Denne oppfinnelse vedrører en overflate-hydratisert, porøs gjenstand omfattende polyakrylonitril eller en kopolymer deray, hvori polyakrylonitrilet består av en ikke-komprimerbar polyakrylonitrilkjerne med en hydrofil overflate, innbefattet de indre vegger i porene, som hovedsakelig består av jevnt fordelte amidgrupper som er dannet ved hydrolysering av nitriloverflate-gruppene, og en fremgangsmåte for fremstilling derav. Spesielt vedrører denne oppfinnelse porøse polyakrylo-nitrilkuler. Videre vedrører denne oppfinnelse substrater slik som porøse polyakrylo-nitrilkuler, med senere beskrevne funksjonaliserte grupper for å danne komplekser med biologisk aktive forbindelser for å separere nevnte forbindelser fra løsninger. Slike kuler er ideelt egnet til anvendelse i kromatograferingsseparasjonsprosesser, méns andre typer slik som hule fibre og membraner kan anvendes i separasjon slik som nyredialyse.This invention relates to a surface-hydrated, porous article comprising polyacrylonitrile or a copolymer deray, wherein the polyacrylonitrile consists of a non-compressible polyacrylonitrile core with a hydrophilic surface, including the inner walls of the pores, which mainly consist of uniformly distributed amide groups formed by hydrolysis of the nitrile surface groups, and a method for producing them. In particular, this invention relates to porous polyacrylonitrile spheres. Furthermore, this invention relates to substrates such as porous polyacrylonitrile spheres, with later described functionalized groups to form complexes with biologically active compounds to separate said compounds from solutions. Such beads are ideally suited for use in chromatography separation processes, while other types such as hollow fibers and membranes can be used in separations such as renal dialysis.
Faste ikke-svellbare polymere materialer som har nøytrale, hydrofile overflater, er anvendbare i forbindelse med proteinløsninger for mange formål. Disse inkluderer kromatograferingsbærere, membraner, bærere for immobiliserte enzymer eller immunoassaybærere. Hydrogenering av polyakrylo-nitriloverflater for å danne akrylamidgrupper er vel kjent.Solid non-swellable polymeric materials having neutral, hydrophilic surfaces are useful in conjunction with protein solutions for many purposes. These include chromatography supports, membranes, supports for immobilized enzymes or immunoassay supports. Hydrogenation of polyacrylonitrile surfaces to form acrylamide groups is well known.
Stoy, US-patent nr. 4 110 529, beskriver innføring av reaktive grupper i overflatelaget til kuler under koagulering. Eksempel 5 i Stoy-patentet beskriver den delvise hydrogenering av et polyakrylonitril til 40% amidgrupper og så koagulering for å danne porøse kuler. Imidlertid er kuler fremstilt på denne måte sterkt svellbare i vann og inneholder en vesentlig mengde av biprodukt karboksylatgrupper i tillegg til de ønskete amidgrupper. Således er kulene ikke spesielt anvendbare som kromatografiske bærere. Deres tendens til å svelle resulterer i veldige trykkfall og springende strømhastigheter i kromatografiske kolonner, og tilstedeværelse av karboksylatgrupper forårsaker ikke-spesifikk binding i separasjonsprosesser som ikke involverer ionebytte. Problemer fremkommer også fra den høye, 40%, amidomdannelses-hastighet, da høy omdannelse til amidgrupper resulterer i betydelige tap iStoy, US Patent No. 4,110,529, describes the introduction of reactive groups into the surface layer of spheres during coagulation. Example 5 of the Stoy patent describes the partial hydrogenation of a polyacrylonitrile to 40% amide groups and then coagulation to form porous spheres. However, spheres produced in this way are highly swellable in water and contain a significant amount of by-product carboxylate groups in addition to the desired amide groups. Thus, the spheres are not particularly useful as chromatographic carriers. Their tendency to swell results in large pressure drops and jumpy flow rates in chromatographic columns, and the presence of carboxylate groups causes non-specific binding in separation processes that do not involve ion exchange. Problems also arise from the high, 40%, amide conversion rate, as high conversion to amide groups results in significant losses in
kromatografisk strøm på grunn av tap av kulefasthet.chromatographic flow due to loss of bead strength.
Andre forsøk på å omdanne nitrilgrupper til amider tidligere har medført behandling med sterke syrer eller baser. Begge disse teknikker fører hovedsakelig til noe dannelse av overflatekarboksylgrupper. Rigopolous, US-patent nr. 4 143 2 03 beskriver faste partikler som har en impermeabel fast polyakrylonitrilkjerne med en hydrolysert overflate. Overflaten hydrolyseres ved å varme opp de faste polyakrylo-nitrilpartikler i en løsning av svovelsyre ved temperaturer som varierer fra 75-95"C. Imidlertid er kuler dannet under disse betingelser ikke-porøse og har en vesentlig mengde av biprodukt karboksylgrupper; og er således ikke anvendbare i ikke-ionebytteprotein-spesifikke kromatografiske anvendelser.Other attempts to convert nitrile groups into amides have previously involved treatment with strong acids or bases. Both of these techniques lead mainly to some formation of surface carboxyl groups. Rigopolous, US Patent No. 4,143,203 discloses solid particles having an impermeable solid polyacrylonitrile core with a hydrolyzed surface. The surface is hydrolyzed by heating the solid polyacrylonitrile particles in a solution of sulfuric acid at temperatures varying from 75-95°C. However, spheres formed under these conditions are non-porous and have a significant amount of by-product carboxyl groups; and thus are not useful in non-ion exchange protein-specific chromatographic applications.
Overflatemodifiseringen av polyakrylonitril under basiske betingelser ble studert av K. Ohta et al., Nippon Kagaku Kaishi, 6, 1200 (1985) ved å anvende infrarød overflate-spektroskopi. Etter behandling av polyakrylonitril-filmer med 5% natriumhydroksyd i 4 timer ved 70°C, fant 4,5% amid og 5,7% karboksylatgrupper på overflaten. Behandling av filmen med 5% natriumhydroksyd. og 15% hydrogenperoksyd (en vandig alkalisk peroksydreaksjon) i 4 timer ved 70°C ga 2,1% amid og 0,7% karboksylat. Disse behandlinger er heller ikke tilstrekkelig selektive.The surface modification of polyacrylonitrile under basic conditions was studied by K. Ohta et al., Nippon Kagaku Kaishi, 6, 1200 (1985) using infrared surface spectroscopy. After treating polyacrylonitrile films with 5% sodium hydroxide for 4 hours at 70°C, 4.5% amide and 5.7% carboxylate groups were found on the surface. Treatment of the film with 5% sodium hydroxide. and 15% hydrogen peroxide (an aqueous alkaline peroxide reaction) for 4 hours at 70°C gave 2.1% amide and 0.7% carboxylate. These treatments are also not sufficiently selective.
