PT93554A - METHOD FOR THE SPECIFIC CLIVING OF A SEPARATED RNA MOLECULA - Google Patents

Description

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1” 1 62.077 Ref: RJW/University Patents-RNA Ribózyme 5 V 0 presente invento refere-se a um método para a clivagem específica de uma molécula RNA separada. 10 O presente pedido é uma continuação-em-parte do pedido Norte-Americano com o número de série 937..372 , agora pendente. 15 A presente invenção fõí conseguida em parte com fundos provenientes do Governo sob.a concessão GM 28039 dos "National Institutes of Health", pelo que o Governo dos Estados Unidos tem alguns direitos sobre a invenção. 8 i O § 0 r-* 1 20 A presente invenção incide sobre composições do AEN que funcionam como uma enzima do ARN, isto é, como uma ribozima, com várias aptidões': desfosforilase (fosfatase ácida e transfosforilase), ribonucleotidil--transferase (com actividade de polimerase) e endorribonuclease com acti vidade especificamente dirigida a determinadas sequências. 25 Verificou-se que o cácido ribonucleico (ARN). purificado pode . actuar ccmo enzima (ribozima) sobre outras moléculas de-ARN in vitro, coi as seguintes actividadesj_ 1 - actividade de enzima desfosforilante , catalizando a remoção do fosfato terminal 3 ' do ARN em substractos com uma sequência específica, 2 -actividade de ARN-polimerase, (nucleotidil transferase), catalizando a conversão de oligorribonucleõtidos a polirri-bonucleõtidos, 3 - actividade de endorribonuclease em substractos com uma sequência específica. (Esta última actividade é também designada coro: 30 actividade de endonuclease de restrição do ARN ou como actividade de endorribonuclease). 35The present invention relates to a method for the specific cleavage of a separate RNA molecule. The present invention relates to a method for the specific cleavage of a separate RNA molecule. The present application is a continuation-in-part of the United States application serial number 937..372, now pending. The present invention is achieved in part by funds from the Government under the GM 28039 grant from the National Institutes of Health, whereby the United States Government has some rights to the invention. The present invention relates to AEN compositions which function as an RNA enzyme, i.e. as a ribozyme, having various apatity: dephosphorylase (acid phosphatase and transphosphorylase), ribonucleotidyl transferase (with polymerase activity) and endoribonuclease with activity specifically directed to certain sequences. Ribonucleic acid (RNA) has been found. purified can. act as an enzyme (ribozyme) on other RNA molecules in vitro, with the following activities: dephosphorylating enzyme activity, catalyzing the removal of 3 'terminal phosphate from RNA in substrates with a specific sequence, 2-RNA polymerase activity , (nucleotidyl transferase), catalyzing the conversion of oligoribonucleotides to polyribonucleotides, 3-endoribonuclease activity in substrates having a specific sequence. (This latter activity is also referred to as: restriction endonuclease activity of RNA or as endoribonuclease activity). 35

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DESCRICAO DAS FIGURAS Figura 1 - compara as actividades de auto-processamento <A) e de endorribonuclèase íB) do ARN. Figura 2 - apresenta os produtos de clivagem de uma série, de substractos ARN pela ARN-endorribonuclease Figura 3 - compara as actividades de três formas variantes de ribozima L.-1S IVS com diferentes substractos em ureia -2.5 M. Figura 4 - apresenta a clivagem de oligonucleótidos em função do tempo. Figura 5 - apresenta a clivagem e a reconstituição de substractos oligorribonucleótido pela L-19 IVS ARN. Figura 6 - apresenta a cinética da conversão de pGS em oligonucleótidos maiores e mais pequenos com a L- 19 IVS ARN. Figura 7 - mostra o intermediário enzima-substracto da L-19 IVS ARN. Figura 8 - apresenta um modelo para o mecanismo enzimático da L-19 IVS ARN quando esta actua como ribonucleotidil transferase. Figura 9 - mostra a inibição competitiva do dCS na reação cõm o pCS. 35 10 15DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Figure 1 - compares the auto-processing activities (A) and endorribonucleases (B) of the RNA. Figure 2 shows the cleavage products of a series of RNA substrates by RNA-endorribonuclease Figure 3 - Compares the activities of three variant forms of ribosome L.-1S IVS with different substrates in urea -2.5 M. Figure 4 - presents the oligonucleotide cleavage as a function of time. Figure 5 shows the cleavage and reconstitution of oligoribonucleotide substrates by the L-19 IVS RNA. Figure 6 shows the kinetics of the conversion of pGS into larger and smaller oligonucleotides with the L-19 IVS RNA. Figure 7 shows the enzyme-substrate intermediate of L-19 IVS RNA. Figure 8 - presents a model for the enzymatic mechanism of L-19 IVS RNA when it acts as ribonucleotidyl transferase. Figure 9 shows the competitive inhibition of dCS in the reaction with pCS. 35 10 15

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Figura 10 - mostra a relação das reacçftes catalisadas pela 13 IVS ARN.. com as reacçbes de auto-processamento e similares mediadas pela IVS ARN. Figura 11 - mostra a desfosforilação do ácido c.oligocitidílico) 3-fosfatado. Figura 12 - · mostra o efeito do pH nas reacçães de transferência de fosfato e de transferência de nucleótidos. Figura 13 - mostra que a fosforilação da ribozima L-19 IVS ARN é reversível. Figura 14 - mostra que a C-19 IVS ARN actua cataiiticamente c orno f osf o t r ansf er ase. Figura 15 - mostra o modelo do centro activo único para a actividade da ' L-19 IVS ARN sobre substractos fosfato diéster e fosfato monoéster. Figura 16 - mostra a construção do plasmídeo que produz a L- 21 IVS ARN. Figura 17 - mostra o aumento da especificidade da clivagem' na presença de ureia ou de forrnamida. Figura 18 - mostra a sensibilidade do mau emparelhamento na presença de ureia. Figura 19 — mostra a construção do plasmídeo pTL—21. Figura 20 - mostra o efeito da ureia. 35Figure 10 shows the ratio of the reactions catalysed by the IVS RNAs with the autoprocessing reactions and the like mediated by the IVS RNA. Figure 11 - shows the dephosphorylation of c-oligocitidylic acid) 3-phosphate. Figure 12 shows the effect of pH on phosphate transfer and nucleotide transfer reactions. Figure 13 shows that the phosphorylation of ribozyme L-19 IVS RNA is reversible. Figure 14 shows that the C-19 IVS RNA acts catalytically with phosphodiesterase. Figure 15 shows the single active site template for L-19 IVS RNA activity on diester phosphate and monoester phosphate substrates. Figure 16 shows the construction of the plasmid that produces the L-21 IVS RNA. Figure 17 shows the increased specificity of cleavage in the presence of urea or formamide. Figure 18 - shows the sensitivity of bad pairing in the presence of urea. Figure 19 shows the construction of the plasmid pTL-21. Figure 20 - shows the effect of urea. 35

52.077Ref: RJWAJniversity Patents-RNA. Ribozyma52.077Ref: RJWAJniversity Patents-RNA. Ribozyma

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Figura 21 - mostra o efeito da ureia usando a L-21 ARN.Figure 21 shows the effect of urea using the L-21 RNA.

Figuras 22 a 31 - mostram os perfis de velocidade das ribozimas TTC, TTA e TQT com substractos bem e mal emparelhados em função da presença de ureia, NH4AC ou Mg++. 10Figures 22 to 31 show the velocity profiles of TTC, TTA and TQT ribozymes with substrates well and poorly paired as a function of the presence of urea, NH4AC or Mg ++. 10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 DESCRICAO DETALHADA DOS DESENHOS Legendas das f iqurasMod. 71-10000 ex. - 89/07 20 DETAILED DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Legends of the films

Fig.1 — Um modelo para a acção da L—19 IVS ARN como endonuclease de restrição do ARN através de um mecanismo que é uma versão intermolecular do primeiro passo do auto-processamento Cself-spl ic ing) do pré-rARN. As letras e as linhas finas representam as sequências da IVS, e as letras e as linhas grossas representam sequências dos ex.8es Cem cima) ou sequências do substracto ARN Cem baixo); o G em itálico é um nucleótido ou nucleôsido guanosina livre.Fig.1 - A model for the action of L-19 IVS RNA as the restriction endonuclease of RNA through a mechanism that is an intermolecular version of the first step of the auto-processing Celfr-spl icing) of the pre-rRNA. Letters and fine lines represent the sequences of the IVS, and the letters and the thick lines represent sequences of ex.8es Cem) or sequences of the substrate RNA Cem low); G in italics is a free guanosine nucleotide or nucleoside.

Fig.2 - A L-19 IVS-beta ARN efectua clivagem em grandes substractos de ARN com transferência de guanosina. a_, pAKlOS ARN C508 nt) 0.6 uM Cu = micro) uniformemente marcado, incubado com L-19 IVS-beta ARN 0.2 uM e 0, 0.1 ou 0.5 mM GTP Cnão marcado) durante 1 h nas condiçSes abaixo descritas. CM). Mistura de 4 substractos ARN usados como marcadores de peso molecular. b, vários substractos ARN substituídos com trítio Cl ug cada) incubados com L-19 IVS-beta ARN 0.2 uM e Calfa-32P1 GTP 120 uM durante 1 h nas mesmas condições reaccionais de a. Q auto-radiograma revela a presença de produtos marcados com C32p) v 4 * ♦Fig.2 - L-19 IVS-beta RNA cleaves large substrates of RNA with guanosine transfer. (0.6 μM Cu = micro) uniformly labeled, incubated with 0.2 μM IVS-beta RNA and 0.1, 0.5 or 0.5 mM unlabeled GTP) for 1 h under the conditions described below. CM). Mixture of 4 RNA substrates used as molecular weight markers. b, several R 1a-substituted RNA substrates incubated with 0.2æM IVS-beta RNA and 120æM Calfa-32P1 GTP for 1h under the same reaction conditions as a. The auto-radiogram reveals the presence of products labeled with C32p) v 4 * ♦

52.077 Ref: RJW/University Patents-RNA. Ribozyme52.077 Ref: RJW / University Patents-RNA. Ribozyme

4 1 STP apenas. A L~13 IVS-beta ARN também se torna marcada com GTP durante a incubação. ç_, sequência de nucleótidos do produto de clivagem pAKlQS(l) determinada pelo método enzimático 5 (Donis-Keller, H. <1380), Nucleic Acids Res. 8} 3133-3142). Alguns nucleótidos nSo puderam ser identificados devido â presença de uma banda na amostra de ARN não tratada (controle). GT, GTP marcado adicionado ao ARN durante a reacção. 10 154 1 STP only. The L-13 IVS-beta RNA also becomes labeled with GTP during the incubation. (1) determined by the enzymatic method 5 (Donis-Keller, H. < 1380), Nucleic Acids Res. 8: 3133-3142). Some nucleotides could not be identified due to the presence of a band in the untreated RNA sample (control). GT, labeled GTP added to the RNA during the reaction. 10 15

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Métodos - A L-19 IVS ARN foi sintetizada por métodos semelhantes aos préviamente descritos CZaug, A.J. e Cech, T.R. (1996) Sc ience 231:470-475) . exceptuando o sistema cadeia-molde Cteniplate) - polimerase, que foi diferente. Q plasmideo pT7-TTlA3 (que contém um promotor da ARN-polimerase de T7, um exão 42 bp 5', a totalidade da 413 bp IVS e um exão 82 bp 3') foi submetido à clivagem com Eco RI e transcrito com ARN-polimerase do bacteriofago T7 (Davanloo, P.et al. (1384) proc. Nat'l. Acad. Sci.V.S.A. 81: 2035-2033). Os transcritos foram pósteriormente incubados em condições favoráveis ao auto-processamento, à ciclização e à hidrólise dirigida <site-specific>, produzindo-se a L—19 IVS ARN (Zaug, A.J., et al. (1984) Science 224: 574—5785 Zaug, A.J: and Cech, T.R. (1986) Science 231:470-475). A guanosina terminal 3' foi então removida por oxidação com periodato e eliminação beta (Winter, G. , et al.(1978) Nucleic Acids Res. 5, 3129-3133), originando a L-19 IVS-beta ARN. Ds substractos ARN foram produzidos pela transcrição com ARN-polimerase de T7, de pAKlOS cortados com BamHI, (Mount, S.M.,et al. (1383) Ceil 33i509-518) pT7-l cortado com Xrnnl ou Seal (comprados à U.S, Biochemical Corp.), e pDW27 cortado com SnaiBI 5 35Methods - L-19 IVS RNA was synthesized by methods similar to those previously described CZaug, A.J. and Cech, T.R. (1996) Scenence 231: 470-475). except for the Cteniplate-polymerase chain-polymerase system, which was different. Q plasmid pT7-TTlA3 (containing a T7 RNA polymerase promoter, a 42 bp 5 'exon, all 413 bp IVS and a 82 bp 3' exon) was cleaved with Eco RI and transcribed with RNA- T7 bacteriophage polymerase (Davanloo, P. et al. (1384) Proc Natl Acad Sci.VSA 81: 2035-2033). The transcripts were subsequently incubated under conditions favorable to self-processing, cyclization and site-specific " hydrolysis ", producing L-19 IVS RNA (Zaug, AJ et al. (1984) Science 224: 574 -5785 Zaug, AJ: and Cech, TR (1986) Science 231: 470-475). The 3 'terminal guanosine was then removed by periodate oxidation and beta deletion (Winter, G., et al. (1978) Nucleic Acids Res. 5, 3129-3133), yielding the L-19 IVS-beta RNA. The RNA substrates were produced by transcription with T7 RNA polymerase from BamHI-cut pAKlOS (Mount, SM, et al. (1383) Ceil 33i509-518) pT7-1 cut with XrnII or Seal (purchased from US Biochemical Corp.), and pDW27 cut with SnaiBI 535

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15 52.077 Pef: RJW/University Patents-BNA Ribozyme15 52,077 Pef: RJW / University Patents-BNA Ribozyme

que codifica o ARN Ml (obtido de D.Uahl e N. Face). Os substractos ARN foram incubados com L-19 IVS-beta ARN em MgC12 S mM, NaCl 10 mM e Tris-HCl 50 mM pH=7.5 á temperatura de 50 °C, na presença de GTP com a concentração indicada. As reacçães foram paradas pela adição de EDTA até ser atingida a concentração final de 25.mM. Os produtos foram analisados por electroforese em geis de poliacrilamida a 4¾ e ureia 8M e sujeitos a fluorografia (a) ou auto-radiografia (b).which encodes M1 RNA (obtained from D.Uahl and N. Face). The RNA substrates were incubated with L-19 IVS-beta RNA in S mM MgCl2, 10 mM NaCl and 50 mM Tris-HCl pH = 7.5 at 50 ° C in the presence of GTP at the indicated concentration. The reactions were stopped by addition of EDTA until the final concentration of 25 mM was reached. The products were analyzed by electrophoresis in 4% polyacrylamide gears and 8M urea and subjected to fluorography (a) or autoradiography (b).

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Fig.3 - Três ribozimas diferentes conseguem distinguir sequências que diferem de apenas uma base dentro do elemento de reconhecimento, a, Síntese de substractos oligorribonucleótido pré-definidos, pelo método de Lowary et al. (Lowary, P., et al. NATO ASI Series A, vol. 110, 69-76, 1986). 0 AON foi transcrito com ARN-põlimerase. do T7 na presença de Calfa-3£pl ATP para produzir oligorribonucleótidos marcados com 32P nas posiçdes indicadas com CIO. b^, Interacç3es propostas entre os três substractos oligorribonucleótidos C cadeias superiores, letras grossas) e os sítios activos das ribozimas emparelhadas (cadeias inferiores). As setas indicam os locais onde se dá a clivagem e a adição de guanos i na.. ç_, Clivagem de três substactos oligorribonucleótidos pelos L-19 IVS ARNs selvagem (wild type) s variante, analisado por electroforese em acrilamída a 20¾ e ureia 7M. C-), substracto não tratado. Noutros pares de faixas, c substracto 1.0 uM marcado com 32P foi incubado com ribozima 0.12S M durante 15 min. (faixa da esquerda) ou 60 min. (faixa da direita) a S0°C em MgC12 10 mM, NaCl 10 mM, Tris-Hcl 50 mt* pH=7.5, GTP (não marcado) 0.5 mM e ureia 2.5M. Dado que ο 32P se 6 «san· 1 5 15Three different ribozymes are able to distinguish sequences that differ from only one base within the recognition element, the Synthesis of Predefined Oligoribonucleotide Substrates, by the method of Lowary et al. (Lowary, P., et al., NATO ASI Series A, vol 110, 69-76, 1986). The AON was transcribed with RNA-polymerase. of T7 in the presence of Calfa-3β-ATP to produce 32 P-labeled oligoribonucleotides at the positions indicated with C10. b) Proposed interactions between the three oligoribonucleotide substrates C higher chains, coarse letters) and the active sites of the annealed ribozymes (lower chains). The arrows indicate the sites where the cleavage occurs and the addition of guanosine in the cleavage of three oligoribonucleotide subsets by the wild type L-19 IVS RNAs (variant), analyzed by 20 ac acrylamide electrophoresis and 7M urea . C-), untreated substrate. In other pairs of lanes, the 32 P-labeled 1.0 ÂμM substrate was incubated with 0.12 M M ribozyme for 15 min. (left lane) or 60 min. (right lane) at 10øC in 10 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 50 mM Tris-Hcl pH = 7.5, 0.5 mM GTP (unlabeled) and 2.5 M urea. Since 32P is 6 'san · 1 5 15

Mod. 71-5 0000 ex. - 89/07 20 62.077 Ref: íOT/University Patents-FNA. RLbozymeMod. 71-50000 ex. - 89/07 20 62.077 Ref: IOT / University Patents-FNA. RLbozyme

encontra confinado aos nucleótidos a jusante do sitio de clivagem, só aparece o menor dos produtos. A identidade do produto GA5 foi confirmada por tratamento do substracto e das misturas reaccionais com RNase de T2 e controlando a transferência do 32P para o Sp. A banda que migra acima da do QA5 nas faixas 2 e 3 não foi consistentemente produzida e nSo foi identificada.is confined to the nucleotides downstream of the cleavage site, only the smallest of the products appears. The identity of the GA5 product was confirmed by treatment of the substrate and the reaction mixtures with T2 RNase and controlling the transfer of 32P to Sp. The band migrating above that of QA5 in lanes 2 and 3 was not consistently produced and was not identified .

25 30 35 Métodos: Os substractos foram preparados pela transcrição de deoxioligonucleótidos sintetizados num sintetizador de ADN da "Applied Bi osys tems". Ut i1izou-se a mesma c ade ia (cadeia superior) como promotor para cada transcrição. A cadeia inferior, que contém as sequências do promotor e da cadeia-moIde, foi modificada de forma a serem obtidos diferentes substractos ARN. 0 ADN foi transcrito com ARN-polimerase purificada do fago T7 (Davanloo, P. et al.,(1984) Proc Nat'l. Acad. Sei. U.8.A. 81:2035-2039), como foi anteriormente descrito CLowary, P., et al.,NATQ ASI Series, vol.110, indicado acima). As ribozimas variantes são descritas por Been e Cech (Been, M.D. , et al.,C198S) Cell, 47:2Q7-21S). A ribozima 24C foi preparada de forma semelhante a partir de transcritos de pBG/-3G:24C. As ribozimas variantes não foram submetidas à eliminação beta para remover o seu G terminal 3'.Methods: The substrates were prepared by the transcription of synthesized deoxyoligonucleotides on a DNA synthesizer from " Applied Bi osys tems ". The same cell (upper chain) was used as the promoter for each transcript. The lower strand, which contains the promoter and moIde sequences, was modified so that different RNA substrates were obtained. DNA was transcribed with purified T7 phage RNA polymerase (Davanloo, P. et al., (1984) Proc Natl Acad. Sci. U.8.A. 81: 2035-2039), as described above CLowary, P., et al., NATQ ASI Series, vol.110, supra). The variant ribozymes are described by Been and Cech (Been, M.D., et al., C198S) Cell, 47: 270-221). 24C ribozyme was prepared similarly from pBG / -3G: 24C transcripts. The variant ribozymes were not beta-removed to remove their 3 'G-terminus.

Fig.4 - Análise cinética da reacção da ARN-endorribonuclease. a, Q substracto oligorribonucleótido (2.5 uM) foi incubado com ARN L-19 IVS-beta selvagem (0.2 uM) como na fig.3, excepto que se omitiu a ureia, b, Cinética da clivagem deFig.4 - Kinetic analysis of the RNA endorribonuclease reaction. The oligoribonucleotide substrate (2.5 μM) was incubated with wild-type L-19 IVS-beta RNA (0.2 μM) as in Figure 3, except that urea, b, K cleavage kinetics

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62.07762,077

Fef: ]^/University Patents-ΒΝΆ Rxbozyite GGCCCUCUAS em função· da concentração de GTP. A concentração do substracto ARN foi mantida constante a 2.5 uM. £, Cinética da clivagem em função da concent-rção do substracto ARN, sendo a concentração de GTP mantida constante a 0.5 mH. Métodos: Os produtos foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida. Utilizando o auto-radiograma como guia, cada gel foi cortado em fitas, e a radioactividade presente no substracto que "não reagiu e no produto GA-5 foi determinada por contagem de cintilações em líquido Cliquid scintillation counting). A velocidade inicial da clivagem CVp) foi determinada a partir de um registo semilogaritmico da fracção que reagiu era função do tempo. 1/V0 foi então registado em função do inverso da concentração do substracto» os gráficos apresentam as rectas que melhor se ajustam aos pontos experimentais por aplicação do método dos mínimos quadrados.Feb:] University Patents-Rxbozyte GGCCCUCUAS as a function of the concentration of GTP. The concentration of the RNA substrate was kept constant at 2.5 uM. The kinetics of cleavage as a function of the concentration of the RNA substrate, the GTP concentration being maintained constant at 0.5 mH. Methods: The products were separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Using the autoradiogram as a guide, each gel was cut into ribbons, and the radioactivity present on the unreacted substrate and the GA-5 product was determined by scintillation counting in Cliquid scintillation counting liquid. The initial rate of CVP cleavage was determined from a half-log of the fraction which reacted was a function of time. 1 / V0 was then recorded as a function of the inverse of the substrate concentration, the graphs show the lines that best fit the experimental points by applying the least squares method.

Fig.S - A L-19 IVS ARN cataliza a clivagem e reconstituição de substractos oligorribonucleótidos; CA) pC5 10 uM, e CB) d-pC5 10 uM ambos com L-19 IVS ARN 1.6 uM ; CC) pCS 45 uM na ausência de L-19 IVS ARN; CD) pU6 45 uM com L-13 IVS ARN 1.6 uM; CE) pCS 10 uM ; CF) pCS 50 uM, e CG) pC5 100 uM, todos com L-13 IVS ARN I. 6 uM. Os oligonucleótidos estavam marcados no terminal 5" por tratamento com Cgama-32 PI ATP e polinucleótido-cinase; foram diluídos com oligonucleótidos não marcados com a mesma sequência para manter constante a quantidade de radioactividade por reacção. A L-19 IVS ARN foi sintetizada por transcrição e processamento in vitro. 0 ADN pSPTTlAS super-ehrolado CPrice, J. V., et al., C1985) Sc.ience 223:713) foi cortado com Eco RI e 8 1 10 15Fig. S-L-19 IVS RNA catalyzes the cleavage and reconstitution of oligoribonucleotide substrates; CA) 10 μM pC5, and CB) 10 μM d-pC5 both with 1.6 μM L-19 IVS RNA; CC) 45 μM pCS in the absence of L-19 IVS RNA; CD) pU6 45 ÂμM with L-13 IVS RNA 1.6 ÂμM; EC) 10æM pCS; CF) pUC 50 μM, and CG) 100 μM pC5, all with L-13 IVS RNA I.6 μM. The oligonucleotides were labeled at terminal 5 " by treatment with Cgam-32 PI ATP and polynucleotide kinase; were diluted with unlabelled oligonucleotides of the same sequence to maintain constant the amount of radioactivity per reaction. L-19 IVS RNA was synthesized by transcription and in vitro processing. Supercoiled pSPTTAS DNA CPrice, J.V., et al., C1985) Sc.ience 223: 713) was cut with Eco RI and 8 1 10 15

Mod. 7.1 -10000 ex. - 89/07 25 30 £2.077 Ref: RjW/TJniversity Patents-BNA RibozyraeMod. 7.1 -10000 ex. - 89/07 25 30 £ 2.077 Ref: RjW / TJniversity Patents-BNA Ribozyrae

depois transcrito com ARN-polimerase SP6 (Butler, E.T., et al. , £1982) J.Biol.Chem. 257:5772; Melton, D.A., et al., (1984) Nucleic Acids Res.12:7035) durante 2 horas a 370C numa solução de nucleósidos trifosfatados (0.5 mM cada), MgC12 6 mM, sspermidina 4mM, ditiotreitol 10 mM, Tris-HCl 40 mM pH=7.5, contendo também 100 unidades de ARN-polimerase SP6 por micrograma de ADN plasmidico. Adicionou-se então NaCl até se atingir a concentração final de 240 mM e a incubação foi continuada a 37°C durante 30 minutos para promover a extracção e a ciclização da IVS do ARN. □s ácidos nucleicos foram precipitados com três volumes de etanol e redissolvidos em CHES 50 mM pH=9.0; adicionou-se MgC12 até se atingir a concentração final de 20 mM e a solução foi incubada a 42°C durante 1 hora para promover a hidrólise dirigida do ARN IVS: circular, para dar a L-19 IVS ARN £2aug, A.J., et al. , Science 224, 574 (1984)). A reacção foi parada por adição de EDTA até ser atingida a concentração de 25 mM. A L-19 IVS ARN foi purificada pôr* electroforese preparativa em gel' e por cromatograf-ia em Sephadex G-50. Os ol igonuc leót-idos marcados foram incubados com L-19 IVS ARN a 42°C em MgC12 20 mM, Tris 50 mM pH=7.5 durante 0, 1, 2, 5, 10, 30 e 60 minutos. As reacçdes foram paradas por adição de EDTA até ser atingida a concentração final de 25 mM. Qs produtos foram analisados por ·electroforese em gel de poliacrilamida a 20¾ e ureia 7M, mostrando-se os respectivos auto-r ad i og ramas.then transcribed with SP6 RNA polymerase (Butler, E. T., et al., 1982) J. Biol. Chem. 257: 5772; Melton, DA, et al. (1984) Nucleic Acids Res.12: 7035) for 2 hours at 37 ° C in a solution of triphosphate nucleosides (0.5 mM each), 6 mM MgCl2, 4 mM Spermidine, 10 mM dithiothreitol, Tris-HCl 40 mM pH = 7.5, also containing 100 units of SP6 RNA polymerase per microgram of plasmid DNA. NaCl was then added until the final concentration of 240 mM was reached and the incubation was continued at 37 ° C for 30 minutes to promote the extraction and cyclisation of the RNA IVS. The nucleic acids were precipitated with three volumes of ethanol and redissolved in 50 mM CHES pH = 9.0; MgCl 2 was added until the final concentration of 20 mM was reached and the solution was incubated at 42 ° C for 1 hour to promote the directed hydrolysis of the circular IVS RNA to give L-19 IVS RNA. al. , Science 224, 574 (1984)). The reaction was stopped by the addition of EDTA until a concentration of 25 mM was reached. The L-19 IVS RNA was purified by preparative gel electrophoresis and by chromatography on Sephadex G-50. The labeled oligonucleotides were incubated with L-19 IVS RNA at 42øC in 20 mM MgCl2, 50 mM Tris pH = 7.5 for 0, 1, 2, 5, 10, 30 and 60 minutes. The reactions were stopped by addition of EDTA until the final concentration of 25 mM was reached. The products were analyzed by 20% polyacrylamide gel electrophoresis and 7M urea, the respective autogranules being shown.

Fig. 6 - Cinética da conversão do pC'5 em o 1 igonucleótidos maiores e menores com L-19 IVS ARN 1.6 uM. Qs produtos foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida. UtilizandoFig. 6 - Kinetics of the conversion of pC50 to the major and minor IgGs with L-19 IVS 1.6 uM RNA. The products were separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Using

Q 1 1 10 15Q 1 1 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

62.07762,077

Bef: lOT/Urãversity Patents-BNA Ribozyrre o auto-radiograma coroo guia, o gel foi. cortado em fitas e a radioactividade de cada espécie de ARN foi determinada por contagem de cintilações em liquido. Q estado da reacç-So (quantidade de produto formado em relação à do composto inicial) a cada valor de tempo foi tomado como a razão entre as radioactividades C - pC3 + pC4 + pC6 + pC7 +...) e a radioactividade total na faixa. A velocidade inicial de formação do produto, VO, foi determinada a partir de um registo semi logarítmico da fracção que reagiu em função do tempo. VO foi então registado em função da concentração de substracto; a curva é a que melhor se ajusta aos pontos experimentais pelo método dos mínimos quadrados aplicado à equação de Michaelis-Menten. Os parâmetros cinéticos resultantes são : Km = 42 uM, Vmax = 2.8 uM min-1, e kcat'= 1.7 min-1. Os parâmetros cinéticos referentes aos primeiro e segundo passos da reacção ainda não foram determinados separadamente.Bef: lOT / Urãversity Patents-BNA Ribozyrre the self-radiogram coroo guide, the gel was. and the radioactivity of each RNA species was determined by liquid scintillation counting. The reaction state (amount of product formed relative to that of the starting compound) at each time value was taken as the ratio between the radioactivities C-pC3 + pC4 + pC6 + pC7 + ...) and total radioactivity at range. The initial rate of formation of the product, VO, was determined from a semi logarithmic register of the reacted fraction as a function of time. VO was then recorded as a function of substrate concentration; the curve is the one that best fits the experimental points by the least squares method applied to the Michaelis-Menten equation. The resulting kinetic parameters are: Km = 42 ÂμM, Vmax = 2.8 ÂμM min-1, and kcat = 1.7 min-1. The kinetic parameters relating to the first and second reaction steps have not yet been determined separately.

Fig. 7 - Formação e resolução do intermediário enzima-substracto. CA) Para formar o -intermediário-covalente L-19 IVS· ARN - substracto, tratou-se CSp-t 8.5 nM com L-13 IVS ARN 0.15 uM em condições reaccionais Standard de 0 a 60 minutos. CB) Fez-se reagir pt'C5 C0.01 uM) com L—19 IVS ARN 0.16 uM. A clivagem ocorreu normalmente mas houve muito pouca reconstituição. CC) 0 intermediário covalente marcado foi preparado como em CA) (60-minutos) , e purificado por electroforese em gel de poliacri-lamida a 4% e ureia ÕM. Foi então incubado com CS não marcado 10 uM em condições reaccionais Standard de 0 a 60 minutos. 0 produto, designado como C6, co—migrou com o padrão C6 marcado (não 10 * * 10 15 62.077 Ref: Rjw/University Patents-FNA. RxbozymeFig. 7 - Formation and resolution of the intermediate enzyme-substrate. CA) To form the Intermediate-covalent IV-RNA-substrate, 8.5 nM CSP-t was treated with L-13 IVS RNA 0.15æM under standard reaction conditions of 0 to 60 minutes. CB) C 10.01 uM) was reacted with L-19 IVS RNA 0.16æM. Cleavage occurred normally but there was very little reconstitution. CC). The labeled covalent intermediate was prepared as in CA) (60 minutes), and purified by electrophoresis on 4% polyacrylamide gel and M M urea. It was then incubated with 10æM unlabeled CS under standard reaction conditions of 0 to 60 minutes. The product, designated C6, co-migrated with the labeled C6 standard (no 10 * 10 15 62.077 Ref: Rjw / University Patents-FNA.

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 25 30 apresentado). (D) 0 intermediário cova lente isolado como em CC) foi incubado em condições de hidrólise dirigida (MgC12 20 mM, CHE’3 50 mM pH-9.0) a 42 °C de 0 a 60 minutos. As posições dos mono- e dinucleótidos marcados encontram-se indicadas. Nas faixas correspondentes a 10 e 30 minutos em CA), e a 10, 30 e 60 minutos em CC), a compressão das bandas Credução das diferenças de mobilidade electroforética) é verificada entre C6 e C7 e menos óbviamente entre C7 e C8. Isto é devido à ausência de fosfato 5". Assim, a razão carga/massa aumenta com o aumento do tamanho da cadeia, enquanto no caso de oligonucleôtidos fosforilados em 5' a razão carga/massa é independente do tamanho da. cadeia. Quando estes produtos foram fosforilados por tratamento com polinucleótido-cinase e ATP, a distribuição voltou a apresentar o espaçamento normal análogo ao da Fig.1 C 2aug, A., et al., C resu 1 t-ados não pub 1 i cados) 3.Mod. 71-10000 ex. 89/07 25 30). (D) The isolated covalent intermediate as in CC) was incubated under targeted hydrolysis conditions (20 mM MgCl2, 50 mM CHE3 pH-9.0) at 42øC for 0 to 60 minutes. The positions of the labeled mono- and dinucleotides are indicated. In the bands corresponding to 10 and 30 minutes in CA), and at 10, 30 and 60 minutes in CC), the compression of the bands of electrophoretic mobility) is verified between C6 and C7 and less obviously between C7 and C8. This is due to the absence of phosphate 5 ". Thus, the charge / mass ratio increases with increasing chain size, while in the case of 5 'phosphorylated oligonucleotides the charge / mass ratio is independent of the size of the strand. jail. When these products were phosphorylated by treatment with polynucleotide kinase and ATP, the distribution returned to the normal spacing analogous to that of Fig. 1 C 2aug, A., et al., Unpublished C) 3.

Fig. 8 - Modelo para o mecanismo enzimático da L-19 IVS ARN. 0 ARN catalisa a clivagem e a reconstituição de oligoCC) pelo caminho . 1-2-3-4-1. A enzima L-19 IVS ARN Cl) é apresentada com o local de fixação CRRRRRR, seis purinas) próximo dd seu terminal 5', e com a 6414 com um grupo 3'-hidroxilo no seu terminal 3". A complexa estrutura terciária da molécula CDavies, R.W., et. al.,C1982) Nature CLondon) 300: 719; Waring, R.W., et al. , C1983) -J. Mol. Biol. 167:595? Michel, F. , et al. , C1983) EMBQ J. 2:33; Cech, T.R., et al.,C1983) Proc. Nai'l. Acad. Sei. U.S.A. 80:3903; Inoue, T. et al., C1985) ibid. 82:648) está representada como uma simples linha curva. A enzima liga-se ao seu substracto CCS) por emparelhamento de bases tipo Watson- 11 35 zzmwFig. 8 - Model for the enzymatic mechanism of L-19 IVS RNA. The RNA catalyzes cleavage and oligoCC reconstitution by the way. 1-2-3-4-1. The enzyme L-19 IVS RNA Cl) is presented with the CRRRRRR binding site, six purines) near its 5 'terminus, and at 6414 with a 3'-hydroxyl group at its 3' terminus. The complex tertiary structure of the molecule CDavies, R.W., et. al., C1982) Nature CLondon) 300: 719; Waring, R.W., et al. , C1983) -J. Mol Biol. 167: 595; Michel, F., et al. , C1983) EMBOD. J. 2:33; Cech, T.R., et al., C1983) Proc. Nai'l. Acad. Know. U.S.A. 80: 3903; Inoue, T. et al., C1985) ibid. 82: 648) is represented as a simple curved line. The enzyme binds to its CCS substrate) by Watson-11 base pairing

Í2.077 1 tef: MW/Oniversity Patents-RNA Ribozyme 10 15No. 2,077 1 tef: MW / Oniversity Patents-RNA Ribozyme 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

Crick) formando o complexo enzima-substracto não covalente C2>. 0 ataque nucleôfilo pela 6414 leva à formação do intermediário covalente £3). Na reacção com o substracto pentanucleótido CS, o intermediário covalente comporta geralmente um único nucleótido, como está indicado? com substractos de cadeia maior pode existir um oligonucleótido ligado ao terminal 3'' da 64Í4. Se o CS se liga ao intermediário £3) conforme indicado em £4), pode ocorrer transest-erificação que origina o novo produto CS e regenera a enzima £1). Note-se que todas as quatro reacçbes neste caminho reaccional são reversíveis. Quando actua como ribonuclease, a L-19 IVS ARN segue o caminho 1--2-3 - 1. 0 intermediário covalente £3) sofre hidrólise libertando o nucleótido ou oligonucleótido ligado ao seu terminal 3" (neste caso, pC) e regenerando a enzima Cl).Crick) forming the non-covalent enzyme-substrate complex C2>. The nucleophilic attack by 6414 leads to the formation of the covalent intermediate (3). In the reaction with the substrate pentanucleotide CS, the covalent intermediate generally comprises a single nucleotide, as indicated? with longer chain substrates an oligonucleotide attached to the 3 'terminal of 64β may exist. If CS binds to intermediate β3) as indicated in Eq. (4), transesterification may occur which gives rise to the new CS product and regenerates the β1 enzyme. Note that all four reactions in this reaction pathway are reversible. When acting as a ribonuclease, the L-19 IVS RNA follows the pathway 1--2-3-1. The covalent intermediate (3) undergoes hydrolysis by releasing the nucleotide or oligonucleotide attached to its 3 " (in this case, pC) and regenerating the enzyme Cl).

Fig. 9 - Inibição competitiva provocada por d-C5 na reacção com o pCS. CA) p$C5 5 uM, apresentado (sem reacção prévia) na faixa 0, foi incubado com L-19 IVS ARN 0.16 uM em condiçSes reaccionais Standard. As reacçóes foram efectuadas na ausência de d-CS ou na presença de d—CS SG uíi, SOO ui*l ou 1000 uM, . como indicado. CE!) Gráficos de Lineweaver-Burk da velocidade da reacção da conversão de pCS a pC4 + pC3 na presença de d-C5 não marcado nas seguintes concentraçSes: Co) 0 uM, (quadrado aberto) S0 uM, (triângulo aberto) ISO uM. (circulo a cheio) 300 uM, ou (quadrado a cheio) SOO uM. A análise limitou-se aos produtos mais pequenos porque a respectiva produção é afectada apenas pela primeira reacção de transesterificação (Fig.8). Embora o d-C5 seja inactivo na primeira reacção de transesterificação apresenta 1Fig. 9 - Competitive inhibition caused by d-C5 in reaction with pCS. CA) pUC5 5 μM, presented (without prior reaction) in the 0 range, was incubated with L-19 IVS RNA 0.16 μM under standard reaction conditions. Reactions were carried out in the absence of d-CS or in the presence of d-CS SG1, SO2 Î »1 or 1000 ÂμM,. as indicated. CE!) Lineweaver-Burk plots of the reaction rate of conversion of pCS to pC4 + pC3 in the presence of unlabeled d-C5 in the following concentrations: Co) 0 æM, (open square) δ æM, (open triangle) ISO æM . (solid circle) 300æM, or (square-filled) SO uuM. The analysis was limited to the smaller products because their production is affected only by the first transesterification reaction (Fig. 8). Although d-C5 is inactive in the first transesterification reaction it has 1

1515

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 25 30 &2.077Mod. 71-10000 ex. - 89/07 25 30 &

Bef; RJW/University Patents-BNA Ribozyine 5 alguma actividade como substracto na segunda reacção de transester if icação CZaug, A., et al. , resultados não publicados)., podendo assim afeetar a produção de cadeias de tamanho superior a 5. &lt;C) Q Km/Vmax&quot; determinado a partir dos coeficientes 10 angulares das curvas em C8) encontra-se registado em função da concentração de inibidor. A intercepção no eixo dos xx é igual a -K i ? K i = 260 uM.Bef; RJW / University Patents-BNA Ribozyme 5 some activity as substrate in the second transesterification reaction CZaug, A., et al. , unpublished results), and thus could affect the production of chains of size greater than 5. <C) Q Km / Vmax &quot; determined from the angular coefficients 10 of the curves in C8) is recorded as a function of inhibitor concentration. The intercept on the x-axis is equal to -K i? K i = 260 ÂμM.

Fig. 10 - Relação entre as reacçSes catalisadas pela L-13 IVS ARN e as reacçbes de auto-processamento e similares mediadas pela IVS ARN. A formação do intermediário enzima-substracto covalente (A) é análoga à auiociclização da IVS ARN CB). A resolução do intermediário enzima-substracto CC) é análoga à ligação do exão CD) ou à iversão da ciclização CSullivan, F.X. and Cech, T.R &lt;1985) Cell 42:639). A hidrólise do intermediário enzima-substracto CE) é análoga à hidrólise dirigida da IVS ARN circular CF) ou do pré-rARN C Inoue, T. et al &lt;1986) J. Mol.Fig. 10 - Relation between the reactions catalysed by L-13 IVS RNA and the self-processing reactions and the like mediated by IVS RNA. The formation of the covalent enzyme-substrate intermediate (A) is analogous to the enhancement of the IVS RNA CB). The resolution of the enzyme-substrate intermediate CC) is analogous to the binding of the CD exon) or to the cyclic moiety CSullivan, F.X. and Cech, T.R &lt; 1985) Cell 42: 639). The hydrolysis of the enzyme-substrate intermediate CE) is analogous to the directed hydrolysis of the circular RNA IVS CF) or the preRARN C Inoue, T. et al., 1986) J. Mol.

Biol. 1891143—165).Biol. 1891143-165).

