본 출원은 히알루로니다제 폴리펩티드와 약물을 포함하는 피하투여용 조성물에 관한 것이다.The present application relates to a composition for subcutaneous administration comprising a hyaluronidase polypeptide and a drug.
히알루론산을 저분자화하는 효소의 총칭인 히알루로니다제는 Duran-Reynals에 의하여 처음에는 확산 인자로써 알려졌으나, 그 후 히알루론산(Hyaluronic acid)에 강력한 활성을 나타나는 것이 관찰되어 히알루로니다제 (Hyaluronidase)라 불리게 되었다. 이 효소는 그 작용기전에 따라 고환, 리소좀 및 벌독에 분포하는 히알루로네이트 4-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.35), 거머리에 존재하는 히알루로네이트 3-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.1.36)와 세균에 존재하는 히알루로네이트 라이아제(EC 4.2.2.1)로 분류된다.Hyaluronidase, a general term for enzymes that degrade hyaluronic acid, was first known as a diffusion factor by Duran-Reynals, but was later observed to exhibit strong activity on hyaluronic acid and was called hyaluronidase. Depending on its mechanism of action, this enzyme is classified into hyaluronate 4-glycanohydrolase (EC 3.2.1.35) distributed in the testis, lysosomes, and bee venom, hyaluronate 3-glycanohydrolase (EC 3.2.1.36) present in leeches, and hyaluronate lyase (EC 4.2.2.1) present in bacteria.
특히, 고환에서의 히알루로니다제(PH-20)는 정자의 첨체 부분의 글리코실포스파티딜이노시톨 고정부위(Glycosylphosphatidylinositol, GPI anchor)에 부착되어 있어서, 난자 외부의 두꺼운 외벽층을 분해하여 수정을 일으키는 중요한 효소이다. 또한, PH-20은 포유류의 피부에 존재하는 글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan) 중 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)과 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트에 존재하는 D-글루쿠로닉 산과 N-아세틸-D-글루코사민의 β(1-4) 결합을 가수 분해하는 것으로 알려져 있다. 이 효소들의 일반적인 분자식은 C2455H3775N617O704S21이며, 분자량은 53870.9 g/mol이다. 사람의 경우, HYAL1, HYAL2, HYAL3, 및 PH-20/SPAM1 등을 포함한 6개의 유전자가 이 효소와 연관되어 있다.In particular, hyaluronidase (PH-20) in the testis is an important enzyme that is attached to the glycosylphosphatidylinositol (GPI anchor) of the acrosome of the sperm, thereby decomposing the thick outer wall layer of the egg and causing fertilization. In addition, PH-20 is known to hydrolyze the β(1-4) linkage of hyaluronic acid (HA) among the glycosaminoglycans present in the skin of mammals, and D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine present in chondroitin and chondroitin sulfate. The general molecular formula of these enzymes is C2455H3775N617O704S21, and the molecular weight is 53870.9 g/mol. In humans, six genes have been linked to this enzyme, including HYAL1, HYAL2, HYAL3, and PH-20/SPAM1.
1950년대부터 히알루로니다제의 광범위한 사용에 대하여 포괄적으로 검토되었는데, 최초의 사용은 수액제의 피하 주입이었으며, 그 외의 정형외과, 안과, 성형외과, 치과, 구강외과, 부인과 및 이비인후과의 수술에서 국소 마취제 및 스테로이드의 확산을 증가시키기 위하여 침윤 및 차단 마취에 사용, 혈종과 같이 체액이 모인 것을 분산, 복막 유착의 방지, 결석 생성 방지 및 불임의 치료 등에 사용되고 있다.The wide range of uses of hyaluronidase has been comprehensively reviewed since the 1950s, with the first use being subcutaneous injection of fluids. It is also used for infiltration and blocking anesthesia to increase the diffusion of local anesthetics and steroids in orthopedic, ophthalmological, plastic, dental, oral surgery, gynecological and otolaryngological surgeries, to disperse collections of body fluids such as hematomas, to prevent peritoneal adhesions, to prevent stone formation and to treat infertility.
현재 시판되고 있는 히알루로니다제는 양(Ovine)이나 소(Bovine)의 고환에서 추출하여 사용하고 있다. 이러한 예로는 비트라제(Vitrase, ISTA Pharmaceuticals, Ovine source), 암파다제(Amphadase, Amphastar Pharmaceuticals, Bovine source)등이 있으며, 이러한 가공되지 않은 히알루로니다제를 적정농도로 녹여 바이알에 충전하여 동결건조하는 방법으로 제품화하고 있다. 제품화된 동물 유래의 히알루로니다제에는 이물 단백질이 포함되어 있으며 따라서, 알러지 반응을 일으키는 원인이 될 수 있고, 시간에 따른 안정성의 저하로 인하여 생리활성이 감소하여 다양한 방면에 적용하기에는 많은 문제를 남기고 있었다.Currently commercially available hyaluronidases are extracted from the testes of sheep (Ovine) or cows (Bovine). Examples of these include Vitrase (ISTA Pharmaceuticals, Ovine source) and Amphadase (Amphadase, Amphastar Pharmaceuticals, Bovine source). These raw hyaluronidases are dissolved in an appropriate concentration, filled into vials, and then lyophilized to produce products. Commercialized animal-derived hyaluronidases contain foreign proteins, which can cause allergic reactions. In addition, since stability decreases over time, physiological activity decreases, leaving many problems for application in various fields.
이러한 문제점을 개선하기 위하여 재조합 히알루로니다제에 대한 연구가 진행되었다. 재조합단백질은 대장균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등 다양한 종류의 세포에서 발현할 수 있다. 특히, 히알루로니다제의 경우 단백질 번역 후 변형과정에서 이루어지는 당화가 활성에 영향을 미친다. 이는 글리칸이 당단백질의 항원성, 구조적 폴딩, 가용성 및 안정성에 대한 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 이러한 관점에 볼 때, 당화가 이루어지는 효모나 곤충세포의 경우, 단백질번역 후 변형과정에서의 양상이 포유류와 다르기 때문에 여러 종류의 발현 세포 중 동물세포가 적합하고, 특히 동물 세포 중에서는 안전성이 확보된 CHO(Chinese Hamster Ovary)세포가 가장 적합하다.To improve these problems, research on recombinant hyaluronidase has been conducted. Recombinant proteins can be expressed in various types of cells, such as E. coli, yeast, insect cells, and animal cells. In particular, in the case of hyaluronidase, glycosylation that occurs during the post-translational modification process of proteins affects its activity. This is because glycans can affect the antigenicity, structural folding, solubility, and stability of glycoproteins. From this perspective, in the case of yeast or insect cells where glycosylation occurs, animal cells are suitable among various types of expression cells because the aspects of the post-translational modification process of proteins are different from those of mammals, and among animal cells, CHO (Chinese Hamster Ovary) cells, which have secured safety, are the most suitable.
