RU2129441C1 - Mixed vaccine against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis in piglets - Google Patents

Abstract

FIELD: veterinary science, microbiology, vaccines, biotechnology. SUBSTANCE: mixed vaccine has a clostridious component as Clostridium perfringens N 3 producing B-toxin of type C actively. It has a complex escherichiosis component consisting of a set of polysaccharide antigens O, K, adhesive antigens, TL- and TC-anatoxins taken at the ratio 1:1. Vaccine provides broad pattern of immunogenetics against enterotoxemia and escherichiosis in piglets at two-fold vaccination of pregnant pigs. The use of the mixed vaccine decreases labor intensity by two-fold, injection numbers and time required for vaccination as compared with the use of monovaccine. EFFECT: enhanced effectiveness. 1 tbl, 3 ex

Description

Translated fromRussian

Изобретение относится к области биотехнологии и касается изготовления профилактических препаратов против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят. The invention relates to the field of biotechnology and for the manufacture of prophylactic drugs against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets.

Обе инфекции широко распространены, особенно в комплексах, и частично протекают в виде смешанной инфекции. Both infections are widespread, especially in complexes, and partially proceed as a mixed infection.

Химиотерапия анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза мало эффективна и трудоемка. В связи с этим основным эффективным методом борьбы является вакцинация субпоросных свиноматок, обеспечивающая сохранность поросят за счет колострального иммунитета. Chemotherapy of anaerobic enterotoxemia and Escherichiosis is not very effective and time-consuming. In this regard, the main effective method of control is the vaccination of subbreeding sows, ensuring the safety of piglets due to colostral immunity.

Известна вакцина против эшерихиоза животных, содержащая адгезивные антигены K88, K99, 987P, F41, термостабильный (ТС) и термолабильный (ТЛ) анатоксины, соматические антигены 078, 0141 и полисахаридные капсульные антигены K80 и K87 (в виде суспензии клеток шт. ВГНКИ N 305-37/11 и N 334-37/12), адъювант - гидрат окиси алюминия, консервант - формалин, культуральную среду (бульон Хоттингера) и фосфатно-мочевинный буфер. В качестве продуцентов антигенов в вакцине использованы следующие штаммы эшерихий, депонированные в Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: ВГНКИ N 305-37/11 (078: K80), ВГНКИ N 334-37/12 (0141:K87:K88), ВГНКИ N 453-37/17 (0115: K88), ВГНКИ N 353-37/17 (0141:K99), ВГНКИ N 397-37/14 (09: K103: 987P), ВГНКИ N 398-37/14 (0101:F41). Вакцину вводят двухкратно внутримышечно с интервалами 14 - 20 дней по 5 мл на инъекцию (патент РФ N 2043771, A 61 K 39/108, 199). Known vaccine against animal escherichiosis containing adhesive antigens K88, K99, 987P, F41, thermostable (TS) and thermolabile (TL) toxoids, somatic antigens 078, 0141 and polysaccharide capsular antigens K80 and K87 (in the form of a cell suspension of 30 PCR NIHI -37/11 and N 334-37 / 12), adjuvant - alumina hydrate, preservative - formalin, culture medium (Hottinger broth) and phosphate-urea buffer. The following Escherichia strains deposited at the All-Russian State Research Institute for Control, Standardization and Certification of Veterinary Medicines: VGNKI N 305-37 / 11 (078: K80), VGNKI N 334-37 / 12 (0141: K87: K88), VGNKI N 453-37 / 17 (0115: K88), VGNKI N 353-37 / 17 (0141: K99), VGNKI N 397-37 / 14 (09: K103: 987P), VGNKI N 398- 37/14 (0101: F41). The vaccine is administered twice intramuscularly at intervals of 14 to 20 days, 5 ml per injection (RF patent N 2043771, A 61 K 39/108, 199).

Использование известной вакцины профилактирует эшерихиоз поросят, но, естественно, не создает иммунитета против анаэробной энтеротоксемии. Кроме того, она имеет повышенную реактогенность за счет содержания высокотоксичных штаммов серогрупп 078 и 0141 и недостаточную концентрацию анатоксинов, что делает необходимым вводить эту вакцину в большой дозе - 10 см³ на одно животное.The use of a well-known vaccine prevents Escherichia piglets, but, of course, does not create immunity against anaerobic enterotoxemia. In addition, it has an increased reactogenicity due to the content of highly toxic strains of serogroups 078 and 0141 and an insufficient concentration of toxoids, which makes it necessary to administer this vaccine in a large dose of 10 cm³ per animal.