Således har den foreliggende teknikkens stand fortsatt alvorlige ulemper når det gjelder dannelse av høyt selektive ikke-svellbare høyt porøse akrylonitrilpolymere kuler som har nøytrale hydrofile overflater. Dess større overflateområde av høyt porøse kuler og den lille diameter i polymerstrukturen gjør det vesentlig å kontrollere nøyaktig graden av hydrogenering. Omdannelse av mer enn 10% av nitrilgruppene til amidgrupper resulterer i betydelige tap i strøm i kromato-graf eringsseparasjoner. Det er vanskelig å kontrollere nøyaktig graden av reaksjon med sur hydrogenering. Sur hydrogenering er også kjent for å ha sterk sidegruppevirkning som danner en "blokk"-polymerstruktur. En blokkpolymerstruktur ved lav omdannelse kan resultere i ikke-uniform dekning av overflaten. Igjen forårsaker dette problemer med ikke-spesifikk binding i kromatograferingsanvendelser. Et tredje problem med sur hydrogenering er dannelse av karboksyl- og imidgrupper. Tilstedeværelse av karboksylgrupper forårsaker uønskete ionevekslevirkninger under størrelsesekslusjon eller affinitetskromatograferingsanvendelser.Thus, the present state of the art still has serious disadvantages in terms of forming highly selective non-swellable highly porous acrylonitrile polymeric spheres having neutral hydrophilic surfaces. Its larger surface area of highly porous spheres and the small diameter of the polymer structure make it essential to precisely control the degree of hydrogenation. Conversion of more than 10% of the nitrile groups to amide groups results in significant losses in current in chromatographic separations. It is difficult to precisely control the degree of reaction with acid hydrogenation. Acid hydrogenation is also known to have strong side group action that forms a "block" polymer structure. A block polymer structure at low conversion can result in non-uniform coverage of the surface. Again, this causes problems with non-specific binding in chromatography applications. A third problem with acidic hydrogenation is the formation of carboxyl and imide groups. The presence of carboxyl groups causes undesirable ion exchange effects during size exclusion or affinity chromatography applications.
Overraskende nok har de foreliggende oppfinnere funnet at alkalisk peroksydhydratisering av nitriler med forsiktig kontroll av løsningsmiddelet kan omgå disse problemer. Reaksjonen omdanner selektivt nitrilgrupper til amidgrupper uten bireaksjoner til imid- eller karboksylgrupper.Surprisingly, the present inventors have found that alkaline peroxide hydration of nitriles with careful control of the solvent can circumvent these problems. The reaction selectively converts nitrile groups to amide groups without side reactions to imide or carboxyl groups.
I henhold til den foreliggende oppfinnelse er den innledningsvis nevnte overflate-hydratiserte, porøse gjenstand særpreget ved at amidgruppene omfatter mellom 1 mol% til mindre enn 15 mol% av de totale nitrilgrupper, at overflaten er uten eller i alt vesentlig uten imid- eller karboksyl-grupper, og at gjenstanden i det vesentlige er ikke-svellbar i vann og ikke komprimerbar.According to the present invention, the initially mentioned surface-hydrated, porous object is characterized by the fact that the amide groups comprise between 1 mol% to less than 15 mol% of the total nitrile groups, that the surface is without or essentially without imide or carboxyl groups, and that the object is essentially non-swellable in water and not compressible.
Produktet fremstilles ifølge oppfinnelsen vedThe product is produced according to the invention by
a) oppslemming i et væskeformig ikke-løsningsmiddel for et porøst substrat av (i) det porøse substrat omfattende polyakrylonitril eller en kopolymér derav; oga) slurrying in a liquid non-solvent for a porous substrate of (i) the porous substrate comprising polyacrylonitrile or a copolymer thereof; and
(ii) en alkalisk katalysator; og eventuelt(ii) an alkaline catalyst; and eventually
(iii) av et reaksjonsadditiv til nevnte suspensjon;(iii) of a reaction additive to said suspension;
b) tilsetning av et peroksyd til nevnte oppslemming og oppvarming av denne oppslemming inntil mellom 1 mol% og 15b) adding a peroxide to said slurry and heating this slurry to between 1 mol% and 15
mol% av de totale nitrilgrupper er hydratisert tilmol% of the total nitrile groups are hydrated to
amidgrupper; eventueltamide groups; possibly
c) redusering av i det minste en del av nevnte amid, nevnte nitril eller en blanding av disse til amingrupper,c) reducing at least part of said amide, said nitrile or a mixture of these to amine groups,
eventuelt succinylering av nevnte amingrupper for å omdanne i det minste en del av dem til grupper som inneholder karboksyl-grupper på enden av den tilheftende gruppe, eventuelt under aktivering av reaksjonen medoptionally succinylation of said amine groups to convert at least part of them into groups containing carboxyl groups at the end of the attaching group, optionally during activation of the reaction with
karboksydiimid, og eventueltcarboxydiimide, and optionally
d) tilknytting av en biologisk aktiv ligand til dette, idet nevnte substrater kan ha nevnte ligander knyttet til seg for å danne komplekser med enzymer for å separered) attaching a biologically active ligand thereto, said substrates may have said ligands attached to them to form complexes with enzymes to separate
nevnte enzymer fra enzymholdige løsninger,said enzymes from enzyme-containing solutions,
e) og utvinning av gjenstanden.e) and recovery of the item.
Tilknytning av en biologisk aktiv ligand ved karbodiimid-aktivering av karboksylgruppene er blitt funnet effektivt å danne komplekser med enzymer, hormoner eller blandinger av disse for biologiske separasjonsteknikker.Attachment of a biologically active ligand by carbodiimide activation of the carboxyl groups has been found to efficiently form complexes with enzymes, hormones, or mixtures thereof for biological separation techniques.
Polyakrylonitrilkjernens fasthet blir minimalt påvirket ved denne milde behandling, og således er produktene i henhold til denne oppfinnelse i det vesentlige ikke-svellbare i vann og ikke-sammenpressbare. Anvendt her og i de vedlagte krav betyr begrepet "ikke-sammenpressbar" istand til å motstå hydrostatiske trykk i kolonnelag på opptil omtrent 205 atm. uten å falle sammen.The firmness of the polyacrylonitrile core is minimally affected by this mild treatment, and thus the products according to this invention are essentially non-swellable in water and non-compressible. As used herein and in the appended claims, the term "non-compressible" means capable of withstanding column layer hydrostatic pressures of up to approximately 205 atm. without collapsing.
I en foretrukket konfigurasjon er substratet i det vesentlige en hudløs porøs kule som har et porevolum på ikke i det vesentlige mindre enn 1,5 ml/g og som i det vesentlige er isotrop. Fortrinnsvis er den gjennomsnittlige porediameter fra omtrent 0,002 mikron til omtrent 5 mikron, og den gjennomsnittlige kulediameter er fra omtrent 5 mikron til omtrent 2 mm.In a preferred configuration, the substrate is essentially a skinless porous sphere having a pore volume of not substantially less than 1.5 ml/g and which is substantially isotropic. Preferably, the average pore diameter is from about 0.002 microns to about 5 microns, and the average sphere diameter is from about 5 microns to about 2 mm.
Fortrinnsvis omfatter ikke-løsningsmiddelet i væskeform metanol, den alkaliske katalysator omfatter natriumhydroksyd og peroksydet omfatter hydrogenperoksyd. Utvinningstrinnet kan omfatte en vaskingsprosedyre hvor man anvender salter, vann og bufferløsninger. Et reaksjonstilsetningsstoff slik som dimetylsulfoksyd, kan tilsettes til suspensjonen og substratet varmebehandles før kombinasjon i suspensjon. Videre kan reduk-sjonsmidler også anvendes for å redusere i det minste en del av amidgruppene, nitrilgruppene eller begge til funksjonelle amingrupper. Amingruppene kan videre suksinyleres for å danne karboksylgrupper. Gjennom å aktivere karboksylgruppene ved å la dem reagere med et hvilket som helst stoff kjent for å aktivere -COOH-grupper, slik som karbodiimid, kan en biologisk aktiv ligand tilknyttes. Kulen med slik tilknyttet ligand kan bindes til enzymer, inkludert lipaser og proteinaser slik som acetylcholin-esterase, for å binde seg til hormoner og for å binde seg til proteiner slik som human serumalbumin, okseserumalbumin, hemoglobin, ovalbumin, myoglobin, alfa-laktalbumin, thyroglobin og okseserumgammaglobulin, til biologiske separasjonsprosesser.Preferably, the non-solvent in liquid form comprises methanol, the alkaline catalyst comprises sodium hydroxide and the peroxide comprises hydrogen peroxide. The extraction step may include a washing procedure where salts, water and buffer solutions are used. A reaction additive such as dimethylsulfoxide can be added to the suspension and the substrate heat-treated before combination in suspension. Furthermore, reducing agents can also be used to reduce at least part of the amide groups, the nitrile groups or both to functional amine groups. The amine groups can further be succinylated to form carboxyl groups. By activating the carboxyl groups by allowing them to react with any substance known to activate -COOH groups, such as carbodiimide, a biologically active ligand can be attached. The bead with such attached ligand can bind to enzymes, including lipases and proteinases such as acetylcholinesterase, to bind to hormones and to bind to proteins such as human serum albumin, bovine serum albumin, hemoglobin, ovalbumin, myoglobin, alpha-lactalbumin, thyroglobin and bovine serum gamma globulin, for biological separation processes.
