Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к области конструирования молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для определения происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомных аномалий, в том числе и добавочные хромосомы при различных формах рака. Проблема происхождения добавочных или маркерных (мини-) хромосом и связи их с определенной клинической картиной недостаточно изучена. Эти хромосомы часто сегрегируют в семье и у отдельных ее членов могут вызывать клинические проявления патологии в виде умственной отсталости и врожденных пороков развития, в то время как другие члены семьи фенотипически остаются нормальными. Частота встречаемости маркерных хромосом в популяции сравнима с частотой синдрома Дауна и составляет 1-2 случая на 1000, при этом 40% случаев - семейные. Определение происхождения данных хромосом традиционными цитогенетическими методами крайне затруднено. Как правило, эти лишние акроцентрические или метацентрические хромосомы в кариотипе имеют небольшой размер и состоят из материала различных хромосом или их участков с центромерой и околоцентромерным гетерохроматином. Использование ДНК зондов при гибридизации in situ позволяет определить молекулярный состав добавочных хромосом и их происхождение, а также обосновать тактику проведения генетического консультирования и пренатальной диагностики в семье. При определении происхождения маркерных хромосом необходимо иметь большую коллекцию ДНК зондов на все хромосомы человека, то есть необходимо иметь 24 ДНК зонда и провести 24 реакции гибридизации для каждого исследования маркерной хромосомы. С целью проведения более эффективной диагностики и сокращения числа ДНК зондов при идентификации маркерных хромосом нами был создан набор из 4-х ДНК зондов (pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29) для определения группового происхождения добавочных (мини-) хромосом на первом этапе. Это значительно облегчает ее точную идентификацию на последующих этапах с помощью ДНК зондов определенной группы. The invention relates to the field of genetic engineering, in particular to the field of construction of molecular genetic markers, and can be used in medical genetics to determine the origin of human normal or mini (mini) chromosomes and pathologies, including prenatal and postnatal diagnosis of chromosomal abnormalities, including extra chromosomes in various forms of cancer. The problem of the origin of accessory or marker (mini-) chromosomes and their connection with a specific clinical picture is not well understood. These chromosomes often segregate in the family and can cause clinical manifestations of pathology in individual members of the family in the form of mental retardation and congenital malformations, while other family members remain phenotypically normal. The frequency of occurrence of marker chromosomes in a population is comparable to the frequency of Down syndrome and amounts to 1-2 cases per 1000, with 40% of cases being familial. Determining the origin of these chromosomes by traditional cytogenetic methods is extremely difficult. As a rule, these extra acrocentric or metacentric chromosomes in the karyotype are small in size and consist of material from different chromosomes or their sections with centromere and pericentromeric heterochromatin. The use of DNA probes for in situ hybridization allows one to determine the molecular composition of accessory chromosomes and their origin, as well as to justify the tactics of genetic counseling and prenatal diagnosis in the family. When determining the origin of marker chromosomes, it is necessary to have a large collection of DNA probes on all human chromosomes, that is, it is necessary to have 24 probe DNA and conduct 24 hybridization reactions for each study of the marker chromosome. In order to conduct a more effective diagnosis and reduce the number of DNA probes in identifying marker chromosomes, we created a set of 4 DNA probes (pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29) to determine the group origin of the additional ( mini-) chromosomes in the first stage. This greatly facilitates its accurate identification in subsequent stages using DNA probes of a particular group.
В настоящее время известно, что клонированы и охарактеризованы ДНК зонды для различных хромосом человека. Однако в качестве ДНК зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные) последовательности ДНК, которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомоспецифичные ДНК зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократно повторяющиеся, от нескольких сотен до несколько тысяч раз, относительно короткие (длиной до 170 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК зонды со спецификой для альфоидной ДНК хромосом 1, 3, 11, 13, 18, 21 и Х человека (Гиндилис и др., 1984, 1203108; Юров и др., 1989, 1494724; Юров и др., 1992, 1792429; Юров и др., 1997, 2087533; Соловьев и др., 1997, 2087534; Юров и др., 2000, 2161199). Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК зондов для маркирования других хромосом человека и отдельных групп хромосом. It is now known that DNA probes for various human chromosomes are cloned and characterized. However, DNA probes most often use unique (single-copy or small-copy) DNA sequences that do not allow for effective molecular cytogenetic diagnostics due to the low resolution of modern cytogenetic methods. An exception is chromosome-specific DNA probes containing repeating (multi-copy) DNA sequences. These include satellite (alpha and “classical” satellite) DNAs, which are repeatedly repeated, from several hundred to several thousand times, relatively short (up to 170 pairs of nucleotides) DNA fragments that form the centromeric regions of all human chromosomes. Based on them, DNA probes with specifics for alpha chromoid DNA 1, 3, 11, 13, 18, 21 and X of a person were created and protected by copyright certificates (Gindilis and others, 1984, 1203108; Yurov et al., 1989, 1494724; Yurov et al., 1992, 1792429; Yurov et al., 1997, 2087533; Soloviev et al., 1997, 2087534; Yurov et al., 2000, 2161199). The task of obtaining highly efficient DNA probes for labeling other human chromosomes and individual groups of chromosomes remains relevant.
В литературе описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для отдельных групп и разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипов, предлагаемых в данном изобретении рекомбинантных плазмид. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК человека, которые гибридизуются с отдельными группами хромосом (Catalog "Aneu Vision", 1999, Vysis Inc. 3100 Woodcreek Drive, Downers Grove, IL 60515-5400). Эти ДНК зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения их конструирования для маркирования хромосом человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для отдельных групп хромосом, не обладают достаточно высокой групповой специфичностью. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация маркерных хромосом с последующим медико-генетическим консультированием, а также с возможной пренатальной диагностикой, вследствие которой решается вопрос о сохранении или прерывании беременности в результате определения их происхождения. Актуальным в молекулярно-цитогенетической диагностике остается конструирование таких маркеров хромосом человека, которые позволили бы в одних условиях проводить идентификацию центромерных районов определенных групп хромосом в метафазных клетках, а в других - центромерные районы отдельных хромосом. The literature describes a number of cloned alpha satellite and classical satellite DNA, which are characterized by specificity for individual groups and different human chromosomes. These sequences can be considered as prototypes proposed in this invention recombinant plasmids. However, the possibility of their use for marking and identification of human chromosomes remains open. In particular, variants of human alphaoid DNA have been discovered that hybridize with individual chromosome groups (Catalog "Aneu Vision", 1999, Vysis Inc. 3100 Woodcreek Drive, Downers Grove, IL 60515-5400). These DNA probes have not been studied in sufficient detail from the point of view of their construction for marking human chromosomes in applied works. Moreover, all recombinant plasmids described in the literature that contain human alpha satellite DNA with specificity for individual groups of chromosomes do not have a sufficiently high group specificity. Therefore, they cannot be used for effective molecular cytogenetic diagnostics in medical practice, when the correct identification of marker chromosomes is required, followed by medical and genetic counseling, as well as possible prenatal diagnostics, as a result of which the issue of maintaining or terminating pregnancy as a result of determining their origin is resolved. Of current interest in molecular cytogenetic diagnostics is the construction of such markers of human chromosomes that would make it possible, under some conditions, to identify the centromeric regions of certain groups of chromosomes in metaphase cells, and in others, centromeric regions of individual chromosomes.