Известна концентрированная формолвакцина на основе гидроокиси алюминия против энтеротоксемии поросят, полученная на основе производного штамма Clostridium perfringens типа C (Ветеринария, 1971, N 6, с. 53 - 55). Known concentrated formol vaccine based on aluminum hydroxide against enterotoxemia of piglets obtained on the basis of a derived strain of Clostridium perfringens type C (Veterinary, 1971, No. 6, S. 53 - 55).

Недостатком известной вакцина против анаэробной энтеротоксемии является низкая иммуногенная активность в связи с потерей производственным штаммом токсигенности. A disadvantage of the known vaccine against anaerobic enterotoxemia is the low immunogenic activity due to the loss of a production strain of toxigenicity.

Наиболее близким аналогом является ассоциированная вакцина Gletvax 5 против E.coli и Cl. pertringens типа C свиней, содержащая в каждых 5 см³ по 100 единиц антигенов K88ab, K88ac, K99 и 987P и не менее 300 интернациональных единиц эквивалента бета-токсоида Cl. pertringens типа C. Вакцину вводят субпоросным свиноматкам двукратно внутримышечно или подкожно, первую дозу за 6 недель, вторую - за 2 недели до опороса. Ревакцинацию проводят путем однократного введения вакцины за 2 недели до опороса (проспект фирмы Pitman Moore, Великобритания).The closest analogue is the associated vaccine Gletvax 5 against E. coli and Cl. pig type pertringens containing in each 5 cm³ 100 units of K88ab, K88ac, K99 and 987P antigens and at least 300 international units of beta-toxoid Cl. type C pertringens. The vaccine is administered to sub-sows twice intramuscularly or subcutaneously, the first dose for 6 weeks, the second - 2 weeks before farrowing. Revaccination is carried out by a single injection of the vaccine 2 weeks before farrowing (prospectus company Pitman Moore, UK).

Однако известная ассоциированная вакцина недостаточно иммуногенна, не содержит адгезивных антигенов F41, ТЛ- и ТС-анатоксинов и О-антигенов эшерихий, что делает ее малоэффективной в ряде хозяйств, где превалируют соответствующие возбудители, против которых вакцина не содержит антигенов. However, the known associated vaccine is not sufficiently immunogenic, does not contain adhesive antigens F41, TL and TC toxoids and O-antigens of Escherichia, which makes it ineffective in a number of farms where the corresponding pathogens prevail against which the vaccine does not contain antigens.

Технический результат изобретения заключается в повышении иммуногенной активности и расширении антигенного спектра ассоциированной вакцины, а также снижение реактогенности. The technical result of the invention is to increase the immunogenic activity and the expansion of the antigenic spectrum of the associated vaccine, as well as a decrease in reactogenicity.

Сущность изобретения заключается в следующем:
Ассоциированная вакцина против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят содержит из антигенов клостридий - суспензию клеток и B-токсин штамма Cl. perfingens типа C N 3, из антигенов эшерихий - адгезивный антиген K88 в фосфатно-мочевинном буфере, выделенный из штамма Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, адгезивный антиген K99 в фосфатно-мочевинном бефере, выделенный из штамма E.coli ВГНКИ N 454-37/17, адгезивный антиген 987P в фосфатно-мочевинном буфере, выделенный из штамма E.coli ВГНКИ N 397-37/14, адгезивный антиген F41 в фосфатно-мочевинном буфере, выделенный из штамма E.coli ВГНКИ N 398-37/14, термолабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов E.coli ВГНКИ N 334-37/12, ВГНКИ N 397-37/14 и ВГНКИ N 453-37/17, термостабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов E. coli ВГНКИ N 305-37/11, ВГНКИ N 398-37/14, суспензию клеток штамма E.coli ВГНКИ N 305-37/11 в культуральной среде, суспензию клеток штамма E.coli ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде, инактиватор-формалин и адъювант-гель гидроокиси алюминия, взятые в определенных соотношениях.The invention consists in the following:
The associated vaccine against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets contains Clostridia antigens - cell suspension and B-toxin of strain Cl. perfingens oftype CN 3, from Escherichia antigens — adhesive antigen K88 in phosphate-urea buffer isolated from Escherichia coli strain VGNKI N 453-37 / 17, adhesive antigen K99 in phosphate-urea befer isolated from E. coli strain VGNKI N4 37/17, adhesive antigen 987P in phosphate-urea buffer isolated from E. coli strain VGNKI N 397-37 / 14, adhesive antigen F41 in phosphate-urea buffer isolated from E. coli strain VGNKI N 398-37 / 14, thermolabile toxoid in the culture medium obtained by culturing E.coli strains VGNKI N 334-37 / 12, VGNKI N 397-37 / 14 and VGNKI N 453-37 / 17, thermostat a potent toxoid in the culture medium obtained by culturing E. coli strains of VGNKI N 305-37 / 11, VGNKI N 398-37 / 14, a suspension of cells of E. coli strain VGNKI N 305-37 / 11 in a culture medium, a suspension of cells of strain E .coli VGNKI N 334-37 / 12 in culture medium, inactivator-formalin and adjuvant gel of aluminum hydroxide, taken in certain proportions.