Substrater som omfatter polyakrylonitril-homopolymerer eller kopolymerer er hovedsakelig kjent. F.eks. blir semi-permeable membraner av polyakrylonitril anvendt i forskjellige kjemiske separasjoner. Hule fibre av polyakrylonitril slik som de markedsført av Asahi Medical Company Ltd. under betegnelsen PAN 140, blir vanlig anvendt i nyredialyseutstyr.Substrates comprising polyacrylonitrile homopolymers or copolymers are mainly known. E.g. semi-permeable membranes of polyacrylonitrile are used in various chemical separations. Polyacrylonitrile hollow fibers such as those marketed by Asahi Medical Company Ltd. under the designation PAN 140, is commonly used in kidney dialysis equipment.
Porøse kuler som omfatter akrylonitrilpolymerer eller kopolymerer er kjent for fagfolk på området og anvendbare i utførelsen av den foreliggende oppfinnelse. Én fremgangsmåte for fremstilling av porøse kopolymerer er beskrevet i US-patent nr. 4 246 352. En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av porøse polyakrylonitrilkuler er beskrevet i på vanlig måte overdratt samtidig under behandling US-patent-søknader, Cooke og Hiscock, serienr. 07/275 317 Attorhey's Docket nr. 30 985, og Ley, Hiscock, og Cooke serienr. 07/275 170, Attorney's Docket nr. 30 987 og Cooke og Hiscock, serienr. 07/275 256 Attorney's Docket nr. 30 669. Den termisk induserte faseseparasjonsprosess beskrevet der gir mikroporøse kuler som omfatter akrylonitrilpolymerer eller kopolymerer som i det vesentlige er hudløse, isotrope og har et høyt porevolum. Slike kuler er foretrukket som substratet anvendt i utførelsen av den foreliggende oppfinnelse. Slike porøse kulesubstrater er blant de foretrukne substrater anvendt i utførelsen av den foreliggende oppfinnelse. Også anvendelige er polyakrylonitrilsubstrater slik som ikke-porøse plater eller filmer, porøse membraner, hule fibre, inkludert porøs fiber, monofilamenter, akryliske tråder og fibrilerte fibre. Også inkludert er strukturer som omfatter ett eller flere av de ovenfor identifiserte substrater. Det bør derfor være klart at formen for substrat ikke er vesentlig for utførelsen av oppfinnelsen beskrevet her.Porous spheres comprising acrylonitrile polymers or copolymers are known to those skilled in the art and useful in the practice of the present invention. One method for making porous copolymers is described in US Patent No. 4,246,352. A preferred method for making porous polyacrylonitrile beads is described in commonly assigned concurrently pending US patent applications, Cooke and Hiscock, Serial No. 07/275 317 Attorhey's Docket No. 30,985, and Ley, Hiscock, and Cooke Serial No. 07/275,170, Attorney's Docket No. 30,987 and Cooke and Hiscock, Serial No. 07/275 256 Attorney's Docket No. 30,669. The thermally induced phase separation process described therein produces microporous spheres comprising acrylonitrile polymers or copolymers that are substantially skinless, isotropic, and have a high pore volume. Such spheres are preferred as the substrate used in the execution of the present invention. Such porous ball substrates are among the preferred substrates used in the implementation of the present invention. Also useful are polyacrylonitrile substrates such as non-porous sheets or films, porous membranes, hollow fibers, including porous fiber, monofilaments, acrylic threads and fibrillated fibers. Also included are structures that comprise one or more of the above-identified substrates. It should therefore be clear that the form of substrate is not essential for the performance of the invention described here.
Som nevnt ovenfor, kan polyakrylonitrilsubstratene omfatte akrylonitrilhomopolymerer eller kopolymerer. Egnete komonomerer omfatter C2-C6-monoolefiner, vinylaminoaromatiske stoffer, alkenylaromatiske stoffer, vinylaromatiske stoffer, vinylhalogenider, Cx-Cg-alkyl (met) akrylater, akrylamider, metakrylamider, vinylpyrrolidoner, vinylpyridin, C^-Cg-hydroksyestere av alkyl (met) akrylater, met (akryl) syrer, akrylometylpropylsulfonsyrer, N-hydroksy-inneholdende C1-C6-alkyl (met) akrylamid, akrylamidometylpropylsulfonsyrer, vinylacetat, glycidyl(met)akrylat, glyserol(met)akrylat, tris (hydroksymetyl)aminometyl(met)akrylamid eller en blanding av disse. Akrylonitrilkopolymerer kan omfatte fra omtrent 99 til omtrent 20 deler i vekt av akrylonitril og fra omtrent 1 til omtrent 80 deler i vekt av komonomer. Det er foretrukket at akrylonitril er tilstede i mer enn omtrent 90 molprosent, og den foretrukne komonomer omfatter metylakrylat.As mentioned above, the polyacrylonitrile substrates may comprise acrylonitrile homopolymers or copolymers. Suitable comonomers include C2-C6 monoolefins, vinylaminoaromatics, alkenylaromatics, vinylaromatics, vinyl halides, Cx-Cg alkyl (meth)acrylates, acrylamides, methacrylamides, vinyl pyrrolidones, vinylpyridine, C^-Cg hydroxy esters of alkyl (meth)acrylates , met (acrylic) acids, acrylomethylpropylsulfonic acids, N-hydroxy-containing C1-C6 alkyl (meth)acrylamide, acrylamidomethylpropylsulfonic acids, vinyl acetate, glycidyl (meth)acrylate, glycerol (meth)acrylate, tris (hydroxymethyl)aminomethyl (meth)acrylamide or a mixture of these. Acrylonitrile copolymers may comprise from about 99 to about 20 parts by weight of acrylonitrile and from about 1 to about 80 parts by weight of comonomer. It is preferred that acrylonitrile is present in greater than about 90 mole percent, and the preferred comonomer comprises methyl acrylate.
Overflaten av akrylonitrilsubstratene hydrolyseres til amidgrupper ved å reagere nitriloverflategruppene med et alkalisk peroksyd i et væskeformig, ikke-løsningsmiddel for polymeren. Reaksjonen hydratiserer selektivt nitrilgrupper til amidgrupper uten bireaksjoner til imid- eller karboksyl-grupper. Videre kan fremgangsmåten i henhold til denne oppfinnelse overraskende lett kontrolleres, og omdannelser på mer enn 15 molprosent av nitrilgrupper til amidgrupper kan lett oppnås. Hovedsakelig omfatter fremgangsmåten dannelse av en suspensjon av akrylonitrilsubstratet og ikke-løsningsmiddel og eventuelt vann. Det er også mulig å innføre en katalysator i suspensjonen. Suspensjonen røres og et alkalisk reagens tilsettes. Suspensjonen blir så oppvarmet, et peroksyd tilsatt, suspensjonen røres og reaksjonen utføres i den ønskete grad.The surface of the acrylonitrile substrates is hydrolyzed to amide groups by reacting the nitrile surface groups with an alkaline peroxide in a liquid, non-solvent for the polymer. The reaction selectively hydrates nitrile groups to amide groups without side reactions to imide or carboxyl groups. Furthermore, the method according to this invention can be surprisingly easily controlled, and conversions of more than 15 mole percent of nitrile groups to amide groups can be easily achieved. Mainly, the method comprises forming a suspension of the acrylonitrile substrate and non-solvent and optionally water. It is also possible to introduce a catalyst into the suspension. The suspension is stirred and an alkaline reagent is added. The suspension is then heated, a peroxide is added, the suspension is stirred and the reaction is carried out to the desired extent.
