RU1615918C - Adjuvant - Google Patents

Abstract

FIELD: veterinary medicine; immunology. SUBSTANCE: adjuvant has poly-alpha-olefin oil and emulsifier taken in the following proportions of ingredients in by mass: poly-alpha-olefin oil 55-59, emulsifier 5-15. Sorbitanol oleate, pentaerithritol oleate, anhydrous lanolin or other are useable as emulsifiers. EFFECT: lower viscosity and reactogenicity of the preparation. 7 tbl

Description

Translated fromRussian

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к масляным адъювантам, и может быть использовано в научно-исследовательской работе и биологической промышленности при разработке и производстве преимущественно средств специфической профилактики ящура для всех видов сельскохозяйственных животных. The invention relates to veterinary virology, namely to oil adjuvants, and can be used in research and biological industry in the development and production of mainly means of specific prophylaxis of foot and mouth disease for all types of farm animals.

Целью изобретения является снижение вязкости и реактогенности препарата, а также повышение его адъювантных свойств. The aim of the invention is to reduce the viscosity and reactogenicity of the drug, as well as increasing its adjuvant properties.

П р и м е р 1. Готовят пять смесей ингредиентов. Сведения об этом приведены в табл.1. PRI meR 1. Prepare five mixtures of ingredients. Information about this is given in table 1.

При исследовании образцов противоящурных эмульсионных вакцин установлено, что при соотношении компонентов адъюванта 80:20 препараты обладают повышенной вязкостью (более 2000 мм²/с), а также повышенной реактогенностью. Эмульсионные препараты на основе адъюванта, приготовленного из компонентов, взятых в соотношении 97:3, являются нестабильными.In the study of samples of FMD emulsion vaccines, it was found that, with an adjuvant component ratio of 80:20, the preparations have an increased viscosity (more than 2000 mm² / s), as well as increased reactogenicity. Emulsion preparations based on adjuvant prepared from components taken in the ratio of 97: 3 are unstable.

Аналогичные результаты получают при использовании других эмульгаторов: пентаэритритоолеата, арлацела, безводного ланолина и других, стабилизирующих обратные эмульсии. Similar results are obtained using other emulsifiers: pentaerythritol oleate, arlacel, anhydrous lanolin and others stabilizing inverse emulsions.

Адъювант готовят следующие образом. Adjuvant is prepared as follows.

Эмульгатор СПАН-80 растворяют в ПАОМ в оптимальных соотношениях и стерилизуют общепринятыми методами: либо методом стерилизующей фильтрации с помощью пластин марок СФ, ЕК, УАМ-150 и т.п. при комнатной температуре, либо нагреванием в сушильном шкафу до 120-130^оС в течение 1-1,5 ч. Готовый адъювант представляет собой маслянистую жидкость цвета от светло-желтого до коричневого в зависимости от качества эмульгатора СПАН-80. Допускается слабая опалесценция. Вязкость такого адъюванта при 20^оС колеблется в пределах 12-15 мм²/с в зависимости от вязкости масляной основы. Готовый адъювант проверяют на реактогенность на белых мышах и хранят при комнатной температуре до момента использования.The SPAN-80 emulsifier is dissolved in PAOM in optimal proportions and sterilized by conventional methods: either by sterilizing filtration using plates of the SF, EK, UAM-150 grades, etc. at room temperature or by heating in an oven to 120-130^{° C} for 1-1.5 hours. Ready adjuvant is an oily liquid color from light yellow to brown, depending on the quality of SPAN 80 emulsifier. Mild opalescence is allowed. The viscosity of this adjuvant at²⁰ ° C ranges between 12-15 mm² / s depending on the viscosity of the base oil. Ready adjuvant checked for reactogenicity in white mice and stored at room temperature until use.