Ассоциированная вакцина согласно изобретению содержит необходимое количество протективных антигенов, обеспечивающее формирование иммунитета высокой напряженности у животных по отношениюя к энтеропатогенным эшерихиям независимо от их серогрупповой принадлежности. Вакцина содержит соматические антигены 078 и 0141 в форме анаэндотоксинов, белковые адгезивные антигены K88, K99, 987P, F41, широко распространенные полисахаридные капсульные антигены K80 и K87, термолабильный и термостабильный антитоксины, а также высокоиммуногенные анатоксины клостридий типа C. The associated vaccine according to the invention contains the necessary number of protective antigens, which ensures the formation of high tension immunity in animals with respect to enteropathogenic Escherichia, regardless of their serogroup affiliation. The vaccine contains somatic antigens 078 and 0141 in the form of anaendotoxins, protein adhesive antigens K88, K99, 987P, F41, the widely distributed polysaccharide capsular antigens K80 and K87, thermolabile and thermostable antitoxins, as well as highly immunogenic C. clostridia toxoids

Эшерихиозные антигены получают в соответствии с патентом RU N 2043771, уже упомянутом выше в качестве аналога. Escherichia antigens are obtained in accordance with patent RU N 2043771, already mentioned above as an analogue.

Клостридиозные антигены получают из нового штамма Cl. perfingens типа C N 3. Clostridiosis antigens are obtained from a new strain of Cl. perfingens type C N 3.

Штамм Cl. perfingens типа С N 3 выделен от павшего от энтеротоксемии поросенка, характеризуется следующими свойствами:
Морфологические свойства. Клетки в среде Китт-Тароцци имеют форму палочек, прямые с округленными и обрубленными концами, грамположительные, неподвижные, располагаются в форме полисада или попарно. Размер 4-8х 1,0-1,5 μ . Образуют большие овальные споры, располагающиеся центрально или субтерминально. В процессе лабораторного и производственного культивирования споры и капсулы обычно не образуются.Strain Cl. perfingens oftype C N 3 isolated from a pig sucked from enterotoxemia, characterized by the following properties:
Morphological properties. Cells in the Kitt-Tarozzi environment are stick-shaped, straight with rounded and chopped ends, gram-positive, motionless, located in the form of a polysad or in pairs. Size 4-8x 1.0-1.5 μ. Form large oval spores located centrally or subterminally. During laboratory and industrial cultivation, spores and capsules usually do not form.

Культуральные свойства. Колонки на поверхности агара Цейсслера имеют в диаметре 2 - 5 мм, круглые, куполообразной формы, от серого до зеленовато-желтого цвета с глянцевой поверхностью. Cultural properties. The columns on the Zeissler agar surface are 2-5 mm in diameter, round, domed in shape, from gray to greenish-yellow in color with a glossy surface.

Образуют три вида гемолизинов: альфа, дельта и тета. Может образовывать очень широкую грязновато-коричнесую зону гемолиза на среде с кровью овцы или коровы за счет действия дельта-токсина. Растет одинаково хорошо при температуре 37^o и 45^oC. Рост стимулируется присутствием сбраживаемых углеводов и не угнетается 20% желчью.Three types of hemolysins are formed: alpha, delta and theta. It can form a very wide muddy-brownish hemolysis zone on a medium with sheep or cow blood due to the action of delta toxin. It grows equally well at temperatures of 37^o and 45^o C. Growth is stimulated by the presence of fermentable carbohydrates and is not inhibited by 20% bile.

Ферментный свойства. Штамм образует аммиак и сероводород, восстанавливает нейтральный красный, ферментирует большинство сахаров и продуцирует лецитиназу, дезоксирибонуклеазу, рибонуклеазу, эластазу, гиалуронидазу, амилазу, нейроминидазу и гемагглютинин. Enzymatic properties. The strain forms ammonia and hydrogen sulfide, restores neutral red, ferments most sugars and produces lecithinase, deoxyribonuclease, ribonuclease, elastase, hyaluronidase, amylase, neurominidase and hemagglutinin.

Бурно свертывает молоко с образованием губчатого осадка и разжижает желатин на 3 - 5 день. Rapidly coagulates milk with the formation of a spongy sediment and liquefies gelatin on 3-5 days.

