RU2151612C1

Movatterモバイル変換

Info

Publication number: RU2151612C1
Application number: RU95115405/14A
Authority: RU
Inventors: Ман Сунг Ко (GB); Ман Сунг КО
Original assignee: Протеин Дизайн Лэбс, Инк.
Priority date: 1992-12-01
Filing date: 1993-11-30
Publication date: 2000-06-27
Also published as: PL309249A1; AU689090B2; CA2149025A1; KR100371784B1; HU9501564D0; FI952658A0; CZ140195A3; NO952160D0; AU5732794A; WO1994012215A1; EP0671951A1; EP0671951A4; JPH08503617A; NO952160L; HUT71790A; FI952658A7; FI952658L

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: human immunoglobulin showing specificity to human protein L-selectin is chimeric immunoglobulin having regions that determine complementarity (CDR) corresponding to CDR-regions of murine donor immunoglobulin and carcass regions of variable site of heavy and light chain of human acceptor immunoglobulin and specifically binding with human L-selectin (affinity constant is 10⁷M^-1). Invention ensures to prepare nonimmunogeneous for human immunoglobulin showing specificity to protein L-selectin. EFFECT: improved method of preparing. 19 cl, 1 tbl, 6 dwg, 5 ex

Description

Translated fromRussian

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки США рег. N 07/983946, поданной 12/1/92, которая во всех случаях и во всей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки. This application is a partial continuation of the application US reg. N 07/983946, filed 12/1/92, which in all cases and in its entirety is incorporated into this description by reference.

Изобретение относится к комбинированным технологиям рекомбинантных ДНК и моноклональных антител, используемых для разработки новых биологических материалов, а в частности, для продуцирования неиммуногенных (для человека) иммуноглобулинов, специфичных для белка L-селектина, а также к использованию указанных иммуноглобулинов in vitro и in vivo. The invention relates to combined technologies of recombinant DNA and monoclonal antibodies used to develop new biological materials, and in particular, to produce non-immunogenic (for humans) immunoglobulins specific for the L-selectin protein, as well as to use the indicated immunoglobulins in vitro and in vivo.

Способность клеток к взаимной адгезии играет важную роль в созревании, нормальной физиологии и в патологических процессах. Указанная способность опосредуется факторами адгезии, в основном, гликопротеинами, экспрессированными на клеточных мембранах. Во многих случаях, фактор адгезии на одном типе клетки связывается с другим фактором адгезии, экспрессированным на другом типе клеток, образуя пару "контррецептор-рецептор". Существует три основных класса факторов адгезии, а именно интегрины, селектины и члены суперсемейства иммуноглобулинов (Ig) (см. работы Springer, Nature 346:425 (1990); Osborn, Cell 62:3 (1880); Hynes, Cell 69:11 (1992), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Указанные молекулы имеют особенно важное значение для взаимодействия лейкоцитов и тромбоцитов друг с другом, с внеклеточным матриксом и васкулярным эндотелием. The ability of cells to mutual adhesion plays an important role in maturation, normal physiology, and in pathological processes. The indicated ability is mediated by adhesion factors, mainly glycoproteins expressed on cell membranes. In many cases, the adhesion factor on one type of cell binds to another adhesion factor expressed on another type of cell to form a “counterreceptor-receptor” pair. There are three main classes of adhesion factors, namely integrins, selectins, and members of the immunoglobulin (Ig) superfamily (see Springer, Nature 346: 425 (1990); Osborn, Cell 62: 3 (1880); Hynes, Cell 69:11 ( 1992), which in their entirety are introduced into the present description by reference). These molecules are especially important for the interaction of leukocytes and platelets with each other, with the extracellular matrix and vascular endothelium.

Интегрины представляют собой гетеродимерные трансмембранные гликопротеины, состоящие из α-цепи (120-180 кДа) и β-цепи (90-110 кДа), имеющих, в основном, короткие цитоплазматические домены. Все α- субъединицы имеют гомологичную последовательность и содержат общие элементы, также как и β-субъединицы. Три известных интегрина, содержащих β-субъединицу, обозначаемую β₂, играют важную роль в функции Т-клеток, нейтрофилов и моноцитов. LFA-I (α_Lβ₂) широко распространен на лимфоцитах, гранулоцитах и моноцитах. Его контррецептор представляет собой молекулу ICAM-1 (и, вероятно, молекулу меньшего значения ICAM-2), принадлежащую к семейству Ig, которая экспрессируется на многих клетках, включая лейкоциты, и активируется на васкулярном эндотелии цитокинами, такими как TNF и IL-1. Блокирование LFA-1 на T-клетках антителами к α- или β-субъединице в значительной степени ингибирует адгезивно-зависимые функции, такие как CTL-опосредованный лизис клеток-мишеней. Mac-1 (α_Mβ₂) располагается на нейтрофилах и моноцитах, а его контррецептором также является ICAM-1 (а возможно ICAM-2). Кроме того, Mac-1 представляет собой рецептор активированного комплемента 3 (CR3) и связывается с C3bi-фрагментом. Третий β₂-интегрин, P15095 (α_xβ₂), также находится на нейтрофилах и моноцитах, но, по всей вероятности, он играет менее значительную роль. α-Субъединицы, LFA-1, Mac-1 и P150.95 имеют также соответствующие CD - обозначения CD11a, CD11b и CD11c, а β₂ обозначается также CD18, так что LFA-1 представляет собой CD11a/CD18, а Mac-1 представляет собой CD11b/CD18.Integrins are heterodimeric transmembrane glycoproteins consisting of an α chain (120-180 kDa) and a β chain (90-110 kDa) having mainly short cytoplasmic domains. All α-subunits have a homologous sequence and contain common elements, as well as β-subunits. Three known integrins containing a β-subunit denoted by β₂ play an important role in the function of T cells, neutrophils and monocytes. LFA-I (α_L β₂ ) is widely distributed on lymphocytes, granulocytes and monocytes. Its counterreceptor is an ICAM-1 molecule (and probably a lower ICAM-2 molecule) belonging to the Ig family, which is expressed on many cells, including white blood cells, and is activated on the vascular endothelium by cytokines such as TNF and IL-1. Blocking LFA-1 on T cells with antibodies to the α or β subunit significantly inhibits adhesive-dependent functions, such as CTL-mediated lysis of target cells. Mac-1 (α_M β₂ ) is located on neutrophils and monocytes, and its counterreceptor is also ICAM-1 (and possibly ICAM-2). In addition, Mac-1 is an activated complement complement 3 (CR3) receptor and binds to the C3bi fragment. The third β₂ -integrin, P15095 (α_x β₂ ), is also found on neutrophils and monocytes, but in all likelihood it plays a less significant role. The α-Subunits, LFA-1, Mac-1 and P150.95 also have the corresponding CD designations CD11a, CD11b and CD11c, and β₂ is also designated CD18, so LFA-1 is CD11a / CD18, and Mac-1 is itself CD11b / CD18.

Существует три известных селектина, которые ранее обозначались LECCAM, а в настоящее время обозначаются как L-селектин (именуемый также LECCAM-1, Меl-14 или LAM-1), E-селектин (именуемый также ELAM-1) и P-селектин (именуемый также GMP140 или PAD GEM). Все указанные селектины были секвенированы на уровне кДНК и имеют гомологичные последовательности и идентичные фрагменты, включая лектин-подобный домен. L-селектин имеет двойную функцию: с одной стороны, он является "хоминг"-рецептором на T-клетках для наружных эндотелиальных венул периферических лимфатических узлов; а с другой стороны, он является фактором адгезии на нейтрофилах для эндотелия (Hallmann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 174:236 (1991); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). E-селектин и P-селектин индуцируются на эндотелии цитокинами, но с различной кинетикой. L-селектин на нейтрофилах является контррецептором E-селектина и P-селектина (Picker и др., Cell 66:921 (1991); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), хотя, возможно, что все три указанные рецепторы имеют также другие контррецепторы. В частности, E-селектин связывается с углеводной группой сиалил-Льюиса x (SLex)(Lowe et al., Cell 63:475, (1990); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), тогда как этот углевод, как известно, присутствует на L-селектине (Picker et al., Cell 66:921 (1991)) и может, очевидно, присутствовать на других белках. E-селектин экспрессируется, в основном, в воспалительных участках кожи, а также служит в качестве фактора адгезии для "хоминга" Т-клеток кожи, которые могут участвовать в воспалительных процессах (Picker et al. , Nature 349:796 (1991); эта работа вводится во всей своей полноте посредством ссылки). There are three known selectins that were formerly designated LECCAM, but are now referred to as L-selectin (also referred to as LECCAM-1, Mel-14 or LAM-1), E-selectin (also referred to as ELAM-1) and P-selectin ( also referred to as GMP140 or PAD GEM). All of these selectins were sequenced at the cDNA level and have homologous sequences and identical fragments, including a lectin-like domain. L-selectin has a dual function: on the one hand, it is a “homing" receptor on T cells for the external endothelial venules of the peripheral lymph nodes; and on the other hand, it is a neutrophil adhesion factor for endothelium (Hallmann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 174: 236 (1991); this work is hereby incorporated by reference in its entirety). E-selectin and P-selectin are induced on the endothelium by cytokines, but with different kinetics. Neutrophil L-selectin is a counterreceptor of E-selectin and P-selectin (Picker et al. Cell 66: 921 (1991); this work is hereby incorporated by reference in its entirety), although it is possible that all three of these receptors also have other counterreceptors. In particular, E-selectin binds to the sialyl-Lewis x carbohydrate group x (SLex) (Lowe et al., Cell 63: 475, (1990); this work is hereby incorporated by reference in its entirety), while this carbohydrate is known to be present on L-selectin (Picker et al., Cell 66: 921 (1991)) and may obviously be present on other proteins. E-selectin is expressed mainly in inflammatory areas of the skin, and also serves as an adhesion factor for the “homing” of skin T cells that may be involved in inflammatory processes (Picker et al., Nature 349: 796 (1991); this the work is introduced in its entirety by reference).

Как показывают различные анализы, все антитела к CD11a, CD11b, CD18, L-селектину и E-селектину в большей или меньшей степени блокируют связывание нейтрофилов с активированными эндотелиальными клетками, но наиболее полное ингибирование достигается, в основном, комбинацией антитела к CD18 и антитела к L- или E-селектину (см., например, Luscinskas, J. Immunol., 142:2257 (1989); эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Лишь совсем недавно получила широкое признание модель, которая объясняет вышеуказанные факты трехстадийным процессом адгезии (Butcher, Cell 67:1033(1991); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). В первой стадии нейтрофилы обратимо связываются с воспаленным васкулярным эндотелием посредством селектинов, которые очень хорошо связываются в условиях кровотока, заставляя нейтрофилы буквально "катиться" вдоль стенок сосудов. Затем нейтрофилы активируются рядом стимуляторов, находящихся вокруг или высвобождаемых эндотелием, включая IL-8, PAF и C5a. Активированные нейтрофилы выделяют L-селектин и активируют Mac-1. В конечной стадии связывание Mac-1 с ICAM-1 и вероятно с другими контррецепторами на клетках эндотелия способствует стабильной адгезии и транссудации через эндотелий. As various analyzes show, all antibodies to CD11a, CD11b, CD18, L-selectin and E-selectin to a greater or lesser extent block the binding of neutrophils to activated endothelial cells, but the most complete inhibition is achieved mainly by a combination of anti-CD18 antibody and anti L- or E-selectin (see, for example, Luscinskas, J. Immunol., 142: 2257 (1989); this work is hereby incorporated by reference in its entirety). Only very recently has a model been widely recognized that explains the above facts with a three-stage adhesion process (Butcher, Cell 67: 1033 (1991); this work is incorporated herein by reference in its entirety). In the first stage, neutrophils bind reversibly to inflamed vascular endothelium through selectins, which bind very well in the bloodstream, causing neutrophils to literally "roll" along the walls of blood vessels. Neutrophils are then activated by a number of stimulants located around or released by the endothelium, including IL-8, PAF and C5a. Activated neutrophils secrete L-selectin and activate Mac-1. In the final stage, the binding of Mac-1 to ICAM-1 and probably to other counterreceptors on endothelial cells promotes stable adhesion and transudation through the endothelium.

В принципе, антитела или другие антагонисты таких факторов адгезии, как интегрин и селектин, могут остановить этот процесс, предотвращая связывание нейтрофилов с эндотелием и их транссудацию в ткани. Следовательно, указанные антитела могут быть использованы для лечения множества патологических состояний, в основе которых лежит воспалительный процесс. In principle, antibodies or other antagonists of adhesion factors such as integrin and selectin can stop this process by preventing the binding of neutrophils to endothelium and their extravasation into tissues. Therefore, these antibodies can be used to treat many pathological conditions, which are based on the inflammatory process.

Например, в живых моделях антител против CD 18, которые связываются с LFA-1 и Мac-1, были использованы для снижения повреждений при ишемической реперфузии (см. , например, Vedder et sl., J. Clin. Invest., 81:939 (1988); Vedder et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2643 (1990); патент США N 4797277). Эти антитела также способствуют снижению нейтрофил-опосредованных повреждений в легких, обусловленных различными инсультами (Doerschuk et al., J. Immunol 144:2327 (1990) и Mulligan et al., J.Immunol. 148:1847 (1992)), включая сепсис, вызванный грамотрицательными бактериями (Walsh et al., Surgery 110:205 (1991)). В экспериментах с кроликами антитела против CD 18 также защищали от летального исхода, обусловленного менингитом (Tuomanen et al. , J. Exp. Med., 170:959 (1990)). Эти антитела могут быть также использованы для предупреждения или лечения отторжения трансплантата, поскольку они блокируют функцию T-клеток. For example, in live models of anti-CD18 antibodies that bind to LFA-1 and Mac-1, they were used to reduce damage during ischemic reperfusion (see, for example, Vedder et sl., J. Clin. Invest., 81: 939 (1988); Vedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2643 (1990); U.S. Patent No. 4,797,277). These antibodies also contribute to the reduction of neutrophil-mediated lung damage caused by various strokes (Doerschuk et al., J. Immunol 144: 2327 (1990) and Mulligan et al., J. Immunol. 148: 1847 (1992)), including sepsis caused by gram-negative bacteria (Walsh et al., Surgery 110: 205 (1991)). In rabbit experiments, anti-CD 18 antibodies were also protected from death due to meningitis (Tuomanen et al., J. Exp. Med., 170: 959 (1990)). These antibodies can also be used to prevent or treat transplant rejection, as they block the function of T cells.

Например, инъекция антител против L-селектина или E-селектина грызунам способствует подавлению аккумуляции нейтрофилов внутри воспаленных очагов брюшины (Jutila et al., J. Immunol., 143:3318 (1989) и Milligan et al., J. Clin. Invest. 88:1396 (1991)). С помощью видеомикроскопа для витальных исследований было обнаружено, что антитело против L-селектина в высокой степени ингибирует "прокатывание" лейкоцитов вдоль эндотелия сосудистой стенки мезентериальных венул кролика, временно выведенных на поверхность тела (Von Andrian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:7538 (1991)). Антитело против E-селектина способствует значительному снижению васкулярных нарушений, индуцированных отложением иммунных комплексов в коже или легких крыс, а также значительному снижению аккумуляции нейтрофилов на этих участках (Mulligen et al. , J. Clin. Invest. 88:1396 (1991)). Кроме того, в модели приобретенной бронхиальной астмы у приматов антитело против E-селектина способствует значительному снижению притока нейтрофилов в легкие, и ассоциированную с ним позднюю обструкцию дыхательных путей после ингаляции антигена (Gundel et al. , J. Clin. Invest. 88:1407 (1991)). For example, injection of antibodies against L-selectin or E-selectin to rodents inhibits the accumulation of neutrophils inside the inflamed foci of the peritoneum (Jutila et al., J. Immunol., 143: 3318 (1989) and Milligan et al., J. Clin. Invest. 88: 1396 (1991)). Using a video microscope for vital studies, it was found that the anti-L-selectin antibody highly inhibits the “rolling” of white blood cells along the endothelium of the vascular wall of rabbit mesenteric venules temporarily brought to the surface of the body (Von Andrian et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 7538 (1991)). Antibody against E-selectin contributes to a significant reduction in vascular disorders induced by the deposition of immune complexes in the skin or lungs of rats, as well as a significant decrease in the accumulation of neutrophils in these areas (Mulligen et al., J. Clin. Invest. 88: 1396 (1991)). In addition, in the primates model of acquired bronchial asthma, an anti-E-selectin antibody significantly reduces the influx of neutrophils into the lungs and its associated late airway obstruction after antigen inhalation (Gundel et al., J. Clin. Invest. 88: 1407 ( 1991)).

Было получено несколько антител, включая мышиное DREG-55, мышиное DREG-56 и мышиное DREG-200, которые связываются с L-селектином человека (Kishimoto et al. , Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:2244 (1990); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). Эти антитела частично или полностью блокируют связывание лимфоцитов человека с наружными эндотелиальными венулами периферических лимфатических узлов, а также связывание нейтрофилов человека со стимулированными клетками пупочной вены человека (Kishimoto et al., Blood 78:805, (1991); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). Способность указанных антител блокировать связывание нейтрофилов с эндотелиальными клетками свидетельствует о том, что антиген, с которым они связываются, а именно L-селектин, может быть подходящей мишенью для потенциальных терапевтических агентов. Several antibodies have been prepared, including murine DREG-55, murine DREG-56, and murine DREG-200, which bind to human L-selectin (Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2244 (1990); this work is entirely introduced into the present description by reference). These antibodies partially or completely block the binding of human lymphocytes to the external endothelial venules of the peripheral lymph nodes, as well as the binding of human neutrophils to stimulated human umbilical vein cells (Kishimoto et al., Blood 78: 805, (1991); this work is fully introduced in the present description by reference). The ability of these antibodies to block the binding of neutrophils to endothelial cells suggests that the antigen with which they bind, namely L-selectin, may be a suitable target for potential therapeutic agents.

К сожалению, использование моноклональных антител, не являющихся человеческими, например, таких как мышиное антитело DREG-200, для лечения человека имеет некоторые недостатки, особенно в режимах повторной терапии, как поясняется ниже. Например, мышиные моноклональные антитела имеют относительно короткое время полужизни в кровотоке, а также не обладают другими важными иммуноглобулиновыми функциональными свойствами, необходимыми для использования в лечении человека. Unfortunately, the use of non-human monoclonal antibodies, such as, for example, the DREG-200 murine antibody, for treating humans has some drawbacks, especially in re-treatment regimens, as explained below. For example, murine monoclonal antibodies have a relatively short half-life in the bloodstream, and also do not have other important immunoglobulin functional properties necessary for use in human treatment.

И вероятно, что более важно, нечеловеческие моноклональные антитела содержат значительные фрагменты аминокислотных последовательностей, которые могут быть иммуногенными при их введении человеку. Многочисленные исследования показали, что после инъецирования пациенту чужеродного антитела иммунный ответ, индуцированный в организме пациента против этого антитела, может быть настолько сильным, что сведет на нет терапевтический эффект антитела уже в самом начале лечения. Более того, поскольку в настоящее время постоянно разрабатываются новые мышиные или другие антигенные (по отношению к человеку) моноклональные антитела для лечения самых различных заболеваний, то может оказаться, что после первого или нескольких введений человеку чужеродных антител последующее лечение даже с использованием совершенно другой терапии будет неэффективным или опасным из-за перекрестной реактивности. Определенный успех был получен при продуцировании так называемых "химерных антител" (в которых, например, мышиные вариабельные области соединены с человеческими константными областями), но несмотря на это, проблема, связанная со значительной иммуногенностью, все же не была решена. And probably, more importantly, non-human monoclonal antibodies contain significant fragments of amino acid sequences that can be immunogenic when administered to humans. Numerous studies have shown that after an injection of a foreign antibody to a patient, the immune response induced in the patient's body against this antibody can be so strong that it will negate the therapeutic effect of the antibody at the very beginning of treatment. Moreover, since new murine or other antigenic (with respect to humans) monoclonal antibodies are currently being developed to treat a wide variety of diseases, it may turn out that after the first or several introductions of foreign antibodies to humans, subsequent treatment, even using completely different therapy, will be ineffective or dangerous due to cross-reactivity. Some success was achieved in the production of so-called "chimeric antibodies" (in which, for example, murine variable regions are connected to human constant regions), but despite this, the problem associated with significant immunogenicity has not yet been resolved.

Для решения проблемы иммуногенности чужеродных антител было предпринято несколько попыток получения "очеловеченных" (гуманизированных) антител. Переход от мышиного к "очеловеченному" антителу предусматривает определенный компромисс в отношении некоторых конкурирующих факторов, и выбор того или иного решения зависит от конкретно используемых антител. Для минимизации иммуногенности в иммуноглобулине должна сохраниться по возможности большая часть человеческой последовательности акцептора. Однако, для сохранения аутентичной способности к связыванию иммуноглобулиновый остов должен содержать достаточное количество замещений в последовательности акцептора человека в целях обеспечения трехмерной конформации CDR-областей, по возможности более близкой к конформации мышиного донорного иммуноглобулина. В результате этого многие "очеловеченные" антитела, продуцированные до настоящего времени, обнаруживают значительную потерю аффинности связывания по сравнению с соответствующими мышиными антителами. См., например, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Shearman et al., J. Immunol. 147:4366-4373 (1991); Kettleborough Protein Engineering 4: 773-783 (1991); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185 (1991); Tempest et al., Boitechnology 9:266-271 (1991); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) и публикация EPO N 0239400 (каждая из указанных работ вводится во всей своей полноте посредством ссылки). To solve the problem of the immunogenicity of foreign antibodies, several attempts have been made to obtain “humanized” (humanized) antibodies. The transition from a murine to a humanized antibody involves a certain compromise with respect to certain competing factors, and the choice of a solution depends on the antibodies used specifically. To minimize immunogenicity, as much of the human acceptor sequence as possible should be preserved in the immunoglobulin. However, in order to maintain authentic binding ability, the immunoglobulin backbone must contain a sufficient number of substitutions in the human acceptor sequence in order to ensure three-dimensional conformation of the CDR regions, as close as possible to the conformation of mouse donor immunoglobulin. As a result of this, many “humanized” antibodies produced to date show a significant loss in binding affinity compared to corresponding murine antibodies. See, for example, Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Shearman et al., J. Immunol. 147: 4366-4373 (1991); Kettleborough Protein Engineering 4: 773-783 (1991); Gorman et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88: 4181-4185 (1991); Tempest et al., Boitechnology 9: 266-271 (1991); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988) and EPO publication 0239400 (each of these works is introduced in its entirety by reference).

В соответствии с вышеуказанным очевидно, что необходимо разработать улучшенные формы очеловеченных иммуноглобулинов, специфичных к антигену L-селектину, которые являются не только, в основном, неиммуногенными для человека, но и могли бы быть легко и без больших экономических затрат продуцированы способом, приемлемым для изготовления лекарственных средств, и для использования в других целях. Эти и другие проблемы были решены с помощью настоящего изобретения. In accordance with the above, it is obvious that it is necessary to develop improved forms of humanized immunoglobulins specific for the L-selectin antigen, which are not only mainly non-immunogenic for humans, but could be easily and without high economic costs produced in a manner acceptable for the manufacture of medicines, and for other uses. These and other problems have been solved using the present invention.