최초의 PH-20에 대한 재조합 히알루로니다제는 Halozyme Therapeutic의 상품명 Hylenex로 판매하고 있으며, 피하주사, 유리체절제술 및 안과 장애 등 다양한 용도로 개발 중에 있다. 하지만, 히알루로니다제는 여전히 수율이나 안정성이 낮고 수요에 비하여 공급이 낮아, 수율 또는 안정성이 향상된 히알루로니다제가 필요한 실정이다.The recombinant hyaluronidase for the first PH-20 is sold under the trade name Hylenex by Halozyme Therapeutics and is under development for various applications including subcutaneous injection, vitrectomy and ophthalmic disorders. However, hyaluronidase still has low yield and stability and the supply is low compared to demand, so there is a need for hyaluronidase with improved yield or stability.
본 출원의 일 예는 안정성이 우수하고 활성이 증가된 히알루로니다제 폴리펩티드; 및 약물을 포함하는 피하투여용 조성물을 제공하기 위한 것이다.One example of the present application is to provide a composition for subcutaneous administration comprising a hyaluronidase polypeptide having excellent stability and increased activity; and a drug.
본 출원의 또 다른 일 예는 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제 폴리펩티드 및 항암제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.Another example of the present application is to provide a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising a hyaluronidase polypeptide according to an example of the present application and an anticancer agent.
본 출원의 일 예는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단이 절단된 폴리펩티드; 및 약물을 포함하는 피하투여용 조성물에 관한 것이다.One example of the present application relates to a composition for subcutaneous administration comprising a polypeptide having a C-terminal truncated amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase; and a drug.
본 출원의 또 다른 일 예는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단으로부터 1 내지 203의 정수 중 선택된 개수의 아미노산이 연속하여 결실된 폴리펩티드; 및 약물을 포함하는 피하투여용 조성물에 관한 것이다.Another example of the present application relates to a composition for subcutaneous administration, comprising a polypeptide having a sequence of amino acids of a wild-type hyaluronidase, wherein a selected number of amino acids from 1 to 203 are consecutively deleted from the C-terminus; and a drug.
본 출원의 또 다른 일 예는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단이 절단된 폴리펩티드; 및 항암제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.Another example of the present application relates to a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising a polypeptide having a C-terminal truncated amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase; and an anticancer agent.
본 출원의 또 다른 일 예는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단으로부터 1 내지 203의 정수 중 선택된 개수의 아미노산이 연속하여 결실된 폴리펩티드; 및 항암제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.Another example of the present application relates to a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising a polypeptide having a sequence of amino acids of a wild-type hyaluronidase in which a selected number of amino acids from 1 to 203 are consecutively deleted from the C-terminus; and an anticancer agent.
이하, 본 출원을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Below, the present application will be described in more detail.
본 출원의 일 예는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단이 절단된 폴리펩티드와 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 야생형 히알루로니다제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 것일 수 있다.An example of the present application relates to a polypeptide having a sequence identity of at least 90% with a C-terminal truncated polypeptide in the amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase. The wild-type hyaluronidase may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 히알루로니다제 활성을 가지며, 하기 (1) 내지 (6) 중 하나 이상의 특성을 가진다:A polypeptide according to an example of the present application has hyaluronidase activity and has one or more of the following properties (1) to (6):
(1) pH 3 내지 10, pH 3 내지 9, pH 3 내지 8, pH 3 내지 7, pH 3 내지 6.5, pH 3 내지 6, pH 3 내지 5.5, pH 3 내지 5, pH 3 내지 4.5, pH 4 내지 10, pH 4 내지 9, pH 4 내지 8, pH 4 내지 7, pH 4 내지 6.5, pH 4 내지 6, pH 4 내지 5.5, pH 4 내지 5, pH 4 내지 4.5, pH 4.5 내지 10, pH 4.5 내지 9, pH 4.5 내지 8, pH 4.5 내지 7, pH 4.5 내지 6.5, pH 4.5 내지 6, pH 4.5 내지 5.5, pH 4.5 내지 5, pH 5 내지 10, pH 5 내지 9, pH 5 내지 8, pH 5 내지 7, pH 5 내지 6.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 5 내지 5.5의 pH 범위에서 안정한 특성, 구체적으로 pH 3 초과 10 이하에 속하는 pH (예를 들어, pH 3 초과 7 미만, pH 3 초과 6.5 이하, pH 3 초과 6 이하, pH 3 초과 5.5 이하, pH 3 초과 5 이하에 속하는 pH, 일 예로 pH 5.0, pH 7.0, 또는 pH 10)에서 4주 보관 후 효소 활성이 초기 활성의 57% 이상, 또는 pH 3 이상 5 미만에 속하는 pH (예를 들어, pH 3 내지 4.5, 또는 pH 3 내지 4, 일 예로 pH 3.0)에서 4주 보관 후 효소 활성이 초기 활성의 32% 이상임,(1) pH 3 to 10, pH 3 to 9, pH 3 to 8, pH 3 to 7, pH 3 to 6.5, pH 3 to 6, pH 3 to 5.5, pH 3 to 5, pH 3 to 4.5, pH 4 to 10, pH 4 to 9, pH 4 to 8, pH 4 to 7, pH 4 to 6.5, pH 4 to 6, pH 4 to 5.5, pH 4 to 5, pH 4 to 4.5, pH 4.5 to 10, pH 4.5 to 9, pH 4.5 to 8, pH 4.5 to 7, pH 4.5 to 6.5, pH 4.5 to 6, pH 4.5 to 5.5, pH 4.5 to 5, pH 5 to 10, pH 5 to 9, pH 5 to 8, pH A stable property in a pH range of 5 to 7, pH 5 to 6.5, pH 5 to 6, or pH 5 to 5.5, specifically, an enzyme activity of at least 57% of the initial activity after storage for 4 weeks at a pH ranging from greater than pH 3 to less than 10 (e.g., greater than pH 3 to less than 7, greater than pH 3 to 6.5, greater than pH 3 to 6, greater than pH 3 to 5.5, greater than pH 3 to 5, for example, pH 5.0, pH 7.0, or pH 10), or an enzyme activity of at least 32% of the initial activity after storage for 4 weeks at a pH ranging from greater than pH 3 to less than 5 (e.g., pH 3 to 4.5, or pH 3 to 4, for example, pH 3.0),
(2) -20 내지 45℃ 온도에서 안정한 특성, 구체적으로 0℃ 미만에 속하는 온도에서 4주 보관 후 효소 활성이 초기 활성의 63% 이상, 0 내지 40℃ 온도 범위에 속하는 온도에서 4주 보관 후 효소 활성이 초기 활성의 83% 이상, 또는 40℃ 이상에 속하는 온도에서 4주 보관 후 효소 활성이 초기 활성의 52% 이상임,(2) - Stable properties at temperatures ranging from -20 to 45°C, specifically, enzyme activity of at least 63% of the initial activity after storage for 4 weeks at a temperature below 0°C, enzyme activity of at least 83% of the initial activity after storage for 4 weeks at a temperature ranging from 0 to 40°C, or enzyme activity of at least 52% of the initial activity after storage for 4 weeks at a temperature ranging from 40°C or higher.
(3) 높은 히알루로니다제 활성, 구체적으로 야생형 히알루로니다제 대비 히알루로니다제 활성이 1배 초과 내지 3배임,(3) High hyaluronidase activity, specifically, hyaluronidase activity is 1 to 3 times higher than that of wild-type hyaluronidase.