Реактогенность предлагаемого адъюванта и его компонентов в сравнении с прототипом и его ингредиентом контролируют на белых мышах. Для этого группе мышей в количестве 10 голов массой 20±1 г каждая в одну из задних лопаток подкожно в область стопы вводят образцы по 0,05 мл. Через 10 дней после введения задние лапки обрезают по скакательный сустав и взвешивают. Реактогенность (Р) определяют как процент образовавшейся массы опухоли лапок от введения образца по сравнению с контрольными лапками и выражают формулой:
P

1

100% где ΣМ_о сумма масс лапок, в которые были введены образцы;
ΣМ_к сумма масс контрольных лапок.The reactogenicity of the proposed adjuvant and its components in comparison with the prototype and its ingredient is controlled on white mice. For this, a group of mice in the amount of 10 animals weighing 20 ± 1 g each, samples of 0.05 ml are injected subcutaneously into the foot area into one of the hind scapulae. 10 days after insertion, the hind legs are cut at the hock joint and weighed. Reactogenicity (P) is defined as the percentage of the formed mass of the tumor of the legs from the injection of the sample compared to the control legs and expressed by the formula
P

1

100% where ΣM is_the sum of the masses of the paws into which the samples were introduced;
ΣМ_{to the} sum of the masses of the control paws.

Результаты сравнительной оценки реактогенности различных масел и адъювантов представлены в табл.2. The results of a comparative assessment of the reactogenicity of various oils and adjuvants are presented in table 2.

Из представленных в табл.2 данных следует, что предлагаемый адъювант и ПАОМ обладают наименьшей реактогенностью для мышей в сравнении как с отечественным минеральным маслом, так и зарубежным Маркол-52 и неполным адъювантом Фрейнда, используемыми для производства противоящурных биопрепаратов. From the data presented in Table 2, it follows that the proposed adjuvant and PAOM have the lowest reactogenicity for mice in comparison with both domestic mineral oil and foreign Markol-52 and incomplete Freund's adjuvant used for the production of anti-FMD biological products.

Кроме количественной характеристики реактогенность предлагаемого адъюванта и ПАОМ изучают при подкожном введении в качественной пробе на крупном рогатом скоте, овцах, кроликах и при внутримышечном на свиньях и морских свинцах. In addition to quantitative characterization, the reactogenicity of the proposed adjuvant and PAOM are studied by subcutaneous administration in a qualitative sample on cattle, sheep, rabbits and intramuscular on pigs and marine lead.

Результаты исследования приведены в табл.3. The results of the study are given in table.3.

Изготовление эмульсионной формы вакцины с новым адъювантом сводится к приготовлению эмульсии типа воды в масле. Эмульсионную вакцину получают путем эмульгирования равных частей полученного антигена и предлагаемого адъюванта с помощью коллоидных мельниц или других гомогенизаторов до образования эмульсии белого цвета. The manufacture of the emulsion form of the vaccine with a new adjuvant is reduced to the preparation of an emulsion such as water in oil. An emulsion vaccine is obtained by emulsifying equal parts of the obtained antigen and the proposed adjuvant using colloidal mills or other homogenizers to form a white emulsion.

В результате получают противоящурную эмульгированную вакцину, не растворимую в воде, жидкой консистенции (до 700 мм²/с), которая легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов, обладает выраженной иммуногенностью для КРС в дозе 2 мл и для свиней в дозе 1 мл через 21 день после вакцинации. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и белым мышам подкожно. Сорбированно-масляную форму вакцины готовят путем механического смешивания сорбированного антигена и предлагаемого адъюванта.The result is a FMD vaccine emulsified, insoluble in water, of a liquid consistency (up to 700 mm² / s), which is easily absorbed from the injection site, does not cause the formation of abscesses, has pronounced immunogenicity for cattle at a dose of 2 ml and for pigs at a dose of 1ml 21 days after vaccination. The vaccine is administered intramuscularly to pigs, and cattle and white mice subcutaneously. The sorbed oil form of the vaccine is prepared by mechanically mixing the sorbed antigen and the adjuvant of the invention.

