RU2125887C1 - Method of liposomal interferon preparing - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves mixing a liposomal carrier prepared from soybean food vegetable oil production waste with cholesterol and alpha-tocopherol, dissolving in chloroform, evaporation up to thin layer formation, nitrogen blowing for 1 h followed by addition of interferon, treatment by ultrasonic oscillation, dispersing and pasteurization. EFFECT: enhanced effectiveness of interferon incorporation. 2 ex, 5 tbl, 1 dwg

Description

Translated fromRussian

Известны средства, помогающие повышению проницаемости клеток. Это липосомы. Однако липосомальные формы интерферона, изученные в эксперименте на животных (Eppstein D. A. 1982 г.; Мельников В.Р. с соавт., 1990) для медицинских целей не создавались и не применялись, α - интерферон (человеческих лейкоцитарный) представляет собой низкомолекулярный пептид, водорастворимый с молекулярной массой 17,5 КД, содержащий две дисульфидные связи (Овчинников Ю.А., Биоорганическая химия, 1987, с. 224-226). Known agents that help increase cell permeability. These are liposomes. However, the liposomal forms of interferon studied in an animal experiment (Eppstein DA 1982; Melnikov V.R. et al., 1990) were not created or used for medical purposes, α-interferon (human leukocyte) is a low molecular weight, water-soluble peptide with a molecular weight of 17.5 KD, containing two disulfide bonds (Ovchinnikov Yu.A., Bioorganic chemistry, 1987, p. 224-226).

При этом применяемый для лечения водный раствор интерферона лабилен и не защищен от действия протеаз, имеющихся в биологических жидкостях организма (Мельников В.Д., соавт., 1990). At the same time, the aqueous solution of interferon used for treatment is labile and not protected from the action of proteases present in body fluids (V. Melnikov, et al., 1990).

Целью настоящего изобретения явилась разработка способа приготовления липосомального лейкоцитарного α -интерферона и оценка его терапевтической эффективности в сравнении с нативными. The aim of the present invention was to develop a method for the preparation of liposomal leukocyte α-interferon and evaluate its therapeutic efficacy in comparison with native ones.

Наиболее близок к предлагаемому способу классический метод получения МЛЛ-везикул, описанный в информации: WO 91/01710, 21.02.91 г., КЛ⁶ A 61 A 37 K 37/66, учитывающий добавление к смеси липидов, включающей яичный лецитин, холестерин и фосфатидилсерин в молярном соотношении 2:1:0,33 антоксиданта альфа-токоферола в количестве 1%. Смесь растворяют в хлороформе и выпаривают из раствора под азотом. Липидную пленку ресуспендируют в фосфатном буфере при pH 7, содержащем человеческий рекомбинантный альфа-интерферон и альбумин, смесь озвучивают от 10' до 30' мин. и невключенный интерферон удаляют центрифугированием. Липосомы содержали 1,8 • 10⁷ МЕ на 1 мл.Closest to the proposed method is the classical method for producing MLL vesicles described in the information: WO 91/01710, 02.21.91, CL⁶ A 61 A 37 K 37/66, taking into account the addition of lipids to the mixture, including egg lecithin, cholesterol and phosphatidylserine in a molar ratio of 2: 1: 0.33 alpha-tocopherol antioxidant in an amount of 1%. The mixture was dissolved in chloroform and evaporated from the solution under nitrogen. The lipid film is resuspended in phosphate buffer at pH 7 containing human recombinant alpha interferon and albumin, the mixture is voiced from 10 'to 30' min. and unincorporated interferon is removed by centrifugation. Liposomes contained 1.8 • 10⁷ IU per 1 ml.

Целью настоящего изобретения явилась разработка способа интерферона и оценка его терапевтической эффективности в сравнении с нативным. Для достижения цели были использованы:
1. Официальный препарат лейкоцитарного человеческого интерферона - реаферон производства НПО "Иммунопрепарат" г. Уфа, разрешенный к применению в медицинской практике по ФС 42-247 ВС-91.The aim of the present invention was to develop a method of interferon and evaluate its therapeutic efficacy in comparison with native. To achieve the goal were used:
1. The official preparation of human leukocyte interferon is Reaferon produced by the NGO Immunopreparat, Ufa, approved for use in medical practice according to FS 42-247 BC-91.