Изобретение относится к новым композициям, которые могут быть использованы, например, для лечения воспалительных заболеваний у человека и которые содержат "очеловеченные" иммуноглобулины, способные к специфическому связыванию L-селектином. Указанные иммуноглобулины могут обладать двумя парами комплексов "легкая цепь/тяжелая цепь", где по крайней мере одна цепь содержит одну или несколько гипервариабельных областей, функционально соединенных с сегментами каркасных областей иммуноглобулина человека. Например, мышиные гипервариабельные области с дополнительными натуральными аминокислотными остатками мыши или без них могут быть введены в каркасные области иммуноглобулина человека в целях продуцирования "очеловеченных" иммуноглобулинов, способных к связыванию с L-селектином при уровнях аффинности, составляющих более чем 10⁷ М^-1. Указанные "очеловеченные" иммуноглобулины также обладают способностью блокировать связывание CD R-донорного мышиного моноклонального антитела с L-селектином.The invention relates to new compositions that can be used, for example, for the treatment of inflammatory diseases in humans and which contain "humanized" immunoglobulins capable of specific binding of L-selectin. These immunoglobulins can have two pairs of light chain / heavy chain complexes, where at least one chain contains one or more hypervariable regions that are functionally connected to segments of the framework regions of the human immunoglobulin. For example, murine hypervariable regions with or without additional natural mouse amino acid residues can be introduced into the framework regions of a human immunoglobulin in order to produce humanized immunoglobulins capable of binding to L-selectin at affinity levels of more than 10⁷ M^-1 . These "humanized" immunoglobulins also have the ability to block the binding of CD R-donor mouse monoclonal antibodies to L-selectin.

Иммуноглобулины настоящего изобретения, включая связывающие фрагменты и другие их производные, могут быть легко продуцированы с использованием техники рекомбинантных ДНК, где конечную экспрессию в трансфецированных клетках осуществляют предпочтительно в иммортализованных эукариотических клетках, таких как клетки миеломы или гибридомы. Полинуклеотиды, содержащие первую последовательность, кодирующую каркасные области "очеловеченного" иммуноглобулина, и вторую серию последовательностей, кодирующих нужные гипервариабельные области иммуноглобулина, могут быть продуцированы синтетически либо путем объединения соответствующих кДНК и геномных ДНК-сегментов. The immunoglobulins of the present invention, including binding fragments and other derivatives thereof, can be easily produced using recombinant DNA techniques, where the final expression in transfected cells is preferably carried out in immortalized eukaryotic cells, such as myeloma cells or hybridomas. Polynucleotides containing the first sequence encoding the framework regions of the “humanized” immunoglobulin and the second series of sequences encoding the desired hypervariable immunoglobulin regions can be synthetically produced or by combining the corresponding cDNA and genomic DNA segments.

"Очеловеченные" иммуноглобулины могут быть использованы отдельно, т.е., в основном, в чистом виде либо в сочетании с химиотерапевтическим средством, таким как нестероидное противовоспалительное средство (например, аспирин); кортикостероид или иммунодепрессант. Все указанные соединения особенно эффективны при лечении воспалительных заболеваний. "Очеловеченные" иммуноглобулины или их комплексы могут быть получены в виде фармацевтически приемлемых лекарственных препаратов, форма которых может варьироваться в зависимости от способа введения. “Humanized” immunoglobulins can be used alone, ie, mainly in pure form or in combination with a chemotherapeutic agent, such as a non-steroidal anti-inflammatory agent (eg, aspirin); corticosteroid or immunosuppressant. All of these compounds are especially effective in the treatment of inflammatory diseases. "Humanized" immunoglobulins or their complexes can be obtained in the form of pharmaceutically acceptable drugs, the form of which may vary depending on the route of administration.

На фиг.1 представлены последовательности кДНК и транслированные аминокислоты последовательности вариабельных областей легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) мышиного антитела DREG-200. Зрелая тяжелая цепь начинается с аминокислоты 20 E, а зрелая легкая цепь начинается с аминокислоты 21 D, которым предшествуют сигнальные последовательности. Figure 1 shows the cDNA sequences and translated amino acids of the variable regions of the light chain (A) and heavy chain (B) regions of the mouse DREG-200 antibody. The mature heavy chain begins with amino acid 20 E, and the mature light chain begins with amino acid 21 D, which is preceded by signal sequences.

На фиг. 2 - аминокислотные последовательности вариабельных областей зрелой легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) мышиного антитела DREG-200 (верхние строки) и "очеловеченного" антитела DREG-200 (нижние строки). Три CDR в каждой цепи подчеркнуты. Аминокислотные остатки в каркасных областях, которые были заменены мышиными аминокислотами, или типичные аминокислоты человека в "очеловеченном" антителе подчеркнуты двойной чертой. In FIG. 2 — amino acid sequences of the variable regions of the mature light chain (A) and heavy chain (B) of the mouse DREG-200 antibody (upper lines) and the “humanized” DREG-200 antibody (lower lines). Three CDRs in each chain are underlined. Amino acid residues in the framework regions that have been replaced by murine amino acids, or typical human amino acids in a humanized antibody, are underlined by a double dash.

На фиг. 3 - нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вариабельные области легкой цепи (A) и тяжелой цепи (B) "очеловеченного" антитела DREG-200 и начинающихся, и кончающихся XbaI-сайтами; и транслированные аминокислотные последовательности, включая сигнальные последовательности. In FIG. 3 - nucleotide sequences of genes encoding the variable regions of the light chain (A) and heavy chain (B) of the “humanized” DREG-200 antibody, which begin and end with XbaI sites; and translated amino acid sequences, including signal sequences.

На фиг. 4 - конкурентное связывание мышиного и "очеловеченного IgG1 и IqG4 DREG-200. Клетками-мишенями являются клетки 2-1, линия мышиных пре-B-клеток, которые были трансфецированы геном человеческого L-селектина, а поэтому экспрессировали человеческий L-селектин (Berg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 1048 (1992)). 5•10⁵ клеток инкубировали с 3 нг¹²⁵1-меченного мышиного антитела (2 мкКи/мкг) вместе с возрастающими количествами мышиного или "очеловеченного" антитела-конкурента в 0,2 мл буфера для связывания (PBS + 2%FBs +0,1% азида) в течение 1 часа при 4^oC. Клетки промывали и осаждали, после чего измеряли их связанную радиоактивность. Затем вычисляли концентрации связанного и свободного меченного антитела.In FIG. 4 - competitive binding of mouse and humanized IgG1 and IqG4 DREG-200. Target cells are 2-1 cells, a line of mouse pre-B cells that were transfected with the human L-selectin gene, and therefore expressed human L-selectin (Berg et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 1048 (1992)). 5 x 10⁵ cells were incubated with 3 ng of¹²⁵ 1-labeled murine antibody (2 μCi / μg) along with increasing amounts of mouse or humanized competitor antibody in 0.2 ml of binding buffer (PBS + 2% FBs + 0,1% azide) for 1 hour at 4^o C. The cells were washed and pelleted, its their bound radioactivity measured. Then the calculated concentration of bound and free labeled antibody.

На фиг. 5 - связывание человеческих нейтрофилов с IL-I-стимулированными эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HU V EC). Нейтрофилы сначала обрабатывали иррелевантным контрольным антителом, мышиным антителом DREG-200 или очеловеченным антителом IgG1 DREG-200, или вообще не обрабатывали антителом (слева). In FIG. 5 - binding of human neutrophils to IL-I-stimulated human umbilical vein endothelial cells (HU V EC). Neutrophils were first treated with an irrelevant control antibody, murine DREG-200 antibody, or humanized IgG1 DREG-200 antibody, or not treated with antibody at all (left).

На фиг. 6 - защита ишемическо-реперфузированной ткани сердца с помощью "очеловеченного" антитела DREG-200. На рис. проиллюстрирован эксперимент, проведенный на кошках, обработанных "очеловеченным" антителом DREG-200 или контрольным антителом; слева направо: область под угрозой/полная вентрикулярная область; область некротической ткани/область под угрозой и область некротической ткани/полная область левого желудочка. Величины в скобках означают +/- среднеквадратичное отклонение для шести кошек; высота отрезков означает среднее значение. In FIG. 6 - protection of ischemic-reperfused heart tissue using the "humanized" DREG-200 antibody. In fig. illustrated an experiment conducted on cats treated with a humanized DREG-200 antibody or a control antibody; from left to right: area at risk / complete ventricular area; necrotic tissue area / area at risk and necrotic tissue area / total left ventricular area. Values in brackets mean +/- standard deviation for six cats; line height means average.

Определения
Термин "в основном идентичный" или "в основном гомологичный" означает, что две пептидные последовательности при оптимальном сравнении их первичной структуры, например, с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием весов предполагаемых брешей имеют идентичность по крайней мере 65%, а предпочтительно, по крайней мере 80-90%, а более предпочтительно, по крайней мере 95% или более (например, 99%). При этом, предпочтительно, если положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются друг от друга консервативными аминокислотными замещениями.Definitions
The term “substantially identical” or “substantially homologous” means that two peptide sequences, when optimally comparing their primary structure, for example, using GAP or BESTFIT programs using the weights of suspected gaps, have an identity of at least 65%, and preferably, at least 80-90%, and more preferably at least 95% or more (for example, 99%). Moreover, it is preferable if the positions of the residues, which are not identical, differ from each other by conservative amino acid substitutions.

Для классификации консервативных или неконсервативных аминокислотных замещений аминокислоты могут быть разделены на следующие группы: Группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, met, ala, val, leu, ile; Группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): сys, ser, thr; Группа III (кислотные боковые цепи): asp, glu; Группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; Группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro и Группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативными замещениями являются замещения между аминокислотами одного и того же класса. Неконсервативные замещения представляют собой замену аминокислоты одного класса на аминокислоту другого класса. To classify conservative or non-conservative amino acid substitutions, amino acids can be divided into the following groups: Group I (hydrophobic side chains): norleucine, met, ala, val, leu, ile; Group II (neutral hydrophilic side chains): cys, ser, thr; Group III (acidic side chains): asp, glu; Group IV (main side chains): asn, gln, his, lys, arg; Group V (residues affecting chain orientation): gly, pro; and Group VI (aromatic side chains): trp, tyr, phe. Conservative substitutions are substitutions between amino acids of the same class. Non-conservative substitutions are the replacement of an amino acid of one class with an amino acid of another class.

Аминокислоты из вариабельных областей зрелых тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов обозначаются Hx и Lx соответственно, где x представляет собой число, обозначающее положение аминокислот в соответствии со схемой Kobat в "Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 и 1991). В этой работе Kabat перечисляется много аминокислотных последовательностей антител для каждого подкласса, а также перечисляются наиболее часто встречающиеся аминокислоты для каждого положения остатка в данном подклассе. Kabat использовал метод, в котором каждой аминокислоте в перечисленных последовательностях приписывался номер, и этот метод нумерации аминокислотных остатков был принят специалистами за стандарт. Схема Kabat может быть использована и в отношении других антител, не включенных в список Kabat, путем сравнения первичной структуры исследуемого антитела с одной из консенсусных последовательностей в списке Kabat. Использование системы, нумерации Kabat, позволяет легко идентифицировать аминокислоты в эквивалентных положениях различных антител. Например, аминокислота в положении L 50 человеческого антитела занимает эквивалентное положение по отношению к положению аминокислоты L 50 мышиного антитела. Amino acids from the variable regions of the mature heavy and light chains of immunoglobulins are denoted by Hx and Lx, respectively, where x is a number denoting the position of amino acids according to the Kobat scheme in Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991) In this work, Kabat lists many amino acid sequences of antibodies for each subclass, and also lists the most common amino acids for each position of the residue in this subclass. Kabat used a method in which each amine the number was assigned to the acid in the listed sequences, and this method of numbering the amino acid residues was accepted by the experts as standard. The Kabat scheme can be used for other antibodies not included in the Kabat list by comparing the primary structure of the studied antibody with one of the consensus sequences in the Kabat list Using the Kabat numbering system, it is easy to identify amino acids at the equivalent positions of various antibodies. For example, the amino acid atposition L 50 of a human antibody is equivalent to the position ofamino acid L 50 of a murine antibody.

Начиная от N-конца и кончая C-концом, легкая и тяжелая цепи включают в себя домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Приписывание аминокислот к каждому домену проводится в соответствии с определениями Kabat (1987) и (1991), (см. выше) или Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Starting from the N-terminus and ending with the C-terminus, the light and heavy chains include the domains FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4. The assignment of amino acids to each domain is carried out in accordance with the definitions of Kabat (1987) and (1991), (see above) or Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989).

Подробное описание изобретения
В основном, классификация, используемая ниже, а также при описании лабораторных процедур; методы молекулярной генетики, химии нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные ниже, являются хорошо известными и широко используются специалистами в этой области. В методах рекомбинантных ДНК, синтеза полинуклеотидов, культивировании клеток и трансгенного введения генетического материала (например, электропорация, микроинъекции, липофекция) используется традиционная техника. В основном, ферментные реакции, синтез олигонуклеотидов и стадии очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителей. Способы и процедуры, в основном, осуществляют в соответствии со стандартной техникой, обычно применяемой в данной области, а также в соответствии с описаниями, имеющимися в литературе, ссылки на которую приводятся в настоящей заявке. Для удобства читателя в настоящей заявке также приводится описание хорошо известных процедур. Вся нужная информация вводится в настоящее описание посредством ссылки.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Basically, the classification used below, as well as in the description of laboratory procedures; the methods of molecular genetics, nucleic acid chemistry, and hybridization described below are well known and widely used by those skilled in the art. Methods of recombinant DNA, polynucleotide synthesis, cell culture and transgenic introduction of genetic material (e.g. electroporation, microinjection, lipofection) use a traditional technique. Basically, enzyme reactions, synthesis of oligonucleotides and purification steps are carried out in accordance with the instructions of the manufacturers. The methods and procedures are mainly carried out in accordance with standard techniques commonly used in this field, as well as in accordance with the descriptions in the literature, referenced in this application. For the convenience of the reader, this application also describes well-known procedures. All relevant information is entered into the present description by reference.

"Очеловеченные" антитела против L-селектина
Настоящее изобретение относится к получению "очеловеченных" иммуноглобулинов, специфически связывающихся с эпитопами L-селектина. Указанные иммуноглобулины, в основном, имеют высокую аффинность связывания с L-селектином, составляющую по крайней мере около 10⁷ М^-1, а предпочтительно от 10⁸ М^-1 до 10⁹ М^-1 или более, и обладают способностью связываться, например, с нейтрофилами. "Очеловеченные" иммуноглобулины имеют каркас человеческого иммуноглобулина, и одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR-Complementarity determining regions), происходящих от иммуноглобулина, обычно мышиного иммуноглобулина, способного к специфической реакции с L-селектином. В предпочтительном варианте настоящего изобретения одна или несколько CDR-областей происходят от мышиного антитела DREG-200, а "очеловеченный" иммуноглобулин, в целом, имеет изотип IgG1 или IqG4. Таким образом, иммуноглобулины настоящего изобретения, которые могут быть получены в больших количествах экономически эффективным способом, предназначены для использования в лечении воспалительных заболеваний у человека с применением различной техники.Humanized Anti-L-Selectin Antibodies
The present invention relates to the production of “humanized” immunoglobulins that specifically bind to L-selectin epitopes. These immunoglobulins generally have a high binding affinity for L-selectin of at least about 10⁷ M^-1 , and preferably from 10⁸ M^-1 to 10⁹ M^-1 or more, and have the ability to bind, for example, with neutrophils. “Humanized” immunoglobulins have a human immunoglobulin framework and one or more complementarity determining regions (CDRs) derived from immunoglobulin, usually a mouse immunoglobulin capable of a specific reaction with L-selectin. In a preferred embodiment of the present invention, one or more CDR regions are derived from a murine DREG-200 antibody, and the humanized immunoglobulin generally has an IgG1 or IqG4 isotype. Thus, the immunoglobulins of the present invention, which can be obtained in large quantities in a cost-effective manner, are intended for use in the treatment of inflammatory diseases in humans using various techniques.

Известно, что основная структурная единица антитела состоит из тетрамера. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом пара имеет одну "легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). NG₂-конец каждой цепи начинается с вариабельной области, состоящей приблизительно из 100-110 или более аминокислот, которые ответственны, главным образом, за узнавание антигена. COOH-часть каждой цепи определяет константная область, которая ответственна, главным образом, за эффекторную функцию.It is known that the main structural unit of an antibody consists of a tetramer. Each tetramer consists of two identical pairs of polypeptide chains, with the pair having one “light” (about 25 kDa) and one “heavy” chain (about 50-70 kDa). The NG₂ end of each chain begins with a variable region consisting of approximately 100-110 or more amino acids, which are mainly responsible for antigen recognition. The COOH part of each chain defines a constant region, which is mainly responsible for effector function.

Легкие цепи подразделяются на каппа- и лямбда-цепи. Тяжелые цепи классифицируются как гамма-, мю-, альфа-, дельта- или эпсилон-цепи, которые определяют изотип антитела, а именно IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области соединены "J"-областью, состоящей примерно из 12 аминокислот или более; причем в тяжелой цепи, кроме того, имеется область "D", состоящая примерно из 10 или более аминокислот (См. например, Fundamental Immunology, Paul, W., Ed., Chapter 7 pp. 131-166, Raven Press, N.Y. (1984); эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). Light chains are divided into kappa and lambda chains. Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon chains, which determine the antibody isotype, namely IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively. In light and heavy chains, variable and constant regions are connected by a “J” region of about 12 amino acids or more; moreover, in the heavy chain, in addition, there is a “D” region consisting of about 10 or more amino acids (See, for example, Fundamental Immunology, Paul, W., Ed.,Chapter 7 pp. 131-166, Raven Press, NY ( 1984); this work is incorporated herein by reference in its entirety).

Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий центр. Консервативные каркасные области всех цепей имеют, в основном, одинаковое строение и соединяются посредством трех гипервариабельных областей, называемых также участками, определяющими комплементарность (CDR) (см., например, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. и др., U.S. Department of Health and Human Services (1987) и Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); эти работы целиком вводятся в настоящее описание посредством ссылки). CDR двух цепей каждой пары перемещался с каркасными участками, обладающими способностью связываться со специфическим эпитопом. The variable regions of each pair of light / heavy chains form an antigen-binding center. The conservative framework regions of all chains have basically the same structure and are connected via three hypervariable regions, also called complementarity determining regions (CDRs) (see, for example, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E. et al., US Department of Health and Human Services (1987) and Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); these works are incorporated herein by reference in their entirety). The CDR of two strands of each pair moved with scaffold sites that are capable of binding to a specific epitope.

Используемый в настоящем описании термин "иммуноглобулин" относится к белку, состоящему из одного или нескольких полипептидов, в основном, кодируемых генами иммуноглобулина. Такими генами являются каппа-, лямбда-, альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон- и мю-гены константных областей, а также множество генов вариабельной области иммуноглобулина. Иммуноглобулины могут существовать, помимо антител, в виде других форм, например, таких как FV, Fab, и (Fab')₂, а также в виде гетеровалентных антител (например, Lanzavechia и др. , Eur. J. Immunol. 17:105 (1987)) и одиночных цепей (например, Huston et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988) и Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); указанные работы во всей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). (В общих чертах, см. Hood et al., Immunology (Benjamin N.Y., 2nd ed., 1984), Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) и Hunkapiller & Hood, Nature, 323: 15-16 (1986); все указанные работы вводятся в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки).Used in the present description, the term "immunoglobulin" refers to a protein consisting of one or more polypeptides, mainly encoded by immunoglobulin genes. Such genes are kappa, lambda, alpha, gamma, delta, epsilon and mu genes of constant regions, as well as many genes of the variable region of immunoglobulin. Immunoglobulins can exist, in addition to antibodies, in the form of other forms, for example, such as FV, Fab, and (Fab ')₂ , as well as in the form of heterovalent antibodies (e.g., Lanzavechia et al., Eur. J. Immunol. 17: 105 (1987)) and single chains (e.g., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988) and Bird et al., Science 242: 423-426 (1988); cited works in their entirety are hereby incorporated by reference). (Generally, see Hood et al., Immunology (Benjamin NY, 2nd ed., 1984), Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) and Hunkapiller & Hood, Nature, 323: 15-16 (1986); all of these works are introduced in the present description in its entirety by reference).

Химерные антитела представляют собой такие антитела, у которых гены легкой и тяжелой цепей были сконструированы обычно методами генной инженерии из сегментов иммуноглобулиновых генов, принадлежащих к различным видам. Например, вариабельные (V) сегменты генов от моноклонального мышиного антитела могут быть соединены с константными (C) сегментами иммуноглобулина человека, таким как V₁ и V₄. Таким образом, типичное терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из V или антигенсвязывающего домена, происходящего от мышиного антитела, и C или эжекторного домена, происходящего от антитела человека, хотя могут быть использованы антитела и других видов млекопитающих.Chimeric antibodies are those antibodies in which the light and heavy chain genes were usually constructed by genetic engineering from segments of immunoglobulin genes belonging to different species. For example, variable (V) gene segments from a monoclonal mouse antibody can be coupled to constant (C) segments of a human immunoglobulin, such as V₁ and V₄ . Thus, a typical therapeutic chimeric antibody is a fusion protein consisting of a V or antigen binding domain derived from a murine antibody and a C or ejector domain derived from a human antibody, although antibodies of other mammalian species can be used.

Используемый в настоящем описании термин "каркасная область" относится к таким участкам вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, которые являются относительно консервативными (т.е. менее вариабельными, чем CDR) у иммуноглобулинов одного вида (как было определено Kabat и др., см. выше). Используемый в настоящем описании термин "каркасная область человека" означает каркасную область, которая, в основном, идентична (например, на 85% или более) каркасной области натурального антитела человека или консенсусной последовательности нескольких таких антител. As used herein, the term “framework region” refers to those regions of the variable regions of the light and heavy chains of the immunoglobulin that are relatively conservative (ie, less variable than the CDRs) of the same type of immunoglobulins (as defined by Kabat et al., See . above). As used herein, the term “human framework region” means a framework region that is substantially identical (for example, 85% or more) to the framework region of a natural human antibody or the consensus sequence of several such antibodies.