Штамм чувствителен к бактериоцинам энтерококков и продуцирует высокоактивные бактериоцины. The strain is sensitive to enterococcal bacteriocins and produces highly active bacteriocins.

Токсигенность. Бета-токсин, продуцируемый штаммом в высоком титре (20 тыс. и более ДЛМ для белых мышей массой 16 - 18 г), высоко трипсиночувствителен, состоит из единственной полипептидной цепи с молекулярной массой около 30000 Д. Его токсический эфир обусловлен увеличением проницаемости капиллярных сосудов. Продукция бета-токсина обеспечивается плазмидой. Штамм продуцирует также альфа-токсин, который является фосфолипазой C и вызывает гидролиз лецитина до фосфорилхолина и диглицерина. Toxigenicity. Beta-toxin produced by the strain in high titer (20 thousand or more DLM for white mice weighing 16 - 18 g) is highly trypsin-sensitive, consists of a single polypeptide chain with a molecular weight of about 30,000 D. Its toxic ether is due to an increase in the permeability of capillary vessels. Beta toxin production is provided by the plasmid. The strain also produces alpha toxin, which is phospholipase C and causes the hydrolysis of lecithin to phosphorylcholine and diglycerin.

Эшерихиозные антигены и клостридиозный анатоксин соединяют в определенных соотношениях согласно изобретению, доводят до нужной концентрации геля гидрата окиси алюминия в вакцине и устанавливают pH 7,2 - 7,4. Escherichial antigens and clostridial toxoid are combined in certain proportions according to the invention, adjusted to the desired concentration of the alumina hydrate gel in the vaccine, and adjusted to pH 7.2-7.4.

Полученная ассоциированная вакцина против эшерихиоза и анаэробной энтеротоксемии поросят имеет следующий состав, (на 1 л):
Суспензия клеток штамма Cl. perfingens типа C N 3 в культуральной среде, кл. - 3,8 - 4,0•10¹²
Суспензия клеток штамма E coli ВГНКИ N 334-37/12 (0141:K87:K88) в культуральной среде, кл. - 9,0•10¹²-1,0•10¹³
Суспензия клеток штамма E coli ВГНКИ N 305-37/11 (078:K80) в культуральной среде, кл. - 9,0•10¹²-1,0•10¹³
B-токсин штамма Cl. perfingens типа C N 3, ДЛМ - 1,2•10⁴-1,3•10⁴
Адгезивный антиген K88 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген K99 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген 987P в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1: 16-1:32, см³ - 60 - 80
Гидроокись алюминия, 6%-ная, см³ - 270 - 320
Формалин, см³ - 2,7 - 3,2
Термолабильный и термостабильный анатоксины эшерихий в культуральной среде с титром в РДП 1:8-1:16, л - До 1
Входящие в состав ассоциированной вакцины антигены в эффективных количествах обеспечивают синергетический эффект, проявляемый в увеличении напряженности и длительности иммунитета.The resulting associated vaccine against Escherichiosis and anaerobic enterotoxemia of piglets has the following composition (1 l):
Suspension of cells of strain Cl.perfingens type CN 3 in a culture medium, cl. - 3.8 - 4.0 • 10¹²
Suspension of cells of strain E coli VGNKI N 334-37 / 12 (0141: K87: K88) in culture medium, cl. - 9.0 • 10¹² -1.0 • 10¹³
Suspension of cells of strain E coli VGNKI N 305-37 / 11 (078: K80) in culture medium, cl. - 9.0 • 10¹² -1.0 • 10¹³
B-toxin of strain Cl.perfingens type CN 3, DLM - 1.2 • 10⁴ -1.3 • 10⁴
Adhesive antigen K88 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 16-1: 32, cm³ - 60 - 80
Adhesive antigen K99 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 16-1: 32, cm³ - 60 - 80
Adhesive antigen 987P in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 16-1: 32, cm³ - 60 - 80
Adhesive antigen F41 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 16-1: 32, cm³ - 60 - 80
Aluminum hydroxide, 6%, cm³ - 270 - 320
Formalin, cm³ - 2.7 - 3.2
Thermolabile and thermostable Escherichia toxoids in a culture medium with a titer in the RDP of 1: 8-1: 16, l - Up to 1
The antigens that are part of the associated vaccine in effective amounts provide a synergistic effect, manifested in an increase in tension and duration of immunity.