Egnete peroksyder for anvendelse i utførelsen av den foreliggende oppfinnelse omfatter hydrogenperoksyd, t-butyl-hydroperoksyd eller -blandinger av disse og liknende. Spesielt foretrukket er hydrogenperoksyd.Suitable peroxides for use in carrying out the present invention include hydrogen peroxide, t-butyl hydroperoxide or mixtures thereof and the like. Particularly preferred is hydrogen peroxide.
Mange alkaliske reagenser er kjent for fagfolk på området og er egnet til anvendelse i denne oppfinnelse. Alkaliske reagenser omfatter natriumhydroksyd, kaliumhydroksydMany alkaline reagents are known to those skilled in the art and are suitable for use in this invention. Alkaline reagents include sodium hydroxide, potassium hydroxide
eller blandinger av disse og liknende.or mixtures of these and the like.
Vesentlig for utførelsen av den foreliggende oppfinnelse er valget av et egnet ikke-løsningsmiddel for akrylonitril-polymeren eller kopolymeren. Ikke-løsningsmiddelet må imidlertid også være et løsningsmiddel for det alkaliske reagens og peroksyd. Valget og konsentrasjonen av komponentene av løsningsmiddel ikke-løsningsmiddelsystemet er trodd å kontrollere selektiviteten og graden av reaksjon. Selvom søkere ikke ønsker å være bundet av noen teori, er det trodd at løsningsmiddelsystemets evne til å oppløse amidgruppene når de dannes, kontrollerer graden av reaksjon. Således, ved å kontrollere forholdet mellom løsningsmiddel og ikke-løsningsmiddel, kan graden av omdannelse kontrolleres. Fortrinnsvis, der hvor hydrogenperoksyd er peroksydet og natriumhydroksyd er det alkaliske reagens, anvendes metanol som ikke-løsningsmiddel.Essential to the practice of the present invention is the selection of a suitable non-solvent for the acrylonitrile polymer or copolymer. However, the non-solvent must also be a solvent for the alkaline reagent and peroxide. The choice and concentration of the components of the solvent-non-solvent system are believed to control the selectivity and degree of reaction. Although applicants do not wish to be bound by any theory, it is believed that the ability of the solvent system to dissolve the amide groups as they form controls the degree of reaction. Thus, by controlling the ratio of solvent to non-solvent, the degree of conversion can be controlled. Preferably, where hydrogen peroxide is the peroxide and sodium hydroxide is the alkaline reagent, methanol is used as the non-solvent.
Utvinningstrinnet kan også omfatte en vaskingsprosedyre katalytisk redusert for å danne funksjonelle amingrupper. Amingruppene kan videre suksinyleres for å danne karboksyl-funksjonalitet i enden av den tilknyttede gruppe. Aktivering av karboksylgruppene med karbodiimid muliggjør tilknytting av en biologisk aktiv ligand. Kuler som inneholder biologisk aktive ligander, slik som para-aminobenzamidin (PABA) kan anvendes i biologiske separasjonsprosesser for å binde seg til enzymer, slik som acetylcholinesterase.The recovery step may also include a washing procedure catalytically reduced to form amine functional groups. The amine groups can further be succinylated to form carboxyl functionality at the end of the attached group. Activation of the carboxyl groups with carbodiimide enables attachment of a biologically active ligand. Beads containing biologically active ligands, such as para-aminobenzamidine (PABA) can be used in biological separation processes to bind to enzymes, such as acetylcholinesterase.
I en foretrukket utførelsesform blir substratkulene varmebehandlet før innføring i suspensjonen med ikke-løsnings-middelet. Varmebehandlingstrinnet utføres fortrinnsvis i to stadier. Først blir kulene oppvarmet til en temperatur over omtrent 50"C i et ikke-løsningsmiddel. Egnete ikke-løsnings-midler inkluderer vann, lavere alkoholer og Cx- og C8-hydrokarboner. Kulene blir så tørket ved en temperatur på mindre enn 50°C og så oppvarmet til 90-100°C i omtrent 3 0-60 minutter. Det viser seg at det første trinn (oppvarming i et ikke-løsningsmiddel) eliminerer kuleagglomerering i det andre trinn. Varmebehandlingstrinnet viser seg å minske reaktivi-teten av kulen. Selvom søkerne ikke ønsker å være bundet av noen enkelt teori, er det antatt at dette foregår ved at polymeren blir mer ordnet og/eller minsker overflate-området. Varmebehandling representerer således en videre metode for kontroll av reaksjonen fra nitril- til amidgrupper.In a preferred embodiment, the substrate balls are heat-treated before introduction into the suspension with the non-solvent agent. The heat treatment step is preferably carried out in two stages. First, the beads are heated to a temperature above about 50°C in a non-solvent. Suitable non-solvents include water, lower alcohols, and Cx and C8 hydrocarbons. The beads are then dried at a temperature of less than 50°C. and then heated to 90-100°C for about 30-60 minutes. The first step (heating in a non-solvent) is found to eliminate bead agglomeration in the second step. The heat treatment step is found to decrease the reactivity of the bead. Although the applicants do not wish to be bound by any single theory, it is assumed that this takes place by the polymer becoming more ordered and/or reducing the surface area.Heat treatment thus represents a further method for controlling the reaction from nitrile to amide groups.
De følgende eksempler illustrerer den foreliggende oppfinnelse.The following examples illustrate the present invention.
Den følgende fremgangsmåte anvendes for å fremstille porøse polymere kuler som omfatter polyakrylonitril eller en kopolymer av dette egnet til anvendelse som substrater for overflatehydrogenering.The following method is used to produce porous polymeric spheres comprising polyacrylonitrile or a copolymer thereof suitable for use as substrates for surface hydrogenation.
Porøse kuler lages fra akrylonitrilpolymerer og/eller kopolymerer. Akrylonitrilkopolymerene omfatter fortrinnsvis polyakrylonitril kopolymerisert med f.eks. en (C2-C6)-mono-olefin, et vinylaromatisk stoff, et vinylaminoaromatisk stoff, et vinylhalogenid, et (Ci-Cg)-alkyl (met) akrylat, et (met)akrylamid, et vinylpyrrolidon, et vinylpyridin, et (Ci-Cg)-hydroksy-alkyl(met)akrylat, en (met)akrylsyre, en akrylometylpropyl-sulfonsyre, et N-hydroksy-inneholdende (C^-Cg) -alkyl(met)-akrylamid, eller en blanding av hvilke som helst av de foregående. Spesielt blir det nevnt (C1-C6)-alkyl(met)-akrylater.Porous spheres are made from acrylonitrile polymers and/or copolymers. The acrylonitrile copolymers preferably comprise polyacrylonitrile copolymerized with e.g. a (C 2 -C 6 )-mono-olefin, a vinyl aromatic, a vinyl amino aromatic, a vinyl halide, a (C 1 -C 8 )alkyl (meth)acrylate, a (meth)acrylamide, a vinyl pyrrolidone, a vinyl pyridine, a (Ci -C 6 )-hydroxy-alkyl (meth)acrylate, a (meth)acrylic acid, an acrylomethylpropyl-sulfonic acid, an N-hydroxy-containing (C 6 -C 8 )-alkyl (meth)-acrylamide, or a mixture of any of the previous ones. In particular, mention is made of (C1-C6)-alkyl(meth)-acrylates.