(4) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 역가의 1배 초과 내지 3배의 역가를 가짐,(4) Having a potency that is 1 to 3 times greater than the potency of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of sequence number 1;
(5) 120,000 내지 150,000 IU/mg의 활성을 가짐, 및(5) having an activity of 120,000 to 150,000 IU/mg, and
(6) 하나 이상의 아미노산 잔기가 당화됨.(6) One or more amino acid residues are glycated.
구체적으로, 본원 실시예에서 Ovine 유래 야생형 히알루로니다제(CAS no.488712-31-8)의 아미노산 서열에서 C-말단을 절단하여 폴리펩티드를 제조하였으며, 제조된 폴리펩티드의 안정성 및 활성을 확인한 결과, 상기 야생형 히알루로니다제 대비 현저히 우수한 안정성 및 활성을 나타내고, 적은 양의 단백질을 사용하여 동등한 약물 흡수 효과, 약물 확산 촉진 효과, 및 체액 재흡수 촉진 효과를 달성할 수 있었다. 이에, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 히알루로니다제인 것일 수 있다.Specifically, in the present example, a polypeptide was prepared by truncating the C-terminus of the amino acid sequence of an ovine-derived wild-type hyaluronidase (CAS no. 488712-31-8), and the stability and activity of the prepared polypeptide were confirmed. As a result, it exhibited significantly superior stability and activity compared to the wild-type hyaluronidase, and could achieve equivalent drug absorption effect, drug diffusion promotion effect, and body fluid reabsorption promotion effect using a small amount of protein. Accordingly, a polypeptide according to an example of the present application may be a hyaluronidase.
구체적으로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단으로부터 1 내지 203의 정수 중 선택된 개수의 아미노산이 연속하여 결실된 폴리펩티드와 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 이 때, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드가 아니다. 또한, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제의 촉매적 활성을 유지하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제 동등 이상의 활성 및/또는 안정성을 가지는 것일 수 있다. 상기 야생형 히알루로니다제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 것일 수 있다.Specifically, a polypeptide according to an example of the present application may have a sequence identity of 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.5% or more, or 99.9% or more to a polypeptide having a consecutive deletion of an integer number of amino acids from 1 to 203 from the C-terminus in the amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase. In this case, the polypeptide according to an example of the present application is not a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, the polypeptide according to an example of the present application may maintain the catalytic activity of wild-type hyaluronidase. Specifically, the polypeptide according to an example of the present application may have an activity and/or stability equivalent to or greater than that of wild-type hyaluronidase. The above wild-type hyaluronidase may be a polypeptide consisting of an amino acid sequence of sequence number 1.
구체적으로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단으로부터 n개 아미노산이 연속하여 결실된 것일 수 있다 (단, n은 1 내지 203의 자연수이다).Specifically, a polypeptide according to an example of the present application may have n amino acids consecutively deleted from the C-terminus in the amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase (wherein n is a natural number from 1 to 203).
일 예로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 C-말단으로부터 1 내지 203의 정수 중 선택된 개수, 1 내지 170의 정수 중 선택된 개수, 1 내지 136의 정수 중 선택된 개수, 1 내지 102의 정수 중 선택된 개수, 1 내지 68의 정수 중 선택된 개수, 34 내지 203의 정수 중 선택된 개수, 34 내지 170의 정수 중 선택된 개수, 34 내지 136의 정수 중 선택된 개수, 34 내지 102의 정수 중 선택된 개수, 34 내지 68의 정수 중 선택된 개수, 68 내지 203의 정수 중 선택된 개수, 68 내지 170의 정수 중 선택된 개수, 68 내지 136의 정수 중 선택된 개수, 68 내지 102의 정수 중 선택된 개수, 34개, 68개, 102개, 136개, 또는 170개 아미노산이 연속하여 결실된 것일 수 있다. 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 첫 번째 아미노산이 추가로 결실된 것일 수 있다. 상기 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열인 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application comprises an amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase, from the C-terminus, an integer selected from 1 to 203, an integer selected from 1 to 170, an integer selected from 1 to 136, an integer selected from 1 to 102, an integer selected from 1 to 68, an integer selected from 34 to 203, an integer selected from 34 to 170, an integer selected from 34 to 136, an integer selected from 34 to 102, an integer selected from 34 to 68, an integer selected from 68 to 203, an integer selected from 68 to 170, an integer selected from 68 to 136, an integer selected from 68 to 102, 34, 68, 102, 136, or 170 amino acids may be deleted consecutively. A polypeptide according to an example of the present application may be one in which the first amino acid from the N-terminus is additionally deleted from the amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase. The amino acid sequence of the wild-type hyaluronidase may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
일 예로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 1 내지 m개 또는 2 내지 m개 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다 (단, m은 315 내지 517의 자연수이다). 상기 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열인 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application may be composed of 1 to m or 2 to m amino acids from the N-terminus in the amino acid sequence of a wild-type hyaluronidase (wherein m is a natural number from 315 to 517). The amino acid sequence of the wild-type hyaluronidase may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
일 예로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application may be comprised of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 6.
일 예로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 동물 세포를 숙주로 사용하여 발현되는 것일 수 있다. 이에, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 동물 세포를 숙주로 사용하여 발현되어, 단백질 발현 시 Post-Translational Modifications(PTM) 과정을 거쳐 당화 (glycosylation)된 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application may be expressed using an animal cell as a host. Accordingly, a polypeptide according to an example of the present application may be expressed using an animal cell as a host, and may be glycosylated through a Post-Translational Modifications (PTM) process during protein expression.
본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 pH 3 내지 10에서 안정한 것일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 pH 3 내지 10에서 보관 시 야생형 히알루로니다제 대비 효소 활성의 감소가 더 적은 것일 수 있다.A polypeptide according to an example of the present application may be stable at pH 3 to 10. Specifically, a polypeptide according to an example of the present application may have a lesser decrease in enzymatic activity compared to wild-type hyaluronidase when stored at pH 3 to 10.
본원 실시예에서 pH 3 내지 10 범위에서 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드를 보관하며 효소 활성을 측정한 결과, 보관 4주차에도 효소 활성을 유지하였다.In the present invention, a polypeptide according to an example of the present application was stored in a pH range of 3 to 10 and enzyme activity was measured. As a result, enzyme activity was maintained even after 4 weeks of storage.
예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 pH 3 내지 5 미만, 또는 pH 3 내지 4의 범위에 속하는 pH, 일 예로 pH 3에서 4주 보관 후 효소 활성이, 초기 활성의 32% 이상, 33% 이상, 34% 이상, 35% 이상, 36% 이상, 37% 이상, 38% 이상, 39% 이상, 40% 이상, 41% 이상, 42% 이상, 43% 이상, 44% 이상, 45% 이상, 46% 이상, 47% 이상, 48% 이상, 49% 이상, 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 또는 55% 이상인 것일 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드의 보관 온도는 5℃ 또는 37℃인 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application may have an enzyme activity of at least 32%, at least 33%, at least 34%, at least 35%, at least 36%, at least 37%, at least 38%, at least 39%, at least 40%, at least 41%, at least 42%, at least 43%, at least 44%, at least 45%, at least 46%, at least 47%, at least 48%, at least 49%, at least 50%, at least 51%, at least 52%, at least 53%, at least 54%, or at least 55% of the initial activity after storage for 4 weeks at a pH ranging from pH 3 to less than 5, or at a pH ranging from pH 3 to 4. In this case, the storage temperature of the polypeptide may be 5°C or 37°C.