Из представленных в табл.3 данных следует, что при подкожном и внутримышечном введении образцов предлагаемого масла и адъюванта местные реакции у животных отсутствуют или отмечаются небольшие соединительно-тканевые гранулемы, в то время как компоненты известного адъюванта обладают повышенной реактогенностью с образованием абсцессов. From the data presented in table 3 it follows that with subcutaneous and intramuscular injection of samples of the proposed oil and adjuvant, local reactions in animals are absent or small connective tissue granulomas are noted, while the components of the known adjuvant have increased reactogenicity with the formation of abscesses.

П р и м е р 2. Эффективность предлагаемого адъюванта проварена в экспериментах на лабораторных и сельскохозяйст- венных животных и двух формах противоящурной вакцины: эмульсионной и сорбированно-масляной из лапинизированного вируса А₂₂.PRI meR 2. The effectiveness of the proposed adjuvant was tested in experiments on laboratory and agricultural animals and two forms of FMD vaccine: emulsion and sorbed oil from lapinized virus A₂₂ .

Сорбированно-масляную вакцину вводят белым мышам подкожно. Sorbed oil vaccine is administered subcutaneously to white mice.

В лабораторных опытах контроль авирулентности инактивированных антигенов контролируют на новорожденных мышатах. При введении 20 мышатам-сосунам в дозе по 0,1 мл подкожно все антигены были авирулентны. In laboratory experiments, the control of the avirulence of inactivated antigens is monitored in newborn mice. When administered to 20 suckling mice at a dose of 0.1 ml subcutaneously, all antigens were avirulent.

Проводят испытания на стабильность эмульсии образцов противоящурной вакцины на основе предлагаемого адъюванта. Результаты представлены в табл.4. Test the stability of the emulsion of samples of FMD vaccine based on the proposed adjuvant. The results are presented in table 4.

При диспергировании водного антигена с соответствующим количеством адъюванта получают во всех случаях стабильные эмульсии типа воды в масле, за исключением 5 образца, в котором 1,5 мас. эмульгатора было недостаточно для получения стабильной эмульсии, а ведение в состав эмульсии 10 мас. эмульгатора приводит к образованию высоковязких препаратов. Стабильность эмульсии контролируют путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30 мин и хранения в термостате при 37^оС в течение 1 месяца. При такой проверке не отмечают отделения водной фазы и эмульсия сохраняет свои физические свойства. Эмульсии на основе предлагаемого адъюванта относятся к типу воды в масле и отличаются выраженной стабильностью и относительно невысокой вязкостью в широком интервале температур от 4 до 25^оС, что выгодно отличает ее от вакцины на основе известного адъюванта.When dispersing an aqueous antigen with an appropriate amount of adjuvant, stable emulsions of the type water in oil are obtained in all cases, with the exception of 5 samples, in which 1.5 wt. the emulsifier was not enough to obtain a stable emulsion, and maintaining the composition of theemulsion 10 wt. emulsifier leads to the formation of highly viscous drugs. The emulsion stability is controlled by centrifugation at 3000 rev / min for 30 min and stored in a thermostat at 37^{° C} for 1 month. With this test, no separation of the aqueous phase is noted and the emulsion retains its physical properties. Emulsions based on the proposed adjuvant are of the type water in oil and differ pronounced stability and relatively low viscosity over a wide temperature range of from 4^to 25 ° C, which distinguishes it from vaccines based on the known adjuvant.

Таким образом, предлагаемый адъювант позволяет получать эмульсионные формы вакцин типа воды в масле с невысокой вязкостью, умеренной реактогенностью и незастывающими при хранении при температуре 2-6^оС.Thus, the proposed adjuvant allows to obtain emulsion forms of vaccines such as water in oil with low viscosity, moderate reactogenicity and non-freezing during storage at a temperature of 2-6^about C.

