioned for 5-24 h, then recipient's surface should be isolated against air medium in a chamber constantly filled with interchangeable sterile solution of the following composition:

water - up to 1000 g, solution should be supplemented with metronidasol at the quantity of 10 mg and ciprofloxacin at the quantity of 8 mg/l; transplantation area should be kept in solution till forming epidermic horny layer. The method enables to shorten the terms to restore skin and provide the closure of wound defects with less volume of donor's skin.

EFFECT: higher efficiency of transplantation.

2 ex

Description

Translated fromRussian

Способ относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использован для восстановления кожного покрова.The method relates to medicine, namely to experimental medicine, and can be used to restore the skin.

В литературе описан способ аутотрансплантации клеток кожи, основанный на пересадке на раневую поверхность культивированных эпителиоцитов (Rapid Amplification of Human Keratinocyte Stem Cell in Culture and Application to Skin Grafting and Reconstructive Surgery./Rheinwald J.G., O’Connell W.T., Lindberg K., Bronstein B. // J.Cell. Biochem. 1992. - Suppl.l6 F, p.120-126). Суть этого способа состоит в выращивании в культуре эпителиоцитов, с последующей их пересадкой на раневую поверхность. Существенными недостатками этого метода являются такие сложные технические проблемы, как высокая стоимость работ, необходимость специальных ростовых сред с низким содержанием кальция, многочисленный лабораторный персонал, имеющий хорошую специальную подготовку, значительные сроки получения достаточного по площади трансплантата из аутоклеток пациента (3-4 недели), что резко повышает риск развития осложнений и ухудшает прогноз.The literature describes a method of autotransplantation of skin cells based on transplantation onto a wound surface of cultured epithelial cells (Rapid Amplification of Human Keratinocyte Stem Cell in Culture and Application to Skin Grafting and Reconstructive Surgery./ Rheinwald JG, O'Connell WT, Lindberg K., Bronstein B // J. Cell. Biochem. 1992 .-- Suppl. 6 F, p. 120-126). The essence of this method is the cultivation of epithelial cells in culture, followed by their transplantation onto the wound surface. Significant disadvantages of this method are such difficult technical problems as the high cost of the work, the need for special growth media with a low calcium content, the large number of laboratory personnel with good special training, the considerable time to obtain a sufficient transplant area from the patient’s autologous cells (3-4 weeks), which dramatically increases the risk of complications and worsens the prognosis.

Наиболее близким техническим решением, выбранным нами в качестве прототипа, является способ использования культивированных фибробластов при местном лечении ран, заключающийся в том, что аллофибробласты, полученные при культивировании, переносят на полупроницаемой мембране (последнее субкультивирование проводили на полупроницаемой мембране “Биофоль”) на раневую поверхность длительно незаживающих ран донорских участков, сверху трансплантат покрывают парафинизированной марлей и накладывают сухую асептическую повязку (Аллотрансплантация культивированных фибробластов на незаживающие раны после аутодермопластики /Д.С.Саркисов, Е.В.Глущенко, Ш.Р.Гуруков, С.С.Морозов, В.П.Туманов, Н.В.Бережков//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1991. - № 5. - С. 542-544). Недостатком этого способа является резкое изменение условий существования культивированных фибробластов при их переносе из условий in vitro на раневую поверхность, что отрицательно влияет на жизнедеятельность этих клеток и вызывает гибель не менее восьмидесяти процентов пересаженных клеток при применении этого способа. Причем не исключается вероятность развития реакции отторжения трансплантата, имеющая место в ряде случаев. Этот метод эффективен только в случае, когда в ране сохраняются придатки кожи, и в сочетании с аутопластикой перфорированными кожными лоскутами. Покрытие трансплантата парафинизированной марлей, с наложенной сверху асептической повязкой вызывает травмирование раневой поверхности при движениях тела и при смене повязки, а также затрудняет отток раневого отделяемого и наблюдение за реципиентной поверхностью.The closest technical solution that we have chosen as a prototype is the method of using cultured fibroblasts in the local treatment of wounds, which consists in the fact that the allofibroblasts obtained during cultivation are transferred to a semi-permeable membrane (the last subculture was carried out on a semi-permeable membrane “Biofol”) on the wound surface for long-term non-healing wounds of donor sites, the graft is covered with paraffinized gauze on top and a dry aseptic dressing is applied (Allotranspl ntation of cultured fibroblasts on non-healing wounds after autodermoplasty / D.S. Sarkisov, E.V. Glushchenko, Sh.R. Gurukov, S.S. Morozov, V.P. Tumanov, N.V. Berezhkov // Bulletin of experimental biology and medicine. - 1991. - No. 5. - S. 542-544). The disadvantage of this method is a sharp change in the conditions of existence of cultured fibroblasts during their transfer from in vitro conditions to the wound surface, which negatively affects the vital activity of these cells and causes the death of at least eighty percent of the transplanted cells when using this method. Moreover, the likelihood of developing a transplant rejection reaction, which occurs in some cases, is not excluded. This method is effective only when skin appendages remain in the wound, and in combination with autoplasty with perforated skin grafts. Covering the graft with paraffinized gauze, with an aseptic dressing applied on top, causes injury to the wound surface during body movements and when changing the dressing, and also makes it difficult to drain the wound and monitor the recipient surface.

Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков восстановления эпидермального покрова при отсутствии на раневой поверхности источников регенерации эпидермиса, а также закрытие при дефиците донорских ресурсов меньшим объемом донорской кожи большей площади дефекта.The technical result of the claimed invention is to reduce the recovery time of the epidermal cover in the absence of epidermal regeneration sources on the wound surface, as well as closing with a deficit of donor resources with a smaller volume of donor skin of a larger defect area.

Сущность заключается в том, что в заявляемом способе суспензию клеток кожи и их кластеров, полученную сразу после механической и последующей ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимающее ложе реципиента и выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 часов, за которые клетки кожи осаждаются под действием гравитации и прикрепляются к раневой поверхности за счет собственной адгезивности, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере-изоляторе, постоянно заполненной сменяемыми стерильными водными растворами с химиотерапевтическими средствами до формирования рогового слоя эпидермиса. В результате предотвращается значительное уменьшение количества клеток на этапе подготовки клеток к трансплантации, что происходит в прототипе: во-первых, при получении первичной культуры (не все клетки способны прикрепиться к субстрату и выжить в условиях in vitro); во-вторых, при перемещении клеток из культуральной среды на реципиентную поверхность (значительная часть клеток не способна адаптироваться ко второму изменению условий существования). Клетки в заявляемом способе быстро адаптируются на раневой поверхности и активно ее покрывают за счет распластывания, миграции и пролиферации. Присутствие всех типов клеток в суспензии обеспечивает адекватное межклеточное взаимодействие и способствует быстрой регенерации наружного покрова, причем источником регенерации кожи являются трансплантированные клетки, что позволяет при дефиците донорских ресурсов меньшим объемом донорской кожи закрывать обширные посттравматические или послеожоговые дефекты наружного покрова.The essence is that in the claimed method, a suspension of skin cells and their clusters, obtained immediately after mechanical and subsequent enzymatic disaggregation of the skin, is poured onto the receptive bed of the recipient and the exposed tissues of the bottom of the wound under a layer of this suspension for 5-24 hours, for which skin cells are precipitated by gravity and attached to the wound surface due to their own adhesiveness, after which the recipient surface is isolated from the air in an insulating chamber, constantly filled with replaceable sterile aqueous solutions with chemotherapeutic agents until the formation of the stratum corneum of the epidermis. As a result, a significant decrease in the number of cells at the stage of preparing the cells for transplantation is prevented, which occurs in the prototype: firstly, upon receipt of the primary culture (not all cells are able to attach to the substrate and survive in vitro); secondly, when cells move from the culture medium to the recipient surface (a significant part of the cells is not able to adapt to the second change in the conditions of existence). Cells in the present method quickly adapt to the wound surface and actively cover it due to spreading, migration and proliferation. The presence of all types of cells in suspension provides adequate intercellular interaction and promotes rapid regeneration of the outer cover, and the source of skin regeneration is transplanted cells, which allows for deficient donor resources with a smaller volume of donor skin to cover extensive post-traumatic or post-burn defects of the outer cover.