Пример 1. Для изготовления клостридиозного компонента ассоциированной вакцины производственный штамм Cl. perfingens типа C N 3 выращивают на мясо-печеночно-казеиновой среде в реакторе в течение 4 - 6 часов при температуре 37 - 38^oC до накопления не менее 4 млрд/см³ микробных клеток, проверяют токсичность выращенной культуры на белых мышах, которые должны погибнуть после внутривенного введения 0,5 см³ культуры в срок до 24 часов.Example 1. For the manufacture of the clostridiosis component of an associated vaccine, a production strain of Cl. perfingens oftype CN 3 are grown on a meat-liver-casein medium in a reactor for 4-6 hours at a temperature of 37-38^o C until at least 4 billion / cm^{3 of} microbial cells are accumulated, the toxicity of the grown culture is checked on white mice that must die after intravenous administration of 0.5 cm³ culture for up to 24 hours.

Для изготовления вакцины используют культуру, содержащую не менее 6000 ДЛМ/см³ для белых мышей. В реактор добавляют формалин до 0,65%-ной концентрации и выдерживают 8 суток при температуре 37 - 38^oC, добавляют 3%-ную гидроокись алюминия до 20%-ной концентрации, выдерживают 2 - 5 суток и удаляют 50% общего объема надосадочной жидкости. К осадку добавляют расплавленный агар-агар до 0,05%-ной концентрации, устанавливают pH 7,4 - 7,6.For the manufacture of vaccines using a culture containing at least 6000 DLM / cm³ for white mice. Formalin is added to the reactor to a concentration of 0.65% and held for 8 days at a temperature of 37 - 38^o C, 3% aluminum hydroxide is added to a 20% concentration, maintained for 2 to 5 days and 50% of the total supernatant volume is removed liquids. Melted agar-agar was added to the precipitate to a 0.05% concentration, and a pH of 7.4-7.6 was established.

Эшерихиозный компонент получают из следующих штаммов:
1. Escherichia coli ВГНКИ N305-37/11 (078:K80).The Escherichia component is obtained from the following strains:
1. Escherichia coli VGNKI N305-37 / 11 (078: K80).

2. Escherichia coli ВГНКИ N334-37/12 (0141:K87:K88). 2. Escherichia coli VGNKI N334-37 / 12 (0141: K87: K88).

3. Escherichia coli ВГНКИ N453-37/17 (0115:K88). 3. Escherichia coli VGNKI N453-37 / 17 (0115: K88).

4. Escherichia coli ВГНКИ N454-37/17 (0141:K99). 4. Escherichia coli VGNKI N454-37 / 17 (0141: K99).

5. Escherichia coli ВГНКИ N397-37/14 (09:K103:987P). 5. Escherichia coli VGNKI N397-37 / 14 (09: K103: 987P).

6. Escherichia coli ВГНКИ N398-37/14 (0101:F41). 6. Escherichia coli VGNKI N398-37 / 14 (0101: F41).

Штаммы известны и охарактеризованы в патенте RU N 2043771. The strains are known and characterized in patent RU N 2043771.

Штаммы выращивают раздельно в бульоне Хоттингера, содержащем аминный азот - 150 - 200 мг%, триптофан - 50 - 100 мг% при pH 7,8 - 8,0. The strains are grown separately in the Hottinger broth containing amine nitrogen - 150 - 200 mg%, tryptophan - 50 - 100 mg% at pH 7.8 - 8.0.

Выращенные культуры шт. NN397-37/14, 398-37/14, 453-37/17, 454-37/17 отделяют от культуральной жидкости на сепараторе или центрифуге при 10 - 15 тыс. об/мин. Культуральную жидкость сливают в отдельную емкость и определяют концентрацию ТЛ и ТС токсинов в реакции диффузной преципитации (РДП). Cultivated cultures pcs. NN397-37 / 14, 398-37 / 14, 453-37 / 17, 454-37 / 17 are separated from the culture fluid in a separator or centrifuge at 10-15 thousand rpm. The culture fluid is poured into a separate container and the concentration of TL and TS of toxins in the diffuse precipitation (RDP) reaction is determined.

Титр ТС и ТЛ-токсинов в культуральной жидкости должен быть не менее 1: 4-1:8. The titer of TS and TL-toxins in the culture fluid should be at least 1: 4-1: 8.

Бактериальную массу штаммов ресуспендируют в фосфатно-мочевинном буфере до концентрации не менее 100 млрд/см³ микробных клеток, прогревают при температуре 60 - 65^oC в течение 20 - 25 мин, супернатант отделяют от бактериальной массы и проверяют на концентрацию адгезивного антигена в РДП. Титр каждого антигена в супернатанте должен быть не менее 1:16.The bacterial mass of the strains is resuspended in phosphate-urea buffer to a concentration of at least 100 billion / cm^{3 of} microbial cells, heated at a temperature of 60 - 65^o C for 20 - 25 min, the supernatant is separated from the bacterial mass and checked for the concentration of adhesive antigen in the RDP. The titer of each antigen in the supernatant should be at least 1:16.