П р и м е р 3. Для испытания на лабораторных животных изготавливают две серии эмульсионной и две серии сорбированно-масляной противоящурной вакцины из лапинизированного вируса А₂₂ соответственно на основе предлагаемого и известного адъювантов. Кроме того, из этого антигена изготовлена противоящурная сорбированная вакцина. Количество 146S компонента во всех образцах вакцин было равноценным. Результаты иммуногенности на взрослых белых мышах представлены в табл.5.PRI meR 3. For testing on laboratory animals make two series of emulsion and two series of sorbed oil-based FMD vaccine from lapinized virus A_22, respectively, based on the proposed and known adjuvants. In addition, sorbent vaccine is prepared from this antigen. The amount of the 146S component in all vaccine samples was equivalent. The results of immunogenicity in adult white mice are presented in table 5.

Из табл.5 видно, что наиболее выраженной иммуногенностью обладают вакцины, изготовленные на основе полиальфа-олефинового масла. При этом установлено, что эмульсионная вакцина с предлагаемым адъювантом почти в три раза активнее препарата на основе известного адъюванта (ИМД₅₀ 0,087 мл против 0,250 мл). Сорбированно-масляная вакцина на основе предлагаемого адъюванта активнее вакцины этой же формы с известным адъювантом и в 6 раз активнее сорбированной (ИМД₅₀ 0,054 мл против 0,066 и 0,320 мл соответственно). Одновременно отмечено, что у мышей на месте введения эмульсионной вакцины, приготовленной на основе предлагаемого адъюванта, местных реакций не установлено, а у остальных животных в особенности при введении сорбированно-масляной вакцины с известным адъювантом, отмечены абсцессы.From table 5 it is seen that vaccines made on the basis of polyalpha-olefin oil possess the most pronounced immunogenicity. It was found that the emulsion vaccine with the proposed adjuvant is almost three times more active than the drug based on the known adjuvant (IPD₅₀ 0.087 ml versus 0.250 ml). A sorbed oil vaccine based on the proposed adjuvant is more active than a vaccine of the same form with a known adjuvant and 6 times more active than sorbed (IPD₅₀ 0.054 ml versus 0.066 and 0.320 ml, respectively). At the same time, it was noted that in mice at the injection site of the emulsion vaccine prepared on the basis of the proposed adjuvant, no local reactions were found, and in other animals, especially when the sorbed oil vaccine with the known adjuvant was administered, abscesses were noted.

П р и м е р 4. Для испытания на свиньях используют по одной серии эмульсионной противоящурной вакцины из лапинизированного вируса А₂₂, приготовленных на предлагаемом (серия 173) и предлагаемом (серия 168) адъювантах.PRI meR 4. For testing on pigs, one series of emulsion FMD vaccine from lapinized virus A_{22 is used} , prepared on the adjuvant proposed (series 173) and proposed (series 168).

Испытание иммунитета проводят на подсвинках массой 30-35 кг, привитых эмульсионной вакциной внутримышечно в объеме по 1 мл и зараженных путем введения в слизистую оболочку языка гомологического афтозного вируса в дозе 10000 ЛД₅₀/0,2 мл.The immunity test is carried out on gilts weighing 30-35 kg, inoculated with an emulsion vaccine intramuscularly in a volume of 1 ml and infected by introducing into the mucous membrane of the tongue a homologous aphthous virus at a dose of 10,000 LD₅₀ / 0.2 ml.

При этом испытание проводят на 21-й день после введения вакцины. Результаты контроля иммуногенности образцов эмульсионной противоящурной вакцины из вируса типа А₂₂ приведены в табл.6.The test is carried out on the 21st day after the introduction of the vaccine. The results of the control of the immunogenicity of samples of emulsion FMD vaccine from type A₂₂ virus are given in table.6.

