KR790001452B1 - Process for the microbiological oxidation of steroids - Google Patents

Abstract

From the sterols or their 4-ene deriv. or their 1,4-diene-3-one deriv. or their 1,4-diene-3-one deriv., 17-hydroxy androsta-1,4-diene-3-one and(or) -1,4-diene-3,17-one were prepd. by the improved microbial oxidation. Thus, culture medium should the oils, oil seeds, oil fruits and glycerides which should exceed 0.3% of total medium weight.

Description

Translated fromKorean

미생물에 의한 스테로이드의 산화방법Oxidation of Steroids by Microorganisms

첨부 도면은 종축에 콜레스테롤(A선), 콜레스트-4-엔-3-온(B선), 콜레스타-1,4-디엔-3-온(C선), DHT(D선) 및 ADD(E선)의 농도를 그리고 횡축에 발효시간(hrs)을 나타낸 그라프임.The accompanying drawings show cholesterol (A line), cholest-4-en-3-one (B line), cholesta-1,4-diene-3-one (C line), DHT (D line) and ADD on the longitudinal axis. Graph showing concentration of (E line) and fermentation time (hrs) on the horizontal axis.

본 발명은 미생물에 의한 스테로이드의 산화방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 스테롤류 또는 그의 4-엔-3-온 유도체 혹은 그의 1,4-디엔-3-온 유도체의 미생물산화에 의한 17-하이드록시안드로스타-1,4-디엔-3-온 및 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온 제조법의 개량에 관한 것이다.The present invention relates to a method of oxidizing steroids by microorganisms. More specifically, the present invention relates to 17-hydroxyandrostar-1,4-diene-3 by microbial oxidation of sterols or 4-en-3-one derivatives thereof or 1,4-diene-3-one derivatives thereof. It relates to an improvement in the preparation of -one and androstar-1,4-diene-3,17-dione.

17-하이드록시안드로스타-1,4-디엔-3-온 및 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온은 귀중한 스테로이드호르몬의 합성용 중간체로서 상업적으로 중요하다.17-hydroxyandrostar-1,4-diene-3-one and androstar-1,4-diene-3,17-dione are commercially important as intermediates for the synthesis of valuable steroid hormones.

17-하이드록시안드로스타-1,4-디엔-3-온(1-대하이드로테스로스테론)(이후 DHT로 약칭함)과 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온(이후 ADD로 약칭함)을 스테롤류의미생물산화에 의해 제조하는 것은 오래 전부터 알려져 왔었다. 그러나 이 방법은 형성된 DHT 및 ADD를 또 산화시킴으로써 DHT 및 ADD의 수율을 크게 저하시키는 결점이 있다. 아리마(Arima) 등에 의해 1968년 6월 11자 특허된 미국특허 제3,388,042호에는 스테롤류의 미생물산화에 의해 배지 중에 존재하고 ADD의 미생물산화 중에 침전되는 철 및 구리이온을 갖는 킬레이트 화합물을 형성할 수 있는 킬레이트제를 사용하여 ADD를 얻는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 ADD의 추가산화를 피하여 양호한 결과를 주지만, 상업적으로 현저한 수율과 전환을 달성하지 못한다. 그러므로, 이와 같이 수율과 전환을 증대시킬 수 있는 방법의 개량이 요구되었다.17-hydroxyandrostar-1,4-dien-3-one (1-large hydrotesosterone) (hereinafter abbreviated as DHT) and androstar-1,4-diene-3,17-dione (hereafter ADD The production of sterols by microbial oxidation has been known for a long time. However, this method has the drawback of significantly lowering the yield of DHT and ADD by further oxidizing the formed DHT and ADD. U.S. Patent No. 3,388,042, issued June 11, 1968 to Arima et al., Is capable of forming chelate compounds with iron and copper ions present in the medium by microbial oxidation of sterols and precipitated during microbial oxidation of ADD. A method for obtaining ADD using a chelating agent is described. This method avoids further oxidation of ADD and gives good results, but does not achieve commercially significant yields and conversions. Therefore, improvement of the method which can increase the yield and conversion in this way was required.

스테로이드의 미생물산화에 지방과 오일을 함유하는 배지를 사용하는 것은 잘 알려진 사실이다.It is well known to use media containing fats and oils for the microbial oxidation of steroids.

조셉 프리이드(Josef Fried) 등에 의해 1956.7.24자 특허된 미국특허 제2,756,179호의 실시예 1에 ADD 및 DHT에 프로게스테론의 미생물산화에 있어서 대두유 약 0.22중량%와 대두분 약 1.5중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.Example 1 of US Pat. No. 2,756,179, issued by Joseph Fried et al to US Pat. No. 2,756,179, contains a medium containing about 0.22% by weight soybean oil and about 1.5% by weight soy flour in the microbial oxidation of progesterone in ADD and DHT. The use of is described.

진 피. 로센레트(Jean P. Rosselet) 등에 의해 1958.7.8자 특허된 미국특허 제2,842,566호의 실시예 1에 1-디하이드로-6α-메틸아드레노스테론 및 1-디하이드로-6α-메틸-11-케로테스토스테론에 대한 6α-메틸-11-케토프로게스테론의 미생물 산화에 있어서 라아드유 약 0.1중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.Gin blood. 1-dihydro-6α-methyladrenosterone and 1-dihydro-6α-methyl-11-kero in Example 1 of US Pat. No. 2,842,566, filed July 8, 1958 to Jean P. Rosselet et al. The use of a medium containing about 0.1% by weight of lard oil in the microbial oxidation of 6α-methyl-11-ketoprogesterone to testosterone is described.

군터 에스. 폰켄(Gunther S. Fonken) 등에 의해 1961.4.25자 특허된 미국특허 제2,981,659호의 실시에 4A에 1-디하이드로프로게스테론 20-에틸렌 케탈에 대해 프로게스테론 20-에틸렌케탈의 미생물산화에 있어서 대부분 약 1.5중량%와 대두유 약 0.25중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.Gunter S. Mostly about 1.5% by weight of the microbial oxidation of progesterone 20-ethyleneketal to 1-dihydroprogesterone 20-ethylene ketal in 4A in the practice of US Pat. No. 2,981,659, patented by Gunther S. Fonken et al. And the use of a medium containing about 0.25% soybean oil by weight.

동 미국특허 제2,981,659호의 실시예 5A에 1-디하이드로프로게스테론 20-에틸렌케탈에 대해 프로게스테론 20-에틸렌케탈의 미생물산화에 있어서 대두유 약 0.22중량%나 또는 라아드유 약 0.2중량%를 함유하는 배지에 사용이 기재되어 있다.Example 5A of U.S. Patent No. 2,981,659 in a medium containing about 0.22% by weight of soybean oil or about 0.2% by weight of lard oil in microbial oxidation of progesterone 20-ethyleneketal to 1-dihydroprogesterone 20-ethyleneketal Use is described.

단 제이. 바디아(Dan J. Badia) 등에 의해 1961.11.28자 특허된 미국특허 제3,010,876호의 실시예 Ⅲ에 화합물 F에 대해 화합물 S의 미생물산화에 있어서 대두유 약 0.27중량%(10㎖/gal)를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.Only Jay. Example III of US Pat. No. 3,010,876, filed Jan. 19, 11.28 to Dan J. Badia et al, contains about 0.27% by weight (10 ml / gal) of soybean oil in the microbial oxidation of Compound S to Compound F. The use of the medium is described.

찰스 존 시이(Charles John Sih) 등에 의해 1962.7.31자 특허된 미국특허 제3,047,469호에 고리에 있어서 완전히 또는 부분적으로 포화된 A고리를 갖는 스테로이드류의 A고리를 탈수소하는데 있어서 대두유 0.22중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.U.S. Patent No. 3,047,469, filed by Charles John Sih et al., 1962.7.31, contains 0.22% by weight soybean oil in the dehydrogenation of ring A of steroids having ring A completely or partially saturated in the ring. The use of a medium is described.

이봉국(Bong Kuk Lee) 등에 의해 1970.10.27자 특허된 미국특허 제3,536,586호에 1,2-위치에서 포화되었고 16-위치에 대치할 수 있는 수소원자를 갖는 스테로이드의 1-탈수소 및 16-하이드록실화에 있어서 대두유 약 0.22중량%와 대두분 약 1.5-2.0중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.U.S. Patent No. 3,536,586, filed by Bong Kuk Lee et al. On Oct. 27, 1970, 1-dehydrogen and 16-hydrides of steroids saturated at 1,2-position and having hydrogen atoms replaceable at 16-position. The use of a medium containing about 0.22% soybean oil and about 1.5-2.0% soy flour by weight for oxylation is described.

일본국 특허공고 제16,147호/1971의 실시예 4에 ADD 및 안드로스트-4-엔-3,17-디온에 대한 콜레스테롤의 미생물산화에 있어서 대두유 약 0.1중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.Example 4 of Japanese Patent Publication No. 16,147 / 1971 describes the use of a medium containing about 0.1% by weight soybean oil in the microbial oxidation of cholesterol to ADD and androst-4-ene-3,17-dione. have.

일본국 특허공고 제29193호/1971의 실시예 1에 ADD 및 안드로스트-4-엔-3,17-디온에 대한 리로콜산의 미생물산화에 있어서 대두유 약 0.2중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.Example 1 of Japanese Patent Publication No. 29193/1971 describes the use of a medium containing about 0.2% by weight soybean oil in the microbial oxidation of lirocolic acid to ADD and androst-4-ene-3,17-dione. It is.