2. Липосомная основа, приготовленная нами из очищенных нами же отходов производства пищевых соевых растительных масел (схема 1). 2. The liposome base prepared by us from the same waste products of the production of edible soybean vegetable oils that we cleaned (Scheme 1).

3. Комплексная липосомальная форма препарата интерферона, изготовленная нами с учетом рекомендаций В.Р.Мельникова с соавт. (1990). Липосомальную основу готовили следующим образом: производили очистку сырого фосфолипидного концентрата - отхода при производстве пищевых масел на масложиркомбинатах. Очистку фосфолипидного коммерческого соевого концентрата производили с учетом рекомендаций Л. Д.Бергельсона (1981) путем многократной переэкстракции хлороформом, этанолом переосаждением охлажденным ацетоном по разработанной нами схеме 1 "Выделение, очистка и анализ липидного носителя для конструирования липосом из отходов производства пищевых соевых растительных масел". 3. The complex liposomal form of the preparation of interferon, made by us taking into account the recommendations of V. R. Melnikov et al. (1990). The liposomal base was prepared as follows: the crude phospholipid concentrate was purified — waste in the production of edible oils at oil and fat plants. Purification of the phospholipid commercial soybean concentrate was carried out taking into account the recommendations of L. D. Bergelson (1981) by repeatedly reextracting with chloroform, ethanol by reprecipitation with chilled acetone according to our scheme 1 "Isolation, purification and analysis of a lipid carrier for constructing liposomes from the waste products of edible soybean vegetable oils" .

Химический состав фосфолипидов очищенного соевого фосфолипидного концентрата приведен в табл. 1. The chemical composition of phospholipids purified soybean phospholipid concentrate are given in table. 1.

Экспериментальные исследования по использованию очищенного суммарного фосфолипидного носителя в медицине показали, что он нетоксичен, не обладает парогенными свойствами и хорошо усваивается организмом. Состав очищенного суммарного фосфолипидного концентрата имеет большее сродство к фракционному профилю внутренних органов - детоксикантов у человека - печени и почек, нежели состав фосфолипидов куриного желтка (табл. 2). Experimental studies on the use of a purified total phospholipid carrier in medicine have shown that it is non-toxic, does not have steamogenic properties and is well absorbed by the body. The composition of the purified total phospholipid concentrate has a greater affinity for the fractional profile of internal organs - detoxicants in humans - liver and kidneys than the composition of chicken yolk phospholipids (Table 2).

Таким образом, фосфолипидный носитель, приготовленный по нашей технологии можно считать более гомологичным для человека, нежели традиционно используемый яичный фосфолипид. Thus, the phospholipid carrier prepared by our technology can be considered more homologous to humans than the traditionally used egg phospholipid.

Препарат производственного интерферона подготавливали к использованию так: одну ампулу интерферона, содержащую 1 млн ME разводили таким образом в стерильном физрастворе, что концентрация составила от 1 млн МЕ до 250000 МЕ/см³. Использовали сразу же после приготовления.A preparation of industrial interferon was prepared for use as follows: one ampoule of interferon containing 1 million ME was diluted in sterile saline in such a way that the concentration ranged from 1 million IU to 250,000 IU / cm³ . Used immediately after preparation.

Липосомальную форму интерферона готовили по следующей методике в два этапа. The liposomal form of interferon was prepared according to the following procedure in two stages.