Изобретение не имеет аналогов, так как подобный набор рекомбинантных плазмид для высокоспецифичного маркирования определенных групп хромосом человека в одних условиях и отдельных хромосом в других условиях разработан впервые. Полученные рекомбинантные плазмиды отличаются от известных по литературе клонированных сателлитных ДНК по способу их получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, а также по особенностям хромосомной локализации и высокой специфичности для определенных групп хромосом человека в одних условиях и отдельных хромосом - в других. Предлагаемое техническое решение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т.к. для молекулярного маркирования и цитогенетической идентификации центромерных районов определенных групп хромосом данное техническое решение разработано впервые. The invention has no analogues, since a similar set of recombinant plasmids for highly specific labeling of certain groups of human chromosomes under certain conditions and individual chromosomes under other conditions was developed for the first time. The resulting recombinant plasmids differ from the cloned satellite DNAs known in the literature by the method of their preparation, by the restriction map and the size of the insert of human alphaoid DNA, as well as by the features of chromosome localization and high specificity for certain groups of human chromosomes under certain conditions and individual chromosomes in others. The proposed technical solution has no common features with any of the above analogues, because for molecular marking and cytogenetic identification of centromeric regions of certain groups of chromosomes, this technical solution was developed for the first time.
Целью изобретения является создание набора новых эффективных молекулярно-генетических маркеров, а именно, специфичных для центромерных районов, включая гетерохроматин обоих плеч, которые в отличие от описанных в литературе рекомбинантных плазмид, обладали бы следующим преимуществом: строго маркировали околоцентромерные районы определенных групп хромосом в одних условиях и отдельных хромосом в других условиях, без перекрестной гибридизации с другими хромосомами. The aim of the invention is to create a set of new effective molecular genetic markers, namely, specific for centromeric regions, including heterochromatin of both arms, which, unlike the recombinant plasmids described in the literature, would have the following advantage: they strictly marked pericentric regions of certain groups of chromosomes under the same conditions and individual chromosomes under other conditions, without cross hybridization with other chromosomes.
Сущность изобретения заключается в том, что клонированные в плазмиде pUC 19 (2700 пар нуклеотидов) по Pst-сайтам фрагменты ДНК человека pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 размерами 1500, 1100, 680 и 2700 пар нуклеотидов, соответственно, представляющие собой последовательности альфоидной ДНК, используются в качестве набора специфических молекулярных маркеров определенных групп хромосом человека в одних условиях ("мягких") и отдельных хромосом - в других ("жестких"). Данные фрагменты относятся к классу альфоидной ДНК и маркируют следующие группы и отдельные хромосомы: 1) последовательность альфоидной ДНК pYAI 11-19 - группу хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 и в специальных условиях только хромосому 10; 2) последовательность альфоидной ДНК pYAI 2-45 - группу хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20 и в специальных условиях только хромосому 4; 3) последовательность альфоидной ДНК pYS 37 - группу хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У и в специальных условиях только хромосомы 13 и 21; 4) последовательность альфоидной ДНК pYAI 7-29 - группу хромосом 1, 11, 17, X и в специальных условиях только хромосому 17, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК зондов, опытов по блот-гибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ. The essence of the invention lies in the fact that cloned in the plasmid pUC 19 (2700 nucleotide pairs) at the Pst sites of human DNA fragments pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 sizes of 1500, 1100, 680 and 2700 pairs nucleotides, respectively, which are sequences of alpha-DNA, are used as a set of specific molecular markers of certain groups of human chromosomes in some conditions ("soft") and individual chromosomes in others ("hard"). These fragments belong to the class of alpha-DNA and label the following groups and individual chromosomes: 1) the sequence of alpha-DNA pYAI 11-19 - a group of chromosomes 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 and under special conditions only the chromosome 10; 2) the sequence of alpha-DNA pYAI 2-45 - a group of chromosomes 2, 4, 8, 9, 18, 20 and under special conditions only chromosome 4; 3) the sequence of alpha-DNA pYS 37 is a group of chromosomes 13, 14, 15, 21, 22, Y and under special conditions only chromosomes 13 and 21; 4) the sequence of alpha-DNA pYAI 7-29 is a group of chromosomes 1, 11, 17, X and, under special conditions, only chromosome 17, which was proved by restriction mapping of DNA probes, experiments on blot hybridization and in situ hybridization on chromosomes.
Таким образом, эти 4 типа альфа-сателлитных последовательностей ДНК с "относительной хромосомной специфичностью" позволяют выявить маркерные хромосомы из 4-х различных групп хромосом: 1) последовательность альфоидной ДНК pYAI 11-19 - из группы хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; 2) последовательность альфоидной ДНК pYAI 2-45 - из группы хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20; 3) последовательность альфоидной ДНК pYS 37 - из группы хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У; 4) последовательность альфоидной ДНК pYAI 7-29 - из группы хромосом 1, 11, 17, X. Thus, these 4 types of alpha-satellite DNA sequences with "relative chromosomal specificity" make it possible to identify marker chromosomes from 4 different groups of chromosomes: 1) the sequence of alpha-DNA pYAI 11-19 - from the group of chromosomes 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; 2) the sequence of alpha-DNA pYAI 2-45 - from the group of chromosomes 2, 4, 8, 9, 18, 20; 3) the sequence of alpha-DNA pYS 37 - from the group of chromosomes 13, 14, 15, 21, 22, Y; 4) the sequence of alpha DNA pYAI 7-29 - from the group of chromosomes 1, 11, 17, X.
Новые ДНК зонды отличаются от известных следующими характеристиками:
1) pYAI 11-19 является геномным фрагментом ДНК человека размером 1500 пар нуклеотидов, имеющим 4 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 или только с центромерным районом хромосомы 10;
2) pYAI 2-45 - геномным фрагментом ДНК человека размером 1100 пар нуклеотидов, имеющим 3 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20 или только с центромерным районом хромосомы 4;
3) pYS 37 - геномным фрагментом ДНК человека размером 680 пар нуклеотидов, имеющим 2 внутренних уникальных сайта рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У или только с центромерными районами хромосом 13 и 21;
4) pYAI 7-29 - геномным фрагментом ДНК человека размером 2700 пар нуклеотидов, имеющим 7 внутренних уникальных сайтов рестрикции EcoRl и ограниченным Pstl-сайтами с разных концов геномного фрагмента. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК зонд гибридизуется или с центромерными районами хромосом 1, 11, 17, X или только с центромерным районом хромосомы 17.New DNA probes differ from those known for the following characteristics:
1) pYAI 11-19 is a genomic fragment of human DNA with a size of 1,500 pairs of nucleotides, having 4 internal unique EcoRl restriction sites and limited to Pstl sites from different ends of the genomic fragment. Under special conditions described in the examples and method of use, this DNA probe hybridizes with either centromere regions of chromosomes 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19, or only with centromere region of chromosome 10;
2) pYAI 2-45 - a genomic fragment of human DNA with a size of 1100 nucleotides, having 3 internal unique EcoRl restriction sites and limited to Pstl sites from different ends of the genomic fragment. Under special conditions described in the examples and method of use, this DNA probe hybridizes with either the centromere regions of chromosomes 2, 4, 8, 9, 18, 20, or only with the centromere region of chromosome 4;
3) pYS 37 — a human genomic DNA fragment with a size of 680 nucleotides, having 2 internal unique EcoRl restriction sites and limited to Pstl sites from different ends of the genomic fragment. Under special conditions described in the examples and method of use, this DNA probe hybridizes with either the centromere regions of chromosomes 13, 14, 15, 21, 22, Y or only with the centromere regions of chromosomes 13 and 21;
4) pYAI 7-29 - a genomic fragment of human DNA with a size of 2700 nucleotides, having 7 internal unique EcoRl restriction sites and limited to Pstl sites from different ends of the genomic fragment. Under the special conditions described in the examples and method of use, this DNA probe hybridizes with either the centromere regions of chromosomes 1, 11, 17, X or only with the centromere region of chromosome 17.