바이오테크놀러지(Biotechnology) 및 바이오엔지니어링(Bioengineering) 11 1255-1270(1969)에 9α-플루오로-11β,16α,17,21-테트라하이드록시프레그나-1,4-디엔-3,20-디온에 대한 9α-플루오로-11β,17,21-트리하이드록시-프레그나-4-엔-3,20-디온-21-아세테이트의 미생물산화에 있어서 대두유 약 0.22중량%와 대두유분 약 1.5-2.0중량%를 함유하는 배지의 사용이 기재되어 있다.Biotechnology and Bioengineering 11 1255-1270 (1969) to 9α-fluoro-11β, 16α, 17,21-tetrahydroxypregna-1,4-diene-3,20-dione About 0.22% by weight of soybean oil and about 1.5-2.0% of soybean oil in the microbial oxidation of 9α-fluoro-11β, 17,21-trihydroxy-pregna-4-ene-3,20-dione-21-acetate The use of media containing% is described.

그러나, 스테롤류의 미생물산화에 있어서 배지에 전기한 바와 같은 소량의 지방분을 부가하면 DHT 및 ADD의 수율에 있어서 약간의 증가현상을 가져온다.However, in the microbial oxidation of sterols, the addition of a small amount of fat as described above to the medium causes a slight increase in the yield of DHT and ADD.

글리세리드, 지방, 유종자 및 유과실로 되는 군 중에서 선택한 물질을 함유하는 적어도 한개 이상의 글리세리드를 배지가 적어도 0.3중량%의 글리세리드를 함유하는데 충분한 양으로 배지에 부가할 때에, DHT 및 ADD는 고수율 및 농도로 수득되었음을 발견했다.When adding at least one glyceride containing a substance selected from the group consisting of glycerides, fats, oil seed and fruit fruit to the medium in an amount sufficient to contain at least 0.3% by weight of glycerides, DHT and ADD are high yield and concentration Was found to be obtained.

상기한 바와 같이, 본 발명은 스테롤류 또는 4-엔-3-온 유도체 및 그의 1,4-디엔-3온 유도체의 미생물산화에 의한 DHT 및 ADD의 제조에 관한 것이다.As mentioned above, the present invention relates to the production of DHT and ADD by microbial oxidation of sterols or 4-en-3-one derivatives and their 1,4-diene-3one derivatives.

스테롤류의 미생물산화에 의한 방법은 완전히 이해할 수 없지만, 스테롤류의 미생물산화는 다음과 같이 행하는 것으로 추정된다. (미국특허 제3,388,042호 참조)Although the method by microbial oxidation of sterols is not fully understood, it is estimated that microorganism of sterols is performed as follows. (See US Patent No. 3,388,042)

상기의 구조식들에서, R는 8~10개의 탄소원자를 갖는 측쇄를 나타낸다.In the above structural formulae, R represents a side chain having 8 to 10 carbon atoms.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 스테로이드 기질로서는 스테롤류, 그의 4-엔-3-온 유도체 혹은 그의 1,4-디엔-3-온 유도체가 있다.Steroids for use in the method of the present invention include sterols, 4-en-3-one derivatives thereof or 1,4-dien-3-one derivatives thereof.

스테롤류는 C-3에 수산기, C-5에 이중결합, C-17에 8~10개의 탄소원자를 갖는 측쇄 및 어떤 경우에는 퍼하이드로사이클로펜타노페난트렌핵의 C-7에 이중결합을 갖는다.Sterols have a hydroxyl group at C-3, a double bond at C-5, a side chain having 8-10 carbon atoms at C-17, and in some cases a double bond at C-7 of the perhydrocyclopentanophenanthrene nucleus.

이와 같은 스테롤류의 예로 콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 시로스테롤, 에르고스테롤, 브라시카스테롤 및 푸코스테롤이 있다. 이 중에서 콜레스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤 및 샤로스테롤이 특히 적합하다.Examples of such sterols are cholesterol, stigmasterol, camphorsterol, sirosterol, ergosterol, brassicasterol and fucosterol. Of these, cholesterol, stigmasterol, camphorolol and roosterol are particularly suitable.

물론, 스테롤류의 상기한 산화경로에서 제안된 산화중간체인 스테롤류의 4-엔-3-온 유도체 및 1,4-디엔-3-온 유도체들을 본 발명의 출발물질로서 또한 사용할 수 있다. 배지 중의 스테로이드 기질의 농도는 중요하지 않지만, 일반적으로 약 0.05~약 5중량%, 바람직하기로는 약 0.1~약 3중량%의 범위이다.Of course, 4-en-3-one derivatives and 1,4-dien-3-one derivatives of sterols, which are the intermediates of oxidation proposed in the above oxidation pathways of sterols, may also be used as starting materials of the present invention. The concentration of steroid substrate in the medium is not critical but is generally in the range of about 0.05 to about 5% by weight, preferably about 0.1 to about 3% by weight.

본 발명의 방법에 의하여, 글리세리드, 지방류, 유종자(oil seeds) 및 유과실(oil fruits)로 되는 군 중에서 선택한 적어도 한개 이상의 글리세리드-함유기질을 배지에 부가한다. 배지에 부가된 글리세리드의 예로 모노글리세리드, 디글리세리드 및 트리글리세리드를 들 수 있다.By the method of the present invention, at least one glyceride-containing substrate selected from the group consisting of glycerides, fats, oil seeds and oil fruits is added to the medium. Examples of glycerides added to the medium include monoglycerides, diglycerides and triglycerides.

이와 마찬가지로, 동일한 지방산기를 함유하는 단일 글리세리드 및 2종 또는 3종의 상이한 지방산기를 함유하는 혼합글리세리드를 또한 사용할 수 있다. 지방산기의 예로 불포화 지방산기 및 포화지방산기를 들 수 있다. 소수성의 관점에서 지방산기는 탄소원자를 26개까지 함유하는 것이 바람직하다.Similarly, single glycerides containing the same fatty acid group and mixed glycerides containing two or three different fatty acid groups can also be used. Examples of fatty acid groups include unsaturated fatty acid groups and saturated fatty acid groups. In view of hydrophobicity, the fatty acid group preferably contains up to 26 carbon atoms.

적합한 단일 글리세리드의 예로 α-모노아세틴, β-모노아세틴, α-모노팔미틴, β-모노팔미틴, α-모노스테아린, β-모노스테아린, α-모노올레인, β-모노올레인 등과 같은 모노글리세리드류; α,α'-디아세틴, α,β-디아세틴, α,α'-디팔미틴, α,β-디팔미틴, α,α'-디스테아틴, α,β-디스테아틴, α,α'-디올레인, α,β-디올레인 등과 같은 디글리세리드류; 트리아세틴, 트리라우틴, 트리미리스틴, 트리팔미틴, 트리스테아틴, 트리올레인 등과 같은 트리글리세리드류를 들 수 있다.Examples of suitable single glycerides are α-monoacetin, β-monoacetin, α-monopalmitin, β-monopalmitin, α-monostearin, β-monostearin, α-monolein, β-monolein and the like. Monoglycerides; α, α'-diacetin, α, β-diacetin, α, α'-dipalmitin, α, β-dipalmitin, α, α'-disteatin, α, β-disteatin, α, α Diglycerides such as' -diolein, α, β-diolein and the like; Triglycerides such as triacetin, trilautin, trimyristin, tripalmitin, tristeatin, triolein and the like.

적합한 혼합 글리세리드의 예로 1-아세토-2,3-디팔미틴, 1-팔미토-2,3-디카프틴, 1-라우로-2-밀리스로-3-팔미틴, 2-올레오-1,3-디팔미틴 및 2-스테아로-1,3-디올레인을 들 수가 있다.Examples of suitable mixed glycerides are 1-aceto-2,3-dipalmitin, 1-palmito-2,3-dicaptin, 1-lauro-2-milliro-3-palmitin, 2-oleo-1,3 -Dipalmitin and 2-stearo-1,3-diolein.

본 발명의 방법에 있어서, 글리세리드류 대신에 유지류를 사용할 수 있다.In the method of the present invention, fats and oils can be used instead of glycerides.

본 명세시에 사용하는 "유지(fats)"란 용어는 이들의 물리적 상태는 불문하고 식물유지 및 동물유지가 포함된다.As used herein, the term "fats" includes vegetable and animal fats, regardless of their physical state.

식물유지로서 적합한 예로 아마인유, 들기름, 등유, 참기름, 옥수수기름, 평지씨기름, 면실유, 잇꽃유(safflower oil), 대두유, 대두레시틴, 동백유, 쌀겨기름, 올리브유, 피마자유, 낙화생유, 야자유, 파암유 및 파암커어넬유(palm kernel oil)가 있다. 이 중에서, 공급상 안정 때문에, 면실유, 대두유, 평지씨기름, 파암유 및 파암커어유가 특별히 적합하다.Examples of suitable vegetable oils include linseed oil, perilla oil, kerosene, sesame oil, corn oil, rapeseed oil, cottonseed oil, safflower oil, soybean oil, soybean lecithin, camellia oil, rice bran oil, olive oil, castor oil, peanut oil, palm oil, Rock oil and palm kernel oil. Among them, cottonseed oil, soybean oil, rapeseed oil, rockstone oil and rocker oil are particularly suitable for supply stability.

동물유지의 적합한 예로서 어유, 고래기름, 우지, 돈지, 양지, 우각유 및 간유가 있다. 이 중에서 특별히 적합한 것은 돈지, 어유 및 고래기름이다.Suitable examples of animal fats and oils include fish oil, whale oil, tallow, lard, sunny, parsley and cod liver oil. Particularly suitable among these are lard, fish oil and whale oil.

이와 마찬가지로, 글리세리드-함유 유종자 또는 유과실류를 글리세리드 대신에 또한 사용할 수 있다.Similarly, glyceride-containing seed or fruit may also be used in place of glycerides.

본 명세서에서 사용하는 "유종자류(oil seeds)" 및 "유과실류(oil fruits)"는 지방분을 갖는 종자류 및 과실류를 의미한다. 유종자류 및 유과실류의 적합한 예로서 아마씨, 올리브, 참깨, 평지씨, 목화씨, 대두, 락화생 및 쌀겨를 들 수가 있다.As used herein, "oil seeds" and "oil fruits" refer to seeds and fruits having fat content. Suitable examples of oilseeds and fruits are flaxseeds, olives, sesame seeds, rapeseeds, cottonseeds, soybeans, lactic plants and rice bran.