I. , Первый этап. Смешивают 100 мг очищенных фосфолипидов сои в 10 мл CHCl₃ 20 мг холестерина (соотношение 5:1), v/v в р-ре хлороформа и 4 мг антиоксиданта альфа-токаферола в растворе этанола. Полученный раствор упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре 35^o-40^oC до образования тонкой пленки холестерин /антиоксидант/ фосфолипид. Полученную пленку аэрируют в течение 1 часа с помощью азота для предотвращения окислительных процессов.I., The first stage. 100 mg of purified soybean phospholipids are mixed in 10 ml of CHCl_3, 20 mg of cholesterol (5: 1 ratio), v / v in chloroform solution and 4 mg of alpha-tocoferol antioxidant in ethanol solution. The resulting solution was evaporated on a rotary vacuum evaporator at a temperature of 35^o -40^o C to form a thin film of cholesterol / antioxidant / phospholipid. The resulting film is aerated for 1 hour with nitrogen to prevent oxidative processes.

II. На втором этапе вводят свежеприготовленный интерферон в физрастворе от 1 млн МЕ до 250000 мг/см³, объемом от 1 до 5 см³. Содержимое колбы диспергируют и затем озвучивают в течение 10 минут трехкратно при 22 кГц при 10^oC. Суспензию липосом отделяют от невключенного интерферона центрифугированием при 10000 об/мин в течение 45 минут. Надосадочную жидкость сливают. Определяют в ней содержание невключенного интерферона спектрофотометрическим методом на приборе СФ-4 при рабочей длине 280 нм с использованием стандартной калибровочной кривой по интерферону.II. At the second stage, freshly prepared interferon is introduced in saline from 1 million IU to 250,000 mg / cm³ , with a volume of 1 to 5 cm³ . The contents of the flask were dispersed and then voiced for 10 minutes three times at 22 kHz at 10^° C. The liposome suspension was separated from unincorporated interferon by centrifugation at 10,000 rpm for 45 minutes. The supernatant is drained. The content of unincorporated interferon is determined in it by the spectrophotometric method on an SF-4 device at a working length of 280 nm using a standard calibration curve for interferon.

Получают липосомный комплекс следующего состава, мг/мл
фосфолипиды - 20 мг
холестерин - 4 мг
антиоксидант - 2 мг
интерферон - 12,5 мг
физиологический р-р - до 3 мл;
соотношение компонентов 1:5:0,1:0,5.Get the liposome complex of the following composition, mg / ml
phospholipids - 20 mg
cholesterol - 4 mg
antioxidant - 2 mg
interferon - 12.5 mg
physiological solution - up to 3 ml;
ratio of components 1: 5: 0.1: 0.5.

При запредельных отношениях фосфолипидов/физраствор не достигается максимальной стабильности липосом, а при запредельных отношениях фосфолипиды/ интерферон увеличивается содержание интерферона невключенного. With transcendental ratios of phospholipids / saline, the maximum stability of liposomes is not achieved, and with transcendental ratios of phospholipids / interferon, the content of interferon not included increases.

Коэффициент включения интерферона 55-65%. Сравнительная эффективность включения интерферона в различные носители помещена в табл. 3. The interferon inclusion coefficient is 55-65%. The comparative efficacy of incorporating interferon into various carriers is given in table. 3.

Для безопасности применения липосомальный интерферон подвергали пастеризации при 40^oC последующим контролем возможного присутствия бактериальных примесей методом посева готового препарата на питательную среду, термостатирования посевов при комнатной температуре (+22^o, +25^oC) и в условиях термостата (+37^oC). При отсутствии роста в течение 5 суток (визуальный и стериомикроскопический контроль) препарат считался стерильным и готовым к применению.For safety of use, liposomal interferon was pasteurized at 40^o C followed by monitoring the possible presence of bacterial impurities by inoculating the finished product on a nutrient medium, temperature control of the crops at room temperature (+22^o , +25^o C) and in thermostat (+37^o C) . In the absence of growth for 5 days (visual and steriomicroscopic control), the drug was considered sterile and ready for use.

Для терапевтического лечения в условиях гинекологического стационара центра по профилактике и лечению СПИДа было отобрано 60 женщин волонтеров, страдающих урогенетальным герпесом. Все они получали общепринятое лечение, согласно существующей инструкции, в том числе и местно интерферон, но в отличие от контрольной группы больных этим заболеванием, леченых нативным интерфероном, опытная группа женщин-волонтеров получала тот же препарат той же серии производства, но в липосомальной форме. 60 women volunteers suffering from urogenital herpes were selected for therapeutic treatment in the gynecological hospital of the AIDS prevention and treatment center. All of them received conventional treatment according to the existing instructions, including topical interferon, but unlike the control group of patients with this disease treated with native interferon, an experienced group of female volunteers received the same drug of the same production series, but in liposome form.