Используемый в настоящем описании термин "очеловеченный иммуноглобулин" относится к иммуноглобулину, который включает в себя каркас иммуноглобулина человека; и по крайней мере одну гипервариабельную область (CDR), происходящую от антитела, не являющегося человеческим и в котором любая присутствующая константная область, в основном, идентична константной области человеческого иммуноглобулина по крайней мере примерно на 85-90%, а предпочтительно, по крайней мере на 95 %. Следовательно, все части "очеловеченного" иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, являются, в основном, идентичными соответствующим частям одного или нескольких последовательностей нативного иммуноглобулина человека. Так, например, к "очеловеченному" иммуноглобулину не относится химерное антитело, имеющее мышиную вариабельную область и человеческую константную область. As used herein, the term “humanized immunoglobulin” refers to an immunoglobulin that includes a human immunoglobulin framework; and at least one hypervariable region (CDR) derived from a non-human antibody and in which any constant region present is substantially identical to the constant region of human immunoglobulin by at least about 85-90%, and preferably at least by 95%. Therefore, all parts of the “humanized” immunoglobulin, with the possible exception of CDR, are essentially identical to the corresponding parts of one or more sequences of the native human immunoglobulin. Thus, for example, a “humanized” immunoglobulin does not include a chimeric antibody having a murine variable region and a human constant region.

По сравнению с антителами, а в некоторых случаях и с химерными антителами "очеловеченные" антитела имеют по крайней мере три потенциальных преимущества при их использовании для лечения человека, а именно:
(1) поскольку эффекторная часть "очеловеченного" антитела происходит от человеческого иммуноглобулина, то это антитело лучше взаимодействует с другими частями иммунной системы человека (например, с большей эффективностью разрушает клетки мишени благодаря комплементзависимой цитотоксичности (CDC) или антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC)).Compared with antibodies, and in some cases with chimeric antibodies, humanized antibodies have at least three potential advantages when used for treating humans, namely:
(1) since the effector part of the “humanized” antibody is derived from human immunoglobulin, this antibody interacts better with other parts of the human immune system (for example, it destroys target cells more efficiently due to complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) )

(2) Человеческая иммунная система не должна распознавать каркасную или C-область "очеловеченного" антитела как чужеродную, а поэтому антительный ответ организма против такого инъецированного антитела должен быть меньше, чем ответ против целиком чужеродного мышиного антитела, либо частично чужеродного химерного антитела. (2) The human immune system should not recognize the framework or C region of a “humanized” antibody as foreign, and therefore the antibody response of the body against such an injected antibody should be less than the response against a completely foreign mouse antibody or a partially foreign chimeric antibody.

(3) Сообщалось (Shaw D., et al., J. Immunol., 138:4534-4538 (1987)), что инъецированные мышиные антитела имеют более короткое время полужизни в кровотоке человека, чем нормальные антитела. Инъецированные "очеловеченные" антитела, по всей вероятности, имеют такое же время полужизни, что и натуральные антитела человека, если учесть, что эти антитела попадают в кровоток в меньших и не в столь частых дозах. (3) It has been reported (Shaw D., et al., J. Immunol., 138: 4534-4538 (1987)) that injected murine antibodies have a shorter half-life in the human bloodstream than normal antibodies. Injected “humanized” antibodies, in all probability, have the same half-life as natural human antibodies, given that these antibodies enter the bloodstream in smaller and less frequent doses.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к сегментнам рекомбинантных ДНК, кодирующим CDR-области тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина, способного связываться с нужным эпитопом L-селектина, например, такого как мышиные моноклональные антитела DREG-200, DREG-55 или DREG-56 (Kishimoto et al. (1990), см.выше; эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). ДНК-сегменты, кодирующие указанные области, сшивают с ДНК-сегментами, кодирующими соответствующие каркасные области, происходящие от иммуноглобулина человека. Характерные ДНК-последовательности, которые после экспрессии кодируют полипептидные цепи, содержащие CDR-области тяжелой и легкой цепей моноклонального мышиного антитела DREG-200, показаны на фиг. 1. Благодаря вырождению кодона и некритическим аминокислотным замещениям, эти последовательности могут быть легко заменены другими ДНК-последовательностями, как, например, описано ниже. Подробное описание конструирования и продуцирования "очеловеченных" иммуноглобулинов приводится в общих чертах в переуступленных заявках per. N 07/290975 и 07/310252, поданных 28 декабря 1988 и 13 февраля 1989 соответственно, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. In one embodiment, the present invention relates to recombinant DNA segments encoding an immunoglobulin heavy and / or light chain CDR region capable of binding to a desired L-selectin epitope, such as, for example, DREG-200, DREG-55 or DREG murine monoclonal antibodies -56 (Kishimoto et al. (1990), supra; this work is hereby incorporated by reference in its entirety). DNA segments encoding these regions are crosslinked with DNA segments encoding corresponding framework regions derived from human immunoglobulin. Typical DNA sequences that, after expression, encode polypeptide chains containing the CDR regions of the heavy and light chains of the DREG-200 monoclonal mouse antibody are shown in FIG. 1. Due to codon degeneration and non-critical amino acid substitutions, these sequences can be easily replaced by other DNA sequences, as, for example, described below. A detailed description of the design and production of humanized immunoglobulins is outlined in the assigned applications per. N 07/290975 and 07/310252, filed December 28, 1988 and February 13, 1989, respectively, which in their entirety are introduced into the present description by reference.

Кроме того, ДНК-сегменты могут содержать ДНК-последовательность, регулирующую экспрессию и соответствующим образом присоединенную к последовательностям, кодирующим "очеловеченный" иммуноглобулин, например, натуральные или гетерологичные промоторные области. Предпочтительными регуляторными последовательностями являются эукариотические промоторные системы, присутствующие в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотических клеток-хозяев, хотя могут быть также использованы и регуляторные последовательности для прокариотических клеток. После введения вектора в соответствующую клетку-хозяина эту клетку выдерживают в условиях, подходящих для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, а затем, если это необходимо, осуществляют сбор и очистку легких цепей, тяжелых цепей, димеров легких/тяжелых цепей или интактных антител, связывающихся фрагментов или других форм иммуноглобулинов. In addition, DNA segments may contain a DNA sequence that controls expression and is appropriately linked to sequences encoding humanized immunoglobulin, for example, natural or heterologous promoter regions. Preferred regulatory sequences are eukaryotic promoter systems present in vectors capable of transforming or transfecting eukaryotic host cells, although regulatory sequences for prokaryotic cells can also be used. After the vector has been introduced into the appropriate host cell, this cell is maintained under conditions suitable for high expression of nucleotide sequences, and then, if necessary, light chains, heavy chains, light / heavy chain dimers, or intact antibodies binding fragments are collected and purified. or other forms of immunoglobulins.

Таким образом, нуклеиновокислотные последовательности настоящего изобретения, обладающие способностью к продуцированию нужных "очеловеченных" антител, могут быть сконструированы из различных полинуклеотидов (таких, как геномная или кДНК, РНК, синтетические олигонуклеотиды и т.п.) и компонентов (таких, как V-, J-, D- и C-области) с использованием различной техники. Наиболее распространенным методом такого конструирования является соединение соответствующих геномных и синтетических последовательностей, хотя могут быть также использованы и кДНК-последовательности (см.публикацию Европатента N 0239400 и Riechmann, L. et al., Nature 332: 323-327 (1988); обе эти работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Thus, nucleic acid sequences of the present invention, capable of producing the desired “humanized” antibodies, can be constructed from various polynucleotides (such as genomic or cDNA, RNA, synthetic oligonucleotides, etc.) and components (such as V- , J-, D- and C-regions) using various techniques. The most common method of this construction is to combine the corresponding genomic and synthetic sequences, although cDNA sequences can also be used (see publication Europatent N 0239400 and Riechmann, L. et al., Nature 332: 323-327 (1988); both of these the work in its entirety is introduced into the present description by reference).

ДНК-последовательности константных областей человека могут быть выделены с использованием известных процедур из различных клеток человека, а предпочтительно изиммортализованных B-клеток (Kabat см.выше, и WP87/02671). CDR, используемые для получения иммуноглобулинов настоящего изобретения, могут быть получены от моноклональных антител, способных связываться с L-селектином, и продуцированы в любом подходящем источнике, взятом от млекопитающего, например, такого, как мышь, крыса, кролик или другое позвоночное животное, способное к продуцированию антител, с использованием методов, хорошо известных специалистам. Подходящие клетки-источники для ДНК-последовательностей, а также клетки-хозяева для экспрессии и секреции иммуноглобулинов могут быть получены из ряда источников, например, таких как Американская коллекция типовых культур (Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 5-th ed. (1985) Rockville, MD; эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). В предпочтительных вариантах настоящего изобретения CDR-последовательности соответствуют CDR-последовательностям антитела DREG-200, антитела мыши DREG-55 или антитела DREG-56 и могут содержать вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие соответствующие аминокислотные последовательности CDR мышиного антитела DREG-200, DREG-55 или DREG-56. DNA sequences of human constant regions can be isolated using known procedures from various human cells, and preferably ismortalized B cells (Kabat, supra, and WP87 / 02671). The CDRs used to produce the immunoglobulins of the present invention can be obtained from monoclonal antibodies capable of binding to L-selectin and produced in any suitable source taken from a mammal, such as a mouse, rat, rabbit or other vertebrate capable of to antibody production using methods well known in the art. Suitable source cells for DNA sequences, as well as host cells for expression and secretion of immunoglobulins, can be obtained from a number of sources, for example, such as the American Type Culture Collection (Catalog of Cell Lines and Hybridomas, 5th ed. (1985) Rockville, MD; this work is hereby incorporated by reference in its entirety). In preferred embodiments of the present invention, the CDR sequences correspond to the CDR sequences of a DREG-200 antibody, a DREG-55 mouse antibody or a DREG-56 antibody, and may contain degenerate nucleotide sequences encoding the corresponding CDR amino acid sequences of a mouse DREG-200, DREG-55 or DREG antibody -56.

Помимо "очеловеченных" иммуноглобулинов, подробно описанных в настоящей заявке, могут быть легко сконструированы и продуцированы другие "в основном, гомологичные" модифицированные иммуноглобулины с использованием хорошо известной техники рекомбинантных ДНК. В качестве источника каркасной последовательности могут быть использованы и другие антитела человека, отличающиеся от антител Eu, обсуждаемых в Примере 2. Эти каркасные последовательности должны быть в высокой степени идентичными вариабельным каркасным доменам мышиного антитела DREG-200, от которых происходят области CDR. Вариабельные каркасные области тяжелой и легкой цепей могут происходить от последовательностей одного и того же антитела либо от последовательностей разных антител человека. Так, например, каждая из каркасных областей тяжелой и легкой цепей может происходить от нескольких антител человека. Такими последовательностями могут быть последовательности природных антител человека, либо консенсусные последовательности нескольких антител человека (см. Carter и др. WO 92/22653 (1992)). In addition to the "humanized" immunoglobulins described in detail in this application, other "substantially homologous" modified immunoglobulins can be easily constructed and produced using well-known recombinant DNA techniques. Other human antibodies other than the Eu antibodies discussed in Example 2 can be used as a source of the framework sequence. These framework sequences must be highly identical to the variable framework domains of the mouse DREG-200 antibody from which the CDR regions are derived. The variable framework regions of the heavy and light chains can be derived from sequences of the same antibody or from sequences of different human antibodies. For example, each of the frame regions of the heavy and light chains can be derived from several human antibodies. Such sequences may be sequences of natural human antibodies, or the consensus sequences of several human antibodies (see Carter et al. WO 92/22653 (1992)).

Непосредственное и неестественное соседство мышиных CDR-областей с вариабельной каркасной областью человека может приводить к конформационным затруднениям, которые, если их не скорректировать посредством замещения некоторых аминокислотных остатков, могут привести к потере аффинности связывания. Выбор аминокислотных остатков для замещения осуществляется частично с помощью компьютерного моделирования. Для этих целей широко используется компьютерная аппаратура и программное обеспечение для проецирования трехмерного изобретения молекул иммуноглобулина. В общих чертах, молекулярные модели продуцируют исходя из известных структур иммуноглобулиновых цепей или их доменов. Моделируемые цепи сравнивают с цепями или доменами известных трехмерных структур для анализа сходства их аминокислотных последовательностей и, если указанные цепи или домены обнаруживают высокую степень сходства, то их используют в качестве отправной точки для конструирования молекулярной модели. Выбранные сходные структуры модифицируют с учетом различия между тактически существующими аминокислотами в моделируемых цепях или доменах иммуноглобулина и аминокислотами, имеющимися в исходной структуре. Затем модифицированные структуры собирают с получением модели составного иммуноглобулина. И, наконец, полученную модель совершенствуют путем энергетической минимизации и контроля за тем, чтобы все атомы находились на соответствующем расстоянии друг от друга и чтобы длина связей и углы находились в пределах химически допустимых диапазонов. Стадии продуцированной трехмерной компьютерной модели для вариабельных областей мышиного антитела DREG-200 подробно обсуждаются в Примере 2. Эта модель, в свою очередь, может быть отправной точкой предсказания трехмерной структуры антитела, содержащего гипервариабельные области мышиного DREG-200, замещенные в каркасных чел. структурах. Кроме того, могут быть сконструированы модели, представляющие структуру в том случае, если вводятся дополнительные аминокислотные замещения, обсуждаемые ниже. The direct and unnatural proximity of murine CDR regions to the variable framework region of a person can lead to conformational difficulties, which, if not corrected by substitution of certain amino acid residues, can lead to a loss of binding affinity. The choice of amino acid residues for substitution is carried out in part by computer simulation. For these purposes, computer equipment and software are widely used to project the three-dimensional invention of immunoglobulin molecules. In general terms, molecular models are produced based on known structures of immunoglobulin chains or their domains. The modeled chains are compared with chains or domains of known three-dimensional structures to analyze the similarity of their amino acid sequences and, if these chains or domains show a high degree of similarity, they are used as a starting point for constructing a molecular model. Selected similar structures are modified to take into account the differences between the tactically existing amino acids in the simulated immunoglobulin chains or domains and the amino acids present in the original structure. Then, the modified structures are assembled to obtain a composite immunoglobulin model. And, finally, the resulting model is improved by energy minimization and control so that all atoms are at an appropriate distance from each other and that the bond lengths and angles are within chemically acceptable ranges. The stages of the produced three-dimensional computer model for the variable regions of the mouse DREG-200 antibody are discussed in detail in Example 2. This model, in turn, can be the starting point for predicting the three-dimensional structure of the antibody containing the hypervariable regions of the mouse DREG-200, substituted in frame people. structures. In addition, models can be constructed that represent the structure in the event that additional amino acid substitutions are introduced, discussed below.

Вообще говоря, замещение человеческих аминокислотных остатков мышиными остатками должно быть минимизировано, так как введение мышиных остатков увеличивает риск индуцирования у человека HAMA-ответ. Аминокислоты для замещения выбирают исходя из их возможного влияния на CDR-конформацию и/или связывание с антигеном. Исследование такого возможного влияния проводят путем моделирования, оценки характеристик аминокислот в конкретных положениях или эмпирического наблюдения влияния замещения или мутагенеза конкретных аминокислот. Generally speaking, the substitution of human amino acid residues with murine residues should be minimized, since the introduction of murine residues increases the risk of inducing a HAMA response in humans. Amino acids for substitution are selected based on their possible effect on the CDR conformation and / or binding to the antigen. The study of this possible effect is carried out by modeling, evaluating the characteristics of amino acids in specific positions or empirically observing the effects of substitution or mutagenesis of specific amino acids.

Если аминокислота в вариабельной каркасной области мышиного антитела DREG-200 отличается от аминокислоты в эквивалентной вариабельной каркасной области человека, то человеческая аминокислота должна быть заменена эквивалентной мышиной аминокислотой в случае, если имеются основания ожидать, что данная аминокислота:
/1/ нековалентно контактирует непосредственно с антигеном, или
/2/ находится в непосредственной близости или как-нибудь иначе взаимодействует с CDR-областью /например, находится на расстоянии примерно

от CDR-области/.If the amino acid in the variable framework region of the mouse DREG-200 antibody is different from the amino acid in the equivalent variable framework region of a person, then the human amino acid should be replaced with an equivalent mouse amino acid if there is reason to expect that this amino acid:
/ 1 / non-covalently contact directly with the antigen, or
/ 2 / is in close proximity or otherwise interacts with the CDR region / for example, is approximately

from the CDR region.

Другими кандидатами на замещение являются аминокислоты акцепторного каркаса иммуноглобулина человека, которые несвойственны для иммуноглобулина человека в этом положении /например, аминокислота H113 человеческого антитела Eu/. Эти аминокислоты могут быть замещены аминокислотами из эквивалентного полонения более типичных иммуноглобулинов человека. Альтернативно, аминокислоты из эквивалентных положений мышиного антитела DREG-200 могут быть введены в каркасные области человека, если такие аминокислоты являются типичными для иммуноглобулина человека в эквивалентном положении. Other candidates for substitution are amino acids of the acceptor skeleton of a human immunoglobulin that are not characteristic of a human immunoglobulin in this position / for example, amino acid H113 of the human Eu antibody /. These amino acids can be replaced by amino acids from equivalent poloneniya more typical human immunoglobulins. Alternatively, amino acids from the equivalent positions of the mouse DREG-200 antibody can be introduced into human framework regions if such amino acids are typical of human immunoglobulin at the equivalent position.

Вообще говоря, замещение всех или большинства аминокислот, удовлетворяющее вышеуказанным критериям, является желательным. Однако, иногда, имеется некоторая неопределенность относительно того, какая именно аминокислота отвечает вышеуказанному критерию, и в этом случае продуцируют альтернативный вариант иммуноглобулинов, один из которых содержит данное замещение, а другой - нет. "Очеловеченные" антитела настоящего изобретения обычно имеют замещение в каркасной области легкой цепи соответствующим остатком мышиного антитела DREG-200 по крайней мере в 1, 2, 3, 4 и обычно 5 положениях, выбранных из следующих положений: L87, L54, L66, L76 и L93. "Очеловеченные" антитела также обычно содержат замещение остатком каркасной области мышиной тяжелой цепи по крайней мере в 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, а обычно 12 положениях, выбранных из следующих положений: H93, H95, H98, H111, H112, H115, H30, H98, H111, H27, H48 и H72. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, если акцепторным иммуноглобулином с тяжелой цепью человека является антитело Eu, то тяжелая цепь также имеет замещение в H113. Это положение обычно замещается аминокислотой из эквивалентного положения иммуноглобулина человека, имеющего более типичные аминокислотные остатки. Generally speaking, substitution of all or most of the amino acids that meets the above criteria is desirable. However, sometimes, there is some uncertainty as to which particular amino acid meets the above criteria, in which case an alternative variant of immunoglobulins is produced, one of which contains this substitution and the other does not. "Humanized" antibodies of the present invention usually have a substitution in the frame region of the light chain with the corresponding residue of the mouse DREG-200 antibody in at least 1, 2, 3, 4 and usually 5 positions selected from the following positions: L87, L54, L66, L76 and L93. "Humanized" antibodies also usually contain the substitution of the remainder of the frame region of the mouse heavy chain in at least 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, and usually 12 positions selected from the following positions: H93, H95, H98, H111, H112, H115, H30, H98, H111, H27, H48 and H72. In a preferred embodiment of the present invention, if the human heavy chain acceptor immunoglobulin is an Eu antibody, the heavy chain also has a substitution in H113. This position is usually replaced by an amino acid from the equivalent position of a human immunoglobulin having more typical amino acid residues.

Обычно, CDR-области в "очеловеченных" антителах являются, в основном и предпочтительно, идентичными соответствующим CDR-областям мышиного антитела DREG-200. Однако, в некоторых случаях может оказаться предпочтительным заменить один остаток в CDR-области, например, для создания сходства с местом связывания лиганда L-селектина. Иногда можно, хотя и нежелательно, сделать одно или несколько консервативных аминокислотных замещений CDR-остатков, если это, конечно, заметно не повлияет на аффинность связывания полученного "очеловеченного" иммуноглобулина. Typically, the CDR regions in humanized antibodies are substantially and preferably identical to the corresponding CDR regions of the mouse DREG-200 antibody. However, in some cases it may be preferable to replace one residue in the CDR region, for example, to create similarities with the binding site of the L-selectin ligand. Sometimes it is possible, although undesirable, to make one or more conservative amino acid substitutions of CDR residues, if this, of course, does not noticeably affect the binding affinity of the obtained humanized immunoglobulin.

За исключением конкретных аминокислотных замещений, обсуждаемых выше, каркасные области "очеловеченных" иммуноглобулинов, в основном и в большинстве случаев, идентичны каркасным областям антител человека, от которых они происходят. Однако, в некоторых вариантах настоящего изобретения каркасные области могут отличаться от нативных последовательностей по своей первичной структуре, например, несколькими аминокислотными замещениями, концевыми или промежуточными вставками и делециями, и т.п. Подходящими компонентами для полипептидов настоящего изобретения могут также служить стереоизомеры /например, D-аминокислоты/ двадцати главных аминокислот, ненатуральные аминокислоты, такие как α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкил-аминокислоты, молочная кислота и другие второстепенные аминокислоты. Очевидно, что многие из аминокислот каркасной области могут вносить свой небольшой или косвенный вклад в специфичность или аффинность антитела. Поэтому многие отдельные консервативные замещения остатков каркасной области являются вполне допустимыми, если только они не оказывают неблагоприятного воздействия на специфичность или аффинность полученного "очеловеченного" иммуноглобулина. Однако, в основном, такие замещения являются нежелательными. Модификации генов могут быть легко осуществлены с использованием хорошо известной техники, такой как сайт-специфический мутагенез /см. Gillman & Smith, Gene 8:81-97 /1989/ и Robers et al. , Nature 328:731-734 /1987/; обе из указанных работ во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки/. With the exception of the specific amino acid substitutions discussed above, the framework regions of humanized immunoglobulins are basically and in most cases identical to the framework regions of the human antibodies from which they originate. However, in some embodiments of the present invention, framework regions may differ from native sequences in their primary structure, for example, by several amino acid substitutions, terminal or intermediate inserts and deletions, and the like. Suitable components for the polypeptides of the present invention may also be stereoisomers (for example, D-amino acids) of twenty major amino acids, unnatural amino acids such as α, α-disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid and other minor amino acids. Obviously, many of the amino acids of the framework region can make a small or indirect contribution to the specificity or affinity of the antibody. Therefore, many individual conservative substitutions of residues of the framework region are quite acceptable, provided that they do not adversely affect the specificity or affinity of the resulting humanized immunoglobulin. However, in general, such substitutions are undesirable. Gene modifications can be easily carried out using well-known techniques, such as site-specific mutagenesis / cm. Gillman & Smith, Gene 8: 81-97 / 1989 / and Robers et al. Nature 328: 731-734 / 1987 /; both of these works in their entirety are introduced into the present description by reference /.