유종자 및 유과실은 이들이 잘 융합할 수 있는 세분도로 분쇄하는 것이 적합하다. 글리세리드류, 유지류, 유종자류 및 유과실류로 되는 군 중에서 선택한 글리세리드-함유 물질은 개별적으로 사용해도 좋고, 또는 필요에 따라 2개 이상의 개개의 글리세리드-함유 물질들의 혼합물을 사용해도 좋다.Seeds and fruit are suitable to be ground into fine granules where they can fuse well. Glyceride-containing materials selected from the group consisting of glycerides, fats, oils, oils and fruits may be used individually, or a mixture of two or more individual glyceride-containing materials may be used as necessary.

글리세리드-함유 물질을 배지의 중량에 각각 기초해서 배지가 0.3~4.0%의 글리세리드, 적합하기로는 0.5~3.5%의 글리세리드, 더 적합하기로는 0.7~3.0%의 글리세리드를 함유하는 양으로 배지에 부가한다.The glyceride-containing material is added to the medium in an amount containing 0.3-4.0% glycerides, suitably 0.5-3.5% glycerides, more suitably 0.7-3.0% glycerides, based on the weight of the medium, respectively. .

부가하고자 하는 유지의 양은 유지 중 글리세리드 함량에 기초해서 계산된다. 그러나, 유지의 주성분은 글리세리드이므로, 유지의 중량은 거의 글리세리드의 중량과 같다.The amount of fat or oil to be added is calculated based on the glyceride content in the fat or oil. However, since the main component of fats and oils is glycerides, the weight of fats and oils is almost equal to the weight of glycerides.

이와 마찬가지로, 부가하고자 하는 글리세리드-함유 유종자류 또는 유과실류의 양은 유종자류 또는 유과실류 중 글리세리드 함량에 기초해서 계산된다. 참고로 전형적인 유종자류 및 유과실류 중 글리세리드 함량을 다음 표에 나타낸다.Likewise, the amount of glyceride-containing oilseeds or fruit fruits to be added is calculated based on the glyceride content in the oilseeds or fruit fruits. For reference, the content of glycerides in typical oilseeds and fruits is shown in the following table.

글리세리드-함유물질을 갖는 식물유지분을 배지에 부가하면 DHT 및 ADD의 제조에 있어서 특별시 유익한 결과를 가져오며, DHT 및 ADD의 수율을 상당히 증가시킨다.The addition of plant fats with glyceride-containing substances to the medium has a very beneficial result in the production of DHT and ADD, which significantly increases the yield of DHT and ADD.

본 명세서에서 사용하는 "식물유지분"이란 용어는 오일을 함유하는 종자류 또는 과실유의 추출에서 얻은 분쇄한 잔유물인 "식물유지박"을 의미한다. 추출방법에 좌우되어, 단백질 및 지방분의 가변백분율이 유지분 중에 남게 될 것이다. 그러나 식물성 유지분의 어느 것이나 사용될 수 있다. 일반적으로, 상업적으로 이용할 수 있는 식물유지분이 적합하다.As used herein, the term "plant fat" refers to "plant fat" which is a pulverized residue obtained from the extraction of oil-containing seed oil or fruit oil. Depending on the extraction method, a variable percentage of protein and fat will remain in the fat. However, any vegetable oil may be used. In general, commercially available plant oils are suitable.

식물성 유지분의 적합한 예로 대두유분, 아마인유분, 면실유분, 참기름분, 낙화생유분 및 잇꽃유분이 있다.Suitable examples of vegetable oils are soybean oil, linseed oil, cottonseed oil, sesame oil powder, peanut oil and safflower oil.

첨가되는 식물성 유지분의 양은 사용되는 글리세리드-함유물질의 양에 따라 폭넓게 변하며, 일반적으로 글리세리드~함유물질의 중량에 약 0.1-약 50배, 적합하기로는 약 0.3-약 30배, 더 적합하기로는 약 0.6~약 20배의 범위이다. 그러나, 배지 중의 식물성 유지분의 농도는 배지의 중량에 기초해서 각각 약 0.3~약 15%, 적합하기로는 약 0.6~약 10%, 더 적합하기로는 약 1~약 8%이다. 글리세리드-함유물질의 보다 많은 양의 첨가는 글리세리드와 잘 동화할 수 있는 적당한 미생물의 선택을 요구한다.The amount of vegetable fat to be added varies widely depending on the amount of glyceride-containing material used, and generally about 0.1- about 50 times the weight of the glyceride-containing material, suitably about 0.3- about 30 times, and more suitably It ranges from about 0.6 to about 20 times. However, the concentration of vegetable oil in the medium is about 0.3% to about 15%, suitably about 0.6% to about 10%, and more preferably about 1% to about 8%, respectively, based on the weight of the medium. The addition of higher amounts of glyceride-containing materials requires the selection of suitable microorganisms that can well assimilate with glycerides.

실제로, 보다 낮은 정도로 글리세리드와 동화하는 미생물의 사용은 거의 미생물산화를 일으키지 않는데, 그 이유는 글리세리드가 잘 동화하지 않고, 이와 동시에 글리세리드가 괴상으로 되기 때문이다. 그리하여, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 미생물은 고도로 스테롤류와 글리세리드류와 동화될 수 있는 것이 요구된다.Indeed, the use of microorganisms that assimilate with glycerides to a lesser extent rarely causes microbial oxidation because glycerides do not assimilate well and at the same time glycerides become bulky. Thus, microorganisms that can be used in the method of the present invention are required to be highly assimilated with sterols and glycerides.

이와 같은 미생물의 예로서 다음과 같은 것들이 있다 :Examples of such microorganisms include:

아아스로박터속(Arthrobacter), 노카르디아속(Nocardia), 푸사리움속(Fusarium), 마이크로박테리움속(Microbacterium), 마이코박테리움속(Mycobacterium), 프로타미노박터속(Protaminobacter), 브레비박테리움속(Brevibacterium), 코리네박테리움속(Corynebacterium), 바실루스속(Bacillus), 세라티아속(Serratia), 아조토박터속(Azotobacter), 스트렙토미세속(Streptomyces), 알칼리게네스속(Alkaligenes) 및 슈도모나스속(Pseudomonas).Arthrobacter, Nocardia, Fusarium, Microbacterium, Mycobacterium, Protaminobacter, Brevibac Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Serratia, Azotobacter, Streptomyces, Alkaligenes ) And Pseudomonas.

상기의 미생물 중 대표적인 것은 다음과 같다.Representative of the above microorganisms are as follows.

아아스로박터 심플렉스(Arthobacter simplex)(IAM 1660), 브레비박테리움 리폴리티컴(Brevibacterium lipolyticum)(IAM 1398), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)(IFO 3083), 프로타미노박터 알보플라버스(Protaminobacter alboflavus)(ATCC 8458), 노카르디아 에리스로폴리스(Nocardia erythropolis)(ATCC 4277), 코리네박테리움 에퀴(Corynebacterium equi)(IAM 1038) 및 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium Phlei)(IFO 3158). 특별히 적합한 것은 아이스로박터 심플렉스 및 브레비박테리움리폴리티컴이다.Arthobacter simplex (IAM 1660), Brevibacterium lipolyticum (IAM 1398), Mycobacterium smegmatis (IFO 3083), Protaminobacter albo Protaminobacter alboflavus (ATCC 8458), Nocardia erythropolis (ATCC 4277), Corynebacterium equi (IAM 1038) and Mycobacterium Phlei (IFO) 3158). Particularly suitable are the Icelobacter simplex and Brevibacterium polypolycomb.

본 명세서에 사용하는 "IAM"이란 용어는 일본국 도꾜도, 동경대학교의 "응용미생물연구소"를 의미하는 것이고, "IFO"란 용어는 일본국 오사까의 "오사까 발효연구소"를 의미하는 것이다.As used herein, the term "IAM" means "Applied Microorganism Research Institute" of Tokyo, Tokyo University, and the term "IFO" means "Osaka Fermentation Research Institute" of Osaka, Japan.

본 발명의 방법은 상기한 미생물들에 한정되지 않는다.The method of the present invention is not limited to the microorganisms described above.

상기 미생물들의 2가지 이상의 혼합물을 또한 사용할 수 있다.Mixtures of two or more of these microorganisms may also be used.

글리세리드-함유 물질 및 식물유지분에 첨가해서 탄소원, 질소원 및 무기물질들에 배지에 화합할 수 있다. 탄소원의 예로서 n-파라핀류, α-올레핀류, 키실렌 등과 같은 탄화수소; 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 고급 알코올류와 같은 알코올류; 호박산, 초산, 고급지방산 등과 같은 유기산류 및 그의 염류; 전분, 말토오스, 슈크로오스, 글루코오스, 람노오스 등과 같은 단당류를 들 수가 있다.In addition to glyceride-containing materials and plant oils, carbon sources, nitrogen sources and inorganics can be combined in the medium. Examples of the carbon source include hydrocarbons such as n-paraffins, α-olefins, xylene, and the like; Alcohols such as methanol, ethanol, glycerol and higher alcohols; Organic acids and salts thereof such as succinic acid, acetic acid, higher fatty acids and the like; Monosaccharides such as starch, maltose, sucrose, glucose, rhamnose and the like.

탄소원, 질소원 및 기타 영양물질들을 함유하는 천연영양원들을 배지에 화합할 수 있다.Natural nutrients containing carbon, nitrogen and other nutrients can be combined in the medium.