Полученные супернатанты смешивают в равных частях, консервируют формалином до 0,3%-ной концентрации и используют для изготовления вакцины. Бактериальную массу утилизируют. The resulting supernatants are mixed in equal parts, canned with formalin to 0.3% concentration and used for the manufacture of the vaccine. The bacterial mass is disposed of.

В выращенных культурах штаммов NN305-37/11 и 334-37/12 определяют концентрацию микробных клеток и разбавляют культуральной средой, полученной при выращивании штаммов NN397-37/14, 398-37/14, 453-37/17, 454-37/17, до концентрации 15,0 - 16,0 млрд/см³ микробных клеток. Культуры штаммов 305-37/11 и 334-37/12 смешивают в равных частях, добавляют формалин до 0,3%-ной концентрации, выдерживают 15 - 16 дней при температуре 37 - 38^oC. Затем добавляют содержащий адгезивные антигены супернатант до 25 - 30%-ной концентрации, гидроокись алюминия 6%-ную до 30%-ной концентрации и дополнительно формалин до 0,12 - 0,15%-ной концентрации.In the grown cultures of strains NN305-37 / 11 and 334-37 / 12, the concentration of microbial cells is determined and diluted with the culture medium obtained by growing strains NN397-37 / 14, 398-37 / 14, 453-37 / 17, 454-37 / 17, to a concentration of 15.0 - 16.0 billion / cm^{3 of} microbial cells. The cultures of strains 305-37 / 11 and 334-37 / 12 are mixed in equal parts, formalin is added to 0.3% concentration, incubated for 15-16 days at a temperature of 37 - 38^o C. Then a supernatant containing adhesive antigens is added up to 25 - 30% concentration, aluminum hydroxide 6% to 30% concentration and additionally formalin to 0.12 - 0.15% concentration.

Доводят pH 10%-ным раствором NaOH до 7,2 - 7,4, оставляют вакцину при температуре 10 - 22^oC на 8 - 10 часов и удаляют половину надосадочной жидкости. Проводят контроль на стерильность, безвредность и активность.The pH was adjusted with a 10% NaOH solution to 7.2-7.4, the vaccine was left at a temperature of 10-22^o C for 8-10 hours and half of the supernatant was removed. They monitor for sterility, safety and activity.

Клостридиозный и эшерихиозный компоненты смешивают в соотношении 1:1, доводят концентрацию 6%-ным гелем гидрата окиси алюминия до его 30%-ного содержания в вакцине и устанавливают pH 7,2 - 7,4. Clostridiosis and Escherichia components are mixed in a 1: 1 ratio, the concentration is adjusted with a 6% gel of alumina hydrate to its 30% content in the vaccine and the pH is adjusted to 7.2 - 7.4.

Полученную ассоциированную вакцину против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят расфасовывают во флаконы емкостью 100 - 200 см³, контролируют внешний вид, наличие посторонних примесей, концентрацию водородных ионов, стерильность, безвредность и иммуногенность.The resulting associated vaccine against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets is packaged in bottles with a capacity of 100 - 200 cm³ , control the appearance, the presence of impurities, the concentration of hydrogen ions, sterility, harmlessness and immunogenicity.

Получают 3 серии ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят при следующем соотношении компонентов (табл. 1). Get 3 series of associated vaccines against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets in the following ratio of components (table. 1).

Пример 2. Активность ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят проверяют в сравнении с моновакцинами против анаэробной энтеротоксемии поросят и против эшерихиоза животных. Example 2. The activity of the associated vaccine against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets is tested in comparison with mono-vaccines against anaerobic enterotoxemia of piglets and against escherichiosis of animals.

Иммуногенную активность вакцины против энтеротоксемии проводят путем двукратной иммунизации 6 кроликов массой 2,0 - 2,5 кг с интервалами между введениями 18 - 20 суток. Препарат в дозе 4 см³ вводят в мышцы конечности с внутренней стороны бедра.The immunogenic activity of the vaccine against enterotoxemia is carried out by double immunization of 6 rabbits weighing 2.0 - 2.5 kg with intervals between administrations of 18 to 20 days. The drug in a dose of 4 cm³ is injected into the muscles of the limbs from the inside of the thigh.

Через 18 - 20 суток после второй инъекции в сыворотке крови каждого кролика определяют титр антитоксических антител в реакции нейтрализации токсина Cl. perfingens типа C на белых мышах. After 18 to 20 days after the second injection in the blood serum of each rabbit, the titer of antitoxic antibodies in the neutralization reaction of Cl toxin is determined. type C perfingens on white mice.