Конкретная цель исследования достигалась следующим образом. Источником выделения маркерных фрагментов pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа ХМ-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидуума мужского пола) обрабатывают рестриктазой Pstl до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты "вшивают" с помощью лигирования по "липким" концам в Pstl-сайт бактериального плазмидного вектора pUC19 (2700 пар нуклеотидов). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином. The specific goal of the study was achieved as follows. The source of isolation of marker fragments pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 is human lymphocyte DNA purified by electrostatic filtration on an Amicon XM-300 ultrafiltration membrane. The preparation of purified human lymphocytic DNA (obtained from a male individual) is treated with Pstl restrictase enzyme until complete hydrolysis. The obtained restriction fragments are “ligated” by ligation at the “sticky” ends at the Pstl site of the bacterial plasmid vector pUC19 (2700 nucleotides). This plasmid carries the gene for resistance to ampicillin. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells to be selected on the medium with this antibiotic. Thus, this vector allows you to create a recombinant clonoteca (type "short-gun") in automatic selection on a medium with ampicillin.
На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфа-ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (32P) ДНК тотальной фракции АRI-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека, непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.In the next step, clones possessing homology with alpha DNA are identified in the created clonoteca. For this, recombinant clones on nitrocellulose filters are introduced into a hybridization reaction with radioactive phosphorus-labeled (32 P) DNA of the total fraction of human ARI-DNA, which is mainly represented by alpha-DNA. Colonies whose DNA gives positive reflections on radio autographs as a result of hybridization are selected and used to determine the chromosome localization of the restriction fragments of human DNA cloned in them directly in cytological preparations of chromosomes in situ.
Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в одноразовых шприцах при температуре 37oС в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 ч. За 1,5 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки со средой культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М КСl и инкубируют 10 мин при температуре 37oС. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором в отношении 3:1 трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37oС и используют в 4 опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.For this, chromosome preparations are prepared from dividing cells in a culture of peripheral blood lymphocytes according to a known method. Blood lymphocytes stimulated by division with phytohemagglutinin (Difco, USA) are cultured in disposable syringes at a temperature of 37° C in Eagle’s medium with the addition of up to 20% bovine serum for 72 hours. Colchicine is administered 1.5 hours before the end of cultivation at a concentration of 0.5 μg / ml. Cells with culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1000 rpm. The precipitate was resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at a temperature of 37o C. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative in a ratio of 3: 1 three times for 20 minutes. Chromosome preparations are stored at a temperature of 37o C and used in 4 experiments no later than 2-3 weeks after preparation.
Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения; в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl2; 0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл3Н-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при температуре 20oС. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 х 10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with an isotopic tag by a known substitution method; 15 μl of a ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1 M MgCl2 ; 0.05 M dithiothreitol), 5 μl of non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0 each) are successively dissolved in 100 μl of deionized water , 01 mmol of each except thymidine triphosphate), 5 μl of DNase-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl of3 N-thymidine triphosphate (specific activity 114 Ci / mol, concentration of 5 mCi / ml), 10 μl of DNA polymerase -1 (concentration of 2 u / μl). The volume of the reaction mixture is 150 μl. The reaction is carried out for 20-40 minutes at a temperature of 20o C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 x 10 pulses per minute per 1 μg of DNA.
Гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ в "мягких" условиях проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70o и 96o спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100oС. Гибридизацию проводят при температуре 37oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при температуре 37oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70o и 96o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.Hybridization of pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 recombinant DNA labeled with radioactive precursors with in situ metaphase chromosomes under “mild” conditions is carried out according to the following procedure: metaphase chromosome preparations are denatured for 30 s at 0.07 N NaOH followed by washing for 10 minutes in solutions of 70o and 96o alcohol; preparations of radioactive DNA samples are denatured in a hybridization mixture containing 50% formamide, 10% dextransulfate-500 and standard saline (2 x SSC) for 10 min at a temperature of 100o C. Hybridization is carried out at a temperature of 37o C for 17- 18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 x SSC at a temperature of 37o C, in two shifts of 2 x SSC at room temperature, in solutions of 70o and 96o of ethyl alcohol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer, the preparations are thoroughly washed for 2 minutes with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of x 1000 or x 1125.
Гибридизация in situ в специально установленных или "мягких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализованы в прицентромерных районах определенных групп хромосом человека, а именно: 1) pYAI 11-19 - в группе хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; 2) pYAI 2-45 - в группе хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20; 3) pYS 37 - в группе хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У; 4) pYAI 7-29 - в группе хромосом 1, 11, 17, X, и являются, таким образом, специфическими молекулярными маркерами данных групп хромосом. Следовательно, эти 4 ДНК зонда позволяют легко определить принадлежность маркерных хромосом к одной из 4-х групп хромосом. In situ hybridization under specially established or “mild” conditions on human metaphase chromosomes shows that the cloned fragments pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 are localized in the centromeric regions of certain groups of human chromosomes, namely: 1 ) pYAI 11-19 - in the group of chromosomes 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; 2) pYAI 2-45 - in the group of chromosomes 2, 4, 8, 9, 18, 20; 3) pYS 37 - in the group of chromosomes 13, 14, 15, 21, 22, U; 4) pYAI 7-29 - in the group of chromosomes 1, 11, 17, X, and are, therefore, specific molecular markers of these groups of chromosomes. Therefore, these 4 probe DNAs make it easy to determine whether marker chromosomes belong to one of the 4 groups of chromosomes.
Далее проводят гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ в "жестких" условиях по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70o и 96o спирта; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстран-сульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100oС. Гибридизацию проводят при температуре 42oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 0,1 х SSC при температуре 42oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70o и 96o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.Next, hybridization of radiolabeled precursors of recombinant DNA pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 with metaphase chromosomes in situ under "stringent" conditions is carried out according to the following procedure: metaphase chromosome preparations are denatured for 30 s at 0, 07 N NaOH followed by washing for 10 minutes in a solution of 70o and 96o alcohol; preparations of radioactive DNA samples are denatured in a hybridization mixture containing 50% formamide, 10% dextran sulfate-500 and standard saline (2 x SSC) for 10 min at a temperature of 100o C. Hybridization is carried out at a temperature of 42o C for 17-18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 0.1 x SSC at 42o C, in two shifts of 2 x SSC at room temperature, in solutions of 70o and 96o of ethyl alcohol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer, the preparations are thoroughly washed for 2 minutes with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of x 1000 or x 1125.
Гибридизация in situ в специально подобранных или "жестких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализованы в прицентромерных районах отдельных хромосом человека, а именно, pYAI 11-19 - хромосомы 10; pYAI 2-45 - хромосомы 4; pYS 37 - хромосомы 13 и 21; pYAI 7-29 - хромосомы 17, и являются, таким образом, специфическими молекулярными маркерами названных хромосом. In situ hybridization under specially selected or “harsh” conditions on metaphase human chromosomes shows that the cloned fragments pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 are located in the pericentromeric regions of individual human chromosomes, namely, pYAI 11 -19 - chromosome 10; pYAI 2-45 - chromosome 4; pYS 37 - chromosomes 13 and 21; pYAI 7-29 are chromosomes 17, and are thus specific molecular markers of the named chromosomes.