Альтернативно могут быть продуцированы полипептидные фрагменты, содержащие лишь часть первичной структуры антитела и обладающие одной или несколькими активностями иммуноглобулина /например, активностью связывания/. Эти полипептидные фрагменты могут быть продуцированы путем протеолитического расщепления интактных антител известными методами либо путем инсерции стоп-кодонов в нужных положениях в векторы pVk и pVg1- dhfr с использованием сайт-специфического мутагенеза, например, так, чтобы после CH1 продуцировались Fab-фрагменты или после шарнирной области продуцировались /Fab'/₂-фрагменты. Одноцепочечные антитела могут быть продуцированы путем соединения VL и VH с ДНК-линкером /см. Huston et al., см. выше, и Bird et al. , см.выше/. Например, FV - или Fab-фрагменты могут быть продуцированы в E.coli в соответствии с методами, описанными Buchner & Rudolph, Bio/Technology 9: 157-162 /1991/ и Skerra et al., Bid Technology 9:273-277 /1991/ /эти работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки/. FV- и Fab-фрагменты могут быть также продуцированы путем экспрессии кодирующих полинуклеотидов в эукариотических клетках, предпочтительно в клетках млекопитающего. Кроме того, поскольку, подобно многим генам, гены, ассоциированные с иммуноглобулинами, содержат отдельные функциональные области, каждая из которых обладает одной или несколькими характерными биологическими активностями, то эти гены могут быть лигированы с функциональными областями от других генов /например, ферментов, см. переуступленную заявку США рег. N 132387, поданную 15 дек.1987, которая вводится во всей полноте в настоящее описание посредством ссылки/, в результате чего могут быть получены гибридные белки /например, иммунотоксины/, обладающие новыми свойствами.Alternatively, polypeptide fragments can be produced containing only part of the primary structure of the antibody and having one or more immunoglobulin activities (for example, binding activity). These polypeptide fragments can be produced by proteolytic cleavage of intact antibodies by known methods or by insertion of stop codons at desired positions into pVk and pVg1-dhfr vectors using site-specific mutagenesis, for example, so that Fab fragments are produced after CH1 or after hinge regions produced / Fab '/₂ fragments. Single chain antibodies can be produced by combining VL and VH with a DNA linker / cm. Huston et al., Supra, and Bird et al. , see above/. For example, FV or Fab fragments can be produced in E. coli in accordance with the methods described by Buchner & Rudolph, Bio / Technology 9: 157-162 / 1991 / and Skerra et al., Bid Technology 9: 273-277 / 1991 / / these works in their entirety are introduced into the present description by reference /. FV and Fab fragments can also be produced by expression of coding polynucleotides in eukaryotic cells, preferably in mammalian cells. In addition, since, like many genes, genes associated with immunoglobulins contain separate functional regions, each of which has one or more characteristic biological activities, these genes can be ligated to functional regions from other genes / e.g. enzymes, see assigned application US reg. N 132387, filed December 15, 1987, which is introduced in its entirety in the present description by reference /, as a result of which hybrid proteins (for example, immunotoxins) with new properties can be obtained.

Экспрессия последовательностей "очеловеченного" иммуноглобулина в бактериальных хозяевах может быть использована для благоприятного выбора последовательностей "очеловеченного" иммуноглобулина с более высокой аффинностью посредством мутагенеза CDR-областей и продуцирования фаговых дисплейных библиотек, которые могут быть скринированы на наличие CDR-вариантов "очеловеченного" иммуноглобулина, обладающих высокой аффинностью и/или высокой специфичностью связывания с L-селектином. Одним из потенциальных преимуществ такого усовершенствованного подбора аффинности является генерирование CDR-вариантов "очеловеченного" иммуноглобулина, имеющих более высокую аффинность связывания и/или более низкую перекрестную реактивность по отношению к молекулам, не являющимся L-селектинами. Методы продуцирования фаговых дисплейных библиотек, содержащих последовательности вариабельных областей иммуноглобулина, известны специалистам /см., например, Cesareni, FEBS Lett 307: 66-70 /1992/; Swimmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3756-60 /1992/; Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89-3576-80 /1992/;
Clackson et al. , Nature 352:624-8 /1991/; Scott & Smith, Science 249: 386-90 /1990/; Garrard et al., Bid Techniques 9:1373-1377 /1991/; все указанные работы во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки/. Полученные в результате последовательности CDR-вариантов "очеловеченного" иммуноглобулина затем экспрессируют в подходящем хозяине, обеспечивающем эффективную экспрессию.Expression of humanized immunoglobulin sequences in bacterial hosts can be used to favorably select humanized immunoglobulin sequences with higher affinity by mutagenesis of CDR regions and production of phage display libraries that can be screened for CDR variants of humanized immunoglobulin having high affinity and / or high specificity of binding to L-selectin. One of the potential advantages of this improved affinity selection is the generation of CDR variants of humanized immunoglobulin having higher binding affinity and / or lower cross-reactivity with respect to non-L-selectin molecules. Methods for producing phage display libraries containing sequences of immunoglobulin variable regions are known to those skilled in the art / see, for example, Cesareni, FEBS Lett 307: 66-70 / 1992 /; Swimmer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 3756-60 / 1992 /; Gram et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 89-3576-80 / 1992 /;
Clackson et al. Nature 352: 624-8 / 1991 /; Scott & Smith, Science 249: 386-90 / 1990 /; Garrard et al., Bid Techniques 9: 1373-1377 / 1991 /; all of these works in their entirety are introduced into the present description by reference /. The resulting sequence of CDR variants of the “humanized” immunoglobulin is then expressed in a suitable host that provides efficient expression.

Как указывалось ранее, ДНК-последовательности могут быть экспрессированы в соответствующих клетках-хозяевах после того, как эти последовательности будут надлежащим образом присоединены /т.е. таким образом, чтобы обеспечивалось их функционирование/ к последовательности, регулирующей экспрессию. Для этих целей могут быть использованы экспрессирующие векторы, которые способны к репликации в хозяйских организмах либо как эписомы, либо как интегральная часть хромосомной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии содержат селективные маркеры, например, резистентность к тетрациклину /tet^R/, в G418-резистентность /neo^R/, резистентность к микофенольной кислоте /gpt/, HSV-tk, которые позволяют обнаруживать клетки, трансформированные нужными ДНК-последовательностями /см. например, патент США 4704362, который полностью вводится в настоящее описание посредством ссылки/.As indicated previously, DNA sequences can be expressed in appropriate host cells after these sequences have been appropriately linked (i.e. so that their functioning / to the expression regulatory sequence is ensured. For these purposes, expression vectors can be used that are capable of replication in host organisms either as episomes or as an integral part of the host chromosomal DNA. Typically, expression vectors contain selectable markers, for example, tetracycline resistance / tet^R /, G418 resistance / neo^R /, mycophenolic acid resistance / gpt /, HSV-tk, which allow the detection of cells transformed with desired DNA sequences / cm . for example, US patent 4704362, which is fully introduced into the present description by reference /.

Одним из прокариотических хозяев, конкретно используемых для клонирования ДНК-последовательностей настоящего изобретения, является E.coli. Другими подходящими микробными хозяевами являются бациллы, такие как Bacillus Subtilis; другие энтеробактерии, такие как Salmonella, Serratia, и различные виды Pseudomonas. В этих прокариотических хозяевах могут быть также экспрессированы векторы, которые обычно содержат регуляторные последовательности, совместимые с данной клеткой-хозяином /например, сайт-инициации репликации/. Кроме того, могут также присутствовать любые другие хорошо известные промоторы, такие как промоторная система лактозы, промоторная система триптофана /trp/, промоторная система бета-лактамазы или промоторная система фага-лямбда. Эти промоторы обычно контролируют экспрессию, необязательно, посредством операторной последовательности и имеют последовательности сайта связывания с рибосомой и т.п. для инициации и терминации транскрипции и трансляции. One of the prokaryotic hosts specifically used for cloning the DNA sequences of the present invention is E. coli. Other suitable microbial hosts are bacilli, such as Bacillus subtilis; other enterobacteria, such as Salmonella, Serratia, and various species of Pseudomonas. Vectors can also be expressed in these prokaryotic hosts, which typically contain regulatory sequences that are compatible with this host cell (for example, a replication initiation site). In addition, any other well-known promoters may also be present, such as the lactose promoter system, tryptophan promoter system / trp /, the beta-lactamase promoter system, or the phage lambda promoter system. These promoters typically control expression, optionally via an operator sequence, and have ribosome binding site sequences and the like. to initiate and terminate transcription and translation.

Для экспрессии могут быть также использованы и другие микробы, такие как дрожжи. Предпочтительным хозяином является Saccharomyces, а подходящими векторами являются векторы, имеющие последовательности, контролирующие экспрессию, такие как промоторы, например, промоторы 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, а также сайт инициации репликации, терминирующие последовательности и т.п., если это необходимо. Other microbes, such as yeast, can also be used for expression. The preferred host is Saccharomyces, and suitable vectors are vectors having expression control sequences, such as promoters, for example, 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzyme promoters, as well as a replication initiation site, termination sequences, and the like, if necessary.

Для экспрессии "очеловеченного" иммуноглобулина настоящего изобретения могут быть использованы растения и культуры растительных клеток /Larrick & Fry, Hum. Antibodies Hybridomas 2/4/:172-89 /1991/; Benvenuto et al., Plant Mol. Biol. 17/4/:865-74 /1991/; Durin et al., Plant Mol. Biol. 15/2/:281-93 /1990/; Hiatt et al., Nature 342:76-8 /1989/; все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки/. Предпочтительными растительными хозяевами являются, например, Arabidopsis, Nicotiana tabacum, Nicotiana rustica и Solanum tuberosum. Предпочтительным полигенным экспрессирующим кластером, подходящим для экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих "очеловеченные" антитела настоящего изобретения, направленные против L-селектина, является плазмида pMOG18, в которой инсертированная полинуклеотидная последовательность, кодирующая цепь "очеловеченного" иммуноглобулина, является соответственно сшитой с CAMV35S-промотором, связанным с дуплицированным энхансером; причем указанная плазмида используется в соответствии с методом, описанным Sijmons et al., Bio/Technology, 8:217-221 /1990/; эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки/. Альтернативно, экспрессию "очеловеченных иммуноглобулинов в растениях осуществляют предпочтительно по методу Hiatt и др. /см.выше/, за исключением того, что иммуноглобулиновые последовательности, используемые Hiatt и др. /см. выше/, заменяют полинуклеотидными последовательностями, кодирующими "очеловеченные" антитела настоящего изобретения против L-селектина. Для экспрессии последовательностей "очеловеченного" иммуноглобулина могут быть также использованы векторы на основе Т-ДНК Agrobacterium tumifaciens, а предпочтительно такие векторы, которые содержат маркерный ген, кодирующий резистентность к спектиномицину, или другой маркерный ген. Plants and plant cell cultures / Larrick & Fry, Hum can be used to express the “humanized” immunoglobulin of the present invention.Antibodies Hybridomas 2/4 /: 172-89 / 1991 /; Benvenuto et al., Plant Mol. Biol. 17/4 /: 865-74 / 1991 /; Durin et al., Plant Mol. Biol. 15/2 /: 281-93 / 1990 /; Hiatt et al., Nature 342: 76-8 / 1989 /; all of these works are introduced into the present description by reference /. Preferred plant hosts are, for example, Arabidopsis, Nicotiana tabacum, Nicotiana rustica and Solanum tuberosum. A preferred polygenic expression cluster suitable for expressing polynucleotide sequences encoding the humanized antibodies of the present invention directed against L-selectin is the plasmid pMOG18, in which the inserted polynucleotide sequence encoding the humanized immunoglobulin chain is suitably crosslinked with CAMV35S associated with a duplicated enhancer; moreover, the specified plasmid is used in accordance with the method described by Sijmons et al., Bio / Technology, 8: 217-221 / 1990 /; this work is introduced into the present description by reference /. Alternatively, expression of humanized immunoglobulins in plants is preferably carried out according to the method of Hiatt et al. (See above), except that the immunoglobulin sequences used by Hiatt et al. (See above) are replaced by polynucleotide sequences encoding humanized antibodies of the present invention against L-selectin: Agrobacterium tumifaciens T-DNA vectors can also be used to express humanized immunoglobulin sequences, and preferably vectors that contain atm marker gene encoding spectinomycin-resistance or other selectable marker gene.

Для продуцирования "очеловеченных" иммуноглобулинов настоящего изобретения могут быть также использованы культуры клеток насекомых, но, в основном, используется экспрессирующая система на основе бакуловируса. "Очеловеченные" иммуноглобулины могут быть продуцированы путем экспрессии полинуклеотидных последовательностей, кодирующих "очеловеченные" иммуноглобулины, с использованием методики Putlitz и др. /Bio/Technology, 8:651-654 /1990/, эта работа полностью вводится в настоящее описание посредством ссылки/. Метод Putlitz и др. может быть модифицирован, например, вместо кДНК-последовательностей тяжелой и легкой цепи мышиного моноклонального антитела Ab6A4, используемых Putlitz и др. , могут быть введены полинуклеотидные последовательности, кодирующие "очеловеченные" антитела против L-селектина. Insect cell cultures can also be used to produce the “humanized” immunoglobulins of the present invention, but a baculovirus-based expression system is generally used. Humanized immunoglobulins can be produced by expression of polynucleotide sequences encoding humanized immunoglobulins using the methodology of Putlitz et al. / Bio / Technology, 8: 651-654 / 1990 /, this work is fully introduced into the present description by reference /. The method of Putlitz et al. Can be modified, for example, instead of the heavy and light chain cDNA sequences of the mouse monoclonal antibody Ab6A4 used by Putlitz et al., Polynucleotide sequences encoding humanized anti-L-selectin antibodies can be introduced.

Для экспрессии и продуцирования полипептидов настоящего изобретения, помимо микроорганизмов и растений, могут быть использованы клеточные культуры млекопитающих /см. Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publisher, NY, 1987; эта работа полностью вводится в настоящее описание посредством ссылки/. При этом, предпочтительными клетки млекопитающих, поскольку специалистами получены подходящие линии клеток-хозяев, способные секретировать интактные иммуноглобулины, например линии клеток CHO, различные линии клеток COS, HEIa-клетки, предпочтительно клеточные линии миеломы, и т.п. либо трансформированные B-клетки или гибридомы. Экспрессирующие векторы, используемые для этих клеток, могут содержать регуляторные последовательности, такие как сайт инициации репликации, промотор, энхансер /Queen и др., Immunol. Rev. 89:49-68 /1986/; эта работа полностью вводится в настоящее описание посредством ссылки/, а также необходимые сайты, регулирующие процессинг, например, такие как сайты связывания с рибосомой, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования, и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительными регуляторными последовательностями являются промоторы, происходящие от генов иммуноглобулина, SV 40, аденовируса, бычьего вируса папилломы, цитомегаловируса и т.п. Обычно экспрессирующий вектор содержит маркерный ген, такой как neo^R.For the expression and production of the polypeptides of the present invention, in addition to microorganisms and plants, mammalian cell cultures / cm can be used. Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publisher, NY, 1987; this work is fully introduced in the present description by reference /. Moreover, mammalian cells are preferred, since suitable host cell lines capable of secreting intact immunoglobulins, such as CHO cell lines, have been prepared by specialists. , various COS cell lines, HEIa cells, preferably myeloma cell lines, etc., either transformed B cells or hybridomas. The expression vectors used for these cells may contain regulatory sequences such as to the site of replication initiation, promoter, enhancer / Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49-68 / 1986 /; this work is fully introduced in the present description by reference /, as well as the necessary sites that regulate processing, for example, such as ribosome binding sites, RNA splicing sites, polyadenylation sites, and transcription termination sequences Preferred regulatory sequences are promoters derived from immunoglobulin,SV 40, adenovirus, bovine papilloma virus, cytomegalovirus and the like. Typically, the expression vector contains a marker gene, such as neo^R.

Трансгены, кодирующие "очеловеченный" иммуноглобулин настоящего изобретения, могут быть использованы для генерирования трансгенных животных, не относящихся к человеку, которые экспрессируют "очеловеченный" иммуноглобулин, обычно, в выделяемых жидкостях организма, таких как молоко или сыворотка. Указанные трансгены содержат полинуклеотидную последовательность, кодирующую "очеловеченные" иммуноглобулины и надлежащим образом соединенную с промотором, обычно с присоединенным энхансером, таким как иммуноглобулин грызунов или промотор/энхансер казеинового гена /Buhler et al., Bio/Technology 8: 140-143, /1990/; Meade et al., Bio/Technology 8:443-446 /1990/; эти работы вводятся целиком в настоящее описание посредством ссылки/. Трансгены могут быть введены в клетки и эмбрионы в соответствии с известной методикой, в результате чего /см.ниже/ могут быть получены гомологичные рекомбинантные конструкции. Предпочтительными животными, не относящимися к человеку, являются мыши, крысы, овцы, коровы и козы; при этом предпочтительно, если для экспрессии используется коровье молоко. См. WO 91/08216 /1991/ /эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки/. Очистку "очеловеченных" антител настоящего изобретения осуществляют в соответствии с известными методами очистки, обычно применяемыми для очистки иммуноглобулинов. Transgenes encoding the humanized immunoglobulin of the present invention can be used to generate non-human transgenic animals that express humanized immunoglobulin, typically in excreted body fluids, such as milk or serum. These transgenes contain a polynucleotide sequence encoding humanized immunoglobulins and appropriately linked to a promoter, usually a linked enhancer, such as a rodent immunoglobulin or a casein gene promoter / enhancer / Buhler et al., Bio / Technology 8: 140-143, / 1990 /; Meade et al., Bio / Technology 8: 443-446 / 1990 /; these works are introduced entirely in the present description by reference /. Transgenes can be introduced into cells and embryos in accordance with known methods, as a result of which (see below) homologous recombinant constructs can be obtained. Preferred non-human animals are mice, rats, sheep, cows and goats; it is preferable if cow milk is used for expression. See WO 91/08216 / 1991 / / this work is introduced into the present description by reference /. Purification of the "humanized" antibodies of the present invention is carried out in accordance with known purification methods commonly used for purification of immunoglobulins.

Векторы, содержащие ДНК-сегменты /например, последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепь, и регуляторные последовательности/, могут быть перенесены в клетки-хозяева известными методами, выбор которых зависит от типа клетки-хозяина. Например, для прокариотических клеток обычно применяют трансфекцию с использованием хлорида кальция, тогда как для других клеток-хозяев могут быть использованы такие методы, как обработка фосфатом кальция, липофекция, биобаллистика, трансдукция с помощью вируса или электропорация. Для клеток растений и тканей предпочтительно использовать метод баллистического трансгенеза с помощью вольфрамовых частиц /В общих чертах см. Maniatis et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual /Cold Spring Harbor Press, 1982/; эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки/. Vectors containing DNA segments (for example, heavy and light chain encoding sequences and regulatory sequences) can be transferred into host cells by known methods, the choice of which depends on the type of host cell. For example, for prokaryotic cells, transfection using calcium chloride is usually used, while for other host cells, methods such as calcium phosphate treatment, lipofection, bio-ballistics, virus transduction or electroporation can be used. For plant cells and tissues, it is preferable to use the method of ballistic transgenesis using tungsten particles / In general terms, see Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / Cold Spring Harbor Press, 1982 /; this work is introduced into the present description by reference /.

После экспрессии интактные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулина настоящего изобретения могут быть очищены в соответствии со стандартными процедурами, такими как, например, осаждение сульфатом аммония, аффинная хроматография, колоночная хроматография, гель-электрофорез/в общих чертах, см. Scopes, R., Protein Purificatin (Springer-Verlag, NY, 1982; эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки/. В основном, очищенные иммуноглобулины, имеющие, предпочтительно, гомогенность по крайней мере около 90-95%, а наиболее предпочтительно 98-99%, могут быть использованы в фармацевтических целях. Затем очищенные /частично или до гомогенности/ полипептиды могут быть использованы в терапевтических целях/например, экстракорпорально/ либо в исследовательских и аналитических процедурах, в иммунофлуоресцентном окрашивании и т. п. /в общих чертах, см. Immunological Methods, vols. I и II /Lefkovits & Pernis, eds. Academic Press, NY, 1979 and 1981/. After expression, intact antibodies, their dimers, individual light and heavy chains, or other forms of the immunoglobulin of the present invention can be purified according to standard procedures, such as, for example, ammonium sulfate precipitation, affinity chromatography, column chromatography, gel electrophoresis / in general , see Scopes, R., Protein Purificatin (Springer-Verlag, NY, 1982; this work is fully introduced in the present description by reference /. Basically, purified immunoglobulins, preferably having a homogeneity of at least about 9 0-95%, and most preferably 98-99%, can be used for pharmaceutical purposes, then the purified / partially or homogeneously / polypeptides can be used for therapeutic purposes / for example, extracorporeal / or in research and analytical procedures, in immunofluorescence staining and the like / in general terms, see Immunological Methods, vols. I and II / Lefkovits & Pernis, eds. Academic Press, NY, 1979 and 1981 /.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения продуцируются "очеловеченные" иммуноглобулины, которые связываются с L-селектином с аффинностью связывания, составляющей по крайней мере 1•10⁷ М^-1 при стандартных условиях связывания /например, фосфатно-буферный физиологический раствор, содержащий 2% плодной телячьей сыворотки; при 25^oC/. Одним из примеров таких "очеловеченных" иммуноглобулинов является "очеловеченное" антитело DREG-200, имеющее аминокислотную последовательность, показанную на фиг. 2. /Далее, в некоторых случаях, "очеловеченное" антитело DREG-200 обозначаться "чел. DREG-200"/. Очеловеченные иммуноглобулины, содержащие области CDR, происходящие от мышиного антитела DREG-55 или от мышиного антитела DREG-56, также могут связываться с L-селектином с аффинностью, составляющей по крайней мере 1•10⁷ М^-1.In a preferred embodiment of the present invention, humanized immunoglobulins are produced that bind to L-selectin with a binding affinity of at least 1 × 10⁷ M^-1 under standard binding conditions / for example, phosphate buffered saline containing 2% fetal calf serum; at 25^o C /. One example of such “humanized” immunoglobulins is the “humanized” DREG-200 antibody having the amino acid sequence shown in FIG. 2. / Further, in some cases, the “humanized” DREG-200 antibody is designated “human DREG-200” /. Humanized immunoglobulins containing CDR regions originating from the mouse DREG-55 antibody or from the mouse DREG-56 antibody can also bind to L-selectin with an affinity of at least 1 × 10⁷ M^-1 .

Очеловеченные антитела настоящего изобретения связываются (в стандартных условиях связывания) с L-селектином предпочтительно с аффинностью, составляющей по крайней мере 1• 10⁸ M^-1, более предпочтительно с аффинностью, составляющей по крайней мере 1•10⁸ M^-1; а наиболее предпочтительно с аффинностью, составляющей по крайней мере, 1•10¹⁰ М^-1 или выше. Обычно, аффинность связывания "очеловеченного" иммуноглобулина примерно в три раза превышает аффинность связывания мышиного иммуноглобулина, от которого он происходит. Так, например, аффинность мышиного антитела DREG-200 составляет около 10⁸ М^-1.The humanized antibodies of the present invention bind (under standard binding conditions) to L-selectin, preferably with an affinity of at least 1 • 10⁸ M^-1 , more preferably with an affinity of at least 1 • 10⁸ M^-1 ; and most preferably with an affinity of at least 1 • 10¹⁰ M^-1 or higher. Typically, the binding affinity of a humanized immunoglobulin is about three times that of the binding mouse immunoglobulin from which it is derived. For example, the affinity of the murine DREG-200 antibody is about 10⁸ M^-1 .