이와 같은 천연영양원의 예로 하이테스트당밀,정제당밀 및 키실로스당밀을 함유하는 당밀유; 버개스(bagasse), 옥수수속대, 자주개자리, 코온스티잎리쿼, 디스틸러스 솔루블(distillers' solubles), 미액(대두 유분을 HCl로 가수분해하여 제조한 아미노산혼합물의 수용액), 어분, 효모, 밀기울, 육엑스(meatextract), 효모엑스, 감자엑스, 맥아엑스, 글루우텐, 펩톤, 글루타민산염, 아스파라긴, 글리신, 카세인, 카세인가수 분해물 및 탈지유가 있다.Examples of such natural nutrition sources include molasses oil containing high test molasses, refined molasses and xylose molasses; Bagasse, corncob, alfalfa, coon tea leaf liquor, distillers' solubles, fine liquid (aqueous solution of amino acid mixture prepared by hydrolyzing soybean oil with HCl), fishmeal, yeast, bran , Meat extract, yeast extract, potato extract, malt extract, gluten, peptone, glutamate, asparagine, glycine, casein, casein hydrolyzate and skim milk.

배지 중에 화합될 수 있는 적당한 무기물질의 예로 황산암모늄, 염화암모늄 등과 같은 질소원; 인산수소 2칼륨과 같은 칼륨 및 인원; 철, 구리, 마그네슘, 코발트, 아연, 칼슘 등의 염류를 들 수 있다.Examples of suitable inorganic materials that can be compounded in the medium include nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride and the like; Potassium and personnel such as dipotassium hydrogen phosphate; Salts, such as iron, copper, magnesium, cobalt, zinc, and calcium, are mentioned.

주성분들의 기능을 방해하지 않는다면 비타민과 같은 기타의 성분들이 배지 중에 존재할 수 있다.Other ingredients, such as vitamins, may be present in the medium as long as the main ingredients do not interfere with the function.

배지 중의 조성은 사용하는 미생물에 좌우된다. 탄소원, 질소원, 칼륨 및 마그네슘이 배지 중의 성분들로서 중요하다.The composition in the medium depends on the microorganism used. Carbon sources, nitrogen sources, potassium and magnesium are important as components in the medium.

폴리옥시알킬렌글리코올과 같은 항-포말제를 필요에 따라 배지 중에 화합할 수 있다. 그러나 항시 부가할 필요는 없는데, 그 이유는 글리세리드-함유물질이 항-포말제로서 작용하기 때문이다. 배지는 계면활성제를 함유할 수 있다. 이 활성제는 필요치 않지만, 통상으로 배지의 조작을 더욱 좋게 한다.Anti-foaming agents such as polyoxyalkylene glycols can be compounded in the medium as needed. However, it is not always necessary to add, since the glyceride-containing substance acts as an anti-foaming agent. The medium may contain a surfactant. This activator is not necessary, but usually the media is better operated.

적당한 계면활성제의 예로 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트, 솔비탄모노팔미테이트 및 폴리에틸렌글리코올모노스테아레이트가 있다.Examples of suitable surfactants are polyoxyethylene sorbitan monostearate, sorbitan monopalmitate and polyethyleneglycol monostearate.

DHT 및 ADD를 고수율로 얻기 위하여, 배지에 DHT 및 ADD의 산화억제제를 부가할 필요가 있다.In order to obtain high yields of DHT and ADD, it is necessary to add antioxidants of DHT and ADD to the medium.

이와 같은 억제제의 예로 니켈 및 코발트염류와 철 및 구리이온과 킬레이트 화합물을 형성할 수 있는 킬레이트제가 있다.Examples of such inhibitors include chelating agents capable of forming chelate compounds with nickel and cobalt salts and iron and copper ions.

이와 같은 킬레이트제의 대표적인 예로 1,10-페난트롤린, 2,2-비피리딜, 8-하이드록시퀴놀린, 쿠페론, 이소니코틴산하이드라지드, 0-페닐렌디아민 및 소디움 N,N'-디에틸-디티오카아바메이트가 있다. 이 종에서 특별히 적합한 것은 1,10-페난트롤린, 2,2'-비피리딜 및 8-하이드록시 퀴놀린이다.Representative examples of such chelating agents include 1,10-phenanthroline, 2,2-bipyridyl, 8-hydroxyquinoline, couperone, isicotinic acid hydrazide, 0-phenylenediamine and sodium N, N'- Diethyl-dithiocaamate. Particularly suitable in this species are 1,10-phenanthroline, 2,2'-bipyridyl and 8-hydroxy quinoline.

배지 중 킬레이트제의 농도는 킬레이트제의 성질 및 배지의 조성에 따라 폭 넓게 변하며, 이것은 일반적으로 약 1×10^-5-약 1×10^-2M의 범위이다.The concentration of the chelating agent in the medium varies widely depending on the nature of the chelating agent and the composition of the medium, which is generally in the range of about 1 × 10⁻⁵ -about 1 × 10⁻² M.

배지에 킬레이트제를 첨가하는 시기는 사용한 미생물 및 배지의 조성에 따라 폭넓게 변하며, 이것은 일반적으로 배양개시 후 10~60시간이다.The timing of adding the chelating agent to the medium varies widely depending on the microorganism used and the composition of the medium, which is generally 10 to 60 hours after the start of the culture.

배양온도는 통상으로 약 20°~약 37℃이다.The culture temperature is usually about 20 ° to about 37 ° C.

미생물을 아아스로박터속 또는 브레비박테리움 속에 속하는 것을 사용하는 경우에, 적합한 배양온도는 약 30℃이다. 미생물로서 마이코박테리움속에 속하는 것을 사용할 때에, 적합한 배양온도는 약 35℃이다.When using microorganisms belonging to the genus Aslobacter or Brevibacterium, a suitable incubation temperature is about 30 ° C. When using a microorganism belonging to the genus Mycobacterium, a suitable culture temperature is about 35 ° C.

배지의 초기의 pH는 pH5~8, 적합하기로는 pH 7 부근이 바람직하다.The initial pH of the medium is preferably pH 5-8, preferably around pH 7.

건열산균 또는 습열산균 후, 스테로이드 기질은 어떤 적당한 방법, 예를 들면 분제 또는 디메틸포름아미드와 같은 적당한 용매 중에 용해시킨 용액형태로, 또는 이것을 초음파처리에 의해 미세하게 분산시켜 제조한 현탁액의 형태로 첨가한다.After dry or wet thermolysis, the steroid substrate is added in the form of a solution dissolved in any suitable method, for example powder or dimethylformamide, or in the form of a suspension prepared by microdispersion by sonication. do.

스테로이드기질과 계면활성제는 동시에 부가하는 것이 적합한데, 그 이유는 스테로이드기질의 유화가 증가되기 때문이다.It is suitable to add the steroid substrate and the surfactant at the same time because the emulsification of the steroid substrate is increased.

배지에 스테로이드기질을 첨가하는 시기는 사용한 미생물 및 스테로이드기질의 성질에 따라 변한다.The timing of adding steroid substrate to the medium varies depending on the nature of the microorganisms used and the steroid substrate.

일반적으로, 스테로이드기질을 배양개시 후 30시간 이내에 첨가한다. 미생물의 생육이 충분하지 않은 경우에는, 스테로이드기질을 배양개시 후 30시간 이후에 첨가한다. 또, 미생물의 생육에 따라서 스테로이드기질을 분할 첨가할 수 있다.Generally, steroid substrates are added within 30 hours after the start of the culture. If the growth of microorganisms is not sufficient, the steroid substrate is added 30 hours after the start of the culture. In addition, the steroid substrate can be separately added according to the growth of microorganisms.

본 발명의 방법에 의해 배지 중에 첨가된 글리세리드-함유물질과 식물유지분은 미생물산화의 전단계에서 미생물의 생육을 촉진하는데 유효하므로, 이들은 일반적으로 접종개시시에 첨가한다.Glyceride-containing substances and plant fats added in the medium by the method of the present invention are effective for promoting the growth of microorganisms in the preliminary stage of microbial oxidation, so they are generally added at the start of inoculation.

글리세리드-함유물질과 식물유지분은 스테로이드의 C-17에서 측쇄의 산화에 있어서 특별히 유효한 것으로 추정된다. 그리하여 스테로이드 기질의 부가시에 또는 스테로이드기질의 부가 후 약 50시간 이내에 글리세리드-함유물질과 식물유지분을 부가하면 DHT 및 ADD의 수율이 상당히 증가한다.Glyceride-containing substances and plant oils are believed to be particularly effective for the oxidation of side chains in the C-17 of steroids. Thus, the addition of glyceride-containing substances and plant fats at the time of addition of the steroid substrate or within about 50 hours after addition of the steroid substrate significantly increases the yield of DHT and ADD.

발효도중에 글리세리드-함유물질을 분할 첨가하여 상기한 범위 내의 최종농도를 얻는 것이 또한 적합한데, 그 이유는 이것이 상기한 바와 같이 항-포말제로서 작용하기 때문이다. 여기에서 사용한 "최종농도"란 용어는, 비록 글리세리드가 동화의 결과로서 발효 중에 감소한다 하더라도, 배지 중에 부가한 글리세리드-함유물질에 함유된 총 글리세리드의 농도를 의미한다.It is also suitable to add the glyceride-containing material during fermentation in portions to obtain a final concentration within the above range since it acts as an anti-foaming agent as described above. The term "final concentration" as used herein refers to the concentration of total glycerides contained in the glyceride-containing material added in the medium, even if glycerides decrease during fermentation as a result of assimilation.

본 발명의 방법에 의하여, DHT 및 ADD가 얻어진다. 상기한 바와 같이 스테롤류의 산화용에 제안된 기구의 관점에서, ADD는 DHT의 C-17에서 수산기의 산화에 의해 형성되는 것으로 추정된다. 실제로, 첨부도면에 나타낸 바와 같이, 배양 초기에 보다 높은 농도를 갖는 DHT의 농도는 스테로이드 기질의 산화가 진행됨에 따라 감소하고, 이와 동시에, ADD의 농도도 증가한다. 다음에, DHT의 보다 높은 농도를 얻기 위해, 배양은 산화의 초기단계에 종료시켜야 하며, 보다 높은 농도의 APD를 얻기 위해, 배양은 장기간 동안 계속해야 된다.By the method of the present invention, DHT and ADD are obtained. In view of the mechanism proposed for the oxidation of sterols as described above, it is assumed that ADD is formed by oxidation of hydroxyl groups at C-17 of DHT. Indeed, as shown in the accompanying drawings, the concentration of DHT with a higher concentration at the beginning of culture decreases as oxidation of the steroid substrate proceeds, and at the same time, the concentration of ADD also increases. Next, in order to obtain higher concentrations of DHT, the culture must be terminated at an early stage of oxidation, and in order to obtain higher concentrations of APD, the culture must continue for a long time.