Использование набора рекомбинантных плазмид ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 для идентификации определенных групп и отдельных хромосом человека в метафазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняется следующими примерами. The use of a set of recombinant DNA plasmids pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 to identify specific groups and individual human chromosomes in metaphase cells for the purpose of molecular-cytogenetic diagnosis is illustrated by the following examples.
Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом - 500 в соотношении 5:1; смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при температуре 0-4oС. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450 g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис-НСl (рН 8,0), 5 мМ MgCl2, 0,02 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,05%. Фракцию ядер отмывают трехкратным центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450 g, 10 мин).Example 1. Whole heparinized blood of a healthy donor is diluted with 0.015 M NaCl in a volume ratio of 1: 3. To precipitate red blood cells, diluted blood is mixed with 6% dextran sulfate - 500 in a ratio of 5: 1; the mixture is left to stand for 30 minutes at room temperature; all subsequent procedures are carried out at a temperature of 0-4o C. Leukocytes from the supernatant are precipitated by centrifugation at 450 g for 20 min and washed three times by centrifugation in 0.15 M NaCl (450 g, 10 min). The washed cells are resuspended in STM buffer containing 0.5 M sucrose, 50 mM Tris-Hcl (pH 8.0), 5 mM MgCl2 , 0.02 mM EDTA with Triton X-100 at a final concentration of 0.05%. The nuclear fraction was washed three times by centrifugation in the same buffer without X-100 newt (450 g, 10 min).
Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ (50 мМ трис-НСl, рН 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрации 1%. Лизат инкубируют при температуре 65oС не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром ХМ-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электродные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис-НСl, 89 мМ НВО и 5 мМ EDTA (рН 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см2 в течение 6-8 ч.Nuclei are resuspended in TE buffer (50 mM Tris-Hcl, pH 8.0; 5 mM EDTA) based on: 100 ml of buffer per 1 ml of nuclear pellet and lysed by adding sarcosyl to a concentration of 1%. The lysate is incubated at a temperature of 65o C for at least 1 h until complete enlightenment and centrifuged for 60 min at 2000 rpm to remove mechanical impurities. The supernatant is transferred to a cylinder, covered by an XM-300 ultrafilter ("Amicon") from below. An equal volume of TE buffer + 1% sarcosyl is layered onto the supernatant. The fluid in the cylinder is separated from the anode chamber by a dialysis membrane. The lower edge of the filter cylinder is lowered into the cathode chamber; both electrode chambers are filled with buffer containing 89 mM Tris-Hcl, 89 mM HBO and 5 mM EDTA (pH 8.3). Electrofiltration of the solution is carried out at 5 mm / cm2 for 6-8 hours
После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М ТЕ. After electrophoretic deposition of DNA on the filter, the liquid is removed from the cylinder, and the gel-like layer of DNA is dissolved in the desired volume of 0.1 M TE.
Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека Е. coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при температуре 37oС на качалке в течение 12 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (рН 8,0), 50 мМ EDTA и 5% тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при температуре 65oС. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при температуре 65oС проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изопропилового спирта (-18oС, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 х SSC (lx SSC г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при температуре 81oС в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1М КСl+20 мМ трис-НСl при рН 7,1 и температуре 0oС. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см3 объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают в растворах 50o изопропилового или 70o этилового спиртов, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.For preparative isolation of plasmid DNA with a human DNA insert, E. coli carrying the plasmid is grown in 100 ml of LB medium (10 g / l peptone, 5 g / l yeast extract, 10 g / l NaCl) with the addition of the necessary antibiotics (100 μg / ml of ampicillin) at a temperature of 37° C on a shaker for 12 hours. Cells are precipitated by centrifugation (5000 rpm, 10 min) and resuspended in 10 ml of a solution containing 50 mm glucose, 50 Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA and 5% Triton X-100. Freshly prepared lysozyme solution up to 5 mg / ml is added to the suspension and left at room temperature for 10-15 minutes. Then the sample volume is brought to 50 ml with lysozyme-free buffer and placed overnight in a thermostat at a temperature of 65o C. The DNA-membrane complex and denatured cell proteins are precipitated by centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes. 100 μg / ml RNAse A is added to the supernatant, and after 2 hours of incubation at a temperature of 65° C, phenolic and then chloroform deproteinization is carried out. DNA from the solution is precipitated with an equal volume of isopropyl alcohol (-18o C, 20 min), the precipitate is dissolved in TE. The DNA solution is dialyzed on Sephadex G-50 against 0.1 x SSC (lx SSC g / l sodium chloride and 4.8 g / l sodium citrate). This solution is heated at a temperature of 81o C for 10 min and quickly cooled by adding a volume of 1 M KCl + 20 mm Tris-Hcl at pH 7.1 and a temperature of 0o C. The resulting mixture is passed through a column with nitrocellulose Nitro-Cell-S (Serva ) based on 1 mg of DNA per 10 cm3 of column volume. Fractions containing circular forms of plasmid DNA are combined; DNA is precipitated from them with an equal volume of isopropyl alcohol; the precipitate is washed in solutions of 50o isopropyl or 70o ethyl alcohol, dried under vacuum and dissolved in TE buffer to the desired concentration.
ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-НСl (рН 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 мин при температуре 0oС. К клеткам добавляют 2 мл раствора 0,2 N NaOH с 1% SDS для лизиса клеток и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на 1 ч при температуре 0oС. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (12000 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18oС, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл раствора, содержащего 50 мМ трис-НСl (рН 8,0)+0,1 М ацетата натрия, и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.DNA of recombinant plasmids for screening bacterial clones was isolated from 5 ml of overnight culture, precipitating by centrifugation at 5000 rpm for 10 min, the pellet was resuspended in 1 ml of 25 mM Tris-Hcl (pH 8.0); 20 mM EDTA, 50 mM glucose and 2 mg / ml lysozyme, followed by incubation for 30 min at a temperature of 0o C. To the cells add 2 ml of a solution of 0.2 N NaOH with 1% SDS for cell lysis and, after thorough mixing, continue incubation 5 minutes. 1.5 ml of 3 M sodium acetate was added to the lysate, the solution was gently mixed and left for 1 h at a temperature of 0o C. The resulting precipitate was removed by centrifugation (12000 rpm), nucleic acids were precipitated from the supernatant with 2.5 volumes of ethyl alcohol (- 18o C, 30 min). The precipitate was dissolved in 1 ml of a solution containing 50 mm Tris-Hcl (pH 8.0) +0.1 M sodium acetate, and reprecipitated with ethanol. The reprecipitation procedure is repeated twice, the final precipitate after drying is dissolved in 100 μl of TE.
Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-НСl (рН 7,4), 10 мМ MgCl2, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при температуре 37oС. Реакцию останавливают прогреванием пробы при температуре 70oС в течение 10 мин.Endonuclease treatment of human DNA and bacterial plasmids is carried out in REB buffer containing 10 mM Tris-Hcl (pH 7.4), 10 mM MgCl2 , 10 mM NaCl and 1 mM dithiothreitol (DTT). Complete endonuclease DNA hydrolysis is obtained at a relative concentration of restriction enzymes of 5-8 u / μg of DNA after the reaction for 2 hours at a temperature of 37o C. The reaction is stopped by heating the sample at a temperature of 70o C for 10 minutes
Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pUC 19, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки, несущие плазмиды с ДНК человека. To obtain the genomic clonotope of human DNA, the bacterial plasmid pUC 19 carrying the ampicillin resistance gene is used as a vector. The presence of the ampicillin resistance gene in the plasmid allows only transformed cells carrying plasmids with human DNA to be selected on the medium with this antibiotic.
Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E. coli HB 101, выращивают на качалке при температуре 37oС до мутности А= 0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до температуры 0oС раствора 100 мМ CaCl2, клетки осаждают и ресуспендируют в 12 мл 100 мМ CaCl2. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaCl2 с 15%-ным глицерином. Культуру можно трансформировать после инкубации полученной суспензии при температуре 0oС в течение 30 мин. Она хранится в малых порциях при температуре -80oС, при этом ее компетентность сохраняется в течение 4-5 месяцев. К 200 мкл компетентной культуры бактерий при температуре 0oС добавляют 0,1-0,2 мкг лигированной плазмидной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (температура 42oС) на 1-1,5 мин и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 ч при температуре 37oС. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) с добавлением необходимых антибиотиков, обуславливающих селекцию трансформированных клонов, как правило ампициллина.A competent bacterial culture for transformation is prepared as follows: in 25 ml of LB culture medium 1 ml of fresh night culture of E. coli HB 101 is inoculated, grown on a rocking chair at a temperature of 37o C to a turbidity of A = 0.4-0.5. Cell division is stopped by placing the culture on ice for 10-15 minutes, followed by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes in the cold. The precipitate is washed with an equal volume of a solution of 100 mM CaCl2 cooled to a temperature of 0° C. , the cells are precipitated and resuspended in 12 ml of 100 mM CaCl2 . The cell suspension is kept in the cold for 20-30 minutes, centrifuged, and the pellet is resuspended in 2.5 ml of 0.1 M CaCl2 with 15% glycerol. The culture can be transformed after incubation of the resulting suspension at a temperature of 0o C for 30 minutes It is stored in small portions at a temperature of -80o C, while its competence is maintained for 4-5 months. To 200 μl of a competent bacterial culture at a temperature of 0° C. , 0.1-0.2 μg of ligated plasmid DNA is added and incubated at this temperature for 45-60 minutes. Then the mixture is transferred to a water bath (temperature 42o C) for 1-1.5 minutes and placed on ice. Nutrient LB broth is added to the transformed culture and it is grown on a rocking chair for 2-3 hours at a temperature of 37o C. Transformants are seeded on solid medium with 1.5% agar (0.1 ml of culture per Petri dish) with the addition of the necessary antibiotics that cause selection of transformed clones, usually ampicillin.
30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в растворе, содержащем 0,015 М NaCl, 5 мМ СаСl2, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при температуре 70oС 10 мин, после чего к смеси добавляют буферный раствор, состоящий из 0,4 М трис-НСl (рН 7,4); 50 мМ MgCl2, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема), по 1 нмолю каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из32P - дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 ч при температуре 37oС. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5 х 108 имп/мин/мкг ДНК.30 μl of a solution containing 0.1-0.2 μg of plasmid DNA or 0.1 μg of a fragment prepared from the gel and 1 μl of DNAase-1 in a solution containing 0.015 M NaCl, 5 mM CaCl2 , are incubated for 10 min at room temperature, DNA-aza-1 was inactivated at a temperature of 70° C. for 10 minutes, after which a buffer solution consisting of 0.4 M Tris-Hcl (pH 7.4) was added to the mixture; 50 mM MgCl2 , 25 mM DTT (up to 1/5 of the final volume), 1 nmol of each of the unlabeled DNA precursors, 20-40 μCi of one of32 P - deoxynucleoside triphosphates with a specific activity of 110 TV / mmol (3000 Ci / mmol) ( Amersham) and 1 unit of DNA polymerase-1. The volume of the reaction mixture, as a rule, is 100 μl, the reaction is carried out for 1 h at a temperature of 37o C. The radioactivity of the acid-insoluble fraction of DNA is measured on a LRB 1215 counter according to a special program. The average specific activity of labeled preparations is 2-5 x 108 imp / min / μg of DNA.
Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при температуре 37oС. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив с нижней стороны фильтровальной бумагой, фильтр дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-НСl (рН 7,5), а затем раствором, содержащим 1,5 М NaCl с 1 М трис-НСl (рН 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2 х SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при температуре 37oС. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при температуре 80oС в течение 1-2 ч.To identify human DNA inserts in hybrid clones, bacterial colonies previously tested as recombinant in phenotype are applied with a replica to nitrocellulose filters (Millipore, HAWP) located directly on the surface of a solid nutrient medium in Petri dishes and grown for 24 hours at 37o C. The grown colonies together with the filter are transferred to the surface of a solution of 0.5 M NaOH and left for 5-10 minutes. After drying on the underside with filter paper, the filter is treated with a solution of 1 M Tris-Hcl (pH 7.5) twice for 10 minutes and then with a solution containing 1.5 M NaCl with 1 M Tris-Hcl (pH 7.5). The air-dried filter is placed in a solution of 2 x SSC with proteinase K at a concentration of 50 μg / ml and incubated in it for 30 min at a temperature of 37o C. Then, the dried filter is washed in 0.3 M NaCl and then dried under vacuum at a temperature of 80o C for 1-2 hours
Перед гибридизацией фильтр вымачивают при температуре 68oС в растворе 2 х SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в течение 60-90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл раствора гибридизационной смеси, содержащей 6 х SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированную пробу32Р-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5 • 106 имп/мин. Гибридизацию проводят при температуре 68oС в течение 18-24 ч. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 х SSC с 0,5% SDS при температуре 68oС в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 24 ч экспозиции их проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.Before hybridization, the filter is soaked at a temperature of 68° C in a solution of 2 x SSC, 0.5% SDS, 0.1% ficol-400 and 0.1% polyvinylpyrrolidone-350 for 60-90 minutes. Following this, the filter is dry dried with filter paper and placed in 4-5 ml of a solution of a hybridization mixture containing 6 x SSC; 0.1% SDS; 10% dextransulfate-500, 50 μg / ml poly (A) and a denatured sample of32 P-labeled DNA with a total activity of 1-5 • 106 cpm. Hybridization is carried out at a temperature of 68o C for 18-24 hours. The filters are washed in several shifts of a solution of 0.5 x SSC with 0.5% SDS at a temperature of 68o C for several hours. The washed filters are finally dried and placed in a cassette with x-ray film PM-1. After 24 hours of exposure, they are shown autographically and hybrid clones are identified by the presence of positive signals (round blackening sites).
Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой Pstl фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенная препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoR 1 и идентификации полосы размером в 680 пар нуклеотидов. В указанный образец ДНК вводится изотопная метка методом замещения, описанным ранее. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, четыре из которых получили название pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29. The described method put the experiment on three filter replicas with a clone collection of Pstl fragments of human DNA. In this case, as a probe for hybridization with colonies on the filters, a sample of human alpha-DNA is taken, isolated preparatively from an agarose gel after electrophoretic separation of the hydrolyzate of human genomic DNA with endonuclease EcoR 1 and identification of a band of 680 nucleotides in size. An isotopic label is introduced into the indicated DNA sample by the substitution method described previously. After hybridization in the colonies, a positive signal is detected particularly clearly in several colonies, four of which are called pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29.
Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Difco" США) в одноразовых шприцах при температуре 37oС в среде Игла с добавлением 20% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За 1 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М КСl и инкубируют в течение 10 мин при температуре 37oС. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при температуре 37oС и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.Chromosome preparations are prepared in a culture of peripheral blood lymphocytes stimulated by division using phytohemagglutinin (Difco USA) in disposable syringes at a temperature of 37° C in Eagle's medium with the addition of 20% bovine serum for 74 hours. 1 hour before the end of cultivation colchicine is administered at a concentration of 0.5 μg / ml. Cells in the culture medium are transferred to centrifuge tubes and centrifuged for 5 min at 1000 rpm. The precipitate is resuspended in a hypotonic solution of 0.07 M KCl and incubated for 10 min at a temperature of 37o C. Fixation is carried out with methanol-vinegar fixative (in a ratio of 3: 1) three times for 20 minutes. Chromosome preparations are stored at a temperature of 37o C and used in experiments no later than 2-3 weeks after preparation.
Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: для каждого образца в четырех пробирках в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно по 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М MgCl2); 0,05 М дитиотреитола, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением Н3-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл Н3-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), 5 мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл) и по 5 мкл ДНК (1 мкг) одной из проб pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 в разные пробирки. Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при температуре 20oС. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 х 106 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.DNA samples for in situ hybridization on chromosomes are labeled with an isotopic label by the substitution method: for each sample, 15 μl of ten-fold buffer solution (0.8 M Tris-HCl, pH 7.4; 0.1) is sequentially dissolved in four tubes in 100 μl of deionized water M MgCl2 ); 0.05 M dithiothreitol, 5 μl non-radioactive deoxynucleoside triphosphates in an equimolar mixture (0.1 mm each except H3 -thymidine triphosphate), 5 μl DNAse-1 (concentration 1 μg / ml), 10 μl H3 -thymidine triphosphate ( specific activity 114 Ci / mol, concentration 5 mCi / ml), 5 μl DNA polymerase 1 (concentration 2 u / μl) and 5 μl DNA (1 μg) of one of the samples pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 in different tubes. The volume of the reaction mixture is 150 μl. The reaction is carried out for 20-40 minutes at a temperature of 20o C. The average specific radioactivity of labeled DNA preparations is about 25 x 106 pulses per minute per 1 μg of DNA.
На первом этапе гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ проводят в специально подобранных "мягких" условиях с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70o и 96o этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100oС. Гибридизацию проводят при температуре 37oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при температуре 37oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70o и 96o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.At the first stage, the hybridization of radioactive precursor-labeled recombinant DNAs pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 with metaphase chromosomes in situ is carried out under specially selected "mild" conditions with preliminary denaturation for 30 s at 0.07 N NaOH, followed by washing for 10 minutes in solutions of 70o and 96o ethyl alcohol. The preparations of radioactive DNA samples are denatured in a hybridization mixture containing 50% formamide, 10% dextransulfate-500 and standard saline (2 x SSC) for 10 min at a temperature of 100o C. Hybridization is carried out at a temperature of 37o C for 17- 18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 2 x SSC at a temperature of 37o C, in two shifts of 2 x SSC at room temperature, in solutions of 70o and 96o of ethyl alcohol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer for 2 minutes, the preparations are thoroughly washed with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of x 1000 or x 1125.
Гибридизация in situ в "мягких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализуются только в прицентромерных районах определенных групп хромосом человека (pYAI 11-19 - в группе хромосом 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; pYAI 2-45 - в группе хромосом 2, 4, 8, 9, 18, 20; pYS 37 - в группе хромосом 13, 14, 15, 21, 22, У; pYAI 7-29 - в группе хромосом 1, 11, 17, X) и являются, таким образом, молекулярными маркерами определенных групп хромосом, специфически маркирующими околоцентромерные районы. In-situ hybridization under “mild” conditions on human metaphase chromosomes shows that cloned fragments pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 are localized only in the centromeric regions of certain groups of human chromosomes (pYAI 11-19 - in the group of chromosomes 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19; pYAI 2-45 - in the group of chromosomes 2, 4, 8, 9, 18, 20; pYS 37 - in the group of chromosomes 13, 14, 15, 21, 22, Y; pYAI 7-29 - in the group of chromosomes 1, 11, 17, X) and are, therefore, molecular markers of certain groups of chromosomes that specifically mark pericentromeric regions.
Затем, на втором этапе, проводят гибридизацию меченных радиоактивными предшественниками рекомбинантных ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 с метафазными хромосомами in situ в "жестких" условиях. Препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в растворах 70o и 96o этилового спирта. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстран-сульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 х SSC), в течение 10 мин при температуре 100oС. Гибридизацию проводят при температуре 42oС в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 0,1 х SSC при температуре 42oС, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в растворах 70o и 96o этилового спирта по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении х 1000 или х 1125.Then, at the second stage, hybridization of the radiolabeled precursors of recombinant pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 with in situ metaphase chromosomes under stringent conditions is carried out. Metaphase chromosome preparations were denatured for 30 seconds in 0.07 N NaOH, followed by washing for 10 minutes in solutions of 70° and 96° ethyl alcohol. The preparations of radioactive DNA samples are denatured in a hybridization mixture containing 50% formamide, 10% dextran sulfate-500 and standard saline (2 x SSC) for 10 min at a temperature of 100o C. Hybridization is carried out at a temperature of 42o C for 17-18 hours. After hybridization, the preparations are washed in two shifts of 0.1 x SSC at 42o C, in two shifts of 2 x SSC at room temperature, in solutions of 70o and 96o of ethyl alcohol for 15 minutes in each shift. After drying in air, the preparations are coated with type M emulsion and exposed in the dark for up to 10 days. After developing with a standard amidol developer for 2 minutes, the preparations are thoroughly washed with running water and stained with a 3% solution of Romanovsky-Giemsa dye in 0.02 M phosphate buffer (pH 6.8) for 10-15 minutes. Radio autographs analyze and photograph under a microscope at a magnification of x 1000 or x 1125.
Гибридизация in situ в "жестких" условиях на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированные фрагменты pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 локализуются только в прицентромерных районах отдельных хромосом человека (pYAI 11-19 - в хромосоме 10; pYAI 2-45 - в хромосоме 4; pYS 37 - в хромосомах 13 и 21; pYAI 7-29 - в хромосоме 17) и являются, таким образом, молекулярными маркерами определенных хромосом, специфически маркирующими околоцентромерные районы. In-situ hybridization under “harsh” conditions on human metaphase chromosomes shows that cloned fragments pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 are localized only in the pericentromeric regions of individual human chromosomes (pYAI 11-19 in the chromosome 10; pYAI 2-45 on chromosome 4; pYS 37 on chromosomes 13 and 21; pYAI 7-29 on chromosome 17) and are thus molecular markers of certain chromosomes that specifically mark pericentromeric regions.
Пример 2. Особенно важным является применение набора предлагаемых молекулярных маркеров для распознавания групп и отдельных хромосом в тех случаях, когда в кариотипе имеется добавочная или маркерная (мини-) хромосома неизвестного происхождения. Example 2. Especially important is the use of a set of proposed molecular markers for recognition of groups and individual chromosomes in cases where the karyotype has an additional or marker (mini-) chromosome of unknown origin.