Компьютеры
В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к компьютерам для построения трехмерного изображения антител на мониторе. Например, для целей настоящего изобретения могут быть использованы автоматизированная рабочая установка Silicon Graphics IRIS 4D, работающая в операционной системе UNIX, и пакет программ для молекулярного моделирования QUANTA (Polygen Corp. USA). Компьютеры могут быть использованы для генерирования вариантов "очеловеченных" антител. Вообще говоря, антитела настоящего изобретения уже обладают достаточной аффинностью связывания. Однако, очевидно, что антитела даже с более сильной аффинностью связывания могут быть идентифицированы путем последующей вариации некоторых аминокислотных остатков. С помощью трехмерного изображения можно также идентифицировать множество некритических аминокислот, которые могут быть объектами консервативных замещений, не оказывающих заметного влияния на аффинность связывания данного антитела. Однако, даже консервативные замещения, взятые вместе, могут оказывать значительное влияние на свойства иммуноглобулина. Но многие отдельные консервативные замещения, по всей вероятности, не оказывают неблагоприятного воздействия на свойства иммуноглобулинов.Computers
In another embodiment, the present invention relates to computers for constructing a three-dimensional image of antibodies on a monitor. For example, for the purposes of the present invention, a Silicon Graphics IRIS 4D workstation operating on a UNIX operating system and QUANTA molecular modeling software package (Polygen Corp. USA) can be used. Computers can be used to generate variants of humanized antibodies. Generally speaking, the antibodies of the present invention already have sufficient binding affinity. However, it is obvious that antibodies with even stronger binding affinity can be identified by subsequent variation of certain amino acid residues. Using a three-dimensional image, you can also identify many non-critical amino acids, which can be objects of conservative substitutions that do not significantly affect the binding affinity of this antibody. However, even conservative substitutions taken together can have a significant effect on the properties of immunoglobulin. But many individual conservative substitutions, in all likelihood, do not adversely affect the properties of immunoglobulins.

Человеческие антитела против L-селектина
В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к человеческим антителам против L-селектина. Эти антитела продуцируют с использованием различной техники, описанной ниже. Некоторые человеческие антитела выбирают путем экспериментов на конкурентное связывание либо иначе путем определения, имеют ли эти антитела такую же специфичность антигенной детерминанты, что и конкретное мышиное антитело, например, такое как мышиное антитело DREG-200 или его "очеловеченный" вариант. Эти антитела имеют, по всей вероятности, общие ценные терапевтические свойства, продемонстрированные для "очеловеченного" антитела DREG-200.Human antibodies against L-selectin
In another embodiment, the present invention relates to human antibodies against L-selectin. These antibodies are produced using various techniques described below. Some human antibodies are selected by competitive binding experiments or otherwise by determining whether these antibodies have the same antigenic determinant specificity as a particular murine antibody, such as, for example, the DREG-200 murine antibody or its “humanized” variant. These antibodies have, in all likelihood, the common valuable therapeutic properties demonstrated for the humanized DREG-200 antibody.

Антитела, имеющие требуемую специфичность антигенной детерминанты, могут быть также идентифицированы путем их скрининга на способность блокировать взаимодействие нейтрофилов и эндотелиальных клеток. Простой визуальный анализ на обнаружение такого взаимодействия был описан Kishimoto и др. (1991) (см. выше). Вкратце, этот способ заключается в том, что монослои клеток, происходящих из пупочной вены человека, стимулируют интерлейкином IL -1. Затем к этим слоям при определенных условиях добавляют нейтрофилы, необработанные или заранее обработанные испытуемым антителом, после чего с помощью микроскопа определяют число прилипающих нейтрофилов. В одном из методов, нейтрофилы получают от пациентов с дефицитом прилипания лейкоцитов. См. Anderson и др. Ann. Rev. Med. 38:175 (1987). Нейтрофилы от таких пациентов не имеют рецепторов интегрина, что очень удобно, поскольку связывание этих рецепторов с нейтрофилами могло бы затемнить эффекты блокирования связывания с L-селектином. Antibodies having the required specificity of antigenic determinants can also be identified by screening for their ability to block the interaction of neutrophils and endothelial cells. A simple visual analysis to detect this interaction has been described by Kishimoto et al. (1991) (see above). Briefly, this method consists in the fact that monolayers of cells originating from the umbilical vein of a person stimulate interleukin IL -1. Then, under certain conditions, neutrophils are added to these layers, untreated or pre-treated with the test antibody, after which the number of adhering neutrophils is determined using a microscope. In one method, neutrophils are obtained from patients with a deficiency of white blood cell adhesion. See Anderson et al. Ann. Rev. Med. 38: 175 (1987). Neutrophils from such patients do not have integrin receptors, which is very convenient, since binding of these receptors to neutrophils could obscure the effects of blocking binding to L-selectin.

а. Методология с использованием триомы
Существо этого метода и подходящий партнер для получения клеточных гибридов (SPAZ-4), используемый в этом методе, описаны Oestberg и др. (Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg (патент США 4634664) и Engleman и др. (патент США N 4634666) (каждая из этих работ во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). Клеточные линии, продуцирующие антитело и полученные указанным способом, были названы триомами, поскольку они происходят из трех клеток - из двух человеческих и одной мышиной. Сначала линию клеток мышиной миеломы гибридизировали с B-лимфоцитом человека, в результате чего получали ксеногенную гибридную клетку, не продуцирующую антитело, такую как клеточная линия SPAZ-4, описанную Oestberg (см. выше). Затем полученную ксеногенную клетку гибридизировали с иммунизированным B-лимфоцитом человека, в результате чего получали клеточную линию триомы, продуцирующую антитело. Было установлено, что триомы продуцируют антитело более стабильно, чем обыкновенные гибридомы, полученные из клеток человека.a. Methodology Using Triomes
The essence of this method and a suitable partner for producing cell hybrids (SPAZ-4) used in this method are described by Oestberg et al. (Hybridoma 2: 361-367 (1983); Oestberg (US Pat. No. 4,634,664) and Engleman et al. (Patent US N 4,634,666) (each of these works is hereby incorporated by reference in its entirety.) The cell lines producing the antibody and obtained by this method were called triomes because they come from three cells - from two human and one mouse. mouse myeloma cell line hybridized with human B-lymphocyte, in resulting in a non-antibody producing xenogenous hybrid cell, such as the Oestberg SPAZ-4 cell line described above, then the resulting xenogenic cell was hybridized with an immunized human B lymphocyte, resulting in an antibody producing trioma cell line. It was found that triomas produce an antibody more stably than ordinary hybridomas derived from human cells.

Иммунизированные B-лимфоциты получали из крови, селезенки, лимфатических узлов или костного мозга человека-донора. In vivo-иммунизация живых людей L-селектином нежелательна из-за риска продуцирования неблагоприятного ответа. Поэтому B-лимфоциты, обычно, иммунизируют in vitro с использованием полипептида L-селектина, его антигенного фрагмента, или клетки, несущей указанный полипептид или его фрагмент. Если необходимо получить антитела против конкретного антигена или эпитопа, то для in vitro-иммунизации предпочтительно использовать этот антиген или эпитоп. B-лимфоциты, обычно, экспонируют антигеном в течение 7-14 дней в такой среде, как RPMI-1640 (см. Engleman, см. выше), содержащей 10% плазму человека. Immunized B lymphocytes were obtained from the blood, spleen, lymph nodes or bone marrow of a human donor. In vivo immunization of living people with L-selectin is undesirable because of the risk of producing an adverse response. Therefore, B-lymphocytes are usually immunized in vitro using the L-selectin polypeptide, its antigenic fragment, or a cell carrying the specified polypeptide or its fragment. If it is necessary to obtain antibodies against a particular antigen or epitope, it is preferable to use this antigen or epitope for in vitro immunization. B-lymphocytes are usually exposed to antigen for 7-14 days in a medium such as RPMI-1640 (see Engleman, see above) containing 10% human plasma.

Иммунизированные B-лимфоциты гибридизируют с ксеногенными гибридными клетками, такими как SPAZ-4, хорошо известными способами. Например, клетки обрабатывают 40-50% полиэтиленгликолем (MW 1000-4000) примерно при 37^oC в течение около 5-10 минут. Затем клетки выделяют из гибридизационной смеси и культивируют в селективной среде для получения нужных гибридов (например, HAT или AH). Клоны, секретирующие антитела с требуемой специфичностью связывания, идентифицируют путем анализа среды с триомной культурой на способность к связыванию с L-селектином или его фрагментом. Затем триомы, продуцирующие антитела с требуемой специфичностью, субклонируют с использованием методологии серийного разведения и культивируют in vitro в культуральной среде. После этого полученные клетки триомы анализируют на способность к связыванию с L-селектином или его фрагментом.Immunized B lymphocytes hybridize with xenogenic hybrid cells, such as SPAZ-4, by well known methods. For example, cells are treated with 40-50% polyethylene glycol (MW 1000-4000) at about 37^° C. for about 5-10 minutes. Cells are then isolated from the hybridization mixture and cultured in selective medium to obtain the desired hybrids (e.g., HAT or AH). Clones secreting antibodies with the desired binding specificity are identified by analyzing the medium of the trioma culture for binding to L-selectin or a fragment thereof. Then, the triomes producing antibodies with the required specificity are subcloned using a serial dilution methodology and cultured in vitro in culture medium. After that, the obtained trioma cells are analyzed for their ability to bind to L-selectin or its fragment.

Хотя триомы являются генетически стабильными, они не продуцируют очень высоких уровней антител. Уровни экспрессии могут быть увеличены путем клонирования генов антител, полученных из триомы, в одном или нескольких экспрессирующих векторах с последующей трансформацией вектора в клеточную линию, например, такую как обсуждаемые клеточные линии, используемые для экспрессии рекомбинантных или "очеловеченных" иммуноглобулинов. Although triomes are genetically stable, they do not produce very high levels of antibodies. Expression levels can be increased by cloning antibody genes derived from a trioma in one or more expression vectors, followed by transformation of the vector into a cell line, such as the discussed cell lines used to express recombinant or humanized immunoglobulins.

b. Трансгенные млекопитающие, не относящиеся к человеку
Человеческие антитела против L-селектина могут быть также продуцированы от трансгенных млекопитающих, не являющихся человеком, и содержащие трансгены, которые кодируют по крайней мере сегмент локуса иммуноглобулина человека. Обычно эндогенный локус иммуноглобулина таких трансгенных млекопитающих функционально инактивируют. Предпочтительно, если сегмент локуса иммуноглобулина человека включает в себя нереаранжированные последовательности компонентов тяжелой и легкой цепи. Инактивация генов эндогенного иммуноглобулина и введение генов экзогенного иммуноглобулина могут быть осуществлены путем направленной гомологичной рекомбинации или путем введения УАС-хромосом. Полученные в результате трансгенные млекопитающие обладают способностью к функциональной реаранжировке последовательностей компонентов иммуноглобулина, а также к экспрессии сывороточного спектра антител различных изотипов, кодируемых генами иммуноглобулина человека, но при этом эти млекопитающие не обладают способностью экспрессировать гены эндогенного иммуноглобулина. Продуцирование таких млекопитающих и их свойства подробно описаны Lonberg и др., 093/12227 (1993); Kucherlapati WO 91/10741 (1991) (каждая из указанных работ полностью вводится в настоящее описание посредством ссылки). Особенно подходящими являются трансгенные мыши. Антитела против L-селектина могут быть получены путем иммунизации трансгенных млекопитающих, не относящихся к человеку (например, описанных Lonberg или Kucherlapati (см. выше)), с использованием L-селектина или его фрагмента. Моноклональные антитела могут быть получены, например, путем гибридизации B-клеток, полученных от вышеуказанных млекопитающих, с соответствующими линиями клеток миеломы с использованием известной технологии Kohler-Milstein.b. Non-human transgenic mammals
Human antibodies against L-selectin can also be produced from transgenic non-human mammals and containing transgenes that encode at least a segment of the human immunoglobulin locus. Typically, the endogenous immunoglobulin locus of such transgenic mammals is functionally inactivated. Preferably, the segment of the human immunoglobulin locus includes unregulated sequences of heavy and light chain components. Inactivation of endogenous immunoglobulin genes and the introduction of exogenous immunoglobulin genes can be accomplished by targeted homologous recombination or by introducing UAS chromosomes. The resulting transgenic mammals have the ability to functionally rearrange the sequences of immunoglobulin components, as well as to express the serum spectrum of antibodies of various isotypes encoded by human immunoglobulin genes, but these mammals do not have the ability to express endogenous immunoglobulin genes. The production of such mammals and their properties are described in detail by Lonberg et al., 093/12227 (1993); Kucherlapati WO 91/10741 (1991) (each of these works is fully incorporated into the present description by reference). Transgenic mice are particularly suitable. Antibodies against L-selectin can be obtained by immunization of transgenic non-human mammals (e.g. as described by Lonberg or Kucherlapati (see above)) using L-selectin or a fragment thereof. Monoclonal antibodies can be obtained, for example, by hybridizing B cells obtained from the above mammals with the corresponding myeloma cell lines using the well-known Kohler-Milstein technology.

c. Методы фаговой индикации
Другой способ получения чел. антител против L-селектина заключается в скрининге ДНК-библиотеки из B-клеток человека в соответствии с общим протоколом Huse и др. Science 246:1275- 1281 (1989). Для этого выбирают антитела, связывающиеся с L-селектином, или его фрагментов. Затем клонируют и амплифицируют последовательности, кодирующие указанные антитела (или связывающиеся фрагменты). Протокол, разработанный Huse, может быть использован с большей эффективностью в сочетании с методикой фаговой индикации. См., например, Dawer и др. WO 91/17271 и Mc Cafferty и др. WO 92/01047 (каждая из указанных работ во всей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки). В этой методике продуцируются библиотеки фага, члены которой отображают на своей поверхности различные антитела. Эти антитела обычно представляют собой FV- или Fao-фрагменты. Выбор фага, указывающего на антитело с нужною специфичностью, осуществляют по наиболее высокой аффинности в отношении полипептида L-селектина или его фрагмента.c. Phage Indication Methods
Another way to get people antibodies against L-selectin consists of screening a DNA library from human B cells in accordance with the general protocol of Huse et al. Science 246: 1275-1281 (1989). For this, antibodies that bind to L-selectin or its fragments are selected. The sequences encoding the indicated antibodies (or binding fragments) are then cloned and amplified. The protocol developed by Huse can be used with greater efficiency in combination with a phage indication technique. See, for example, Dawer et al. WO 91/17271 and Mc Cafferty et al. WO 92/01047 (each of these works is hereby incorporated by reference in its entirety). In this technique, phage libraries are produced, the members of which display various antibodies on their surface. These antibodies are usually FV or Fao fragments. The selection of the phage indicating the antibody with the desired specificity is carried out by the highest affinity for the L-selectin polypeptide or its fragment.

В одном из своих вариантов метод фаговой индикации заключается в том, что могут быть продуцированы человеческие антитела, имеющие специфичность связывания выбранного мышиного антитела. См. Winter, WO 92/20791. В этом методе в качестве исходного материала используют вариабельную область либо тяжелой, либо легкой цепи выбранного мышиного антитела /например, мышиного антитела DREG-200/. Если, например, в качестве исходного материала выбирают вариабельную область легкой цепи, то фаговую библиотеку конструируют для тех членов, которые обнаруживают одинаковую вариабельную область легкой цепи (т. е. мышиный исходный материал) и различные вариабельные области тяжелой цепи. Вариабельные области тяжелой цепи получают из библиотеки реаранжированных вариабельных областей тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Затем выбирают фаг, обнаруживающий сильное специфическое связывание с L-селектином (например, по крайней мере 10⁸ М^-1, а предпочтительно, по крайней мере 10⁹ М^-1). Вариабельная область тяжелой цепи человека, полученная от этого фага, служит впоследствии в качестве исходного материала для конструирования дополнительной фаговой библиотеки. В этой библиотеке каждый фаг указывает на одинаковую вариабельную область тяжелой цепи (т.е. область, идентифицированную из первой фаговой библиотеки) и на разные вариабельные области легкой цепи. Вариабельные области легкой цепи получают из библиотеки перегруппированных вариабельных областей легкой цепи человека. И аналогично выбирают фаг, обнаруживающий сильное специфическое связывание с L-селектином. Этот фаг указывает на вариабельные области, принадлежащие целиком человеческому антителу против L-селектина. Указанные антитела обычно имеют идентичную или схожую специфичность антигенной детерминанты, что и исходный мышиный материал (например, мышиное антитело DREG-200).In one of its variants, the phage indication method is that human antibodies can be produced having the binding specificity of the selected mouse antibody. See Winter, WO 92/20791. In this method, the variable region of either the heavy or light chain of the selected murine antibody (eg, DREG-200 murine antibody) is used as starting material. If, for example, a light chain variable region is selected as the starting material, then a phage library is designed for those members who find the same light chain variable region (i.e., murine starting material) and different variable regions of the heavy chain. The heavy chain variable regions are obtained from a library of rearranged human immunoglobulin heavy chain variable regions. Then select a phage that exhibits strong specific binding to L-selectin (for example, at least 10⁸ M^-1 , and preferably at least 10⁹ M^-1 ). The variable region of the human heavy chain obtained from this phage subsequently serves as starting material for the construction of an additional phage library. In this library, each phage points to the same variable region of the heavy chain (i.e., the region identified from the first phage library) and to different variable regions of the light chain. Light chain variable regions are obtained from a library of rearranged human light chain variable regions. And similarly, a phage that displays strong specific binding to L-selectin is chosen. This phage indicates variable regions that belong entirely to the human anti-L-selectin antibody. These antibodies usually have the same or similar specificity of the antigenic determinant as the original murine material (for example, the DREG-200 murine antibody).

Методы использования
Антитела настоящего изобретения могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с воспалительными процессами, в частности, опосредованными нейтрофилами или Т-клетками. Предпочтительным применением антител настоящего изобретения является лечение или профилактика таких состояний, как ишемическо-реперфузионные повреждения, вызванные инфарктом миокарда, инсультом (например, "ударом"), почечным, печеночным или селезеночным инфарктом, операцией на головном мозге, операцией на сердце (например, артериокоронарного шунтирования), пластической операцией на сосудах и т.п. Другими предпочтительными применениями антител настоящего изобретения является лечение сепсиса, респираторного дистресс-синдрома у взрослых и недостаточности различных органов. Антитела настоящего изобретения могут быть использованы для лечения различных повреждений, вызванных травмами, ожогами, отморожениями, или повреждений спинного мозга. Кроме того, антитела настоящего изобретения могут быть также использовали для лечения аутоиммуных заболеваний, например, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, рассеянный склероз, диабет I-типа и увеит; для лечения воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз, и для лечения менингита и энцефалита. Другими типичными применениями указанных антител являются предупреждение и лечение отторжения трансплантированного органа и ревущий "трансплантат против хозяина".Usage Methods
Antibodies of the present invention can be used to treat diseases associated with inflammatory processes, in particular, mediated neutrophils or T cells. A preferred use of the antibodies of the present invention is the treatment or prevention of conditions such as ischemic reperfusion injury caused by myocardial infarction, stroke (eg, “stroke”), renal, hepatic or splenic infarction, brain surgery, heart surgery (eg, arterio-coronary bypass surgery), plastic surgery on vessels, etc. Other preferred uses of the antibodies of the present invention are the treatment of sepsis, adult respiratory distress syndrome and various organ failure. The antibodies of the present invention can be used to treat various injuries caused by injuries, burns, frostbite, or damage to the spinal cord. In addition, the antibodies of the present invention can also be used to treat autoimmune diseases, for example, such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, type I diabetes and uveitis; for the treatment of inflammatory skin diseases such as psoriasis, and for the treatment of meningitis and encephalitis. Other typical uses of these antibodies are the prevention and treatment of organ transplant rejection and the roaring “graft versus host”.

Любой иммуноглобулин настоящего изобретения может быть использован в сочетании с другими антителами, в частности, с человеческими или "очеловеченными" антителами, связывающимися с другими адгезивными молекулами. Например, подходящими для этой цели являются иммуноглобулины, обладающие специфичностью к CD11A, CD11b, CD18, E-селектину, P-селектину, и ICAM-1. Другими подходящими антителами являются антитела, специфичные к лимфокинам, таким как IL-1, IL-2 и IFN- γ , и к другим рецепторам. Any immunoglobulin of the present invention can be used in combination with other antibodies, in particular with human or humanized antibodies that bind to other adhesive molecules. For example, immunoglobulins having specificity for CD11A, CD11b, CD18, E-selectin, P-selectin, and ICAM-1 are suitable for this purpose. Other suitable antibodies are those specific for lymphokines, such as IL-1, IL-2 and IFN-γ, and other receptors.

Антитела настоящего изобретения могут быть также использованы в виде отдельно вводимых композиций, применяемых в сочетании с химиотерапевтическими агентами. Такими агентами могут быть нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды либо другие хорошо известные лекарственные средства (например, циклоспорин). В основном, иммуноглобулины настоящего изобретения предназначены для использования в комбинации с другими лекарственными средствами, обычно используемыми в современной медицине для лечения конкретных заболеваний. Antibodies of the present invention can also be used as separately administered compositions used in combination with chemotherapeutic agents. Such agents may be non-steroidal anti-inflammatory drugs and corticosteroids, or other well-known drugs (e.g., cyclosporin). Basically, the immunoglobulins of the present invention are intended for use in combination with other drugs commonly used in modern medicine to treat specific diseases.

В некоторых терапевтических методах антитела против L-селектина могут быть использованы в комбинации с тромболитическими средствами. В ранее применяемых методах, лечение пациентов с острым инфарктом миокарда часто проводилось путем открытия закупоренной коронарной артерии. Повторное открытие закупоренной коронарной артерии может быть достигнуто путем введения тромболитических агентов, растворяющих сгустки, вызванные обструкцией артерии, и тем самым восстанавливающих коронарный кровоток. Реперфузия сосудов может быть также достигнута путем экстренной чрезкожной катетерной коронарной ангиопластики (PTCA), осуществляемой с помощью баллонной дилатации закупоренной артерии и суженного сегмента коронарной артерии. Однако, при использовании указанных методов восстановление коронарного кровотока приводит к ишемическо- реперфузионному повреждению сосудов. In some therapeutic methods, antibodies against L-selectin can be used in combination with thrombolytic agents. In previously used methods, the treatment of patients with acute myocardial infarction was often carried out by opening a clogged coronary artery. The reopening of a clogged coronary artery can be achieved by administering thrombolytic agents that dissolve clots caused by artery obstruction and thereby restore coronary blood flow. Vascular reperfusion can also be achieved by emergency percutaneous catheter coronary angioplasty (PTCA) by balloon dilatation of a blocked artery and a narrowed segment of the coronary artery. However, when using these methods, restoration of coronary blood flow leads to ischemic-reperfusion vascular damage.