예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 pH 3 초과 내지 10, pH 4 내지 10, 또는 pH 5 내지 10의 범위에 속하는 pH, 일 예로 pH 5, pH 7, 또는 pH 10에서 4주 보관 후 효소 활성이, 초기 활성의 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 또는 65% 이상인 것일 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드의 보관 온도는 5℃ 또는 37℃인 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application may have an enzyme activity of at least 57%, at least 58%, at least 59%, at least 60%, at least 61%, at least 62%, at least 63%, at least 64%, or at least 65% of the initial activity after storage for 4 weeks at a pH ranging from pH 3 to 10, pH 4 to 10, or pH 5 to 10, for example, pH 5, pH 7, or pH 10. In this case, the storage temperature of the polypeptide may be 5°C or 37°C.
예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 pH 3 초과 내지 10 미만, pH 3 초과 내지 9, pH 3 초과 내지 8, pH 3 초과 내지 7, pH 4 내지 10 미만, pH 4 내지 9, pH 4 내지 8, pH 4 내지 7, pH 5 내지 10 미만, pH 5 내지 9, pH 5 내지 8, 또는 pH 5 내지 7의 범위에 속하는 pH, 일 예로 pH 5 또는 pH 7에서 4주 보관 후 효소 활성이, 초기 활성의 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 또는 82% 이상인 것일 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드의 보관 온도는 5℃ 또는 37℃인 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application has an enzyme activity after 4 weeks storage at a pH ranging from greater than pH 3 to less than 10, from greater than pH 3 to less than pH 9, from greater than pH 3 to 8, from greater than pH 3 to 7, from pH 4 to less than 10, from pH 4 to 9, from pH 4 to 8, from pH 4 to 7, from pH 5 to less than 10, from pH 5 to 9, from pH 5 to 8, or from pH 5 to 7, for example at pH 5 or pH 7, of at least 57%, at least 58%, at least 59%, at least 60%, at least 61%, at least 62%, at least 63%, at least 64%, at least 65%, at least 66%, at least 67%, at least 68%, at least 69%, at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least 74% of the initial activity. The polypeptide may be at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 79%, at least 80%, at least 81%, or at least 82%. At this time, the storage temperature of the polypeptide may be 5°C or 37°C.
구체적으로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 약산성 조건, 예를 들어 pH 3 내지 6.5, pH 3 내지 6, pH 3 내지 5.5, pH 3 내지 5, pH 3 내지 4.5, pH 4 내지 4.5, pH 4 내지 5, pH 4 내지 5.5, pH 4 내지 6, pH 4 내지 6.5, pH 4.5 내지 5, pH 4.5 내지 5.5, pH 4.5 내지 6, pH 4.5 내지 6.5, pH 5 내지 5.5, pH 5 내지 6, 또는 pH 5 내지 6.5에서 안정한 것일 수 있다. pH는 약물의 안정성에 중요한 요인으로, 특히 항체 약물의 경우 pH 5 내지 6.5 또는 pH 5 내지 6의 범위를 가진다. 종래의 히알루로니다제는 중성의 pH에서 안정하여, 종래의 히알루로니다제와 항체 약물을 혼합하여 장기 보관할 경우, pH에 의한 안정성이 문제될 수 있다. 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 항체 약물의 pH와 유사한 상기 약산상 조건 (예를 들어 pH 5.0)에서 안정하여, 항체 약물과 혼합된 제형으로 제조하기에 유리하여, 제형화 및 장기 보관에 유리하다.Specifically, a polypeptide according to an example of the present application may be stable under slightly acidic conditions, for example, pH 3 to 6.5, pH 3 to 6, pH 3 to 5.5, pH 3 to 5, pH 3 to 4.5, pH 4 to 4.5, pH 4 to 5, pH 4 to 5.5, pH 4 to 6, pH 4 to 6.5, pH 4.5 to 5, pH 4.5 to 5.5, pH 4.5 to 6, pH 4.5 to 6.5, pH 5 to 5.5, pH 5 to 6, or pH 5 to 6.5. pH is an important factor in the stability of drugs, and particularly, in the case of antibody drugs, it has a range of pH 5 to 6.5 or pH 5 to 6. Conventional hyaluronidases are stable at neutral pH, and thus, when conventional hyaluronidases are mixed with antibody drugs and stored for a long period of time, stability due to pH may be an issue. A polypeptide according to an example of the present application is stable under slightly acidic conditions similar to the pH of the antibody drug (e.g., pH 5.0), and thus is advantageous for manufacturing as a formulation mixed with the antibody drug, and is advantageous for formulation and long-term storage.
본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 냉동, 냉장 및 고온 온도 조건에서 안정한 것일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 냉동, 냉장 및 고온 온도 조건에서 보관 시 야생형 히알루로니다제 대비 효소 활성의 감소가 더 적은 것일 수 있다.A polypeptide according to an example of the present application may be stable under freezing, refrigeration and high temperature conditions. Specifically, a polypeptide according to an example of the present application may exhibit less decrease in enzymatic activity compared to wild-type hyaluronidase when stored under freezing, refrigeration and high temperature conditions.
본원 실시예에서 냉동 (예를 들어, -18℃ 내지 -20℃), 냉장 (예를 들어, 2 내지 8℃) 및 고온 (예를 들어, 40 내지 45℃) 온도에서 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드를 보관하며 효소 활성을 측정한 결과, 보관 4주차에도 효소 활성을 유지하였다.In the present invention, when a polypeptide according to an example of the present invention was stored at frozen (e.g., -18°C to -20°C), refrigerated (e.g., 2°C to 8°C) and high temperature (e.g., 40°C to 45°C) temperatures and enzyme activity was measured, it was found that the enzyme activity was maintained even after 4 weeks of storage.
예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 냉동 온도, 예를 들어 0℃ 미만, -20 내지 0℃ 미만, -20 내지 -10℃, 또는 -20 내지 -18℃의 범위에 속하는 온도, 일 예로 -20℃ 온도에서 4주 보관 후 효소 활성이, 초기 활성의 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 것일 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드의 보관 pH는 5 또는 7 일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application has an enzyme activity of at least 63%, at least 64%, at least 65%, at least 66%, at least 67%, at least 68%, at least 69%, at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least 74%, at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 79%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, or at least 90% of the initial activity after storage for 4 weeks at a temperature of -20°C. The polypeptide may have a purity of 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more. At this time, the storage pH of the polypeptide may be 5 or 7.