Все процедуры по выделению образцов ДНК pYAI 11-19; pYAI 2-45; pYS 37; pYAI 7-29 и их обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты с нормальным хромосомным набором от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты с хромосомным набором носителя добавочной или маркерной (мини-) хромосомы. Так при цитогенетическом анализе клеток пробанда была обнаружена маркерная (мини-) хромосома неизвестного происхождения. При этом у ребенка отмечались олигофрения и множество микроаномалий развития. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом оказались малоэффективны. Однако после проведения гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярных маркеров pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 для определенных групп хромосом, установить происхождение маркерной хромосомы не составило труда, так как сразу, на первом этапе, была определена ее принадлежность ко 2-й группе хромосом. На следующем этапе уже с помощью ДНК зонда 2-й группы pYAI 2-45 в "жестких" условиях гибридизации была определена принадлежность добавочной хромосомы. Оказалось, что она является дереватом хромосомы 4. Таким образом, с помощью молекулярных маркеров pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 можно быстро определить происхождение маркерных хромосом в кариотипе, а также обосновать тактику проведения медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в семье при повторных случаях. All procedures for the isolation of pYAI 11-19 DNA samples; pYAI 2-45; pYS 37; pYAI 7-29 and their processing with an isotopic label for in situ hybridization on metaphase chromosomes, as well as all procedures for the preparation of metaphase chromosome preparations and hybridization on chromosomes are repeated as in example 1. The only difference is that in example 1, drugs with normal chromosome set from a healthy male donor, whereas in example 2, drugs with a chromosome set of an additional or marker (mini) chromosome carrier are used. So, in a cytogenetic analysis of proband cells, a marker (mini-) chromosome of unknown origin was detected. At the same time, the child had oligophrenia and many developmental anomalies. Traditional cytogenetic methods using differential staining of chromosomes have been found to be ineffective. However, after hybridization on metaphase chromosomes in situ using molecular markers pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 for certain groups of chromosomes, it was not difficult to determine the origin of the marker chromosome, since immediately, at the first stage , its belonging to the 2nd group of chromosomes was determined. At the next stage, using the DNA probe of the 2nd group pYAI 2-45, the accessory chromosome was determined in the "harsh" hybridization conditions. It turned out that it is a tree of chromosome 4. Thus, using the molecular markers pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29, it is possible to quickly determine the origin of marker chromosomes in the karyotype, as well as to justify the tactics of medical genetic counseling and prenatal diagnosis in the family in repeated cases.
Пример 3. Еще одной иллюстрацией практического применения набора предлагаемых молекулярных маркеров для распознавания групп и отдельных хромосом может служить пример, когда в кариотипах пробанда и его матери имеются добавочные или маркерные (мини-) хромосомы неизвестного происхождения. При этом мать фенотипически здорова, а у ребенка отмечаются олигофрения и множество микроаномалий развития. Example 3. Another example of the practical application of the set of proposed molecular markers for the recognition of groups and individual chromosomes is the example when in the karyotypes of proband and its mother there are additional or marker (mini) chromosomes of unknown origin. In this case, the mother is phenotypically healthy, and the child has oligophrenia and many microanomalies of development.
Все процедуры по выделению образцов ДНК pYAI 11-19; pYAI 2-45; pYS 37; pYAI 7-29 и их обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие состоит только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 3 используются препараты хромосомных наборов носителей добавочных или маркерных (мини-) хромосом неизвестного происхождения: пробанд с олигофренией и множеством микроаномалий развития и его фенотипически здоровая мать. Традиционные цитогенетические методы с применением дифференциального окрашивания хромосом оказались малоэффективны. Однако после проведения двух этапов гибридизации на метафазных хромосомах in situ с помощью молекулярных маркеров pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29, установить происхождение маркерных хромосом не составило труда, так как сразу была определена принадлежность добавочных (мини-) хромосом к двум различным группам, третьей и четвертой. На следующем этапе уже с помощью ДНК зондов pYS 37 и pYAI 7-29 было показано, что у пробанда добавочная (мини-) хромосома является дереватом хромосомы 21, а у его фенотипически здоровой матери - не дериватом хромосомы 17, то есть маркерные (мини-) хромосомы имели разное происхождение. All procedures for the isolation of pYAI 11-19 DNA samples; pYAI 2-45; pYS 37; pYAI 7-29 and their processing with an isotopic tag for in situ hybridization on metaphase chromosomes, as well as all procedures for the preparation of metaphase chromosome preparations and hybridization on chromosomes are repeated analogously to example 1. The difference is only in that normal preparations are used in example 1 a chromosome set from a healthy male donor, whereas in example 3 we use preparations of chromosome sets of carriers of additional or marker (mini-) chromosomes of unknown origin: proband with oligophrenia and many microanomalies of development and its phenotypically healthy mother. Traditional cytogenetic methods using differential staining of chromosomes have been found to be ineffective. However, after carrying out two stages of in situ hybridization on metaphase chromosomes using molecular markers pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29, it was not difficult to determine the origin of marker chromosomes, as the accessory (mini -) chromosomes to two different groups, the third and fourth. At the next stage, it was already shown with the help of DNA probes pYS 37 and pYAI 7-29 that in proband, the additional (mini) chromosome is a tree of chromosome 21, and in its phenotypically healthy mother it is not a derivative of chromosome 17, i.e. marker (mini ) chromosomes had a different origin.
В тех случаях, когда маркерные (мини-) хромосомы не являются дереватами хромосом 10, 4, 17 и 21, на втором этапе гибридизации в "жестких" условиях, можно использовать ДНК зонды со спецификой для альфоидной ДНК хромосом 1, 3, 11, 13, 18, 21 и Х человека, защищенные авторскими свидетельствами ранее (Гиндилис и др., 1984, 1203108; Юров и др., 1989, 1494724; Юров и др., 1992, 1792429; Юров и др., 1997, 2087533; Соловьев и др., 1997, 2087534; Юров и др., 2000, 2161199). In cases where marker (mini-) chromosomes are not trees of chromosomes 10, 4, 17, and 21, at the second stage of hybridization under “harsh” conditions, DNA probes with specifics for alpha chromosome DNA 1, 3, 11, 13 can be used , 18, 21 and X of a person protected by copyright certificates earlier (Gindilis et al., 1984, 1203108; Yurov et al., 1989, 1494724; Yurov et al., 1992, 1792429; Yurov et al., 1997, 2087533; Soloviev et al., 1997, 2087534; Yurov et al., 2000, 2161199).
В последующем было определено, что у матери пробанда в примере 3 добавочная маркерная (мини-) хромосома является дериватом хромосомы X. Subsequently, it was determined that the mother of the proband in Example 3, the extra marker (mini-) chromosome is a derivative of chromosome X.
Итак, появляется реальная возможность корректно, без дополнительных затрат на поочередное использование всех 24 хромосомоспецифичных ДНК зондов, определять происхождение добавочных или маркерных (мини-) хромосом в практике клинической цитогенетики и онкоцитогенетики, а также обосновать тактику проведения медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в семье при повторных случаях. So, there is a real opportunity to correctly, without additional costs for the alternate use of all 24 chromosome-specific DNA probes, determine the origin of additional or marker (mini) chromosomes in the practice of clinical cytogenetics and oncocytogenetics, as well as justify the tactics of conducting genetic counseling and prenatal diagnosis in the family in repeated cases.