Вакцина считается активной против энтеротоксемии, если сыворотка крови кроликов, в опыте постановки реакции нейтрализации, предохраняет не менее двух мышей из трех, взятых в опыт, при гибели всех контрольных животных. Такая сыворотка содержит от 0,15 до 0,3 АЕ анатоксина. The vaccine is considered active against enterotoxemia if the blood serum of rabbits, in the experience of setting the neutralization reaction, protects at least two of the three mice taken in the experiment, with the death of all control animals. Such a serum contains from 0.15 to 0.3 AU of the toxoid.

Иммуногенную активность вакцины к эшерихиям проверяют на 40 белых мышах массой 18 - 20 г. Вакцину вводят 20 мышам подкожно двукратно с интервалом 7 - 10 суток в дозе 0,2 см³, а 20 мышей не вакцинируют. Через 16 - 18 суток после введения второй дозы вакцины животным вводят внутрибрюшинно подтитрованную смертельную дозу двух контрольных штаммов эшерихий серогрупп 0141, 078, используя на штамм каждой серогруппы 10 вакцинированных и 10 невакцинированных животных.The immunogenic activity of the vaccine against Escherichia is tested on 40 white mice weighing 18 to 20 g. The vaccine is administered to 20 mice subcutaneously twice with an interval of 7 to 10 days at a dose of 0.2 cm³ , and 20 mice are not vaccinated. 16-18 days after the administration of the second dose of the vaccine, the animals were injected intraperitoneally with a lethal dose of two control strains of Escherichia serogroups 0141, 078, using 10 vaccinated and 10 unvaccinated animals for each serogroup strain.

Вакцину считают активной при выживании не менее 7 из 10 вакцинированных и гибели не менее 8 невакцинированных контрольных белых мышей в каждой из групп. The vaccine is considered active in the survival of at least 7 out of 10 vaccinated and the death of at least 8 unvaccinated control white mice in each group.

Концентрацию адгезивных и капсульных антигенов в вакцине против эшерихиоза проверяют на 6 кроликах массой 3,0 - 3,5 кг, которые вводят внутрибрюшинно или внутримышечно вакцину в дозе 0,75 см³. Через 24 - 27 дней у кроликов берут кровь и исследуют сыворотку в реакции агглютинации, используя в качестве антигенов производственные и моноплазмидные штаммы-продуценты адгезивных антигенов K12:K38, K12:K99, K12:987P, K12:F41.The concentration of adhesive and capsular antigens in the vaccine against Escherichiosis is checked on 6 rabbits weighing 3.0 - 3.5 kg, which is administered intraperitoneally or intramuscularly at a dose of 0.75 cm³ . After 24 - 27 days, blood was drawn from rabbits and the serum was examined in the agglutination reaction using production and monoplasmid strains producing adhesive antigens K12: K38, K12: K99, K12: 987P, K12: F41 as antigens.

Результаты сравнительной оценки активности ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят и соответствующих моновакцин, полученных на лабораторных животных, показывают, что ассоциированная вакцина вызывает формирование иммунитета большей напряженности, чем моновакцины. Содержащиеся в ассоциированной вакцине антигены не проявляют конкурентного действия по отношению друг к другу, напротив, во всех случаях при проверке трех серий вакцин зарегистрирован синергетический эффект. The results of a comparative evaluation of the activity of the associated vaccine against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets and the corresponding mono-vaccines obtained in laboratory animals show that the associated vaccine causes the formation of immunity of greater tension than mono-vaccines. The antigens contained in the associated vaccine do not show a competitive effect in relation to each other; on the contrary, in all cases, when testing three series of vaccines, a synergistic effect was recorded.

Пример 3. Ассоциированную вакцину против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят вводят супоросным свиноматкам внутримышечно двукратно с интервалом между введениями 15 - 20 дней в дозах 5 и 5 см³.Example 3. The associated vaccine against anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets is administered to pregnant sows intramuscularly twice with an interval between administrations of 15 to 20 days at doses of 5 and 5 cm³ .

Эффективность вакцины оценивают по количеству заболевших и павших от анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят в неблагополучных по этим инфекциям свиноводческих хозяйствах. The effectiveness of the vaccine is assessed by the number of sick and dead from anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets in pig farms unsuccessful for these infections.

Иммунитет формируется через 2 недели после начала вакцинации и длится не менее 6 месяцев. Immunity is formed 2 weeks after the start of vaccination and lasts at least 6 months.