Менее благоприятное для приживления воспринимающее ложе, представленное поверхностной фасцией или жировой клетчаткой, не является препятствием для использования данного способа. Раневая поверхность полностью изолирована от внешней среды, что предотвращает вторичное инфицирование, отсутствие парафинизированной марли, прилежащей к реципиентной поверхности, исключает ее травмирование. Сменяемый раствор создает благоприятные условия для регенерации и позволяет вводить в полость капсулы лекарственные средства и биологически активные вещества, активно воздействуя на ход восстановительных процессов и микрофлору в области трансплантации. Пролиферация пересаженных клеток на раневой поверхности позволяет исключить использование в растворах сыворотки и факторов роста, что способствует удешевлению данного способа.The receptive bed, which is less favorable for engraftment, is represented by superficial fascia or fatty tissue, is not an obstacle to using this method. The wound surface is completely isolated from the external environment, which prevents secondary infection, the absence of paraffinized gauze adjacent to the recipient surface, eliminates its injury. The exchangeable solution creates favorable conditions for regeneration and allows the administration of drugs and biologically active substances into the capsule cavity, actively affecting the course of restoration processes and the microflora in the transplantation area. The proliferation of transplanted cells on the wound surface eliminates the use of serum and growth factors in solutions, which helps to reduce the cost of this method.

В доступной нам литературе по биологии и медицине сведения о таком способе аутотрансплантации клеток кожи не обнаружены, что позволяет считать заявленное изобретение соответствующим критерию “новизна”.In the literature on biology and medicine available to us, information about such a method of autotransplantation of skin cells has not been found, which allows us to consider the claimed invention to meet the criterion of "novelty."

Пример 1Example 1

У двенадцати белых крыс-самцов линии “Вистар”, массой 160 г под нембуталовым наркозом в стерильных условиях проводилось иссечение полнослойного лоскута кожи с подкожно-жировой клетчаткой до поверхностной фасции, площадью 24 кв.см на боковой поверхности тела. Затем животное укладывалось на противоположный от повреждения бок и с помощью нитей-держалок, поднимались и фиксировались в вертикальном положении края раны. Края раны были подняты с таким расчетом, чтобы обнаженные ткани дна раны было возможно полностью покрыть слоем жидкости (воспрепятствовать стеканию растворов). Далее в образованную емкость с помощью шприца заливалась среда 199. В это время из удаленного лоскута кожи выделялся участок площадью 2 кв.см. Проводилось удаление подкожно-жировой клетчатки, а затем механическим путем участок собственно кожи измельчался до размеров эксплантантов 1 куб.мм. Далее эти эксплантанты помещались в 4 мл раствора коллагеназы (Препарат “Коллализин”, производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток и Предприятия по производству бактериальных препаратов) в концентрации 250 Ед./мл в среде 199, с температурой 36° Цельсия. При постоянном встряхивании пробирки с раствором, ферментативная дезагрегация тканей продолжалась 25 минут, затем на реципиентную поверхность через сетку с размерами ячеек не пропускающими, заметные на глаз эксплантанты, производили сливание суспензии клеток и их кластеров. В пробирку с эксплантантами снова наливали раствор коллагеназы и подобным образом проводили ферментную дезагрегацию эксплантантов кожи с дальнейшим помещением суспензии клеток на раневую поверхность. Приданное в начале эксперимента положение крысы с покрытием суспензией клеток реципиентной поверхности поддерживали у 6 крыс в течение 5 часов, а у других 6 животных на протяжении 24 часов, во втором случае проводилось дополнительное парентеральное введение нембутала. Далее реципиентная поверхность у всех крыс заключалась в специальную камеру-изолятор постоянно заполненную сменяемыми стерильными водными растворами с химиотерапевтическими средствами до формирования рогового слоя эпидермиса. В качестве раствора использовали следующий солевой раствор: NaCl - 6,38 г, CaCl₂ - 0,182 г, MgSO₄×7HO - 0,13 г, KHCO₃ - 0,4 г, NaHCO₃ - 2,18 г, MgCl₂×6H₂O - 0,1 г, Na₂HPO₄×7H₂O - 0,3 г, вода до 1000 г. Раствор стерилизовали автоклавированием при давлении 1 атм 20 мин. Перед использованием в 1 л раствора добавлялись: метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг. Периодичность смены раствора составляла 1 раз в 3 часа круглосуточно. В конце 5 сут после трансплантации практически вся раневая поверхность была покрыта эпидермисом, происходило формирование базальной мембраны. Эпидермис многослойный, разделения на слои еще не произошло. К 12 сут происходит кератинизация эпидермальных клеток и формирование рогового слоя. На этот срок снимали камеру и прекращали воздействие раствора. Происходило полное функциональное восстановление эпидермального покрова.Twelve white Wistar male rats weighing 160 g under nembutal anesthesia under sterile conditions had a full-layer skin flap with subcutaneous fatty tissue excised to the superficial fascia, with an area of 24 sq. Cm on the lateral surface of the body. Then the animal was laid on the side opposite from the damage and with the help of filament-holders, rose and fixed in the vertical position of the edge of the wound. The edges of the wound were raised so that exposed tissue of the bottom of the wound was possible to completely cover with a layer of liquid (to prevent runoff of solutions). Then, medium 199 was poured into the formed container using a syringe. At this time, a 2-square-cm area was allocated from a removed skin flap. Subcutaneous fat was removed, and then mechanically the area of the skin itself was crushed to an explant size of 1 cubic mm. Next, these explants were placed in 4 ml of collagenase solution (The drug “Collalizin”, manufactured by the St. Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Serums and the Enterprise for the Production of Bacterial Preparations) at a concentration of 250 Units / ml in medium 199, with a temperature of 36 ° Celsius. With constant shaking of the test tube with the solution, the enzymatic disaggregation of tissues lasted 25 minutes, then on the recipient surface through a mesh with mesh sizes that did not pass, explants visible to the eye merged the suspension of cells and their clusters. The collagenase solution was again poured into the test tube with the explants, and enzymatic disaggregation of skin explants was carried out in a similar way with the further suspension of cells on the wound surface. The rat position attached at the beginning of the experiment, coated with a suspension of recipient surface cells, was maintained in 6 rats for 5 hours, and in the other 6 animals for 24 hours, in the second case, additional parenteral administration of nembutal was carried out. Further, the recipient surface in all rats was enclosed in a special isolation chamber constantly filled with replaceable sterile aqueous solutions with chemotherapeutic agents until the formation of the stratum corneum of the epidermis. The following saline solution was used as a solution: NaCl - 6.38 g, CaCl₂ - 0.182 g, MgSO₄ × 7HO - 0.13 g, KHCO₃ - 0.4 g, NaHCO₃ - 2.18 g, MgCl₂ × 6H₂ O — 0.1 g, Na₂ HPO₄ × 7H₂ O — 0.3 g, water up to 1000 g. The solution was sterilized by autoclaving at a pressure of 1 atm for 20 min. Before use, in 1 l of solution were added: metronidazole in an amount of 10 mg and ciprofloxacin in an amount of 8 mg. The frequency of the solution change was 1 time in 3 hours around the clock. At the end of 5 days after transplantation, almost the entire wound surface was covered with the epidermis, and a basement membrane was formed. The epidermis is multi-layered, separation into layers has not yet occurred. By day 12, keratinization of epidermal cells and the formation of the stratum corneum occur. For this period, the camera was removed and the exposure to the solution was stopped. There was a full functional restoration of the epidermal cover.