보다 높은 농도로 DHT 또는 ADD를 얻기 위해 소요되는 배양시간은 미생물의 종류, 배양온도 및 배지의 조성에 따라 폭넓게 변화한다. 보다 높은 농도의 DHT를 얻기 위해, 킬레이트제를 부가한 후 약 15~35시간 동안 배양을 종료시키는 것이 적합하며, 한편 보다 높은 농도의 ADD를 얻기 위해 킬레이트제를 부가한 후에 약 35~90시간 동안 배양을 시키는 것이 적합하다.Incubation time for obtaining DHT or ADD at a higher concentration varies widely depending on the type of microorganism, the culture temperature and the composition of the medium. In order to obtain higher concentrations of DHT, it is suitable to terminate the incubation for about 15 to 35 hours after adding the chelating agent, while for about 35 to 90 hours after adding the chelating agent to obtain higher concentrations of ADD. It is suitable to incubate.

발효종료 후, 생성되는 DHT 및 ADD를 종래법으로 발효액으로부터 회수한다. 생성물의 회수에 특별히 유익한 방법은 발효액을 물과 혼화할 수 없는 유기용매, 예를 들면 염화메틸렌, 클로로포름, 에에테르, 벤젠, 톨루엔, 초산에틸 등으로 추출하는 것이다.After fermentation ends, the resulting DHT and ADD are recovered from the fermentation broth by conventional methods. A particularly advantageous method for the recovery of the product is to extract the fermentation broth with an organic solvent that is incompatible with water, such as methylene chloride, chloroform, ether, benzene, toluene, ethyl acetate and the like.

화합된 유기추출물들을 증발시킨 후에, 생성되는 제품들을 적당한 용매, 예를 들면 사이클로헥산으로 재결정하거나 또는 적당한 용매, 예를 들면 키실렌-헥산과 혼합하여 재침전시켜 정제할 수 있다.After evaporation of the combined organic extracts, the resulting products can be purified by recrystallization with a suitable solvent such as cyclohexane or by reprecipitation by mixing with a suitable solvent such as xylene-hexane.

선택적인 방법으로, 생성물들을 실질적으로 순수한 형태로 분리시킨 개개의 생성물들을 얻기 위해 실리카 또는 알루미나를 채운 컬럼으로 크로마토그라피이할 수 있다. 석유에에테르, 벤젠, 클로로포름, 에에테르, 메탄올 등과 같은 전개제를 사용할 수 있다. 크로마토그라피이 과정에서 얻은 분리된 생성물들을 적당한 용매로 재결정하여 또 정제할 수 있다.Alternatively, the product can be chromatographed with a column filled with silica or alumina to obtain individual products that separate the products into substantially pure form. Developers such as petroleum ether, benzene, chloroform, ether, methanol and the like can be used. Chromatography The isolated products obtained during this procedure can be purified again by recrystallization with a suitable solvent.

본 발명을 일반적으로 기술했지만, 본 발명은 다음의 실시예에서 더 구체적으로 기술되며, 이 실시예들은 설명의 목적으로 기술된 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다.Although the present invention has been described in general, the invention is described in more detail in the following examples, which are described for illustrative purposes and do not limit the invention.

다음의 실시예들에서, 생성물들의 분석은 가스크로마토그라피이로 했으며, 백분율은 면적항으로 표시했다. 달리 지적하지 않는 한, 다음의 실시예들에 있어서 백분율은 중량부에 의한 것이다.In the following examples, the analysis of the products was done with gas chromatography, and the percentages were expressed in area terms. Unless indicated otherwise, percentages in the following examples are by weight.

[실시예 1]Example 1

이 실시예는 ADD의 수량에 있어서 첨가되는 면실유의 양의 효과를 설명한 것이다.This example illustrates the effect of the amount of cottonseed oil added on the amount of ADD.

다음과 같은 조성을 갖는 종자배지를 제조했다.Seed medium having the following composition was prepared.

효모엑스 1.0%Yeast extract 1.0%

육엑스 1.0%IX 1.0%

펩 톤 1.0%Peptone 1.0%

물 잔여량Water remaining

종자배지의 pH를 NaOH로 7.0으로 조정했다. 500㎖용 교반풀라스크에 종자배지 100㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그 내용물을 120℃에서 15분동안 고압살균한 다음 냉각했다. 이 배지를 아아스로 박터 심플렉스(IAM 1660)의 1백금이(loopful)로 접종하고, 접종된 배지를 매분당 130 스토로크에서 7^-cm 스트로크를 갖는 왕복 교반기에서 28℃의 온도에서 48시간 동안 배양했다.The pH of the seed medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 100 ml of seed medium was added to a 500 ml stirring pull-out flask. The full flask and its contents were autoclaved at 120 ° C. for 15 minutes and then cooled. This medium was inoculated with a loopful of Aasbacter simplex (IAM 1660), and the inoculated medium was incubated for 48 hours at a temperature of 28 ° C. in a reciprocating stirrer with 7^- cm stroke at 130 stroke per minute. Incubated.

종자배지의 것과 동일한 조성을 갖는 주발효배지를 사용하고, 예외로 제1표에 나타낸 면실유의 소요량을 표에 나타낸 농도를 얻기 위해 배지에 부가했다. 주발효배지의 pH를 NaOH로 7.0으로 조정했다. 500㎖용 교반풀라스크에 주발효배지 50㎖를 부가했다. 풀라스크와 그 내용물을 120℃의 온도에서 20분 동안 고압살균한 다음 냉각했다. 이 풀라스크를 상기에서 수득한 종자배액 2㎖로 접종한 다음 매분당 130 스트로크에서 7-cm 스트로크를 갖는 왕복교반기에서 30℃에서 배양했다.A main fermentation medium having the same composition as that of the seed medium was used, except for the requirement of cottonseed oil shown in Table 1, added to the medium to obtain the concentrations shown in the table. The pH of the main fermentation medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 50 ml of the main fermentation medium was added to a 500 ml stirring pull flask. The full flask and its contents were autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes and then cooled. This full flask was inoculated with 2 ml of the seed drainage obtained above, and then incubated at 30 ° C. in a reciprocating agitator having 130 strokes per minute and 7-cm strokes.

접종 개시 후 약 20시간 후에, 물 2㎖에 현탁시킨 콜래스테롤 150mg을 부가했다. 접종 개시 후 28시간 후에, 2,2'-비피리딜 4.0mg을 부가했다. 2,2'-비피리딜의 부가 후 85시간 후에, 배양을 멈추었다. 발효액을 초산에틸 150㎖로 추출했다. 이 추출물을 농축하고, 실리카겔로 크로마토그라피이 하고, 벤젠-아세톤(1 : 1)으로 전개하여 중간산화생성물과 스테로이드기질로 분리했다. ADD의 수량을 표 1에 나타냈다.Approximately 20 hours after the start of inoculation, 150 mg of cholesterol suspended in 2 ml of water was added. 28 hours after the start of inoculation, 4.0 mg of 2,2'-bipyridyl was added. 85 hours after addition of 2,2'-bipyridyl, the culture was stopped. The fermentation broth was extracted with 150 ml of ethyl acetate. The extract was concentrated, chromatographed with silica gel, developed with benzene-acetone (1: 1), and separated into intermediate oxidation products and steroid substrates. The quantity of ADD is shown in Table 1.

콜레스테롤 대신에 β-시토스테롤 및 캄페스테롤(2 :1)의 혼합물, 스티그스테롤, 콜레스트-4-엔-3-온 또는 콜레스타-1,4-디엔-3-온을 사용하여, 상기한 배양을 반복했다.Instead of cholesterol, a mixture of β-sitosterol and camphorsterol (2: 1), stigsterol, choles-4-en-3-one or cholesta-1,4-dien-3-one, are described above. Incubation was repeated.

첨가해서, 면실유를 부가하지 않고 상기한 접종을 반복했다. 그 결과를 표 1에 함께 나타냈다.The above inoculation was repeated without adding cottonseed oil. The result was combined with Table 1 and shown.

[표 1]TABLE 1

[실시예 2]Example 2

이 실시예는 배지에 지방분의 부가에 의한 ADD의 수량의 증가를 설명한 것이다.This example illustrates the increase in the amount of ADD due to the addition of fat to the medium.

다음과 같은 조성을 갖는 배지를 제조했다 :A medium with the following composition was prepared:

슈크로오스 2.0%Sucrose 2.0%

NaNO₃1.0%NaNO₃ 1.0%

효모엑스 1.0%Yeast extract 1.0%

K₂HPO₄0.25%K₂ HPO₄ 0.25%

MgSO₄·7H₂O 0.03%MgSO₄ 7H₂ O 0.03%

표 2에 나타낸 농도를 행하기 위한 지방분의 양 및 잔류물의 양The amount of fat and the amount of residue for carrying out the concentrations shown in Table 2

배지의 pH를 NaOH로 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 배지 50㎖를 첨가했다. 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 10분 동안 고압살균한 다음 냉각시켰다. 이 풀라스크를 실시예 1과 동일한 방법으로 수득한 종자배양액 1㎖로 접종하고, 여기에서 예외로 아아스로박터 심플렉스(IAM 1660) 대신에 브레비박테리움 리폴리티컴(IAM 1398)을 사용했다. 접종한 배지를 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 왕복교반기에서 30℃에서 배양했다. 배양개시 후 15시간 후에, 이 배지에 콜레스테롤 200mg을 부가했다. 배양개시 후 28시간 후에, 1,10-페난트렌트롤린 1.0mg을 부가했다. 70시간 동안 더 배양을 계속했다. 그 후에, 생성물을 초산에틸로 추출하고 실시예 1과 동일한 방법으로 분리했다. ADD의 수량을 표 2에 나타냈다.The pH of the medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 50 ml of medium was added to a 500 ml stirred pull flask. Pulask and its contents were autoclaved for 10 minutes at a temperature of 120 ° C. and then cooled. This full flask was inoculated with 1 ml of the seed culture solution obtained in the same manner as in Example 1, except that Brevibacterium lipoliticom (IAM 1398) was used instead of the Aaslobacter simplex (IAM 1660). . The inoculated medium was incubated at 30 ° C. in the same reciprocator as described in Example 1. 15 hours after the start of the culture, 200 mg of cholesterol was added to the medium. 28 hours after the start of the culture, 1.0 mg of 1,10-phenanthrenethroline was added. The incubation was continued for 70 hours. Thereafter, the product was extracted with ethyl acetate and separated in the same manner as in Example 1. The quantity of ADD is shown in Table 2.