Fig. 11 - A L-19 IVS ARN catalisa a desfosforilação do ácido ol igoC citidí lico) fosfatado em 3'-. CA) A L—19 IVS ARN ^0.16 uM^ foi incubada com ptC-5 CIO uM) , p#AS CIO uli) , CSpfCp Ccerca de 2 nM) , e A6p#Cp- C cerca de 3 nM&gt; em MgCI2 20 mil e tris-HCl 50 mM pH-7.5 a 42°C durante os tempos indicados. Qs produtos da reacção foram separados por electroforese em gel de sequenciação de poliacrilamida a 20% e ureia 7M, de que se apresenta um auto-radiograma. CB) A L-19 IVS ARN &lt;0.2 uM) foi incubada com CSp# (cerca de 2nM) como indicado acima. A fosfoenzima Ε-ρΐ é aFig. 11 - L-19 IVS RNA catalyzes the dephosphorylation of oligo-cytidylic acid phosphate in 3'-. CA) L-19 IVS RNA = 0.16æM was incubated with ptC-5 (10%), pCS (10%), CSpfCp (about 2 nM), and A6p # Cp-C about 3 nM> in 20 mM MgCl 2 and 50 mM Tris-HCl pH 7.5 at 42øC for the indicated times. The reaction products were separated by 20% polyacrylamide and 7M urea sequencing gel electrophoresis, which showed an autoradiogram. CB) L-19 IVS RNA &lt; 0.2æM) was incubated with CSβ ((about 2æM) as indicated above. The phosphoenzyme Ε-ρΐ is the

35 1 5 10 12.077 tef: RjW/University Patents-RKA Ribozyme35 1 5 10 12,077 tef: RjW / University Patents-RKA Ribozyme

.“13 IVS ARN com um fosfato monoéster no terminal Electroforese em gel e auto-radiografia como em CA). Apenas :arregou no gel uma porção da amostra obtida após 5 minutos.. IVS RNA with a monoester phosphate at the terminus Gel electrophoresis and autoradiography as in CA). Only: a portion of the sample obtained after 5 minutes was added to the gel.

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25

Fig. 12 - Efeito do pH nas reacçóes de transferência de fosfato e de grupos nucieôtido. CA) faixa 1, CSptCp não tratado; faixas 2-11, CSpXCp C15 nM) incubados com excesso de L-19 IVS ARN CSOO nM) em MgC12 20 mM e tampão S0 mM C NaOAc para os pH 4.0 e 5.0, Tris-Hcl para o pH=7.5 CHÉS para os pH 3.0 e 10.0)? faixa 12, C5p$ Cp tratado cora fosfatase do intestino de vitelo, para fornecer um marcador para o CSp#C-QH; faixa 13, ptCS não tratado; faixas 14-23, p.*C5 &lt;15 nM) incubado com excesso de L-13 IVS ARN CSOO nM), como nas faixas 2-11. As reacçóes processaram-se a 42°C durante os tempos indicados, após o que foram paradas por adição de um volume igual de tampão de ureia contendo EDTA 50 mM. CB&gt; C5p$Cp Ccerca de 2 nM),foi incubado com L-19 IVS ARN C0.2 uM) a dH=5.0 durante os tempos indicados. CC) Dados semelhantes aos apresentados em CB) excepto com C5p$Cp 15 nM, que - foram quantificados por contagem de cintilações em liquido nas fitas de gel. Os registos semi logarítmicos Clineares para os três ou quatro primeiros valores do tempo) foram utilizados para a determinação de tl/2. A constante de velocidade de primeira ordem observada, CKobsd) foi calculada como (In 2) /tl/2). Os tampões utilizados foram o NaOAc (para os pH 4.0 e 5.0), MES (para os pH 5.5 e 6.0) e Tris-HCl CpH 7). (A estimativa foi baseada num único ponto experimental obtido quando tinha ocorrido cerca de 50% da reacção). 14 35Fig. 12 - Effect of pH on phosphate and nucleotide transfer reactions. CA) lane 1, untreated CSptCp; lanes 2-11, CS15 C15 nM) incubated with excess L-19 IVS CSOO nRNA) in 20 mM MgCl2 and 10 mM NaCl buffer NaOAc at pH 4.0 and 5.0, Tris-HCl at pH = 7.5 CHES for pH 3.0 and 10.0)? lane 12, C5p $ Cp treated with calf intestinal phosphatase, to provide a marker for CSβ # C-QH; lane 13, untreated ptCS; lanes 14-23, p. * C5 &lt; 15 nM) incubated with excess L-13 IVS CSOO nRNA), as in lanes 2-11. The reactions were run at 42 ° C for the indicated times, after which they were stopped by adding an equal volume of urea buffer containing 50 mM EDTA. CB &gt; C5p $ CpCcerca of 2 nM), was incubated with L-19 IVS RNA C0.2 μM) at dH = 5.0 for the indicated times. CC) Data similar to those given in CB) except for 15 nM C5p $ Cp, which - were quantified by counting liquid scintillation on the gel ribbons. The logarithmic Clinear records for the three or four first time values) were used for the determination of tl / 2. The observed first-order velocity constant, CKobsd) was calculated as (In 2) / tl / 2). The buffers used were NaOAc (at pH 4.0 and 5.0), MES (at pH 5.5 and 6.0) and Tris-HCl CpH 7). (The estimate was based on a single experimental point obtained when about 50% of the reaction occurred). 14

II

£2.077 1 Ref: RJW/University Patents-PNA Ribozyme£ 2,077 1 Ref: RJW / University Patents-PNA Ribozyme

Fig. 13 - A fosforilação da enzima é reversível. A L-13 IVS ARN CG. 2 uM) foi fosforilada incubando com C5p nSo marcado 2.5 uM a durante íalguns) minutos a 42°C a pH 5.0. Adicionaram-se então à E-p não marcada quantidades mínimas Cvestigiais) de: (A) , CSp# Cl. 2 nM) , ou: CB), p#C5 C20 nM) , e a incubação continuou durante os tempos indicados.Fig. 13 - Phosphorylation of the enzyme is reversible. L-13 IVS RNA CG. 2 ÂμM) was phosphorylated by incubating with 2.5 ÂμM unlabelled C5Î ± for a few minutes at 42Â ° C at pH 5.0. The following were then added to the unlabeled E-p, minimal amounts (C) of: (A), CSP # Cl. 2 nM), or: CB), p # C5 C20 nM), and incubation continued for the indicated times.

Fig. 14 - A L-13 IVS ARN act-ua cataliticamente como fosfotransferasè. CA) incubaram-se concentrações sucessivamente menores de C5p$ com L—19 IVS ARN 0.32 uM e UCU—0H não marcado 100 15Fig. 14 - The L-13 IVS RNA acts catalytically as phosphotransferase. CA) successively lower concentrations of C5β incub were incubated with 0.32æM IVS RNA IVS and unlabeled UCU-OH 100 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 uH durante 30 minutos. A radioactividadè especifica do CSp$ foi ajustada por adição de CSp# não marcado para manter a radioactividadè constante nas amostras. A pequena banda intermédia observada em algumas reacções, é provavelmente devida 20 a UCUCp formado pelo ataque do UCU a um intermediário covalente E-pCp . Faixa &lt;-), C5p$ antes da incubação. CB) C5p:t C2.5 uM) incubado com L—19 IVS ARN 0.16 uM e UCU—QH não marcado 200 uM. &lt;C) Quantif icação dos dados' apresentados em CB)-, incluindo o E-p 25 marcado, que migrou junto ao topo do gel. Em todos os casos a incubação processou-se a 42°C e MgCI2 20 mM e MES 50 mM pH=6.0. 30Mod. 71-10000 ex. For up to 30 minutes. The specific radioactivity of CSp foi was adjusted by the addition of unlabeled CSp # to maintain radioactivity constant in the samples. The small intermediate band observed in some reactions is probably due to the UCUCp formed by the UCU attack on a covalent E-pCp intermediate. Range &lt;-), C5p $ before incubation. CB) C5p: t C2.5uM) incubated with L-19 IVS RNA 0.16æM and 200æM unlabeled UCU-QH. &lt; C) Quantification of data presented in CB) - including labeled E-p25, which migrated near the top of the gel. In all cases the incubation was run at 42øC and 20 mM MgCl 2 and 50 mM MES pH = 6.0. 30

Fig. 15 - Modelo de um centro activo único para a actividade da L-13 IVS ARN com os substactos fosfato diéster e fosfato monoéster. CA) Nucleotidi1ização reversível da L—13 IVS ARN, proposta como o passo fulcral na reacção da poliCO-polimerase CZaug &amp; Cech, &lt;1386) Science CWash. D.C. 231:47o-475). CB) Fosforilação reversível da L-19 IVS ARN que permite à enzima actuar como fosfotransferase. Em ambos os casos o substracto oligoCC) emparelha-se através das bases com o local 15Fig. 15 - Model of a single active site for L-13 IVS RNA activity with the phosphate diester and monoester phosphate substitutes. CA) Reversible nucleotidiization of L-13 IVS RNA, proposed as the key step in the reaction of the CZaug &amp; Cech, &lt; 1386) Science CWash. D.C. 231: 474-475). CB) Reversible phosphorylation of L-19 IVS RNA that allows the enzyme to act as phosphotransferase. In both cases the oligoCC substrate is annealed through the bases with the locus 15

£2.077£ 2,077

Hef: RJW/University Patents-RNA. Ribozyme de fixação ol igoCpirimidinsJ C se is R&quot;s) para formar um complexo não covalente. 0 local de fixação da IVS ARN consiste nos nucleótidos 22 a 27 e tem a sequência CGGAGGG) CW.D.Been e T.R. Cech (1986) Cell 47:206-216). 0 ataque nucleófilo pelo hidroxilo 3' da guanosina G414 do centro activo leva à formação de E-pC CA) ou E-p CB) e à libertação de C5. A complexa estrutura terciária da molécula é representada por urna simples linha curva.Hef: RJW / University Patents-RNA. Ribozyme binding of oligo C-pyrimidines and C (R is) to form a non-covalent complex. The IVS RNA binding site consists of nucleotides 22 to 27 and has the sequence CGGAGGG) CW.D.Been and T.R. Cech (1986) Cell 47: 206-216). Nucleophilic attack by the 3 'hydroxyl of guanosine G414 from the active site leads to the formation of E-pC CA) or E-pBc) and to C5 release. The complex tertiary structure of the molecule is represented by a simple curved line.

Fig. 16 - 0 plasmideo pBGST7 contém um fragmento com a IVS inserida no local de clonagem múltipla de um pequeno derivado do pUC18, que por sua vez contém um promotor do fago T7. A linha dupla representa o ADN do plasmideo com a IVS. As posições relativas dos promotores encontram-se indicadas. As posições do local EcoRI e Hind III estão indicadas pelas setas. A linha superior representa o transcrito feito in vitrò a partir do ADN do plasmideo purificado com a ARN-polimerase do fago T7. Os números acima da linhá referem-se ao tamanho, em nucleótidos, dos exões e da IVS. A linha inferior representa o transcrito in vivo do terminal 5' do lacZ', A IVS (linha grossa) contém códões de paragem em todas as três zonas de leitura Creadig frarnes),' pelo que um fragmento alfa funcional pode apenas ser produzido se a IVS for retirada e os exões forem juntos por autoprocessamento em E.coli.Fig. 16 - Plasmid pBGST7 contains an IVS fragment inserted into the multiple cloning site of a small derivative of pUC18, which in turn contains a T7 phage promoter. The double line represents plasmid DNA with IVS. The relative positions of the promoters are indicated. Positions of the EcoRI and Hind III site are indicated by the arrows. The topline represents the in vitro transcript from plasmid DNA purified with the T7 phage RNA polymerase. The numbers above the line refer to the nucleotide size of the exons and the IVS. The lower line represents the in vivo transcript of the 5 'terminal of the lacZ'. The IVS (heavy line) contains stop codons in all three Creadig reading areas, 'whereby a functional alpha fragment can only be produced if the IVS is withdrawn and the exons are joined by autoprocessing in E. coli.

Fig. 17 - Aumento na especificidade de clivagem na presença de ureia ou de formam ida', (a) Um substracto ol igonuc leõtido (GGCCCUCUAS), de tamanho igual a 13, marcado com 32P no seu terminal 5-, foi incubado com a 1-19 IVSbeta ut selvagem ou com 16 i.Fig. 17 - Increase in cleavage specificity in the presence of urea or formamide, (a) An oligonucleotide (GGCCCUCUAS) substrate of size equal to 13, labeled with32P at its 5-terminus was incubated with 1-19 IVSbeta ut wild or with 16 i.

£2.077 Ref: RJW/University Patents-ΒΚΆ Ribozyme£ 2,077 Ref: RJW / University Patents-ΒΚΆ Ribozyme

a variante 24C, ambas preparadas'como é descrito por Zaug et al., Nature ¢1996). Os diagramas mostram os complexos propostos (com as bases emparelhadas) entre o substracto (cadeia de cima) e o sitio activo da ribozima (cadeia de baixo). As reacções contém substracto 0.12 uM, ribozima 0.05 uM, STP 0.5 mM, NaCl 10 mM, MgC12 10 mM, Tris-Hcl 50 mM pH=7.5 e as concentações de ureia indicadas. A incubação fez-se a S0°C durante 15 ou 60 minutos conforme o indicado. As amds-tras foram analisadas por electrofo-rese em gel de poliacrilamida a 20% e ureia 7M, de que sevariant 24C, both prepared as described by Zaug et al., Nature ¢ 1996). The diagrams show the proposed complexes (with the paired bases) between the substrate (upper chain) and the ribozyme (lower chain) active site. Reactions contain 0.12 ÂμM substrate, 0.05 ÂμM ribozyme, 0.5 mM STP, 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl pH = 7.5 and the indicated urea concentrations. Incubation was carried out at 50 ° C for 15 or 60 minutes as indicated. The amds-tras were analyzed by electrophoresis in 20% polyacrylamide gel and 7M urea, from which

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 apresenta um auto-radiograma. (b) Um substracto oligonucleótido CGGCCGCUA5), de tamanho igual a 12, foi incubado com a L-19 IVSbeta ARN selvagem ou com a variante 24C. As condições são as descritas em Ca), excepto as concentrações de substracto 1.0 uM, a de ribozima 0.10 uM. íc) As mesmas condições reaccionais e de substracto que em Cb&gt;, mas substituindo a ureia pela formamida CA formamida 2.SM corresponde a 10% v/v). A clivagem pela ribozima da variante 24C ultrapassa a clivagem pela ribozima selvagem entre 1-0 M e 2.0 M de formamida. 25Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 presents an auto-radiogram. (b) An oligonucleotide substrate CGGCCGCUA5), of size equal to 12, was incubated with wild-type L-19 IVSbeta or 24C variant. The conditions are those described in Ca), except for the concentrations of 1.0 ÂμM substrate, 0.10 ÂμM ribozyme concentration. (c) The same reaction conditions and substrate as in Cb>, but replacing urea with formamide 2.SM formamide corresponds to 10% v / v). The ribozyme cleavage of the 24C variant overcomes the cleavage by the wild ribozyme between 1-0M and 2.0M formamide. 25

Fig. 18 - A clivagem de um substracto nucleótido que forma um complexo ribozima-substacto mal emparelhado é muito sensível à ureia. Os dados da fig. 17a referentes aos pontos obtidos cipós 15 minutos foram quantificados por contagem de cintilações em 30 líquido nas fitas de gel. (·&gt;, ribozima selvagem, (&gt;) ribozima da variante 24C (complexo mal emparelhado).Fig. 18 - Cleavage of a nucleotide substrate forming a poorly paired ribozyme-subtact complex is very sensitive to urea. The data of Fig. 17a for the points obtained 15 minute vines were quantified by counting liquid scintillations on the gel ribbons. (?), Wild ribozyme, (>) ribozyme of variant 24C (mismatched complex).

Fig. 19 - Construção do pT7L-21, um plasmideo que facilita a síntese da ribozima selvagem C L-21 Seal ARN). 0 vector pUC18 foi preparado por remoção do fragmento Sphl/EcoRI do local de 17 35 1 €2.077Fig. 19 - Construction of pT7L-21, a plasmid which facilitates the synthesis of the wild-type ribozyme C L-21 Seal RNA). The pUC18 vector was prepared by removal of the SphI / EcoRI fragment from the site of 17 351 € 2.077

Raf: RJW/University Patents-RNA Ribozyme 5 : lonagem múltipla. Um fragmento de AON sintético contendo um terminal EcoRI saliente em 5'CS' overhang), um promotor da ARN-Do1imerase do fago T7 CDunn &amp; Studier, (1983) J. Mol. Biol. 166:477-535), e as bases 22-44 do rARN do IVS do Tetrahvmena thermophila (incluindo o terminal Sphl saliente em 3&quot;) foram inseridos no vector. Este plasmídeo foi clonado e sequenciado, e em seguida cortado com Sphl e HindIII. Q fragmento Sphl/HindiII do pBGST7 (395 bp) CBeen &amp; Gech, (1386) CeII (Cambrige, llass. ) 47:207-216·), contendo as bases 45-414 da IVS e mais 25 bases do 15 “~Raf: RJW / University Patents-RNA Ribozyme 5: multiple slurry. A synthetic AON fragment containing a salient EcoRI terminus in 5'CS 'overhang), a CD4 + phage T7 RNA-Do1imerase promoter. Studier, (1983) J. Mol. Biol. 166: 477-535), and Tetrahvmena thermophila IVS rRNA bases 22-44 (including the 3 'outgoing SphI terminal) were inserted into the vector. This plasmid was cloned and sequenced, and then cut with SphI and HindIII. The SphI / HindIII fragment of pBGST7 (395 bp) CBeen & Gech, (1386) CeII (Cambrige, llass.) 47: 207-216), containing bases 45-414 of IVS and 25 bases of 15%

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 exão 3', fqi inserido para dar pT7L-21. 0 pT7L-21 foi linearizado com endonuclease de restrição -Seal, truncando a cadeia-roolde no IVS cinco nucleótidos a montante do local de processamento 3'. A transcrição in vitro com a ARN-polimerase de T7 purificada dá 20 então o ARN L-21 Seal, que contém os nucleótidos 22-409 da IVS. 25Mod. 71 -10000 ex. The exon 3 'was inserted to give pT7L-21. PT7L-21 was linearized with -Seal restriction endonuclease, truncating the chain-roolde in the IVS five nucleotides upstream of the 3 'processing site. In vitro transcription with the purified T7 RNA polymerase then gives the L-21 RNA Seal, which contains nucleotides 22-409 of IVS. 25

Fig. 20 - Efeito da concentração de ureia na velocidade de. clivagem do substracto GGCCCGCUA5 com a L-21 Seal ARN. A concentração de ribozima era de 0.01 uM» a concentração do substracto oligonucleótido variou entre 0.10 e 3.78 uM. As concentrações de ureia (M) são as indicadas.20 - Effect of urea concentration at the rate of. cleavage of substrate GGCCCGCUA5 with L-21 Seal RNA. The ribozyme concentration was 0.01 ÂμM, the concentration of the oligonucleotide substrate ranged from 0.10 to 3.78 ÂμM. The concentrations of urea (M) are as indicated.

Fig. 21 - Efeito da concentração de ureia na velocidade de clivagem de substractos oligonucleótido pela L-21 Seal ARN. Os substract-os oligonucleótido continham as sequências de reconhecimento CCCCCU (), CCC6CU (♦), CCCUCU (·), CUCCCU (D), CUCGCU (Ό), e CUCUCU (o&gt;. Em cada caso a sequência de reconhecimento era precedida por dois resíduos Θ e seguidas por cinco resíduos A. As reaeções continham oligonucleótido 0.80 uM e L-21 18 10 15Fig. 21 - Effect of urea concentration on the rate of cleavage of oligonucleotide substrates by L-21 Seal RNA. The oligonucleotide subunits contained the recognition sequences CCCCCU (), CCC6CU ()), CCCUCU ()), CUCCCU (D), CUCGCU (Ό), and CUCUCU (&). In each case the recognition sequence was preceded by two residues Θ and followed by five residues A. The reactions contained oligonucleotide 0.80 æM and L-21 18 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62.077 Ref: RJW/University Patents-RM RibozymsMod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62.077 Ref: RJW / University Patents-RM Ribozyms

Seal ARN 0.01 uM. Todas as velocidades são velocidades iniciais excepto para os substractos contendo CCCCCU, onde a c1ivagem era tão rápida qua algumas das velocidades são baseadas em dados em que houve clivagem de uma grande fraeção do substractoj nesses casos, a velocidade inicial é subestimada. Figs. 22-31 - mostram o efeito da ureia, do NH4Ac ou do Mg++ nos perfis da velocidade de clivagem das ribozimas TTC, TTA e TGT em substractos emparelhados e mal emparelhados. DESCRICÃO A sequência interveniente (IVS) do rARN de Tetrahymena é * uma molécula de ARN catalítica ou ribozima. E mediadora do auto-processamento do ARN, conseguindo a sua própria extraeção do grande percursor do ARN ribossomal e convertendo-se subsequentemente numa forma circular (Kruger, K., et al. (1982) Cell 31.:147-1575 Zaug, A.J. , et al. (1983) Nature 301:578-583). Nestas reacçóes os locais de processamento e os locais de ciclização podem ser visualizados como substractos intramoleeulares para uma actividade que reside na IVS do ARN (Zaug, A. J., et al. (1984) Science 224:574-578). Esta não é contudo uma verdadeira reacçSo enzimática , já que o ARN não é regenerado na sua forma original ao fim da reacção de auto-processamento. A IVS do ARN na sua forma linear é designada como L IVS ARN. Este ponto de vista foi corroborado por estudos com a L-19 IVS ARN, uma forma linear da IVS- em que faltam os 19 primeiros nucleótidos. Como os locais de ciclização estão ausentes, a L-19 19 35Seal RNA 0.01æM. All speeds are initial velocities except for CCCCCU-containing substrates, where the cation was so fast that some of the velocities are based on data where there was cleavage of a large fraction of the substrate, in which case the initial velocity is underestimated. FIGS. 22-31 show the effect of urea, NH4Ac or Mg ++ on the cleavage rate profiles of TTC, TTA and TGT ribozymes in paired and mismatched substrates. The intervening sequence (IVS) of Tetrahymena rRNA is a catalytic RNA or ribozyme molecule. It mediates RNA self-processing, achieving its own extraction from the major precursor of ribosomal RNA and subsequently converting to a circular form (Kruger, K., et al. (1982) Cell 31: 147-1575 Zaug, AJ , et al (1983) Nature 301: 578-583). In these reactions the processing sites and the cyclization sites can be visualized as intramolecular substrates for an activity residing in the RNA IVS (Zaug, A.J., et al. (1984) Science 224: 574-578). This is not, however, a true enzymatic reaction, since the RNA is not regenerated in its original form at the end of the auto-processing reaction. The IVS of RNA in its linear form is designated as L IVS RNA. This view was corroborated by studies with L-19 IVS RNA, a linear form of IVS- lacking the first 19 nucleotides. As the cyclization sites are absent, L-19 19 35

62.077 i Bef: R)W/University Patents-RNA Rlbozyme62,077 i Bef: R) W / University Patents-RNA Rlbozyme

I 5 10 15I 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 IVS ARN não pôde participar em reacçÕes intramoleculares CZaug, A.J., et ai. ,(1984-) Science 224:574-57S) . Contudo, mantém ainda a actividade e pode catalisar reacções de clivagem-ligaçâo em outras moléculas de ARN CZaug, A.J. and Cech, T.R. (1986) Science 231:470-475). Na presença de substracto ácido oligo(citidíli-CO) , a L-19 IVS ARN actua como uma enzima com activ idades de nucleotidi1-transferase EpoiiCO-polimerase], e de fosfodiestera-se Cribonuclease) (Zaug, A.J., and Cech, T.R.C1986) Science 231:470-475). Com sustráctos oligo-CC) fosforilados em 3', a mesma ribozima actua como uma fosfotransferase e como uma fosfatase ácida CZaug, A.J.,e Cech, T.R. (1986) Biochemistry 25:4478-4482). Uma caracteristica-chave, presente nos mecanismos de todas estas quatro reacções, consiste na formação de um intermediário enzima-substracto covalente no qual se dá a esterificação de um nucleótido ou de um fosfato com o 3'-Q da G414, a guanosina terminal 3' da IVS ARN. Além disso, iremos aqui descrever uma quinta actividade enzimática, relacionada com a actividade de endorribonuclease da L-19 IVS ARN sobre outras moléculas de ARN. A seguir ao auto-processamento do percursor do rARN de Tetrahvmena. a IVS ARN extraída (Abreviações: IVS, sequência interveniente ou intrão? L-19 IVS ARN Cleia-se &quot;L menos 19&quot;) , um ARN com 395-nt sem os primeiros 19 nt Cnt, nucleótidos) da L IVS ARN (o produto directo do processamento do ARN pré-ribossomal); p$, 32P (isótopo fósforo 32) inserido num oiigonucleótido, em que, por exemplo, CSptC representa CpCpCpCpCC32P)C e ptCS representa (32P)CpCpCpCpC; d-CS, deoxi-C5&gt; passa por uma série de 20 10 15Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 IVS RNA could not participate in intramolecular reactions CZaug, A.J., et al. , (1984-) Science 224: 574-57S). However, it still retains activity and can catalyze cleavage-binding reactions on other RNA molecules CZaug, A.J. and Cech, T.R. (1986) Science 231: 470-475). In the presence of an oligo (cytidyl-CO) substrate, the L-19 IVS RNA acts as an enzyme with nucleotide di-transferase actives, and phosphodiesterase Cribonuclease) (Zaug, AJ, and Cech, TR C1986) Science 231: 470-475). With 3 'phosphorylated oligo-CCs, the same ribozyme acts as a phosphotransferase and as an acid phosphatase CZaug, A.J., and Cech, T.R. (1986) Biochemistry 25: 4478-4482). A key feature, present in the mechanisms of all four of these reactions, is the formation of a covalent enzyme-substrate intermediate in which the esterification of a nucleotide or a phosphate is carried out with 3'-Q of G414, terminal guanosine 3 of the IVS RNA. In addition, we will describe here a fifth enzymatic activity, related to the endorribonuclease activity of L-19 IVS RNA over other RNA molecules. Following the self-processing of the Tetrahvmena rRNA precursor. the IVS RNA extracted (Abbreviations: IVS, intervening sequence or intron? L-19 IVS RNA Clears &quot; L at 19 &quot;), a 395-nt RNA without the first 19 nt Cnt, nucleotide) the direct product of pre-ribosomal RNA processing); p 322 (phosphorus isotope 32) inserted into a oligonucleotide, where, for example, CSptC represents CpCpCpCpCC32P) C and ptCS represents (32P) CpCpCpCpC; d-CS, deoxy-C5 &gt; goes through a series of 20 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 62.077 4 Eef: BJW/University Patents-RNA RibozynieMod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 62,077 4 Eef: BJW / University Patents-RNA Ribozynie

reacções de ciclização e de hidrólise dirigida. Q produto final, a L-19 IVS ARN, é uma molécula linear que não tem os primeiros 19 nucleótidos do ARN originalmente extraído CZaug, A.J., et al. C1984) Science 224;574) Interpretámos a ausência de reacções posteriores da espécie L-19 como uma indicação de que todos os locais reactivos potencialmente existentes na molécula, e que podiam atingir o seu centro activo, Cisto é, os substractos intramoleculares) tinham sido consumidos; e propusémos que a actividade provávelmente não era perturbada CZaug, A. J. , et al.C19S4) Science 224:574) CL IVS é a IVS ARN linear). Testámos esta hipótese adicionando substractos oligonucleótido à L-19 IVS ARN. Verificámos que cada molécula de IVS ARN consegue catalisar a clivagem e a reconstituição de muitos oligonucleôtidos. Assim, a L-19 IVS ARN é uma verdadeira enzima. Embora a enzima possa actuar sobre moléculas de ARN com grandes dimensões e sequências complexas, verificámos que os estudos com oligorribonucleótidos simples como o pC5 Cácido pentacitidílico) são mais informativos, permitindo a determinação das quantidades mínimas de substracto necessárias à reacção, bem como do mecanismo da reacção desta enzima. Actividades de nucleotidi1-transferase ou de ARN—po1imerasecyclization reactions and directed hydrolysis. The final product, L-19 IVS RNA, is a linear molecule lacking the first 19 nucleotides of originally extracted RNA CZaug, A.J., et al. C1984) Science 224; 574) We interpreted the absence of further reactions of the L-19 species as an indication that all reactive sites potentially present in the molecule, and which could reach its active site, Cyst, intramolecular substrates) had been consumed; and we proposed that the activity was probably not disturbed CZaug, A.J., et al. C19S4) Science 224: 574) CL IVS is the linear RNA IVS). We tested this hypothesis by adding oligonucleotide substrates to the L-19 IVS RNA. We have found that each RNA IVS molecule can catalyze the cleavage and reconstitution of many oligonucleotides. Thus, L-19 IVS RNA is a true enzyme. Although the enzyme may act on large RNA molecules and complex sequences, we have found that studies with simple oligoribonucleotides such as pC5 Pentacytidyl Ccid) are more informative, allowing the determination of the minimum amounts of substrate required for the reaction, as well as the mechanism of reaction of this enzyme. Nucleotide-transferase or RNA-poimerase activities

Quando a forma encurtada da sequência interveniente do ARN ribosomal CrARN) auto-processsda de Tetrahvmena thermophila actua como uma nucleotidi1-transferase, catalisa a clivagem e a reconstituição de substractos nucleótido de uma maneira que depende da sequência, com Km =42 uM e kcat = 2 min-1. 0 mecanismo da reacção é semelhante ao dp auto-processamento do 21 35 5 &amp;.077When the shortened form of the Tetrahvmena thermophila ribosomal RNA (RNA) intervening sequence acts as a nucleotidyl transferase, it catalyzes the cleavage and reconstitution of nucleotide substrates in a sequence-dependent manner with Km = 42æM and kcat = 2 min-1. The mechanism of the reaction is similar to that of the self-processing of 21 35 5 &amp; .077

Ref: RJW/University Patehts-FNA RLbozyire percursor do rARN. Usando o ácido pentacitidilico como substracto, as sucessivas reacçbes de clivagem e de reconstituição levam â síntese de ácido policitidílico. Quando o sitio activo é mudado da sequência de nucleótidos natural, 66AG68, para a sequência 6AAAA6, o ácido oligo-uridilico é polimerizado a ácido poliuridílico CBeen e Cech, Cell 47:207(1386)3. Assim, a molécula de ARN pode actuar como uma ARN-polimerase, diferindo da enzima proteica na medida em que utiliza uma cadeia-molde interna em vez de uma externa. Assim, poderiam ser construídos vários heteropolímeros por formas variantes da enzima ARN. Prevê—se, por exemplo , a formação de moléculas de ARN mensageiro para determinados peptídeos ou proteínas. Este mensageiro poderia ser Sintetizado com ou sem intrSes. A valores de pH de.cerca de 3, a mesma enzima ARN apresenta comportamento de ribonuclease com actividade especificamente dirigida a uma ou mais sequências determinadas. 25 30Ref: RJW / University Patehts-FNA RLbozyire rARN precursor. Using pentacytidylic acid as the substrate, successive cleavage and reconstitution reactions lead to the synthesis of polycytidylic acid. When the active site is changed from the native nucleotide sequence, 66AG68, to the sequence 6AAAA6, the oligohydride acid is polymerized to polyurethylic acid CBeen and Cech, Cell 47: 207 (1386). Thus, the RNA molecule may act as an RNA polymerase, differing from the protein enzyme in that it utilizes an internal template strand instead of an outer strand. Thus, several heteropolymers could be constructed by varying forms of the RNA enzyme. It is foreseen, for example, the formation of messenger RNA molecules for certain peptides or proteins. This messenger could be synthesized with or without intrSes. At pH values of about 3, the same RNA enzyme exhibits ribonuclease behavior with activity specifically directed to one or more particular sequences. 25 30

A L-19 IVS ARN faz poli(C) com 30 nucleótidos ou mais ao reagir com o substracto CS, actuando como uma ARN-polimerase ou como uma nucleotidil-transferase. Assim, podem formar-se oligonucleòtidos mais longos Cpolinucleôtidos) a partir de oligonucleótidos curtos. □ número de ligaçóes P-0 não é alterado durante o processo. Na síntese de poliCC) numa cadeia-molde de poliídS) pela ARN-polimerase, uma CTP sofre clivagem por cada resíduo polimerizado. Assim, a reacção da ARN-polimerase é também conservativa em ordem ao número de licções P—0 no sistema. A L—19 IVS ARN pode portanto ser considerada como uma poliCO-polime-rase, que utiliza C4pC como substracto em vez de pppC. Incorpora 22 35 4’L-19 IVS RNA makes poly (C) with 30 nucleotides or more by reacting with the CS substrate, acting as an RNA polymerase or as a nucleotidyl transferase. Thus, longer oligonucleotides C-polynucleotides may be formed from short oligonucleotides. □ number of calls P-0 is not changed during the process. In the synthesis of polyCC) in a polyde template chain) by RNA polymerase, a CTP undergoes cleavage for each polymerized residue. Thus, the R-polymerase reaction is also conservative in order to the number of P-0-licenses in the system. L-19 IVS RNA can therefore be considered as a polyCO-polymorase, which uses C4-C as substrate instead of pppC. Incorporates 22 35 4 '

Í2.077 1 íef: RJW/University Patents-RNA. RLbozyme 5 10 15 unidades pC nõ terminal 3&quot; da cadeia em crescimento, e liberta C45 a C4. é análoga ao pirofosfato libertado pela ARN-polimerase. A síntese é dirigida por uma cadeia-molde, mas essa cadeia-molde encontra-ae no interior da própria enzima ARN. Talvez seja possível separar fisicamente o troço contendo a cadeia-molde do troço catalítico na enzima ARN, com retenção de actividade. Se for esse o caso, a enzima ARN poderia , por hipótese, actuar como uma ARN-replicase primordial, catalisando tanto a sua própria replicação como a de outras moléculas de ARN (T.R. Cech (1386)No. 2,077,1ef: RJW / University Patents-RNA. RLbozyme 5 10 15 units pC non-terminal 3 &quot; of the growing chain, and releases C45 to C4. is analogous to the pyrophosphate released by RNA polymerase. The synthesis is directed by a template strand, but this template strand meets it and within the RNA enzyme itself. It may be possible to physically separate the moiety containing the template strand from the catalytic moiety into the RNA enzyme, with retention of activity. If this is the case, the RNA enzyme could hypothesize to act as a primordial RNA-replicase, catalyzing both its own replication and that of other RNA molecules (T.R. Cech (1386)

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Proc Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. 83:4360-4363). A L-19 IVS ARN catalisa a reacção de clivagem-ligação da pC5 com Km = 42 uM, kcat = 2 min-1, e kcat/Km = 1 X 103 s-1 M-l; 0 Km á da ordem de grandeza dos determinados para as enzimas proteicas. Qs valores de kcat e kcat/Km são mais baixos que os de muitas enzimas proteicas. Contudo, o kcat encontra-se dentro dos valores normais para proteínas que reconhecem sequências específicas de ácidos nueleicos e que catalisam a clivagem na cadeia ou o início da polimerização. Por exemplo, a endonuclease de restrição Eco RI efectua clivagem na sua sequência de reconhecimento em vários substractos ADN, incluindo um fragmento especifico de AON 8 bp, com kcat = 1 min-1 a 18 min-1 CSreene, P. J., et al. (1975) J. Mol. Biol. 93:237; Modrich, et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:5866; Wells, R.D., et al., (1981) Enzymes 14:1575 Brennan, M.B., em preparação, e Terry, B., et al., em preparação). 0 kcat é também semelhante ao da enzima de ARN ribonuclease P, que efectua clivagem no percursor do tARN com kcat = 2 min-1 (Quer.rier-Takada, C. , et al. , (1983) Cell 35:849;Proc Natl. Acad. Know. U.S.A. 83: 4360-4363). L-19 IVS RNA catalyzes the cleavage-binding reaction of pC5 with Km = 42 ÂμM, kcat = 2 min-1, and kcat / Km = 1 X 103 s-1 M-1; 0 Km in the order of magnitude of those determined for protein enzymes. The kcat and kcat / Km values are lower than those of many protein enzymes. However, kcat is within normal values for proteins which recognize specific sequences of nucleic acids and which catalyze cleavage in the chain or the initiation of polymerization. For example, Eco RI restriction endonuclease cleaves its recognition sequence on several DNA substrates, including a specific fragment of AON 8 bp, with kcat = 1 min -1 at 18 min -1 CSreene, P.J., et al. (1975) J. Mol. Biol. 93: 237; Modrich, et al. (1976) J. Biol. Chem. 251: 5866; Wells, R.D., et al., (1981) Enzymes 14: 1575 Brennan, M.B., in preparation, and Terry, B., et al., In preparation). The kcat is also similar to that of the RNA ribonuclease P enzyme, which cleaves the precursor of the tRNA with kcat = 2 min -1 (Querer-Takada, C., et al., (1983) Cell 35: 849;

-“IO 35 1 5 10 15 62.077 Fef: HJW/CJniversity Patents-RM Ribozyire- IO 35 1 5 10 15 62.077 Fef: HJW / CJniversity Patents-RM Ribozyire

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Marsh, T. L., et al. em &quot; Sequence Speeificity in Transçription and Translation&quot; , R. Calendar e L. Qold Eds., UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology» &lt;Plenum, New York), a publicar). Outra maneira de avaliar a eficiência da L-19 IVS ARN consiste em comparar a velocidade da reacção catalisada com a velocidade da reacção puramente química. A reacção de transesterificação entre dois oligonueleótidos livres nunca foi observada, pelo que a velocidade da reacção não catalisada é desconhecida. Por outro lado, a velocidade de hidrólise de fosfatos diéster simples tem sido estudada CKumamotó, -J., et al. &lt;1356) J. Am. Chem. Soc. 78:4853; P.C. Haake et al. ibid &lt;1961) 83:1102; Kirby, A. J. et al, &lt;1970) J. Ghem. Soc. Ser. 5‘. , p. 1165; Bunton, C.A., et al. &lt;1969) J. Org. Chem. 34:767)). A constante de velocidade de segunda ordem para a hidrólise alcalina da ligação fosfodiéster lâbil na IVS ARN circular &lt;Zaug, A.J., et al., &lt;19S5) Biochemistry 24:6211) é 12 ordens de grandeza superior â determinada para o dimetilfosfato &lt;Kumamoto, J. et al &lt;1956) supra), e dez ordens de grandeza superior à esperada para uma ligação fosfodiéster normal no ARN &lt; a velocidade de ataque nucleófilo nos ésteres de fosfato pelo ião hidróxido é sensível ao pKa do ácido conjugado do grupo libertado. Um grupo fosfato no ARN deveria ser mais reactivo que o no dimetilfosfato* porque o pKa =12.5 para uma ribose nucleosídica e o pKa = 15.5 para o metanol t valores a 25°C, de P.G.P. T'so, Basic Principies in Nuçleic Acid Chemistry &lt;Academic Press, New York &lt;1974), yol.I, pp462-463, e P. Ballinger e F.A. Long, J. Am. Chem.Soc.82:735 C1960), respectivamente]. Tomando os 24 35 γχ4:ν.·\..Marsh, T. L., et al. in &quot; Sequence Speeificity in Transcription and Translation &quot; , R. Calendar and L. Qold Eds., UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, &lt; Plenum, New York), to be published). Another way to evaluate the efficiency of L-19 IVS RNA is to compare the rate of the catalyzed reaction with the rate of the purely chemical reaction. The transesterification reaction between two free oligonueleotides has never been observed, whereby the rate of the uncatalyzed reaction is unknown. On the other hand, the rate of hydrolysis of simple diester phosphates has been studied CKumamotó, -J., Et al. &lt; 1356) J. Am. Chem. Soc. 78: 4853; P. C. Haake et al. ibid., 1961) 83: 1102; Kirby, A.J et al, &lt; 1970) J. Ghem. Soc. Ser. 5 '. , P. 1165; Bunton, C.A., et al. &lt; 1969) J. Org. Chem. 34: 767)). The second order rate constant for alkaline hydrolysis of the labile phosphodiester bond in circular IVS RNA &lt; Zaug, AJ, et al., <19S5) Biochemistry 24: 6211) is 12 orders of magnitude higher than that determined for dimethylphosphate &lt;; Kumamoto, J. et al. &Lt; 1956) supra), and ten orders of magnitude greater than expected for a normal phosphodiester linkage in RNA < the nucleophilic rate of attack on the phosphate esters by the hydroxide ion is sensitive to the pKa of the conjugate acid of the liberated group. A phosphate group on RNA should be more reactive than that on dimethylphosphate * because pKa = 12.5 for a nucleoside ribose and pKa = 15.5 for methanol have values at 25 ° C, of P.G.P. T'so, Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry &lt; Academic Press, New York &lt; 1974), yol.I, pp462-463, and P. Ballinger and FA Long, J. Am. Chem.Soc.82: 735 C1960 ), respectively]. Taking the 24 35 γχ4: ν. · ...