Производственные испытания вакцины подтвердили его безвредность и противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности отдельных компонентов ассоциированной вакцины. Production trials of the vaccine confirmed its safety and antiepizootic efficacy, manifested in enhancing the immunizing activity of the individual components of the associated vaccine.

Claims (1)

Translated fromRussian

Вакцина, ассоциированная против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоза поросят, содержащая антигены клостридий, антигены эшерихий, инактиватор формалин и адъювант, отличающаяся тем, что из антигенов клостридий она содержит В-токсин и суспензию клеток штамма Clostridium perfringens типа C N 3, из антигенов эшерихий - адгезивные антигены K88, K99, 987P, F41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, выделенные из штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, Escherichia coli ВГНКИ N 454-37/17, Escherichia coli ВГНКИ N 397-37/14 и Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14 соответственно, термолабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 331-37/12, Escherichia coli ВГНКИ N 397-37/14 и Escherichia coli ВГНКИ N 453-37/17, термостабильный анатоксин в культуральной среде, полученный при культивировании штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 и Escherichia coli ВГНКИ N 398-37/14, суспензию клеток штаммов Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 и Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде, из адъювантов - гель гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов на 1 л вакцины:
Суспензия клеток штамма Clostridium perfinges типа C N 3 в культуральной среде, кл. - 3,8 • 10¹² - 4,0 • 10¹²
Суспензия клеток штамма Escherichia coli ВГНКИ N 334-37/12 в культуральной среде, кл. - 9,0 • 10¹² - 1,0 • 10¹³
Суспензия клеток штамма Escherichia coli ВГНКИ N 305-37/11 в культуральной среде, кл. - 9,0 • 10¹² - 1,0 • 10¹³
B-токсин штамма Clostridium perfringens типа C N 3, ДЛМ - 1,2 • 10⁴ - 1,3 • 10⁴
Адгезивный антиген K88 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген K99 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген 987P в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Адгезивный антиген F 41 в фосфатно-мочевинном буфере с титром в РДП 1 : 16 - 1 : 32, см³ - 60 - 80
Гидроокись алюминия, 6%-ная, см³ - 270 - 320
Термолабильный и термостабильный анатоксины в культуральной среде с титром в РДП 1 : 8 - 1 : 16, л - До 1A vaccine associated with anaerobic enterotoxemia and escherichiosis of piglets containing Clostridia antigens, Escherichia antigens, a formalin inactivator and adjuvant, characterized in that it contains B-toxin and Clostridium perfringens antigens of antigens of type CN 3 antigens from Clostridia antigens, K88, K99, 987P, F41 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP of 1: 16 - 1: 32, isolated from Escherichia coli strains of VGNKI N 453-37 / 17, Escherichia coli of VGNKI N 454-37 / 17, Escherichia coli VGNKI N 397-37 / 14 and Escherichia coli VGNKI N 398-37 / 14, respectively, thermolabile toxoid in the culture medium obtained by cultivating the strains of Escherichia coli VGNKI N 331-37 / 12, Escherichia coli VGNKI N 397-37 / 14 and Escherichia coli VGNKI N 453-37 / 17, thermostable toxoid in the culture medium obtained by culturing strains of Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11 and Escherichia coli VGNKI N 398-37 / 14, a suspension of cells of strains of Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11 and Escherichia coli VGNKI N 334-37 / 12 in a culture medium, from adjuvants - aluminum hydroxide gel in the following ratio of components per 1 liter of vaccine:
A suspension of cells of a strain of Clostridium perfinges type CN 3 in a culture medium, cl. - 3.8 • 10¹² - 4.0 • 10¹²
Suspension of cells of the strain Escherichia coli VGNKI N 334-37 / 12 in culture medium, cl. - 9.0 • 10¹² - 1.0 • 10¹³
Suspension of cells of the strain Escherichia coli VGNKI N 305-37 / 11 in culture medium, cl. - 9.0 • 10¹² - 1.0 • 10¹³
B-toxin of the strain Clostridium perfringens type CN 3, DLM - 1.2 • 10⁴ - 1.3 • 10⁴
Adhesive antigen K88 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP of 1: 16 - 1: 32, cm³ - 60 - 80
Adhesive antigen K99 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP 1: 16 - 1: 32, cm³ - 60 - 80
Adhesive antigen 987P in phosphate-urea buffer with a titer in RDP of 1: 16 - 1: 32, cm³ - 60 - 80
Adhesive antigen F 41 in phosphate-urea buffer with a titer in RDP of 1: 16 - 1: 32, cm³ - 60 - 80
Aluminum hydroxide, 6%, cm³ - 270 - 320
Thermolabile and thermostable toxoids in a culture medium with a titer in the RDP of 1: 8 - 1: 16, l - Up to 1

Images