Оценку сравнительной эффективности проводили по 16-бальной системе, в которой учитывались субъективные ощущения - боль, зуд, гиперемия, отек, высыпания - везикулы и эрозии. Дополнительными критериями служили время начала признаков остановки патологического процесса, продолжительность острого периода, периода ремиссии, катамнестические сведения за время наблюдения - частоту обострений. При этом учитывался и экономический эффект: средняя стоимость койко-дня, применяемого интерферона, оборачиваемость коечного фонда и прочие медико-социальные и экономические признаки. Assessment of comparative effectiveness was carried out according to a 16-point system, which took into account subjective sensations - pain, itching, hyperemia, edema, rashes - vesicles and erosion. Additional criteria were the time of onset of signs of stopping the pathological process, the duration of the acute period, the period of remission, follow-up information during the observation period - the frequency of exacerbations. At the same time, the economic effect was taken into account: the average cost of a bed-day, the interferon used, the turnover of the bed fund, and other medical, social and economic signs.

Результаты сравнительной оценки медико-социальной эффективности и экономической ценности предлагаемого способа представлены в табл. 4, 5. The results of a comparative assessment of medical and social effectiveness and economic value of the proposed method are presented in table. 4, 5.

Пример 1. Больная С., 32 лет, диагноз - рецидивирующий генитальный герпес. Заболела 5 лет назад после случайного полового контакта, перенесла острую форму инфекции в течение 3 недель, с лихорадкой, болезненностью, гиперемией, отеком, обширными высыпаниями на половых органах. Лечение - местное. После чего 6-8 раз в году появляются рецидивы генитального герпеса с менее выраженной симптоматикой, продолжающиеся 7-9 дней. В течение 6 месяцев получает иммунокоррегирующее, противовирусное лечение - ацикловиром, местное лечение - водным раствором интерферона, на фоне которого купирование местных симптомов происходит за 4-5 дней. Example 1. Patient S., 32 years old, the diagnosis of recurrent genital herpes. She fell ill 5 years ago after accidental sexual intercourse, suffered an acute form of infection for 3 weeks, with fever, soreness, hyperemia, edema, extensive rashes on the genitals. The treatment is local. After that, relapses of genital herpes with less severe symptoms appear for 6-8 times a year, lasting 7-9 days. Within 6 months, receives immunocorrective, antiviral treatment with acyclovir, local treatment with an aqueous solution of interferon, against which local symptoms stop in 4-5 days.

При применении липосомального интерферона симптомы купируются за 2-3 дня. When using liposomal interferon, symptoms stop in 2-3 days.

Пример 2. Больная Г. , 18 лет, диагноз - рецидивирующий генитальный герпес. Заболела 2 года назад после нетрадиционного полового контакта. Example 2. Patient G., 18 years old, the diagnosis of recurrent genital herpes. She became ill 2 years ago after non-traditional sexual contact.

Перенесла острую форму инфекции, продолжающуюся 4 недели. После чего через 1-2 месяца возникают рецидивы заболевания до или после менструации. С течением времени высыпания становятся более болезненными, обширными, периоды обострений сопровождаются лихорадкой. She suffered an acute infection lasting 4 weeks. Then, after 1-2 months, relapses of the disease occur before or after menstruation. Over time, rashes become more painful, extensive, periods of exacerbations are accompanied by fever.

В течение 6 месяцев получает лечение - ацикловир, реадгерон, противогерпетический - глобулин, местно - водный раствор интерферона. Within 6 months he receives treatment - acyclovir, readgeron, antiherpetic - globulin, topically - aqueous solution of interferon.

Купирование симптомов происходило за 4-5 дней; При использовании липосомального интерферона симптомы купировались за 1-2 дня. Relief of symptoms occurred within 4-5 days; When using liposomal interferon, the symptoms stopped in 1-2 days.