В методах настоящего изобретения ишемическо-реперфузионное повреждение сосудов можно уменьшить или предупредить с использованием комбинации тромболитического средства или PTCA и человеческого или "очеловеченного" антитела против L-селектина. Антитела, используемые для профилактических целей, обычно вводят перед введением или одновременно с введением тромболитического агента или инициацией PTCA. Часто после или во время введения тромболитического агента или проведения ангиопластического лечения вводят дополнительные дозы антитела. Интервал между профилактическим введением антитела и началом тромболитического или ангиопластического лечения, в основном, составляет 5-30 мин, предпочтительно 5-20 мин, а более предпочтительно 5-10 мин. Антитела настоящего изобретения вводят парентерально, предпочтительно путем внутривенной инъекции, в дозах, составляющих 0,1 - 10 мг/кг веса тела, предпочтительно 0,14 - 5 мг/кг, а наиболее предпочтительно 0,3-3 мг/кг. Указанные антитела могут быть введены в виде внутривенной инъекции ударной дозы, например, в течение 1 - 5 мин в виде повторных инъекций с меньшими дозами либо в виде внутривенного вливания. Инъекция ударной дозы обычно используется для профилактических доз или в критических случаях. Дополнительные дозы антител могут быть повторно введены (например, каждые 4-6 ч), во время или после тромболитического или ангиопластического лечения острого инфаркта миокарда в тех же самых количествах, что указаны выше, в целях достижения оптимальных уровней антитела в плазме. In the methods of the present invention, ischemic reperfusion vascular damage can be reduced or prevented using a combination of a thrombolytic agent or PTCA and a human or humanized anti-L-selectin antibody. Antibodies used for prophylactic purposes are usually administered before or simultaneously with the administration of a thrombolytic agent or initiation of PTCA. Often, after or during administration of a thrombolytic agent or angioplastic treatment, additional doses of the antibody are administered. The interval between the prophylactic administration of an antibody and the initiation of thrombolytic or angioplastic treatment is generally 5-30 minutes, preferably 5-20 minutes, and more preferably 5-10 minutes. The antibodies of the present invention are administered parenterally, preferably by intravenous injection, in doses of 0.1-10 mg / kg body weight, preferably 0.14-5 mg / kg, and most preferably 0.3-3 mg / kg. These antibodies can be administered as an intravenous injection of a loading dose, for example, within 1-5 minutes as repeated injections with lower doses or as an intravenous infusion. A loading dose injection is usually used for prophylactic doses or in critical cases. Additional doses of antibodies can be reintroduced (for example, every 4-6 hours), during or after thrombolytic or angioplastic treatment of acute myocardial infarction in the same amounts as indicated above, in order to achieve optimal plasma antibody levels.

Тромболитические агенты представляют собой лекарственные средства, обладающие способностью непосредственно или косвенно стимулировать растворение тромбов in vivo. Такими тромболитическими средствами являются тканевый активатор плазминогена (см. EP-B0 093619), активаза, альтеплаза, дутеплаза, силтеплаза, стрептокиназа, анистреплаза, урокикиназа, гепарин, варфарин и кумарин. Дополнительными тромоболитическими средствами являются саруплаза и активатор плазминогена вампировых. См. Harris, Protejn Engineering, 6:449-458 (1987); PCT-EP 90/00194; патент США 4 970 159). Тромболитические средства вводят пациенту в количестве, достаточном для частичного рассасывания, или для предупреждения образования тромбов и их осложнений. Количество, адекватное для достижения этой цели, определяется как "терапевтически эффективная доза" или "эффективная доза". Количества, эффективные для использования в вышеуказанных целях, зависят от тяжести состояния, общего состояния пациента, способа введения и используемой комбинации с другими лекарственными средствами. Часто терапевтически эффективные дозы тромболитических агентов и схемы их введения утверждаются Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для независимого использования, например, для альтеразы эта доза составляет 100 мг, а для стрептокиназы 1,5 млн.ME. Thrombolytic agents are drugs that have the ability to directly or indirectly stimulate the dissolution of blood clots in vivo. Such thrombolytic agents are tissue plasminogen activator (see EP-B0 093619), activase, alteplase, duteplase, silteplase, streptokinase, anistreplase, urokininase, heparin, warfarin and coumarin. Additional thrombolytic agents are saruplase and the vampire plasminogen activator. See Harris, Protejn Engineering, 6: 449-458 (1987); PCT-EP 90/00194; U.S. Patent 4,970,159). Thrombolytic agents are administered to the patient in an amount sufficient for partial resorption, or to prevent the formation of blood clots and their complications. An amount adequate to achieve this goal is defined as a “therapeutically effective dose” or “effective dose”. Amounts effective for use for the above purposes depend on the severity of the condition, general condition of the patient, route of administration, and combination used with other drugs. Often therapeutically effective doses of thrombolytic agents and their administration are approved by the Food and Drug Administration (FDA) for independent use, for example, for alterase, this dose is 100 mg, and for streptokinase 1.5 million ME.

Предпочтительная композиция настоящего изобретения предусматривает использование иммуноглобулина настоящего изобретения, включенного в иммунотоксины, которые нейтрализуют клетки, экспрессирующие L-селектин. Иммунотоксины характеризуются тем, что они состоят из двух компонентов и используются для лизиса отобранных клеток in vitro или in vivo. Один компонент иммунотоксина представляет собой цитотоксичный агент, оказывающий фатальное действие на клетку при его присоединении или абсорбции. Другой компонент, известный как "направленный носитель", является средством доставки токсичного агента к клеткам конкретного типа, например к клеткам, экспрессирующим антигенную детерминанту L-селектина. Эти два компонента обычно связывают друг с другом химическим путем с использованием хорошо известных процедур. Например, если цитотоксичный агент является белком, а второй компонент представляет собой интактный иммуноглобулин, то эти компоненты могут быть связаны с помощью перекрестно-сшивающих агентов (кросс-линкеров), например SPDP, карбодиимида, глутаральдегида или т.п. Продуцирование различных иммунотоксинов хорошо известно специалистам, см., например, работу "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet" Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Указанные компоненты могут быть также связаны генетически (см. Chaudhary et al., Nature 339: 394 (1989); эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки). A preferred composition of the present invention provides for the use of the immunoglobulin of the present invention, included in immunotoxins that neutralize cells expressing L-selectin. Immunotoxins are characterized in that they are composed of two components and are used to lyse selected cells in vitro or in vivo. One component of an immunotoxin is a cytotoxic agent that has a fatal effect on a cell when it is attached or absorbed. Another component, known as a "targeted carrier", is a means of delivering a toxic agent to cells of a particular type, for example to cells expressing the antigenic determinant of L-selectin. These two components are usually chemically bonded to each other using well-known procedures. For example, if the cytotoxic agent is a protein, and the second component is an intact immunoglobulin, then these components can be connected using cross-linking agents (cross-linkers), for example, SPDP, carbodiimide, glutaraldehyde or the like. The production of various immunotoxins is well known in the art, see, for example, Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet by Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982), which is introduced into the present description by reference. These components may also be linked genetically (see Chaudhary et al., Nature 339: 394 (1989); this work is incorporated herein by reference).

Для получения иммунотоксинов могут быть использованы различные цитотоксичные агенты. Такими цитотоксичными агентами могут быть радионуклиды, такие как йод-131 или другие изотопы йода, иттрий-90, рений-188 и висмут-212 или другие альфа-излучатели; различные химиотерапевтические средства, такие, как виндезин, метотрексат, адриамицин и цисплатин; а цитотоксичные белки, такие как белки, инактивирующие рибосому, например противовирусный белок фитоллаки американской, экзотоксин A Pseudomonas, рицин, дифтерийный токсин, цепь рицина A и т.п., либо агент, активный на клеточной поверхности, такой как фосфолипаза (например, фосфолипаза C). (См. в общих чертах, переуступленная заявка на патент США рег. N 07/290968; "Chimeric Toxins', Olsnas & Phil, Pharmac. There., 25:355-381 (1982) и Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy (изд. Baldwin & Byers, Academic Press, 1985), pp. 159-179, 22-266; все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Various cytotoxic agents can be used to produce immunotoxins. Such cytotoxic agents may be radionuclides, such as iodine-131 or other isotopes of iodine, yttrium-90, rhenium-188 and bismuth-212, or other alpha emitters; various chemotherapeutic agents, such as vindesine, methotrexate, adriamycin and cisplatin; and cytotoxic proteins, such as ribosome inactivating proteins, for example, the American phytlaki antiviral protein, Pseudomonas exotoxin A, ricin, diphtheria toxin, ricin A chain, and the like, or an agent active on the cell surface, such as phospholipase (e.g. phospholipase C) (See, in general, Assigned Patent Application Reg. N 07/290968; "Chimeric Toxins', Olsnas & Phil, Pharmac. There., 25: 355-381 (1982) and Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy ( Baldwin & Byers, Academic Press, 1985), pp. 159-179, 22-266; all of these works are incorporated herein by reference).

В качестве компонента, используемого для доставки цитотоксичного агента, могут быть использованы иммуноглобулины настоящего изобретения. Предпочтительными являются интактные иммуноглобулины или их связывающие фрагменты, такие как Fab или Fv. Обычно, антитела, используемые в иммунотоксинах, являются человеческими иммуноглобулинами изотипа IgM или IqG, но, если необходимо, то могут быть также использованы константные области иммуноглобулинов других млекопитающих. As the component used to deliver the cytotoxic agent, the immunoglobulins of the present invention can be used. Intact immunoglobulins or their binding fragments, such as Fab or Fv, are preferred. Typically, antibodies used in immunotoxins are human immunoglobulins of the IgM or IqG isotype, but, if necessary, constant regions of immunoglobulins from other mammals can also be used.

Антитела и фармацевтические композиции настоящего изобретения используются предпочтительно для парентерального введения, например подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Антитела настоящего изобретения могут быть также использованы для местного применения, для чреззондового питания или лаважа, для внутрибрюшинных инъекций, для изготовления глазных мазей и мазей для наружного применения, для внутричерепных инъекций (обычно, в желудочек головного мозга), для интраперикардиальных инъекций или для интрасиновиальных инъекций. Композиции для парентерального введения, обычно, содержат раствор иммуноглобулина или его смесь, растворенную в приемлемом носителе, а предпочтительно в водном носителе. В этих целях могут быть использованы различные водные носители, например вода, забуферная вода, фосфатно-буферный раствор (PBS); 0,4% физиологический раствор, 0,3% глицин, раствор альбумина человека и т.п. Эти растворы являются стерильными и, в основном, не содержат каких-либо частиц. Композиции настоящего изобретения могут быть стерилизованы стандартными способами, хорошо известными специалистам. Эти композиции могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, необходимые для создания физиологических условий, такие как pH-корректирующие и забуферивающие агенты, агенты, регулирующие токсичность, и т.п., например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и лактат натрия. Концентрация антитела в этих композициях может широко варьироваться, например, примерно от менее чем 0,005%, а обычно по крайней мере от около 1% до не менее чем 15 или 20 мас.%; и выбор концентрации антитела осуществляют, главным образом, исходя из объема жидкости, вязкости и т.п., а также в зависимости от выбранного способа введения. Antibodies and pharmaceutical compositions of the present invention are preferably used for parenteral administration, for example subcutaneous, intramuscular or intravenous administration. The antibodies of the present invention can also be used for topical application, for trans-probe nutrition or lavage, for intraperitoneal injection, for the manufacture of eye ointments and ointments for external use, for intracranial injections (usually in the ventricle of the brain), for intrapericardial injections or for intrasinovial injections . Compositions for parenteral administration usually contain an immunoglobulin solution or a mixture thereof dissolved in an acceptable carrier, and preferably in an aqueous carrier. For this purpose, various aqueous vehicles may be used, for example, water, buffered water, phosphate buffered saline (PBS); 0.4% saline, 0.3% glycine, human albumin solution, etc. These solutions are sterile and generally do not contain any particles. The compositions of the present invention can be sterilized by standard methods well known in the art. These compositions may contain pharmaceutically acceptable additives necessary to create physiological conditions, such as pH correcting and buffering agents, toxicity regulating agents, and the like, for example, sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride and sodium lactate . The concentration of antibodies in these compositions can vary widely, for example, from about less than 0.005%, and usually at least about 1% to at least 15 or 20 wt.%; and the choice of antibody concentration is carried out mainly on the basis of the volume of liquid, viscosity, etc., as well as depending on the chosen route of administration.

Так, например, типичная фармацевтическая композиция для инъекций может содержать 1 мл стерильной забуференной воды и 1-70 мг иммуноглобулина. Типичная композиция для внутривенных вливаний может содержать 250 мл стерильного раствора Рингера и 150 мг антитела. Методы получения парентеральных композиций хорошо известны специалистам и подробно описаны в литературе (см. , например Remington's Pharmaceutical Science (15-ое изд., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980; эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки). Композиции, подходящие для лаважа или для других способов введения, могут быть изготовлены в соответствующих формах в зависимости от целей их использования. Некоторые фармацевтическое композиции могут содержать как антитело против L-селектина, так и тромболитическое средство. For example, a typical pharmaceutical composition for injection may contain 1 ml of sterile buffered water and 1-70 mg of immunoglobulin. A typical composition for intravenous infusion may contain 250 ml of sterile Ringer's solution and 150 mg of antibody. Methods for preparing parenteral compositions are well known in the art and are described in detail in the literature (see, for example, Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980; this work is incorporated herein by reference). for lavage or for other routes of administration, can be made in appropriate forms depending on the purpose of their use.Some pharmaceutical compositions may contain both an anti-L-selectin antibody and a thrombolytic agent.

Для хранения антитела настоящего изобретения могут быть заморожены или лиофилизованы с последующим их восстановлением в соответствующем носителе непосредственно перед использованием. Было установлено, что при использовании обычных иммуноглобулинов может быть с успехом применена традиционная техника лиофилизации и восстановления. Однако, следует отметить, что лиофилизация и последующее восстановление могут привести к различной степени потери активности антител (например, в случае обычных иммуноглобулинов антитела IgM обнаруживают большую тенденцию к потере активности, чем антитела IgG), а поэтому может оказаться необходимым скорректировать используемые уровни для компенсации возможных потерь. For storage, the antibodies of the present invention can be frozen or lyophilized, followed by reconstitution in an appropriate vehicle immediately prior to use. It was found that using conventional immunoglobulins, the traditional lyophilization and recovery technique can be successfully applied. However, it should be noted that lyophilization and subsequent recovery can lead to varying degrees of loss of antibody activity (for example, in the case of conventional immunoglobulins, IgM antibodies show a greater tendency to lose activity than IgG antibodies), and therefore it may be necessary to adjust the levels used to compensate for possible losses.

Композиции настоящего изобретения, содержащие антитела или их смесь, могут быть введены в профилактических и/или терапевтических целях. Для терапевтических целей композиции вводят пациенту, страдающему воспалительными заболеваниями, в количестве, достаточном для излечения или по крайней мере для частичного подавления данного заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для достижения этой цели, определяется как "терапевтически эффективная доза". Эффективная доза зависит от тяжести заболевания, общего состояния иммунной системы пациента и составляет, в основном, от около 1 до около 200 мг антитела на дозу, а обычно от 5 до 70 мг на пациента. Схема введения лекарственного средства может варьироваться в зависимости от конкретного заболевания и состояния пациента и обычно колеблется от одной ударной дозы или продолжительного вливания в день до многократного введения в течение 1 дня (например, каждые 4-5 часов) в соответствии с назначением лечащего врача исходя из состояния пациента. При этом следует иметь в виду, что материалы настоящего изобретения могут быть использованы при серьезных заболеваниях в опасных для жизни или потенциально опасных для жизни ситуациях. В таких случаях для минимизации присутствия инородных веществ и снижения вероятности отторжения "чужеродного материала", которое достигается благодаря применению иммуноглобулинов настоящего изобретения, может оказаться желательным введение избыточного количества этих антител. Compositions of the present invention containing antibodies or a mixture thereof can be administered for prophylactic and / or therapeutic purposes. For therapeutic purposes, the compositions are administered to a patient suffering from inflammatory diseases in an amount sufficient to cure or at least partially suppress the disease and its complications. An amount adequate to achieve this goal is defined as a “therapeutically effective dose”. The effective dose depends on the severity of the disease, the general condition of the patient’s immune system and is generally from about 1 to about 200 mg of antibody per dose, and usually from 5 to 70 mg per patient. The dosage regimen may vary depending on the specific disease and condition of the patient and usually ranges from one loading dose or continuous infusion per day to repeated administration over 1 day (for example, every 4-5 hours) in accordance with the appointment of the attending physician based on patient condition. It should be borne in mind that the materials of the present invention can be used for serious diseases in life-threatening or potentially life-threatening situations. In such cases, in order to minimize the presence of foreign substances and to reduce the likelihood of rejection of “foreign material” that is achieved by using the immunoglobulins of the present invention, it may be desirable to administer an excess of these antibodies.

В профилактическом применении композиции, содержание антитела настоящего изобретения или их смесь, вводят пациенту, еще не страдающему конкретной болезнью, в целях усиления его сопротивляемости. Количество антитела, вводимого в этих целях, определяют как "профилактически эффективную дозу". В таких случаях точные количества антитела также зависят от общего состояния здоровья пациента и общего уровня его иммунитета и, в основном, составляют от 1 до 70 мг на дозу. Предпочтительными профилактическими целями использования композиций настоящего изобретения являются предупреждение респираторного дистресс-синдрома у взрослых пациентов, страдающих травмами или сепсисом; предупреждение отторжения трансплантированного органа и предупреждение реперфузионного повреждения у пациентов, страдающих ишемией. Для серьезно больных пациентов могут быть использованы дозы, составляющие от около 50 до 150 мг "очеловеченного" или человеческого иммуноглобулина на дозу либо более высокие дозы. In the prophylactic use of the composition, the antibody content of the present invention, or a mixture thereof, is administered to a patient who is not yet suffering from a particular disease in order to enhance its resistance. The amount of antibody administered for this purpose is defined as a "prophylactically effective dose." In such cases, the exact amount of the antibody also depends on the general health of the patient and the general level of his immunity, and generally ranges from 1 to 70 mg per dose. Preferred prophylactic uses of the compositions of the present invention are the prevention of respiratory distress syndrome in adult patients suffering from trauma or sepsis; prevention of transplant organ rejection and prevention of reperfusion injury in patients suffering from ischemia. For seriously ill patients, doses ranging from about 50 to 150 mg of humanized or human immunoglobulin per dose or higher doses may be used.

Выбор доз и схемы введения (т.е. разовое или многократное введение) композиций настоящего изобретения обычно осуществляет лечащий врач. Но в любом случае фармацевтические композиции должны включать в себя определенное количество антител, достаточное для эффективного лечения пациента. The choice of doses and administration patterns (i.e., single or multiple administration) of the compositions of the present invention is usually carried out by the attending physician. But in any case, the pharmaceutical compositions must include a certain amount of antibodies, sufficient for effective treatment of the patient.

Кроме того, антитела настоящего изобретения могут найти широкое применение в in vitro-исследованяях. Например, эти антитела могут быть использованы для детекции антигенов L-селектина в целях выделения специфических лейкоцитов или т.п. In addition, the antibodies of the present invention can be widely used in in vitro studies. For example, these antibodies can be used to detect L-selectin antigens in order to isolate specific white blood cells or the like.

Другими примерами такого применения являются, но не ограничиваются ими, "очеловеченный" иммуноглобулин DREG-200, который может быть иммобилизован и подвергнут взаимодействию с кровью, взятой у пациента, для удаления клеток крови, несущих антигены L-селектина, после чего оставшаяся кровь с удаленными L-селектин-несущими клетками может быть снова введена пациенту. Любые остаточные "очеловеченные" антитела, присутствующие в L-селектин-обедненной и вновь введенной пациенту крови (например, в результате отщепления от иммобилизирующего носителя), будут иметь очень небольшую или совсем незначительную антигенность по сравнению с антителом. Other examples of this use include, but are not limited to, humanized DREG-200 immunoglobulin, which can be immobilized and reacted with blood taken from a patient to remove blood cells carrying L-selectin antigens, after which the remaining blood is removed L-selectin-bearing cells can be reintroduced to the patient. Any residual “humanized” antibodies present in L-selectin-depleted and newly injected patient blood (for example, as a result of cleavage from an immobilizing carrier) will have very little or very little antigenicity compared to the antibody.

При использовании в целях диагностики антитела могут быть меченными или немеченными. Немеченные антитела могут быть использованы в комбинации с другими меченными антителами ("вторые" антитела), которые являются реактивными по отношению к "очеловеченным" или человеческим антителам, например антитела, специфичные к константным областям иммуноглобулина человека. Альтернативно, антитела могут быть подвергнуты прямому мечению. Для этого могут быть использованы различные метки широкого ряда, например, такие как радионуклиды, флуоресцентные вещества, ферменты, ферментные субстраты, конферменты, ингибиторы ферментов, лиганды (в частности, гаптены) и т.п. В этих целях могут быть использованы различные типы иммуноанализов, хорошо известных специалистах. When used for diagnostic purposes, antibodies may be labeled or unlabeled. Unlabeled antibodies can be used in combination with other labeled antibodies (“second” antibodies) that are reactive with humanized or human antibodies, for example, antibodies specific for the constant regions of a human immunoglobulin. Alternatively, antibodies can be directly labeled. For this, various labels of a wide range can be used, for example, such as radionuclides, fluorescent substances, enzymes, enzyme substrates, conferments, enzyme inhibitors, ligands (in particular, haptens), etc. For these purposes, various types of immunoassays well known in the art can be used.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют настоящее изобретение и не должны рассматриваться как некое ограничение объема изобретения. При этом следует отметить, что хотя приведенные ниже примеры относятся к использованию мышиного антитела DREG-200 для продуцирования "очеловеченного" антитела против L-селектина с высокой аффинностью связывания, однако, для продуцирования "очеловеченного" антитела могут быть также использованы гипервариабельные области (CDR), происходящие от мышиного антитела DREG-55, мышиного антитела DREG-56 или другого моноклонального антитела, способного связываться с эпитопом L-селектина. The following examples illustrate the present invention and should not be construed as limiting the scope of the invention. It should be noted that although the examples below relate to the use of the mouse DREG-200 antibody to produce a “humanized” anti-L-selectin antibody with high binding affinity, however, hypervariable regions (CDR) can also be used to produce a “humanized” antibody derived from a mouse DREG-55 antibody, a mouse DREG-56 antibody, or another monoclonal antibody capable of binding to an L-selectin epitope.