예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 냉장 온도, 예를 들어 0 내지 40℃, 0 내지 10℃, 또는 2 내지 8℃의 범위에 속하는 온도, 일 예로 5℃ 온도에서 4주 보관 후 효소 활성이, 초기 활성의 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 것일 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드의 보관 pH는 5 또는 7 일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application may have an enzyme activity of at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the initial activity after storage for 4 weeks at a refrigerated temperature, for example, a temperature in the range of 0 to 40°C, 0 to 10°C, or 2 to 8°C, for example, a temperature of 5°C. At this time, the storage pH of the polypeptide may be 5 or 7.
예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 고온, 예를 들어 40℃ 이상, 40 내지 50℃, 또는 40 내지 45℃의 범위에 속하는 온도, 일 예로 40℃ 온도에서 4주 보관 후 효소 활성이, 초기 활성의 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 또는 79% 이상인 것일 수 있다. 이 때, 상기 폴리펩티드의 보관 pH는 5 또는 7 일 수 있다.For example, a polypeptide according to an example of the present application can have an enzymatic activity of at least 52%, at least 53%, at least 54%, at least 55%, at least 56%, at least 57%, at least 58%, at least 59%, at least 60%, at least 61%, at least 62%, at least 63%, at least 64%, at least 65%, at least 66%, at least 67%, at least 68%, at least 69%, at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least 74%, at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least 78%, or at least 79% of the initial activity after storage for 4 weeks at a high temperature, for example, at a temperature of 40° C. At this time, the storage pH of the polypeptide may be 5 or 7.
본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제와 비교하여 높은 역가를 가지는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 야생형 히알루로니다제 역가의 1배 초과 내지 3배, 1배 초과 내지 2.5배, 1배 초과 내지 2배, 1배 초과 내지 1.9배, 1배 초과 내지 1.8배, 1배 초과 내지 1.7배, 1.1배 내지 3배, 1.1배 내지 2.5배, 1.1배 내지 2배, 1.1배 내지 1.9배, 1.1배 내지 1.8배, 1.1배 내지 1.7배, 1.2배 내지 3배, 1.2배 내지 2.5배, 1.2배 내지 2배, 1.2배 내지 1.9배, 1.2배 내지 1.8배, 1.2배 내지 1.7배, 1.3배 내지 3배, 1.3배 내지 2.5배, 1.3배 내지 2배, 1.3배 내지 1.9배, 1.3배 내지 1.8배, 1.3배 내지 1.7배, 1.4배 내지 3배, 1.4배 내지 2.5배, 1.4배 내지 2배, 1.4배 내지 1.9배, 1.4배 내지 1.8배, 1.4배 내지 1.7배, 1.5배 내지 3배, 1.5배 내지 2.5배, 1.5배 내지 2배, 1.5배 내지 1.9배, 1.5배 내지 1.8배, 또는 1.5배 내지 1.7배의 역가를 가지는 것일 수 있다.A polypeptide according to an example of the present application may have a higher titer compared to wild-type hyaluronidase. For example, a polypeptide according to one example of the present application has an activity of greater than 1-fold to 3-fold, greater than 1-fold to 2.5-fold, greater than 1-fold to 2-fold, greater than 1-fold to 1.9-fold, greater than 1-fold to 1.8-fold, greater than 1-fold to 1.7-fold, 1.1-fold to 3-fold, 1.1-fold to 2.5-fold, 1.1-fold to 2-fold, 1.1-fold to 1.9-fold, 1.1-fold to 1.8-fold, 1.1-fold to 1.7-fold, 1.2-fold to 3-fold, 1.2-fold to 2.5-fold, 1.2-fold to 2-fold, 1.2-fold to 1.9-fold, 1.2-fold to 1.8-fold, 1.2-fold to 1.7-fold, 1.3-fold to 3-fold, 1.3-fold to It may have a potency of 2.5 times, 1.3 times to 2 times, 1.3 times to 1.9 times, 1.3 times to 1.8 times, 1.3 times to 1.7 times, 1.4 times to 3 times, 1.4 times to 2.5 times, 1.4 times to 2 times, 1.4 times to 1.9 times, 1.4 times to 1.8 times, 1.4 times to 1.7 times, 1.5 times to 3 times, 1.5 times to 2.5 times, 1.5 times to 2 times, 1.5 times to 1.9 times, 1.5 times to 1.8 times, or 1.5 times to 1.7 times.
예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 120,000 내지 150,000 IU/mg, 120,000 내지 145,000 IU/mg, 120,000 내지 140,000 IU/mg, 120,000 내지 135,000 IU/mg, 121,000 내지 150,000 IU/mg, 121,000 내지 145,000 IU/mg, 121,000 내지 140,000 IU/mg, 121,000 내지 135,000 IU/mg, 122,000 내지 150,000 IU/mg, 122,000 내지 145,000 IU/mg, 122,000 내지 140,000 IU/mg, 또는 122,000 내지 135,000 IU/mg의 활성을 가지는 것일 수 있다.For example, a polypeptide according to one example of the present application has an amino acid sequence of 120,000 to 150,000 IU/mg, 120,000 to 145,000 IU/mg, 120,000 to 140,000 IU/mg, 120,000 to 135,000 IU/mg, 121,000 to 150,000 IU/mg, 121,000 to 145,000 IU/mg, 121,000 to 140,000 IU/mg, 121,000 to 135,000 IU/mg, 122,000 to 150,000 IU/mg, 122,000 to 145,000 IU/mg, 122,000 to It may have an activity of 140,000 IU/mg, or 122,000 to 135,000 IU/mg.
본원 실시예에서 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드를 국소 투여한 결과, 야생형 히알루로니다제 대비 약물의 흡수 및 확산 촉진 효과가 현저히 우수하였다. 또한, 본원 실시예에서 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드를 국소 투여한 결과, 야생형 히알루로니다제 대비 과도한 체액의 재흡수 촉진 효과가 현저히 우수하였다. 이에, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 약물과 함께 병용되어, 약물의 피하 투여를 위해 사용될 수 있다.In the present invention, when a polypeptide according to an example of the present invention was administered locally, the effect of promoting drug absorption and diffusion was significantly superior to that of wild-type hyaluronidase. In addition, when a polypeptide according to an example of the present invention was administered locally, the effect of promoting excessive body fluid reabsorption was significantly superior to that of wild-type hyaluronidase. Accordingly, a polypeptide according to an example of the present invention can be used in combination with a drug for subcutaneous administration of the drug.
본 출원의 일 예에 따른 조성물에 포함되는 약물은 단백질 의약품, 항체, 압타머 (aptamer), mRNA, siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), aiRNA (asymmetric interfering RNA), RNAi (RNA interference), 안티센스올리고뉴클레오타이드 (antisense oligonucleotide), 또는 소분자 화합물 (small molecule) 일 수 있다.A drug included in a composition according to an example of the present application may be a protein drug, an antibody, an aptamer, mRNA, siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (micro RNA), aiRNA (asymmetric interfering RNA), RNAi (RNA interference), an antisense oligonucleotide, or a small molecule.
상기 약물은 수용성 수용체 (soluble receptor), 또는 수용성 수용체와 Fc 융합 단백질일 수 있다.The drug may be a soluble receptor, or a soluble receptor and Fc fusion protein.