Все больные отмечали хорошую переносимость препарата, его впитываемость кожей, слизистыми, отсутствие аллергических реакций. All patients noted good tolerability of the drug, its absorption by the skin, mucous membranes, and the absence of allergic reactions.

Расчет ведется исходя из стоимости 1 ампулы 1,6 тыс. рублей. Расчет предотвращенного экономического ущерба в связи с затратами на лечение 100 больных. The calculation is based on the cost of 1 ampoule of 1.6 thousand rubles. Calculation of prevented economic damage in connection with the cost of treatment of 100 patients.

Расчет сделан на основе Методической рекомендации ЦНИО НИУ 1 ММИ им. И. М.Сеченова, Москва, 1984 г. The calculation is made on the basis of the Methodological recommendation of the Central Scientific Research Institute NRU 1 MMI named after I.M.Sechenova, Moscow, 1984

Способ лечения Липосом. И.Ф. The method of treatment of liposomes. I.F.

1,6 • 5 • 10 = 900 тыс. рублей. 1.6 • 5 • 10 = 900 thousand rubles.

Способ лечения водным раствором интерферона
1,6 • 25 • 100 = 4 млн. руб.A method of treating an aqueous solution of interferon
1.6 • 25 • 100 = 4 million rubles.

Таким образом экономический эффект предлагаемого способа лечения определяется тем, что он обходится государству в 40 раз дешевле. Thus, the economic effect of the proposed method of treatment is determined by the fact that it costs thestate 40 times cheaper.

Как следует из приведенных данных экономический эффект применения липосомального препарата больше. As follows from the above data, the economic effect of using a liposome preparation is greater.

Все сказанное позволяет уменьшить лечебные дозы препарата в 5 раз. Препарат обладает направленным действием. Данный липосомальный комплекс интерферона привлекателен как средство доставки во внутриклеточную среду. Все это значительно повышает эффективность препарата и определяет его деятельное использование для лечения урогенитального герпеса и других инфекционных заболеваний. All of the above allows to reduce the therapeutic dose of the drug by 5 times. The drug has a directed action. This interferon liposome complex is attractive as a means of delivery to the intracellular environment. All this significantly increases the effectiveness of the drug and determines its active use for the treatment of urogenital herpes and other infectious diseases.

На основании медико-социальной и экономических преимуществ предлагается следующая формула изобретения. Based on medical, social and economic advantages, the following claims are proposed.

Claims (1)

Translated fromRussian

Способ приготовления липосомального интерферона, отличающийся тем, что в липосомальный носитель, приготовленный из отходов производства соевых пищевых растительных масел, имеющий следующий фракционный состав суммарных фосфолипидов, %:
Фосфатидилхолин - 32,0
Фосфатидилэтаноламин - 21,0
Фосфатидилсерин - 3,0
Фосфатидилинозин - 18,0
Фосфатидная кислота - 2,0
Фитогликолипиды - 15,0
Другие - 9,5
вводят холестерин в качестве антиоксиданта - альфа-токоферол, растворяют в хлороформе, упаривают до образования тонкой пленки, продувают азот в течение 1 ч и добавляют интерферон в физрастворе активностью 208 - 250 тысяч ME, диспергируют и после ультраозвучивания пастеризуют при 80^oC.A method of preparing a liposomal interferon, characterized in that in a liposomal carrier prepared from waste products of soybean edible vegetable oils, having the following fractional composition of total phospholipids,%:
Phosphatidylcholine - 32.0
Phosphatidylethanolamine - 21.0
Phosphatidylserine - 3.0
Phosphatidylinosine - 18.0
Phosphatidic acid - 2.0
Phytoglycolipids - 15.0
Others - 9.5
enter cholesterol as an antioxidant - alpha-tocopherol, dissolve in chloroform, evaporate to form a thin film, purge nitrogen for 1 h and add interferon in saline with an activity of 208 - 250 thousand ME, disperse and pasteurize at 80^o C. after ultra sounding.

Images