[표 2]TABLE 2

[실시예 3]Example 3

이 실시예는 배지에 글리세리드의 부가에 의한 ADD의 수량의 증가를 설명하는 것이다. 실시예 2를 반복했지만, 예외로 1,10-페난트롤린 대신에 8-하이드록시퀴놀린 3.0mg을 사용하고, 지방분 대신에 일정량의 글리세리드를 부가하여 제3표에 나타낸 바와 같은 농도를 만들었고 배양을 8-하이드록시퀴놀린의 부가 후 28시간 후에 (8-하이드록시퀴놀린의 부가 후 56시간 후에) 중지했다. 배양을 이 초기단계에서 중지했을 때에, DHT는 ADD와 함께 형성되었다. 배양 종료 후, 발효액을 실시예 1과 동일한 방법으로 처리했다. 그 결과를 표 3에 나타냈다.This example illustrates the increase in the amount of ADD due to the addition of glycerides to the medium. Example 2 was repeated, with the exception of 3.0 mg of 8-hydroxyquinoline in place of 1,10-phenanthroline and the addition of an amount of glycerides in place of fat to make the concentrations as shown in Table 3 Stopped 28 hours after addition of 8-hydroxyquinoline (56 hours after addition of 8-hydroxyquinoline). When incubation was stopped at this early stage, DHT was formed with ADD. After the incubation was completed, the fermentation broth was treated in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 3.

[표 3]TABLE 3

첨부도면은 접종시간, 콜레스테롤의 농도 및 본 실시예의 시험예 4에서 형성한 그의 산화생성물 사이의 관계를 설명한 것이다.The accompanying drawings illustrate the relationship between the inoculation time, the concentration of cholesterol and its oxidation product formed in Test Example 4 of this example.

[실시예 4]Example 4

본 실시예는 배지에 평지씨 기름의 부가에 의한 ADD의 증가수량을 설명한 것이다.This example illustrates the increased amount of ADD due to the addition of rapeseed oil to the medium.

다음과 같은 조성을 갖는 종자배지를 다음과 같이 제조했다 :Seed media having the following composition were prepared as follows:

n-파라핀(주성분 C₁₄) 2.0%n-paraffin (Principal component C₁₄ ) 2.0%

황산암모늄 0.5%Ammonium Sulfate 0.5%

K₂HPO₄0.25%K₂ HPO₄ 0.25%

MgSO₄·7H₂O 0.1%MgSO₄ 7H₂ O 0.1%

코온스티잎리쿼 0.5%Coon Tea Leaf Liquor 0.5%

물 잔류량Water residue

종자 배지의 pH를 NaOH로 7.5로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 종자배지 100㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 15분 동안 교반한 다음 고압살균했다. 종자배지를 노카르디아 에리스로폴리스(ATCC 4277)의 1백금이로 접종하고, 접종된 배지를 실시예 1에서 기술한 것과 유사한 왕복교반기상에서 30℃의 온도에서 35시간 동안 배양했다.The pH of the seed medium was adjusted to 7.5 with NaOH. 100 ml of seed medium was added to a 500 ml stirring pull-out flask. The pulllasque and its contents were stirred at a temperature of 120 ° C. for 15 minutes and then autoclaved. Seed medium was inoculated with platinum of Nocardia erythropolis (ATCC 4277) and the inoculated medium was incubated for 35 hours at a temperature of 30 ° C. on a reciprocating agitator similar to that described in Example 1.

다음과 같은 조성을 갖는 주발효배지를 제조했다 :The main fermentation medium was prepared having the following composition:

글루코오스 1.0%Glucose 1.0%

효모엑스 0.5%Yeast extract 0.5%

맥아엑스 0.5%Malt 0.5%

육엑스 0.5%Sixx 0.5%

K₂HPO₄0.1%K₂ HPO₄ 0.1%

MgSO₄·7H₂O 0.02%MgSO_{4 7} H₂ O 0.02%

평지씨기름 1.0%Rapeseed oil 1.0%

배지의 pH를 NaOH으로 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 주발효배지 50㎖를 부가했다. 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 20분 동안 고압살균한 다음에 냉각시켰다. 이 풀리스크에 상기에서 얻은 종자배양액 2㎖로 접종하고 실시예 1에서 기술한 것과 유사한 왕복교반기상에서 30℃의 온도에서 접종했다. 주발효의 개시 후 20시간 후에, 콜레스테롤 150mg을 부가했다. 주발효의 개시 후 28시간후에, 2,2,-비피리딜 4.7mg을 부가했다. 2,2'-비피리딜의 부가 후 70시간 후에, 배양을 중지했다. 배양종료 후, 실시예 1과 동일한 처리를 하여 ADD 12mg을 얻었다.The pH of the medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 50 ml of the main fermentation medium was added to a 500 ml stirring pull flask. Pulask and its contents were autoclaved for 20 minutes at a temperature of 120 ° C. and then cooled. This pool was inoculated with 2 ml of the seed culture solution obtained above and inoculated at a temperature of 30 ° C. on a reciprocating agitator similar to that described in Example 1. Twenty hours after the start of the main fermentation, 150 mg of cholesterol was added. 28 hours after the start of the main fermentation, 4.7 mg of 2,2, -bipyridyl was added. After 70 hours after the addition of 2,2'-bipyridyl, the culture was stopped. After completion of the culture, the same treatment as in Example 1 was carried out to obtain 12 mg of ADD.

상기한 방법을 반복했지만, 예외로 평지씨 기름을 배지에 부가하지 않고, ADD8mg을 수득했다.The above method was repeated, except that rapeseed oil was not added to the medium, and ADD8 mg was obtained.

[실시예 5]Example 5

본 실시예는 ADD의 수량에 대한 평지씨기름 및 대두유분의 부가효과를 설명한 것이다. 다음과 같은 조성을 갖는 종자배지를 제조했다.This example describes the additive effects of rapeseed oil and soybean oil on the yield of ADD. Seed medium having the following composition was prepared.

글루코오스 1.0%Glucose 1.0%

육엑스 0.3%Hex X 0.3%

펩톤 1.0%Peptone 1.0%

NaCl 0.5%NaCl 0.5%

물 잔여량Water remaining

종자배지의 pH를 NaOH로 7.2로 조정했다. 500㎖용 교반풀라스크에 종자배지 100㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 20분 동안 고압살균한 다음 냉각했다. 이 풀라스크를 마이코박테리움 펠리(IFO 3158)의 1백금이로 접종하고 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 왕복교반기로 35℃의 온도에서 70시간 동안 배양했다.The pH of the seed medium was adjusted to 7.2 with NaOH. 100 ml of seed medium was added to a 500 ml stirring pull-out flask. The fulasque and its contents were autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes and then cooled. This full flask was inoculated with platinum of Mycobacterium Felis (IFO 3158) and incubated for 70 hours at a temperature of 35 ° C. with the same reciprocating agitator described in Example 1.

다음과 같은 조성을 갖는 주발효배지를 제조했다.A main fermentation medium was prepared having the following composition.

코온스티잎리퀴 2.0%COON Tea Leaf Liqueur 2.0%

글루코오스 2.0%Glucose 2.0%

글루타민산나트륨 0.4%Sodium Glutamate 0.4%

아스파라긴 0.2%Asparagine 0.2%

KH₂PO₄0.2%KH₂ PO₄ 0.2%

평지씨기름 1.0%Rapeseed oil 1.0%

물 잔여량Water remaining

배지의 pH를 NaOH으로 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 주발효배지 50㎖를 부가했다. 이풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 20분 동안 고압살균한 다음 냉각시켰다. 이 풀라스크를 상기에서 얻은 종자배양액 2㎖로 접종하고 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 왕복교반기로 35℃의 온도에서 배양했다.The pH of the medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 50 ml of the main fermentation medium was added to a 500 ml stirring pull flask. Ipulac and its contents were autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes and then cooled. This full flask was inoculated with 2 ml of the seed culture solution obtained above and incubated at a temperature of 35 ° C. with the same reciprocating agitator described in Example 1.

주발효 개시 후 40시간 후에, 콜레스테롤 150mg을 배지에 첨가했다. 주발효개시 후 48시간 후에, 2,2'-비피리딜 6.2mg을 배지에 부가했다. 2,2'-비피리딜의 부가 후 96시간 후에, 발효를 중지했다. 발효종료 후, 실시예 1과 동일한 처리를 하여 ADD 25mg을 얻었다.40 hours after the start of the main fermentation, 150 mg of cholesterol was added to the medium. 48 hours after the start of the main fermentation, 6.2 mg of 2,2'-bipyridyl was added to the medium. After 96 hours after the addition of 2,2'-bipyridyl, fermentation was stopped. After the end of fermentation, the same treatment as in Example 1 was carried out to obtain ADD 25 mg.

상기한 방법을 반복했으나, 예외로 대두유분 4.0%가 배지 중에 존재하였으며, ADD 38mg이 얻어졌다.The procedure was repeated, with the exception that soybean oil 4.0% was present in the medium and 38 mg of ADD was obtained.