Som løsningsmidler for akrylonitrilpolymerer eller kopolymerer kan enhver organisk eller uorganisk væske istand til å løse dem uten permanent kjermisk transformasjon anvendes. Disse inkluderer dimetylsulfoksyd, dimetylformamid, dimetylsulfon, vandige løsninger av zinkklorid, og natrium-thiocyanat.As solvents for acrylonitrile polymers or copolymers, any organic or inorganic liquid capable of dissolving them without permanent chemical transformation can be used. These include dimethylsulfoxide, dimethylformamide, dimethylsulfone, aqueous solutions of zinc chloride, and sodium thiocyanate.
Ikke-løsningsmidler for akrylonitrilpolymerer eller kopolymerer kan omfatte ethvert væskemedium som er ikke-blandbart med disse. Disse kan omfatte urea, vann, glyserol, propylenglykol, etylenglykol eller blandinger av disse.Non-solvents for acrylonitrile polymers or copolymers may include any liquid medium which is immiscible therewith. These may include urea, water, glycerol, propylene glycol, ethylene glycol or mixtures thereof.
Ikke-løsningsmiddeldispergeringsmidler kan omfatte ethvert væskemedium som er ikke-blandbart med akrylonitril-polymerene eller kopolymerene og polymerløsningsmiddelet. Vanligvis vil de omfatte væsker med lav polaritet, slik som alifatiske, aromatiske eller hydroaromatiske hydrokarboner og deres halogenerte derivater, polysiloksaner med lav molekyl-vekt, olefiner, etere og liknende slike forbindelser.Non-solvent dispersants may include any liquid medium which is immiscible with the acrylonitrile polymers or copolymers and the polymer solvent. Typically they will include liquids of low polarity, such as aliphatic, aromatic or hydroaromatic hydrocarbons and their halogenated derivatives, low molecular weight polysiloxanes, olefins, ethers and similar such compounds.
Foretrukne løsningsmiddel/ikke-løsningsmiddelsystemer omfatter en løsningsmiddelblanding av dimetylsulfon/urea/vann eller dimetylsulfon med enten vann, propylenglykol eller etylenglykol tilsatt.Preferred solvent/non-solvent systems include a solvent mixture of dimethylsulfone/urea/water or dimethylsulfone with either water, propylene glycol or ethylene glycol added.
Kontroll av den ytre porøsitet og porestørrelses-fordeling bestemmes begge gjennom sammensetningen av løsningen av polymer, løsningsmiddel og ikke-løsningsmiddel(midler). Det følgende er detaljerte fremgangsmåter for fremstilling av disse porøse polymere kuler. 5 g av en våt kopolymer som inneholder 99 molprosent akrylonitril og 1 molprosent metylakrylat (1:1 kopolymer:vann i vekt) males med 5 g urea og 30 g dimetylsulfon til en pulverisert blanding. Blandingen plasseres i en 1 liters kolbe med 100 ml mineralolje oppvarmet til 160°C. Blandingen røres inntil to væskefaser fremstår, én fase er en homogen polymer-løsning, den andre mineralolje. Hurtig røring av blandingen med en overliggende skovlrører gir en suspensjon som består av dråper av den varme (omtrent 120°C) polymerløsning i mineralolje. Dråpene avkjøles ved å overføre suspensjonen via en kanyle til en annen rørt blanding som består av 500 ml mineralolje, 6 g dimetylsulfon og 1 g urea holdt ved 70°C. Dråpene blir faste ved kontakt med den kaldere mineralolje. Blandingen avkjøles under røring til romtemperatur, fortynnes så med metylenklorid for å redusere viskositeten av oljen. Dråpene oppsamlet på en Buchner-trakt og vaskes med metylenklorid, så ekstraheres løsningsmiddelet med 2 00 ml aceton i 1,5 timer ved romtemperatur. De resulterende kuler undersøkes ved scanning-elektronmikroskopi og observeres som sterkt porøse med relativt ensartet porediameter på omtrent 0,5 mikron. Porene strekker seg gjennom de ytre overflater.av kulene. Kulene varierer i størrelse fra 10 mikron til noen få mm i diameter.Control of the external porosity and pore size distribution are both determined through the composition of the solution of polymer, solvent and non-solvent(s). The following are detailed methods for making these porous polymeric spheres. 5 g of a wet copolymer containing 99 mole percent acrylonitrile and 1 mole percent methyl acrylate (1:1 copolymer:water by weight) is ground with 5 g urea and 30 g dimethyl sulfone to a powdered mixture. The mixture is placed in a 1 liter flask with 100 ml of mineral oil heated to 160°C. The mixture is stirred until two liquid phases appear, one phase is a homogeneous polymer solution, the other mineral oil. Rapid stirring of the mixture with an overhead paddle stirrer produces a suspension consisting of droplets of the hot (approximately 120°C) polymer solution in mineral oil. The drops are cooled by transferring the suspension via a cannula to another stirred mixture consisting of 500 ml of mineral oil, 6 g of dimethylsulfone and 1 g of urea kept at 70°C. The drops become solid on contact with the colder mineral oil. The mixture is cooled with stirring to room temperature, then diluted with methylene chloride to reduce the viscosity of the oil. The drops are collected on a Buchner funnel and washed with methylene chloride, then the solvent is extracted with 200 ml of acetone for 1.5 hours at room temperature. The resulting spheres are examined by scanning electron microscopy and are observed to be highly porous with a relatively uniform pore diameter of approximately 0.5 microns. The pores extend through the outer surfaces of the spheres. The spheres range in size from 10 microns to a few mm in diameter.
Et annet detaljert eksempel på fremstilling av disse porøse polymerkuler er som følger: 288 g dimetylsulfon, 12 g akrylonitrilkopolymer som består av et 99:1 molforhold akrylonitril:metylakrylat, og 100 ml propylenglykol kombineres og plasseres i en Parr-reaktor utstyrt med en magnetisk drevet rører og et fallrør. Reaktoren oppvarmes til 140"C for å danne en homogen løsning. Løsningen presses gjennom oppvarmete, 140oC, rørledninger og en forstøvningsdyse (f.eks. Lechler Co. fullkjegle "center jet" dyse, åpningsdiameter på 11,7 mm) ved å anvende 10,2 atm. nitrogentrykk. Dysen monteres 7,6 cm over 3 liter rørt mineralolje eller 10,2 cm over 4 liter rørt heptan for å stoppe væskedråpene. Stivnete dråper vaskes med heptan for å fjerne mineralolje, tørkes og ekstraheres i 1 time med 3 liter 85-90°C vann for å produsere mikroporøse kuler. Porestørrelser varierer fra 0,5-1,5 mikron, og majoriteten av kulene er mellom 25 og 150 mikron.Another detailed example of the preparation of these porous polymer spheres is as follows: 288 g of dimethyl sulfone, 12 g of acrylonitrile copolymer consisting of a 99:1 molar ratio of acrylonitrile:methyl acrylate, and 100 ml of propylene glycol are combined and placed in a Parr reactor equipped with a magnetically driven pipes and a downpipe. The reactor is heated to 140°C to form a homogeneous solution. The solution is forced through heated, 140°C piping and an atomizing nozzle (e.g., Lechler Co. full cone "center jet" nozzle, 11.7 mm orifice diameter) using 10 .2 atm nitrogen pressure. The nozzle is mounted 7.6 cm above 3 liters of stirred mineral oil or 10.2 cm above 4 liters of stirred heptane to stop the liquid droplets. Solidified droplets are washed with heptane to remove mineral oil, dried and extracted for 1 hour with 3 liters of 85-90°C water to produce microporous spheres.Pore sizes range from 0.5-1.5 microns, and the majority of spheres are between 25 and 150 microns.