상기 약물은 항암제, 당뇨병치료제, 항염증제, 항바이러스제, 또는 면역조절제일 수 있다. 상기 면역조절제는 예를 들어 자가면역질환 치료제일 수 있다.The above drug may be an anticancer agent, an antidiabetic agent, an anti-inflammatory agent, an antiviral agent, or an immunomodulatory agent. The immunomodulatory agent may be, for example, an autoimmune disease treatment agent.
상기 단백질 의약품은 아미노산으로 구성되어 단백질의 활성을 통해 질병의 치료 또는 예방효과를 나타내는 약물로서, 항체 의약품 이외의 단백질로 이루어진 의약품을 의미하며, 예를 들어 사이토카인(cytokines), 치료용 효소(therapeutic enzyme), 호르몬(hormone), 수용성 수용체(soluble receptor) 및 이의 융합 단백질, 인슐린(insulin) 또는 이의 유사체(analogue), BMP(Bone Morphogenetic Protein), EPO(erythropoietin) 및 혈장 유래 단백질(serum derived protein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.The above protein pharmaceutical is a drug composed of amino acids and exhibits a disease treatment or prevention effect through the activity of the protein, and refers to a drug composed of proteins other than antibody pharmaceuticals, and may include one or more selected from the group consisting of, for example, cytokines, therapeutic enzymes, hormones, soluble receptors and fusion proteins thereof, insulin or analogues thereof, BMP (Bone Morphogenetic Protein), EPO (erythropoietin), and serum derived proteins.
상기 사이토카인은 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukin), CSF (colony stimulating factor), TNF (tumor necrosis factor) 및 TGF (tissue growth factor)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.The above cytokines may include one or more selected from the group consisting of interferon, interleukin, colony stimulating factor (CSF), tumor necrosis factor (TNF), and tissue growth factor (TGF).
상기 사이토카인 및 이의 유사 제품으로 오프렐베킨 (Oprelvekin), 페그인터페론 베타1a (Peginterferon Beta-1a), 페길로데카킨 (Pegilodecakin), 레즈페갈데스류킨 (Rezpegaldesleukin), SAR 444245, GO-203-2c, 데카빌 (Dekavil), 넴발류킨 알파 (Nemvaleukin alfa), 에파바류킨 알파 (Efavaleukin alfa), 에피네프타킨 알파 (Efineptakin alfa), 온페카프스프 알파 (Onfekafusp alfa), 비피카프스프 알파 (Bifikafusp alfa), 또는 레로달씨베프 (Lerodalcibep) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.The above cytokines and their analogues include, but are not limited to, Oprelvekin, Peginterferon Beta-1a, Pegilodecakin, Rezpegaldesleukin, SAR 444245, GO-203-2c, Dekavil, Nemvaleukin alfa, Efavaleukin alfa, Efineptakin alfa, Onfekafusp alfa, Bifikafusp alfa, or Lerodalcibep.
상기 치료용 효소는 베타-글루코세레브로시다제(β-Glucocerebrosidase) 및 아갈시다제 베타(agalsidase β)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.The above therapeutic enzyme may include at least one selected from the group consisting of β-glucocerebrosidase and agalsidase β.
상기 수용성 수용체(soluble receptor)는 수용체의 세포 외 도메인(extracellular domain)을 의미하고, 이의 융합 단백질은 상기 수용성 수용체에 항체의 Fc 영역 등이 융합된 단백질을 의미한다. 상기 수용성 수용체는 질병과 관련된 리간드가 결합하는 수용체의 수용성 형태로서, TNF-α 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태 (예를 들어, 에타너셉트(Etanercept)라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), VEGF 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태 (예를 들어, 아플리버셉트(Aflibercept), 컨버셉트 (Conbercept) 또는 OPT-302 라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), CTLA-4에 Fc 영역이 융합된 형태 (예를 들어, 아바타셉트(Abatacept) 또는 벨라다셉트 (Belatacept)라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), 인터루킨 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태 (예를 들어, 릴로나셉트 (Rilonacept) 또는 인바키셉트 (Inbakicept) 라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), LFA3 수용성 수용체에 Fc 영역이 융합된 형태 (예를 들어, 알레파셉트 (Alefacept) 라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), CD47과 상호작용하는 신호조절단백질 알파 (Signal regulatory protein alpha, SIRPalpha)에 Fc영역이 융합된 형태 (예를 들어, 에보르파셉트 (Evorpacept), 온토르파셉트 (Ontorpacept), 또는 TTI-622 라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태), 소타테르셉트 (Sotatercept), 달란테르셉트 (Dalantercept), 아카지콜셉트 (Acazicolcept), 또는 다조달리베프 (Dazodalibep) 라는 성분명의 제품 및 이와 유사한 형태 등이 예시될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.The above soluble receptor refers to the extracellular domain of the receptor, and its fusion protein refers to a protein in which the Fc region of an antibody, etc. is fused to the above soluble receptor. The above-mentioned soluble receptor is a soluble form of a receptor to which a disease-related ligand binds, and includes a form in which an Fc region is fused to a TNF-α soluble receptor (e.g., a product with the generic name Etanercept and similar forms), a form in which an Fc region is fused to a VEGF soluble receptor (e.g., a product with the generic name Aflibercept, Conbercept or OPT-302 and similar forms), a form in which an Fc region is fused to a CTLA-4 (e.g., a product with the generic name Abatacept or Beladacept and similar forms), a form in which an Fc region is fused to an interleukin soluble receptor (e.g., a product with the generic name Rilonacept or Inbakicept and similar forms), and a form in which an Fc region is fused to a LFA3 soluble receptor (e.g., Alefacept). Examples thereof include, but are not limited to, products with the active ingredient name of terpenoid ligand and similar forms), products in which an Fc region is fused to signal regulatory protein alpha (SIRPalpha) that interacts with CD47 (for example, products with the active ingredient name of Evorpacept, Ontorpacept, or TTI-622 and similar forms), products with the active ingredient name of Sotatercept, Dalantercept, Acazicolcept, or Dazodalibep and similar forms.
상기 호르몬은 호르몬 결핍 등으로 인해 발생하는 질환의 치료 또는 예방을 위해 체외에서 주입하는 호르몬 또는 이의 유사체를 의미하며, 사람 성장호르몬(human growth hormone), 에스트로겐(estrogen), 프로게스테론(Progesterone) 등이 예시될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.The above hormone refers to a hormone or analogue thereof that is injected externally to treat or prevent diseases caused by hormone deficiency, etc., and examples thereof include, but are not limited to, human growth hormone, estrogen, and progesterone.
상기 혈장 유래 단백질은 혈장에 존재하는 단백질로, 혈장에서 추출한 것과 재조합으로 생산된 것들 모두를 의미하며, 피브리노겐(fibrinogen), 본 빌레블란트 인자(von Willebrand Factor), 알부민(albumin), 트롬빈(thrombin), FII (Factor II), FV (Factor V), FVII (Factor VII), FVIII (Factor VIII), FIX (Factor IX), FX (Factor X) 및 FXI (Factor XI) 등이 예시될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.The above plasma-derived proteins are proteins present in plasma, including both those extracted from plasma and those produced recombinantly, and examples thereof include, but are not limited to, fibrinogen, von Willebrand Factor, albumin, thrombin, FII (Factor II), FV (Factor V), FVII (Factor VII), FVIII (Factor VIII), FIX (Factor IX), FX (Factor X), and FXI (Factor XI).