Пример 1: Клонирование кДНК тяжелой и легкой цепи
кДНК для генов вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи мышиного антитела DREG-200 клонировали с использованием полимеразно-цепных реакций (описанных Co и др. в. J. Immu. Vol. 148:1149 (1992) и в переуступленной заявке США рег. N 07/634278), а также 3'-праймеров, которые гибридизируются с константными областями и содержат HindIII-сайты, и 5'-праймеров, которые гибридизируются с IgG-концами и содержат EcoRI-сайты. PCR-амплифицированные фрагменты переваривали ферментами EcoRI и HindIII и клонировали в вектор pUC18 для секвенирования. Для мышиного антитела DREG-200 были секвенированы по крайней мере два гамма-1-специфических клона и два каппа-специфических клона. Гамма-1-клоны и каппа-клоны имели идентичную последовательность. кДНК-последовательности вариабельного домена и введенные аминокислотные последовательности представлены на фиг. 1.Example 1: Cloning of heavy and light chain cDNA
The cDNA for the heavy and light chain variable domain genes of the mouse DREG-200 antibody was cloned using polymerase chain reactions (described by Co et al. J. Immu. Vol. 148: 1149 (1992) and in assigned application US reg. N 07 / 634278), as well as 3'-primers that hybridize to constant regions and contain HindIII sites, and 5'-primers that hybridize to IgG ends and contain EcoRI sites. PCR amplified fragments were digested with EcoRI and HindIII enzymes and cloned into pUC18 vector for sequencing. For a murine DREG-200 antibody, at least two gamma-1 specific clones and two kappa-specific clones were sequenced. Gamma-1 clones and kappa clones had an identical sequence. The variable domain cDNA sequences and introduced amino acid sequences are shown in FIG. 1.

Пример 2: Компьютерное моделирование "очеловеченных" антител
Для сохранения высокой аффинности связывания в "очеловеченных" антителах были проведены нижеследующие процедуры, описанные Queen и др. (см. Queen и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989) и WO 90/07861; эти работы полностью вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Для исходного донорного мышиного антитела необходимо выбрать более гомологичное акцепторное человеческое антитело, поскольку в этом случае при объединении мышиных CDR-областей с чел. каркасными областями меньше вероятности внести искажения в CDR, которые могут привести к снижению аффинности связывания антитела. Предпочтительно, если гомология (т.е., процент идентичности последовательности) между каркасной вариабельной областью тяжелой цепи "очеловеченного" иммуноглобулина и каркасной вариабельной областью тяжелой цепи донорного иммуноглобулина составляет по крайней мере 65%. Обычно, для получения каркасных последовательностей тяжелую и легкую цепь выбирают от одного и того же антитела человека для того, чтобы по возможности снизить несовместимость при сборке этих двух цепей. В результате поиска гомологичных последовательностей исходя из базы данных белковых последовательностей (осуществляемого с использованием программного обеспечения Micro Genie Sequence Analysis Soft Ware (Beckman)) было выбрано антитело Eu, которое было затем использовано для получения каркасных последовательностей в целях "очеловечивания" мышиного антитела DREG-200.Example 2: Computer Simulation of Humanized Antibodies
To maintain a high binding affinity for humanized antibodies, the following procedures were performed as described by Queen et al. (See Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989) and WO 90/07861; these works fully incorporated into the present description by reference). For the initial donor mouse antibody, it is necessary to choose a more homologous acceptor human antibody, since in this case, when combining murine CDR regions with humans. frame regions are less likely to introduce distortion into the CDRs, which can lead to a decrease in antibody binding affinity. Preferably, the homology (i.e., percent sequence identity) between the humanized immunoglobulin heavy chain variable region and the donor immunoglobulin heavy chain variable region is at least 65%. Usually, to obtain frame sequences, the heavy and light chains are selected from the same human antibody in order to reduce incompatibility when assembling these two chains. As a result of the search for homologous sequences based on the protein sequence database (performed using Micro Genie Sequence Analysis Soft Ware (Beckman) software), the Eu antibody was selected, which was then used to generate frame sequences for the purpose of humanization of the DREG-200 mouse antibody .

Для конструирования модели вариабельной области мышиного DREG-200 использовали компьютерную программу ENCAD(Levitt, J. Mol. Biol. 168:595 (1983); эта работа вводится во всей полноте посредством ссылки). Полученную модель использовали для определения аминокислотных последовательностей в каркасной области DREG-200 мыши, которая была достаточно близкой к CDR-областям, чтобы иметь возможность взаимодействовать с этими областями (категория 4, см. ниже). Для конструирования вариабельных областей легкой и тяжелой цепей "очеловеченного" DREG-200 в каждом положении аминокислоты выбирали так, чтобы они совпадали с аминокислотами в антителе Eu, если только это положение не подпадает под одну или более из нижеследующих 5 категорий:
(1) Это положение находится внутри области CDR;
(2) аминокислота в Eu является не характерной для антител человека в этом положении, а аминокислота мышиного DREG-200 является типичной для человеческих антител в этом положении;
(3) Это положение находится в непосредственной близости от CDR;
(4) В соответствии с описанной выше моделью имеется предположение, что данная аминокислота может находиться в непосредственной близости к антигенсвязывающей области (CDR).The computer program ENCAD (Levitt, J. Mol. Biol. 168: 595 (1983) was used to construct the variable region model of the mouse DREG-200; this work is hereby incorporated by reference). The resulting model was used to determine the amino acid sequences in the mouse DREG-200 framework region, which was close enough to the CDR regions to be able to interact with these regions (category 4, see below). To construct the variable regions of the light and heavy chains of the “humanized” DREG-200 at each position, the amino acids were chosen so that they coincide with the amino acids in the Eu antibody, unless this position falls into one or more of the following 5 categories:
(1) This position is within the CDR region;
(2) the amino acid in Eu is not characteristic of human antibodies in this position, and the mouse DREG-200 amino acid is typical of human antibodies in this position;
(3) This position is in close proximity to the CDR;
(4) In accordance with the model described above, there is an assumption that this amino acid may be in close proximity to the antigen binding region (CDR).

Для положений, подпадающих под эти категории, использовались аминокислоты от мышиного антитела DREG-200. For positions falling into these categories, amino acids from the mouse DREG-200 antibody were used.

Кроме того, конкретное положение могло подпадать под пятую категорию, а именно:
(5) Аминокислота Eu является в высокой степени нехарактерной для человеческих антител в этом положении, аминокислота DREG-200, хотя и отличается от аминокислоты Eu, но также является нехарактерной. В этих случаях для данного положения использовали аминокислоту, типичную для человеческого антитела.In addition, a specific provision could fall into the fifth category, namely:
(5) The Eu amino acid is highly uncharacteristic for human antibodies in this position, the DREG-200 amino acid, although different from the Eu amino acid, is also uncharacteristic. In these cases, an amino acid typical of a human antibody was used for this position.

Аминокислоты каждой категории показаны в Таблице 1. Некоторые аминокислоты могут подпадать под более чем одну категорию. Конечные последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи "очеловеченного" антитела DREG-200 показаны на фиг. 2 в сравнении с последовательностями мышиного DREG-200. The amino acids of each category are shown in Table 1. Some amino acids may fall into more than one category. The final sequences of the variable domains of the light and heavy chains of the “humanized” DREG-200 antibody are shown in FIG. 2 compared with murine DREG-200 sequences.

Для конструирования генов, кодирующих "очеловеченные" антитела, были выбраны (в основном, с использованием кодонов, обнаруживаемых в мышиной последовательности) нуклеотидные последовательности, кодирующие белковые последовательности тяжелых и легких цепей "очеловеченного" антитела, включая сигнальные пептиды. Для создания сайтов рестрикции или для удаления нежелательных сайтов некоторые вырожденные кодоны были заменены. Нуклеотидные последовательности генов также включают в себя донорные сигналы сплайсинга и XbaI-сайт на каждом конце. Нуклеотидные последовательности и кодированные вариабельные домены легкой и тяжелой цепи "очеловеченного" иммуноглобулина показаны на фиг. 3. Каждый ген был сконструирован из четырех перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, описанных в литературе (см. Co и др., J. Immunol. 148:1149 (1992) и переуступленная заявка США рег. N 07/634278, указанные работы целиком вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Затем гены, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепи, лигировали в XbaI- сайты экспрессирующих векторов pVg1-dhfr или pVk (см. переуступленную заявку США рег. N 07/634278) в соответствующей ориентации в целях продуцирования генов полной тяжелой и легкой цепи. Реакции осуществляли в стандартных условиях, хорошо известных специалистам (Maniatis и др., см. выше). To construct genes encoding humanized antibodies, nucleotide sequences encoding the protein sequences of the heavy and light chains of the humanized antibodies, including signal peptides, were selected (mainly using codons found in the mouse sequence). To create restriction sites or to remove unwanted sites, some degenerate codons have been replaced. The nucleotide sequences of the genes also include splicing donor signals and an XbaI site at each end. The nucleotide sequences and encoded variable domains of the light and heavy chains of the humanized immunoglobulin are shown in FIG. 3. Each gene was constructed from four overlapping synthetic oligonucleotides described in the literature (see Co and others, J. Immunol. 148: 1149 (1992) and assigned application US reg. N 07/634278, these works are fully introduced in the present description by reference). The genes encoding the variable regions of the heavy and light chains were then ligated to the XbaI sites of the pVg1-dhfr or pVk expression vectors (see assigned application US reg. N 07/634278) in the appropriate orientation in order to produce genes for the full heavy and light chains. The reactions were carried out under standard conditions well known to those skilled in the art (Maniatis et al., Supra).

Плазмиды для тяжелой и легкой цепей были введены в клетки мышиной миеломы Sp2/O путем электропорации, и клетки отбирали для экспрессии gpt. Клоны скринировали путем оценки продуцирования человеческого антитела в супернатанте культуры с помощью ELISA и из клонов о наилучшим продуцированием выделяли антитело. Затем "очеловеченное" IgGI-антитело DREG-200 очищали путем пропускания супернатанта тканевой культуры через колонку с A-Сефарозой стафилококкового белка CL-4B (Phafmacia). Связанное антитело элюировали 0,2 М Глицином-HCl (pH 3,0) и нейтрализовали 1 М Трисом (pH 8,0). Затем буфер заменяли на PBS путем пропускания через PD10-колонку (Pharmacia) или путем диализа. Для получения клеток, продуцирующих наиболее высокие уровни антитела, трансфецированные клоны могут быть культивированы в возрастающих концентрациях метотрексата. Heavy and light chain plasmids were introduced into mouse Sp2 / O mouse myeloma cells by electroporation, and cells were selected for expression of gpt. Clones were screened by evaluating the production of the human antibody in the culture supernatant using ELISA and the antibody was isolated from the best producing clones. Then, the “humanized” DREG-200 IgGI antibody was purified by passing the tissue culture supernatant through a staphylococcal CL-4B protein A-Sepharose column (Phafmacia). The bound antibody was eluted with 0.2 M Glycine-HCl (pH 3.0) and neutralized with 1 M Tris (pH 8.0). The buffer was then replaced with PBS by passing through a PD10 column (Pharmacia) or by dialysis. To obtain cells that produce the highest levels of antibodies, transfected clones can be cultured in increasing concentrations of methotrexate.

Для продуцирования "очеловеченного" антитела DREG-200 изотипа IgG4 сначала был сконструирован другой вектор pVg4-dnfr. Для этого XbaI-BamH1-фрагмент вектора pVg1-dnfr, содержащего константную γ 1-область, заменяли фрагментом (приблизительно в 2000 п.о.) гена константной γ 4-области иммуноглобулина человека (Ellison и Hood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1984 (1982)), который простирался от Hind111-сайта, находящегося перед C_H1-экзоном γ 4-гена до 270 п. о. после Nsi1-сайта, расположенного за C_H4-экзоном этого гена, с использованием известной техники, включая полимеразно-цепную реакцию. Затем ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи "очеловеченного" антитела DREG-200, клонировали в Xba1-сайт вектора pVg4-dnfr. Полученную плазмиду, несущую ген тяжелой цепи, вместе с вышеописанной плазмидой, несущей ген легкой цепи, вводили в клетки Sp2/O, клоны отбирали,
а "очеловеченное" антитело DREG-200 изотипа IgG4 очищали как описано выше для антитела IgG1.To produce the humanized DREG-200 antibody of the IgG4 isotype, another pVg4-dnfr vector was first constructed. For this, the XbaI-BamH1 fragment of the pVg1-dnfr vector containing theconstant γ 1 region was replaced by a fragment (approximately 2000 bp) of the human immunoglobulinconstant γ 4 region gene (Ellison and Hood, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 1984 (1982)), which extended from the Hind111 site located in front of theC_H 1 exon of theγ 4 gene to 270 bp after the Nsi1 site located behind theC_H 4 exon of this gene using known techniques, including the polymerase chain reaction. Then, the gene encoding the variable region of the heavy chain of the “humanized” DREG-200 antibody was cloned into the Xba1 site of the pVg4-dnfr vector. The obtained plasmid carrying the heavy chain gene, together with the above plasmid carrying the light chain gene, was introduced into Sp2 / O cells, clones were selected,
and the “humanized” IgG4 isotype DREG-200 antibody was purified as described above for the IgG1 antibody.

Пример 3. Свойства "очеловеченных" антител
Аффинность "очеловеченных антител DREG-200 против L-селектина определяли путем конкурентного связывания с мышиным антителом DREG-200, меченным радиоактивным йодом (фиг. 4). Аффинность связывания вычисляли по методу Berzofsky (J. A. Berzofsky и L.J. Berkower, в"Fundamental Immunology (ed. W.E. Paul), Raven Press (New York), 595 (1984), эта работа целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки). Аффинность "очеловеченных" антител DREG-200 примерно в 2 раза превышает аффинность мышиного антитела DREG-200. Аналогичные результаты могут быть получены, если аффинность антитела против L-селектина измерять на нейтрофилах человека.Example 3. Properties of "humanized" antibodies
The affinity of humanized anti-L-selectin DREG-200 antibodies was determined by competitive binding to mouse DREG-200 antibody labeled with radioactive iodine (Fig. 4). The binding affinity was calculated by the Berzofsky method (JA Berzofsky and LJ Berkower, in Fundamental Immunology (ed . WE Paul), Raven Press (New York), 595 (1984), this work is incorporated herein by reference in its entirety). The affinity of the “humanized” DREG-200 antibodies is about 2 times that of the mouse DREG-200 antibody. Similar results can be obtained if the affinity of the anti-L-selectin antibody is measured on human neutrophils.

Способность мышиного и "очеловеченного" антитела DREG-200 блокировать прилипание нейтрофилов к эндотелиальным клеткам определяли посредством модификации аналитического метода Hallmann et al., Bio Chem. Biophys. Res. Comm. 174:236 (1991). В частности, эндотелиальные клетки пуповины (HUVEC, от Clonetics, San Diego) культивировали до состояния сплошности в EGM-среде (Clonetics) на предметных стеклах с лунками Lab-Tek 8 (Nunc, Naperville, IL). Перед использованием HUVEC-клетки стимулировали в течение 4 часов с использованием 20 нг/мл IL - 1β (R&D Systems, Minneapolis, MN). Посредством центрифугирования в градиенте плотности нейтрофилы выделяли из светлых слоев кровяного сгустка, который был очищен от эритроцитов путем осаждения декстраном, после чего их количество доводили до 10⁷/мл. Нейтрофилы (100 мкл) предварительно инкубировали в течение 20 минут на льду с различными концентрациями антитела (в 100 мкл RPMI). Предметные стекла с HUVEC-клетками промывали при отсутствии 1L - 1β и помещали в роторный шейкер (100 об./мин) при 4^oC. Затем в лунки добавляли необработанные или обработанные антителом нейтрофилы и предметные стекла инкубировали на шейкере в течение 30 минут при 4^oC. Затем предметные стекла промывали путем погружения 10 раз в сосуд со RPMI-средой, фиксировали в 1% глутаральдегиде в RPMI и оставляли на воздухе для осушки. Количественную оценку прилипания нейтрофилов проводили путем подсчета нейтрофилов, связанных с определенными участками монослоя эндотелиальных клеток, при помощи микроскопа. Как показано на фиг. 5, "очеловеченное" lgG1 и мышиное антитела DREG-200 эффективно блокируют связывание нейтрофилов с HUVEC, тогда как иррелевантное контрольное антитело к такому блокированию неспособно. "Очеловеченное" IgG4-антитело DREG-200 аналогичным образом блокирует связывание нейтрофилов с эндотелиальными клетками.The ability of the mouse and humanized DREG-200 antibodies to block the attachment of neutrophils to endothelial cells was determined by modifying the analytical method of Hallmann et al., Bio Chem. Biophys. Res. Comm. 174: 236 (1991). In particular, umbilical cord endothelial cells (HUVEC, from Clonetics, San Diego) were cultured to a state of continuity in an EGM medium (Clonetics) on Lab-Tek 8 glass slides (Nunc, Naperville, IL). Before use, HUVEC cells were stimulated for 4 hours using 20 ng / ml IL-1β (R&D Systems, Minneapolis, MN). By centrifugation in a density gradient, neutrophils were isolated from the light layers of a blood clot, which was purified from red blood cells by sedimentation with dextran, after which their number was adjusted to 10⁷ / ml. Neutrophils (100 μl) were preincubated for 20 minutes on ice with various antibody concentrations (in 100 μl RPMI). Slides with HUVEC cells were washed in the absence of 1L - 1β and placed in a rotary shaker (100 rpm) at 4^° C. Untreated or antibody-treated neutrophils were then added to the wells and the slides were incubated on the shaker for 30 minutes at 4^o C. Then the slides were washed byimmersion 10 times in a vessel with RPMI medium, fixed in 1% glutaraldehyde in RPMI and left in air for drying. Quantification of neutrophil adhesion was carried out by counting neutrophils associated with specific sections of the monolayer of endothelial cells using a microscope. As shown in FIG. 5, humanized lgG1 and murine DREG-200 antibodies effectively block the binding of neutrophils to HUVEC, while the irrelevant control antibody is not capable of such blocking. The “humanized” DREG-200 IgG4 antibody likewise blocks the binding of neutrophils to endothelial cells.

Пример 4. Example 4

Влияние антитела чел. DREG-200 на повреждение мио- после реперфузии. The effect of antibodies DREG-200 for myo damage after reperfusion.

Исследовали степень реального защитного действия "очеловеченного" антитела DREG-200 изотипа IgG4 (очел. DREG-200) на ишемическую ткань миокарда после реперфузии. Самцов взрослых кошек (2,8-4,2 кг) анестезировали натрия пентобарбиталом (30 мг/кг, i. v.). В срединный разрез вводили трахеотомическую канюлю, после чего кошек помещали в условия искусственной вентиляции легких под переменным положительным давлением (небольшой респиратор для животных, Harvard, Dover, МА). В правую внешнюю яремную вену вводили полиэтиленовый катетер для дополнительного введения пентобарбитала для поддержания нужного уровня наркоза при операции и для введения антител. Другой полиэтиленовый катетер вставляли через левую бедренную артерию и помещали в абдоминальной аорте для измерения среднего артериального давления (МАВР) с помощью датчика давления (Cobe Instruments, Lakewood, CO). После грудинной торакотомии вскрывали передний перикард и наносили шов шелковой нитью (3-0) вокруг левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии на расстоянии 8-10 мм от ее начала. Затем через апикальную ямку в левый жердочек вводили высокоточный датчик давления с наконечником катетера (Model MPC 500 с блоком управления - Model TCB 500, Milla Instruments Inc., Houston, TX). Катетер устанавливали посредством наблюдения за LV-давлением и формой dP/dt-волны, а затем закрепляли на месте шелковым швом. Для определения частоты пульса (HR) и элевации ST-сегмента использовали стандартное отведение II скалярной электрокардиограммы (ECG). Элевацию ST-сегментов определяли путем анализа записи ECG при 50 мм/с каждые 2O минут. ECG, MABP, LVP и dP/dt постоянно контролировали на мониторе с блоком Hewlett - Packard 78304 A(Hewlett - Packard, Palo Alto, CA) и записывали на осцилографическом рекордере (Gould Inc., Cleveland, OH) каждые 20 минут. PRI-индекс, приблизительная потребность миокарда в кислороде, вычисляли как отношение MABP и HP/1000. The degree of real protective effect of the “humanized” DREG-200 antibody of the IgG4 isotype (human. DREG-200) on myocardial ischemic tissue after reperfusion was investigated. Male adult cats (2.8-4.2 kg) were anesthetized with sodium pentobarbital (30 mg / kg, i. V.). A tracheotomy cannula was inserted into the midline incision, after which the cats were placed under conditions of artificial ventilation under variable positive pressure (a small respirator for animals, Harvard, Dover, MA). A polyethylene catheter was inserted into the right external jugular vein for additional administration of pentobarbital to maintain the desired level of anesthesia during surgery and for the introduction of antibodies. Another polyethylene catheter was inserted through the left femoral artery and placed in the abdominal aorta to measure mean arterial pressure (MABP) using a pressure transducer (Cobe Instruments, Lakewood, CO). After sternal thoracotomy, the anterior pericardium was opened and a suture was sewn with silk thread (3-0) around the left anterior descending (LAD) coronary artery at a distance of 8-10 mm from its beginning. Then, a high-precision pressure transducer with a catheter tip (Model MPC 500 with a control unit - Model TCB 500, Milla Instruments Inc., Houston, TX) was inserted through the apical fossa into the left ventricle. A catheter was placed by observing the LV pressure and the dP / dt waveform, and then fixed in place with a silk suture. To determine the heart rate (HR) and elevation of the ST segment, standard lead of II scalar electrocardiogram (ECG) was used. Elevation of ST segments was determined by analyzing ECG recording at 50 mm / s every 2O minutes. ECG, MABP, LVP, and dP / dt were constantly monitored on a Hewlett-Packard 78304 A monitor (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) and recorded on an oscilloscope (Gould Inc., Cleveland, OH) every 20 minutes. The PRI index, the approximate oxygen demand of the myocardium, was calculated as the ratio of MABP and HP / 1000.

После завершения всех хирургических процедур кошек оставляли на 30 минут для стабилизации и в течение этого времени записывали базовые показания ECG, MABP, LVP и dP/dt. Ишемию миокарда (MI) индуцировали путем стягивания обратимой лигатуры, первоначально помещенной вокруг LAD, в целях достижения полной закупорки сосудов. Эту ситуацию определяли как нулевой момент времени. Через 80 минут после коронарной окклюзии внутривенно вводили в качестве ударной дозы 2 мг/кг веса тела очел. DREG-200 (изотип IgG4) или контрольное антитело Mab hu ABL - 364 (т.е. "очеловеченное" контрольное Mab, соответствующее изотипу IgG4) (за 10 минут до реперфузии, R). Затем через 10 минут (т.е. в целом через 90 минут после ишемической окклюзии, I) лигатуру вокруг LAD развязывали и ишемический миокард подвергали реперфузии в течение 4,5 часов. After completion of all surgical procedures, the cats were left to stabilize for 30 minutes and during this time the baseline ECG, MABP, LVP and dP / dt were recorded. Myocardial ischemia (MI) was induced by tightening a reversible ligature, originally placed around LAD, in order to achieve complete blockage of the vessels. This situation was defined as a zero point in time. 80 minutes after coronary occlusion, 2 mg / kg of body weight was administered intravenously as a shock dose. DREG-200 (IgG4 isotype) or Mab hu ABL-364 control antibody (ie, humanized control Mab corresponding to IgG4 isotype) (10 minutes before reperfusion, R). Then, after 10 minutes (i.e., generally 90 minutes after ischemic occlusion, I), the ligature around the LAD was untied and the ischemic myocardium was reperfused for 4.5 hours.