Eksempel 1Example 1
En suspensjon av 5 g tørre, varmebehandlete polyakrylo-nitrilkuler (45-90 mm, 94,5 mmol) i 115 ml metanol og 4 ml dimetylsulfoksyd (56,4 mmol) ble rørt under nitrogen-gjennomblåsning. Etter 10 minutter ble 2,4 ml 2N vandig natriumhydroksyd (4,8 mmol) tilsatt til suspensjonen og suspensjonen oppvarmet til 35°C. Hydrogenperoksyd, 4,9 ml av en 30% løsning (0,96 mmol) ble tilsatt i løpet av 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble rørt ved 35°C i 3 timer. Etter 3 timer ble 2,4 ml 2N saltsyre (4,8 mmol) tilsatt, og reaksjonsblandingen ble rørt i 1 minutt og filtrert. Kulene ble vasket med 0,1N vandig saltsyre, vann, metanol og så tørket. Amidinnholdet i kulene ble bestemt til å være 8,3% ved infrarød analyse.A suspension of 5 g of dry, heat-treated polyacrylonitrile beads (45-90 mm, 94.5 mmol) in 115 mL of methanol and 4 mL of dimethyl sulfoxide (56.4 mmol) was stirred under nitrogen purging. After 10 minutes, 2.4 mL of 2N aqueous sodium hydroxide (4.8 mmol) was added to the suspension and the suspension was heated to 35°C. Hydrogen peroxide, 4.9 ml of a 30% solution (0.96 mmol) was added over 10 minutes. The reaction mixture was stirred at 35°C for 3 hours. After 3 hours, 2.4 mL of 2N hydrochloric acid (4.8 mmol) was added, and the reaction mixture was stirred for 1 minute and filtered. The beads were washed with 0.1N aqueous hydrochloric acid, water, methanol and then dried. The amide content of the balls was determined to be 8.3% by infrared analysis.
Eksempel 2Example 2
Fremgangsmåten i eksempel 1 ble fulgt, med unntak av at 5,6 ml vann ble tilsatt til reaksjonsblandingen før gjennom-blåsing av suspensjonen med nitrogen. Amidinnholdet i kulene ble bestemt til å være 9,5% ved infrarød analyse.The procedure in Example 1 was followed, with the exception that 5.6 ml of water was added to the reaction mixture before blowing through the suspension with nitrogen. The amide content of the beads was determined to be 9.5% by infrared analysis.
Eksempel 3Example 3
Fremgangsmåten i eksempel 1 ble fulgt, med unntak av at 14,7 ml 3 0% hydrogenperoksyd ble anvendt, og reaksjonen ble kjørt ved 35°C i 45 minutter. Amidinnholdet i kulene ble bestemt til å være 9,2 infrarød analyse.The procedure in Example 1 was followed, except that 14.7 ml of 30% hydrogen peroxide was used, and the reaction was run at 35°C for 45 minutes. The amide content of the beads was determined to be 9.2 infrared analysis.
Eksempler 4 og 5Examples 4 and 5
Porøse 99:1 molforhold akrylonitril/metylakrylat kopolymerkuler fremstilt ved termisk indusert faseinversjon ble lagret i vann etter ekstrahering av løsningsmidler som skulle kastes. En prøve ble fjernet, tørket og varmebehandlet ved 95°C i 0,5 timer. Både varmebehandlete kuler og våte kuler (0,2 g tørre) ble reagert med 0,16 ml dimetylsulf oksyd, 0,58 ml 3 0% hydrogenperoksyd og 0,1 ml 2N natriumhydroksyd i 9 ml metanol. Etter 3 timer hadde de varmebehandlete kuler 1,8% amidomdannelse, mens de ikke-varmebehandlete, våte kuler hadde 8,5% amidomdannelse. Dette illustrerer videre kontrollnivået for mulig omdannelse gjennom anvendelse av den foreliggendePorous 99:1 molar ratio acrylonitrile/methylacrylate copolymer beads prepared by thermally induced phase inversion were stored in water after extraction of solvents to be discarded. A sample was removed, dried and heat treated at 95°C for 0.5 hours. Both heat-treated beads and wet beads (0.2 g dry) were reacted with 0.16 ml of dimethylsulfoxide, 0.58 ml of 30% hydrogen peroxide and 0.1 ml of 2N sodium hydroxide in 9 ml of methanol. After 3 hours, the heat-treated beads had 1.8% amide conversion, while the non-heat-treated, wet beads had 8.5% amide conversion. This further illustrates the level of control for possible transformation through application of the present
. oppfinnelse.. invention.
Eksempler 6- 12Examples 6-12
Fremgangsmåten i eksempel 1 ble fulgt ved å variere mengden av hydrogenperoksyd og vann. Resultatene er fremsatt i tabell 1 nedenfor.The procedure in example 1 was followed by varying the amount of hydrogen peroxide and water. The results are presented in table 1 below.
Tabell 1 viser evnen til å kontrollere graden av amidomdannelse ved å variere forholdet mellom løsningsmiddel og ikke-løsningsmiddel.Table 1 shows the ability to control the degree of amide conversion by varying the ratio of solvent to non-solvent.
Eksempel 13Example 13
46 g porøse kuler med 99 mol% akrylonitrilkopolymer og 1 mol% metylakrylat ble fremstilt ved termisk indusert faseinversjon. Kulene ble varmebehandlet og så reagert med 37,0 ml dimetylsulfoksyd, 2 07,5 ml metanol, 133,2 ml 30% hydrogenperoksyd og 21,7 ml 2N natriumhydroksyd. Blandingen ble oppvarmet til 50°C mens den ble rørt. Etter å ha blitt holdt ved 50"C i 1 time ble kulene oppsamlet og vasket med 0,6 1 deionisert vann, 1,5 1 0,1N saltsyre, 4,0 1 deionisert vann og 1,0 1 metanol. Etter vakuumtørking ble 44,1 g (96%) kuler fjernet. Amidinnholdet i kulene ble bestemt til å være 8,1% ved FI-IR-analyse.46 g porous spheres of 99 mol% acrylonitrile copolymer and 1 mol% methyl acrylate were prepared by thermally induced phase inversion. The balls were heat treated and then reacted with 37.0 ml of dimethylsulfoxide, 207.5 ml of methanol, 133.2 ml of 30% hydrogen peroxide and 21.7 ml of 2N sodium hydroxide. The mixture was heated to 50°C while stirring. After being held at 50°C for 1 hour, the beads were collected and washed with 0.6 L of deionized water, 1.5 L of 0.1N hydrochloric acid, 4.0 L of deionized water and 1.0 L of methanol. After vacuum drying, 44.1 g (96%) beads removed The amide content of the beads was determined to be 8.1% by FI-IR analysis.
Eksempel 14Example 14
Produktet fra eksempel 13 ble reagert med et kompleks som besto av 1500 ml dioksan og 700 ml boran-tetrahydrofuran. Denne blanding ble tatt under tilbakeløp ved 85°C i 4 timer i en tørr 5 liters kolbe som var tilpasset med en kondensator. Etter avkjøling ble overskudd av boran bundet ved langsomt å tilsette IM saltsyre. Etter 2 0 minutter ble kulene oppsamlet på en Buchner-trakt, vasket med vann, metanol og vakuumtørket. Amininnholdet i kulene ble bestemt til å være 184 mmol amin/g ved fremgangsmåten til G. Antoni et al., Analytical Biochemistry, 129, 60-63, 1983.The product from Example 13 was reacted with a complex consisting of 1500 ml of dioxane and 700 ml of borane-tetrahydrofuran. This mixture was refluxed at 85°C for 4 hours in a dry 5 liter flask fitted with a condenser. After cooling, excess borane was bound by slowly adding 1M hydrochloric acid. After 20 minutes the beads were collected on a Buchner funnel, washed with water, methanol and vacuum dried. The amine content of the beads was determined to be 184 mmol amine/g by the method of G. Antoni et al., Analytical Biochemistry, 129, 60-63, 1983.