상기 항체 의약품은 단클론 항체 의약품 (monoclonal antibody drug) 또는 다클론 항체 의약품 (polyclonal antibody drug)일 수 있다. 항체는 완전한 항체 또는 이의 결합 단편일 수 있으며, 상기 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.The above antibody drug product may be a monoclonal antibody drug or a polyclonal antibody drug. The antibody may be a complete antibody or a binding fragment thereof, and the "antigen-binding fragment" refers to a fragment of the entire immunoglobulin structure, which is a part of a polypeptide including a portion capable of binding to an antigen. For example, it may be scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' or F(ab')2, but is not limited thereto. The antigen-binding fragment of the antibody in the present application may be selected from the group consisting of antibody fragments including one or more of the complementarity determining regions, for example, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' and F(ab')2. The above antigen-binding fragments can be obtained using a proteolytic enzyme (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of a whole antibody with papain, and F(ab')2 fragments can be obtained by digestion with pepsin), and can be produced using genetic recombination technology.
상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연적으로 생성된(non-naturally occurring) 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 합성적 또는 재조합적으로 생성된 것일 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment may be isolated from a living organism or non-naturally occurring. The antibody or antigen-binding fragment may be synthetically or recombinantly produced.
상기 단클론 항체 의약품은 특정 질병과 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체 및 단클론 항체 단편을 포함한 단백질을 의미한다. 단클론 항체에는 이중/다중 특이성 항체도 포함되며, 단클론 항체 또는 이의 단편을 포함하는 단백질은 항체-약물 접합체 (Antibody-drug conjugate; ADC)를 포함하는 의미로 사용된다.The above monoclonal antibody drug refers to a protein including a monoclonal antibody and a monoclonal antibody fragment that can specifically bind to an antigen associated with a specific disease. Monoclonal antibodies also include bi/multi-specific antibodies, and a protein including a monoclonal antibody or a fragment thereof is used in the sense of including an antibody-drug conjugate (ADC).
예를 들어, 특정 질병과 관련된 항원은 4-1BB, 5T4, 인테그린 (integrin), 액티빈 (Activin), 아밀로이드 베타 (amyloid beta), 안지오포에틴(안지오포에틴 1 또는 2), 안지오포에틴 유사물질3, B세포 성숙화 항원 (B cell maturation antigen, BCMA), B세포 활성인자 (B-cell activating factor, BAFF), B7-H3, 보체5 (complement 5), CCR4, CCR5, CCL11, CD2, CD3, CD4, CD6, CD11a, CD16A, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD28, CD30, CD32B, CD33, CD38, CD40, CD45, CD46, CD47, CD52, CD56, CD62, CD70, CD73, CD74, CD79b, CD80, CD105, CD123, CD154, CD166, CD262, CD278, CD319, CD326, 태아성암항원 (Carcinoembryonic antigen, CEA), CGRP, 클라우딘18 (Claudin-18), c-Met, CSF-1, CSF-1 수용체, CTLA4, DLL3, EGF 수용체, 혈우병 인자, Fc 수용체, FGF23, 폴레이트 (folate) 수용체, GD2, 글루코코르티코이드 유도 TNF 수용체 (Glucocorticoid-induced TNF receptor, GITR), 글리피칸 3 (Glypican 3), GM-CSF, HER2, HER3, 간세포성장인자 (Hepatocyte Growth Factor, HGF), 인터페론 수용체, 인터페론 감마, IgE, IGF-1 수용체, 인터루킨1, 인터루킨2 수용체, 인터루킨4, 인터루킨4 수용체, 인터루킨5, 인터루킨5 수용체, 인터루킨6, 인터루킨6 수용체, 인터루킨8, 인터루킨12/23, 인터루킨13, 인터루킨17A, 인터루킨17수용체A, 인터루킨23, 인터루킨31 수용체, 인터루킨36 수용체, 림프구활성화유전자 3 (Lymphocyte-activation gene 3, LAG3), 라이실 산화효소 유사체 2 (Lysyl oxidase homolog 2, LOXL2), 메소텔린 (Mesothelin), 뮤신1 (Mucin-1), 뮤신16 (Mucin-16), 넥틴4 (Netin-4), 신경성장인자 (Nerve Growth Factor, NGF), OX40, 전구단백질 전환효소 유형9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9, PCSK9), PD-1, PD-L1, 포스포리파제 C (Phospholipase C), RANKL (Receptor activator of nuclear factors kappa Bligand), 티로신-단백질 키나제 막횡단 수용체 (Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor, ROR1), 시알산 결합 Ig-유사 렉틴 15 (Sialic acid binding ig-like lectin 15, Siglec-15), 전환성장인자 베타 (Transforming growth factor beta, TGFβ), TIGIT (T-cell innunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain), T세포 면역글로블린 및 뮤신-도메인 함유물질 3 (T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3, Tim-3), 조직인자 (Tissue factor), 조직인자경로억제제 (Tissue factor pathway inhibitor, TFPI), TORP-2, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF), 흉선 기질상 림포포이에틴 (Thymic stromal lymphopoietin, TSLB), 큰포식세포집락자극인자 (Colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R), 혈관내피세포성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF), VEGF 수용체 및 vWF(von Willebrand Factor) 등이 예시될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.For example, antigens associated with specific diseases include 4-1BB, 5T4, integrin, Activin, amyloid beta, angiopoietin (angiopoietin 1 or 2), angiopoietin-like substance 3, B cell maturation antigen (BCMA), B-cell activating factor (BAFF), B7-H3, complement 5, CCR4, CCR5, CCL11, CD2, CD3, CD4, CD6, CD11a, CD16A, CD19, CD20, CD22, CD25, CD27, CD28, CD30, CD32B, CD33, CD38, CD40, CD45, CD46, CD47, CD52, CD56, CD62, CD70, CD73, CD74, CD79b, CD80, CD105, CD123, CD154, CD166, CD262, CD278, CD319, CD326, Carcinoembryonic antigen (CEA), CGRP, Claudin-18, c-Met, CSF-1, CSF-1 receptor, CTLA4, DLL3, EGF receptor, Hemophilia factor, Fc receptor, FGF23, Folate receptor, GD2, Glucocorticoid-induced TNF receptor (GITR), Glypican 3, GM-CSF, HER2, HER3, Hepatocyte Growth Factor (HGF), Interferon receptor, Interferon gamma, IgE, IGF-1 receptor, Interleukin 1, Interleukin 2 receptor, Interleukin 4, Interleukin 4 receptor, Interleukin 5, Interleukin 5 receptor, Interleukin 6, Interleukin 6 receptor, Interleukin 8, Interleukin 12/23, Interleukin 13, Interleukin 17A, Interleukin 17 receptor A, Interleukin 23, Interleukin 31 receptor, Interleukin 36 receptor, Lymphocyte-activation gene 3 (LAG3), Lysyl oxidase homolog 2 (LOXL2), Mesothelin, Mucin-1, Mucin-16, Netin-4, Nerve Growth Factor (NGF), OX40, Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9 (PCSK9), PD-1, PD-L1, Phospholipase C, RANKL (Receptor activator of nuclear factors kappa Bligand), Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor (ROR1), Sialic acid binding Ig-like lectin 15 (Siglec-15), Transforming growth factor beta (TGFβ), TIGIT (T-cell innunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain), T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 (Tim-3), Tissue factor, Tissue factor pathway inhibitor (TFPI), TORP-2, Tumor necrosis factor (TNF), Thymic stromal lymphopoietin, Examples include, but are not limited to, TSLB, colony stimulating factor 1 receptor (CSF1R), vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptor, and von Willebrand Factor (vWF).