62.077 Bef: RJW/University Patents-RNA. RIbozyiTie 10 15 .δ § ο £ :;ϊ 20 ·;;&quot;μ.•fft: 25 30 illl 35 dados cinéticos conhecidos para a hidrólise alcalina dos fos-fatos diéster (Kumamoto, J. et al. (1956) J. Am. Chem. Soc. 79:4858? Haafce, P.G. (1961) et al. ibid 83:1102? Kirby, A. J., et al. (1970) J. Qhem. Soc. Ser. B, p.1165? Bunton, C.A., et al. (1969) J. Qrg. Chem. 34:767), pode estimar-se grosseiramente o coeficiente angular do gráfico do logaritmo da constante de velocidade de hidrólise em função do pKa, que tem o valor aproximado de 0.6. Assim, é de esperar que o ARN seja mais 0 6 %(15 5** reactivo que o dimetil fosfato por um factor de 10 l&quot;'1 5) 1 8 *’’ -10 . A estimativa para o ARN aponta para o ataque directo no fosfato pelo OH-, o que resulta na formação de terminais hidroxil-3' e fosfato S'. (A clivagem do ARN por t-ransf osf or i lação catalisada por 0H-, produzindo o fosfato cíclico 2', 3·', é uma reacção (intramoleeular) muito mais rápida, mas não é relevante para as reacçSes da L—19 IVS ARN). De acordo com os dados da fig. 7D o complexo enzima-substacto covalente sofre hidrólise com velocidade aproximadamente igual à da hidrólise de uma ligação equivalente na IVS ARN circular. Assim, estima-se que a L-19 IVS ARN, quando actua como ribonuclease, aumente a velocidade de hidrólise do seu substracto cerca de IO10 vezes. A parte ARN da ribonuclease P, a enzima responsável pela clivagem dos percursores do ARN de transferência CtARN) para gerar o terminal 5'‘ do tARN,. é o exemplo de uma molécula de enzima-ARN. CSuerrier—Takada, C. et al. (1983) Ce11 35:849? Guerrier-Takada, C., et al. (1984) Science 223:285? Marsh, T.L., et al. in &quot;Sequence Specificity in Transcription and 25 a62,077 Bef: RJW / University Patents-RNA. (Kumamoto, J., et al., (1956) J), the known kinetic data for the alkaline hydrolysis of the diester phosphates (Kumamoto, J. et al., 1956). 79: 4858 Haafce, PG (1961) et al., Ibid 83: 1102 Kirby, AJ, et al. (1970) J. Qhem Soc Ser B, p.1165 Bunton , CA, et al. (1969) J. Chem., 34: 767), roughly the angular coefficient of the plot of the log of the hydrolysis rate constant as a function of pKa, which has the approximate value of 0.6 . Thus, RNA is expected to be more 0 6% (15 5 ** reagent than dimethyl phosphate by a factor of 10 1 &quot;). The estimate for the RNA points to the direct attack on the phosphate by OH-, which results in the formation of hydroxyl-3 'and S-phosphate terminals. (RNA cleavage by 0 H-catalysed t-translocphosphorylation yielding 2 ', 3' cyclic phosphate is a much faster (intramolecular) reaction, but is not relevant for L-19 reactions IVS RNA). According to the data of fig. 7D the covalent enzyme-substaple complex undergoes hydrolysis at approximately the same rate as the hydrolysis of an equivalent binding in the circular IVS RNA. Thus, it is estimated that L-19 IVS RNA, when acting as a ribonuclease, increases the rate of hydrolysis of its substrate by about 10-fold. The RNA part of ribonuclease P, the enzyme responsible for cleavage of the precursors of the CtRNA transfer RNA) to generate the 5 'terminal of the tRNA. is the example of an enzyme-RNA molecule. CSuerrier-Takada, C. et al. (1983) Ce11 35: 849; Guerrier-Takada, C., et al. (1984) Science 223: 285; Marsh, T.L., et al. in &quot; Sequence Specificity in Transcription & 25th

IWod. 71-10000 ex. - 89/07 1 62.077Ref : lUW/University Pàtents-RNA RLbozyme Transiation&quot;, R.Calendar and L. Gold, Eds.IWod. 71-10000 ex. - 89/07 1 62,077 Ref: lUW / University Pàtents-RNA RLbozyme Transiation &quot;, R.Calendar and L. Gold, Eds.

I UCLA Symposium onI UCLA Symposium on

Molecular and Cellular Biology CPlenum, New York), . a publicai1)? 5 Marsh, T.L. ei al. C1985) Science 229?793. Contudo, esta enzima catalisa apenas uma reacçSo especifica do tARN, sem apresentar actividade em relação ao ARN em geral. A especificidade é de tal ordem que substituiçftes em bases únicas .na porção tARN do 10 substracto pré-ARN impedem a enzima de efectuar clivagem no substract-o.Molecular and Cellular Biology CPlenum, New York). to publish1)? 5 Marsh, T.L. hey al C1985) Science 229, 793. However, this enzyme catalyzes only a specific reaction of the tRNA, without activity in relation to the RNA in general. The specificity is such that single-base substitutions on the tRNA portion of the pre-RNA substrate prevent the enzyme from performing cleavage on the substrate.

Actividade de desfosforilacão 15 20 25 30Activity of dephosphorylation 15 20 25 30

Verificámos também que a mesma enzima apresenta actividade em relação aos monoésteres de fosfato. 0 fosfato 3' de CSp ou CSp é transferido para a guanosina terminal 3' da enzima . A dependência da reacção com o pH (óptimo a pH 5) indica que a enzima tem actividade em relação ao dianião, e actividade muito maior em relação ã forma monoaniônica do fosfato 3' do substracto. A fosforilação da enzima é reversível na presença dè CS-QH e outras oligoCpiriraidinas) como o UCU-QH. Assim, a enzima ARN âctua como uma fosfotransferase, transferindo o fosfato terminal 3' do CSp para UCU-QH num processo envolvendo uma multiplicidade de ciclos. A pH 4 e 5, a fosfoenzima sofre hidrólise lenta para dar fosfato inorgânico. Assim, a enzima tem actividade de fosfatase ácida. Estes são dois novos aspectos da sua actividade como desfosforilase. A enzima ARN desfosforila substractos oligonucleótido com especificidade muito dirigida a uma dada sequência , o que a distingue das enzimas proteicas conhecidas. 26 1 10 15We have also found that the same enzyme shows activity relative to the phosphate monoesters. The 3 'phosphate of CSp or CSp is transferred to the 3' terminal guanosine of the enzyme. Reaction dependence with pH (optimum at pH 5) indicates that the enzyme has activity in relation to the dianion, and much greater activity relative to the monoanionic form of the 3 'phosphate of the substrate. Phosphorylation of the enzyme is reversible in the presence of CS-QH and other oligopeptidines) such as UCU-QH. Thus, the RNA enzyme acts as a phosphotransferase, transferring the 3 'terminal phosphate from the CSp to UCU-QH in a process involving a multiplicity of cycles. At pH 4 and 5, the phosphoenzyme undergoes slow hydrolysis to give inorganic phosphate. Thus, the enzyme has acid phosphatase activity. These are two new aspects of its activity as dephosphorylase. The RNA enzyme dephosphorylates oligonucleotide substrates with very specific specificity to a given sequence, which distinguishes it from known protein enzymes. 26 1 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 30 £2.077Pef: RJW/University Patents-RNA RlbozymeMod. 71 -10000 ex. - 89/07 30 £ 2.077Pef: RJW / University Patents-RNA Rlbozyme

A L-19~ IVS ARN tem actividade de transfosforilação em relação aos substractos oligoCC) fosforilados em 3&quot;. As propriedades da reacção de transfosforilação indicam que esta se dá no mesmo sítio activo que as reacçães envolvendo as activida-des de poliCC)-polimerase e de ribonuclease (Figura 15). Essas propriedades incluem a especificidade das reacções em relação aos substractos oligoCC), a produção de produtos oligoCC) com terminais 3&quot; hidroxilados e a formação de complexos enzima-substracto covalentes semelhantes. 0 provável intermediário é uma fosfoenzima, E—p, no caso da reacção da fosfotransferase, - e uma nucleotidi 1—enzima, E—pC ou E-CpOn.. no caso das reacçbes da poliCO-polimerase e da ribonuclease CZaug &amp; Cech (1998) Science CWash. D.C. 231:4-70-475) . Em ambos os casos o provável intermediário covalente envolve uma ligação éster-fosfato através do 3&quot;-Q da G414 da L-19 IVS ARN CZaug e Cech, resultados não publicados). A reacção de transfosforilação é prontamente reversível. 0 fosfato pode ser transferido da enzima para um aceitador com um gupo hidroxilo 3'- , como 05 ou UCU. Com os co-subst-ractos C5p e UCU, a L-19 IVS ARN consegue catalisar a reacção CSp + VCU-QH C5-0H + UCUp. 0 caminho reaccional proposto é&quot;The L-19-IVS RNA has 3-phosphorylated 3 'phosphorylated oligonucleotide transphosphorylation activity. The properties of the transphosphorylation reaction indicate that it occurs on the same active site as the reactions involving the poly (C) -polymerase and ribonuclease activities (Figure 15). Such properties include the specificity of the reactions with respect to oligoCC substrates, the production of oligoCC products) with 3 &quot; hydroxylates and the formation of similar covalent enzyme-substrate complexes. The probable intermediate is a phosphoenzyme, E-p, in the case of the phosphotransferase reaction, and a nucleotide 1-enzyme, E-pC or E-CpOn .. in the case of polyCO-polymerase and ribonuclease reactions. Cech (1998) Science CWash. D.C. 231: 4-70-475). In both cases the probable covalent intermediate involves an ester-phosphate bond through the 3 '-Q of G414 of L-19 IVS RNA CZaug and Cech, unpublished results). The transphosphorylation reaction is readily reversible. The phosphate can be transferred from the enzyme to an acceptor having a 3'-hydroxyl group, such as 05 or UCU. With the C5p and UCU co-substances, the L-19 IVS RNA can catalyze the reaction CSp + VCU-QH C5-0H + UCUp. The proposed reaction path is &quot;

C--0H UCU-OH5 f I E + CgP * E.C5p = E-p - E-p.UCU-OH = UCUp + EE-p-E-p-UCU-OH = UCUp + E

Assim. a L-19 IVS ARN tem actividade de transfosforilação 35 semelhante à da fosfatase alcalina da Escherichia coli (Reid &amp; 27Like this. L-19 IVS RNA has transphosphorylation activity similar to that of the alkaline phosphatase of Escherichia coli (Reid &amp; 27

62.07762,077

Ref: RJW/University Patents-RNA RibozymeRef: RJW / University Patents-RNA Ribozyme

Wilson.. &lt;1371) , Enzymes &lt;3á ed. ) 4_2 373-4.15? Coleman &amp; Gettins &lt;1*383) Adv. Enzymol Relat. Area Mol. Biol. , 55; 381) , à. da fosfatase ácida, e à de uma série de outras fosfotransferases que formam intermediários enzima-substracto covalentes. &lt; Knowles, (1980) Ann. Rev. Biochem. 49:877). Além disso, a fosfoenzima da L-19 IVS ARN pode transferir o seu fosfato para água a pH 4 e 5, indicando que tem actividade de fosfatase ácida.Wilson .. &lt; 1371), Enzymes &lt; 3d ed. ) 373-4.15? Coleman &amp; Gettins &lt; 1 * 383) Adv. Enzymol Relat. Area Mol. Biol. , 55; 381), a. acid phosphatase, and to a number of other phosphotransferases which form covalent enzyme-substrate intermediates. &lt; Knowles, (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 877). In addition, the L-19 IVS RNA phosphoenzyme can transfer its phosphate to water at pH 4 and 5, indicating that it has acid phosphatase activity.

Quando se baixa o pH de 7.5 para 5.0, a velocidade da reacção de transfosfar ilação aumenta substancialmente. Nesta mesma gama de pH, o fosfato 3' do C5p é convertido a monoanião [pKa aproximadamente igual a 6.0, baseado no valor para a citidina 3'-fosfato de Ts&quot;o &lt;1974) Basic Principies in Nucleic Acid Chemistry vol.I, pp 462 Academic, N.Y.3. A protonação de um fosfato monoéster faz com que este possa reagir como um diéster &lt;Benkovic 2; Schray, &lt;1973) Enzymes &lt;3a Ed. ) 8:235). Assim, parece razoável que uma enzima que reage com diést-eres possa utilizar o mesmo mecanismo para reagir com monoaniões monoéster. A necessidade- de-pH acidico para a hidrólise da fosfoenzima- pode ser explicada de forma semelhante, se a reacção ocorrer por ataque da água no monoanião fosfato monoéster. A independência da transfosforilação a pHs entre pH 7.5 e pH 3 sugere fortemente que o dianião monoéster é também reactivo, embora a reacção se processe com uma velocidade menor que 5% da do monoanião monoéster. A reactividade do dianião monoéster é surpreendente e talvez indique que a enzima fornece &quot;ajuda&quot; eleetrofí1ica á saida do grupo eliminado através de um protão ou de uni ião metálico. id 10 15When the pH is lowered from 7.5 to 5.0, the rate of the transphosphorylation reaction increases substantially. In this same pH range, the 3 'phosphate of C5p is converted to monoanion [pKa approximately equal to 6.0, based on the value for cytidine 3'-phosphate from Ts &quot; 1974) Basic Principles in Nucleic Acid Chemistry vol.I , pp. 462 Academic, NY3. Protonation of a monoester phosphate causes it to react as a &lt; Benkovic 2 diester; Schray, &lt; 1973) Enzymes &lt; 3a Ed.) 8: 235). Thus, it seems reasonable that an enzyme that reacts with diastereomers can use the same mechanism to react with monoester monoesters. The acidic pH requirement for the hydrolysis of phosphoenzyme can be explained in a similar way if the reaction occurs by attacking the water on the monoanion phosphate monoester. The independence of the transphosphorylation at pHs between pH 7.5 and pH 3 strongly suggests that the monoester dianion is also reactive, although the reaction is carried out at a rate of less than 5% of that of the monoester monoester. The reactivity of the monoester dianion is surprising and may indicate that the enzyme provides &quot; help &quot; The reaction is carried out by means of a proton or a metal ion. id 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 52.077 ítef: RJW/University Patents-KNA. RibozyineMod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 52 077 ftef: RJW / University Patents-KNA. Ribozyine

A pHs alcalinos, a ligação fosfod-iéster que se seque á 6414 é lábil na IVS ARN circular &lt;Zaug et al, 1384 Science CWash. D.C. 224:5744; no pré-rARN CInoue et al 1386, J. Mol. Biol. 183:143), e na E-pC CZaug, A.J. e Cech, T, 138S, Science CWash. D.C.) 231:470-475), enquanto a ligação fosfomonoéster a seguir à 6414 é estável no E-p. A hidrólise especifica das ligações fosfodiéster envolve o ataque do ião hidróxido CZaug, A.J, et al (.1985) Biochemistry 24:6211). Não é surpreendente que o ataque do ião hidróxido ao aniãò fosfato monoést-sr de E-p possa ser impedido devido á repulsão electrostátiea CKirby &amp; Younas, (1370) ._T. Chem. Soc. B, 1165). A pH = 5 a fosfoenzima sofre hidrólise muito lenta, mas transfere prontamente o seu grupo fosfato para o C5-0H. A velocidade da reacção de hidrólise é 2 a 3 ordens de grandeza mais lenta qua a da reacção de transferência de fosfato, apesar de H2Q estar presente com a concentração de 55M e o oligonucleó- tido com concentração inferior a íuM. Assim, o C5-QH έ melhor 10 aceitador que H20 por um factor em excesso de 10 . CNão é raro um factor tão elevado nas fosfotransferases; por exemplo, Ray et al.C1376) Biochemistry 15:4006 referem que a fosfoglucomutase transfere um fosfato para o hidroxilo C-6 da glucose-l-fosfato com uma velocidade 3X1Q10 superior à da transferência para Η2θ}. A diferença de velocidades é demasiado elevada para ser explicada peia nucleofilicidade superior do hidroxilo 3' do CS-QH em relação à de H2Q, que podia talvez originar um factor de 10 CLohrmann &amp; Qrgel &lt;1378) Tetrahedron 34:8-54; Kirby &amp; Varvogiis &lt;1367) J. Am. Chem. Soc. 83:415-423). Grande parte da diferença 35 10 15At alkaline pHs, the phosphodiester bond drying to 6414 is labile in the circular RNA IVS &lt; Zaug et al, 1384 Science CWash. D.C. 224: 5744; in the pre-rRNA CInoue et al 1386, J. Mol. Biol. 183: 143), and in E-pC CZaug, A.J. and Cech, T, 138S, Science CWash. D.C.) 231: 470-475), while the phosphomonoester bond following 6414 is stable on E-p. Specific hydrolysis of the phosphodiester bonds involves the attack of the hydroxide ion CZaug, A.J. et al. (1985) Biochemistry 24: 6211). It is not surprising that the attack of the hydroxide ion to the monoester phosphate anion of E-p can be prevented due to the electrostatic repulsion CKirby & Younas, (1370). Chem. Soc. B, 1165). At pH = 5 the phosphoenzyme undergoes very slow hydrolysis, but readily transfers its phosphate group to the C5-OH. The rate of the hydrolysis reaction is 2 to 3 orders of magnitude slower than that of the phosphate transfer reaction, although H2 O is present at the concentration of 55 M and the oligonucleotide having a concentration of less than 1 μM. Thus, the C5-QH is better acceptor than H220 by a factor in excess of 10. Such a high factor in phosphotransferases is not uncommon; for example, Ray et al. C1376) Biochemistry 15: 4006 report that phosphoglucomutase transfers a phosphate to the C-6 hydroxyl of glucose-1-phosphate at a rate 3X10% higher than that of transfer to θ2θ. The difference in velocities is too high to be explained by the higher nucleophilicity of the 3 'hydroxyl of CS-QH over that of H2 O, which could perhaps give rise to a factor of 10 CLohrmann & Qrgel &lt; 1378) Tetrahedron 34: 8-54; Kirby &amp; Varvogiis &lt; 1367) J. Am. Chem. Soc. 83: 415-423). Much of the difference 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex. -89/07 20 25 30 52.077 Sef: RJW/University Patents-RNA. RibozyitieMod. 71 -10000 ex. -89/07 20 25 30 52,077 Sef: RJW / University Patents-RNA. Ribozyitie

de velocidades reflecte provávelmente a capacidade que a enzima tem para utilizar as energias de ligação envolvidas nas interacções com porções do C5-QH que não reagem CJencks, W.P. 1975, Adv. Enzymol. Relat. fireas Md. Biol. 43:219). Por exemplo, as interacções devidas às ligações especificas posicionariam o hidroxilo 3' do CS-QH na orientação precisa para a remoção do fosfato da enzima, mas não estariam disponíveis para facilitar a adição de água. Para além disso, a aparelhagem catalítica pode não estar completamente montada até que o aceitador oligonucleé-tido se encontre correctamente posicionado e a água esteja ausente CKoshland,(91363) Cold Spring Harbor Symp. Quani. Biol. 285473, Knowies, (1980) Ann. ReV. Biochem. 495877). Começamos apenas a compreender como é que a L-19 IVS ARN catalisa a transferência de fosfato. A reacção de transferência global é sem dúvida facilitada pela formação de uma ligação covalente entre a enzima e o fosfato do substracto. Este tipo de catálise covalente é comum em reacções de transferência de grupo cataiizadas enzimáticamente CJencks, (1969) Catalysis in Chemistry and Enzymology McGraw-Hill, New York; Walsh, (1979) Enzymat-ic Reaction Mechanisms W.H. Freeman, San Francisco). Os locais na IVS ARN para a ligação do substracto oligoípirimidina) CZaug &amp; Cech, (1986) Science (Wash., Q.C. 2315470-475), e do resíduo G nucleófilo no seu próprio terminal 3'', CN.K. Tanner &amp; T.R. Cech, resultados não publicados) contribuem para a catálise das reacções de transferência. Estas interacções ligantes colocam provávelmerite o grupo hidroxilo 3&quot; da Θ414 numa orientação óptima para o ataque nucleófilo no fosfato terminal da C5p (Figura 15B), 30 35 52.077of speeds probably reflects the ability of the enzyme to utilize the binding energies involved in interactions with portions of C5-QH that do not react CJencks, W.P. 1975, Adv. Enzymol. Relat. fireas Md Biol. 43: 219). For example, the interactions due to the specific bonds would position the 3 'hydroxyl of the CS-QH in the precise orientation for the removal of the phosphate from the enzyme, but would not be available to facilitate the addition of water. In addition, the catalytic apparatus may not be fully assembled until the oligonucleotide acceptor is positioned correctly and the water is absent CKoshland, (91363) Cold Spring Harbor Symp. Quani. Biol. 285473, Knowies, (1980) Ann. ReV. Biochem. 495877). We only begin to understand how L-19 IVS RNA catalyzes the transfer of phosphate. The overall transfer reaction is undoubtedly facilitated by the formation of a covalent bond between the enzyme and the phosphate of the substrate. This type of covalent catalysis is common in enzymatically catalyzed catabolic group transfer reactions, (1969) Catalysis in Chemistry and Enzymology McGraw-Hill, New York; Walsh, (1979) Enzymat-ic Reaction Mechanisms W. H. Freeman, San Francisco). The sites on IVS RNA for oligopyrimidine substrate binding) CZaug &amp; Cech, (1986) Science (Wash., Q.C. 2315470-475), and nucleophilic residue G at its own 3 'terminus, CN.K. Tanner &amp; T.R. Cech, unpublished results) contribute to the catalysis of the transfer reactions. These linker interactions probably cause the hydroxyl group 3 &quot; of Θ 414 in an optimal orientation for the nucleophilic attack on the C5p terminal phosphate (Figure 15B), 30 35 52 077

Ref: RJW/University Patents-RKA. RibozymeRef: RJW / University Patents-RKA. Ribozyme

10 cu num fosfato interno do CS-0H (figurei ISA). Suspeitamos que a catálise possa também envolver um papel especifico para o Mg2+ CSteffens et ai., (1973) -J. Am. Chem. Soc. 95:935 e (137-5) Biochemistry 14:2431; Anderson et al. , (1377) -J. Απί. Chem. Soc. 99:2552? ve j a-se também Zaug et al. (1935) Biochemistry 24:6211 and Guer r ier-Takada et al. (198É ϊ) B i o c h e m i s t r y 25: 1509 3 , e catálise âc ido—base geral (ve .1 a—se Cech â Bass (1986) Ann. Rev. Biochem. 55:559-629), , mas não temos evidência directa para estes 1510 ÂμM in an internal phosphate of CS-OH (figure ISA). We suspect that catalysis may also involve a specific role for Mg2 + CS et al., (1973) -J. Am. Chem. Soc. 95: 935 and (137-5) Biochemistry 14: 2431; Anderson et al. , (1377) -J. Απί. Chem. Soc. 99: 2552; Zaug et al. (1935) Biochemistry 24: 6211 and Guerrier-Takada et al. (198E) B iochemistry 25: 1509 3, and general base acid catalysis (see Cech, Bass (1986) Ann Rev. Biochem 55: 559-629), but we have no direct evidence for these 15

Mqd. 71 -10000 ex. - 89/07Mqd. 71-10000 ex. - 89/07

30 mecanismos. Os requerentes admitem não considerar os mecanismos discutidos nesta publicação como hipóteses únicas.30 mechanisms. Applicants admit not to consider the mechanisms discussed in this publication as unique hypotheses.

Uma questão não respondida diz respeito á pouquíssima transferência de nucleótídos com o substracto C5p verificada a pH neutro. Como o C5-QH é prontamente atacado no fosfato seguinte ao quarto C para produzir E-pC, porque será que o C5p não é atacado no fosfato equivalente para produzir E-pCp ? Talvez o fosfato terminal do CSp esteja coordenado ao Mg (II) ou sirva de aceitante de uma ligação de hidrogénio, o que resulta num modo preferencial de ligação diferente do que ocorre no CS—0H. A descoberta de uma enzima com ambas as actividades de fosfodiesterase e de fosfomonoesterase é invulgar mas não sem precedente. A exonuclease III (Richardson &amp; Kornberg, (1964) J. Biol. Chem. 239:242-250), a Pi-nuclease e a nuclease do feijão CShishido &amp; Ando, 1382 in Nucleases (Linn, S.M. &amp; Roberts, R.J. Eds) pp. 155-185, Cold. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) têm todas actividade de 3'-fosfat-ase. 35 31 £2.077 Ref: KJWAJniversity Patents-RKA. RlbozymaAn unanswered question concerns very little nucleotide transfer with the C5p substrate checked at neutral pH. Since C5-QH is readily attacked in the phosphate following the fourth C to produce E-pC, why is C5p not attacked in the equivalent phosphate to produce E-pCp? Perhaps the terminal phosphate of CSp is coordinated to Mg (II) or serves as an acceptor of a hydrogen bond, which results in a preferential mode of attachment different from that in CS-OH. The discovery of an enzyme with both phosphodiesterase and phosphomonoesterase activities is unusual but not unprecedented. Exonuclease III (Richardson & Kornberg, (1964) J. Biol. Chem. 239: 242-250), Pi-nuclease and nuclease from CShishido & Ando, 1382 in Nucleases (Linn, S.M. & Roberts, R.J. Eds) pp. 155-185, Cold. Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) all have 3'-phosphatase activity. 35 31 £ 2.077 Ref: KJWAJniversity Patents-RKA. Rlbozyma

1 5 10 15 A L~19 IVS ARN é única entre as enzimas conhecidas, na medida em que apresenta a capacidade de remover fosfatos 3' doIVS RNA is unique among the known enzymes, insofar as it has the ability to remove 3 'phosphates from the

Mod. 71 -10000 ex/-89/07 20 25 30 35 ARN com grande especificidade em relação ao substracto. As fosfatases alcalinas da E. coli e dos mamíferos são não-específicas. Estas enzimas removem fosfatos 5&quot;, 3' e 2&quot; do ARN sem grande sensibilidade á sequência de bases na molécula CGaren &amp; Levinthal, ¢1360) Biochem.· Biophys. Acta. 38:470; Harkness, C1968) Arch. Biochem. Biophys. 126:513). A polinucleótido-cinase tem actividades de 3'-fosfatase, 2'-fosfatase e 2', 3', cíclico-fosfatase CCameron &amp; Uhlenbeck, &lt;1977) Biochemistry 16:5120=! Web_er, &lt;13S5) Ph. D. Thesis, University of Illinois). Substactos tão diversos como o U5p, o ASCp e o pCp são prontamente desfosforilados e, nós casos em que foram feitos estudos cinéticos cuidadosos, as velocidades de desfosforilação de diferentes substactos ARN raramente variam de um factor maior que 2 (Weber, &lt;1385), supra). A pl-nucleasé e a nuclease do feijão têm uma preferência limitada por alguns nucleósidos monofosfatados em 3' CShishido &amp; Ando , &lt;1982), supra). A L-1S IVS ARN, por outro lado, transfere com grande especificidade o fosfato 3' do ARN para uma molécula doadora; o CSp e o C6p são substractos, enquanto o pGp e o A6pCp não o são. Esta especificidade em relação ao tamanho e â sequência é explicada pela exigência do substracto se ligar ã enzima através de emparelhamento de bases tipo Watson-Crick , no sitio activo rico em guanosinas &lt;Figura 15). Se este modelo for correcto, deverá ser possível alterar a especificidade da fosfotransferase em relação a uma dada sequência através dè mutagénese dirigida &lt;site-specific mutagenesis) no sitio activo.Mod. 71 -10000 ex / -89 / 07 20 25 30 35 RNA with high specificity relative to the substrate. The alkaline phosphatases of E. coli and mammals are non-specific. These enzymes remove phosphates 5 ', 3' and 2 &quot; of the RNA without high sensitivity to the base sequence in the CGaren &amp; Levinthal, 1360) Biochem., Biophys. Minutes. 38: 470; Harkness, C1968) Arch. Biochem. Biophys. 126: 513). The polynucleotide kinase has activities of 3'-phosphatase, 2'-phosphatase and 2 ', 3', cyclic-phosphatase CCameron &amp; Uhlenbeck, &lt; 1977) Biochemistry 16: 5120 =! Web_er, &lt; 13S5) Ph.D. Thesis, University of Illinois). Substitutes as diverse as U5p, ASCp and pCp are readily dephosphorylated, and in those cases where careful kinetic studies have been done, the dephosphorylation rates of different RNA subunits rarely vary by a factor greater than 2 (Weber, &lt; 1385) , supra). Bean pl-nuclease and nuclease have a limited preference for some monophosphate nucleosides in 3 'CShishido &amp; Ando, &lt; 1982), supra). L-1S IVS RNA, on the other hand, transfers with high specificity the 3 'phosphate of RNA to a donor molecule; CSp and C6p are substrates, while pGp and A6pCp are not. This specificity in relation to size and sequence is explained by the requirement of the substrate to bind to the enzyme by Watson-Crick type base pairing in the guanosine rich active site &lt; Figure 15). If this model is correct, it should be possible to alter the specificity of phosphotransferase in relation to a given sequence through site-specific mutagenesis (mutagenesis) at the active site.

Mod. 71 -10000 ex;-83/07Mod. 71 -10000 ex; -83/07

11

Uma série de enzimas 3'-P desfósforilant.es contituiriãm um instrumento útil para o estudo da bioquímica do ARM e para as manipulações do ARM recombinante. Contudo, a enzima ARN aqui 5 descrita tem actividade de clivagem-ligação, para além da actividade de desfósforilação. A não ser que estas actividades possam ser separadas, a utilidade da enzima com reagente para a desfósforilação é limitada. 10 15 20 25 30 £2.077A number of enzymes 3'-P desfósforilant.es would constitute a useful tool for the study of the biochemistry of ARM and for the manipulations of the recombinant ARM. However, the RNA enzyme described herein has cleavage-binding activity, in addition to the dephosphorylation activity. Unless these activities can be separated, the usefulness of the enzyme with reagent for the dephosphorylation is limited. 10 15 20 25 30 £ 2077

Ref: Rjw/University Patents-RNA RibozymeRef: Rjw / University Patents-RNA Ribozyme

II

Actividade de endorribonucIease úu de &quot;Endonuclease de restrição do ARN&quot;Endorphonucleotide activity of &quot; RNA restriction endonuclease &quot;

Vamos descrever aqui_uma quinta actividade enzimática da ribozima de Tetrahymena. Esta eféctua clivagem noutras moléculas de ARN, em sequências que se assemelham ao local de processamento 5' do percursor do ARN. A clivagem é concomitante com a adição de um nucleótido guanosina livre ao terminal 5' do fragmento de ARN situado a jusante? assim, um produto pode ser prontamente marcado no terminal durante a reacção. A reacção é análoga ao primeiro passo do auto-processamento do pré—rARN CFig.l). A clivagem não requer o nucleótido G414 da ribozima; ao contrário das primeiras quatro actividades, não envolve a formação de um intermediário enzima-substracto covalente. Assim existem, como resultado do trabalho desta invenção, endorribonucleases especificamente dirigidas a determinadas sequências, sem proteína, ie., capazes de actuar na ausência de proteína, e compostas de ARN, que são enzimáticamente activas sobre outras moléculas de ARN. Estas ribozimas de ARN actuam sobre ARN exógeno. Assim, a enzima ou ribozima é composta por ARN e o substracto é também ARN (ou polímeros mistos de ARN-ADN). 35 162.077 Bef: RJW/Dniversity Patents-FNA. RibozymeWe will describe here a fifth enzymatic activity of the Tetrahymena ribozyme. This cleaves in other RNA molecules, in sequences that resemble the 5 'processing site of the RNA precursor. Cleavage is concomitant with the addition of a free guanosine nucleotide to the 5 'terminus of the RNA fragment downstream? thus, a product can be readily labeled at the terminal during the reaction. The reaction is analogous to the first step of the auto-processing of the pre-RNR (Fig. 1). Cleavage does not require ribozyme G414 nucleotide; unlike the first four activities, does not involve the formation of a covalent enzyme-substrate intermediate. Thus, as a result of the work of this invention, endoribonucleases specifically target certain sequences, without protein, ie, capable of acting in the absence of protein, and composed of RNA, which are enzymatically active on other RNA molecules. These RNA ribozymes act on exogenous RNA. Thus, the enzyme or ribozyme is composed of RNA and the substrate is also RNA (or mixed RNA-DNA polymers). 35 162,077 Bef: RJW / Dniversity Patents-FNA. Ribozyme

A ribozima tem grande especificidade-para efect-uar clivagemThe ribozyme has high specificity-to effect cleavage

15 a seguir à sequência de nuçleôtidos CUCU; sob condições severas, consegue discriminar esta sequência de reconhecimento em relação a locais com 3 das 4 posições análogas. Por exemplo, numa solução contendo ureia 2.5 ΙΊ a enzima efectua clivagem a seguir a CUCU, e ignora as sequências relacionadas CUGU e CGCU (Fig. _3c). A especificidade em relação à sequência é próxima da das endonu-cleases de restrição do AON (Nathans, D. and Smit-h, H.Q. (1375) Annu. Rev. Biochem. 44:273-293). Mostramos também qué as mutações dirigidas no sitio activo da IVS ARN, as chamadas sequência-guia15 following the sequence of CUCU nucleotides; under severe conditions, is able to discriminate this recognition sequence from sites with 3 of the 4 analog positions. For example, in a solution containing 2.5 u urea the enzyme cleaves following the CUCU, and ignores the related sequences CUGU and CGCU (Fig. 3c). Sequence specificity is close to that of the AON restriction endonulechems (Nathans, D. and Smit-h, H.Q. (1375) Annu Rev. Biochem 44: 273-293). We also show that mutations targeting the active site of the IVS RNA, the so-called leader sequences

Mpd. 71-10000 ex.·' 89/07 20Mpd. 71-10000 ex.

25 30 35 interna COavies, R.W. , et al. (1932) Nature 300Ϊ 719—724j Waring, R.B., et al. (1386) Nature 321:133-139), ou locais de ligação ao exão 5&quot; (Inoue, T. , et al. (1985) Cell 43:431-437; Sarriga, G. , et al. (1986) Nature 322:86-89; Beén, M.D. and Cech, T.R. (1986) Cell 47, 207-216), alteram a especificidade da ribozima em relação à sequência de uma maneira previsível. Como endorribonuclease, a L-19 IVS ARN reconhece quatro ou mais nuçleôtidos quando escolhe um sítio de reacção. As ribonucleases proteicas que são activas em substractos de ADN de cadeia simples apenas apresentam especificidade ao nível dos mononucleótidos (por exemplo, a ribonuclease TI efectua clivagem a seguir â guanosina). Assim, a L-19 tem maior especificidade em relação à sequência das bases do ARN de cadeia simples do que qualquer ribonuclease proteica conhecida, podendo aproximar-se da especificidade apresentada por algumas endonucleases de restrição do ADN. Unia particularidade atraente desta nova endorribonuclease é a de que a sua especificidade em relação ao substracto pode ser 3425 30 35 internal COavies, R.W. , et al. (1932) Nature 300, 719-724, Waring, R.B., et al. (1386) Nature 321: 133-139), or exon-binding sites 5 &quot; (1986) Nature 322: 86-89, Beén, MD and Cech, TR (1986) Cell 47, (1986) Cell 43: 431-437, Sarriga et al. 207-216), alter the specificity of the ribozyme to the sequence in a predictable manner. As endorribonuclease, L-19 IVS RNA recognizes four or more nucleotides when it selects a reaction site. Protein ribonucleases that are active on single stranded DNA substrates only have mononucleotide specificity (for example, the ribonuclease TI cleaves following the guanosine). Thus, L-19 has greater specificity relative to the base sequence of single stranded RNA than any known protein ribonuclease, and may approximate the specificity shown by some DNA restriction endonucleases. One attractive feature of this new endorribonuclease is that its specificity relative to the substrate can be 34

Mod. 71 -lOOOO βχ. - 89/07 20 25 30 í2.077 1 lef: RJWAJniversity Patents-PM Ribozyme completa e previsivelmente modificada por alteração da sequência no local de fixação interno. A reacção da endorribonucleâse é análoga ao primeiro passo do auto-processamento do prd-rARN (Fig.l). Ambas as reacções, enzimática e de auto-processamento, utilizam os mesmos dois locais de fixação, um local de fixação oligopirimidina e um local de fixação guanosina, para obter especificidade e contribuir para a catálise. Q local de fixação oligopirimidina é também conhecido como a sequênciâ-guia 5' (Waririg, R.B., et al*,¢1386) Nature 321;133-139) ou local de fixação exão 5' CXnoue, T., et al. &lt;1385) Cell 43:431, Garriga, G. , et al. ¢1386) Nature 322:86-83,Mod. 71 -OOOOOO βχ. Full and predictably modified by alteration of the sequence at the site of internal fixation. The endoribonuclease reaction is analogous to the first step of the self-processing of prd-rRNA (Fig. 1). Both the enzymatic and self-processing reactions utilize the same two fixation sites, an oligopyrimidine fixation site and a guanosine fixation site, to obtain specificity and to contribute to catalysis. The oligopyrimidine locus of attachment is also known as the 5 'guideline sequence (Waririg, R.B., et al., 1386) Nature 321; 133-139) or anchoring site exon 5' CXnoue, T., et al. &lt; 1385) Cell 43: 431, Garriga, G., et al. ¢ 1386) Nature 322: 86-83,

Been, M.D. and Cech', T.R. , Cell (1986) 47 , 207-216) . 0 seu papel no auto-processamento tem sido demonstrado conclusivamente pela análise de mutações em bases únicas e de mutações em supressores secundários C second-site suppressors ,) (Waring R.B., et al. ¢1986) Suora; Been, M.D. e Cèch, T.R., C1986) Supra; Perea, J. e Jacq, C., C1985) EMBG, J. 4J3281) . 0 papel destes mesmos nucleótidos na reacção da endorribonuclease é demonstrado pela alteração da especificidade de enzimas de mutantes em relação ao substracto (Fig. 3), sendo essa especificidade alterada de acordo com as regras de emparelhamento das bases de Watson-Crick. 0 local de fixação guanosina envolvido no auto-processamento não foi localizado em nenhum grupo especial de nucleótidos, mas as suas características gerais já foram descritas CBass, B.L. and Cech, T.R., (1984) Nature 308:820; C1986) Biochemistry 25:4473). A actividade da endorribonuclease parece utilizar o mesmo local de 35 35Been, M.D. and Cech, T.R., Cell (1986) 47, 207-216). Their role in self-processing has been conclusively demonstrated by the analysis of single-base mutations and mutations in secondary suppressors C second-site suppressors (Waring R.B., et al., 1986) Suora; Been, M.D. and Cèch, T.R., C1986) Supra; Perea, J. and Jacq, C., C1985) EMBG, J. 4J3281). The role of these same nucleotides in the endoribonuclease reaction is demonstrated by altering the specificity of mutant enzymes to the substrate (Fig. 3), this specificity being altered according to the Watson-Crick base pairing rules. The guanosine binding site involved in self-processing has not been localized to any particular group of nucleotides, but its general characteristics have already been described CBass, B.L. and Cech, T.R., (1984) Nature 308: 820; C1986) Biochemistry 25: 4473). Endoribonuclease activity appears to utilize the same 35

II

6 2.077 lef: RJW/University Patents-RNA. Rlbozyme ‘23Mâ? fixação guanosinai a partir dos seguintes critérios: · em ambos os casos, a guanosina ê tão açtiva como o GTP, enquanto os UTP, CTP, ATP e dGTP tem pouca ou nenhuma actividade. Além disso, o Krn = 44 uM obtido para o ΘΤΡ é razoávelmente semelhante ao valor de 32+ 3 uM determinado para o auto-processamento em condiçóes reaccionais um pouco diferentes CBass, B.L. &amp; Cech, T.R., Biochemistry (1386) supra). 156 2,077 lef: RJW / University Patents-RNA. Rlbozyme '23Mâ " guanosine fixation from the following criteria: · in both cases, guanosine is as active as GTP, whereas UTP, CTP, ATP and dGTP have little or no activity. Moreover, the Krn = 44 μM obtained for ΘΤΡ is reasonably similar to the value of 32 ± 3 μM determined for self-processing under slightly different reaction conditions CBass, B.L. & Cech, T.R., Biochemistry (1386) supra). 15

Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 20 25Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 20 25

30 35 A actividade da endorribonuclease da L-13 IVS ARN não requer a sua guanosina (G414) terminal 3'. Neste ponto difere das actividades de transferência de nucleótidos , de transferência de fosfato e hidrolitica apresentadas pela mesma enzima. Nessas reacçSes, a G414 participa num complexo enzima-substracto covalente, que parece ser um intermediário obrigatório da reacção (Zaug, A.J. and Cech, T.R. (1986) Science 231:470-475; Zaug, A.J. and Cech, T.R. (1986) Biochemistry 25:4478). Assim, a L-19 IVS ARN não se restringe a mecanismos de reacção envolvendo a formação de um intermediário enzima-substracto covalente. Pode também catalisar reacçbes a dois substractos por um mecanismo de substituição simples. A ribonuclease P, uma enzima de ARN que catalisa a clivagem através da hidrólise em vez de através da transesterificação, também parece actuar sem a formação de um intermediário covalente (Marsh, T.L., et al. (1985) Science 223:73-31; Guerrier-Takeda, C., et al. (1986) Biochemistry 25.: 1503) . A actividade da L-19 IVS ARN como endorribonuclease aqui referida parece exigir substractos de ARN de cadeia simples. Com base num trabalho recentemente publicado por Szostak (1986) 36The endoribonuclease activity of L-13 IVS RNA does not require its 3 'terminal guanosine (G414). At this point it differs from the nucleotide transfer, phosphate transfer and hydrolytic activities exhibited by the same enzyme. In these reactions, G414 participates in a complex covalent enzyme-substrate, which appears to be a mandatory intermediary of the reaction (Zaug, AJ and Cech, TR (1986) Science 231: 470-475; Zaug, AJ and Cech, TR (1986) Biochemistry 25: 4478). Thus, L-19 IVS RNA is not restricted to reaction mechanisms involving the formation of a covalent enzyme-substrate intermediate. It may also catalyze reactions to two substrates by a simple replacement mechanism. Ribonuclease P, an RNA enzyme that catalyzes cleavage through hydrolysis rather than through transesterification, also appears to act without the formation of a covalent intermediate (Marsh, TL, et al. (1985) Science 223: 73-31; Guerrier-Takeda, C., et al. (1986) Biochemistry 25: 1503). The activity of L-19 IVS RNA as endorribonuclease referred to there appears to require single stranded RNA substrates. Based on a study recently published by Szostak (1986) 36

5 &gt;.077 1 Rsf: RlW/Uhiversity Patenhs-RKA Ribozyme 5 155 &gt; .077 1 Rsf: RlW / Uhiversity Patenhs-RKA Ribozyme 5 15

Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 20 25 30Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 20 25 30

Nlaiure 322:83-86. parece possível que uma versão mais pequena da IVS ARN da Tetrahvmena em que falta q seu sítio de ligação ao exão 5, possa apresentar actividade de endorribonuclease sobre substract-os com bases emparelhadas. 0 substracto testado por Szostak (C1936) Nature supra) consistia num fragmento de ARN que apresentava o terminal 5' emparelhado com o local de ligação do exão 5''. Contudo, este &quot; substracto&quot; ARN incluía igualment-e uma parte substancial da IVS ARN, pelo que ainda está em dúvida se a ribozima tem actividade de endorribonuclease com substractos ARNs de cadeia dupla em geral.Nlaiure 322: 83-86. it seems possible that a smaller version of Tetrahm IVS RNA lacking its exon 5 binding site may exhibit endorribonuclease activity on substrate with paired bases. The substrate tested by Szostak (C1936) Nature supra) consisted of an RNA fragment bearing the 5 'terminus paired with the 5' exon binding site. However, this &quot; substrate &quot; RNA also included a substantial part of the IVS RNA, so it is still in doubt whether the ribozyme has endoribonuclease activity with double stranded RNA substrates in general.