Пример 2Example 2

У 6 белых крыс-самцов линии “Вистар”, массой 160 г под нембуталовым наркозом, с соблюдением правил асептики, проводилось иссечение полнослойного лоскута кожи, площадью 24 кв.см на боковой поверхности тела. Затем животное укладывалось на противоположный от повреждения бок и с помощью нитей-держалок, поднимались и фиксировались в вертикальном положении края раны. После чего в созданную емкость с помощью шприца заливалась среда 199. В это время удаленный лоскут кожи натягивался на поверхность специального столика, и с помощью дерматома получали свободный расщепленный трансплантат, из которого выделяли участок площадью 5 кв.см. Далее механическим путем этот выделенный участок измельчался до размеров эксплантантов 1 куб.мм. Далее эти эксплантанты помещались в 5 мл раствора коллагеназы (Препарат “Коллализин”, производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток и Предприятия по производству бактериальных препаратов) в концентрации 250 Ед./мл в среде 199, с температурой 36° Цельсия.In 6 white male Wistar rats weighing 160 g under nembutal anesthesia, aseptic rules were observed, a full-layer skin flap was excised with an area of 24 sq. Cm on the lateral surface of the body. Then the animal was laid on the side opposite from the damage and with the help of filament-holders, rose and fixed in the vertical position of the edge of the wound. Then, medium 199 was poured into the created container using a syringe. At this time, the removed skin flap was pulled onto the surface of a special table, and a free split graft was obtained with the help of a dermatome, from which a 5-square-cm area was isolated. Further, mechanically, this selected area was crushed to an explant size of 1 cubic mm. Then these explants were placed in 5 ml of collagenase solution (“Collizin” preparation, produced by the St. Petersburg Scientific Research Institute of Vaccines and Serums and the Bacterial Production Enterprise) at a concentration of 250 Units / ml in 199 medium, with a temperature of 36 ° Celsius.