Eksempel 15Example 15
26,1 g av de porøse kuler fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 14 ble blandet med et kompleks fremstilt ved å tilsette 313 g ravsyreanhydrid i pulverform til 94 ml deionisert vann, hvortil 313 ml 1,0N natriumhydroksyd ble tilsatt. Løsningen ble rørt for å opprettholde en pH på 6,0. Kulene ble oppsamlet på en Buchner-trakt og vasket med 1,5 1 deionisert vann, 3,0 1 0,1N saltsyre, 3,0 1 deionisert vann og 1,0 1 metanol. Etter vakuumtørking ble 25,1 g (96%) kuler utvunnet. Restamininnholdet i kulene ble bestemt til å være 10 mmol amin/g ved trinitrobenzensulfonat(TBNS)-aminmåling. Eksempel 16 10 g aminoetylsuksinylerte kuler fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 15 ble nedsenket i 0,5M natriumklorid i 1 time, vasket fem ganger med 100 ml 0,5M natriumklorid og vasket fem ganger med 100 ml vann. De vaskete kuler ble suspendert i en løsning av 100 ml vann som inneholdt 500 mg p-aminobenzamidin, hvortil IN natriumhydroksyd ble tilsatt for å opprettholde en pH på 5,0. 800 mg fast l-etyl-3-(e-dimetyl-aminopropyl)karbodiimidhydroklorid (EDAC) ble tilsatt for å opprettholde en pH på 5,0, IN natriumhydroksyd ble tilsatt dråpevis, og suspensjonen ble rystet ved romtemperatur i 1 time. En tilleggsmengde på 800 mg fast EDAC ble tilsatt, og IN natriumhydroksyd ble tilsatt for å opprettholde pH 5,0. Etter at suspensjonen var blitt rystet ved romtemperatur i 18 timer ble bæreren vasket to ganger med 100 ml hver av de følgende26.1 g of the porous spheres prepared by the method in Example 14 were mixed with a complex prepared by adding 313 g of succinic anhydride in powder form to 94 ml of deionized water, to which 313 ml of 1.0N sodium hydroxide was added. The solution was stirred to maintain a pH of 6.0. The beads were collected on a Buchner funnel and washed with 1.5 L of deionized water, 3.0 L of 0.1N hydrochloric acid, 3.0 L of deionized water and 1.0 L of methanol. After vacuum drying, 25.1 g (96%) spheres were recovered. The residual amine content in the balls was determined to be 10 mmol amine/g by trinitrobenzenesulfonate (TBNS) amine measurement. Example 16 10 g of aminoethylsuccinylated beads prepared by the method in example 15 were immersed in 0.5 M sodium chloride for 1 hour, washed five times with 100 ml of 0.5 M sodium chloride and washed five times with 100 ml of water. The washed beads were suspended in a solution of 100 ml of water containing 500 mg of p-aminobenzamidine, to which 1N sodium hydroxide was added to maintain a pH of 5.0. 800 mg of solid 1-ethyl-3-(e-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDAC) was added to maintain a pH of 5.0, 1N sodium hydroxide was added dropwise, and the suspension was shaken at room temperature for 1 hour. An additional amount of 800 mg solid EDAC was added and 1N sodium hydroxide was added to maintain pH 5.0. After the suspension had been shaken at room temperature for 18 hours, the support was washed twice with 100 ml each of the following
løsninger, i følgende rekkefølge: vann, 0,5M natriumklorid, 0,2M NaOAc ved en pH på 4,5, vann, 0,1M natriumbikarbonat ved en pH på 9,0, vann og 0, IM NaHPOA ved en pH på 7,0 som inneholdt 0,02% natriumazid. PABA-innholdet bundet til kulene ble bestemt til å være 137 mmol PABA/g ved å analysere den initielle reaksjonssuspensjon og den første vaskesekvens spektrofotometrisk for PABA.solutions, in the following order: water, 0.5M sodium chloride, 0.2M NaOAc at a pH of 4.5, water, 0.1M sodium bicarbonate at a pH of 9.0, water, and 0.1M NaHPOA at a pH of 7 ,0 which contained 0.02% sodium azide. The PABA content bound to the beads was determined to be 137 mmol PABA/g by analyzing the initial reaction suspension and the first washing sequence spectrophotometrically for PABA.
Eksempel 17Example 17
Porøse kuler som inneholdt p-aminobenzamidin, som ble fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 16, ble pakket ved oppslemmingstilsetning i glasskolonner på 0,7 i.d. x 25 cm som inneholdt 0,01M NaHP04 med 0,02% natriumazid (elueringsbuffer) med 4,8 mg acetylcholinesterase tilsatt til 0,25 ml eluerings-buf f er. Kolonnen ble eluert inntil den initielle manglende topp eluerte (20-30 ml). Kolonnen ble så eluert med eluerings-buf fer som inneholdt IM natriumklorid for å utvinne ethvert ' enzym tilbakeholdt på kolonnen. Det saltholdige eluerings-volumet ble bestemt å ha 6,9-21% utvunnet protein med 47-37% utvunnet aktivitet. Acetylcholinesterasen ble målt ved å anvende Ellmans kolormetriske måling (Ellman, G.L., et al., Biochem. Pharmac. 7. 88-108, 1961) og representerte en 1,5-2,0 gangers rensing av AChE.Porous spheres containing p-aminobenzamidine, which were prepared by the procedure of Example 16, were packed by slurry addition into glass columns of 0.7 i.d. x 25 cm containing 0.01 M NaHPO 4 with 0.02% sodium azide (elution buffer) with 4.8 mg of acetylcholinesterase added to 0.25 ml of elution buffer. The column was eluted until the initial missing peak eluted (20-30 ml). The column was then eluted with elution buffer containing 1M sodium chloride to recover any enzyme retained on the column. The saline elution volume was determined to have 6.9-21% recovered protein with 47-37% recovered activity. Acetylcholinesterase was measured using Ellman's colorimetric assay (Ellman, G.L., et al., Biochem. Pharmac. 7. 88-108, 1961) and represented a 1.5-2.0 fold purification of AChE.
Eksempel 18Example 18
Porøse kuler som inneholdt 8,1% amid, fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 13, ble pakket ved oppslemningstilsetning i en glasskolonne av 0,7 i.d. x 25 cm som inneholdt 0,1M natriumhypofosfat med pH 7,0 og 0,02% natriumazid (elueringsbuffer). 5 ml trypsin ble tilsatt til kolonnen i 0,25 ml kjørebuffer. Kolonnen ble eluert inntil det i begynnelsen manglende volum var eluert. Kolonnen ble så eluert med elueringsbuffer som inneholdt IM natriumklorid for å utvinne ethvert enzym tilbakeholdt på kolonnen. Det i begynnelsen manglende volum ble målt å inneholde 8,6% utvunnet protein med 7,8% aktivitet. Saltelueringen ble målt å gi 53% utvunnet protein med 80% utvunnet aktivitet. Derfor adsorberte/bandt de ikke-derivatiserte kuler seg til trypsin, som kan vises ved salteluering. Proteinverdier ble bestemt ved BCA-proteinmåling (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.).Porous spheres containing 8.1% amide, prepared by the method described in Example 13, were packed by slurry addition into a glass column of 0.7 i.d. x 25 cm containing 0.1M sodium hypophosphate with pH 7.0 and 0.02% sodium azide (elution buffer). 5 ml of trypsin was added to the column in 0.25 ml of running buffer. The column was eluted until the initially missing volume had been eluted. The column was then eluted with elution buffer containing 1M sodium chloride to recover any enzyme retained on the column. The initially missing volume was measured to contain 8.6% extracted protein with 7.8% activity. The salt elution was measured to give 53% recovered protein with 80% recovered activity. Therefore, the non-derivatized beads adsorbed/bound to trypsin, which can be shown by salt elution. Protein values were determined by BCA protein assay (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.).