Potencial utilidade de endorribonucleases com especificidade dirigida a determinadas sequências. As endorribonucleases com especificidade dirigida podem ter muitas das aplicações para o estudo do ARN, que as endonucleases de restrição do ADN tem para o estudo do ADN CNathans, D. and Smith, H.O., (1975) Ann. Rev. Biochem. 44:273). For exemplo, o padrão dos fragmentos da restrição podia ser usado para estabelecer comparações entre as sequências de ARNs relacionados, e ARNs grandes podem ser submetidos a clivagem especifica dando origem a fragmentos com dimensões mais adequadas para o seu estudo. A especificidade da ribozima em relação à sequência de quatro nucleótidos torna-a ideal para a clivagem de ARNs de sequência desconhecida; um ARN com sequência aleatória teria em média um local de clivagem para cada 256 bases. Além disso, a marcação automática do terminal de um dos fragmentos durante a clivagem pela ribozima é uma vantagem prática. 37 35 -Potential utility of endoribonucleases with specificity directed to certain sequences. Targeted specificity endoribonucleases may have many of the applications for the study of RNA, which DNA restriction endonucleases have for the study of DNA CNathans, D. and Smith, H.O., (1975) Ann. Rev. Biochem. 44: 273). For example, the restriction fragment pattern could be used to establish comparisons between the related RNA sequences, and large RNAs may be subjected to specific cleavage giving rise to fragments with dimensions more suitable for their study. The specificity of the ribozyme to the four nucleotide sequence makes it ideal for the cleavage of RNAs of unknown sequence; a RNA with random sequence would have on average one cleavage site for every 256 bases. In addition, the automatic labeling of the terminal of one of the fragments during cleavage by the ribozyme is a practical advantage. 37 35 -

5 10 15 52-077 Kef: R3W/0niversity Patents-KNA Riboz^me5 10 15 52-077 Kef: R3W / 0niversity Patents-KNA Riboz ^ me

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 0 desenvolvimento das ribozimâs como instrumentos úteis em biologia molecular encontra-se no seu inicio. A eficiência da clivagem em grandes substractos ARN precisa de ser melhorada, para se conseguirem obter reacçbes de digestão completas e não parciais, como acontece agora. Qs efeitos de desnaiurantes como a ureia e a formamida têm que ser mais explorados? parecem aumentar a especificidade da clivagem em relação a uma dada sequência, e ao mesmo tempo desfazer Cmelt) a estrutura do substracto, maximizando a disponibilidade das sequências-alvo. Por último, pode efectuar-se mutagénese no sitio activo da ribozima ~ por quem seja perito nessas artes - de modo a serem conseguidas'todas as permutas possíveis correspondentes às enzimas capazes de clivagem em todas as 256 sequências de te t r anu c1eót idos possíveis.Mod. 71-10000 ex. The development of ribozymes as useful tools in molecular biology is at its inception. The efficiency of cleavage in large RNA substrates needs to be improved in order to achieve complete and non-partial digestion reactions, as is the case now. What effects of denaturants such as urea and formamide have to be further explored? appear to increase the specificity of the cleavage relative to a given sequence, while at the same time undoing the structure of the substrate, maximizing the availability of the target sequences. Finally, mutagenesis can be carried out at the active site of the ribozyme by one skilled in the art so that all possible exchanges corresponding to the enzymes capable of cleavage in all 256 possible sequences are possible.

3030

Reconhecimento da sequência do ARN. As ribonucleases proteicas conseguem efectuar clivagem nos substractos de ARN com grande especificidade, através do reconhecimento de uma combinação da estrutura e sequência do ARN, com ênfase na estrutura Cp. ex., RNase III (Robertson, H.O. ¢1982) Ce11 30:669) e RNase MS (Stahl, D.A., et al. &lt;1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:5644). Por outro lado, as proteínas conhecidas que efectuam clivagem em substractos ARN de cadeia simples apresentam especificidade apenas ao nível de mononucleótidos ou dinucleótidos Cp.ex., a RNase TI efect.ua clivagem a seguir às guanosinas EEgami, F., st al. &lt;1980) Molec Bio. Biochem. Biophys: 32:250-2773. Assim, a L-19 IVS ARN procede à clivagem do ARN de cadeia simples com uma especificidade em relação à sequência de 1 10 15Recognition of RNA sequence. Protein ribonucleases can cleave RNA substrates with high specificity by recognizing a combination of RNA structure and sequence, with emphasis on the Cp structure. RNase III (Robertson, H O. ¢ 1982) Ce11 30: 669) and RNase MS (Stahl, D.A., et al. &lt; 1980) Proc. Natl. Acad. Know. USA 77: 5644). On the other hand, known proteins that cleave on single stranded RNA substrates show specificity only at the level of mononucleotides or dinucleotides Cp.ex., RNase TI has its cleavage following the guanosines EEgami, F., st. &lt; 1980) Molec Bio. Biochem. Biophys: 32: 250-2773. Thus, L-19 IVS RNA cleaves the single-stranded RNA with a specificity to the sequence of 1 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 $2.077 Bef: BJW/University Patents-HNA. RibozyiteMod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 $ 2,077 Bef: BJW / University Patents-HNA. Ribozyite

Dases - do ARN considerávelmente superior à de qualquer ribonuclease proteica conhecida.Dases - RNA is considerably higher than that of any known protein ribonuclease.

Ribozimas Variantes (ou outras versões da ribozima que mantêm a actividade) Trabalhos anteriores sobre as caracteristicas das sequências necessárias para o auto-processamento (Price, J.V., et al. (1985) Nucleic Acid. Res. 13:1871) mostram que essas caracteristicas podem ser examinadas, como é indicado na referência, efectuando inserções e cortes para obter outras IVS ARNs capazes de auto-processamento. De forma semelhante, poderíamos alterar a L-19 IVS ARN para obter toda uma série de moléculas de endorrribonuclease com especificidade dirigida a várias sequências do ARN. Assim, Price et al concluíram que são necessárias três' regiões para o auto-processamento da IVS. Experiências semelhantes poderiam revelar as porções da L-19 IVS ARN necessárias para a sua actividade como endorribonuclease. Burke, J.M. et al., (1386) Cell 45:167-176, mostram o papel dos elementos conservados para o auto-processamento da IVS; esse trabalho mostra uma utilização adicional das experiências de mutagénese, no sentido de modificar sequências extremamente conservadas, com alteração consequente da actividade. Assim, e de maneira semelhante, a sequência da L-19 IVS ARN podia ser alterada com concomitante alteração na actividade, para originar toda uma série de endorribonucleases. 35 10 15Ribozymes Variants (or other ribozyme versions that maintain activity) Previous work on the characteristics of the sequences required for self-processing (Price, JV, et al. (1985) Nucleic Acid Res. 13: 1871) show that these characteristics can be examined, as indicated in the reference, by performing insertions and cuts to obtain other IVS RNAs capable of self-processing. Similarly, we could alter the L-19 IVS RNA to obtain a whole series of endorrribonuclease molecules with specificity directed at various RNA sequences. Thus, Price et al concluded that three regions are required for IVS self-processing. Similar experiments could reveal portions of the L-19 IVS RNA required for its activity as endorribonuclease. Burke, J. M. et al., (1386) Cell 45: 167-176, show the role of conserved elements for IVS self-processing; this work shows an additional use of the mutagenesis experiments, in order to modify extremely conserved sequences, with consequent alteration of the activity. Thus, and in a similar manner, the sequence of L-19 IVS RNA could be altered with concomitant alteration in activity to give rise to a whole series of endoribonucleases. 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex.- 89/07 20 25 30 62.077Ref: HJW/ttniversity Patents-RKA RibozymeMod. 71 -10000 ex.- 89/07 20 25 30 62.077Ref: HJW / ttniversity Patents-RKA Ribozyme

Cech, T.R., et al. descobriram recentemente um troço ainda ruais pequeno da L-19 IVS ARN que apresenta actividade enzimática total e que inclui os nucleótidos '19-331 do ARN. Também foi verificado que o troço 21-331 é inteiramente activo. Construi- ilasmideos para produzir directaménte as cadeias das L-19 ’am- e L-21 IVS ARN. Neste caso o pr omotor 19 para -Ξι píOSÍçãtO Â1 â o ADN que codif i s i tua-se na posição 331 em vez da 414.Cech, T.R., et al. have recently discovered a still small roundo section of L-19 IVS RNA that has total enzymatic activity and which includes the nucleotides '19 -331 RNA. It has also been found that section 21-331 is fully active. Builds the plasmids to directly produce the L-19 'am- and L-21 IVS RNA chains. In this case, the probe 19 for the DNA is encoded at position 331 instead of 414.

Been, M.D., and Cech, T.R.¢1986) Cell £7:207) demonstram, usando mu tagénese dirigi da, que a a1 te r ação na espe c i f i c idade apresentada pela poiimerase vai afectar a actividade da polimerase sobre o oligoCU). Assim, os peritos nesta arte podem utilizá-la prontamente para obter outras enzimas L-19 IVS ARIM activas. Waring, R.B. &amp; Davies, ¢19814) Gene 28:277, apresentam uma classe de moléculas de IVS com estrutura semelhante. Este trabalho é semelhante ao de Cech, T.R., et al. ¢1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.3.A. 80:3903, descrevendo uma classe de IVS ARN presente nas mitoncôndrias de fungos. Verificou-se que algumas destas outras moléculas de IVS são auto-processadoras. Ί1 27:487? Kruoer, K.. et al. (1982)Been, M.D., and Cech, T.R. (1986) Cell 7: 207) demonstrate, using directed mutagenesis, that the polymerase activity of the polymerase will affect the activity of the polymerase on oligoCU). Thus, those skilled in the art can readily use it to obtain other active L-19 IVS ARIM enzymes. Waring, R.B. &amp; Davies, ¢ 19814) Gene 28: 277, present a class of IVS molecules of similar structure. This work is similar to that of Cech, T.R., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Know. U.3.A. 80: 3903, describing a class of IVS RNA present in fungus mitonecondria. It has been found that some of these other IVS molecules are self-processors. Ί1 27: 487? Kruoer, K .. et al. (1982)

(Cech , T. R. , et al. (1 98 1) ibid. 31 :i47; Ga r r iga, G Horst , g. , et al . (1 38 5) i: B i o 1. Ch em. 260 : 106 3 PS' der V een, D Λ* 1 \ . &lt;t 'ma V ΰ 1 . - ib id traba lho desta i nv snçã O 40 35(Cech, TR, et al. (1981) ibid 31: 47; Gaugh, G Horst, et al. (1983)): Ch 1. 260: 106 PS 'der V een, D Λ * 1 & ma ma V V V V ΰ ΰ ΰ ΰ ΰ ΰ ΰ ΰ ΰ ΰ - - - - - - - - - - - - 40 40.

10 1510 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62-077Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 62-077

Bef: MW/University Patents-KNA Ribozyme séries, ou de famílias inteiras de endorribonucleases derivadas da mesma ou de diferentes fontes naturais. Qs peritos nesta arte serão capazes de pesquisar a existência de outras enzimas de ARN a partir de fontes naturais várias.Or whole families of endoribonucleases derived from the same or from different natural sources. Those skilled in this art will be able to research the existence of other RNA enzymes from various natural sources.

De acordo com (Ceçh, st al. , PiMAS ¢1983), a Waring â Davies, supra), pode considerar-se que o sítio activo mínimo para a actividade da ribozima á fornecido pelos elementos na sequência do ARN a seguir descritos. Qs elementos A e B interagem um com o outro, tal como o 3L e o 2. Em muitas posições da sequência é permitida mais que uma base? mostram-se as substituições observadas colocando uma letra abaixo da base substituída. Por exemplo, na posição 1 do elemento de sequência A podem observar— se os nucleôtidos A e U, sendo A o mais comum. A C também chamado P) 1 2345678910 ;· 5’-A UGCUGGAAA | I U GAAAG U 1 i G 3L (também chamado R) N - qualquer, base5' -ucagaSãSSna U AG C ; B (também chamado Q) opc ionaloocional 5'-AAUCA(C)GCAGG U CUU C C ; Ctambém chamado S)According to (Ceq, S. et al., PiMAS ¢ 1983), Waring â Davies, supra), the minimum active site for ribozyme activity may be considered to be provided by the elements in the RNA sequence described below. The elements A and B interact with each other, such as 3L and 2. In many sequence positions is more than one base permitted? the observed substitutions are shown by placing a letter below the substituted base. For example, at position 1 of the sequence element A one can observe nucleotides A and U, A being the most common. A C also called P) 1 2345678910; · 5'-A UGCUGGAAA | I U GAAAG U 1 i G 3L (also called R) N - any, base 5 ' B (also called Q) optional 5 'AAUCA (C) GCAGG U CUU C C; Also called S)

AAGAUAOSSEE. U GAAGAUAOSSEE. U G

com GACUA iquerda e com uÃGUC à direita, como está ío permitidas mudanças de bases compensai i Burke, et ai. í 1.3oo) Suara 41 35with GACUA left and with UGUC on the right, as compensatory base changes are allowed. Burke, et al. (1.300) Suara 41 35

Ref: HOW/Cniversity Patents-RKA RUbozyrtERef: HOW / Cniversity Patents-RKA RUbozyrtE

S ARN á mostrada em baixo. A codificação . da IVS ARN começa no local indicado pela seia e fribozima&quot; L-13 estenda-se até ao final (6414).S RNA is shown below. The coding. of the IVS RNA begins at the site indicated by seia and fribozyme &quot; L-13 extends to the end (6414).

Como é óbvio, no ARN os TT são 10Obviously, in RNA, TTs are 10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 • I t « G AM7 AG(JAT ATTT ACCTpTGGAuGGAÀAAGTTATGASGCATGCACCTCGT A 13 i1 (&lt;•11 6C7AG7C7T7AAACCAA7AíiA77GCA7CGGTT7AAAAGGCAA&lt;jACCSTCAAA 10ΓMod. 71-10000 ex. - - • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

I &lt; t I I T7GCGGGAAAGGGG7 CMCAGCCG77CAGTACCAAGTCTCAfiSGSAAACT7T 157I &lt; t I I T7GCGGGAAAGGGG7 CMCAGCCG77CAGTACCAAGTCTCAfiSGSAAACT7T 157

eAGA7GGCCnfiCJUUk6BCTATBfiTMTAA6CT6AaGACATS5TCCTUtt W • I I I · t ACGCA£CCAAG7CC7MG7CAAGAGA7CT7CTSTTÍA7A7WATGCAG7tCA. líl ii li CWCTMA76TCeGTCeeeftUCAJÇ-eTATTCnCTCATAA«7A7MT 3(0eAGA7GGCCnfiCJUUk6BCTATBfiTMTAA6CT6AaGACATS5TCCTUtt ACGCAA CCAAG7CC7MG7CAAGAGA7CT7CTSTTÍA7A7WATGCAG7tCA. (ii) CWCTMA76TCeGTCeeeftUCAJÇ-eTATTCnCTCATAA7A7MT3 (0

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Ctt1ACCTC7CCTTAAT6ÍKAôCTAâCtGA7GAAG7GA7GCAACACTíGAGCC JQ. 4: 35 1 . I &lt; &lt; «Ctt1ACCTC7CCTTAAT6AKAOCTAâCtGA7GAAG7GA7GCAACACTíGAGCC JQ. 4: 35 1. I &lt; &lt; «

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2mt99C2mt99C

55

Durante a discus são da L- 13 IVS ARN, a região da sequência do sitio activo que vai ser discutida do ponto de vista da actividade e das variantes é ct seguinte: U U Θ 6 A a a G 20 21 22 23 24 25 26 27 10 0 primeiro ribonucleótido da L-Í9 IVS ARN no terminal 5' 0H· é equivalente ao nucleótido 20 na L IVS ARN intacta. Quanto às posições 23, 24, 25, etc., estas são as posições 23, 24, 25 da L IVS ARN (como se as primeiras 13 posições estivessem presentes). Como o dC5 se liga ao L-19 IVS ARN (veja-se acima), é 15During the discus of L-13 IVS RNA, the region of the active site sequence to be discussed from the point of view of activity and variants is as follows: UU Θ 6 A aa G 20 21 22 23 24 25 26 27 10 The first ribonucleotide of the L-19 IVR RNA at the 5 'OH terminal is equivalent to nucleotide 20 in the intact L IVS RNA. As for positions 23, 24, 25, etc., these are positions 23, 24, 25 of the L IVS RNA (as if the first 13 positions were present). Since dC5 binds to the L-19 IVS RNA (see above), it is 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 provável que a endorribonuclease funcione sobre polímeros mistos de ARN e ADN. Por exemplo, a L-19 IVS ARN ligar-se-á ao troço de ADN, enquanto a enzima de ARN actua no troço de ARN do polímero misto. Alterações efectuadas no local de fixação de forma a fixar os outros nucleótidos poderão resultar em todo um conjunto de actividades sobre polímeros mistos, originadas por toda uma série de endorribonucleases deste tipo. Abreviações: IVS, sequência interveniente; L—13 IVS ARN (leia-se &quot;L menós 19&quot;), um ARN linear com 395 nucleótidos sem os 30 primeiros 19 nucleótidos da IVS; CHES, ácido 2-Cciclohexilamina) etanosulfónico; EDTA, ácido etilenodiaminotetracético; MES, á c i do2-(N-mo rfo1ino)-etanosu1f ôn i c o 5 Tris, trisChidfox i metil) aminoetano? p$, &quot;'“p presente num oligonucieótido (por exemplo, CSpt é CpCpCpCpC C '&quot;’^Ρ 1 -pCp ) . 35 43 1 1Mod. 71-10000 ex. It is probable that endorribonuclease will work on mixed polymers of RNA and DNA. For example, L-19 IVS RNA will bind to the DNA strand, while the RNA enzyme acts on the RNA portion of the mixed polymer. Alterations made at the attachment site so as to attach the other nucleotides may result in a whole set of activities on mixed polymers originating from a whole series of endoribonucleases of this type. Abbreviations: IVS, intervening sequence; L-13 IVS RNA (read &quot; L menhos 19 &quot;), a linear RNA of 395 nucleotides without the first 30 nucleotides of the IVS; CHES, 2-Cyclohexylamine) ethanesulfonic acid; EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid; (N-morpholino) -ethanesulfonyl-5-Tris, tris (hydroxymethyl) aminoethane; p is present in an oligonucleotide (for example, CSpt is CpCpCpCpC C '' Ρ 1 -pCp). 35 43 1 1

Mpd. 71-10000 ex,- 89/07Mpd. 71-10000 ex, 89/07

15 2015 20

(2.077 lie£: PJW/Dniversity Patents-SNA. Ribozynie PREPARAÇAQ DA ENZIMA - A L-19 IVS ARN pode ser sintetizada e(2077) PJW / Dniversity Patents-SNA Ribozynie PREPARATION OF ENZYME - L-19 IVS RNA can be synthesized and

Durifiçada como é descrito por Zaug &amp; Cech (1986) Science (Wash., 5 D.C.) 231:4.70—4.75 (.veja—se a descrição detalhada na Fig. 5).Durified as described by Zaug &amp; Cech (1986) Science (Wash., 5 D.C.) 231: 4.70-4.75 (see the detailed description in Fig. 5).

Resumindo, o ARIM foi transcrito in vitro, do pSF‘TTlA3, com ARN-joIimerase do bacteriofago 8P6. (Em alternativa, o ARN pode ser transcrito do pT7-TTlÀ3 ou de qualquer dos plasmideos da série 10 sBG com ARN-polimerase do bacteriofago T7 in vitro). Os transcritos foram depois incubados para promover o auto-processamento e a ciclizaçSo da IVS ARN. 0 ARN foi subsequente-mente incubado na presença de MgC12 a pH=9.0 CcondiçSes favoráveis â hidrólise dirigida), para converter a IVS ARN circular à L-19 IVS ARN. A L-19 IVS ARN foi purificada por electroforese em gel de poliacrilamida e por cromatografia em Sephadex G-SO, A, concentração da enzima foi determinada espèctroscópicamente tomando um coeficiente de extinção molar de 3.26 X 10 fa M-l cm-1 a 260 nm.Briefly, ARIM was transcribed in vitro from pSF'TT1A3 with bacteriophage 8P6 RNA-joIimerase. (Alternatively, RNA can be transcribed from pT7-TT1Î ± 3 or any of the 10 sBG series plasmids with bacteriophage T7 RNA polymerase in vitro). Transcripts were then incubated to promote auto-processing and cyclization of IVS RNA. The RNA was subsequently incubated in the presence of MgCl2 at pH = 9.0, conditions conducive to directed hydrolysis), to convert the circular RNA IVS to L-19 IVS RNA. L-19 IVS RNA was purified by polyacrylamide gel electrophoresis and by Sephadex G-SO3 chromatography, concentration of the enzyme was determined spectroscopically by taking a molar extinction coefficient of 3.26 X 10-3 M -1 I cm -1 at 260 nm.

Os plasmideos activos utilizados foram os seguintes: pSPTTlAS, pT7-TTlA3, pBGST7, pBG/-2G:23C, pBG/23C, pBG/-25The active plasmids used were the following: pSPTTlAS, pT7-TTlA3, pBGST7, pBG / -2G: 23C, pBG / 23C, pBG / -25

3G:24C, pBG/24C, pBG/-4G:25C, pBG/25C e pBG/23A4 e pT7L-21. A série de plasmideos PBG encontra-se descrita em Been, M. Si Cech, T.R. (1986) Cell 407;207. Por exemplo, os plasmideos pBG/3G:24C e pBG/24C produzem a variante 24C da L-19 IVS ARN, que efectua 30 clivagem a seguir â sequência de quatro bases CGGU do ARN. Esses plasmideos encontram-se guardados e estão disponíveis no3G: 24C, pBG / 24C, pBG / -4G: 25C, pBG / 25C and pBG / 23A4 and pT7L-21. The PBG plasmid series is described in Been, M. Si Cech, T.R. (1986) Cell 407; 207. For example, plasmids pBG / 3G: 24C and pBG / 24C produce the 24C variant of L-19 IVS RNA, which cleaves following the four CGGU sequence of the RNA. These plasmids are stored and available

Departamento de Química e Bioquímica , Universidade do Colorado,Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado,

Boulder, Colorado 80309-0215. Qs exemplares, incluindo pBG 3T7 35 (ATCC 40288), pT7-TTlA3 CATCC 40290) e pBG/-3G:24C CATCC 40289) 44 1 1Boulder, Colorado 80309-0215. Exemplary Qs, including 3T7 pBG 35 (ATCC 40288), pT7-TTlA3 CATCC 40290) and pBG / -3G: 24C CATCC 40289)

62.07762,077

Sef: aJW/Oniversxty Patents-RKA Rxbozyue foram depositados na Colecção de Culturas-tipo Americanas (American Type Culture Collection, (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20301, em 25 dé Novembro de 1386. 0 plasmídeo pT7L-21 origina a L-21 IVS ARN em que faltam as primeiras 21 bases. Este plasmídeo CATCC 40231) também foi depositado na ATCC em 2 de Dezembro de 1385.Sequence: AJW / Oniversxty Patents-RKA Rxbozyue were deposited in the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20301, November 25, 1386. Plasmid pT7L-21 originates L-21 IVS RNA lacking the first 21 bases. This plasmid CATCC 40231) was also deposited with the ATCC on December 2, 1385.

#W PREFARAÇA0 DOS SUBSTRACTOS - os substractos C5p:£Cp e ASpíCp foram preparados a partir de C5-QH e de AS-QH» respectivamente, com ARN-ligase de T4 (New England Nuclear), p&amp;Cp, e ATP. Os produtos foram purificados por electroforese em gel de poliacri-## STR1 ## PREFACE OF SUBSTRATES - C5p: Cp and ASpIcp substrates were prepared from C5-QH and AS-QH, respectively, with T4 RNA ligase (New England Nuclear), p & Cp, and ATP. The products were purified by polyacrylate gel electrophoresis

Mod. 71-10000 ex. r 89/07 lamida a 20¾ e ureia 7 M, e por cromatograf ia em Sephadex G—25. 0 substracto C5p$ foi preparado a partir de CSp.tCp por tratamento com fosfatase do intestino de vitelo e eliminação beta (Winter &amp; Brownlee, 1378 Nucieic Acid Res. 5:3129). 0 CSp não marcado foi 20 preparado de forma semelhante, usando pCp não marcado como doador na reacção da ligase. A concentração foi determinada por espectroscopia usando um. coeficiente de extinção molar de 30 % . 3 ..... ... ..... . . . ........ 10 M-l cm-1 a 270 nm. 25 30 PREPARAÇAO DE E-p# - Incubou-se L-13 IVS ARN não marcada (16 pmol) com CSp* 5.2 pmol em NaQAc 50 mM, pH 5.0 e MgC12 20 mM a 42° C durante 10 minutos. A reacção foi parada adicionando EDTA até atingir a concentração de 40 mM. A espécie E-p£ foi purificada (separada) do C5p$ que não reagiu por cromatograf ia em coluna com Sephadex G-100-120, préviamente equilibrada com Tris-HC1 0.01 M pH 7.5, NaCl 0.25 M, e EDTA 0.001 M. As fracçSes que continham o complexo E-pf. foram juntas e fez-se precipitar com 3 45 35 10 15Mod. 71-10000 ex. and washed with 20 M urea and 7 M urea and chromatographed on Sephadex G-25. The C5p substrate was prepared from CSp.tCp by treatment with calf intestinal phosphatase and beta elimination (Winter & Brownlee, 1378 Nucleic Acid Res. 5: 3129). Unlabelled CSp was prepared in a similar manner using unlabelled pCp as a donor in the ligase reaction. Concentration was determined by spectroscopy using a. molar extinction coefficient of 30%. 3 ..... ...... . . ... 10 M-1 cm-1 at 270 nm. Unlabelled L-13 IVS RNA (16 pmol) was incubated with CSp * 5.2 pmol in 50 mM NaQAc, pH 5.0 and 20 mM MgCl2 at 42øC for 10 minutes. The reaction was stopped by adding EDTA to the 40 mM concentration. The Ep espécie species was purified (separated) from unreacted Cpp por by column chromatography with Sephadex G-100-120, previously equilibrated with 0.01 M Tris-HCl pH 7.5, 0.25 M NaCl, and 0.001 M EDTA. The fractions which contained the E-mp complex. were combined and precipitated with 3% methanol.

Mod. 71 -10 000 ex. · 89/07 20 25 30Mod. 71 -10 000 ex. · 89/07 20 25 30

«2.077«2.077

Ref: Rjw/Oniversity Patents-BKA Ribozyme volumes de et.anol. 0 precipitado depois de seco foi então dissolvido em H20. ondiçges Standard para a reaccão da nucleotidi1-transferase 0 substracto oligorribonucleótido (por exemplo, pCS 10-100 jM) é incubado com ribozima (por exemplo L-19 IVS ARN 0.1-2.0 jM) a 42° C em MgC12 20 mM e Tris 50 mH pH 7.5, durante uma hora.Ref: Rjw / Oniversity Patents-BKA Ribozyme etanol volumes. The precipitate after drying was then dissolved in H2O. The oligoribonucleotide substrate (e.g. 10-100 μM pCS) is incubated with ribozyme (for example L-19 IVS RNA 0.1-2.0 μM) at 42 ° C in 20 mM MgCl 2 and Tris 50 mH pH 7.5 for one hour.

Pndicftes Standard para a t-ransfosforilase 0 substracto ARN fosforilado em 3' (por exemplo, C5p 2.5 uM) â incubado com ribozima (por exemplo L-13 IVS ARN 0.1 uM) e com jm oligonucleótido aceitante (por exemplo, UpCpU “200 uM) a 42° C sm MgC12 20 mM e MES 50 mM pH 6.0, durante 3 horas.The 3 'phosphorylated RNA substrate (for example, 2.5æM C5p) is incubated with ribozyme (for example 0.1æM RNA IVS RNA) and with an acceptor oligonucleotide (e.g., 200æM UpCpUâ "¢) ) at 42 ° C in 20 mM MgCl2 and 50 mM MES pH 6.0 for 3 hours.

Condições Standard para a fosfatase ácida Q substracto ARN .fosforilado em 3' (por exemplo, C5p 2.5 uM) é incubado com ribozima em concentaçãó equimolar (por exemplo L-13 IVS ARN 2.5 uM) a 42° C em MgC12 20 mM e NaC2H302 (acetato de sódio) 50 mM pH 5.0, durante 24 horas.Standard conditions for acid phosphatase The 3 'phosphorylated RNA substrate (for example, 2.5æM C5p) is incubated with ribozyme in equimolar conc. (For example 2.5æM LS-RNA 2.5æM) at 42øC in 20 mM MgCl2 and NaCl2H302 (sodium acetate) pH 5.0 for 24 hours.

Reaccbes Standard da endorr ibonuc1ease 0 substracto ARN é pré-tratado com glioxal de acordo com o processo descrito por Carmichael and McMaster (1380) Meth. in Enzymol. 65:380-331, precipitado com etanol, e o precipitado é aglut-inado por centrifugação numa centrífuga de eppendorf. 0 aglutinado (pellet) é seco e o ARN é ressuspenso em água. Q substracto ARN glioxilado.(0.2 uM) é incubado com ribozima (por exemplo, L—13 IVS—beta ARN 0.2 uM) a 50° C em MgC12 10 mM, NaCl 10 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7.5, ΘΤΡ 0.5 mM ureia 2.5 M, durante uma hora. 46 35 52.077 Ref: SJW/University Paterxts-RNA RibozyrreThe RNA substrate is pretreated with glyoxal according to the procedure described by Carmichael and McMaster (1380) Meth. in Enzymol. 65: 380-331, precipitated with ethanol, and the precipitate is agglutinated by centrifugation in an eppendorf centrifuge. The pellet is dried and the RNA is resuspended in water. The glyoxylated RNA substrate (0.2æM) is incubated with ribozyme (for example, 0.2æM L-13 IVS-beta RNA 0.2μM) at 50øC in 10mM MgCl2, 10mM NaCl, 50mM Tris-HCl pH 7.5, ΘΤΡ 0.5 mM urea 2.5 M, for one hour. 46 35 52.077 Ref: SJW / University Paterxts-RNA Ribozyrre

Paragem das reaccSes e anàlise dos produtosStopping reactions and analyzing products

Em todos os casos as reacç8es foram paradas por adição de 5 EDTA até ser atingida a concentração de 25 mM. Qs produtos podem ser analisados por electroforese em gel de poliacrilamida a 20¾ e ureia 7.0 M (gel de sequenciação Standard). Qs produtos podem ser localizados por auto-radiografia se forem usados substractos 10 32_ ARN marcados com P. □s exemplos seguintes e as condiç8es Standard precedentes servem para ilustrar a invenção, mas não para a limitar. 15In all cases the reactions were stopped by adding EDTA until the 25 mM concentration was reached. The products can be analyzed by 20 C polyacrylamide gel electrophoresis and 7.0 M urea (standard sequencing gel). The products may be localized by autoradiography if 10 32 RNA-labeled substrates are used. The following examples and the foregoing Standard conditions serve to illustrate the invention, but not to limit it. 15

Mod. 7Ϊ-10000 ex.-89/07 20 25 30Mod. 7Ϊ-10000 ex.-89/07 20 25 30

Exemplo IExample I

Clivagem dirigida em ARNs de grandes dimensães : A enzima L-19 IVS ARN foi preparada por incubação do pré-rARN sob condiç8es que promovem o auto-processamento, a ciclização e a hidrólise dirigida,CZaug, A.J. , et al. (1984) Science 224:574; 2aug, A.J., et al. (1386) Science 231:470). A guanosina terminal 3' CG414) foi então removida da L-19 IVS ARN por oxidação com peviodato seguida de eliminação beta (Winter, G. , et al. (1378) Nucleic Acids Res. 5:3129-3139). Tal como era esperado, a ribozima resultante CL-19 IVS-beta) tem a actividade como nucleotidil-transferase grandemente reduzida , o que foi avaliado usando C^Pl-pCC)5 como substract-o. Quando se adicionou GTP, contudo, a ribozima foi capaz de efectuar clivagem no p(C)5 bem como em grandes moléculas de ARN. Por exemplo, o transcrito pAKlOS (504 nt) íMount, S.M., et al. (1983) Cell 33:509-518), um fragmento do pré-ARN da beta-globina do rato que contém o primeiro intrão, sofreu clivagem dando origem a fragmentos 47 35 1Targeted cleavage in large RNAs: The enzyme L-19 IVS RNA was prepared by incubating the pre-rRNA under conditions that promote self-processing, cyclization and directed hydrolysis, CZaug, A.J., et al. (1984) Science 224: 574; 2aug, A.J., et al. (1386) Science 231: 470). The 3 'CG414 terminal guanosine) was then removed from L-19 IVS RNA by oxidation with peviodate followed by beta elimination (Winter, G., et al. (1378) Nucleic Acids Res. 5: 3129-3139). As expected, the resulting ribozyme CL-19 IVS-beta) has greatly reduced nucleotidyl transferase activity, which was evaluated using C-Pl-pCC) as the substract. When GTP was added, however, the ribozyme was able to carry out cleavage at p (C) 5 as well as large RNA molecules. For example, the transcript pAKlOS (504 nt) Mount, S.M., et al. (1983) Cell 33: 509-518), a fragment of rat beta globin pre-RNA containing the first intron, cleaved to give

II

1 I1 I

62.07762,077

Bef: Rjw/Oniversity Patents-RNA. Ribozyme principais com 14-8, 360 e 464 nt, bem como a alguns fragmentos secundários (Fig. 2a). Como se mostra adiante, os fragmentos com 5 360 e 148 nt seriam os produtos da clivagem em 3' e 5' na posição 360. 0 fragmento com 464 nt é o produto da clivagem em 3' na posição 44, sendo o produto (com 44 nt) da clivagem em 5&quot; demasiado pequeno para ser observado. A ausência de um ARN com 10 316 nt, que seria previsto devido à clivagem nas duas posições 44 a 360, como produto principal, ê indicativa de digestão parcial em que poucas moléculas sofrem clivagem mais do que uma vez. 15Bef: Rjw / Oniversity Patents-RNA. Ribozyme with 14-8, 360 and 464 nt, as well as some secondary fragments (Fig. 2a). As shown below, the 5,335 and 148 nt fragments would be the 3 'and 5' cleavage products at position 360. The 464 nt fragment is the 3 'cleavage product at position 44, the product 44 nt) cleavage at 5 &quot; too small to be observed. The absence of a 10 316 nt RNA, which would be predicted due to cleavage at the two positions 44 to 360, as the major product, is indicative of partial digestion in which few molecules undergo more than one cleavage. 15

Mpd. 7Ϊ-10000 ex. - 80/07 20 25 30Mpd. 7Ϊ-10000 ex. - 80/07 20 25 30

A clivagem exigiu o ião magnésio (concentração óptima de MgC12 entre 10 e 20 mM), e era essencialmente independente do catião monovalente na gama de 0 a 200 mM NaCl. 0 pH óptimo estava compreendido entre 7.5 e 8.0, e a temperatura óptima era de aproximadamente 50° C. Apesar da L-19 IVS ARN com eliminação beta ser capaz de Catalisar a reacção de clivagem, a remoção da G414 da ribozima não é necessária para a actividade de clivagem. A enzima funcionava com a mesma velocidade quer a G414 tivesse sido removida, quer não. Explicamos a actividade da L-19 IVS ARN intacta postulando que, a concentrações saturantes de STP, o ataque ao substracto pelo GTP compete muito eficientemente com o ataque pela &lt;3414. Fazemos notar que a IVS ARN e a L-19 IVS ARN se encontram isentas de proteína. A L-13 IV8 ARN é portanto uma enzima composta por ARN isenta de proteína (ou ribozima). A L-19 IVS ARN e outras similares funcionam também como enzimas na ausência de proteínas. Isto aplica-se tanto às proteínas endógenas como às exógenas. Isto é evidenciado pela manutenção da actividade 48Cleavage required magnesium ion (optimum MgCl2 concentration between 10 and 20 mM), and was essentially independent of the monovalent cation in the range of 0-200 mM NaCl. The optimum pH ranged from 7.5 to 8.0, and the optimum temperature was approximately 50øC. Although L-19 IVS RNA with beta deletion is capable of catalyzing the cleavage reaction, removal of G414 from the ribozyme is not necessary for the cleavage activity. The enzyme worked at the same rate whether G414 had been removed or not. We explained the activity of the intact L-19 IVS RNA postulating that, at saturating concentrations of STP, the attack on the substrate by GTP competes very efficiently with the attack by &lt; 3414. We note that IVS RNA and L-19 IVS RNA are protein-free. L-13 IV8 RNA is therefore an enzyme composed of protein-free RNA (or ribozyme). L-19 IVS RNA and the like also function as enzymes in the absence of proteins. This applies to both endogenous and exogenous proteins. This is evidenced by the maintenance of activity 48

Moa. 71-10000 ex.-.89/07Moa. 71-10000 ex.

©.077© .077

Bef: BJW/University Patents-BNA Ribozyme quando as ribozimas são sujeitas à actividade de proteases, à ebulição ou ao dodecilsulfato de sódio. Qualquer resíduo de ARN-polimerase proteica proveniente do sistema de transcrição utilizado para produzir a IVS ARN é removido por extracção com fenol. A capacidade de produzir a IVS ARN num sistema completamente definido e de remover a ARN-polimerase por extracção com fenol é uma evidência adicional na natureza não proteica da reacção.Bef: BJW / University Patents-BNA Ribozyme when ribozymes are subjected to the activity of proteases, boiling or sodium dodecylsulfate. Any residues of protein RNA polymerase from the transcription system used to produce the RNA IVS are removed by phenol extraction. The ability to produce IVS RNA in a completely defined system and to remove RNA polymerase by phenol extraction is further evidence in the non-protein nature of the reaction.

Exemplo IIExample II

Produtos de clivagem marcados 3·?Cleavage products labeled 3 ·?

Quando a Calfa-’ &quot;‘&quot;PI STP foi incluída na reacção do ARN de pAK105.de forma análoga à do exemplo I, os produtos de clivagem com 148 e 464 nt encontravam-se marcados íFig. 2b). A sequenciação directa destes fragmentos de ARN marcados (e.g., Fig. 2c) mostrou que a clivagem e a adição de GTP ocorrem nos nucleótidos 44 e 360 da sequência, pelo que os produtos de clivagem a jusante se encontram marcados com GTP 5'. As ligaçdes formadas pela adição do GTP são sensíveis à RNase Tl, confirmando que o GTP foi adicionado covalentemente através do seu 0-3' por uma ligação fosfodiéster normal 3-5'' . A reacção do ARN C841 nt) pT7-l (Xmn 1), (essencialmente sequências pBR322&gt; produziu quatro fragmentos marcados principais. Estes foram sequenciados de maneira análoga. No caso do ARN pT7-l com 122 nt adicionais no seu terminal 3', produzido pela transcrição do ADN pT7-i que sofrera corte no local Sca I, ocorreu o aumento esperado nos pesos moleculares dos produtos marcados. Em todas as reacçSes, 49 1 5 10 15When Calfa-PITP was included in the pAK105 RNA reaction in an analogous manner to that of Example I, 148 and 464 nt cleavage products were labeled (Fig. 2b). Direct sequencing of these labeled RNA fragments (e.g., Fig. 2c) has shown that the cleavage and addition of GTP occur at nucleotides 44 and 360 of the sequence, whereby the downstream cleavage products are labeled with 5 'GTP. The bonds formed by the addition of GTP are sensitive to RNase T1, confirming that GTP has been covalently added through its 0-3 'through a normal phosphodiester bond 3-5' '. In the case of pT7-1 RNA with additional 122 nt at its 3 'terminus, the pRNA sequence of the pT7-1 RNA was expressed as the ratio of the pT7-1 RNA produced by the transcription of the pT7-i DNA which had been cleaved at the Sca I site, the expected increase in molecular weights of the labeled products occurred.

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30

35 ©.077 Bef: MW/Oniversity Patents-BNA Riboaçme35 © .077 Bef: MW / Oniversity Patents-BNA Riboaçme

Incluindo aquelas em que o substracto ARN foi omitido, a L-19 IVS 2|RN ficou marcada, talvez devido à reacção de permuta de guanosina, proposta alhures CZaug, A.J. , et al. C198S) Science 229:1060-1064; Price, J.V., et al. ¢1987) J. Mol, Biol., a ser impresso). Os locais de auto-marcação eram heterogéneos.Including those in which the RNA substrate was omitted, L-19 IVS 2 | RN was labeled, perhaps due to the guanosine exchange reaction, proposed elsewhere CZaug, A.J., et al. C198S) Science 229: 1060-1064; Price, J.V., et al. (1987) J. Mol, Biol., To be printed). The self-labeling sites were heterogeneous.