При постоянном встряхивании пробирки с раствором, ферментативная дезагрегация тканей продолжалась 25 минут, затем на реципиентную поверхность, удерживая заметные на глаз эксплантанты, производили сливание суспензии клеток и их кластеров. В пробирку с эксплантантами снова наливали раствор коллагеназы и подобным образом проводили ферментную дезагрегацию оставшихся эксплантантов кожи с дальнейшим помещением суспензии клеток на раневую поверхность. Положение крысы на боку с покрытием суспензией клеток реципиентной поверхности поддерживали у всех крыс в течение 8 часов, при этом строго следили за постоянным покрытием реципиентной поверхности средой 199 со взвесью клеток. Поддержание реципиентной поверхности в горизонтальном положении не менее 6-8 часов очевидно достаточно для надежного закрепления значительного количества пересаживаемых клеток. Далее реципиентная поверхность у всех крыс также заключалась в специальную камеру-изолятор (где эта поверхность занимала преимущественно вертикальное положение). Полость камеры-изолятора была постоянно заполнена сменяемым 8 раз в сутки стерильным водным раствором с химиотерапевтическими средствами (состав описан в примере 1) до формирования рогового слоя эпидермиса и восстановления его функциональных свойств, что происходит через 10-12 сут после трансплантации клеток.With constant shaking of the test tube with the solution, the enzymatic disaggregation of tissues lasted 25 minutes, then on the recipient surface, holding the explants visible to the eye, the suspension of cells and their clusters was merged. The collagenase solution was again poured into the test tube with the explants and the enzyme disaggregation of the remaining skin explants was similarly carried out with the further suspension of the cells on the wound surface. The position of the rat on its side coated with a suspension of cells of the recipient surface was maintained in all rats for 8 hours, while the constant coating of the recipient surface with 199 medium with a suspension of cells was strictly monitored. Maintaining the recipient surface in a horizontal position for at least 6-8 hours is obviously sufficient for reliable fixation of a significant number of transplanted cells. Further, the recipient surface in all rats was also enclosed in a special isolation chamber (where this surface occupied a predominantly vertical position). The cavity of the isolation chamber was constantly filled with a sterile aqueous solution with chemotherapeutic agents that was replaced 8 times a day (the composition is described in Example 1) until the stratum corneum of the epidermis was formed and its functional properties were restored, which occurs 10-12 days after cell transplantation.

Claims (1)

Translated fromRussian

Способ аутотрансплантации клеток кожи на раневую поверхность, отличающийся тем, что суспензию клеток и их кластеров, полученную сразу после механической и ферментативной дезагрегации кожи, наливают на воспринимиающее ложе реципиента, предварительно покрытое средой 199, затем выдерживают обнаженные ткани дна раны под слоем этой взвеси в течение 5-24 ч, после чего реципиентную поверхность изолируют от воздушной среды в камере, постоянно заполненной периодически сменяемым стерильным раствором, имеющим определенный состав: NaCl 6,38 г, СаСl₂ 0,182 г, MgSO₄·7Н₂О 0,13 г, КНСО₃ 0,4 г, NaHCO₃ 2,18 г, MgCl₂·6Н₂O 0,1 г, Na₂HPO₄·7H₂O 0,3 г, вода до 1000 г, в раствор добавляют метронидазол в количестве 10 мг и ципрофлоксацин в количестве 8 мг на 1 л, область трансплантации выдерживают в растворе до формирования рогового слоя эпидермиса.A method for autotransplantation of skin cells onto a wound surface, characterized in that a suspension of cells and their clusters obtained immediately after mechanical and enzymatic disaggregation of the skin is poured onto the receptive bed of the recipient, previously coated with medium 199, then exposed tissue of the bottom of the wound under the layer of this suspension for 5-24 hours, after which the recipient surface is isolated from the air in a chamber constantly filled with periodically replaced sterile solution having a certain composition: NaCl 6.38 g, CaCl₂ 0.182 g MgSO₄ · 7H₂ O 0.13 g, KHCO₃ 0.4 g, NaHCO₃ 2.18 g, MgCl₂ · 6H₂ O 0.1 g, Na₂ HPO₄ · 7H₂ O 0.3 g, water up to 1000 g, metronidazole in the amount of 10 mg and ciprofloxacin in the amount of 8 mg per 1 l are added to the solution, the transplantation area is kept in the solution until the formation of the stratum corneum of the epidermis.