De følgende eksempler viser anvendelsen av substrater forskjellige fra porøse polymere kuler i utførelsen av den foreliggende oppfinnelse.The following examples demonstrate the use of substrates other than porous polymeric spheres in the practice of the present invention.
Eksempel 19Example 19
Tørre, varmebehandlete polyakrylonitrilhule fibre, 0,5 g, ble blandet med 11,5 ml metanol, 0,5 g vann, 0,24 ml 2N vandig natriumhydroksydløsning og 0,4 ml dimetylsulfoksyd. Blandingen ble oppvarmet til 35°C, og 0,49 ml av en 30% hydrogenperoksydløsning ble tilsatt. Etter henstand ved romtemperatur i 3 timer ble reaksjonsblandingen filtrert. Fibrene ble vasket med vann og metanol og vakuumtørket (40°C). Amidinnholdet av fibrene ble bestemt til å være 14,1% ved infrarød analyse.Dry, heat-treated polyacrylonitrile hollow fibers, 0.5 g, were mixed with 11.5 ml of methanol, 0.5 g of water, 0.24 ml of 2N aqueous sodium hydroxide solution and 0.4 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated to 35°C and 0.49 ml of a 30% hydrogen peroxide solution was added. After standing at room temperature for 3 hours, the reaction mixture was filtered. The fibers were washed with water and methanol and vacuum dried (40°C). The amide content of the fibers was determined to be 14.1% by infrared analysis.
Eksempel 20Example 20
Fremgangsmåten i eksempel 19 ble fulgt, med unntak av at 0,50 g av en ikke-varmebehandlet fibrilert fiberplate ble anvendt med 1,47 ml 30% hydrogenperoksydløsning, og fiberen ble varmebehandlet før reaksjonen. IR-analyse viste at amidinnholdet i det fibrilerte fiberprodukt var omtrent 2%.The procedure in Example 19 was followed, except that 0.50 g of a non-heat-treated fibrillated fiber board was used with 1.47 ml of 30% hydrogen peroxide solution, and the fiber was heat-treated before the reaction. IR analysis showed that the amide content in the fibrillated fiber product was approximately 2%.
Eksempel 21Example 21
Reaksjonsprosedyren i eksempel 19 ble fulgt, med unntak av at 0,52 g av en ikke-porøs film laget fra en 89,5:10,5 akrylonitril:metylakrylatfilm ble anvendt, og filmen ble ikke varmebehandlet. Kontaktvinkel for vann var 42° fulgt av reaksjon, mens filmen først hadde en vannkontaktvinkel på 63°.The reaction procedure of Example 19 was followed, except that 0.52 g of a non-porous film made from an 89.5:10.5 acrylonitrile:methyl acrylate film was used, and the film was not heat treated. Contact angle for water was 42° followed by reaction, while the film first had a water contact angle of 63°.
De ovenfor nevnte patenter, patentsøknader og referanserThe above-mentioned patents, patent applications and references
er inkorporert her ved referanse.are incorporated herein by reference.
Mange varianter av det ovenfor beskrevne kan tenkes. F.eks., i stedet for å hydratisere akrylonitrilhomopolymer eller kopolymerer med metylakrylat, kan andre akrylonitrilkopolymerer slik som akrylonitril-vinylklorid og akrylonitril-styren anvendes. Akrylonitrilkopolymerer i form av hule fibre eller membraner er også mulige, liksom anvendelse av t-butyl-hydroperoksyd istedet for hydrogenperoksyd; kaliumhydroksyd istedet for natriumhydroksyd som alkalisk reagens og etanol og i-propanol istedet for metanol som ikke-løsningsmiddel.Many variations of what is described above can be imagined. For example, instead of hydrating acrylonitrile homopolymer or copolymers with methyl acrylate, other acrylonitrile copolymers such as acrylonitrile-vinyl chloride and acrylonitrile-styrene can be used. Acrylonitrile copolymers in the form of hollow fibers or membranes are also possible, as is the use of t-butyl hydroperoxide instead of hydrogen peroxide; potassium hydroxide instead of sodium hydroxide as alkaline reagent and ethanol and i-propanol instead of methanol as non-solvent.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO901829ANO178548C (en) | 1990-04-25 | 1990-04-25 | Surface hydrated porous polyacrylonitrile substrates such as ball derivatives thereof, and processes for their preparation |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO901829ANO178548C (en) | 1990-04-25 | 1990-04-25 | Surface hydrated porous polyacrylonitrile substrates such as ball derivatives thereof, and processes for their preparation |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO901829D0 NO901829D0 (en) | 1990-04-25 |
| NO901829L NO901829L (en) | 1991-10-28 |
| NO178548Btrue NO178548B (en) | 1996-01-08 |
| NO178548C NO178548C (en) | 1996-04-17 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO901829ANO178548C (en) | 1990-04-25 | 1990-04-25 | Surface hydrated porous polyacrylonitrile substrates such as ball derivatives thereof, and processes for their preparation |
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO178548C (en) |
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO901829L (en) | 1991-10-28 |
| NO178548C (en) | 1996-04-17 |
| NO901829D0 (en) | 1990-04-25 |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5863957A (en) | Polymeric microbeads | |
| AU2006278864B2 (en) | Process for cross-linking cellulose ester membranes | |
| US4906379A (en) | Hydrophilic article and method of producing same | |
| US5766908A (en) | High-flux semipermeable membrane containing immobilized affinity ligands | |
| US6291582B1 (en) | Polymer-protein composites and methods for their preparation and use | |
| CZ252095A3 (en) | Method of attaching a ligand to a porous carrier | |
| US4033817A (en) | Pressure-driven enzyme-coupled membranes | |
| JP2002263486A (en) | Endotoxin adsorbent and method for removing endotoxin using the same | |
| CA2003445C (en) | Surface-hydrated porous polyacrylonitrile substrates, such as beads derivatives thereof, process for their preparation, and methods for their use | |
| JPH0458311B2 (en) | ||
| Štamberg | Bead cellulose | |
| NO176181B (en) | Surface-modified substrates, process for making and using such substrates | |
| Scouten | Matrices and activation methods for cell adhesion/immobilization studies | |
| US5096593A (en) | Separation material derived from glucomannan for blood coagulation factor, preparation and use thereof | |
| NO178548B (en) | Surface hydrated porous polyacrylonitrile substrates such as ball derivatives thereof, and processes for their preparation | |
| EP0186347B1 (en) | Method for producing high-active biologically efficient compounds immobilized on a carrier | |
| US4612288A (en) | Oxirane resins for enzyme immobilization | |
| US5284910A (en) | Surface-modified polyacrylonitrile fibrous substrates | |
| KR0167754B1 (en) | Porous bead composition | |
| US5270384A (en) | Surface-modified polyacrylonitrile fibrous substrates | |
| JP2001518382A (en) | Chemically modified porous material with electrically neutral hydrophilic outer surface | |
| Scheler | Synthetic polymers in biology and medicine | |
| US5418284A (en) | Surface-modified polyacrylonitrile beads | |
| CN1817444A (en) | Production of silica-gel carried dye affinity substrate and use thereof | |
| US5268421A (en) | Surface-modified polyacrylonitrile beads |
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees | Free format text:LAPSED IN OCTOBER 2002 |