Exemplo IIIExample III

Avaliação da especificidade A sequência próxima do terminal 5&quot; de cada produto marcado no terminal (veja-se o exemplo II) foi comparada â sequência conhecida do ARN para identificar o nucleótido que precede o local da clivagem. Os resultados encontram-se resumidos na tabela 1. Tanto os locais de clivagem principais como os secundários são precedidos por.quatro pirimidinas, sendo a sequência CUCU a que é consensual. Esta é exactamente a sequência tetranucleoti-dica que se previa ser um alvo óptimo para a ribozima. A importância dos nucleótidos nas posiçóes -5 e -6 relativamente ao local de clivagem ainda .não é clara, embora a ausência, de resíduos Θ possa ser significativa. Não parecem existir preferências em relação à sequência a jusante do local de clivagem, estando todos os quatro nucleótidos representados na posição +1. Quando se avalia a especificidade, é também necessário considerar os locais de clivagem potencial no ARN que não sofreram clivagem pela ribozima. No caso do ARN pAK105, existia apenas um local CUCU em que não se observou clivagem. CA clivagem neste local iria produzir um ARN de 378 nt marcado.) Por outro 50Specificity evaluation The sequence close to terminal 5 &quot; of each terminal labeled product (see example II) was compared to the known RNA sequence to identify the nucleotide preceding the cleavage site. The results are summarized in Table 1. Both the major and secondary cleavage sites are preceded by four pyrimidines, the CUCU sequence being consensual. This is exactly the tetranucleotidic sequence that was predicted to be an optimal target for the ribozyme. The significance of the nucleotides at the -5 and -6 positions relative to the cleavage site is still unclear, although the absence of residues Θ may be significant. There appears to be no preference for the sequence downstream of the cleavage site, with all four nucleotides being represented at the +1 position. When assessing specificity, it is also necessary to consider potential cleavage sites in RNA that have not been cleaved by the ribozyme. In the case of pAK105 RNA, there was only one CUCU site in which no cleavage was observed. CA cleavage at this site would produce a labeled 378 nt RNA.) For another 50

52.07752,077

Bef: MW/University Patents-RKA Ribozyme lado, muitos locais que se assemelham a CUCU em 3 das 4 posições também não sofreram clivagem. Estes incluem 17 sequências CUMU Conde M 4 C) e 7 sequências GNCU Conde N 4 U). No ARN pT7-l, a clivagem foi observada em ambas as sequências CUCU presentes. Assim, a ribozima tem uma forte preferência para efectuar a clivagem a seguir ao tetranucleótido CUCU. 10Bef: MW / University Patents-RKA Ribozyme side, many sites that resemble CUCU in 3 of the 4 positions also did not undergo cleavage. These include 17 sequences CUMU Count M 4 C) and 7 sequences GNCU Count N 4 U). In pT7-1 RNA, cleavage was observed in both CUCU sequences present. Thus, the ribozyme has a strong preference to effect cleavage following the CUCU tetranucleotide. 10

Exemplo IVExample IV

Clivagem em regiões do ARN com emparelhamento de bases e estrutura secundária: 15Cleavage in RNA regions with base pairing and secondary structure:

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 0 ARN Ml, a subunidade ARN da RNase P da E.coli CReed, R.E., et al. C1982) Cell 30:627-636), não sofreu clivagem pela L-13 IVS ARN-beta em condições reaccionais Standard CFig. 2b). 0 ARN Ml contém a sequência UCCUCU, que deveria ser um excelente local para a clivagem. Contudo, esta sequência está inserida numa estrutura secundária em gancho Chairpin stem) estável CGuerrier--Takada, C., et al. &lt;1984) Biochemistry 23:6327-6334j Pace, N.R., et al. C1985) Qrig. of Life 16:97-116), o que provávelmente a torna indisponível para actuar como substracto. Verificámos que a desnaturação do ARN Ml com glioxal permitia uma clivagem eficiente nesse local pela L-19 IVS ARN, o que apoia a interpretação de que a estrutura secundária do ARN pode inibir a clivagem. Q procedimento Ccom glioxal) utilizado para a desnaturação foi feito de acordo com Carmichael, G.G., et al. &lt;1980) Meth. in Enzymol. 65:380-391. 51 35 1 1Mod. 71-10000 ex. RNAse P subunit of E. coli CReed, R.E., et al. C1982) Cell 30: 627-636), was not cleaved by L-13 IVS RNA-beta under standard reaction conditions CFIG. 2b). The M1 RNA contains the sequence UCCUCU, which should be an excellent site for cleavage. However, this sequence is inserted into a stable secondary Chairpin stem structure CGuerrier - Takada, C., et al. &lt; 1984) Biochemistry 23: 6327-6334 Pace, N.R., et al. C1985) Qrig. of Life 16: 97-116), which probably makes it unavailable to act as a substrate. We have found that denaturation of the M1 RNA with glyoxal allowed an efficient cleavage at that site by the L-19 IVS RNA, which supports the interpretation that the secondary structure of the RNA can inhibit cleavage. The C-glyoxal procedure) used for denaturation was done according to Carmichael, G.G., et al. &lt; 1980) Meth. in Enzymol. 65: 380-391. 51 35 1 1

5 10 155 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 52.077Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 52,077

Bef: RJW/University Patenfcs-BNA EibõzymeBef: RJW / University Patenfcs-BNA Eibõzyme

Exemplo VExample V

As mutações no sitio&quot;activo alteram a especificidade em relação ao substractoMutations at the active site alter the specificity in relation to the substrate

Em seguida foi estudada a especificidade em relação ao substracto, num sistema controlado onde podíamos ter a certeza de que a estrutura secundária do substracto ARN nSo afectava a reacção de clivagem. Os substractos oligorribonucleótido foram sintetizados pelo método de transcrição com ARN-polimerase do fago T7 desenvolvido por Ulhenbeck e colaboradores (Lowary, P., et- al. ¢1386) ΝΑΤΟ A8I Series, vol. 110, 63-76) (Fig.Sar). Um dos substractos apresentava um emparelhamento perfeito com sequência-consenso tetránucleotidica. Outros dois substractos tinham substituições numa única base, com emparelhamentos de 3-em-4 em relação à sequência-consenso.Substrate specificity was then studied in a controlled system where we could be sure that the secondary structure of the RNA substrate did not affect the cleavage reaction. The oligoribonucleotide substrates were synthesized by the T7 phage RNA polymerase transcription method developed by Ulhenbeck et al. (Lowary, P., et al., ¢ 1386) A8I Series, vol. 110, 63-76) (Fig.Sar). One of the substrates presented a perfect pairing with consensus-sequence tetranucleotide. Two other substrates had substitutions on a single base, with 3-in-4 pairings to the consensus sequence.

Estes substractos foram testados com a L-19. IVS ARN selvagem e com duas ribozimas alteradas (Been, M.D. and Cech, T.R. , (1386)These substrates were tested with L-19. IVS wild-type RNA and two altered ribozymes (Been, M.D. and Cech, T.R., (1386)

Cell 47, 207-216). As duas variantes tem alterações numa única base no local de fixação 5' do exão, o que altera a 25 especificidade em relação à sequência no primeiro passo do auto-processamento do pré-ARN CBeen, M.D., et al. , suor a.) A variante 23C (com S convertida a C na posição 23 da L-19 IVS ARN) deveria reconhecer os substractos CUSU, e a variante 24C (A convertida a 30 C na posição 24) deveria reconhecer os CGCU (Fig. 3b). Durante estes estudos, verificámos que a adição à reacção de ureia 2.5 íl ou de formamida a 15% aumentava considerávelmente a especificidade, permitindo a cada ribozima distinguir substractos com uma única mudança de base na sequência de reconhecimento. 0 52 1 1 5 10Cell 47, 207-216). The two variants have changes on a single basis at the 5 'attachment site of the exon, which alters sequence specificity in the first step of pre-RNA self-processing CBeen, M.D., et al. , sweat a.) Variant 23C (with S converted to C at position 23 of L-19 IVS RNA) should recognize CUSU substrates, and variant 24C (A converted at 30 C at position 24) should recognize the CGCU (Fig. 3b). During these studies, we found that addition to the reaction of 2.5% urea or 15% formamide greatly enhanced specificity, allowing each ribozyme to distinguish substrates with a single base change in the recognition sequence. 0 52 1 1 5 10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 3.077 5e£: RDW/Dniversity Patents-RNA Ribozyite modelo por nós admitido é o de que estes desnaturantes desestabi-lizam o emparelhamento das bases entre o substracto e os nucleótidos que constituem o sitio activo da ribozima, discriminando dessa forma os complexos mal emparelhados. Qs resultados do tratamento dos três substractos com cada uma das t-rês ribozimas na presença dê ureia 2.5 M encontram—se apresentados na Fig. 3c. Cada substracto sofre clivagem exclusivamente pela ribozima que tem capacidade para formar um complexo enzima-substracto .com emparelhamento perfeito das bases £Fig. 3b). Assim» admite-se que o sitio activo possa ser manipulado de forma a reconhecer qualquer sequência de bases, desde que esta seja do tipo XYZU, onde X, Y, e Z podem ser qualquer das quatro bases A,U,C,S e os nucleótidos contidos na sequência de quatro bases podem ser iguais ou diferentes.Mod. 71 -10000 ex. It is our accepted model that these denaturants destabilize the base pairing between the substrate and the nucleotides that constitute the active site of the ribozyme, discriminating from that form the mismatched complexes. The treatment results of the three substrates with each of the three ribozymes in the presence of 2.5 M urea are shown in Fig. 3c. Each substrate is cleaved exclusively by the ribozyme which has the ability to form an enzyme-substrate complex with a perfect pairing of bases. 3b). It is thus admissible that the active site can be manipulated to recognize any sequence of bases, provided it is of type XYZU, wherein X, Y, and Z may be any of the four bases A, U, C, S, and the nucleotides contained in the four base sequence may be the same or different.

Quando se incubaram ribozimas variantes com o ARN C504 nt&gt; pAKlOS, cada ribozima originou um padrão diferente de produtos de clivagem. Um dos locais de clivagem mais importante foi localizado e caracterizado em três ribozimas variantes, incluindo a variante 25C C6 convertido a C na posição 25). Qs locais clivados pelas ribozimas 23C, 24.C e 25C são precedidos por CCCCUGU, UCUGCU e CUSUCU, respectivamentep as bases sublinhadas são as que formam ligaçSes G.C com o nucleótido mudado na ribozima variante. Cada uma dest-âs sequências pode formar 6 pares de bases seguidos com os nucleótidos do sitio activo da ribozima variante. Estes resultados iniciais são prometedores, embora seja necessário sequenciar rnais locais de clivagem antes de se poder avaliar correctamente a especificidade. 53 35When variant ribozymes were incubated with the C504 RNA nt &gt; pAKlOS, each ribozyme gave a different pattern of cleavage products. One of the most important cleavage sites was located and characterized in three variant ribozymes, including the 25C C6 variant converted to C at position 25). The sites cleaved by the ribozymes 23C, 24C and 25C are preceded by CCCCUGU, UCUGCU and CUSUCU, respectively, the underlined bases are those which form G.C bonds with the nucleotide changed in the variant ribozyme. Each of the sequences may form 6 base pairs followed with the nucleotides of the active site of the variant ribozyme. These initial results are promising, although it is necessary to sequence further cleavage sites before the specificity can be correctly assessed. 53 35

/ $2.077/ $ 2,077

Ref: RJW/UniversitY Patents-RKa. Ribozyite 5Ref: RJW / UniversitY Patents-RKa. Ribozyite 5

Exemp1ο V Γ A c1ivagem catalítica 10 15 A variação da clivagem no substracto oligonucleótido G G C C C: U C U :¾ A A A A A Conde o asterisco indica o local de clivagem) pela ribozima selvagem em ordem ao tempo é apresentada na Fig. 4a. A reacção de suhsiracto 2.S uH com ribozima 0.2 uM está 66% completa em 90 minutos. Assim, é óbvio que a ribozima actua catalíticamente.The variation of the cleavage in the oligonucleotide substrate is shown in Fig. 4a. In the case of the wild-type ribozyme in the order of time, it is shown in Fig. 4a. The reaction of 2.45æM suhsirate with 0.2æM ribozyme is 66% complete in 90 minutes. Thus, it is obvious that the ribozyme acts catalytically.

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 A velocidade da reacção foi determinada para uma série de concentrações de substracto. A cinética é adequadamente descrita pela lei de velocidades de Michaelis-Menten. A dependência da velocidade da concentração de GIF’ é apresentada na Fig. 4b, sob a forma de um gráfico de Lineweaver-Burk. Q Km para o GTP é 44 uM. A dependência da velocidade da concentração de substracto ARN a concentrações saturantes de GTP encontr-se apresentada na Fig. 4C. 0 Km para este substracto oligorribinucleótido é 0.8 uM, e o kçat é 0..13. min-1... Assim, sob condições de Vmax a enzima recomeça o seu ciclo catalítico cerca de 8 vezes por hora.Mod. 71 -10000 ex. The reaction rate was determined for a range of substrate concentrations. The kinetics are adequately described by the Michaelis-Menten velocity law. The GIF concentration concentration dependence is shown in Fig. 4b in the form of a Lineweaver-Burk graph. Q Km for the GTP is 44æM. The dependence of the rate of concentration of RNA substrate at saturating concentrations of GTP is shown in Fig. 4C. 0 Km for this oligoribinucleotide substrate is 0.8 ÂμM, and the kat is 0..13. min-1 ... Thus, under Vmax conditions the enzyme resumes its catalytic cycle about 8 times per hour.

Exemplo VII Na ausência de ureia e formaldeido, as mudanças de uma única 30 base na sequência de três nucleótidos do substracto ARN que precedem o local de clivagem com a ribozima ARN, dando um complexo substracto-ribozima mal emparelhado, aumentam a velocidade da clivagem com a endorribonuclease. Qs substractos 35 mal emparelhados apresentam um aumento até 100 vezes no valor de 54 1 5 10 15In the absence of urea and formaldehyde, single base changes in the three nucleotide sequence of the RNA substrate preceding the cleavage site with the RNA ribozyme, giving a poorly paired substrate-ribozyme complex, increase the cleavage rate with to endoribonuclease. The poorly paired substrates show an increase of up to 100 times in the value of 54 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 25 62.077Bef: RJW/Oniversity Patents-RKA RxbozymeMod. 71 -10000 ex. - 89/07 25 62.077Bef: RJW / Oniversity Patents-RKA Rxbozyme

kcat e, em alguns casos, de kcat/Km. Um mau emparelhamento Introduzido por mudança de um nucleótido no sitio activo da ribozima tem um efeito semelhante. A adição de ureia 2.5 ΙΊ ou de formamida 3.8 M, ou a diminuição da concentração do ião metálico divalente de 10 para 2 mM inverte a especificidade em relação ao substracto, permitindo á enzima discriminar o substracto mal emparelhado. 0 efeito da ureia é o de diminuir o kcat·/ Km para a clivagem do substracto mal emparelhado! o Km não é significativa-mente afectado em ureia de 0 a 2.5 ΙΊ. Assim, a desestabi 1 ização progressiva da ligação ribozima-substfacto por maus emparelhamen-tos ou por adição de desnaturantes como a ureia, aumenta inicialmente a velocidade de clivagem até se atingir um valor óptimo, e depois faz diminuir essa velocidade. A ribozima, e as variantes com especificidade alterada em relação à sequência, dão origem a uma série de endorribonucleases com especificidade dirigida a determinadas sequências, que podem ser reagentes úteis para vários estudos da biologia molecular do ARN. 30 - Materiais. Os nucleósido trifosfatados não marcados foram adquiridos à &quot;P - L Biochemicals&quot;, os nucleósido trifosfatados marcados à &quot;New England Nuclear&quot;, a fosfatase de intestino de vitelo à&quot; New England Nuclear&quot;, a polinucleòtido-cinase do T4 ao &quot;United States Biochemicals&quot;, e as endonucleases de restrição aos &quot;New England Biolabs&quot;. A ARN-polimerase de T7 foi isolada da estirpe BL.21 da escherichia coli contendo o plasmideo pAR1213 (Davanloo et al., (1384) Proc. IMatl. Acad. Sei. USA 81:2035— -2033). 55 35 1 52-077kcat and, in some cases, kcat / Km. Bad mating Introduced by changing a nucleotide at the active site of the ribozyme has a similar effect. The addition of 2.5 ΙΊ urea or 3.8 M formamide or the decrease in divalent metal ion concentration of 10 to 2 mM reverses the specificity relative to the substrate, allowing the enzyme to discriminate the mismatched substrate. The effect of urea is to decrease kcat · / Km for cleavage of the mismatched substrate! Km is not significantly affected in urea from 0 to 2.5 ΙΊ. Thus, the progressive destabilization of the ribozyme-substrate binding by bad pairs or by the addition of denaturants such as urea, initially increases the cleavage rate until an optimum is reached, and then decreases that rate. Ribozyme, and variants with sequence-specific specificity, give rise to a series of endoribonucleases with specificity directed to particular sequences, which may be useful reagents for various studies of the molecular biology of RNA. 30 - Materials. The unlabeled triphosphate nucleoside was purchased from &quot; P-L Biochemicals &quot;, the triphosphate nucleoside labeled with &quot; New England Nuclear &quot;, calf intestinal phosphatase &quot; New England Nuclear &quot;, the T4 polynucleotide kinase to &quot; United States Biochemicals &quot;, and the restriction endonucleases to &quot; New England Biolabs &quot;. T7 RNA polymerase was isolated from the E. coli strain BL.21 containing plasmid pAR1213 (Davanloo et al., (1384) Proc.Matl.Acad.S.A. 81: 2035-2033). 55 35 1 52-077

Bef: RJW/Ohiversity Patents-HNA. RLbozyme 5 - Preparação da L-21 Sca I ARN. 0 plasmideo pT7L~21 foi cortado com endonuclease de restrição Seal, extraído com fenol e clorofórmio, precipitado com etanol, e depois ressuspenso em H2Q de forma a ter uma concentração de 1 ug/uL. A transcrição foiBef: RJW / Ohiversity Patents-HNA. RLbozyme 5 - Preparation of L-21 Sca I RNA. Plasmid pT7L-21 was cut with Seal restriction endonuclease, phenol and chloroform extracted, ethanol precipitated, and then resuspended in H2 O to have a concentration of 1æg / μl. The transcript was

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 efectuada em 2 ml de Tris-HCl 40 mM pH=7.5, MgC12 12 mM, DTT 10 10 mM, espermidina 4 mM, 1 'mM em cada nucleósido trifosfatado, 10 ug/rnL em plasmideo linearizado, e 200 unidades de ARN-polimerase de T7/uq de ADN. A incubação foi feita durante 1 h a.37° C. Os produtos foram precipitados em etanol e purificados por 1g electroforese em gel de poliacrilamidar a 4¾ e ureia 8 Μ. A L-21 Seal ARN foi detectada por iluminação com UV, retirada, e eluida ídurante a noite) a 4o C em NaCl 250 mM, Tris-HCl 10 mM pH=7.5 e EDTA 1 mM. 0 gel foi removido por centrifugação. 0 ARN foi precipitado em etanol, e submetido a cromatografia numa coluna de Sephadex Q-fíO equilibrada em NaCl 250 mM, Tris-HCl 10 mM pH=7.5 e EDTA 1 mM. As fracçSes que continham ARN foram juntas e precipitadas em etanol. 0 precipitado foi lavado com etanol aMod. 71 -10000 ex. - 89/07 in 2 ml of 40 mM Tris-HCl pH = 7.5, 12 mM MgCl2, 10 mM DTT 10, 4 mM spermidine, 1 mM in each triphosphate nucleoside, 10æg / ml in linearized plasmid, and 200 units of T7 RNA polymerase / uq DNA. Incubation was performed for 1 h at 37 ° C. The products were precipitated in ethanol and purified by 1g electrophoresis on 4% polyacrylamide gel and 8æ urea. L-21 Seal RNA was detected by UV illumination, removed, and eluted overnight) at 4 ° C in 250 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH = 7.5 and 1 mM EDTA. The gel was removed by centrifugation. The RNA was precipitated in ethanol, and subjected to chromatography on a Sephadex Q-F10 column equilibrated in 250 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH = 7.5 and 1 mM EDTA. Fractions containing RNA were pooled and precipitated in ethanol. The precipitate was washed with ethanol

70%. seco, e ressuspenso em H2Q. A concentração da L-21 Seal ARN 25 30 foi determinada por espectofotometria. 0 coeficiente de extinção70%. dried, and resuspended in H2 O. The concentration of L-21 Seal RNA 25 30 was determined by spectrophotometry. The extinction coefficient

G (E 2S0nm = 3.2 X 10 M-l cm-1) foi determinado tomando uma amostra de L-21 Seal ARN CA260nm = 0.534), submendo em seguida essa amostra a uma hidrólise completa com uma mistura de ribonucleases ΤΙ, T2 e A e tornando a medir a absorvância CA260nm = 0.753), e multiplicando a razão entre estas absorvâncias pelo coeficiente de extinção calculado para uma mistura de nucleótidos livres com proporç5es análogas âs que ocorrem na L—21 Seal ARN. 56 35 1 1Was determined by taking a sample of L-21 Seal RNA CA260nm = 0.534), then subjecting this sample to complete hydrolysis with a mixture of ribonucleases ΤΙ, T2 and A and making to measure the absorbance CA260nm = 0.753), and multiplying the ratio of these absorbances by the calculated extinction coefficient to a mixture of free nucleotides with proportions analogous to those occurring in L-21 Seal RNA. 56 35 1 1

0s 10 150s 10 15

Mod. 71-10000 ex.-89/07 25 62.077Mod. 71-10000 ex.-89/07 25 62,077

Bef: RJW/University Patenfcs-BKÁ RLbozyme Síntese dos substrac tos· oligorribonucleótido. oligorribonucleòtidos foram produzidos por transcrição de sequências-moIde de AON sintético como é descrito por Lowary et al. NATO ASI ser, ser A 110:63-76 (1986) e Milligan et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8783. As soluçSes dos transcritos (2 mL) continham MgC12 12 mM, Tris-HCl 40 rnM pH=7\5, DTT 10 mM, espermidina 4 mM, 2 mM em cada nucleósido trifosfatado, í.S uM em ADN promotor (cadeia superior, top strand), '1.5 uM em ADN promotor sequência-moIde (cadeia inferior, bottom strand), e 100.000 unidades/mL de ARN-ρο1i merase de T7. (Os deoxioligonucleòtidos das cadeias superior e inferior foram sintetizados num sintetizador de ADN 380B da &quot;Applied Biosystems&quot;, desprotegidos, precipitados em etanol e utilizados sem serem mais purificados). A incubação foi feita durante 2 horas a 37° C. Qs produtos foram precipitados em etanol e purificados por electroforese em gel de poliacrilamida a 20¾ e ureia 7 Μ. A purificação continuou como foi descrito para a L-21 Seal ARN, excepto que a cromat-ografia foi feita numa coluna de Sephadex Θ—25.Bef: RJW / University Patenfcs-BKÁ RLbozyme Synthesis of substrates · oligoribonucleotide. oligoribonucleotides were produced by transcription of synthetic AON moIde sequences as described by Lowary et al. NATO thus, to be A 110: 63-76 (1986) and Milligan et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 8783. The transcript solutions (2 mL) contained 12 mM MgCl2, 40 mM Tris-HCl pH = 7, 10 mM DTT, 4 mM spermidine, 2 mM in each triphosphate nucleoside, æM in promoter DNA (upper strand, top strand), 1.5æM in promoter DNA sequence (bottom strand), and 100,000 units / ml T7 RNA-ρο1i merase. (The upper and lower chain deoxyoligonucleotides were synthesized on an Applied Biosystems &quot; 380B DNA Synthesizer &quot; unprotected, ethanol precipitated and used without further purification.) Incubation was performed for 2 hours at 37 ° C. The products were precipitated in ethanol and purified by 20% polyacrylamide gel electrophoresis and 7% urea. Purification continued as described for L-21 Seal RNA, except that the chromatography was done on a Sephadex Θ-25 column.

Marcação dos oligorribonucleòtidos. 0 oligonucleótido purificado (100 pM) foi incubado com 8 unidades de fosfatase deLabeling of oligoribonucleotides. The purified oligonucleotide (100 pM) was incubated with 8 units of

intestino de vitelo em 100 uL de H20 a 37° C durante 1 hora. A 30 solução foi extraída com fenol e éter e deixada evaporar até â secura. A marcação no terminal 5&quot; foi conseguida utilizando polinucleótido-cinase de T4 e Cgama-32P] ATP, □ ARN marcado foi purificado por electroforese em gel (sequenciador) de poliacrila-35 rnida a 20¾ e ureia 7 M, visualizado por auto-radiografia, 57 1 1 10 15calf intestine in 100æl H2 0 at 37 ° C for 1 hour. The solution was extracted with phenol and ether and allowed to evaporate to dryness. Marking at terminal 5 &quot; was achieved using T4 polynucleotide kinase and Cgam-32P] ATP, □ labeled RNA was purified by 20% polyacrylamide gel sequencing (sequencer) and 7 M urea, visualized by autoradiography, 57 1 1 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

€2.077€ 2,077

Ie£: BJW/University Patents-HNR. Ribozyire retirado, e ei ui do corno foi acima descrito. - Determinação da velocidade inicial. As reacções (30 uL ) continham L-21 Seal ARN 0.01 uM, STP SOO uM, MgC12 10 mH, Tris-HC1 50 rnM pH=7.5, e uma mistura de substractos não marcados e marcados no terminal 5'' com concentrações que variavam entre 0.1 e 4.0 uil. As reacções foram iniciadas por adição de MgC12 e prosseguiram a 50° C. Foram removidas porções de 3uL a intervalos de tempos entre 1 e 120 minutos e a reacção foi parada por adição de uma mistura que continha 100 mM EDTA. As amostras foram submetidas a electroforese em gel de poliacrilami-da a 20% e ureia 7ΙΊ. As bandas foram visualizadas por auto-radiografia, cortadas do gel, e quantificadas por contagem num flúor baseado em tolueno, num contador de cintilações Beckman LS7000, As velocidades iniciais foram determinadas como foi descrito por Bass an Cech 11984) Nature CLondon) 308:820. - Aumento da especificidade da clivagem na presença de ureia e formamida. ' Um' substracto 'oiigorribonucleótido contendo -a sequência de reconhecimento CUCU foi incubado com a L-19 IVSbeta ARN selvagem ou, alternativamente, com a ribozima variante 24C. Como se mostra na Fig. 17a, ambas as ribozimas efectuaram clivagem no mesmo local do substracto. Já se tinha mostrado que o local de clivagem sê encontra imediatamente a seguir à sequência de reconhecimento (Zaug et al., 11986) Nature (London) 324:429). Na ausência de ureia, a velocidade de clivagem é realmente maior com a ribozima variante do que com a ribozima selvagem, apesar da ribozima variante não poder formar um complexo enzima-substracto totalmente emparelhado. A medida que 58 1 1 10Et al., U.S. Pat. Ribozyre removed, and the horn was described above. - Determination of the initial velocity. Reactions (30æl) contained 0.01æM L-21 RNA Seal, 10æM SOO, 10æM MgCl₂, 50æM Tris-HCl pH = 7.5, and a mixture of unlabeled and 5 'terminal-labeled substrates at varying concentrations between 0.1 and 4.0 uil. Reactions were initiated by addition of MgCl2 and proceeded at 50 ° C. Portions of 3æl were removed at time intervals between 1 and 120 minutes and the reaction was stopped by the addition of a mixture containing 100 mM EDTA. The samples were electrophoresed on 20% polyacrylamide gel and 7 u urea. Bands were visualized by autoradiography, cut from the gel, and quantified by counting in a toluene-based fluorine on a Beckman LS7000 scintillation counter. Initial velocities were determined as described by Bass an Cech 11984) Nature CLondon) 308: 820 . - Increased specificity of cleavage in the presence of urea and formamide. A subunit oligonucleotide containing the CUCU recognition sequence was incubated with wild-type L-19 IVSbeta RNA or alternatively with the 24C variant ribozyme. As shown in Fig. 17a, both ribozymes cleaved at the same site of the substrate. It has already been shown that the cleavage site is found immediately following the recognition sequence (Zaug et al., 11986) Nature (London) 324: 429). In the absence of urea, the cleavage rate is actually higher with the variant ribozyme than with the wild ribozyme, although the variant ribozyme can not form a fully annealed enzyme-substrate complex. As 58 1 1 10

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Bef: RjW/Quversity Patents-ENA. Rlbozyme se aumentou a concentração de ureia, a velocidade .de clivagem :om a ribozima da variante 24 C diminuiu continuamente, enquanto a velocidade de clivagem com a ribozima nativa se manteve aproximadamente constante para concentrações de ureia entre 0 e 2 Ί. Assim, quando a ureia apresenta uma concentrações de cerca- de 2 M, existe uma discriminação óptima entre os substractos que formavam complexos ribozima-substacto bem e mal emparelhados CFiguras 17 e 18).Bef: RjW / Quversity Patents-ENA. The concentration of urea was increased at the rate of cleavage: the ribozyme of the 24 C variant was continuously decreased, while the rate of cleavage with the native ribozyme remained approximately constant at urea concentrations between 0 and 2 Ί. Thus, when urea has a concentration of about 2 M, there is optimum discrimination between the substrates which formed well ribozyme-substrate complexes and mismatched CFigures 17 and 18).

Um substracto oligorribonucleõtido contendo uma sequência CSCU foi incubado com as duas ribozimas de forma semelhante à. descrita. Neste caso, esperava—se que a ribozima nativa originasse um complexo enzima-substracto mal emparelhado, enquanto a variante 24C se emparelharia perfeitamente ao substracto. Como se mostra na Fig. 17b, a velocidade de clivagem pela ribozima nativa diminuiu contínuamente com o aumento de concentração de ureia, enquanto a velocidade- de clivagem pela variante 24C aumentou e depois mantave-se constante até a ureia atingir a concentração de 3 M, a concentração mais alta que foi testada. Qbteve-se uma boa discriminação entre os substractos bem e mal emparelhados na extensa gama de concentrações de ureia entre 1.5 e 3 M.An oligoribonucleotide substrate containing a CSCU sequence was incubated with the two ribozymes in a similar fashion. described. In this case, the native ribozyme was expected to give rise to a poorly paired enzyme-substrate complex, while the 24C variant would perfectly match the substrate. As shown in Fig. 17b, the rate of cleavage by the native ribozyme decreased steadily with increasing urea concentration while the rate of cleavage by the 24C variant increased and then remained constant until the urea reached the concentration of 3 M , the highest concentration that was tested. There was good discrimination between well and poorly paired substrates in the wide range of urea concentrations between 1.5 and 3 M.

Um desnaturante do ARN diferente, a formamida, também afectou a especificidade da clivagem no substracto contendo CSCU. Como se mostra na Fig. 17c, a velocidade da clivagem pela ribozima selvagem diminui com o aumento de concentração de formamida, enquanto a velocidade de clivagem pela variante 24C aumenta a depois diminuí para concentrações de formamida 59 35 1 1 10 15A different RNA denaturant, formamide, also affected the specificity of cleavage in the substrate containing CSCU. As shown in Fig. 17c, the rate of cleavage by the wild-type ribozyme decreases with increasing formamide concentration, while the rate of cleavage by the 24C variant increases and then decreases to concentrations of formamide.

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S2.077S2.077

Bef: RJW/University Patents-RKA Ribozyme superiores a 5 Μ. A clivagem óptima pela variante 24C foi obtida entre 2 e 4 M. Assim, a dependência da velocidade de clivagem com a concentração de desnaturante è semelhante para os dois desnaturantes e no caso das duas enzimas, tendo a formamida 2.5 M o mesmo efeito que a ureia 1.5 M. Os efeitos relativos da ureia e da formamida são consistentes com a sua acção como desestabili— zantes de duplexes de ARN. Estudos utilizando ADN mostraram que a formamida 2.5 M ¢40¾ v/v) é aprox.' tão desestabi 1 izante como a ureia 2.1 M (Lerman et al. , ¢1384) Annu. Rev. Biophy. Bioeng. 13:333)5 espera-se que este efeito seja um pouco diferente para os duplexes ARN-ADN (.veja-se a discussão por Casey and Davidson (.1377) Nucleic Acíds. Res. Res. .4:1533). - Síntese da ribozima por transcri.ção direct-a. A L-19 IVSbeta ARN utilizada como ribozima nas experiências acima descritas foi feita por transcrição ín vitro do pré-ARN seguida por uma cascata de auto~reacç5es mediadas pela estrutura tridimensional nativa da IVS: o processamento, a ciclização da IVS cortada e a hidrólise dirigida na junção de ciclização (!Zaug et al., ¢1384) Science 224:574). A L-13 IVS ARN foi então purificada dos exPes ligados e de outros produtos das reacçPes, e a sua guanosina terminal 3' foi removida por oxidação com periodato e eliminação beta para dar a L-13 IVSbeta ARN. Para facilitar a síntese de grandes quantidades de ribozima, construíu-se um plasmideo &lt;Figura 13) de forma a que o produto inicial da transcrição fosse a própria ribozima act-iva, sem necessidade de mais auto-processamento. Um promotor do fago T7 foi justaposto ao ADN que codifica o nucleótido 22 da IVS, para 60 5 5 15Bef: RJW / University Patents-RKA Ribozyme greater than 5 Μ. Optimal cleavage by the 24C variant was obtained between 2 and 4 M. Thus, the dependence of the cleavage rate on the denaturant concentration is similar for the two denaturants and in the case of the two enzymes, the 2.5M formamide having the same effect as the urea 1.5 M. The relative effects of urea and formamide are consistent with their action as destabilizers of RNA duplexes. Studies using DNA showed that formamide 2.5 M ¢ 40¾ v / v) is approx. as destabilizing as urea 2.1 M (Lerman et al., ¢ 1384) Annu. Rev. Biophy. Bioeng. 13: 333) This effect is expected to be somewhat different for RNA-DNA duplexes (see discussion by Casey and Davidson (1377) Nucleic Acids Res. Res. 4: 1533). Synthesis of the ribozyme by direct-a transcription. L-19 IVSbeta RNA used as ribozyme in the above described experiments was done by in vitro transcription of the pre-RNA followed by a cascade of auto-reactions mediated by the native three-dimensional structure of the IVS: processing, cyclization of the cut IVS and hydrolysis directed at the cyclization junction (Zaug et al., 1384) Science 224: 574). The L-13 IVS RNA was then purified from the bound exPes and other reaction products, and its 3 'terminal guanosine was removed by periodate oxidation and beta deletion to give L-13 IVSbeta RNA. To facilitate the synthesis of large amounts of ribozyme, a plasmid <Figure 13> was constructed so that the initial transcription product was the actual ribozyme itself, without the need for further self-processing. A T7 phage promoter was juxtaposed to the DNA encoding the IVS nucleotide 22, to 60 5 5 15

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52.07752,077

Baf: BJW/Oniversity Patents-BNA Rtbozyms que a sequência GGAG6G do sitio activo englobasse os nucleótidos 1 a 6 do. transcrito.. A iruncagem do plasmideo com endonuclease de restrição Seal e a transcrição com ARN-polimerase pura do fago T7 CDavanloo et al, 1984 supra) dá origem à L-21 Seal ARN. A transcrição das cadeias-molde lineares de ADM pela ARN-pol imer ase de T7 produz frequentemente ARN com um ou mais nucleótidos adicionais no seu terminal 3, para além dos especificados pela càdeia-molde CLowary et al. , 1986? Millingan et al. 13S75. 0 terminal 3&quot; da L-19 IVS ARN foi analisada por marcação deste terminal com C32P3pCp e ARN-ligase, seguida por uma digestão completa com RNase de T2 e análise dos produtos nucleôsido fosfatados em 3' por cromatografia em camada fina. 0 marcador distribuiu-se da seguinte maneira: 47% C, 32% U, 9% Θ, 12% A. (considerando a cadeia-moIde, o último nucleôsido previsto deveria ser um U). Assim, embora a L-21 Seal ARN pareça ser homogénea quando é analisada por electroforese em gel de poliacrilamida a 4%, tem da facto um terminal 3&quot; heterogéneo. A L-21 Seal ARN difere da L-19 IVSbeta ARN por ter dois nucleótidos a menos no seu terminal 5' e aprox. 3-4 nucleótidos a menos no seu terminal 3&quot;. A actividade destas duas ribozimas é semelhante. Por exemplo, com um subst-racto GGCCCUCUA5 em condiçóes reaccionais Standard, a L-21 Seal ARN tem kcat/Km = 0.2' min-1 uM-l (tabela 3), comparável aos valores de kcat/Km (entre 0,05 e 0.16 min—1 uM—1) determinados para a L—19 IVSbeta ARN (Figura 4b, c de Zaug et al.(1386)). - Análise cinét-ica da c 1 ivagem de o 1 igorribonuc 1 eótidos na ausência de ureia. Mostrámos que. na ausência dê ureia, certos 61 35 52.077BJW / Oniversity Patents-BNA Rtbozyms that the GGAG6G sequence of the active site encompasses nucleotides 1 to 6 of the present invention. transcript. Iridation of the plasmid with restriction endonuclease Seal and transcription with pure RNA polymerase from the T7 phage CDavanloo et al., 1984 supra) gives rise to L-21 Seal RNA. Transcription of the linear ADM template strands by the T7 polynucleotide often produces RNA with one or more additional nucleotides at its 3-terminus, in addition to those specified by the template cell CLowary et al. , 1986? Millingan et al. 13S75. Terminal 3 &quot; of L-19 IVS RNA was analyzed by labeling this terminal with C32P3pCp and RNA ligase, followed by complete digestion with T2 RNase and analysis of the 3 'phosphate nucleoside products by thin layer chromatography. The label was distributed as follows: 47% C, 32% U, 9% Θ, 12% A. (considering the moiety, the last nucleoside predicted should be a U). Thus, although L-21 Seal RNA appears to be homogeneous when analyzed by 4% polyacrylamide gel electrophoresis, there is in fact a 3 &quot; heterogeneous. L-21 Seal RNA differs from L-19 IVSbeta RNA by having two minus nucleotides at its 5 'terminus and approx. 3-4 nucleotides less at its 3-terminus. &Quot; The activity of these two ribozymes is similar. For example, with a GGCCCUCUA5 substrate under standard reaction conditions, L-21 Seal RNA has kcat / Km = 0.2 'min-1uM-1 (table 3), comparable to kcat / Km values (0.05 and 0.16min-1uM-1) determined for L-19 IVSbeta RNA (Figure 4b, c of Zaug et al. (1386)). - kinetic analysis of the cryopreservation of oocorticoids in the absence of urea. We showed that. in the absence of urea, certain 61 35 52.077

Bef: RJW/University Patents-BNA Ribozyme substractos sofriam uma clivagem mais rápida por uma ribozima que forma um complexo enzima-substracto mal emparelhado, do que por uma ribozima com complementaridade perfeita com o substracto (Figura 17). Mostramos agora que se observa o mesmo comportamento na clivagem quando o mau emparalhamento é introduzido por 10 variação da sequência do substracto, enquanto a da ribozima se mantém c onstante.BNA Ribozyme substrates underwent faster cleavage by a ribozyme forming a mismatched enzyme-substrate complex, than by a ribozyme with perfect complementarity to the substrate (Figure 17). We now show that the same behavior is observed in the cleavage when the bad pairing is introduced by variation of the substrate sequence while that of the ribozyme remains constant.