상기한 방법을 반복했으나, 예외로 평지씨기름을 배지에 부가하지 않고, ADD 20mg을 얻었다.The above method was repeated, except that rapeseed oil was not added to the medium, andADD 20 mg was obtained.

[실시예 6]Example 6

본 실시예는 식물유지분의 부가와 유종자분쇄물의 부가에 의한 ADD수량의 증가를 설명하는 것이다.This example illustrates the increase in the amount of ADD due to the addition of plant oil and the addition of oilseed grind.

실시예 2를 반복했지만, 예외로 배지에 첨가한 물질들은 표 4에 나타낸 바와 같이 변화시켰고, 1,10-페난트롤린 대신에, 2,2'-비피리딜을 표 4에 나타낸 양으로 부가했다. 본 실시예에 사용한 유종자는 웨이링 블렌다(Waring Blender)에서 분쇄한 것이다.Example 2 was repeated, with the exception that the materials added to the medium were changed as shown in Table 4, and instead of 1,10-phenanthroline, 2,2'-bipyridyl was added in the amount shown in Table 4 did. The oil seed used in the present example was ground in a Waring Blender.

[표 4]TABLE 4

[실시예 7]Example 7

본 실시예는 ADD의 수량에 대한 평지씨기름의 부가시기의 효과를 설명한 것이다.This embodiment describes the effect of the addition time of rapeseed oil on the quantity of ADD.

다음과 같은 조성물을 갖는 배지를 제조했다.A medium having the following composition was prepared.

슈크로오스 2.0%Sucrose 2.0%

NaNO₃1.0%NaNO₃ 1.0%

효모엑스 1.0%Yeast extract 1.0%

K₂HPO₄0.25%K₂ HPO₄ 0.25%

MgSO₄·7H₂O 0.03%MgSO₄ 7H₂ O 0.03%

평지씨기름 3.0%Rapeseed oil 3.0%

물 잔여량Water remaining

배지의 pH를 NaOH으로 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 배지 50㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 10분 동안 고압살균한 다음 냉각했다. 이 풀라스크를 실시예 2와 동일한 방법으로 얻은 종자배양액 1㎖로 접종했다. 접종한 배지를 실시예 1에 기술한 것과 유사한 왕복교반기로 30℃의 온도에서 배양했다. 배양개시 후 25시간 후에, 콜레스테롤 250mg을 부가했다. 배양개시 후 30시간 후에, 2,2'-비피리딜 5.5mg을 첨가했다. 표 5에 나타낸 바와 같이 접종개시 후 일정한 시간후에, 평지씨기름 1.0g을 배지에 부가했다. 배양개시 후 110시간 후에, 배양을 중지했다. 형성된 ADD를 실시예 1과 동일한 방법으로 분리했다.The pH of the medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 50 ml of medium was added to a 500 ml stirring pull flask. The pulllasque and its contents were autoclaved at a temperature of 120 ° C. for 10 minutes and then cooled. This full flask was inoculated with 1 ml of seed culture solution obtained in the same manner as in Example 2. The inoculated medium was incubated at a temperature of 30 ° C. with a reciprocating agitator similar to that described in Example 1. 25 hours after the start of the culture, 250 mg of cholesterol was added. 30 hours after the start of the culture, 5.5 mg of 2,2'-bipyridyl was added. As shown in Table 5, 1.0 g of rapeseed oil was added to the medium after a certain time after the start of inoculation. After 110 hours from the start of the culture, the culture was stopped. The formed ADD was separated in the same manner as in Example 1.

상기한 방법을 반복하였으나, 예외로 평지씨기름의 부가시기를 표 5에 나타낸 바와 같이 변화시켰다.The above-described method was repeated, except that the addition time of rapeseed oil was changed as shown in Table 5.

[표 5]TABLE 5

[실시예 8]Example 8

본 실시예는 배지에 식물유지분의 부가에 의한 ADD의 증가된 수량을 설명한 것이다. 다음과 같은 조성을 갖는 종자배지를 제조했다.This example illustrates the increased yield of ADD due to the addition of plant oil to the medium. Seed medium having the following composition was prepared.

효모엑스 1.0%Yeast extract 1.0%

육엑스 1.0%IX 1.0%

펩톤 1.0%Peptone 1.0%

물 잔여량Water remaining

종자배지의 pH를 NaOH으로 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 종자배지 100㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 15분 동안 고압살균한 다음에 냉각했다. 이 배지를 아아스로박터 심플렉스(IAM 1660)의 1 백금이로 접종하고 접종한 배지를 실시예 1에 기술한 것과 유사한 왕복교반기로 28℃의 온도에서 약 48시간 동안 배양했다.The pH of the seed medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 100 ml of seed medium was added to a 500 ml stirring pull-out flask. The fulasque and its contents were autoclaved at a temperature of 120 ° C. for 15 minutes and then cooled. This medium was inoculated with 1 platinum of Asrobacter simplex (IAM 1660) and the inoculated medium was incubated at a temperature of 28 ° C. for about 48 hours with a reciprocating agitator similar to that described in Example 1.

종자배지의 것과 동일한 조성을 갖는 주발효배지를 사용했으나, 예외로 제6표에 나타낸 식물유지분의 소요량을 배지에 첨가하여 표에 나타낸 농도를 만들었다.The main fermentation medium having the same composition as that of the seed medium was used, except for the required amount of the plant fat shown in Table 6 to the medium to make the concentrations shown in the table.

주발효배지의 pH를 NaOH로 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 주발효배지 50㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 20분 동안 고압살균한 다음 냉각했다. 이 풀라스크를 위에서 얻은 종자배양액 2㎖로 접종하고, 그 다음에 7-cm 스트로크를 갖는 왕복교반기에 넣었다. 주발효를 30℃의 온도에서 행했다. 배양개시 후 20시간 후에, 물 2㎖에 현탁시킨 콜레스테롤 150mg을 첨가했다. 배양개시 후 28시간 후에, 2,2'-비피리딜 6.2mg을 부가했다. 2,2'-비피리딜의 부가 후 85시간 후에, 배양을 중지했다. 발효액을 초산에틸 150㎖로 추출했다. 이 추출물을 농축하고, 실리카겔로 크로마토그라피이하고, 벤젠-아세톤(1 :1)으로 전개하여, 중간산화생성물 및 스테로이드기질로부터 ADD를 분리했다. ADD의 수량을 표 6에 나타냈다.The pH of the main fermentation medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 50 ml of the main fermentation medium was added to a 500 ml stirring pull flask. The fulasque and its contents were autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes and then cooled. This full flask was inoculated with 2 ml of the seed culture solution obtained above, and then placed in a reciprocating agitator having a 7-cm stroke. Main fermentation was performed at a temperature of 30 ° C. 20 hours after the start of the culture, 150 mg of cholesterol suspended in 2 ml of water was added. After 28 hours from the start of the culture, 6.2 mg of 2,2'-bipyridyl was added. 85 hours after addition of 2,2'-bipyridyl, the culture was stopped. The fermentation broth was extracted with 150 ml of ethyl acetate. The extract was concentrated, chromatographed with silica gel, and developed with benzene-acetone (1: 1) to separate ADD from the intermediate oxidation product and the steroid substrate. The quantity of ADD is shown in Table 6.

콜레스테롤 대신에 β-시토스테롤 및 캄페스테롤(2 : 1)의 혼합물, 스티그마스테롤, 콜레스트-4-엔-3-온 또는 콜레스타-1,4-디엔-3-온을 사용하여 상기한 배양을 반복했다.The cultures described above were prepared using a mixture of β-sitosterol and camphorsterol (2: 1), stigmasterol, choles-4-en-3-one or cholesta-1,4-dien-3-one instead of cholesterol. Repeated.

첨가해서, 상기한 배양을 행했지만, 예외로 식물유지분을 배지에 부가하지 않았다.In addition, although the above-mentioned culture was performed, the plant fat was not added to the medium.

그 결과를 표 6에 함께 나타냈다.The result was combined with Table 6 and shown.

[표 6]TABLE 6

[실시예 9]Example 9

본 실시예는 ADD의 수량에 있어서 첨가되는 대두유 및 대두유분의 양의 효과를 설명한 것이다.This example illustrates the effect of the amount of soybean oil and soybean oil added on the yield of ADD.

실시예 8의 방법을 반복했지만, 예외로 다음과 같이 배지에 첨가되는 기질의 양을 변경했다 :The method of Example 8 was repeated with the exception of changing the amount of substrate added to the medium as follows:

(1) 기질로서 콜레스테롤 200mg을 사용했다.(1) 200 mg of cholesterol was used as a substrate.

(2) 대두유 및 대두유분을 소요량으로 첨가하여 표 7에 나타낸 바와 같은 농도를 만들었다.(2) Soybean oil and soybean oil were added in required amounts to make concentrations as shown in Table 7.

(3) 대두유분 8% 이상이 배지에 존재했고, 2,2'-비피리딜 7.8mg을 부가했다.(3) More than 8% soybean oil was present in the medium, and 7.8 mg of 2,2'-bipyridyl was added.

그 결과를 표 7에 나타냈다.The results are shown in Table 7.

[표 7a]TABLE 7a

[표 7b]TABLE 7b

[실시예 10]Example 10

본 실시예는 ADD의 수량에 대한 식물유지분의 부가효과를 설명한 것이다.This example illustrates the additive effect of plant fat on the quantity of ADD.

다음과 같은 조성을 갖는 배지를 제조했다.A medium having the following composition was prepared.

슈크로오스 2.0%Sucrose 2.0%

NaNO₃1.0%NaNO₃ 1.0%

효모엑스 1.0%Yeast extract 1.0%

K₂HPO₄0.25%K₂ HPO₄ 0.25%

MgSO₄·7H₂O 0.03%MgSO₄ 7H₂ O 0.03%

표 8에 나타낸 농도를 만드는데 필요한 식물유지분의 양The amount of plant oil required to produce the concentrations shown in Table 8.