Животных произвольно разделяли на три основные группы. Группе из шести кошек с ложной MI + R вводили очел. DREG-200 (2 мг/кг), группе из 6 кошек MI + R вводили контрольное антитело Mab hu ABL - 364 (2 мг/кг) и группе из 6 кошек MI + R вводили очел. DREG-200 (2 мг/кг). Группу кошек с ложной MI + R подвергали аналогичным хирургическим процедурам, за исключением того, что LAD коронарная артерия не подвергалась окклюзии. Animals were randomly divided into three main groups. A group of six cats with false MI + R was administered ocell. DREG-200 (2 mg / kg), a control antibody group Mab hu ABL - 364 (2 mg / kg) was administered to a group of 6 cats MI + R and an ocell was administered to a group of 6 cats MI + R. DREG-200 (2 mg / kg). A group of cats with false MI + R was subjected to similar surgical procedures, except that the LAD coronary artery did not undergo occlusion.

По окончании 4,5-часового периода реперфузии лигатуру вокруг LAD снова затягивали. После этого в левый желудочек быстро инъецировали 20 мл 0,5% голубого Эванс в целях окрашивания зоны миокарда, которая подвергалась перфузии посредством открытых коронарных артерий. Эта зона "под угрозой" определялась путем негативного окрашивания. Сразу после этой инъекции сердце быстро вырезали и помещали в подогретый, насыщенный кислородом K-H-раствор. Левую огибающую (LCX) и LAD-коронарную артерии выделяли и удаляли для последующего исследования вазоактивности коронарного кольца и прилипания PMN. Правый желудочек, крупные сосуды и жировую ткань осторожно удаляли, а левый желудочек разрезали на секции толщиной 3 мм параллельно атриовентрикулярной борозде. Неокрашенную часть миокарда (т.е. полная зона риска или ишемическая зона) отделяли от части миокарда, окрашенного голубым Эванса (т.е. безопасная зона или неишемическая зона). Зону под угрозой (или зону риска) разрезали на небольшие кубики и инкубировали в 0,1% нитросинем тетразолии в фосфатном растворе (pH 7,4) при 37^oC в течение 15 минут. Тетразолиевый краситель образует синий формазановый комплекс в присутствии клеток миокарда, содержащий активные дигидрогеназы и их кофакторы. Необратимо поврежденную или некротическую часть миокарда зоны риска, которая не окрашивалась, отделяли от окрашенной части миокарда (т.е. ишемической, но не некротической зоны). После этого все три части миокарда (т.е. неишемическая, ишемическая, но не некротическая, и ишемическая некротическая ткань) взвешивали. Полученные результаты выражали в виде площади некротической сердечной ткани, вычисленной как % либо от зоны риска, либо от полной массы левого желудочка.At the end of the 4.5-hour reperfusion period, the ligature around the LAD was again tightened. After that, 20 ml of 0.5% Evans blue was quickly injected into the left ventricle to stain the myocardial zone, which was perfused by open coronary arteries. This “threatened” zone was determined by negative staining. Immediately after this injection, the heart was rapidly excised and placed in a heated, oxygenated KH solution. The left envelope (LCX) and LAD coronary artery were isolated and removed for subsequent examination of the coronary ring vasoactivity and PMN adhesion. The right ventricle, large vessels and adipose tissue were carefully removed, and the left ventricle was cut intosections 3 mm thick parallel to the atrioventricular groove. The unpainted part of the myocardium (i.e., the complete risk zone or ischemic zone) was separated from the part of the myocardium stained with Evans blue (i.e., the safe zone or non-ischemic zone). The endangered zone (or risk zone) was cut into small cubes and incubated in 0.1% tetrazolium nitrosine in a phosphate solution (pH 7.4) at 37^° C for 15 minutes. The tetrazolium dye forms a blue formazan complex in the presence of myocardial cells containing active dihydrogenases and their cofactors. Irreversibly damaged or necrotic part of the myocardium of the risk zone, which was not stained, was separated from the stained part of the myocardium (i.e., ischemic, but not necrotic zone). After that, all three parts of the myocardium (i.e., non-ischemic, ischemic, but not necrotic, and ischemic necrotic tissue) were weighed. The results were expressed as the area of necrotic cardiac tissue, calculated as a% of either the risk zone or the total mass of the left ventricle.

В соответствии с этими критериями повреждение сердечной ткани было значительно уменьшено (p < 0,001) у кошек, обработанных очел. DREG-200. Тогда, как у группы, обработанной контрольным антителом, около 30% миокарда зоны риска развивалось в некротическую ткань, причем у очел. DREG-200-oбpaботанной группы количество некротической ткани составляло менее 15% (p < 0,01), т.е. уменьшилось на 50-60% (см. фиг. 6). Значительного различия между мокрыми массами зон риска, выраженными как процент от полной массы левого желудочка, для двух ишемических групп не наблюдалось, что указывает на то, что ишемии миокарда подвержены сравнительно одинаковые области у этих двух групп. Таким образом, очеловеченное антитело DREG-200 обеспечивает значительную защиту от повреждений после реперфузии. According to these criteria, cardiac tissue damage was significantly reduced (p <0.001) in ocel treated cats. DREG-200. Then, as in the group treated with the control antibody, about 30% of the risk zone myocardium developed into necrotic tissue, and in ocles. The DREG-200-treated group had less than 15% necrotic tissue (p <0.01), i.e. decreased by 50-60% (see Fig. 6). Significant differences between the wet masses of the risk zones, expressed as a percentage of the total mass of the left ventricle, were not observed for the two ischemic groups, which indicates that relatively the same areas in these two groups are affected by myocardial ischemia. Thus, the humanized DREG-200 antibody provides significant protection against damage after reperfusion.

Заметная способность очел. DREG-200 защищать ишемическую ткань была также проиллюстрирована благодаря измерениям активности креатинкиназы в плазме, биохимического маркера повреждения миокарда. Пробы артериальной крови (2 мл) брали сразу после наложения лигатуры, а затем через каждый час. Эту кровь собирали в полиэтиленовые пробирки, содержащие 200 ME натриевой соли гепарина. Полученные пробы центрифугировали при 2000 x г при 4^oC в течение 20 минут, после чего плазму декантировали для биохимического анализа. Концентрацию белка в плазме определяли с использованием биурета по методу Gornall и др., J. Biol. Chem. 177:751-766 (1949). Активность креатинкиназы (СK) в плазме измеряли по методу Rosalki, J. Lab. Clin. Med. 69:696-705 (1967) и выражала как ME/мкг белка.Marked ability DREG-200 to protect ischemic tissue was also illustrated by measuring plasma creatine kinase activity, a biochemical marker of myocardial damage. Arterial blood samples (2 ml) were taken immediately after ligature application, and then every hour. This blood was collected in polyethylene tubes containing 200 IU of heparin sodium. The samples were centrifuged at 2000 xg at 4^° C for 20 minutes, after which the plasma was decanted for biochemical analysis. Plasma protein concentration was determined using biuret according to the method of Gornall et al., J. Biol. Chem. 177: 751-766 (1949). Plasma creatine kinase (SK) activity was measured by the method of Rosalki, J. Lab. Clin. Med. 69: 696-705 (1967) and expressed as ME / μg protein.

У кошек с ложной MI/R, получавших очел. DREG-200, на протяжении 6 часов наблюдалась слегка повышенная активность СK в плазме, достигая величины 3,8 ± 0,9 ME/мкг белка. Для двух ишемических групп активность CK в плазме слегка возрастала в период ишемии миокарда. У кошек, получавших hu ABL-364, активность CK в крови значительно возрастала в течение первых 30 минут после реперфузии и оставалась повышенной в течение 4 часов периода реперфузии. В противоположность этому, у ишемической группы, обработанной очел. DREG-200, наблюдалась значительно меньшая активность CK в плазме, чем у ишемической группы, обработанной hu ABL-364 (p < 0,05). Этот эффект наблюдался в течение всего периода реперфузии, что свидетельствовало о том, что очел. DREG-200 обладает значительным защитным действием от повреждений миокарда после реперфузии. In cats with false MI / R who received an ocell. DREG-200, a slightly increased plasma SK activity was observed for 6 hours, reaching 3.8 ± 0.9 ME / μg of protein. For two ischemic groups, plasma CK activity slightly increased during myocardial ischemia. In cats treated with hu ABL-364, blood CK activity increased significantly during the first 30 minutes after reperfusion and remained elevated during the 4 hours of the reperfusion period. In contrast, the ischemic group treated oschel. DREG-200, significantly lower plasma CK activity was observed than in the ischemic group treated with hu ABL-364 (p <0.05). This effect was observed during the entire period of reperfusion, which indicated that the ocel. DREG-200 has a significant protective effect against myocardial damage after reperfusion.

Пример 5: Влияние очел. DREG-200 на функцию сердца
Влияние очел. DREG-200 (изотип IgG4) на функцию сердца определяли путем измерения давления в левом желудочке (LVP), первой производной от LVP, dP/dt_макс, показателя сократительной способности миокарда. Все данные были получены с помощью манометра, вводимого посредством наконечника катетера в полость левого желудочка. Все три группы кошек, обсуждаемые в предыдущем примере, показали сравнительно одинаковые начальные величины указанных кардиальных параметров. Для группы с ложной MI на протяжении всего экспериментального периода (6 часов) не наблюдалось значительных изменений в величинах dP/dt_макс. Тогда как в обеих группах MI/R после окклюзии LAD наблюдалось увеличение dP/dt_макс примерно на 65%. У кошек, обработанных hu ABL-364, сократительная способность миокарда не обнаруживала заметного восстановления. Однако, у очел. DREG-200-обработанных MI/R-кошек, dP/dt_макс. восстановилась до контрольных значений через три часа после реперфузии. Таким образом, после 4,5-часовой реперфузии dP/dt_макс. была значительно ниже у hu ABL-364-обработанных кошек, чем у очел. DREG-200-обработанных кошек (p < 0,01). Полученные результаты показали, что очел. DREG-200-антитело не только способствует снижению постреперфузионного некроза миокарда при ишемии, но также способствует улучшению механических функций сердца.Example 5: Influence of ocel. DREG-200 on heart function
Influence DREG-200 (IgG4 isotype) for heart function was determined by measuring the pressure in the left ventricle (LVP), the first derivative of LVP, dP / dt_max , an indicator of myocardial contractility. All data was obtained using a pressure gauge inserted through the tip of the catheter into the cavity of the left ventricle. All three groups of cats discussed in the previous example showed relatively identical initial values of the indicated cardiac parameters. For the group with false MI throughout the entire experimental period (6 hours), there were no significant changes in the values of dP / dt_max . Whereas in both MI / R groups after LAD occlusion, an increase of dP / dt_{max by} about 65% was observed. In cats treated with hu ABL-364, myocardial contractility did not show a noticeable recovery. However, the staff. DREG-200-treated MI / R cats, dP / dt_max. recovered to control values three hours after reperfusion. Thus, after 4.5 hours of reperfusion, dP / dt_max. was significantly lower in hu ABL-364-treated cats than in ocel. DREG-200-treated cats (p <0.01). The results showed that it was very good. DREG-200 antibody not only helps to reduce post-reperfusion myocardial necrosis in ischemia, but also improves the mechanical functions of the heart.

В соответствии с вышеизложенным следует отметить, что иммуноглобулины настоящего изобретения имеют ряд преимуществ по сравнению с другими антителами, специфичными к L-селектину. По сравнению с мышиными моноклональными антителами иммуноглобулины настоящего изобретения могут быть продуцированы с меньшими экономическими затратами и содержат значительно меньше чужеродных аминокислотных последовательностей. Это снижает вероятность продуцирования антигенности после их введения человеку, что значительно повышает терапевтический эффект этих антител. In accordance with the foregoing, it should be noted that the immunoglobulins of the present invention have several advantages compared with other antibodies specific for L-selectin. Compared to the murine monoclonal antibodies, the immunoglobulins of the present invention can be produced with lower economic costs and contain significantly fewer foreign amino acid sequences. This reduces the likelihood of producing antigenicity after their introduction to humans, which significantly increases the therapeutic effect of these antibodies.

Все публикации и патентные заявки, цитированные выше, во всех случаях и во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Хотя настоящее изобретение описано подробно на конкретных примерах его осуществления, однако, следует указать, что эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях, в связи с чем подразумевается, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за рамки нижеследующей формулы изобретения. All publications and patent applications cited above are, in all cases and in their entirety, incorporated herein by reference. Although the present invention is described in detail on specific examples of its implementation, however, it should be noted that these examples are for illustrative purposes only, and therefore it is understood that various changes and modifications may be made to the present invention without departing from the scope of the following claims .

Claims

Translated fromRussian

1. Гуманизированный иммуноглобулин, специфичный для белка L-селектина человека, имеющий области, определяющие комплементарность (СDR), соответствующие СDR-областям донорного мышиного иммуноглобулина, и каркасные области вариабельного района тяжелой и легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека, причем указанный гуманизированный иммуноглобулин специфически связывается с L-селектином человека с константой аффинности, составляющей, по крайней мере, 10⁷ М^-1, а последовательность каркасной области вариабельного района тяжелой цепи указанного гуманизированного иммуноглобулина на 65% или более идентична последовательности каркасной области вариабельного района тяжелой цепи донорного мышиного иммуноглобулина.1. Humanized immunoglobulin specific for human L-selectin protein, having complementarity determining regions (CDRs) corresponding to CDR regions of donor mouse immunoglobulin, and frame regions of the variable region of the heavy and light chain of the acceptor immunoglobulin of a person, wherein said humanized immunoglobulin specifically binds L-selectin with human affinity constant is at least 10^7M^-1, and the sequence of the framework region of the variable region of the heavy chain yk humanized immunoglobulin bound to 65% or more identical to the framework region of the heavy chain variable region of the murine donor immunoglobulin.

2. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1, отличающийся тем, что представляет собой антитело, содержащее два димера легкой/тяжелой цепи. 2. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that it is an antibody containing two light / heavy chain dimers.

3. Гуманизированный иммуноглобулин по п.2, отличающийся тем, что указанное антитело имеет изотип Ig G1 или Ig G4. 3. The humanized immunoglobulin according to claim 2, characterized in that said antibody has the isotype Ig G1 or Ig G4.

4. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1, отличающийся тем, что специфически связывается с L-селектином человека с аффинностью, составляющей, по крайней мере, 10⁸ М^-1.4. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that it specifically binds to human L-selectin with an affinity of at least 10⁸ M^-1 .

5. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1, отличающийся тем, что указанный донорный иммуноглобулин представляет собой мышиное антитело DREG-200. 5. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that said donor immunoglobulin is a DREG-200 murine antibody.

6. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1, отличающийся тем, что указанный донорный иммуноглобулин представляет собой мышиное антитело DREG-55. 6. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that said donor immunoglobulin is a DREG-55 murine antibody.

7. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1, отличающийся тем, что указанные каркасные области тяжелой и легкой цепи акцепторного иммуноглобулина происходят от одного и того же антитела человека. 7. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that said frame regions of the acceptor immunoglobulin heavy and light chains are derived from the same human antibody.

8. Гуманизированный иммуноглобулин по п.7, отличающийся тем, что указанным антителом человека является антитело Eu человека. 8. The humanized immunoglobulin according to claim 7, characterized in that said human antibody is a human Eu antibody.

9. Гуманизированный иммуноглобулин, специфичный для белка L-селектина человека, имеющий области, определяющие комплементарность (СDR), соответствующие СDR-областям донорного мышиного иммуноглобулина, и каркасные области вариабельного района тяжелой и легкой цепи акцепторного иммуноглобулина человека, причем указанный гуманизированный иммуноглобулин специфически связываются с L-селектином человека, с константой аффинности, по крайней мере 10⁷ М^-1 и содержит аминокислоты каркасной области донорного иммуноглобулина, которые заменяют соответствующие аминокислоты каркасных областей тяжелой и легкой цепи акцепторного иммуноглобулина, и которые не находятся в положении 26 - 30 тяжелой цепи, при этом, каждая из указанных аминокислот расположена возле СDR в последовательности донорного иммуноглобулина или содержит атом на расстоянии

от СDR в указанном гуманизированном иммуноглобулине.9. Humanized immunoglobulin specific for human L-selectin protein having complementarity determining regions (CDRs) corresponding to CDR regions of donor mouse immunoglobulin and frame regions of the variable region of the human acceptor immunoglobulin heavy and light chain, and said humanized immunoglobulin specifically binds L-selectin is human, with an affinity constant of at least 10^7M¹ and comprises amino donor immunoglobulin framework region that replace soot etstvuyuschie amino acids of the framework regions of the heavy and light chain acceptor immunoglobulin and which are not in the position 26 - 30 of the heavy chain, wherein each of said amino acids located near the CDR in the donor immunoglobulin sequence, or contains an atom at a distance

from CDR in said humanized immunoglobulin.

10. Гуманизированный иммуноглобулин по п.9, отличающийся тем, что расстояние указанного атома от СDR определяют исходя из модели иммуноглобулина, построенный с помощью компьютера. 10. The humanized immunoglobulin according to claim 9, characterized in that the distance of the specified atom from the CDR is determined based on the immunoglobulin model constructed using a computer.

11. Гуманизированный иммуноглобулин по п.9, отличающийся тем, что указанным донорным иммуноглобулином является мышиное антитело DRЕG-200. 11. The humanized immunoglobulin according to claim 9, characterized in that said donor immunoglobulin is a DREG-200 murine antibody.

12. Гуманизированный иммуноглобулин по п.9, отличающийся тем, что представляет собой антитело, содержащее два димера легкой/тяжелой цепи. 12. The humanized immunoglobulin according to claim 9, characterized in that it is an antibody containing two light / heavy chain dimers.

13. Гуманизированный иммуноглобулин по п.12, отличающийся тем, что указанное антитело имеет изотип Ig G1 или Ig G4. 13. The humanized immunoglobulin of claim 12, wherein said antibody has the isotype Ig G1 or Ig G4.

14. Гуманизированный иммуноглобулин по п.9, отличающийся тем, что указанные каркасные области тяжелой и легкой цепи акцепторного иммуноглобулина происходят от антитела Eu человека. 14. The humanized immunoglobulin according to claim 9, characterized in that said frame regions of the acceptor immunoglobulin heavy and light chains are derived from human Eu antibodies.

15. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1 или 9, отличающийся тем, что является, по существу, чистым . 15. The humanized immunoglobulin according to claim 1 or 9, characterized in that it is essentially pure.

16. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1 или 9, отличающийся тем, что ингибирует связывание нейтрофилов человека с эндотелиальными клетками человека. 16. The humanized immunoglobulin according to claim 1 or 9, characterized in that it inhibits the binding of human neutrophils to human endothelial cells.

17. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1, отличающийся тем, что специфически связывается с L-селектином человека, причем аминокислотная последовательность вариабельного района зрелой легкой цепи показана в нижних строках на рис.2А. 17. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that it specifically binds to human L-selectin, the amino acid sequence of the variable region of the mature light chain being shown in the lower lines in Fig. 2A.

18. Гуманизированный иммуноглобулин по п.1, отличающийся тем, что специфически связывается с L-селектином человека, причем аминокислотная последовательность вариабельного района зрелой тяжелой цепи показана в нижних строках на рис.2В. 18. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that it specifically binds to human L-selectin, the amino acid sequence of the variable region of the mature heavy chain being shown in the lower lines in Fig. 2B.

19. Гуманизированный иммуноглобулин по п. 1, отличающийся тем, что включает гуманизированную тяжелую цепь гуманизированную легкую цепь, а именно: (1) гуманизированную легкую цепь, содержащую три области, определяющие комплементарность (СDR1, СDR2 и СDR3), имеющие аминокислотные последовательности соответствующих областей, определяющие комплементарность легкой цепи мышиного иммуноглобулина DREG-200 и DREG-55, и каркасную область вариабельного района, происходящую из последовательности каркасной области вариабельного района легкой цепи человека, за исключением, по крайней мере, одного положения, выбранного из первой группы, включающей в себя L 87, L 54, L 66, L 76 и L 93, где указанное аминокислотное положение занято той же самой аминокислотой, которая присутствует в эквивалентном положении каркасной области вариабельного района легкой цепи мышиного иммуноглобулина DREG-200 и DREG-55, и (2) гуманизированную тяжелую цепь, содержащую три области, определяющие комплементарность (СDR1, СDR2 и СDR3), имеющие аминокислотные последовательности, происходящие от соответствующих областей, определяющих комплементарность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина DREG-200 и DREG-55 и каркасную область вариабельного района, происходящую от последовательности каркасной области вариабельного района тяжелой цепи человека, за исключением, по крайней мере, одного положения, выбранного из группы, включающей в себя H93, H95, H98, H111, H112, H115, H30, H98, H111, H27, H30, H78, H72, где указанное аминокислотное положение занимает та же самая аминокислота, которая присутствует в эквивалентном положении каркасной области вариабельного района тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина DREG-200 или DREG-55, где указанный иммуноглобулин связывается с L-селектиновым лигандом и аффинностью связывания, которая почти в три раза превышает аффинность мышиного иммуноглобулина DREG-200 и DREG-55. 19. The humanized immunoglobulin according to claim 1, characterized in that it comprises a humanized heavy chain, a humanized light chain, namely: (1) a humanized light chain containing three complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3) having amino acid sequences of the corresponding regions that determine the complementarity of the light chain of the mouse immunoglobulin DREG-200 and DREG-55, and the frame region of the variable region, derived from the sequence of the frame region of the variable region of the human light chain, the exclusion of at least one position selected from the first group including L 87, L 54, L 66, L 76 and L 93, where the specified amino acid position is occupied by the same amino acid that is present in the equivalent position of the frame region of the variable region the mouse immunoglobulin light chain region of DREG-200 and DREG-55, and (2) a humanized heavy chain containing three complementarity determining regions (CDDR1, CDDR2 and CDDR3) having amino acid sequences originating from corresponding complementarity determining regions the heavy chain of the mouse immunoglobulin DREG-200 and DREG-55 and the frame region of the variable region derived from the sequence of the frame region of the variable region of the human heavy chain, with the exception of at least one position selected from the group including H93, H95, H98, H111, H112, H115, H30, H98, H111, H27, H30, H78, H72, where the specified amino acid position is the same amino acid that is present in the equivalent position of the frame region of the variable region of the heavy chain of the mouse immunoglobulin DREG-200 or DREG -55, where The indicated immunoglobulin binds to the L-selectin ligand and a binding affinity that is almost three times that of the mouse immunoglobulin DREG-200 and DREG-55.