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Preparámos uma série de substractos pTGGCCCNCU AS, em que p# indica o fosfato radioactivo marcado, e N = C, A, Θ e U, e incubámo-los com L-21 Seal ARN na presença de GTP 0.5 mM. Mos casos de M = A, Ge U, o único produto marcado foi um octanucleó-We prepared a series of substrates pTGGCCCNCU AS, where p # indicates the labeled radioactive phosphate, and N = C, A, Θ and U, and incubated with L-21 Seal RNA in the presence of 0.5 mM GTP. In cases of M = A, Ge U, the only labeled product was an octanucleotide.

tido, com o tamanho previsto supondo a clivagem no sitio indicado pela seta vertical. No caso de N * C, a clivagem inicial ocorreu no mesmo local? mais tarde durante a reacção, o octanucleótido sofreu nova clivagem, originando um heptanucleótido, o que indica a existência de clivagem secundária a seguir aos cinco resíduos C. □ valor do kcat da clivagem variava de um factor até 100 quando N era modificado: C &gt; A * G·&gt;&gt; U (tabela-3). Qs valores de Km apresentam muito menor variabilidade. 0 substracto emparelhado (N - U) , e outros substract-os contendo pirimidina (N = C) , tem valores de Km ligeiramente mais baixos que os dois substractos que se esperaria que formassem maus emparelhament-os purina-pufina com a ribozima. Também estudámos a série de substractos p$GGCuc 1MCU-AS, em que N = C, A, Q e U. Em todos os Casos a clivagem ocorreu predominantemente na posição indicada pela seta. Q kcat da clivagem variou de um factor até 50 quando N foi modificado? a ordem C &gt; A ~ G &gt; U é idêntica á obtida para a série pJfcGGCCCNCUAS (tabela 31. 0 Km variou segundo a ordem C &gt; A 62 2Z 'm iQÇih/with the expected size assuming cleavage at the site indicated by the vertical arrow. In the case of N * C, did the initial cleavage occur at the same site? later during the reaction, the octanucleotide undergoes a further cleavage, giving rise to a heptanucleotide, indicating secondary cleavage following the five C residues. The kcat value of the cleavage varied from a factor up to 100 when N was modified: C &gt; A * G &gt; &gt; U (table-3). The values of Km have much lower variability. The paired substrate (N-U), and other pyrimidine-containing sub-layers (N = C), have Km values slightly lower than the two substrates that would be expected to form poorly purine-pufin with the ribozyme. We also studied the series of substrates p $ GGCuc 1MCU-AS, where N = C, A, Q and U. In all Cases cleavage occurred predominantly at the position indicated by the arrow. Q kcat of the cleavage ranged from a factor up to 50 when N was modified? the order C &gt; A-G &gt; U is identical to that obtained for the series pJfcGGCCCNCUAS (table 31. 0 Km varied according to the order C &gt; A 62 2Z 'm iQÇih /

&lt;8.077&lt; 8,077

Bef: RJW/umversity Patents-RNS. Rlbozyme &gt; G &gt;&gt; U, semelhante à do kcat·, 10 15Bef: RJW / umversity Patents-RNS. Rlbozyme &gt; G &gt; &gt; U, similar to that of kcat ·, 10 15

Mod. 71 -10 000 ex. - 89/07 E útil comparar cada substracto que contém um C na posição -S (primeiras quatro linhas da tabela 33 com o substracto correspondente que contem um U na posição -5 (últimas quatro linhas da tabela 33. Q kcat para cada substracto GGCCCNCUA5 é sempre semelhante ao obtido para o correspondente substracto GGCUCNCUAS; a maioria das comparações mostram uma diferença de valores inferior a duas vezes, o que não é considerado significativo. Os Km para os dois substractos com N= U (um nuc leótido emparelhado na posição -33 não foram significativamente diferentes. Nos casos em que houve um nucleótido mal emparelhado na posição -3 C N = C, A ou G3, o Km foi significativamente mais baixo quando existia um C na posição —5 do que quando existia um U na posição -5. De acordo com o nosso modelo (Figura 13. um C na posição -5 origina a formação de um par de bases G-C com a ribozima , enquanto um U formaria um par de bases G-U vacilante. ..... — Análise cinética da clivagem na· presença- de ureia.· 0 25 efeito da ureia na clivagem foi estudado com algum detalhe usando p$GGCCCGCUA5, um substracto cuja clivagem pela ribozima selvagem se previa ser fortemente inibida a concentrações de ureia mais elevadas (Figura 17b) . Corão se mostra na Figura 20 e na tabela 4, 30 a presença de ureia em concentrações baixas aumentava ligeiramente a clivagem pelo L-21 Seal ARN, enquanto a ureia 2.0 e 2.S M inibia a clivagem, como o previsto. Qs efeitos foram devidos na sua quase totalidade a variações no kcat, mantendo-se o Km 35 constante com o valor de 0.5 +/- 0.2 uM. Este não é o resultado esperado se se considerar que o Km representa simplesmente a 53 1 é2.077 I ef: RJW/Otaiversity Pateots-RNA RibozymeMod. 71 -10 000 ex. - 89/07 It is useful to compare each substrate containing a C in the -S position (first four lines of table 33 with the corresponding substrate containing a U in position -5 (last four lines of table 33.) k kcat for each substrate GGCCCNCUA5 is similar to that obtained for the corresponding substrate GGCUCNCUAS, most of the comparisons show a difference of values less than two times, which is not considered significant.KM for the two substrates with N = U (one nucleotide coupled in the - 33 were not significantly different.In cases where there was a mismatched nucleotide at position -3 CN = C, A or G3, Km was significantly lower when there was a C at position -5 than when there was a U at the - 5. According to our model (Figure 13) a C at position -5 gives rise to the formation of a GC base pair with the ribozyme, while a U would form a hesitant GU base pair ..... - Kinetic analysis gives urea-cleavage. The effect of urea on cleavage was studied in some detail using pGGCCCGCUA5, a substrate whose cleavage by the wild-type ribozyme was predicted to be strongly inhibited at higher urea concentrations (Figure 17b). Koran is shown in Figure 20 and in table 4, 30 the presence of urea at low concentrations slightly increased cleavage by L-21 Seal RNA, while urea 2.0 and 2.S M inhibited cleavage as predicted. The effects were due almost entirely to variations in kcat, keeping Km 35 constant with a value of 0.5 +/- 0.2 uM. This is not the expected result if we consider that Km represents simply 53 1 and 2 0 0 I I: RJW / Otaiversity Pateots-RNA Ribozyme

L aumentasse o valor de Km.L increase the value of Km.

Determinou-se o efeito da ureia nas velocidades iniciais comThe effect of urea at the initial velocities with

:iara que as velocidades medidas se aproximassem de Vmax. CA concentração de substracto foi inferior a Km' para dois substracto, GGCUCíCG) CUA;. (os nucleót-idos ent-re parêntesis: the measured speeds would approach Vmax. The substrate concentration was less than Km 'for two substrate, GGCUCCG) CUA ;. (nucleotides given in parentheses

Mod. 71 -10000 βχ. - 89/07 15 correspondem a substrâctos alternativos) pelo que as velocidades de clivagem para estes substrâctos subestimam o Vmax.3 Os substrâctos podem ser divididos em três grupos, com base na resposta da respectiva. velocidade de clivagem à presença de 20 ureia. Os substrâctos SGCUCCC6)CUAg (mal emparelhados na posição-3 e com emparelhamento de bases vacilante na posição -5) apresentam um aumento na velocidade de clivagem a concentrações baixas de ureia, seguido por uma diminuição quando a ureia está a 25 1 M. Os substrâctos CGGCCCCGOCU^ (emparelhados na posição -3 e emparelhados com ligações G-U ou G-C na posição -5) apresentam um aumento na velocidade de clivagem com o aumento da concentração de ureia em toda a gama de valores testada. □ mais bem emparelhado destes dois substracto, G6CCCCUCUA5, apresentou poucaMod. 71 -10000 βχ. - 89/07 15 correspond to alternative substrites) whereby the cleavage rates for these substrings underestimate the Vmax.3 Substrates can be divided into three groups, based on their response. rate of cleavage to the presence of urea. Substitutes SGCUCCC6) CUAg (mismatched at position-3 and with base pairing faltering at position -5) show an increase in the rate of cleavage at low concentrations of urea, followed by a decrease when the urea is at 25 ± 1 M. (annealed at position -3 and annealed with GU or GC bonds at the -5-position) exhibit an increase in the cleavage rate with increasing concentration of urea over the entire range of values tested. The better pairing of these two substrates, G6CCCCUCUA5, showed little

wU alteração na velocidade de clivagem a concentrações de ureia compreendidas entre 0 e 1.5 Μ, o que é consistente com os resultados préviamente obtidos com o mesmo substracto e a ribozima L-19 IVSbeta (Figura .18, círculos a cheio). S4 35 1 1wU change in the rate of cleavage at urea concentrations between 0 and 1.5 Μ, consistent with the results previously obtained with the same substrate and the L-19 IVSbeta ribozyme (Figure 18, solid circles). S4 35 1 1

5 155 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 52.077Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 52,077

Sef: RJW/University Patents-SNA Rzbozyme - Clivagem em excesso de ribozima. Para testar se o aumento de velocidade do subst-racto _ mal emparelhado persistia em condições em que. se dava um único ciclo catalítico, GGCCCGCUA5 e GGCCCUCUAg Í0.05 uM) foram tratados com L-21 Seal ARN 20 vezes em excesso Cl.00 uil), na ausência de ureia. A clivagem do subst-racto mal emparelhado foi mais rápida que a clivagem do subst-racto bem emparelhado. Apesar da clivagem do substracto mal emparelhado ocorrer demasiado depressa pára ser obtida uma velocidade fiável, essa velocidade foi pelo menos 8 vezes maior que a determinada para o substracto emparelhado. A partir dos valores de kcai e Km apresentados na tabela 3, previa—se uma diferença de velocidades da ordem das 23 vezes , usando a equação V0 - kcat CE03 í801/ (Km + CE03) para a reaeção em excesso de enzima. Assim, os resultados desta experiência não forneceram indicação dê um passo limit-ante da velocidade anteriormente não datectado. Contudo, os resultados não permitem pôr de parte s possibilidade de alguma da diferença de velocidades verificada com os substractos bem e mal emparelhados ser devida a diferentes velocidades de libertação dos produtos.Sef: RJW / University Patents-SNA Rzbozyme - Excess cleavage of ribozyme. To test whether the speed increase of the mismatched substracter persisted under conditions where. a single catalytic cycle was given, GGCCCGCUA5 and GGCCCUCUAg (0.05æM) were treated with L-21 Seal RNA 20-fold in excess Cl.00 uil) in the absence of urea. Cleavage of the mismatched substrate was faster than cleavage of the well-matched substrate. Although cleavage of the mismatched substrate occurs too quickly to obtain a reliable speed, that speed was at least 8 times greater than that determined for the paired substrate. From the values of kcai and Km presented in table 3, a velocity difference of the order of 23 times was anticipated, using the equation V0 - kcat CE03 í801 / (Km + CE03) for the excess enzyme reaction. Thus, the results of this experiment did not provide an indication of a limit-ante step of the previously unrecorded velocity. However, the results do not allow to depart from the possibility that some of the difference in velocities observed with the well and poorly coupled substrates is due to different product release rates.

- Clivagem em função da concentração de iões divalentes. A ureia e a formamida, ambas desestabi1iZadoras dos duplexes de ARN. permitem á ribozima discriminar negativamente os substractos 30 mal emparelhados. Para testar a generalidade desta correlação, examinamos a clivagem de um substracto emparelhado CGGCCCUCUA5), e de um mal emparelhado CGGCCCGCUAg), pela L-21 Seal ARN, em função de concentrações decrescentes de Mg2+. As experiências 35 foram efectuadas na presença de ureia. A velocidade inicial da 65 1 1- Cleavage as a function of the concentration of divalent ions. Urea and formamide, both destabilizing the RNA duplexes. allow the ribozyme to discriminate negatively the mismatched substrates. To test the generality of this correlation, we examined the cleavage of a matched substrate CGGCCCUCUA5), and a mismatched CGGCCCGCUAg), by L-21 Seal RNA, as a function of decreasing concentrations of Mg 2+. Experiments were carried out in the presence of urea. The initial velocity of 65 1 1

52.07752,077

Bef: RJW/University Patents-RKA Ribozyma clivagem do substracto mal emparelhado excedeu a do substracto emparelhado a concentrações de MgClZ entre 10 mM e 5 mM, mas a especificidade foi invertida a ligC12 1 mM. Outro conjunto de reacções foi efectuado na presença de CaC12 lmM, que diminui a necessidade em ião magnésio. Neste caso. a velocidade inicial de 10 clivagem d 3 substracto mal emparelhado excedeu a do substracto emparelhado a concentrações de iigC12 entre lOmM e 5 mM, e a especificid ade foi invertida a MgC12 2 mM e 1 mM. Assim, o abaixamento da concentração de iões c ii vai entes, que é outraThe cleavage of the mismatched substrate exceeded that of the annealed substrate at concentrations of MgCl 2 between 10 mM and 5 mM, but the specificity was reversed at 1 mM ligand. Another set of reactions was carried out in the presence of 1 mM CaCl2, which reduced the need for magnesium ion. In this case. the initial mismatched substrate cleavage rate exceeded that of the annealed substrate at concentrations of IC50 of 10 mM to 5 mM, and the specificity was reversed at 2 mM MgCl2 and 1 mM. Thus, the lowering of the concentration of ions and ions goes, which is another

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 maneira de desestabilizar os duplexes de ARN, também permite à ribozima discriminar negativamente os substractos mal emparelha dos .Mod. 71-10000 ex. It is also possible for the ribozyme to discriminate negatively the mismatched substrates.

Focámos inicialmente a importância do emparelhamento das bases entre a ribozima e o seu substracto tanto para a especificidade em relação ao substracto, como para a catálise CZaug &amp; Cech, C1986) Science 231:470 and Bipchemistry 28:4478; Been &amp; Cech, Cell 1986; Zaug et al., Nature 1986). A actual descoberta de' que um mau emparelhamento'rto complexo ribozima-substracto pode de facto aumentar a velocidade de clivagem até 100 vezes, parece, à primeira vista, contradizer a importância do emparelhamento de bases entra a ribozima e o substracto. E portanto útil fazer uma revisão da evidência que inicialmente nos levou a propòr o modelo de emparelhamento das bases indicado na Figura 1. Em primeiro lugar, há uma semelhança clara entre os mecanismos da clivagem cataiizada pela ribozima e do auto-processamento do ARN. No caso do auto-processamento, o emparelhamento das bases entre a sequência CUCUGU no terminal 3&quot; do exão 5' e o sitio activo GGAGGG do exão 5&quot;, encontra-se provado por análise comparativa de 66 35 1 1We initially focused on the importance of base pairing between the ribozyme and its substrate for both substrate specificity and CZaug &amp; Cech, C1986) Science 231: 470 and Biphemistry 28: 4478; Been &amp; Cech, Cell 1986; Zaug et al., Nature 1986). The current finding that poor annealing of the ribozyme substrate complex can in fact increase the cleavage rate by up to 100 fold appears at first to contradict the importance of base pairing between the ribozyme and the substrate. It is therefore useful to review the evidence that initially led us to propose the base pairing model shown in Figure 1. First, there is a clear similarity between the mechanisms of ribozyte-cleaved cleavage and RNA self-processing. In the case of self-processing, base pairing between the CUCUGU sequence at the 3 &quot; of the 5 'exon and the active site GGAGGG of exon 5', is proved by comparative analysis of 66 351 1

52.07752,077

Ref: RJW/Ohiversity Patents-RNA RibozyroeRef: RJW / Ohiversity Patents-RNA Ribozyroe

sequências CQavies et- al. , Nature 300:719 1982; Mie.hei h Dujon, 5 EMBO J. 2:33-38 (1983)), e por análise de mutações numa base única e de mutações em supressores secundários CWaring et al. , Nature 321:133 (1986); Been &amp; Cech, Cell 1986). Em segundo lugar, a clivagem ribozimica de grandes moléculas de ARN ocorre apenas 10 em sequências int.imamente relacionadas com CUCUCU—N, dando-se a clivagem na posição indicada pela set-a. Por exemplo, um pré-ARN 15sequences CQavies et al. , Nature 300: 719 1982; Mie.hei h Dujon, 5 EMBO J. 2: 33-38 (1983)), and by analysis of mutations on a single basis and mutations in secondary suppressors CWaring et al. , Nature 321: 133 (1986); Been &amp; Cech, Cell 1986). Second, the ribozyme cleavage of large RNA molecules occurs only in sequences closely related to CUCUCU-N, giving the cleavage at the position indicated by set-a. For example, a pre-RNA 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 25 com 504 nucleótidos da beta-globina do rato sofre clivagem pela L—13 IVSbeta ARN em dois locais principais, cada um deles precedido por CUCU, e um transcrito com 841 nucleótidos do p8R322 sofre clivagem em quatro locais principais, dois deles precedidos por CUCU, um por CCUU, e um por UUUU (2aug et al., Nature, 1386). Finalmente, as mutações efectuadas no sitio activo alteram a especificidade em relação ao substracto de uma forma prevista pelas regras de emparelhamento de bases de Watson-Crick quando as reâcções se dão na presença de ureia CSaug et al. Nature, 1386). Temos portanto que modificar o modelo do emparelhamento das bases proposto para o mecanismo da clivagem de oligorribonucleótidos, e vamos fazé-lo da seguinte maneira: a formação de um duplex com emparelhamento de bases entre a ribozima e o seu substracto é necessária para haver reacção, mas um complexo mal emparelhado pode reagir melhor que um duplex perfeito.Mod. 71 -10000 ex. With 504 nucleotides of rat beta globin is cleaved by L-13 IVSbeta RNA at two major sites, each preceded by CUCU, and a transcript with 841 nucleotides of p8R322 cleaves at four major sites, two of which were preceded by CUCU, one by CCUU, and one by UUUU (2aug et al., Nature, 1386). Finally, the mutations carried out in the active site alter the specificity in relation to the substrate in a manner predicted by the Watson-Crick base pairing rules when the reactions occur in the presence of urea CSaug et al. Nature, 1386). We must therefore modify the template of the base pairing proposed for the oligoribonucleotide cleavage mechanism, and we will do so in the following way: formation of a base pairing duplex between the ribozyme and its substrate is required for reaction, but a poorly paired complex may react better than a perfect duplex.

Para facilitar a discussão dos dados, considere-se o seguinte esquema de reacção simples: 67 35 I [ 62.077 Ί íaf: HJW/University Patents-Bta. Rib02^ne 5To facilitate the discussion of the data, consider the following simple reaction scheme: I [62.077 Ί f:: HJW / University Patents-Bta. Rib02nne 5

E + SE + S

Íh.*7Ih. * 7

E + P 10E + P 10

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 em que E é a ribozima, S é o substracto oligorribonucleôtido, e o produto P inclui tanto a metade 5&quot; comõ a metade guanidilo 3' do substracto cortado ¢0 substracto guanosina encontra-se presente em grande excesso? a sua ligação não é apresentada explicitamen-te). Se Km = ktí^/k 1, a constante de dissociação de E—S, então as mudanças do substracto na posição -3 em relação ao local de clivagem que resultem num complexo enzima-substracto mal emparelhado deveriam aumentar o Km. A tendência esperada é observada nas linhas 5 - S da tabela 3. 0 substracto que se previa que formasse o complexo ribozima-substracto roais estável (·· g° ss -7.8 Kc a 1/roo 1) tem o menor valor de Km, e os três substractos com ligação roais fraca (-3.6 Kcal/mol) têm valores de Km considerávelmente superiores. Contudo, do ponto de vista quantitativo, a variação de Km é muito menor que a que seMod. 71 -10000 ex. Wherein E is the ribozyme, S is the oligoribonucleotide substrate, and the product P includes both the moiety 5 &quot; like the guanidyl moiety 3 'of the cut substrate, is the guanosine substrate present in large excess? your connection is not explicitly displayed). If Km = kt \ / k 1, the dissociation constant of E-S, then the changes of the substrate at the -3-position relative to the cleavage site that result in a poorly paired enzyme-substrate complex should increase Km. is observed in lines 5-S of table 3. The substrate which was expected to form the stable ribozyme-substrate complex (ε -7.8 Kc to 1 / roo 1) has the lowest value of Km, and the three poorly bonded substrates (-3.6 Kcal / mol) have considerably higher Km values. However, from a quantitative point of view, the variation of Km is much lower than

O esperava dadas as diferenças de 4 S 5 o efeito de um mau emparelhamento parece ser amortecido por outras interações entre ribozima e substracto Ccf. Sugimoto et al. Biochemistry, 27:6384., C1988)). Além disso, no caso dos substractos das linhas 1-4 da tabela 3, o Km não é significativamente afectado por maus empare1hamentos. 68 1 5 10 15 IVIod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30We expected it given the differences of 4 S 5 the effect of a bad pairing seems to be dampened by other interactions between ribozyme and substrate Ccf. Sugimoto et al. Biochemistry, 27: 6384., (1988)). In addition, in the case of the substrates of lines 1-4 of Table 3, Km is not significantly affected by poor pairings. 68 1 5 10 15 IVIod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30

Ê2.077lef: BJW/University Patents-HNA RibozymeÊ2.077lef: BJW / University Patents-HNA Ribozyme

- Modelos para o efeito de maus emparelhamentos na velocidade de c1ivagem. Durante a realização das experiências aqui descritas, consideraram-se três modelos para explicar os maiores valores de fccat determinados para os substractos mal emparelhados. Efectuaram—se alguns testes para avaliar os modelos.- Models for the effect of bad pairings on speed of collection. During the experiments described herein, three models were considered to explain the highest fccat values determined for the mismatched substrates. Some tests were performed to evaluate the models.

Cl) Ligação não produtiva. Prever-se-ia que os substractos contendo CUCU tivessem maior número de possibilidades de ligação não produtiva ao centro activo rico em G, que os substractos contendo CGCU ou CACU5 isto poderia explicar a redução de kcat no primeiro caso. Este modelo foi testado sintetizando os dois substractos contendo CGCU, que se esperaria terem pelo menos o mesmo número de possibilidades de de ligação não produtiva que CUCU. 0 elevado valor de kcat dos substractos contendo CCCU (tabela 3) op3e-se ao que se esperaria se houvesse ligaç3es não produtivas. Além disso, a ligação não produtiva pode diminuir o kcat , e o Km,, mas. não a razão kcat/Km CFersht, Enzyme Structure and Mechanism 2nd Ed. Freeman, New York, 1995). Se os valores de kcat para os substractos contendo CUCU fossem 10 a 100 vezes menores devido a ligação não produtiva, então os seus Kms na ausência dê ligação não produtiva deveriam ser 10 a 100 vezes maiores que os Kms medidos. Isto parece muito pouco provável, porque os substractos que contém CUCU são os que se emparelhari melhor com o centro activo. Continua a ser bastante provável que alguns dos valores de Km sejam diminuídos devido a ligação nãc produtiva. Por exemplo, o troço C5 do substraeto GQCCCCCUA5 pode ter múltiplas possibilidades de ligação não produtiva ao centre activo rico em G da ribozima. 69Cl) Non-productive binding. It would be expected that the CUCU-containing substrates would have more possibilities of non-productive binding to the G-rich active center than the substrates containing CGCU or CACU5, this could explain the reduction of kcat in the former case. This model was tested by synthesizing the two substrates containing CGCU, which would be expected to have at least the same number of non-productive binding possibilities as CUCU. The high kcat value of the CCCU-containing substrates (Table 3) is the same as expected if there were non-productive bonds. In addition, non-productive binding can decrease kcat, and Km, but. not the kcat / km ratio CFersht, Enzyme Structure and Mechanism 2nd Ed. Freeman, New York, 1995). If the kcat values for the CUCU-containing substrates were 10 to 100 fold lower because of non-productive binding, then their Kms in the absence of unproductive binding should be 10 to 100 times greater than the measured Kms. This seems very unlikely, because the substrates containing CUCU are the ones that best match the active center. It remains quite likely that some of the Km values will be decreased due to non-productive binding. For example, the C5 portion of the substrate GQCCCCCUA5 may have multiple possibilities of non-productive binding to the G-rich active center of the ribozyme. 69

I 62.077 Ref: RJW/University Patents-Bt®. Ribozyme (2) Libertação do produto como passo limitante velocidade. Se a libertação do produto for o passo limitante da da velocidade, o kcat poderia ser a constante de velocidade da dissociação do complexo r ibozima-produto &lt;.k3'), em vez deI 62,077 Ref: RJW / University Patents-Bt®. Ribozyme (2) Product release as step speed limiting. If release of the product is the rate-limiting step, kcat could be the rate constant of the dissociation of the β2-product complex &lt; .k3 ') instead of

L 10 15L 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 representar a constante de velocidade do passo químico (.k2&gt; Os substractos mal emparelhados formariam complexos ribozima--produto também mal emparelhados, aumentando assim o kcat. Este modelo foi testado efectuando a clivagem em excesso de ribozima; não se esperaria que a libertação do produto contribuísse para o kcat em condiçbes às quais cada molécula de ribozima participa num único ciclo de catálise. A observação continuada de clivagem mais rápida nos casos de substracto mal emparelhado não sustenta este modelo. (3) □ mau emparelhamento desestabi1iza o E-S. De acordo com a teoria do estado de transição, os maus emparelhamentos poderiam fazer aumentar o kcat desestabilisando o estado fundamental do E-S sem desestabilizar o estado de transição (E-S++) no passo limitante da velocidade (Fersh, 1985). Esta desestabilização deixaria a razão kcat/Km invariávelde acordo com os dados nas linhas 4-8 da tabela 3. Se um mau emparelhamento estabilizasse também o CE-S++), a razão kçat/Km aumentaria, como se observa nas linhas 1-3 da tabela 3. Q aumento na clivagem dos substractos emparelhados originada por desnaturantes como a ureia e a formamida poderia ser explicado se estes desestabilizassem também o E-S. A inibição da clivagem pelos desnaturantes nos substractos mal emparelhados poderia ser explicada se a desestabilização do estado de transição ÍE-8++) se tornasse dominante. 70 35Mod. 71 -10000 ex. The mismatched substrates would form poorly annealed ribozyme-product complexes, thus increasing kcat. This model was tested for excess cleavage of ribozyme; the release of the product would not be expected to contribute to kcat under conditions to which each ribozyme molecule participates in a single catalysis cycle The continued observation of faster cleavage in cases of poorly paired substrate does not support this model. pairing could destabilize the ES state without destabilizing the transition state (E-S ++) in the rate-limiting step (Fersh, 1985) .This destabilization would leave the ratio kcat / Km invariant according to the data in lines 4-8 of table 3. If a bad pairing stabilizes also the CE-S ++), the ratio kçat / Km would increase, as observed in lines 1-3 of Table 3. The increase in the cleavage of the matched substrates caused by denaturants such as urea and formamide could be explained if they also destabilized or ES. Inhibition of cleavage by denaturants on mismatched substrates could be explained if destabilization of the transition state (E-8 ++) became dominant. 70 35

5 15 ©*077 Bef r RJW/Oftiversity Patents-RNR Riiozyme5 15 0 * 077 Bef r RJW / Oftiversity Patents-RNR Riiozyme

Mod. 71-10000 èx. - S9/07 20 25 30Mod. 71-10000 èx. - S9 / 07 20 25 30

Como é que os maus empareihamentos podem desestabilizar o E--S e ter um efeito diferente no E-S++ ? Os nucleótidos que precedem o fosfato reactivo poderiam estar ligados à ribozima no estado E-S++ de uma forma diferente da que estão no complexo E-8.. Uma possibilidade extrema é a de que o substracto possa torna-se dèsemparelhado da sequência complementar no E-S++. Note-se que a E-3++ é o estado de transição para o passo limitante da velocidade; os dados não podem distinguir entre um passe limitante de natureza química e um passo limitante da velocidade envolvendo alterações conformacionais no E-8 antes do passe químico. Propomos que a clivagem óptima exige um grau apurado de estabilidade no complexo ribozima-substracto. Esta ideia é I atraente porque explica os dados obtidos para a clivagem ne ausência e na presença de ureia. De acordo com o modelo, oí substractos que se ligam mais fortemente &lt;6SCCU)CUCUAs, Δδ® -10.9 e -7..Ô Kcal/mol) apresentam .as menores, .constantes. . dí; velocidade nâ ausência de ureia; a adição de ureia desestabi1izí. as suas ligações e aumenta as suas velocidades de reação CFigurii 21 e tabela 35. A classe de substractos seguinte CGGCCCCCCG)CUA.ç 46° * ' -6.7 Kcal/mol) ligam-se com uma estabilidade ligeiramente! menor que a óptima; a adição de ureia 1 M origina uma velocidade; de reacção máxima, enquanto subsequente adição de ureia diminui a velocidade porque E—S++ é desestabilizado. A última classe da substractos CGGCUCGCCGlíCUAg, ΔθΡ -3.6 Kcal/mol) liga-sis demasiado mal para originar uma velocidade de reacção óptima pelo que a desestabilização adicional provocada pela adição d&gt;i ureia faz baixar ainda mais a velocidade da reacção. Poderá se’ 71 1 10 15How can bad pairing destabilize E - S and have a different effect on E - S ++? The nucleotides preceding the reactive phosphate could be attached to the ribozyme in the E-S ++ state in a different way from that in the E-8 complex. An extreme possibility is that the substrate may become paired with the complementary sequence in E -S ++. Note that E-3 ++ is the transition state for the rate-limiting step; the data can not distinguish between a chemical-limiting pass and a rate-limiting step involving conformational changes in E-8 before the chemical pass. We propose that optimal cleavage requires an accurate degree of stability in the ribozyme-substrate complex. This idea is attractive because it explains the data obtained for cleavage and absence and in the presence of urea. According to the model, substrates which bind more strongly &lt; 6SCCU) CUCUAs, Δδ--10.9 and -7 ... Kcal / mol) exhibit minor, constant. . day velocity in the absence of urea; the addition of destabilizing urea. their bonds and their reaction rates are increased CFiguri 21 and table 35. The following class of substrates CGGCCCCCCG) CUA 46 468 Kcal / mol) bind with a slightly stable stability. less than optimal; the addition of 1 M urea gives a rate; of the maximum reaction, while subsequent addition of urea slows down because E-S ++ is destabilized. The last class of the substrates CGGCUCGCCGlCUAg, Δθ -3.6 Kcal / mol) bind too poorly to give an optimum reaction rate whereby further destabilization caused by the addition of urea further depresses the reaction rate. 71 1 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 ©.077 Bef: RJW/Oniversity Patenfcs-BNA RLbozymeMod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 © .077 Bef: RJW / Oniversity Patenfcs-BNA RLbozyme

informativo' verificar se maus emparelhamentos na posição —4 afectam as velocidades de clivagem como é previsto pelo modelo. - Implicações para o auto-processamento. Na reacção de auto- processamento, a adição de guanosina dá-se no local indicado pela seta da sequência CUCUCU-A3. As mudanças de uma única base nas posiçbes -1, -2, -3 e --4 relativamente ao local de clivagem, originam todas um abaixamento da velocidade de processamento (Been et al., Cold Spring Harbor SYmp. Quant. Biol. 52:147-157 (1987)). Em especial, o pré-ARN contendo CUCUCU é muito mais reactivo ao auto-processamento que o pré-ARN contendo CUC6CU (Been &amp; Cech, Cell (1986)). Na clivagem catalítica de oligorriboniji cleótidos pela L-21, Seal ARN, a especificidade é invertida, sendo um substracto contendo CUCSCU muito mais reactivo que um contendo CUCUCU íexcepto em ureia 1 M). 0 sistema enzimático tolera melhor algum mau emparelhamento no complexo substracto-centro I* acti.vo, que o., sistema de auto-processamento. E possível, que algumas das sequências dos exbes ou dos intrSes removidas quando o pré-ARN auto-processado se converte na L-21 Seal ARN aumentem a selectividade em relação ao local de processamento. - Utilização de ribozimas para clivagem em sequências especificas do ARN. 0 actual trabalho tem consequências na utilização das ribozimas como instrumentos para a clivagem em sequências especificas do ARN. Notamos a importância dos nucleótidos -5 e -6 em relação ao local de clivagem. E agora claro que a substituição de um C por um U na posição -5 tem um efeito mínimo no kcat, mas pode ter um efeito muito grande no Km da reacção de clivagem (tabela 3). Em segundo lugar, e com um 72 35 * S2.077Eef: RJW/tTniversity Patents-RKA RLbozyneinformative 'check if bad pairings at position -4 affect the cleavage rates as predicted by the model. - Implications for self-processing. In the self-processing reaction, the addition of guanosine occurs at the location indicated by the arrow of the CUCUCU-A3 sequence. Single base changes at positions -1, -2, -3, and -4 with respect to the cleavage site all result in a decrease in processing speed (Been et al., Cold Spring Harbor SYmp. Quant. Biol. 52 : 147-157 (1987)). In particular, the pre-RNA containing CUCUCU is much more reactive to self-processing than the pre-RNA containing CUC6CU (Been & Cech, Cell (1986)). In the catalytic cleavage of oligoribonotypes by L-21, Seal RNA, the specificity is reversed, a substrate containing CUCSCU being much more reactive than one containing CUCUCU except in 1 M urea). The enzyme system better tolerates some poor pairing in the substrate-center complex I *, which is the self-processing system. It is possible that some of the sequences of exons or introns removed when the pre-RNA self-processed converts to the L-21 Seal RNA increase the selectivity relative to the processing site. Use of ribozymes for cleavage in specific RNA sequences. The present work has implications for the use of ribozymes as tools for cleavage in specific RNA sequences. We noted the importance of nucleotides -5 and -6 relative to the cleavage site. It is now clear that substituting a C for a U at position -5 has a minimal kcat effect, but may have a very large effect on the Km of the cleavage reaction (Table 3). Second, and with a 72 35 * S2.077Eff: RJW / tTiversity Patents-RKA RLbozyne

Mod. 71-10000 ex·. -89/07Mod. 71-10000 ex ·. -89/07

5 10 15 20 255 10 15 20 25

aspecto muito mais fundamental, certas sequências mal emparelhadas sofrem clivagem eficiente mesmo na presença de ureia. 0 caso mais dramático diz respeito ao GGCCCCCU-A5; apesar da sua clivagem ser fortemente inibida pela ureia, é um substracto tão bom que continua a sofrer clivagem mais rápidamente que as sequências GGC(CU)CUCU-A5 em ureia 2-2.5 M. Verificou-se que uma sequência mal emparelhada semelhante CCUCU-) era .o principal local da clivagem pela L-21 Seal ARN do transcrito SV40 com 602 nucleótidos. Parece provável que a discriminação contra os substractos mal emparelhados possa ser melhorada aumentando a concentração de ureia para 3M ou diminuindo a concentração do ião magnésio para 2 mM. Contudo, a não ser que as condições reaccionais sejam bem especificadas, a clivagem de moléculas- de ARN com ribozima irá ocorrer geralmente numa família de locais que inclui a sequência que se emparelha com o sítio activo da ribozima, bem como as sequências relacionadas que contenham um ou dois nucleótidos mal emparelhados. Este texto engloba, como referência, o trabalho descrito em Zaug, Arthur J., et al. Bioehemistry (1988) 27:8924much more fundamentally, certain mismatched sequences undergo efficient cleavage even in the presence of urea. The most dramatic case concerns GGCCCCCU-A5; although its cleavage is strongly inhibited by urea, is such a good substrate that it continues to undergo cleavage more rapidly than the CUCU-A5 GGC (CU) sequences in 2-2.5 M urea. It has been found that a mismatched sequence similar to CCUCU- ) was the major site of cleavage by the L-21 Seal RNA of the 602 nucleotide SV40 transcript. It seems likely that discrimination against mismatched substrates can be improved by increasing the concentration of urea to 3M or decreasing the concentration of the magnesium ion to 2mM. However, unless the reaction conditions are well specified, the cleavage of ribozyme RNA molecules will generally occur in a family of sites which includes the sequence that matches the active site of the ribozyme, as well as related sequences containing one or two mismatched nucleotides. This text includes, as a reference, the work described in Zaug, Arthur J., et al. Bioehemistry (1988) 27: 8924

Exemplo VIII 30 0 sitio activo do pBGST7 sofreu mutagéneses (veja-se o exemplo XV abaixo indicado), de forma a produzir novas ribozimas com a especificidade alterada. Seis destas ribozimas foram sintetizadas e caracterizadas. 73 35Example VIII The active site of pBGST7 underwent mutagenesis (see example XV below) in order to produce novel ribozymes with altered specificity. Six of these ribozymes were synthesized and characterized. 73 35

62*077Bef: R3W/0niversity Patents-KRA Ribozyme62 * 077Bef: R3W / 0niversity Patents-KRA Ribozyme

Estes mutantes podem ser produzidos a partir do plasmideo 5 que produz as ribozimas selvagens L-19 e L-21, onde os sítios activos sofrem mutagénese como é apresentado na tabela 5. A sequência-guia interna da IVS pode ser submetida a mutagénese de forma a construir estas variantes CBeen &amp; Cech, 10 (1986) Cell 47:207-216). 0 ARN pode ser transcrito e preparado utilizando processos semelhantes aos descritos para a ribozimaThese mutants can be produced from plasmid 5 producing the wild-type ribozymes L-19 and L-21, where the active sites undergo mutagenesis as shown in table 5. The internal guiding sequence of the IVS can be mutagenically shaped to construct these CBeen &amp; Cech, 10 (1986) Cell 47: 207-216). The RNA can be transcribed and prepared using procedures similar to those described for the ribozyme

Mod. 71-10000 éx. ' 89/07 20 30 selvagem. Cada uma das seis novas ribozimas reconhece e efectua clivagem nas novas sequências dos substractos, de acordo com as regras estabelecidas no nosso trabalho anterior CZaug, Been &amp; Cech, Nature, 1986). As condições para a reactividade de algumas destas ribozimas variam em relação às condições usadas com a ribozima selvagem. Enquanto a ribozima selvagem tem uma concentração óptima de Mg++ de cerca de 2 mM, várias das nossas ribozimas variantes são mais reactivas a concentrações superiores de Mg++ (até 100 mil). A listagem das ribozimas selvagens e novas é apresentada na tabela 5. Utilizámos ureia 2.·5 M para aumentar a fidelidade da selecção do local de clivagem pela ribozima selvagem. Esta condição é adequada para algumas, mas não para todas as nossas variantes. As reactividades das ribozimas TTA e TTC diminuem substancialmente com o aumento da concentração de ureia. Verificou-se que a utilização de sais como o acetato de amónioMod. 71-10000 ex. '89/07 20 30 wild. Each of the six novel ribozymes recognizes and cleaves the new sequences of substrates, according to the rules established in our previous work CZaug, Been &amp; Cech, Nature, 1986). The conditions for the reactivity of some of these ribozymes vary from the conditions used with the wild ribozyme. While the wild-type ribozyme has an optimum concentration of Mg ++ of about 2 mM, several of our variant ribozymes are more reactive at higher concentrations of Mg ++ (up to 100,000). The listing of wild and new ribozymes is shown in table 5. We used 2. 5 M urea to increase the fidelity of the selection of the cleavage site by the wild-type ribozyme. This condition is suitable for some, but not for all of our variants. The reactivities of TTA and TTC ribozymes decrease substantially with increasing urea concentration. It has been found that the use of salts such as ammonium acetate

CNH4Ac) em altas concentrações aumenta a fidelidade nesses casos. Outros sais, incluindo NH4C1, LiCl, CaC12 e espermidina podem substituir o NH4Ac. 74 10 15CNH4Ac) in high concentrations increases the fidelity in these cases. Other salts, including NH 4 Cl, LiCl, CaCl 2 and spermidine may replace NH 4 Ac. 74 10 15

Mod. 71. -10000 êx; - .89/07 20 25 30 52.077Bef: R3W/University Patents-RNA RibozymeMod. 71.-10000 æ; - .89 / 07 20 25 30 52.077Bef: R3W / University Patents-RNA Ribozyme

Estas questões encontram-se focadas nas figuras 22-31. A ribozima TCC tem pouca especificidade dentro de uma grande variedade de concentrações de MgC12, se o sal ou a ureia se encontrarem ausentes CFig. 22). Esta ribozima tem melhor especificicidade em ureia 1.5'M, mas nestas condições perde a actividade com o substracto emparelhado CFig. 23). O sal Cneste caso, NH4Ac) tem apenas um efeito mínimo na clivagem do substracto emparelhado CFig. 24·), mas reduz substancialmente a clivagem do substracto mal emparelhado CFig. 25), aumentando assim a especificidade. As mesmas questões encontram-se focadas para o caso da enzima TTA nas figuras 26-29. 0 NH4Ac também é usado para aumentar a especificidade da ribozima TGT CFiguras 30-31). Exemplo IX A L-19 IVS ARN cataiiza a clivagem e a reconstituição de oligonucleôtidos Incubou-se L-19 IVS ARN não marcada com pC5 marcado com na posição 5' numa solução contendo MgC12 20 mM e Tris-Hcl 50 mM pH 7.5. 0 pC5 foi sendo progressivamente convertido em ácido oligocitidilico, com cadeias de dimensão tanto superior como inferior à do composto inicial CFig, 5A). 0s maiores produtos chegaram a atingir pelo menos a pC30, de acordo com uma exposição rnais longa de um auto-radiograma como o apresentado na Fig. 5A. Os produtos mais curtos eram exclusivamente pC4 e p€3. A incubação de pC5 na ausência de L-19 IVS ARN não deu reacção CFig. 50. 75 35 1 52.077 Bef: RJW/Dniversity Patents-RNA. RibozymeThese issues are focused on Figures 22-31. The TCC ribozyme has poor specificity within a wide range of MgCl2 concentrations if the salt or urea are absent. 22). This ribozyme has a better specificity in 1.5 M urea, but under these conditions it loses activity with the matched substrate CFig. 23). The salt in this case, NH4Ac) has only a minimal effect on cleavage of the matched substrate CFig. 24), but substantially reduces the cleavage of the mismatched substrate CFig. 25), thus increasing specificity. The same questions are focused on the case of the TTA enzyme in Figures 26-29. NH4Ac is also used to increase the specificity of the TGT ribozyme CFigures 30-31). L-19 IVS RNA catalyzes cleavage and reconstitution of oligonucleotides L-19 IVS RNA unlabeled with 5 '-position labeled pC5 was incubated in a solution containing 20 mM MgCl 2 and 50 mM Tris-Hcl pH 7.5. The pC5 was progressively converted to oligo-cytidylic acid, with chains of both higher and lower size than the starting compound CFig, 5A). The larger products reached at least pC30, according to a longer exposure of an auto-radiogram as shown in Fig. 5A. The shortest products were exclusively pC4 and p € 3. Incubation of pC5 in the absence of L-19 IVS RNA gave no CFIG reaction. 50. 75 35 1 52,077 Bef: RJW / Dniversity Patents-RNA. Ribozyme

Mod. 71 -10000 ex. -39/07Mod. 71 -10000 ex. -39/07

5 10 15 20 25 30 0 tratamento de urna mistura reaccional com fosfatase 60 minutos depois do inicio da reacção, resultou na transferência completa da radioactividade devida ao ^'&quot;P para o fosfato inorgânico, o que foi verificado por cromatografia em camada fina com polietilenoimina CTLC) em formato de sódio 1 M, pH=3.5 CZaug, A., et al., resultados não publicados). Assim, o fosfato terminal 5' do substracto não se torna inacessível durante a reacção, e o substacto é aumentado no lado do seu terminal 3' formando o oligonucleótido maior. Quando se utilizou C5p:fC como substracto e se trataram os produtos com ribonuclease T2 ou ribonuclease A, a 32 radioactividade devida ao P encontrava-se inteiramente no composto cp$ CZaug, A. et al., resultados não publicados). Assim, as ligaçbes formadas durante a reacção consistem exclusivamente de ligaçóes fosfodiéster 3'-5'. Os produtos devidos à reacção com C5p#C foram totalmente resistentes ao tratamento com fosfatase. A reacção apresentava especificidade em relação ao ribonucleótidos, não se dando a reacção com d-pCS CFig. 1B), ou com d-pAS CZaug, A. et al., resultados não publiçados)! De entre os oligorribonucleótidos, a pU6 foi um substracto muito pior que a pCS ou a pC6 CFig. SD), e a pA6 não reagiu CZaug, A., and Cech, T.R., C1986), Biochemistry 25:4478). A reacção não ocorreu quando se omitiu o cloreto de magnésio. A actividade enzimática manteve-se aproximadamente constante na gama compreendida entre 5 mM e 40 mM em MgC12 CZaug, A., et al., resultados não publicados). Utilizou-seTreatment of a reaction mixture with phosphatase 60 minutes after the start of the reaction resulted in the complete transfer of the radioactivity due to the? -P to the inorganic phosphate, which was verified by thin layer chromatography with polyethyleneimine CTLC) in 1 M sodium formate, pH = 3.5 CZaug, A., et al., unpublished results). Thus, the 5 'terminal phosphate of the substrate does not become inaccessible during the reaction, and the substrate is raised on the side of its 3' terminus to form the larger oligonucleotide. When C5β: fC was used as the substrate and the products with ribonuclease T2 or ribonuclease A were treated, the radioactivity due to P was entirely in the compound cpCZaug, A. et al., Unpublished results). Thus, the linkages formed during the reaction consist exclusively of 3'-5 'phosphodiester linkages. The products due to the reaction with C5p # C were completely resistant to treatment with phosphatase. The reaction showed specificity in relation to the ribonucleotides, not giving the reaction with d-pCS CFig. 1B), or with d-pAS CZaug, A. et al., Unpublished results)! Of the oligoribonucleotides, pU6 was a much worse substrate than pCS or pC6 CFig. SD), and pA6 did not react CZaug, A., and Cech, T.R., C1986), Biochemistry 25: 4478). The reaction did not occur when magnesium chloride was omitted. The enzyme activity remained approximately constant in the range of 5 mM to 40 mM in MgCl2 CZaug, A., et al., Unpublished results). It was used

rotineiramente a concentração de 20 mM para evitar o efeito da possível quelação do Mg2+ por substractos oligorribonucleótido em altas concentraçbes. 76the 20 mM concentration routinely to avoid the effect of possible chelation of Mg2 + by oligoribonucleotide substrates at high concentrations. 76

1 02.077 ]íef: HOW/University Patents-HNA. Ribozwe1 02.077] EF: HOW / University Patents-HNA. Ribozwe

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 A L-19 IVS ARN é regenerada depois de cada reacçâo, 'pelo que cada molécula de enzima pode reagir com muitas moléculas de substracto. Por exemplo, o tratamento dos dados apresentados na Fig. 5(3 revela que 16 pmol de enzima convertem 1080 pmol de pC5 a produtos durante um intervalo de 60 minutos. Estes números subestimam o número de ciclos enzimâticos por unidade de tempo (turnover number)? como os produtos iniciais sSo essencialmente constituídos por CS e C4, é provável que a produção de cadeias com dimensão superior a seis ou inferior a quatro nucleótidos envolva dois ou mais ciclos catalíticos. A quantificação da radioactividade em cada produto também fornece alguma indicação sobre o mecanismo da reacção. Pouco depois do inicio da reacção, a quantidade de radioactividade &lt;uma medida do número de cadeias) presente nos produtos maiores que pCS é aproximadamente igual á encontrada na soma de pC4 e pC3, o que é consistente com um mecanismo em que se conserva o número total de ligaçBes fosfodiéster em cada reacção. A medida que a reacção prossegue, contudo, a distribuição da radioactividade desloca-se no sentido dos produtos com menores dimensftes. Isto é muito provávelmente devido à reacção de hidrólise, que entra em competição com a reacção em estudo e que é também cataiizada pela L-19 IVs -ARN, como é descrito abaixo.Mod. 71-10000 ex. The IVS RNA is regenerated after each reaction, whereby each enzyme molecule can react with many substrate molecules. For example, the treatment of the data shown in Fig. 5 (3) shows that 16 pmol of enzyme converts 1080 pmol of pC5 to products over a 60 minute interval. These numbers underestimate the number of enzyme cycles per unit of time (turnover number) As the starting materials are essentially comprised of CS and C4, it is likely that the production of chains larger than six or less than four nucleotides will involve two or more catalytic cycles. The quantification of the radioactivity in each product also provides some indication of the Shortly after the start of the reaction, the amount of radioactivity &lt; a measure of the number of chains) present in the products greater than pCS is approximately equal to that found in the sum of pC4 and pC3, which is consistent with a mechanism in that the total number of phosphodiester bonds in each reaction is conserved. As the reaction proceeds, however, the distribution of the radioactivity shifts towards smaller products. This is most likely due to the hydrolysis reaction, which competes with the reaction under study and which is also catalyzed by L-19 IVs -RNA, as described below.