Из представленных в табл. 6 результатов следует, что противоящурная эмульсионная вакцина, изготовленная на основе предлагаемого адъюванта, обладает более выраженной иммуногенной активностью по сравнению с вакциной на основе предлагаемого адъюванта, где один подсвинок заболел ящуром с генерализацией процесса. Of the presented in table. The 6 results show that the FMD vaccine made on the basis of the proposed adjuvant has a more pronounced immunogenic activity compared to the vaccine based on the proposed adjuvant, where one gilt was ill with foot and mouth disease with generalization of the process.

Противоящурные вакцины с предлагаемым адъювантом обладают умеренной реактогенностью, т. к. при патолого-анатомическом исследовании на 30-й день после прививки у одного подсвинка изменений на месте введения не обнаружено, а у трех отмечены вакцинальные гранулемы со средним размером 3х2х1 см с хорошей организацией соединительной ткани, в то же время у всех подсвинков, привитых вакциной с известным адъювантом, обнаружены абсцессы. FMD vaccines with the proposed adjuvant have moderate reactogenicity, because during pathological anatomical examination on the 30th day after vaccination, one pig did not show any changes at the injection site, and three had vaccine granulomas with an average size of 3x2x1 cm with good organization of connective tissue, at the same time, abscesses were found in all gilts vaccinated with a vaccine with a known adjuvant.

П р и м е р 5. В опытах на крупном рогатом скоте используют по одной серии противоящурной эмульсионной вакцины из лапинированного вируса ящура А₂₂, изготовленных на основе предлагаемого (серия 173) и известного (серия 168) адъювантов.PRI meR 5. In experiments on cattle using one series of FMD vaccine emulsion vaccine from lapinus virus of foot and mouth disease A₂₂ , made on the basis of the proposed (series 173) and known (series 168) adjuvants.

Результаты контроля их иммуногенной активности представлены в табл.7. The results of the control of their immunogenic activity are presented in table.7.

Из приведенных в табл.7 данных следует, что противоящурная эмульсионная вакцина из лапинизированного вируса ящура А₂₂, изготовленная на предлагаемом адъюванте, обладает выраженной иммуногенной активностью, так как при контрольном заражении через 21 день после вакцинации оба животных противостояли заболеванию, по сравнению с вакциной с известным адъювантом, где одно животное заболело ящуром с генерализацией процесса.From the data in table 7 it follows that the FMD vaccine emulsion vaccine from lapinized foot and mouth disease virus A₂₂ , made on the proposed adjuvant, has a pronounced immunogenic activity, since during thecontrol infection 21 days after vaccination both animals resisted the disease, compared with the vaccine with famous adjuvant, where one animal fell ill with foot and mouth disease with a generalization of the process.

При забое через 30 дней после прививки у животных, привитых вакциной на основе предлагаемого адъюванта, на месте подкожного введения препарата отмечают соединительно-тканевые гранулемы со средним размером 10х7,5х3 см, хорошо организованные, в то время как у животных, привитых с известным адъювантом, обнаружены абсцессы. When slaughtered 30 days after vaccination in animals vaccinated with a vaccine based on the proposed adjuvant, at the site of subcutaneous injection of the drug, connective tissue granulomas with an average size of 10x7.5x3 cm, well organized, are observed, while in animals vaccinated with a known adjuvant, abscesses are found.

Claims (1)

Translated fromRussian

АДЪЮВАНТ, содержащий масляную основу и эмульгатор, отличающийся тем, что, с целью снижения вязкости реактогенности препарата, а также повышения его адъювантных свойств, в качестве масляной основы, используют полиальфа-олефиновое масло при следующем соотношении компонентов, мас. ADJUVANT containing an oil base and an emulsifier, characterized in that, in order to reduce the viscosity of the reactogenicity of the drug, as well as increase its adjuvant properties, polyalpha-olefin oil is used as the oil base in the following ratio, wt. Полиальфа-олефиновое масло 85 95
Эмульгатор 5 15Polyalpha-olefin oil 85 95
Emulsifier 5 15

Images