Таким образом, набор клонированных последовательностей ДНК pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 и pYAI 7-29 из генома человека является в специальных условиях эффективным инструментом как для распознавания определенных групп хромосом, так и отдельных хромосом на стандартных препаратах хромосом человека. Указанные возможности позволяют использовать изобретение для эффективного определения происхождения добавочных маркерных (мини-) хромосом в практике медицинской генетики, а именно, в пренатальной диагностике, клинической цитогенетике и онкоцитогенетике. Thus, the set of cloned DNA sequences pYAI 11-19, pYAI 2-45, pYS 37 and pYAI 7-29 from the human genome is an effective tool under special conditions for recognition of certain groups of chromosomes and individual chromosomes on standard human chromosome preparations. These opportunities allow you to use the invention to effectively determine the origin of additional marker (mini) chromosomes in the practice of medical genetics, namely, in prenatal diagnosis, clinical cytogenetics and oncocytogenetics.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002108016ARU2200761C1 (en) | 2002-04-01 | 2002-04-01 | Set of recombinant plasmid dna pyai 11-19, pyai 2-45, pys 37 and pyai 7-29 for determination of origin of human accessory or marker (mini-) chromosomes |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002108016ARU2200761C1 (en) | 2002-04-01 | 2002-04-01 | Set of recombinant plasmid dna pyai 11-19, pyai 2-45, pys 37 and pyai 7-29 for determination of origin of human accessory or marker (mini-) chromosomes |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2200761C1true RU2200761C1 (en) | 2003-03-20 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002108016ARU2200761C1 (en) | 2002-04-01 | 2002-04-01 | Set of recombinant plasmid dna pyai 11-19, pyai 2-45, pys 37 and pyai 7-29 for determination of origin of human accessory or marker (mini-) chromosomes |
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2200761C1 (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2263313C1 (en)* | 2004-09-29 | 2005-10-27 | Рогаев Евгений Иванович | Method for identifying human sex, method for obtaining molecular marker for identifying human sex, a molecular marker |
| US9512480B2 (en) | 2009-11-05 | 2016-12-06 | The Chinese University Of Hong Kong | Determination of the depth coverage of the fetal genome |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2087534C1 (en)* | 1995-05-18 | 1997-08-20 | Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии | Recombinant plasmid dna alpha r 1-6 designated for marking the 13-th and 21-d human chromosomes |
| RU2087533C1 (en)* | 1994-04-20 | 1997-08-20 | Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения РФ | Recombinant plasmid dna pyaia05 for marking and identification of the third human chromosome |
| RU2161199C1 (en)* | 2000-03-24 | 2000-12-27 | Московский НИИ педиатрии и детской хирургии | Recombinant plasmid dna pyai 960 designated for human 18-th chromosome marking |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2087533C1 (en)* | 1994-04-20 | 1997-08-20 | Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Министерства здравоохранения РФ | Recombinant plasmid dna pyaia05 for marking and identification of the third human chromosome |
| RU2087534C1 (en)* | 1995-05-18 | 1997-08-20 | Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии | Recombinant plasmid dna alpha r 1-6 designated for marking the 13-th and 21-d human chromosomes |
| RU2161199C1 (en)* | 2000-03-24 | 2000-12-27 | Московский НИИ педиатрии и детской хирургии | Recombinant plasmid dna pyai 960 designated for human 18-th chromosome marking |
| Title |
|---|
| DELATTRE О., BERNARD A. et al. Hum Hered., 38, c.156-167, 1988. WAJE J.S., WILLARD H., Chromosoma, 97, с.475-480, 1989. GERONIMO I. et al. Phusical map of the short arm/centromeric region of human chromosome 21. Amer. J. Hum. Genet., - 1993, 53, 3, 1294. С.VAN BROECKHOVEN et al. Report of the chromosome 18 workshop. - 1998, Psychiat. genet., 8, 97-108. C.VAN BROECKHOVEN et al. Report of the chromosome 18 workshop. - 1999, Amer. J. Hum. Genet., 88, 263-270.* |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2263313C1 (en)* | 2004-09-29 | 2005-10-27 | Рогаев Евгений Иванович | Method for identifying human sex, method for obtaining molecular marker for identifying human sex, a molecular marker |
| US9512480B2 (en) | 2009-11-05 | 2016-12-06 | The Chinese University Of Hong Kong | Determination of the depth coverage of the fetal genome |
| US10093976B2 (en) | 2009-11-05 | 2018-10-09 | The Chinese University Of Hong Kong | Identifying a de novo fetal mutation from a maternal biological sample |
| US11401551B2 (en) | 2009-11-05 | 2022-08-02 | The Chinese University Of Hong Kong | Identifying a de novo fetal mutation from a maternal biological sample |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Denaro et al. | Ethnic variation in Hpa 1 endonuclease cleavage patterns of human mitochondrial DNA. | |
| Flaman et al. | A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. | |
| Klomp et al. | A missense mutation in FIC1 is associated with greenland familial cholestasis | |
| US4912039A (en) | Multidrug resistance in mammalian cell lines and isolation of determinant glycoprotein DNA | |
| US6623961B2 (en) | Method for selective inactivation of viral replication | |
| Kedes et al. | The organization of sea urchin histone genes | |
| Fisher et al. | Microdissection and microcloning of the mouse X chromosome. | |
| JPH03224499A (en) | Method and composition for specific staining of chromosome | |
| WO1994023041A2 (en) | Method for selective inactivation of viral replication | |
| US20130337462A1 (en) | Extraction of nucleic acids | |
| Nishimura et al. | Synthetic ColE1 plasmids carrying genes for cell division in Escherichia coli | |
| Ohta et al. | Poly (adenylic acid) sequences in the RNA of Caulobacter crescenus. | |
| RU2161199C1 (en) | Recombinant plasmid dna pyai 960 designated for human 18-th chromosome marking | |
| RU2200761C1 (en) | Set of recombinant plasmid dna pyai 11-19, pyai 2-45, pys 37 and pyai 7-29 for determination of origin of human accessory or marker (mini-) chromosomes | |
| RU2087533C1 (en) | Recombinant plasmid dna pyaia05 for marking and identification of the third human chromosome | |
| Ward et al. | Reovirus-specific ribonucleic acid from polysomes of infected L cells | |
| RU2087534C1 (en) | Recombinant plasmid dna alpha r 1-6 designated for marking the 13-th and 21-d human chromosomes | |
| WO1997025442A1 (en) | Method of detection of polymorphism and loss of heterozygosity in a lung tumor suppressor gene | |
| US20220056523A1 (en) | Probe, kit comprising the probe, and method for identifying ccdc6-ret fusion gene | |
| RU2265060C1 (en) | Recombinant plasmid dna alpha-r-12 designated for marking 6-th human chromosome in metaphase in interphase cells | |
| RU2325441C1 (en) | RECOMBINANT PLASMID DNA pYAII-39, USED FOR 4TH AND 9TH HUMAN CHROMOSOME MARKING IN METAPHASIC AND INTERPHASIC CELLS | |
| Magnusson et al. | Analysis of loss of heterozygosity in microdissected tumor cells from cervical carcinoma using fluorescent dUTP labeling of PCR products | |
| Winocour | The investigation of oncogenic viral genomes in transformed cells by nucleic acid hybridization | |
| RU2425890C2 (en) | Method of marking human 7th chromosome in metaphasic and interphasic cells | |
| SU1203108A1 (en) | Method of labelling manъs 11th chromosome,recombination plasmide of genome deoxyribonucleic acid phs 53 for labelling and method of producing fragment of deoxyribonucleic acid phs 53 |
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees | Effective date:20140402 |