7777

52-07752-077

Eef: RJW/CJniversity Patents-FNA. Ribozyma A velocidade de conversão de pC5 30 uM em produtos aumenta linearmente com a concentração da enzima L-19 IVS ARN na gama compreendida entre 0.06 e 1.00 uli (2aug, A. , et al. resultados não publicados). Existe uma relação hiperbólica entre a velocidade de reacção e a concentração de pC5 a uma dada concentração de enzima CFig. 5, E a G). Qs dados são ajustados com base na equação da lei de Michael is-Menten CFig. 6). Os parâmetros cinéticos resultantes são: Km = 42 uM e kcat = 1.7 min-1·.Eef: RJW / CJniversity Patents-FNA. Ribozyma The conversion rate of 30æM pC5 in products increases linearly with the concentration of the enzyme L-19 IVS RNA in the range of 0.06 to 1.00æl (2aug, A., et al., Unpublished results). There is a hyperbolic relationship between the reaction rate and the concentration of pC5 at a given concentration of enzyme CFig. 5, E to G). Qs data are adjusted based on the equation of Michael's law is-Menten CFig. 6). The resulting kinetic parameters are: Km = 42 uM and kcat = 1.7 min -1.

Mod. 71 -10000 ex. 89/07 A estabilidade da enzima foi determinada por incubação preliminar a 42 °C durante 1 hora na presença de Mg2+ Ccondições reaccionais Standard}, ou durante 18 horas nas mesmas condições, mas na ausência de Mg2+. Em ambos os casos, a enzima apresentava uma actividade indistinguível da da enzima não tratada testada paralelamente, e não se observaram produtos de degradação por electroforese em gel de poliacrilamida CZaug, A. et al., resultados não publicados). Assim, a enzima L-19 IVS ARN não é urr bom substracto.- A enzima é-também estável durante, meses, quandc armazenada a -20 °C. A actividade especifica da enzima mantém-se consistente nas várias preparações.Mod. 71 -10000 ex. The stability of the enzyme was determined by preliminary incubation at 42Â ° C for 1 hour in the presence of Mg2 + Standard Reaction Conditions, or for 18 hours under the same conditions, but in the absence of Mg2 +. In both cases, the enzyme exhibited an activity indistinguishable from that of the untreated enzyme tested in parallel, and no degradation products were observed by polyacrylamide gel electrophoresis CZaug, A. et al., Unpublished results). Thus, the enzyme L-19 IVS RNA is not a good substrate. The enzyme is also stable for months, when stored at -20 ° C. The specific activity of the enzyme remains consistent across the various preparations.

Exemplo X 30Example X 30

Intermediário covalente. Quando se usou o CSpM como substracto, a radioactividade passou a estar covalentement-o ligada à L-19 IVS ARN CFig. 7A&gt;. 0 fosfato radioactivo estavo ligado covalentemente ã L-19 IVS ARN, o que foi verificado usando os seguintes critérios: manteve-se ligado quando o complexo fo . 78 51.077 Bsf: R3W/Dniversity Patents-RNA RibozyneCovalent intermediate. When CSpM was used as the substrate, the radioactivity was covalently attached to L-19 IVS RNA CFIG. 7A &gt;. Radioactive phosphate was covalently linked to L-19 IVS RNA, which was verified using the following criteria: it remained bound when the complex was. 78 51,077 Bsf: R3W / Dniversity Patents-RNA Ribozyne

5 10 155 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 isolado e submetido a um segundo processo Cdesnaturamte) de electroforese em gel; foi libertado sob a forma de um nucleótido quando tratado com RNase T2; e foi libertado sob a forma de uma série de oligonucleótidos não identificados quando tratado com RNase TI CA. Zaug &amp; T. Cech, dados não publicados). Estes resultados são consistentes com a existência de uma série de complexos enzima-substracto covalentes, em que vários troços do CSp-f se encontram ligados à L-19 IVS ARN através de uma ligação fosfodiéster 3&quot;—5&quot; normal. Esta observação, considerada em conjunto com o que já conhecíamos sobre o mecanismo da ciclização da IVS ARN CZaug, A.J., et al., (1984) Science 224:574; Sullivan and Cech, T.R. , (.1335) Cell 42:633; Zaug, A.-J. , et al. C1933) Nature CLondon) 301:578), Been, M. and Cech, T.R. C1385) Nucleic Acids Res. 13:8383), levou à proposta de um modelo para o mecanismo da reacção envolvendo um intermediário covalente enzima-substracto CFig.8). Este caminho reaccional é sustentado pela análise de reacçSes nas quais uma quantidade vestigial de p$C5 foi· incubada com um grande excesso (molar) da L-19 IVS ARN. A reacção de clivagem ocorreu com grande eficiência, o que foi verificado pela produção de p#C4 e p$C3, mas houve muito pouca síntese de produtos maiores que o composto original CFig.7B; compare-se com a Fig. 5A). Estes dados são facilmente interpretados com base no caminho reaccional proposto. 0 primeiro caso, a formação do intermediário covalent-e com libertação do fragmento terminal 5' do o1igonucleótido, ocorre normalmente; esse primeiro passo consome todo o substracto, deixando uma quantidade de C5 insuficiente para induzir a segunda reacção de transesterificação. 79. 35 1 15Mod. 71 -10000 ex. And subjected to a second gel electrophoresis method); was released as a nucleotide when treated with RNase T2; and was released as a series of unidentified oligonucleotides when treated with RNase TI CA. Zaug &amp; T. Cech, unpublished data). These results are consistent with the existence of a number of covalent enzyme-substrate complexes, wherein several portions of CSp-f are linked to L-19 IVS RNA via a phosphodiester bond 3 &quot; normal. This observation, taken in conjunction with what we already knew about the cyclization mechanism of IVS RNA CZaug, A.J., et al., (1984) Science 224: 574; Sullivan and Cech, T.R., (1335) Cell 42: 633; Zaug, A.-J. , et al. C1933) Nature CLondon) 301: 578), Been, M. and Cech, TR C1385) Nucleic Acids Res. 13: 8383), led to the proposal of a model for the reaction mechanism involving a covalent enzyme-substrate intermediate CFig.8 ). This reaction pathway is sustained by the analysis of reactions in which a trace amount of pC5 was incubated with a large (molar) excess of the L-19 IVS RNA. The cleavage reaction occurred with great efficiency, which was verified by the production of pC4 and pC3, but there was very little synthesis of products larger than the original compound CFig.7B; compare with Fig. 5A). These data are easily interpreted based on the proposed reaction path. In the first case, the formation of the intermediate covalent and releasing the 5 'terminal fragment of the oligonucleotide normally occurs; this first step consumes the entire substrate, leaving a quantity of C5 insufficient to induce the second transesterification reaction. 79. 35 1 15

Mod. 71-10000 ex. -89/07 20 25 30 52-077Sef: RJW/University Patents-ΒΚΆ RibozymeMod. 71-10000 ex. -89/07 20 25 30 52-077Sef: RJW / University Patents-ΒΚΆ Ribozyme

0 modelo apresentado na fig. 8 foi testado isolando o complexo enzima-substracto covalente preparado por reacção com C5p$C e incubando-o com C5 não marcado. Uma parte da radioactividade foi transferida para oligonucleótidos com mobilidades elect-roforéticas correspondentes a CS, C7, C8 e oligómeros de cadeia superior CFig. 70. Numa experiência confirmatória, o complexo covalente foi preparado com CS não marcado e feito reagir com ρΐCS. A radioactividade foi novamente transferida para uma série de oligonucleótidos de peso molecular superior CSaug, A., et al., dados não publicados). Nos dois tipos de experiência os dados são fácilmente explicados se o complexo covalente fôr uma mistura da L-19 IVS ARN terminandp em GpC, . . . GpCpC, ... GpCpCpC, etc. Dado que podem reagir com CS para completar o ciclo catalítico, estes complexos enzi ma-substracto covalentes são possíveis intermediários da reacção CFig.8). E necessária uma análise mais detalhada da velocidade da sua formação e resolução para avaliar se são ou não cinéticamente capazes de serem intermediários. Não podemos apresentar nenhuma conclusão firme sobre a porção do complexo enzima-substracto que não reagiu com CS. Este ARN não-reactivo poderia ser um intermediário covalente que sofreu desnaturação durante o processo de isolamento de forma a perder a reactividade, ou poderia representar uma pequena quantidade de um complexo enzima— substracto diferente, não produtivo, e que portanto se acumula durante a reacção. A ligação G414-A1S na C IVS ARN, a ligação G414-U20 na C·- IVS ARN, e a ligação G414-U41S no pré-ARN são ligáç8es fosfodiestér 80 35 10 15The model shown in Fig. 8 was tested by isolating the covalent enzyme-substrate complex prepared by reaction with C5 β-C and incubating it with unlabeled C5. A part of the radioactivity was transferred to oligonucleotides with corresponding electromoteretic mobilities corresponding to CS, C7, C8 and higher chain oligomers CFig. 70. In a confirmatory experiment, the covalent complex was prepared with unlabeled CS and reacted with ρΐCS. The radioactivity was again transferred to a series of higher molecular weight oligonucleotides CSaug, A., et al., Unpublished data). In both types of experiment the data are readily explained if the covalent complex is a mixture of L-19 IVS RNA terminandp in GpC. . . GpCpC, ... GpCpCpC, etc. Since they can react with CS to complete the catalytic cycle, these covalent enzyme-substrate complexes are possible reaction intermediates CFig.8). Further analysis of the speed of their formation and resolution is needed to evaluate whether or not they are kinetically capable of being intermediates. We can not present any firm conclusions about the portion of the unreacted enzyme-substrate complex with CS. This non-reactive RNA could be a covalent intermediate that has undergone denaturation during the isolation process in order to lose reactivity, or could represent a small amount of a different, non-productive enzyme-substrate complex and therefore accumulates during the reaction . The G414-A1S binding on the C IVS RNA, the G414-U20 binding on the C-IVS RNA, and the G414-U41S binding on the pre-RNA are phosphodiester ligations

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

J 62.077Bef: Kiw/Õniversity Patents-ΗΝΆ RibozyneJ 62.077Bef: Kiw / Õniversity Patents-ΗΝΆ Ribozyne

alcalina, libertando os terminais fosfato 5' e hidroxil 3'CZaug, A.-J. et al, C 1384) Science 224:574 and Inoue, T. , et al. C1986) J. Mo1. Biol. 189, 143-185). Testámos por isso a labilidade da ligação G414-C no intermediário enzima—substracto covalente, incubando a pH 9.0 num tampão contendo Mg2+. Este tratamento originou a libertação de produtos que co-migraram com padrdes pC e pCpC, bem como de produtos maiores, possivelmente oligómeros de pC de maiores dimensães CFig. 7D). Utilizou-se a cromatografia em camada fina para confirmar a identidade dos produtos principais CZaug, A. et al., dados não publicados). No caso das moléculas em que se verificava libertação de pC, essa libertação estava essencialmente terminada ao fim de 5 minutos. Cerca de metade do complexo covalente ,era resistente ao tratamento a pH 9.0, Mais uma vez não podemos chegar a conclusSes firmes sobre as moléculas que não reagiram. A labilidade da ligação 8414-C ê a base da actuação da L-19 IVS ARN como ribonuclease CFig. 8), através de um mecanismo que é diferente do da endorribonuclease descrita nos exemplos I a VI. - Um inibidor competitivo. A deoxi-C5, que não é um substracto para a clivagem catalisada pela L—19 IVS ARN, inibe a clivagem da pCS CFig. 9A). A análise da velocidade de conversão de pCS a pC4 e pC3 em função da concentração de d-CS indica que o dC5 é um inibidor competitivo verdadeiro, com uma constante de inibição Ki = 2S0 uM. 0 d-A5 a 500 uM inibe a reacção apenas 16¾ do que inibe o d-CS. Assim, a inibição por d-C5 não é devida.a um efeito geral decorrente da adição de um deoxioligonuclebtido ao sistema, mas sim um efeito dependente da sequência. 81 35alkali, releasing the 5 'phosphate and hydroxyl 3'CZaug, A.-J. et al, C 1384) Science 224: 574 and Inoue, T., et al. C1986) J. Mo1. Biol. 189, 143-185). We therefore tested the lability of G414-C binding on the covalent enzyme-substrate intermediate, incubating at pH 9.0 in a buffer containing Mg 2+. This treatment resulted in the release of products that co-migrated with pC and pCpC standards, as well as larger products, possibly larger CFig oligomers of CF. 7D). Thin-layer chromatography was used to confirm the identity of the major products CZaug, A. et al., Unpublished data). In the case of the molecules in which pC release occurred, this release was essentially complete after 5 minutes. About half of the covalent complex was resistant to treatment at pH 9.0. Again, we can not come to firm conclusions about unreacted molecules. The lability of the 8414-C bond is the basis of the action of L-19 IVS RNA as ribonuclease CFig. 8) by a mechanism which is different from that of the endoribonuclease described in examples I to VI. - A competitive inhibitor. Deoxy-C5, which is not a substrate for cleavage catalysed by L-19 IVS RNA, inhibits the cleavage of pCS CFIG. 9A). Analysis of the conversion rate of pCS to pC4 and pC3 as a function of the d-CS concentration indicates that dC5 is a true competitive inhibitor with an inhibition constant Ki = 2.00æM. The d-A5 at 500 æM inhibits the reaction only 16 ¾ than inhibits d-CS. Thus, inhibition by d-C5 is not due to a general effect resulting from the addition of a deoxyoligonucleotide to the system, but rather a sequence dependent effect. 81 35

62.07762,077

Eef: RJW/University Patents-KNA. Ribozyme A formação do complexo enzima-substracto covalente pode representado da seguinte maneira: 10 E + C- f E .* C,.-^ EpC + C,Eef: RJW / University Patents-KNA. Ribozyme The formation of the covalent enzyme-substrate complex can be represented as follows: E + C-

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25

k-.k-.

Se k_^ &gt;&gt; ^2* então Km = k-i/kj, a constante de dissociação do complexo E.CS não-covalente. A observação de que o Ki para o d-CS é da mesma ordem de grandeza do que o Km para o C5 pode então ser interpretada em termos de o d-CS e o C5 terem constantes de ligação semelhantes para a interaeção com o centro activo da enzima. Isto está de acordo com a ideia de que o substracto se liga a uma sequência oligopurina CR5) no centro activo essencialmente através de emparelhamento de bases do tipo Watson-Crick, pelo que o duplex C5 . RS e o duplex d-CS . RS devem apresentar a mesma estabilidade. Q mecanismo da enzima' e a sua relação com o auto-processamento, a estequiometria dos produtos da reacção (produção de quantidades equimolecularés de oligonucleótidos maiores e mais pequenos que o composto original), a nSo-necessidade da energia proveniente do ATP ou do 6TP (adenosina trifosfatoj guanosina trifosfato), o envolvimento de um intermediário covalente, a especificidade em relação aos substractos oligo-C', e a inibição competitiva pelo d-CS, levaram â formulação de um modelo para o mecanismo da enzima (Fig. S). Prop3e-se que a L-13 IVS ARN se ligue não covalentemente ao 82If k_ ^ &gt; &gt; ^ 2 * then Km = k-i / kj, the dissociation constant of the non-covalent E.CS complex. The observation that Ki for d-CS is of the same order of magnitude than Km for C5 can then be interpreted in terms of d-CS and C5 having similar binding constants for interaction with the active site of the enzyme. This is in accordance with the idea that the substrate binds to an oligopurine CR5) sequence in the active site essentially through Watson-Crick-like base pairing, whereby the C5 duplex. RS and the d-CS duplex. RS must have the same stability. The mechanism of the enzyme and its relation to self-processing, the stoichiometry of the reaction products (production of equimolecular quantities of larger and smaller oligonucleotides than the original compound), no need for energy from ATP or 6TP (adenosine triphosphate-guanosine triphosphate), the involvement of a covalent intermediate, the specificity with respect to oligo-C 'substrates, and competitive inhibition by d-CS, led to the formulation of a model for the enzyme mechanism (Fig. S) . The L-13 IVS RNA is intended to bind non-covalently to the 82

62.0771 Bef: BJW/TJniversity Patents-RNA Ribozyme 5 θ'*62.0771 Bef: BJW / TJniversity Patents-RNA Ribozyme 5 θ '*

substracto através interacçães devidas ao empareihamento de bases. A reacção de transest-erif icação ente o resíduo guanosina terminal 3'da enzima e o éster fosfatado do substracto produz então um intermediário enzima-substracto covalente.substrate through interactions due to base pairing. The transesterification reaction between the 3'-terminal guanosine residue of the enzyme and the phosphate ester of the substrate then produces a covalent enzyme-substrate intermediate.

LL

10 15 é de esperar que a transest-erificação seja muito reversível.Transesterification is expected to be very reversible.

Mad. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 35Mad. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 35

Se o produto C4 se torna a ligar à enzima pode atacar o intermediário covalente e reconstituir o composto inicial CS. Contudo, no estádio inicial da reacção, a concentração de CS é muito maior que a de C4j se o CS se ligar e atacar o intermediário covalente, produz-se CS CFig.8). A reacção global consiste na conversão de 2 CS em C4 + CS. Os produtos actuam como substractos em reacçbes posteriores, por exemplo, na conversão de CS + CS em C7 + C4, e de C4 + CS em C3 + CS. A ausência de produtos menores que C3 é explicada tendo em conta a perca de interacçbes ligantes do C3 em relação ao C4 C o C3 só pode criar dois emparelhamentos de bases com o modo de ligação adequado para a clivagem produtiva)..... ...... As reacçÓes de transesterificação são conservativas no que diz respeito ao número de ligaçbes fosfodiéster no sistema. Assim, a ligação do ARN pode ocorrer na ausência de uma fonte externa de energia, ao contrário do que acontece nas AON- e ARN-ligases. A hidrólise do intermediário covalente compete com a transesterificação. A reacção global consiste na conversão de CS + H2Q em C4 + pC, com a L-19 IVS ARN a actuar como ribonuc lease. Baseando-nos nos nossos conhecimentos actuais sobre a reacção, as estrégias catalíticas da enzima L-19 IVS ARN parecem ser iguais às usadas pelas enzimas proteicas CJencks, W.P., 83 1 15If the C4 product binds to the enzyme it can attack the covalent intermediate and reconstitute the starting compound CS. However, at the initial stage of the reaction, the concentration of CS is much higher than that of C4j if the CS binds and attacks the covalent intermediate, CS is produced. The overall reaction consists of the conversion of 2 CS into C4 + CS. The products act as substrates in later reactions, for example, in the conversion of CS + CS to C7 + C4, and of C4 + CS to C3 + CS. The absence of products smaller than C3 is explained in view of the loss of binding interactions of C3 to C4 C or C3 can only create two base pairings with the appropriate binding mode for the cleavage). The transesterification reactions are conservative with respect to the number of phosphodiester linkages in the system. Thus, RNA binding may occur in the absence of an external energy source, unlike in the AON- and RNA-ligases. The hydrolysis of the covalent intermediate competes with the transesterification. The overall reaction consists of the conversion of CS + H2 0 into C4 + pC, with the L-19 IVS RNA acting as ribonuclease. Based on our current knowledge of the reaction, the catalytic properties of the enzyme L-19 IVS RNA appear to be the same as those used by the protein enzymes CJencks, W.P., 83

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 €2.077 Hef: RJW/University Patents-RNA RibozymeMod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 € 2.077 Hef: RJW / University Patents-RNA Ribozyme

C19695 Catalysis in Chemistry and Enzymo 1 ogy (McGraw-Hill, New York). Em primeiro lugar, as enzimas de ARN, tal como as enzimas proteicas, formam um complexo não-covalente especifico com o seu substracto oligorribonucleótido. Admite—se a existência desta interacção para explicar a colocação do substracto à distância e conv a orientação adequadas a um ataque facilitado pelo grupo hidroxil 3' da guanosina terminal da enzima. Em segundo lugar, supõe-se que o intermediário na reacção com a L-19 IVS ARN seja um complexo enzima-substracto covalente. Qs intermediários covalentes são prevalecentes nas reacções de transferência de grupo catalisadas enzimáticamente. Em terceiro lugar, a ligação fosfodiéster formada no intermediário covalente ê invulgarmente susceptivel à hidrólise, indicando que se encontra tensa ou activada, facilitando portanto a formação do estado de transição pentavalente quando sujeita a ataque nucleófilo &lt;Zaug, A.J., et al. C1985) Biochemistry 24:6211; Zaug, A. J., et al. (1984) Science 224:5745. De forma semelhante, pensa-se que os catalisadores proteicos facilitem a formação do estado de transição, por exemplo, fornecendo grupos no sitio activo que se ligam melhor ao estado de transição que ao substracto livre (Fersht, A., (1985) Enzyme Structure and Mechanism (Freeman, New York, ed. 2)5 Wells, T.N.C., et al. (1985) Nature (London) 316:655). Até agora não há evidência que outra categoria principal de catálise enzimática , a catálise geral ácido-base, ocorra nas reacções com a L-19 IVS ARN, mas pensamos que poderá estar envolvida nas transferências de protão necessárias ao processo. 84 35C19695 Catalysis in Chemistry and Enzyme 1 ogy (McGraw-Hill, New York). First, RNA enzymes, such as the protein enzymes, form a specific non-covalent complex with its oligoribonucleotide substrate. The existence of this interaction is understood to explain the placement of the substrate at a distance and conv the orientation appropriate to an attack facilitated by the hydroxyl group 3 'of the terminal guanosine of the enzyme. Second, it is assumed that the intermediate in the reaction with the L-19 IVS RNA is a covalent enzyme-substrate complex. Covalent intermediates are prevalent in enzymatically catalyzed group transfer reactions. Third, the phosphodiester bond formed in the covalent intermediate is unusually susceptible to hydrolysis, indicating that it is tense or activated, thereby facilitating the formation of the pentavalent transition state when subjected to nucleophilic attack &lt; Zaug, A.J., et al. C1985) Biochemistry 24: 6211; Zaug, A.J., et al. (1984) Science 224: 5745. Similarly, it is believed that the protein catalysts facilitate the formation of the transition state, for example by providing groups in the active site which bind better to the transition state than to the free substrate (Fersht, A., (1985) Enzyme Structure and Mechanism (Freeman, New York, ed. 2) 5 Wells, TNC, et al. (1985) Nature (London) 316: 655). So far there is no evidence that another major category of enzyme catalysis, the general acid-base catalysis, occurs in reactions with the L-19 IVS RNA, but we think it may be involved in the proton transfers required for the process. 84 35

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

Jik. ..... 1 52.077 Bef: RlW/tlniversity Patents-FNA Riboz^me 5 Cada reacção de transester if icação ou de hidrólise catalisada pela L-19 IVS ARN é análoga a um dos passos da reacção de auto-processamento (ou outra auto-reacção do mesmo tipo) da Tetrahymena (Fio. 10). Assim. a descoberta de ac tiviriade 1° enzimática num troço da IVS ARN consolida o ponto de vista segundo o qual o pré-rARN tansporta a sua própria enzima de processamento como parte intrínseca da sua cadeia polinucleotídica. Parece provável que o o local de ligação do -10000 ex.-89/07 στ substracto CS da L-19 IVS ARN seja o local de ligação oligopirimidina que dirige a escolha do local de processamento 5' e os vários locais de ciclização da IVS ARN CSullivan, F.X., et al. ¢1985) Cell Suora; Been. M. , et al. C1985) Nucleic Acid •g I 20 Research Supras Inoue. T. . et al. J. Mol. Biol., Supra; Inoue. T. , et al. &lt;1985) Cell 43:4.31). Apesar da localização desse sitio na IVS ARN não ter sido estabelecida, o melhor candidato é 1 25 uma porção da sequência-guia interna proposta por Davies e colaboradores (Davies, R.W.,- et al. - (1982) Nature CLondon) 300:7195 Waring, R. B,, etal. (1983) J. Mol, Biol. 167:595). Michel e Dujon (Michel, F. , et al., (1983) EMB0 J. 2:33) apresentam uma interacçãó de emparelhamento semelhante no seu modelo para a estrutura do ARN. 0 hipotético sítio de ligação 30 GGAGGG encontra-se localizado nos nucleótidos 22 a 27 da IVS ARN de Tetrahvmena intacta, e nas posiçSes 3 a 8, muito perto do terminal 5', da L-19 IVS ARN. Se este for o sitio de ligação ao substracto, a mutação num local especifico da sequência deveria ·;: 35 modificar de uma forma previsível a especificidade da enzima em relação ao substracto. 85 10 15Jik. Each transesterification or hydrolysis reaction catalysed by the L-19 IVS RNA is analogous to one of the steps of the self-processing (or other) reaction sequence of the L-19 IVS RNA. self-reaction of the same type) of Tetrahymena (Thread 10). Like this. the discovery of enzyme acylase 1 in a portion of the IVS RNA consolidates the view that the pre-rRNA carries its own processing enzyme as an intrinsic part of its polynucleotide chain. It seems likely that the binding site of -10000 ex-89/07 στ CS substrate of L-19 IVS RNA is the oligopyrimidine binding site which directs the choice of the 5 'processing site and the various cyclization sites of IVS RNA CSullivan, FX, et al. ¢ 1985) Cell Suora; Been. M., et al. C1985) Nucleic Acid • Research Supras Inoue. T. et al. J. Mol. Biol., Supra; Inoue. T., et al. &lt; 1985) Cell 43: 4.31). Although the location of this site in the IVS RNA has not been established, the best candidate is a portion of the internal leader sequence proposed by Davies et al. (Davies, RW et al., (1982) Nature CLondon) 300: 7195 Waring, R.B., et al. (1983) J. Mol, Biol. 167: 595). Michel and Dujon (Michel, F., et al., (1983) EMB0 J. 2:33) show a similar annealing interaction in their model for RNA structure. The hypothesized GGAGGG binding site is located at nucleotides 22 to 27 of intact Tetrahm IV RNA IVS, and at positions 3 to 8, very close to the 5 'terminus of L-19 IVS RNA. If this is the substrate binding site, mutation at a specific site of the sequence should predictably modify the specificity of the enzyme to the substrate. 85 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 52.077Bef: MW/University Patents-FNA. Eiboz^neMod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 52.077Bef: MW / University Patents-FNA. Eiboz ^ ne

Exemplo XI ^ L-13 ivb ARN desfosforila C6p. Quando o ácido oligocitidílico, com um grupo hidroxilo no terminal 3', é incubado com a enzima L-19 IVS ARN em MgC12 20 mM, é convertido em oligo(C) tanto com cadeias maiores como menores (Figura IA) , como foi práviamente descrito (Exemplos VII e VIII e Zaug &amp; Cech, 1.1986) Science CWash. D.C.) 231 s470-475) A reacção apresenta especificidade em relação ao oligo(C)? por exemplo, o pA6-QH não reage nas mesmas condições (Fig. ílA). Quando o ácido oligocitidilico com um fosfato no terminal 3' é incubado com excesso de L-19 IVS ARN em MgC12 20 mM, o substracto é convertido num produto que apresenta pouca mobilidade eleçtroforética (Fig. 11A). Esta redução abrupta na mobilidade elec trof orética , que é equi\'alente a um aumento de aproximadamente três nucleótidos na sequência, é exactamente igual ao obtido tratando o substracto com fosfatase alcalina (não ê mostrado na Fig. 11? apresenta-se um exemplo na Fig. 12). Assim, parecia que o produto era C6-0H. Quando se usou substracto marcado no meio &lt;C5p#Cp), o fosfato marcado é retido no produto (Fig. 11A). Por outro lado, quando o substracto se encontra marcado no terminal (CSp$), o produto oligorribonucleótido não vem marcado e a L-19 IVS ARN aparece marcada (Fig. 118). Estas observações confirmaram que a reacção envolve a remoção do fosfato terminal 3“ do substracto. 86 35 1 1Example XI-L-13 ivb C6p dephosphoryl RNA. When oligocyclic acid with a 3 'terminal hydroxyl group is incubated with the enzyme L-19 IVS RNA in 20 mM MgCl 2, it is converted to oligo (C) with both major and minor chains (Figure 1A), as was previously (Examples VII and VIII and Zaug & Cech, 1986) Science CWash. D.C.) 231 s470-475) Does the reaction exhibit specificity over oligo (C)? for example, pA6-QH does not react under the same conditions (Fig. 1A). When oligocyclic acid with a phosphate at the 3 'terminus is incubated with excess L-19 IVS RNA in 20 mM MgCl2, the substrate is converted into a product which has little electrophoretic mobility (Fig. 11A). This abrupt reduction in electrophoretic motility, which is equal to an increase of approximately three nucleotides in the sequence, is exactly the same as that obtained by treating the substrate with alkaline phosphatase (not shown in Fig. 11). in Fig. 12). Thus, it appeared that the product was C6-OH. When labeled substrate was used in the &lt; C5p # Cp medium), the labeled phosphate is retained in the product (Fig. 11A). On the other hand, when the substrate is labeled at the terminal (CSp $), the oligoribonucleotide product is not labeled and the L-19 IVS RNA is labeled (Fig. 118). These observations confirmed that the reaction involves removal of the 3 'terminal phosphate from the substrate. 86 35 1 1

5 10 ' 155 10 '15

Mod. 71 -10000 ex, - 89/07 25 30 62.077Mod. 71 -10000 ex, 89/07 25 30 62,077

Bsf: RJW/Dniversity Patents-KNA. RLbozyme ft desfosforilação é especifica em relação ã forma fosfatada em 3' do ácido oligocitidílico. 0 fosfato 5' do pC5 não é reactivo (Fig. 11A), e nenhum dos grupos fosfato ê removido do pCp (dados não apresentados). Nem o ASCp (Figura 1 IA) nem o pASp (não mostrado) se comportam como substractos. (Estimamos que a reacção seria detect-ada se ocorresse a 0.1%). Com base nesta amostra, parece existir tanto a necessidade de uma dimensão mínima de cadeia, como de uma sequência determinada para o substracto, e essas necessidades são semelhantes às determinadas para a actividade de transferência de nucleótidos da L-19 IVS ARN (Zaug ã Cech, (1986) Science, suora).Bsf: RJW / Dniversity Patents-KNA. The dephosphorylation is specific to the 3 'phosphate form of oligocytidic acid. The 5 'phosphate of pC5 is non-reactive (Fig. 11A), and none of the phosphate groups are removed from pCp (data not shown). Neither ASCp (Figure 11A) nor pASp (not shown) behave as substrates. (We estimate that the reaction would be detected if it occurred at 0.1%). Based on this sample, there appears to be both the need for a minimum chain size and a predetermined sequence for the substrate, and those requirements are similar to those determined for the nucleotide transfer activity of L-19 IVS RNA (Zaug Cech , (1986) Science, pers.).

Exemplo XXI - Formação e estabilidade do E-p. Em seguida, investigámos o destino do fosfato removido de CSp na presença de L-19 IVS ARN. A pH neutro não se formou fosfato inorgânico durante a reacção, o que foi verificado por cromatografia em camada f ina dos. produtos, da reacção (dados não apresentados). Quando a reacção se dá na presença de C-Sp:*:, torna-se claro que o fosfato é transferido para a L-19 ARN (Fig. 11B) . Q tratamento da L-19 IVS ARN f osforilada (Designada como E-P daqui em diante) com fosfatase alcalina leva à libertação quantitativa da radioactividade sob a forma de fosfato inorgânico. Assim, a desfosforilação do substracto é conseguida por transfosf ori lação. A estrutura do E-p foi determinada; o fosfato é esterificadò através do 3‘’-0 do resíduo guanosina terminal 3'(6414) do ARN (Zaug &amp; Cech, resultados não publicados). 87 35 1 5 52.077Bef: RJW/aniversity Patents-FKA RLbozsmeExample XXI - Formation and stability of E-p. Next, we investigated the fate of the phosphate removed from CSp in the presence of L-19 IVS RNA. At neutral pH no inorganic phosphate was formed during the reaction, which was verified by layer chromatography. reaction products (data not shown). When the reaction occurs in the presence of C-Sp: +: it becomes clear that the phosphate is transferred to the L-19 RNA (Fig. 11B). Treatment of L-19 IVS phosphorylated RNA (designated as E-P hereinafter) with alkaline phosphatase leads to the quantitative release of radioactivity as inorganic phosphate. Thus, the dephosphorylation of the substrate is achieved by transphosphorylation. The structure of E-p was determined; the phosphate is esterified through the 3 '' - 0 of the 3 'terminal (6414) guanosine residue of the RNA (Zaug & Cech, unpublished results). 87 35 1 5 52.077Bef: RJW / aniversity Patents-FKA RLbozsme

A velocidade de conversão de C5p (N.T: 65p no original) em CS—QH + E—p é dependente do pH, com um ótimo próximo do pH S.O.The conversion rate of C5p (N.T: 65p in the original) in CS-QH + E-p is pH dependent, with an optimum near pH S.O.

Mod. 7.1 -10000 ex. - 89/07Mod. 7.1 -10000 ex. - 89/07

10 15 20 25 3010 15 20 25 30

3535

Na fig. 12 encontra-se uma amostragem dos dados. A reacção de transferência de fosfato é essencialmente independente do pH na gama compreendida entre 7.5 e 9, e processa—se a uma velocidade semelhante à da reacçâo de transferência de nucleótidos CFig. 12A). A pH=5 a reacção de transferência de fosfato é acelerada rnais de 20 vezes, equanto a reacção de transferência de nucleótidos não é afectada. A pH=4 a enzima ainda apresenta uma actividade substancial de transferência de fosfato, enquanto a sua actividade de transferência de nucleótidos se encontra fortemente diminuída. Dado que a enzima começa provavelmente a desnaturar-se a pH abaixo de 5 (Zaug, et al., ¢1985) Biochemistrv 24:6211). o perfil da actividade de transferência de fosfato nesta gama reflete provavelmente a inactivação da enzima e não o óptimo de pH para o passo de transferência. As constantes de velocidades resultantes do tratamento de dados semelhantes aos da fig. 12B encontram—se resumidas na Fig. 12C. 0 intermediário covalente formado durante a reacção do pC5— OH com a L-19 IV3 ARN (E-pC) é lábil em condiçSes alcalinas, sofrendo hidrólise a pH 9.0, em que se liberta o nucleòtido pC e se regenera a enzima livre CZaug &amp; Cech, (1986) Science supra). Dado isto, resolvemos investigar a estabilidade do fosfato monoéster na fosfoenzima E-p. NSo há hidrólise detectável do fosfato monoéster a pH 9, condiçSes às quais o E-pC tratado paralelamente originou a libertação de pC, nem a qualque outro pH na gama comprendida entre 7 e 9. 88In Fig. 12 is a sampling of the data. The phosphate transfer reaction is essentially pH-independent in the range of 7.5 to 9, and is run at a rate similar to that of the nucleotide transfer reaction CFig. 12A). At pH = 5 the phosphate transfer reaction is accelerated by more than 20 times, while the nucleotide transfer reaction is not affected. At pH = 4 the enzyme still exhibits substantial phosphate transfer activity, while its nucleotide transfer activity is strongly decreased. Since the enzyme probably begins to denature at pH below 5 (Zaug, et al., 1985) Biochemistry 24: 6211). the profile of the phosphate transfer activity in this range probably reflects the inactivation of the enzyme and not the optimum pH for the transfer step. The rate constants resulting from the processing of data similar to that of Fig. 12B are summarized in Fig. 12C. The covalent intermediate formed during the reaction of pC5-OH with L-19 IV3 RNA (E-pC) is labile under alkaline conditions, undergoing hydrolysis at pH 9.0, where the pC nucleotide is released and the free enzyme CZaug &amp;; Cech, (1986) Science supra). Given this, we resolved to investigate the stability of the monoester phosphate in the phosphoenzyme E-p. There is no detectable hydrolysis of the monoester phosphate at pH 9, conditions to which the parallel treated E-pC gave the release of pC, or any other pH in the range of 7 to 9. 88

\\

5 10 15 62.077Sef: sjw/University Patents-HNA Ribozyme5 10 15 62.077Sef: sjw / University Patents-HNA Ribozyme

Mod. 71-10000 e*. - 39/07Mod. 71-10000 e *. - 39/07

Por outro lado, a pH ácido o fosfato monoéster terminal de E-p sofreu hidrólise lenta . Quando o E-ρ foi incubado a pH 5.0, o fosfato foi libertado sob a forma de Pi com velocidade aprox. igual a 10% /hora. A velocidade é mais lenta a pH 4.0 e a pH 6.0 que a pH 5.0. A libertação do Pi foi também observada durante a reacção do C5p:t com L-19 IVS ARN a pH 5.0 depois da reacção ocorrer 2 e 4h. Assim, a L-19 IVS ARN apresenta actividade de fosfat-ase ácida. Contudo, esta reacção hidrol i ti ca é tão lenta que nem tentámos demonstrar a existência de múltiplos ciclos de catálise.On the other hand, at acidic pH the terminal monoester phosphate of E-p underwent slow hydrolysis. When E-ρ was incubated at pH 5.0, the phosphate was released in the form of Pi with approx. equal to 10% / hour. The rate is slower at pH 4.0 and at pH 6.0 than at pH 5.0. Release of Pi was also observed during the reaction of C5p: t with L-19 IVS RNA at pH 5.0 after the reaction occurred for 2 and 4h. Thus, L-19 IVS RNA exhibits phosphatase-ase activity. However, this hydrolytic reaction is so slow that we did not even try to demonstrate the existence of multiple cycles of catalysis.