물 잔여량Water remaining

배지의 pH를 NaOH로 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 배지 50㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 20분 동안 고압살균한 다음 냉각했다. 이 풀라스크를 실시예 8과 동일한 방법으로 얻은 종자배양액 1㎖로 접종하고 예외로 아아스로박터심플렉스(IAM 1660) 대신에 브레비박테리움폴리티컴(IAM 1398)을 사용했다. 접종한 배지를 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 왕복교반기로 30℃의 온도에서 배양했다. 배양개시 후 15시간 후에, 콜레스테롤 200mg을 부가했다. 배양개시 후 28시간 후에, 표 8에 나타낸 2,2'-비피리딜의 양을 부가한 다음에 발효를 70시간 더 계속했다. 이 시간 후에, 생성물들을 초산에틸로 추출하고 실시예 8과 동일한 방법으로 분리했다. ADD의 수율을 표 8에 나타냈다.The pH of the medium was adjusted to 7.0 with NaOH. 50 ml of medium was added to a 500 ml stirring pull flask. The fulasque and its contents were autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes and then cooled. The full flask was inoculated with 1 ml of the seed culture solution obtained in the same manner as in Example 8, except that Brevibacterium polyticom (IAM 1398) was used instead of Aaslobacter simplex (IAM 1660). The inoculated medium was incubated at a temperature of 30 ° C. with the same reciprocating agitator described in Example 1. 15 hours after the start of the culture, 200 mg of cholesterol was added. 28 hours after the start of the culture, the amount of 2,2'-bipyridyl shown in Table 8 was added, followed by further fermentation for 70 hours. After this time, the products were extracted with ethyl acetate and separated in the same manner as in Example 8. The yield of ADD is shown in Table 8.

[표 8]TABLE 8

[실시예 11]Example 11

본 실시예는 DHT 및 ADD의 수량에 대한 글리세리드-함유물질과 식물유분의 부가효과를 설명한 것이다.This example illustrates the additive effect of glyceride-containing material and vegetable oil on the yield of DHT and ADD.

실시예 10을 반복했지만, 예외로 배지에 부가한 물질들을 표 9에 나타낸 바와같이 변경하고, 2,2'-비피리딜 대신에 표 9에 나타낸 1,10-페난트를린의 양을 사용하고, 배양을 배양개시 후 28시간 후(배양개시 후 56시간 후)에 중지했다.Example 10 was repeated, with the exception that the materials added to the medium were changed as shown in Table 9 and the amount of 1,10-phenanthrene shown in Table 9 was used instead of 2,2'-bipyridyl. The culture was stopped 28 hours after the start of culture (56 hours after the start of culture).

배양을 이 초기단계에서 중지했을 때에, DHT가 ADD와 함께 형성되었다. DHT 및 ADD의 수율을 표 9에 나타냈다.When incubation was stopped at this early stage, DHT was formed with ADD. The yields of DHT and ADD are shown in Table 9.

[표 9a]Table 9a

[표 9b]TABLE 9b

[실시예 12]Example 12

본 실시예는 ADD의 수량에 대한 식물유지분의 동시부가효과를 설명한 것이다.This example illustrates the simultaneous addition effect of plant fat on the quantity of ADD.

다음과 같은 조성을 갖는 배지를 제조했다.A medium having the following composition was prepared.

코온스티잎리퀴 2.0%COON Tea Leaf Liqueur 2.0%

글루코오스 1.0%Glucose 1.0%

글루타민산나트륨 0.4%Sodium Glutamate 0.4%

아스파라긴 0.2%Asparagine 0.2%

KH₂PO₄0.2%KH₂ PO₄ 0.2%

표 10에 나타낸 농도를 달성하는데 소요되는 식물유지분의 양The amount of plant oil required to achieve the concentrations shown in Table 10

물 잔여량Water remaining

배지의 pH를 NaOH로 부가하여 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 배지 50㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃의 온도에서 20분동안 고압살균했다. 이 풀라스크를 실시예 5와 동일한 방법으로 얻은 종자배양액을 2㎖로 접종했다. 접종한 배지를 실시예 1에서 기술한 것과 유사한 왕복교반기로 35℃의 온도에서 배양했다. 배양개시 후 40시간 후에, 배지에 콜레스테롤 1500mg을 부가했다. 배양개시 후 48시간 후에, 배지에 8-하이드록시퀴놀린 4.2mg을 부가했다. 8-하이드록시퀴놀린 부가 후 60시간 후에, 발효를 종료했다. 발효종료 후에, 형성된 ADD를 실시예 1에 기술한 것과 동일한 방법으로 발효액으로부터 회수했다. ADD의 수량을 표 10에 나타냈다.The pH of the medium was adjusted to 7.0 by addition of NaOH. 50 ml of medium was added to a 500 ml stirring pull flask. The fulasque and its contents were autoclaved for 20 minutes at a temperature of 120 ° C. The seed culture solution obtained in the same manner as in Example 5 was inoculated with 2 ml of this full flask. The inoculated medium was incubated at a temperature of 35 ° C. with a reciprocating agitator similar to that described in Example 1. 40 hours after the start of the culture, 1500 mg of cholesterol was added to the medium. 48 hours after the start of the culture, 4.2 mg of 8-hydroxyquinoline was added to the medium. 60 hours after 8-hydroxyquinoline addition, fermentation was complete | finished. After the end of the fermentation, the formed ADD was recovered from the fermentation broth in the same manner as described in Example 1. The quantity of ADD is shown in Table 10.

[표 10]TABLE 10

[실시예 13]Example 13

이 실시예는 또한 ADD의 수량에 대한 식물유지분의 부가효과를 설명한 것이다.This example also illustrates the additive effect of plant fat on the quantity of ADD.

코온스티잎리쿼 2.0%COON Tea Leaf Liquor 2.0%

글루코오스 2.0%Glucose 2.0%

글루타민산나트륨 0.4%Sodium Glutamate 0.4%

아스파라긴 0.2%Asparagine 0.2%

KH₂PO₄0.2%KH₂ PO₄ 0.2%

표 11에 나타낸 농도를 만드는데 소요되는 식물유지분의 양The amount of plant oil required to produce the concentrations shown in Table 11.

물 잔여량Water remaining

배지의 pH를 NaOH를 부가하여 7.0으로 조절했다. 500㎖용 교반풀라스크에 배지 50㎖를 부가했다. 이 풀라스크와 그의 내용물을 120℃에서 20분동안 고압살균했다. 이 풀라스크를 실시예 5와 동일한 방법으로 수득한 종자배양액 2㎖로 접종하고, 예외로 미생물로서 프로타미노박터 알보플라버스(ATCC8458)를 사용하고, 종자배양을 30℃에서 50시간 동안 행했다. 접종한 배지를 실시예 1과 동일한 교반기로 30℃에서 접종했다. 접종개시 후 25시간 후에, 콜레스테롤 200mg을 첨가했다. 배양개시 후 33시간 후에, 2,2'-비피리딘 6.2mg을 첨가했다. 배양개시 후 95시간 후에, 배양을 중지했다. 배양종료 후, 형성된 ADD를 실시예 1에서 기술한 것과 동일한 방법에 의하여 발효액으로부터 회수했다. ADD의 수량을 표 11에 나타냈다.The pH of the medium was adjusted to 7.0 by adding NaOH. 50 ml of medium was added to a 500 ml stirring pull flask. The fulllask and its contents were autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes. This full flask was inoculated with 2 ml of the seed culture solution obtained in the same manner as in Example 5, except that protaminobacter alboflavus (ATCC8458) was used as the microorganism, and seed culture was carried out at 30 ° C. for 50 hours. The inoculated medium was inoculated at 30 ° C. with the same stirrer as in Example 1. 25 hours after the start of inoculation, 200 mg of cholesterol was added. After 33 hours of incubation, 6.2 mg of 2,2'-bipyridine was added. 95 hours after the start of the culture, the culture was stopped. After incubation, the formed ADD was recovered from the fermentation broth by the same method as described in Example 1. The quantity of ADD is shown in Table 11.

[표 11]TABLE 11

본 발명의 상세한 설명에서, 이 기술계통의 통상의 지식을 가진자라면 전술한 본 발명의 원리나 범위를 이탈함이 없이 다수의 변조물을 제조할 수 있음이 명백하다.In the detailed description of the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that a number of modulations may be prepared without departing from the principles or scope of the invention described above.

Claims (1)

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17-하이드록시안드로스타-1,4-디엔-3-온 및 (또는) 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온을 제조할 수 있는 미생물을 갖는 배지중에서 스테롤, 또는 그의 4-엔-3-온 유도체 혹은 그의 1,4-디엔-3-온 유도체를 발효시켜 17-하이드록시안드로스타-1,4-디엔-3-온 및 (또는) 안드로스타-1,4-디엔-3,17-디온을 제조하는 방법에 있어서, 배지중에 모노, 디, 트리 및 혼합 글리세리드, 또는 유지류, 유종자류 및 유과실류로 되는 군 중에서 선택된 적어도 한개 이상의 글리세리드 함유 물질을 첨가하되, 여기에 함유된 글리세리드의 양이 배지중량에 대해서 적어도 0.3중량% 이상임을 특징으로 하는 공지 미생물에 의한 스테로이드의 산화방법.Sterol in a medium having a microorganism capable of producing 17-hydroxyandrostar-1,4-diene-3-one and / or androstar-1,4-diene-3,17-dione, or 4- 17-hydroxyandrostar-1,4-dien-3-one and / or androstar-1,4-diene- by fermenting an en-3-one derivative or 1,4-diene-3-one derivative thereof A process for preparing 3,17-dione, comprising adding mono, di, tri and mixed glycerides or at least one glyceride containing material selected from the group consisting of oils, oilseeds and fruit fruits in a medium, wherein A method for oxidizing steroids by known microorganisms, characterized in that the amount of glycerides is at least 0.3% by weight or more based on the weight of the medium.

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