Exemplo XIII. A fosforilação da enzima é reversivel. Quando se incuba E-p não marcado com uma quantidade vestigial de C5p$, ocorre muito pouca reacção CFig. ISA). Em contrapartida, quando se incuba o mesmo E-p com uma quantidade vestigial de pC5-0H, forma-se 25 progressivamente pC5p (Fig. 13B). NSo são observados os produtos pC4-QH e pC3-0H que se formam normalmente aquando da reacção do pC5-0H com L-19 IVS ARN em excesso CSaug &amp; Cech, 1985). Assim, o E-p é inactivo como nucleotidiltransferase mas é prontamente 30 submetida a desfosforilação. 35 A reversibilidade da fosfor ilação na L-19 IVS ARN foi confirmada fazendo reagir a enzima com C5p# para formar E-p$, purificando o £-p$ e incubando-o com CS-QH não marcado. Foi produzido um produto marcado correspondente a C5pt Cdados não apresentados). Este critério experimental permitiu testar rápida 89 1 52.077 Kef: RJW/Unxversity Patents-RNA RibozymeExample XIII. Phosphorylation of the enzyme is reversible. When incubating unlabelled E-p with a trace amount of C5β, very little reaction CFig occurs. ISA). In contrast, when the same E-p is incubated with a trace amount of pC5-0H, pC5p is progressively formed (Fig. 13B). The products pC4-QH and pC3-OH that normally form when reaction of pC5-OH with L-19 IVS RNA in excess CSaug &amp; Cech, 1985). Thus, E-p is inactive as nucleotidyltransferase but is readily subjected to dephosphorylation. Reversibility of phosphorylation in L-19 IVS RNA was confirmed by reacting the enzyme with C5Î ± β to form β-Pβ, purifying β-β and incubating it with unlabeled CS-QH. A marked product was produced corresponding to C5-C10 Data not shown). This experimental criterion allowed rapid testing 89 1 52.077 Kef: RJW / Unxversity Patents-RNA Ribozyme

e coerentemente toda urna série de nucleótidos e de 5 oligonucleótidos quanto à sus capacidade para inverter a reacção de fosforilação. Como se mostra na tabela 2, dos oligonucleótidos testados apenas o UCU e o C4U apresentam uma actividade comparável á do CS. Continua a ser possível que outros 10 oligonucleótidos tenham valores de Km elevados e apresentassem actividade detectável a concentrações rnais elevadas.and coherently a whole series of nucleotides and 5 oligonucleotides for their ability to reverse the phosphorylation reaction. As shown in Table 2, of the oligonucleotides tested only UCU and C4U exhibit comparable activity to CS. It is still possible that other 10 oligonucleotides have high Km values and exhibit detectable activity at the highest concentrations.

Exemplo XIV 15Example XIV 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07Mod. 71-10000 ex. - 89/07

35 20 25 30 A L—13 IVS ARN é uma fosfotransferase. As reacções de transferência de fosfato até aqui descritas foram todas efectuadas em excesso de enzima. Para provar que a L-13 IVS ARN podia actuar cataiiticamente, foi necessário demonstrar que cada molécula de enzima podia servir de mediadora na fosforilação de múltiplas moléculas de substracto. Isto foi conseguido incubando a L—19 IVS ARN com CSp:fc em excesso molar e com UCU não marcado em excesso molar ainda maior (para açtuar como aceitante de grupos fosfato). Como se mostra na Fig- I4A, a L-19 ÍVS ARN foi capaz de transferir o fofato terminal 3' do CSp para o UCU. Os resultados do tratamento do produto com RNase de T2, e da cromatografia em camada fina, confirmaram que o fosfato tinha sido transferido de um resíduo C para um resíduo U. A variação em ordem ao tempo apresentada na Fig. 14B foi feita a concentração de enzima mais baixa (0.16 uM), e a concentração de aceitante mais alta (200 uli&gt; que as utilizadas na experiência da Fig.l4A. A quantificação dos dados (Fig. 140 mostra que nestas condições são desfosforiladas 11 moléculas de substracto por molécula de enzima após 120 minutos de reacção. A fosforilação da enzima 90 1 5 10L-13 IVS RNA is a phosphotransferase. The phosphate transfer reactions described so far have all been carried out in excess of enzyme. To prove that L-13 IVS RNA could act catatically, it was necessary to demonstrate that each enzyme molecule could serve as a mediator in the phosphorylation of multiple substrate molecules. This was achieved by incubating L-19 IVS RNA with CSp: fc in molar excess and with unlabelled UCU in still greater molar excess (to be accepted as an acceptor of phosphate groups). As shown in Fig. 14A, L-19βRNA RNA was able to transfer the 3 'terminal peptide from CSp to UCU. The results of treatment of the product with T2 RNase and thin layer chromatography confirmed that the phosphate had been transferred from a residue C to a residue U. The variation in time order shown in Fig. 14B was made the concentration of (Fig. 140) shows that under these conditions 11 molecules of substrate per molecule are dephosphorylated, and the number of substrate molecules per molecule of the substrate is dephosphorylated. enzyme after 120 minutes of reaction Phosphorylation of the enzyme 90 1 5 10

1515

£0/68 - 'Χ3 00001' U 'P°W 20 S2.077 Se£: BJW/University Patents-HNA. Ribozyme£ 0/68 - 'Χ3 00001' U 'P ° W 20 S2.077 If: BJW / University Patents-HNA. Ribozyme

precede a formação de produto em quantidades substanciais , o que é consistente com a hipótese de E-p ser um intermediário obrigatório da reacção. Em condições de estado estacionário, 63¾ da enzima encontra-se sob a forma de E-p.precedes the formation of product in substantial amounts, which is consistent with the hypothesis that E-p is a mandatory reaction intermediate. Under steady-state conditions, 63% of the enzyme is in the form of E-p.

Construção dos plasmídeos pBGST7Construction of plasmids pBGST7

Exemplo XVExample XV

35 25 3035 25 30

Been, Michael D. and Cech, Thomas, R. (19863 Cell 47:207-216 indicam a construção da série de plasmideos pBG. Em geral, o plasrnideo utilizado para estes estudos, o (pSGST73, foi derivado do vector de clonagem pUClS. A metodologia utilizada nas manipulações seguintes é descrita por Maniatis, T., et al. (13823 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor). 0 pUC18 foi parcialmehte digerido com HaelI e as moléculas lineares de dimensão unitária foram isoladas por electroforese em gel de agarose e por electroeluição- 0 ADN recuperado foi tratado com ADN-polimerase do T4, e depois foi desfosforilado com fosfatase do intestino de vitelo. 0 pT7-2 CU.S. Biochemical Corp.3 foi cortado com Pvull e HindIII e tratado com ADN-polimerase de T4, e os fragmentos que continham o promotor do fago T7 foram isolados por electroforese em gel de poliacrilamida e por electroeluição. Gs fragmentos contendo o promotor foram ligados ao pUCIS linearizado e o plasrnideo foi transformado em E. coli (estirpe JM833. As colónias individuais foram recolhidas e a mini-prep(aração) do ADN foi sujeito à pesquisa (por digestão com endonuclease de restrição 3 da 91 1 1In general, the plasmid used for these studies, (pSGST73) was derived from the cloning vector pUClS (pSGST73) The methodology used in the following manipulations is described by Maniatis, T., et al. (13823 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor) pUC18 was partially digested with HaelI and the linear molecules were isolated by agarose gel electrophoresis and by electroelution. The recovered DNA was treated with T4 DNA polymerase and then dephosphorylated with calf intestinal phosphatase. pT7-2 CU.S. Biochemical Corp. was cut with Pvull and HindIII and treated with T4 DNA polymerase, and the fragments containing the T7 phage promoter were isolated by polyacrylamide gel electrophoresis and by electroelution. Fragments containing the promoter were ligated to the linearized pUCIS and the plasmid was transformed into E. coli (strain JM833. The individual colonies were collected and the mini-prep (plowing) of the DNA was subjected to the search (by digestion with restriction endonuclease 3 of 91 1 1

52.07752,077

Bef: RJW/Universxty - Patents-RNA Ribozyrne localização do fragmento promotor do local HaelI correcto (posição 680 no mapa do catálogo da New England Biolabs). A orientação do promotor T7 foi determinada transcrevendo o AON da mini-prep (cortado com EcoRi) com ARN-polimerase de T7, e determinando o tamanho do produto. Este plasmideo (pUT718) foi então cortado no local de clonagern múltipa com Kpnl e Sphl e submetido a um tratamento com ADN-polimerase de T4 seguido de um novo tratamento com fosfatase do intestino de vitelo. Um fragmento de ADN BamHI contendo a IVS foi isolado de pJE457 15Bef: RJW / Universxty - Patents-RNA Ribozyrne location of the promoter fragment from the correct HaelI site (position 680 in the map of the New England Biolabs catalog). The orientation of the T7 promoter was determined by transcribing the mini-prep AON (cut with EcoRi) with T7 RNA polymerase, and determining the size of the product. This plasmid (pUT718) was then cut at the site of multiple clonagern with KpnI and SphI and subjected to treatment with T4 DNA polymerase followed by a new treatment with calf intestinal phosphatase. A BamHI DNA fragment containing the IVS was isolated from pJE457

Mod. 71 -10000 e*. -89/D7 20 25Mod. 71 -10000 e *. -89 / D7 20 25

(Price, J.V. e Cech, T.R. , (198S) Science 228:719-722) tratado com nuclease Sl, extraído com fenol e precipitado em etanol. 0 fragmento tratado com Sl, que apresenta pequenos cortes (deletions) nos dois terminais, foi ligado ao pUT718 cortado com Kpnl e Sphl. A estirpe JM83 da E^_ coli foi transformada com o plasmideo recombinante e clocada num agar LB contendo ampicilina e X-gal ( 5-bromo, 4-cloro, '3-indoil- beta -D galactósido). 0 ADN isolado das colónias azuis foi sujeito à pesquisa de fragmentos intercalares (inserts) com o tamanho da IVS, por - electroforese em geis de agarose. As sequências dos exóes foram determinadas por sequenciação Cdideoxy-sequeneing) do ADN da mini-prep. Idealmente apenas os plasmideos que contenham IVS e exóes que mantém o local de leitura Creading frame) do fragmento do gene lacZ, irão dar origem a colónias azuis, e isto dependerá do processamento da mensagem em E. coli (Uaring, R.B., et al., (1985) Cel 1 4&amp;:371-380; Price, J.V. and Cech, T.R. , (1985) Science 228í719-722). De facto, muitos dos plasmideos que originavam uma cor azul-clara nas colónias tinham exóes para os quais o processamento correcto da IVS não gera os locais de 92 10 15(Price, J.V. and Cech, T.R., (198S) Science 228: 719-722) treated with S-nuclease, phenol extracted and precipitated in ethanol. The Sl treated fragment, which shows small cuts (deletions) at the two ends, was ligated to KpnI and SphI cleaved pUT718. E. coli strain JM83 was transformed with the recombinant plasmid and placed on LB agar containing ampicillin and X-gal (5-bromo, 4-chloro, 3-indolyl-β-D-galactoside). DNA isolated from the blue colonies was subjected to the screening of IVS - sized inserts (fragments) by electrophoresis in agarose geis. The sequences of the exons were determined by Cdideoxy sequencing) of the mini-prep DNA. Ideally only plasmids containing IVS and exons that maintains the Creading frame reading site of the lacZ gene fragment will give rise to blue colonies, and this will depend on the processing of the message in E. coli (Uaring, RB, et al. , (1985) Cell 1 4 &amp;:371-380; Price, JV and Cech, TR, (1985) Science 228, 719-722). In fact, many of the plasmids which gave a light blue color in the colonies had exons for which the correct processing of the IVS did not generate the sites of 92 10 15.

Mod. 71 -1OOOÕ ex. í 89/0.7 20 25 30 ©.077Bef: MW/tJniversity Patents-HNA RLbozynie 23 muMod. 71-10000 ex. 89 / 0.7 20 25 30 © .077Bef: MW / tJniversity Patents-HNA RLbozynie 23 mu

leitura correctos? estes não foram mais investigados. 0 plasmidec pBGST7, que produziu uma colónia azul escura, e que tinha tambén o local de leitura esperado, foi o utilizado para estes estudos. tlutaqénese A mutagénese dirigida nos oligonucleótidos no ADN de plasrnídeos foi efectuada essencialmente como é descrito por Inouye, S. and -Inouye M. &lt;1986) in DNA and RNA Synthesis, 3. Narang, ed. &lt;New York: Academic Press), em impressão. Q ADN .do pBQST7 foi submetido a clivagem com Xmnl no gene que codifica a resistência à ampicilina. Numa reacção separada, o ADN do pBGST7 foi cortado com EcoRI e HindiII nos locais que ladeiam as sequências da IVS e do exão. A porção-vector do plasmídeo foi separada do fragmento contendo a IVS por electroforese em gel de agarose e recuperada por electroeluição. 0 ADN cortado por Xmnl foi misturado com o fragmento-vector na presença de oligonucleótido contendo a base modificada, aquecido a 95° C durante 5 min., colocado a-37? C durante 30 min. e depois a. 4° C durante 30 min, e posto em gelo. Os produtos foram tratados com dNTPs e fragmento Klenow pol I de ADN â temperatura ambiente durante 2 horas. A estirpe JM83 da E^_ coli foi transformada com o ADN e as colónias resistentes à ampicilina foram recolhidas com base na respectiva cor &lt; as cores branca e azul-clara indicam perca de actividade de processamento), e o ADN da miniprep foi sequenciado. Os mutantes duplos foram feitos usando o ADN de plasrnídeos de mutantes simples pesquizando a presença de actividade restaurada da beta-galactosidase. 0 pB6/-2G:23C foi feito a 93 35reading them correctly? these were no longer investigated. Plasmid pBGST7, which produced a dark blue colony, and which also had the expected reading site, was used for these studies. Tougenesis Targeting mutagenesis in the oligonucleotides in plasmid DNA was performed essentially as described by Inouye, S. and -Inouye M. &lt; 1986) in DNA and RNA Synthesis, 3. Narang, ed. &lt; New York: Academic Press), in print. DNA from pBQST7 was cleaved with XmnI in the gene encoding ampicillin resistance. In a separate reaction, the pBGST7 DNA was cleaved with EcoRI and HindIII at sites flanking the IVS and exon sequences. The vector portion of the plasmid was separated from the IVS-containing fragment by agarose gel electrophoresis and recovered by electroelution. DNA cut by Xmnl was mixed with the vector fragment in the presence of oligonucleotide containing the modified base, heated at 95 ° C for 5 min, placed at -37 ° C. C for 30 min. and then to. 4 ° C for 30 min, and put on ice. The products were treated with dNTPs and Klenow pol I fragment of DNA at room temperature for 2 hours. E. coli strain JM83 was transformed with the DNA and ampicillin resistant colonies were harvested based on the respective color &lt; RTI ID = 0.0 &gt; the white and light blue colors indicate loss of processing activity), and the miniprep DNA was sequenced. The double mutants were made using plasmid DNA from single mutants by screening for the presence of restored beta-galactosidase activity. 0 pB6 / -2G: 23C was made at 93 35

©.077© .077

Bef: RJW/Oniversity Patents-ENA Ribozyne partir do pBG/-2G , e dirigiu-se um segundo nucleót-ido à posição 23. 0 pBG/—3G:24C foi feito a partir do pBG/24C usando um oligonucleótido dirigido á posição -3. G pBG/—4G:2SC foi feito gerando um heteroduplex circular a partir do pBG/-4G:2-5C que tinha sido linearizado em posiçSes diferentes. A transformação destes het-eroduplexes origina colónias azuis-escuras e azuis-claras, ambos com frequências baixas. As colónias azuis correspondem â estirpe selvagem e as azuis-claras aos mutantes duplos. □SPTT1A3 □ fragmento Thal do gene do ARN ribossomal da Tetrahymena contém a IVS e pequenas quantidades dos exbes que a ladeiam. Gs ligadores Clinkers) Hind ill foram ligados aos terminais do fragmento Thal e este foi inserido no local do Hind III do poliligador Cpolylinker) dó pSPS2 CNew England Nuclear), que contém o promotor SP6. 0 plasmideo recombinante foi clonado em E. oo1i usando métodos Standard. ΡΪ7ΤΤ1Α3: A construção do pT7TTlA3 foi idêntica à do pSFTT1A3 excepto que o fragmento Thal foi clonado no Cinto the) local Hind III do pT7-2 CU.S. Biochemical Corp.), que contém o promotor T7.Bef: RJW / Oniversity Patents-ENA Ribozyne from pBG / -2G, and a second nucleotide was directed to position 23. 0 pBG / -3G: 24C was made from pBG / 24C using a position-directed oligonucleotide -3. G pBG / 4G: 2SC was done by generating a circular heteroduplex from pBG / -4G: 2-5C which had been linearized at different positions. The transformation of these het-eroduplexes gives rise to dark blue and light blue colonies, both with low frequencies. The blue colonies correspond to the wild strain and the blue colonies to the double mutants. □ SPTT1A3 □ Thal fragment of the Tetrahymena ribosomal RNA gene contains the IVS and small amounts of the exbes that flank it. Clinkers) Hind III linkers were attached to the terminals of the Thal fragment and this was inserted into the Hind III site of the polylinker Cpolylinker (pSPS2 CNew England Nuclear), which contains the SP6 promoter. The recombinant plasmid was cloned into E. coli using standard methods. ΡΪ7ΤΤ1Α3: The construction of pT7TT1A3 was identical to that of pSFTT1A3 except that the Thal fragment was cloned into the Hind III site of pT7-2 CU.S. Biochemical Corp.), which contains the T7 promoter.

Plasmideo pT7 L-21 G pBGST7 Cdescrito por Been &amp; Cech, C138S) Cell £7:207) foi submetido a clivagem com as endonucleases de restrição Sphl e 34 5 10 15 -lOOOffex,: : fs·i .. 20Plasmid pT7 L-21G pBGST7 Described by Been &amp; Cech, C138S) Cell £ 7: 207) was cleaved with the restriction endonucleases SphI and 34510-1500Offex,

25 3025 30

S 35S 35

©.077 Sef: BJM/University Patents-KNA. RibozymeSEQ: BJM / University Patents-KNA. Ribozyme

Hind III, e purificou-se o pequeno fragmento contendo a IVS sem os seus primeiros 44 nucieótidos. 0 pUCIS foi submetido . a clivagem com SpH I e Hind III, misturado com o fragmento cortado pela Sphl e Hind III e tratado com ADN-ligase. Transformaram-se as células de E.co1i escolheram-se as colónias, o plasmideo foi isolado de colónias individuais e sequenciado. Foi seleccionado para os passos seguintes um plasmideo contendo o fragmento da IVS cortado por Sphl e Hind III correctamente inserido no pUCIS. Este plasmideo foi submetido a clivagem com as endonucleases de restrição Sphl e EcorI e inseriu-se um oligonucleótido sintético no plasmideo usando ADN-ligase. Q oligonucleótido sintético continha metade do local de restrição da ÉcorI, o promotor T7 e os nucieótidos 22-44 da IVS da Tetrahvmena. terminando no local da Sphl. Transformàram-se as colónias de £. coli, escolheram-se as colónias, isolou-se e sequenciou-se o ADN do plasmideo de colónias individuais. Verificou-se por análise à sequência que o plasmideo final pT7L-21' continha &quot;o promotor T7 correctamente justaposto ao nucleótido 22 da IVS Cvejam-se as Figs. 16 e 19). Este método pode ser utilizados para criar troços de ARN previamente definidos. Por exemplo, esses troços definidos podem ser os troços terminais 5' OH ou 3' OH, ou troços centrais contendo o sitio activo, para o estudo e produção de formas variantes de ARN. 95 f γ·.Hind III, and the small fragment containing the IVS was purified without its first 44 nucleotides. The pUCIS was submitted. cleavage with SpH I and Hind III, mixed with the fragment cut by SphI and Hind III and treated with DNA ligase. The E. coli cells were transformed into colonies, the plasmid was isolated from individual colonies and sequenced. A plasmid containing the SphI and Hind III cleaved IVS fragment was successfully selected for the next steps in pUCIS. This plasmid was cleaved with the restriction endonucleases SphI and EcorI and a synthetic oligonucleotide was inserted into the plasmid using DNA ligase. The synthetic oligonucleotide contained half the EcorI restriction site, the T7 promoter, and the Tetrahvmena IVS nucleotides 22-44. ending at the Sphl site. The colonies were transformed. coli, the colonies were selected, the plasmid DNA from individual colonies isolated and sequenced. It was verified by sequence analysis that the final plasmid pT7L-21 'contained the T7 promoter correctly juxtaposed to nucleotide 22 of the IVS. See Figs. 16 and 19). This method can be used to create sections of previously defined RNA. For example, such defined sections may be the 5 'OH or 3' OH end sections, or core sections containing the active site, for the study and production of variant forms of RNA. 95 f γ ·.

52.077 Bef: RJW/University Patents-KNA Rtbozyme52.077 Bef: RJW / University Patents-KNA Rtbozyme

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 TABELA I - Locais de clivagem de substractos ARN de grandes dimensões pela L-19 IVS ARN selvagemMod. 71 -10000 ex. - 89/07 TABLE I - Cleavage sites of large RNA substrates by the L-19 IVS wild-type RNA

Substracto Local Tamanho Cnt) sequência 10 1 (h 1 H pAl &gt;105 (l-globln prt-mRNA) 1 148 uccucu ^CCCUC 2 464 AACUC0 AAGAG PT' -1 (pBR322) ’ 1 145 UCCCUU 0UUUG 15 2 556 CACUCU CAGUA 3 603 UAUUUU cuccu 4 ,605 OCCUCU AGAGU Consenso observado · 20 ujcucu esperado c | CjjCUCUSubstrate Local Size Cnt) sequence 10 1 (h 1 H pAl> 105 (1-globlin prt-mRNA) 1 148 uccucu ^ CCCUC 2 464 AUCAG AAGAG PT '-1 (pBR322) 1 145 UCCCUU 0UUUG 15 2 556 CACUCU CAGUA 3 603 UAUUUU cuccu 4, 605 OCCUCU AGAGU Consensus observed · 20 expected ccjCUCU

C*3 Tamanho do fragmento marcado com STP CT3 As sequências estão apresentadas na direcçao 5'-3&quot;. As setas indicam os locais de clivagem e de adição de guanosina.C * 3 Size of the STP CT3-labeled fragment The sequences are given in the 5'-3 "direction. The arrows indicate the cleavage and addition sites of guanosine.

¢¢) A sequência-consenso prevista é baseada na sequência conhecida no terminal do exão 5&quot; CCUCUCU3, modificada tendo em conta que tanto C como U na posição -5 podem emparelhar-se com G no sitio activo. Há evidência que leva a pensar que uma C não seja tão boa como uma U na posição -l.CDavies, R.W. , et al., C19823 Nature 300:710-724? Michel, F. et al., ¢19833 EMBQ J. 2:33-38? Inoue, T., et al., C19863 J. Mol.BiOl. 189:143-1653 96 10 15The expected consensus sequence is based on the known sequence at the exon 5 terminus &quot; CCUCUCU3, modified taking into account that both C and U in the -5 position can pair with G in the active site. There is evidence to suggest that a C is not as good as a U in the -l.CDavies, R.W. , et al., C19823 Nature 300: 710-724; Michel, F. et al., 19833 EMBQ J., 2: 33-38; Inoue, T., et al., C19863 J. Mol.BiOl. 189: 143-1653

Mod. 71 -10000 ex. - 89/Ú7 20 25 30 52.077Bef: RJW/University Patents-BNA RxbozymeMod. 71 -10000 ex. - 89 / Ú7 20 25 30 52.077Bef: RJW / University Patents-BNA Rxbozyme

UTP CTP uc ccAA CU uu cuAUUUTP CTP CU CU CU CU

Aceitante — Actividade relativa dos diferentes ac e itado r es na t r ansf osf orilação. Actividade Aceitante Actividade - ~ uuu 1 ' - ucu - ccu +/“ - AU, - - cu, - - c4u ++ - c, ++ - ué +/- · ! — dC, E-p foi incubado com oligonucleótido Cou mono- ou dinucleótido) 10 uM, em MgC12 20 mM e Tris-HCl 50 mH, pH=7.S, a 42 °C durante 30 minutos. A transferência do fosfato para o oligonucleótido foi avaliada. . por- . ..eleetroforese em gel sequenciador e. auto-radiografia. ++, actividade apro:-íimadamente igual a de CSj +/-, actividade dificilmente detectável (cerca de 1% da de C5).s - , actividade não detectada nestas condiçSes. 97 35Acceptor - Relative activity of the various acylated esters in the antiphosphorylation. Accepting Activity Activity - - - - - - - - - - - c4u ++ - c, ++ - ué +/- ·! - dC, E-p was incubated with 10æM Cou mono- or dinucleotide) oligonucleotide in 20 mM MgCl 2 and 50 mM Tris-HCl, pH = 7.S, at 42 ° C for 30 minutes. Transfer of the phosphate to the oligonucleotide was evaluated. . per- . ..electrophoresis in sequential gel e. auto-radiography. ++ activity, approximately equal to that of CSj +/-, activity hardly detectable (about 1% of C5)., activity not detected under these conditions. 97 35

1 TABELA '3 - Parâmetros cinéticos da reaccão de clivagem de1 TABLE 3 - Kinetic parameters of the cleavage reaction of

substractos oligonucleótido com a L-21 Seal ARN 5 mal emparelhadooligonucleotide substrates with the mismatched L-21 Seal RNA 5

Substracto kcat Km kcat/Km à6J -5 -3 ímin-1) (uM) ímin-ΙμΜ-Ι) (Kcal/mol) 10 15 -* -J . GGCÇCÇCU1AAAAA GGCÇCACUAAAAA GCCÇCgCUAAAAA GGCÇCACUAAAAA GGQ&gt;C£CUAAAAA GGCyC^CUAAAAA GGCyCQCUAAAAÂ GGCyCliCUAAAAA CA 3.7 0.14 . A-A 1.7 0.3 G-A 1.0 0.3 0.04 i 0.01 0.16 ±0.06 U-G , C-A 7.2 6.3 U-G A-A 1.0 3.9 • U-G 1 G-A 0.7 1.7 U-G 0.15 0,13Subscript kcat Km kcat / Km to 6J -5 -3 (min -1) (uM) (min-ΙμΜ-Ι) (Kcal / mol) GGCÇCÇCU1AAAAA GGCÇCACUAAAAA GCCÇCgCUAAAAA GGCÇCACUAAAAA QAG &gt; C £ ^ CUAAAAA GGCyC CUAAAAA GGCyCQCUAAAAÂ GGCyCliCUAAAAA CA 3.7 0:14. A-A 1.7 0.3 G-A 1.0 0.3 0.04 i 0.01 0.16 ± 0.06 U-G, C-A 7.2 6.3 U-G A-A 1.0 3.9 • U-G 1 G-A 0.7 1.7 U-G 0.15 0.13

— · 26 6 -6.7 3 -6.7 0.3 -10.9 1 -3.6 . 0.3 -3.6 0.4 -3.6 | j &gt; -7.S- · 26 6 -6.7 3 -6.7 0.3 -10.9 1 -3.6. 0.3 -3.6 0.4 -3.6 | j &gt; -7.S

Mod. 71-10000 ex. 89/07 20 ( ) Qs substractos foram incubados com L-21 Seal ARN 0.01 uM em condições reaecionais standâdard a 502 C na ausência de ureia Cveja-se Materiais e Métodos). No caso do substracto GGCÇCUCUA5, efectuaram-se três análises cinéticas completas abrangendo a gama de concentrações de substracto entre 0.1 e C ) uM. Encontrâm-se tabelados o valor médio de kcat +- (desvio padrão), e os valores ’ 25 de Km determinados a partir dos três gráficos de Lineweaver-Burk.Mod. 71-10000 ex. Substrates were incubated with 0.01æM L-21 Seal RNA under standard conditions at 50Â ° C in the absence of urea (see Materials and Methods). In the case of substrate GGCUCCUCUA5, three complete kinetic analyzes were performed covering the range of substrate concentrations between 0.1 and 3 μM. The average value of kcat + - (standard deviation), and the values of 25 Km determined from the three Lineweaver-Burk charts, are tabulated.

Em todos os outros casos, kcat e Km foram estimados com base em medidas efectuadas a concentrações de substracto iguais a 0.10 e 1.0 uM. Embora o valor relativo dos valores de kcat e de Km fosse reprodutível nas várias experiências, os valores absolutos variaram, de um factor máximo igual a dois. Cb) Variação da energia livre estimada para a formação do complexo ribozima-substracto a 502 C, baseada em parâmetros termodinâmicos obtidos 30 de estudos com oligorribonucleôtidos (Freier et al., 1386), s corrigidos para 502 C usando os valores para á H2 e β S2 determinados por TurnerC comunicação pessoal). Estes parâmetros partem do principio de que todos os maus emparelhamentos sao igualmente desestabilizadores; medidas termodinâmicas sobre o efeito dos maus emparelhamentos no ADN indicam que um mãe emparelhamento C.A é menos estável que os maus emparelhamentos A.A ou G.a (Aboul-ela et al. 198-5). 38 52.077In all other cases, kcat and Km were estimated based on measurements performed at substrate concentrations of 0.10 and 1.0æM. Although the relative value of the kcat and Km values was reproducible in the various experiments, the absolute values varied by a factor of two. Cb) free energy variation estimated for the formation of the ribozyme-substrate complex at 502 C, based on thermodynamic parameters obtained from 30 studies with oligoribonucleotides (Freier et al., 1386) are adjusted to 502 C using the values for the H2 and β S2 determined by TurnerC personal communication). These parameters start from the principle that all bad pairings are equally destabilizing; thermodynamic measures on the effect of poor DNA pairings indicate that a C.A pairing mother is less stable than the mismatches A.A or G.a (Aboul-ela et al., 198-5). 38 52,077

Bef: RJW/University Patents-KNA RlbozynieBef: RJW / University Patents-KNA Rlbozynie

GGCCCCGCUA5GGCCCCGCUA5

TABELA urei afecta a c 1 ivagem de pr incipaImante devi do à muda nça do :cat. Cureia3 Km Vmax kcat kcat/Km CM) CpM) CjjM m i n-í) C mi η—1&gt; (μΜ-1 min 0 0.89 0.020 2.0 2.2 LO 0.83 0.025 2.5 3.0 1J 0.50 0.016 1.6 3.2 2.0 0.74 0.009 0.9 1.2 2.5 0.70 0.004 0.4 0.6 15TABLE 1 affects the amount of prcentant due to the change of cat. Cure 3 Km Vmax kcat kcat / Km CM) CpM) Cmax m i n-1) C mi η-1 &gt; (μΜ-1 min 0 0.89 0.020 2.0 2.2 LO 0.83 0.025 2.5 3.0 1J 0.50 0.016 1.6 3.2 2.0 0.74 0.009 0.9 1.2 2.5 0.70 0.004 0.4 0.6 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 30 C ) Dados da figura 5. A temperatura foi de 502 C. '39 35Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 30 C) Data of figure 5. The temperature was 502 C. 39

52.07752,077

Ref: RJW/University Patents-RKA Ribozyme 5 TABELA 5 - Nome da Especificidade** Interseção μ X * Ribozima * r ibozima-substrac toRef: RJW / University Patents-RKA Ribozyme 5 TABLE 5 - Specificity Name ** Intersection μ X * Ribozyme * r ibozyme-substrate

Condições reacc ionais J: x *Reaction conditions J: x *

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 30Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 30

JC 10 20 25 Ribozima selvagem 5' -GAG C U C GTP 5'-6GGACC0C G^At | | | | . como foi descrito Ribozimas variantes ^-G G £ A £ G &quot;5' 3' GCC &lt;C) G G C 0^ GGG~ACGGC 0½¾ 1 1 1 Ια G £ £ S G © 20 mM MgCl, 2.5 M Urea 50 mM Tris pH 7.5 0.5 mM GTP GGT (C) iCC^ GGGACACC 0J-A5 .1111· G G 3. S £ G igual a ®‘ TGT (C) A C A. 0^ GGGACACA 0^&quot;Ag IIM· 5 5 5'Sje @ 600 mM MH.Ac 20 mM MgCl2 50 mM Tris pH 7.5 0.5 mM GTP TTA (C) ϋ A A 0^ GGGACOAA O^Ac MM · G G A 2 U G © 100 mM NH.Ac 20 mM MgCl2 50 mM Tris pH 7.5; 0.5 mM GTP TTC (C) G A A U-*· GGGACGAA D^Ae I 1 l-l · G G £ 0 Π G igual a @ AAT (C) A 0· 0 0^ GGGACAU0 O^Ag 1 Ml· G G a A A G 20 mM MgCl2 50 mM Tris pH 7.5 0.5 mM GTP ou igual a @ Ofc) A designação do sitio activo C à sequência do das ribozimas faz-se de acordo com a sequência 2ã, 32 e 4â posições!, determinadas por análise ADN do plasmideo que codifica a ribozima. A primeira posição é sempre G, por isso não é incluída na designação.JC 10 20 25 Wild ribozyme 5'-GAG C U C GTP 5'-6GGACC0C G 'At? | | | . as described variant ribozymes ^ -GG £ A £ L &quot; 5 '3' GCC &lt; C) GGC 0 ^ GGG ~ ACGGC 0½¾ 1 1 1 Ια L £ £ SG © 20 mM MgCl, 2.5 M Urea 50 mM Tris pH 7.5 mM GTP 0.5 GGT (C) BCi GGGACACC ^ 0J-A5 .1111 · GG 3 S £ ® L equal to 'TGT (C) AC GGGACACA A. ^ 0 ^ 0 &quot; IIM · 5 Ag @ 5 5'Sje 600 mM MH.Ac 20 mM MgCl2 50 mM Tris pH 7.5 0.5 mM GTP TTA (C) ϋ AA 0 G GGGACOAA Ac Ac MM Ac GGA U 100 mM NH.Ac 20 mM MgCl 2 50 mM Tris pH 7.5; 0.5 mM GTP TTC (C), GAA GGGACGAA U- * · D ^ Ae · I 1 II XL £ 0 @ Π L equal to AAT (C) · A 0 0 0 O ^ ^ GGGACAU0 Ag 1 · M-20mM AAG GG The designation of the active site C to the sequence of the ribozymes is according to the sequence 2Î ±, 32 and 4â † 'positions determined by DNA analysis of the plasmid encoding to ribozyme. The first position is always G, so it is not included in the designation.

Ct:*:) - A seta representa o local de adição do GTP. 0 CC) representa um nucleótido cuja contribuição para a clivagem não foi avaliada. ( ) - Em cada diagrama, a cadeia superior representa o substracto oligorribonucleótido testado. A cadeia inferior representa o troço da sequência da ribozima que faz parte do centro activo e que determina a especificidade em relação ao substracto. Qs nucleótidos sublinhados indicam as posições em que á baseada a designação da ribozima. (Note-se que a direcção 5'-3' corresponde à direcção da esquerda para a direita para a cadeia inferior, e da direita para a esquerda para a cadeia superior. Note-se igualmente que a um T no AQN corresponde um U no ARN). &lt;$***) - NH4Ac corresponde a NH4C2H302. 100Ct: * :) - The arrow represents the GTP addition place. 0 CC) represents a nucleotide whose contribution to cleavage has not been evaluated. () - In each diagram, the upper strand represents the oligoribonucleotide substrate tested. The lower strand represents the portion of the ribozyme sequence which forms part of the active site and which determines the specificity in relation to the substrate. Underlined nucleotides indicate the positions on which the ribozyme designation is based. (Note that the direction 5'-3 'corresponds to the left to right direction for the lower chain, and from the right to the left for the upper chain. It should also be noted that a T in the AQN corresponds to a U in the RNA). &lt; $ ***) -NH4Ac corresponds to NH4C2H302. 100

Claims (1)

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S 1 10 15 62077 RJW/University Patents-RNA RibozymeS 1 10 15 62077 RJW / University Patents-RNA RibozymeMod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 - REIVINDICAÇÕES - 1ã.- Método para a clivagem específica de uma molécula RNA separada caracterizado por se proporcionar uma molécula RNA enzimática que tem uma actividade endonuclease independente de qualquer proteína, sendo a referida actividade endonuclease específica para uma sequência nucleótida que define um local de clivagem na molécula RNA separada, e por se pôr em contacto as referidas molécula RNA enzimática e molécula RNA separada para permitir que a referida actividade endonuclease provoque a clivagem específica da referida molécula RNA separada na referida sequência nucleótida/ 2â.— Método de acordo com a reivindicação 1 em que a molécula RNA enzimática tem uma actividade endonuclease independente de qualquer proteína, sendo a referida actividade endonuclease específica para uma sequência nucleótida que define um local de clivagem numa molécula RNA separada, caracterizado por o referido local de clivagem ser escolhido entre GGCXJ, ACCC, ACAU, UAAU, GAAU e ADUU. 3i.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado também por a referida molécula RNA enzimática ser separada de outras moléculas RNA e oligonucleótidos. 4ã.- Método de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado também, por a referida actividade endonuclease ser específica para uma sequência nucleótida que define um local de clivagem constitui-do essencialmente por uma zona de faixa única. 5â.- Método ce acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 3, caracterizado também por a referida actividade endonuclease dar origem a clivagem no referido local de clivagem por uma reacção de tran-sesterificação, 6â.- Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado também por a referida molécula RNA enzimática compreender uma zona local activa substancialmente homóloga da zona de local activa de uma molécula RNA existe naturalmente em Tetrahyrnena. - 101 - 35 4 1 10 15 62077 BJW/Univers ity Patents-RNA RibozymeMod. 71-10000 ex. A method for the specific cleavage of a separate RNA molecule characterized in that there is provided an enzymatic RNA molecule having an endonuclease activity independent of any protein, said endonuclease activity being specific for a sequence nucleotide defining a cleavage site in the separate RNA molecule, and if contacting said enzymatic RNA molecule and separate RNA molecule to allow said endonuclease activity causes the specific cleavage of said separate RNA molecule in said sequence nucleotide / 2A. The method of claim 1 wherein the enzymatic RNA molecule has an endonuclease activity independent of any protein, said endonuclease activity being specific for a nucleotide sequence that defines a cleavage site on a separate RNA molecule, wherein said locus of cleavage to be chosen between GGCXJ, ACCC, ACAU, UAAU, GAAU and ADUU. The method of claim 1, further characterized in that said enzymatic RNA molecule is separated from other RNA molecules and oligonucleotides. 4. A method according to claims 2 or 3, characterized in that said endonuclease activity is specific for a nucleotide sequence that defines a cleavage site consisting essentially of a single band zone. 5. A method according to any one of claims 2 to 3, characterized in that said endonuclease activity gives rise to cleavage at said cleavage site by a transesterification reaction. 6. A method according to claim 5, characterized in that said enzymatic RNA molecule comprises an active local zone substantially homologous to the active site site of an RNA molecule which naturally exists in Tetrahynene. - 101 - 35 4 1 10 15 62077 BJW / Universe Patents-RNA RibozymeMod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 7a.- Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado também por as referidas moléculas RNA enzimã-ticas terem um pH õptino para a referida actividade endonuclease entre 7,5 e 8,0. 8â.— Método de acordo ccm uma qualquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado também por a referida actividade endonuclease necessitar da presença de iões magnésio, um desnaturante ou um derivado de guanina. 9â.- Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 6, caracterizado também por a referida actividade endonuclease necessitar da presença de um catião divalente. 10ã.- Método de acordo com a reivindicação 9, caracteri·· zado também por o referido catião divalente ser Mg^+. 11a.- Método de acordo com a reivindicação 6, caracteri·· zado também por a referida molécula RNA enzimãtica compreender substan-cialmente a sequência de base ribonucleõtida de sequência SNA. interveniente L-19 que tem uma sequência de base nucleõtida no seu local activo diferente da da L-19 isolada a partir de Tetrahymena. 12i.- Método de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado também por o referido local activo estar localizado em posições 22 a 25 numa sequência RNA interveniente isolada a partir de Tetrahymena. Lisboa, $01990 Por UNIVERSITY PAEENTS INC. 0 AGENTE OFICIALMod. 71-10000 ex. 7. A method according to any one of claims 2 to 6, further characterized in that said enzymatic RNA molecules have a β-pentane pH for said endonuclease activity of between 7.5 and 8.0. 8. The method of any one of claims 2 to 6, wherein said endonuclease activity requires the presence of magnesium ions, a denaturant or a guanine derivative. 9. The method of any one of claims 2 to 6, wherein said endonuclease activity also requires the presence of a divalent cation. 10. A method according to claim 9, further characterized in that said divalent cation is Mg ++. 11. A method according to claim 6, further characterized in that said enzymatic RNA molecule substantially comprises the sequence of ribonucleotide base of sequence SNA. L-19 moiety having a nucleotide base sequence at its active site other than that of L-19 isolated from Tetrahymena. 12. A method according to claim 6, further characterized in that said active site is located at positions 22 to 25 in an intervening RNA sequence isolated from Tetrahymena. Lisbon, $ 01990 By UNIVERSITY PAEENTS INC. 0 OFFICIAL AGENTVASCO MAXQOES UtiV Afenle O|iciol 4« Propriedade Industriei ^ Certórt· - Arco 4· Conceiçio, 3, MMNNI - 102 - 35VASCO MAXQOES UtiV Afenle O | iciol 4 Industrial Property Certórt - Arco 4 · Conceiçio, 3, MMNNI - 102 - 35