상기 단클론 항체 및 단클론 항체 단편을 포함하는 단백질로는 ADG- 106, EU-101, LVGN6051, 우렐루맙 (Urelumab), 우토밀루맙 (Utomilumab), 벱텔로비맙 (Bebtelovimab), 아두카누맙 (Aducanumab), 바피네주맙 (Bapinezumab), 크레네주맙 (Crenezumab), 도나네맙 (Donanemab), 간테네루맙 (Gantenerumab), 레카네맙 (Lecanemab), 솔라네주맙 (Solanezumab), 네스바쿠맙 (Nesvacumab), 에비나쿠맙 (Evinacumab), 에놉리투주맙 (Enoblituzumab), 옴부르타맙 (Omburtamab), 벨리무맙 (Belimumab), 이아나루맙 (Ianalumab), 타발루맙 (Tabalumab), 베르틸리무맙(Bertilimumab), 모가물리주맙 (Mogamulizumab), 레론리맙 (Leronlimab), 시필리주맙 (Siplizumab), 포랄루맙 (Foralumab), 무로모납-CD3 (Muromonab-CD3), 오텔릭시주맙 (Otelixizumab), 테플리주맙 (Teplizumab), 이발리주맙 (Ibalizumab), 트레갈리주맙 (Tregalizumab), 자노리무맙 (Zanolimumab), 이톨리주맙 (Itolizumab), 에팔리주맙 (Efalizumab), 이네빌리주맙 (Inebilizumab), 타파시타맙 (Tafasitamab), 토시투모맙 (Tositumomab), 오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 리툭시맙 (Rituximab), 우블리툭시맙 (Ublituximab), 벨투주맙 (Veltuzumab), 에프라투주맙 (Epratuzumab), 바실릭시맙 (Basiliximab), 다클리주맙 (Daclizumab), 바르릴루맙 (Varlilumab), 룰리주맙 페골 (Lulizumab pegol), 이라투무맙 (Iratumumab), BI-1206, 린투주맙 (Lintuzumab), 다라투무맙 (Daratumumab), 펠자르타맙 (Felzartamab), GEN3014, 이사툭시맙 (Isatuximab), 메자키타맙 (Mezagitamab), CDX-1140, 블레셀루맙 (Bleselumab), 다쎄투주맙 (Dacetuzumab), 이스칼리맙 (Iscalimab), 루카투무맙 (Lucatumumab), 미타잘리맙 (Mitazalimab), SEA-CD40, 소티갈리맙 (Sotigalimab), SAR441344, 테고프루바르트 (Tegoprubart), 다피롤리주맙 페골 (Dapirolizumab pegol), I-131 아파미스타맙 (I-131-Apamistamab), AO-176, 리구팔리맙 (Ligufalimab), 마그롤리맙 (Magrolimab), 알렘투주맙 (Alemtuzumab), 크리잔리주맙 (Crizanlizumab), 인클라쿠맙 (Inclacumab), 쿠사투주맙 (Cusatuzumab), 올레클루맙 (Oleclumab), 밀라투주맙 (Milatuzumab), 갈릭시맙 (Galiximab), 카로툭시맙 (Carotuximab), 아데카투무맙 (Adecatumumab), 엡티네주맙 (Eptinezumab), 에레누맙 (Erenumab), 프레마네주맙 (Fremanezumab), 갈카네주맙 (Galcanezumab), TST001, ZL-1211, 졸베툭시맙 (Zolbetuximab), 오나르투주맙 (Onartuzumab), 에쿨리주맙 (Eculizumab), 포젤리맙 (Pozelimab), 라불리주맙 (Ravulizumab), 라크노투주맙 (Lacnotuzumab), PD-0360324, AMB-051, 악사틸리맙 (Axatilimab), 카비랄리주맙 (Cabiralizumab), 에막투주맙 (Emactuzumab), BA3071, 이필리무맙 (Ipilimumab), 쿠아본리맙 (Quavonlimab), 트레멜리무맙 (Tremelimumab), 잘리프레리맙 (Zalifrelimab), 세툭시맙 (Cetuximab), 데파툭시주맙 (Depatuxizumab), 푸툭시맙 (Futuximab), 임가투주맙 (Imgatuzumab), 마투주맙 (Matuzumab), 모도특시맙 (Modotuximab), 네씨투무맙 (Necitumumab), 니모투주맙 (Nimotuzumab), 파니투무맙 (Panitumumab), 토무조툭시맙 (Tomuzotuximab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), MK-2060, 바토클리맙 (Batoclimab), 니포칼리맙 (Nipocalimab), 로자놀릭시주맙 (Rozanolixizumab), 부로수맙 (Burosumab), 팔레투주맙 (Farletuzumab), 디누툭시맙 (Dinutuximab), 디누툭시맙 베타 (Dinutuximab beta), 낙시타맙 (Naxitamab), BMS-986156, 라기필리맙 (Ragifilimab), 김실루맙 (Gimsilumab), 렌질루맙 (Lenzilumab), 마브릴리무맙 (Mavrilimumab), 나밀루맙 (Namilumab), 오틸리맙 (Otilimab), 플론마를리맙 (Plonmarlimab), 코드리투주맙 (Codrituzumab), 마르게툭시맙 (Margetuximab), 페르투주맙 (Pertuzumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab), HMBD-001, 파트리투맙 (Patritumab), 세리반투맙 (Seribantumab), 둘리고투주맙 (Duligotuzumab), 피클라투주맙 (Ficlatuzumab), 릴로투무맙 (Rilotumumab), 알롬필리맙 (Alomfilimab), 아니프롤루맙 (Anifrolumab), 에마팔루맙 (Emapalumab), FB825, 리겔리주맙 (Ligelizumab), 오말리주맙 (Omalizumab), 씩수투무맙 (Cixutumumab), 달로투주맙 (Dalotuzumab), 피키투무맙 (Figitumumab), 가니투맙 (Ganitumab), 테프로투무맙 (Teprotumumab), 베르메키맙 (Bermekimab), 카나기누맙 (Canakinumab), 게보키주맙 (Gevokizumab), 브리아키누맙 (Briakinumab), 우스테키누맙 (Ustekinumab), 안루킨주맙 (Anrukinzumab), 쎈다키맙 (Cendakimab), 레브리키주맙 (Lebrikizumab), 트랄로키누맙 (Tralokinumab), 브로달루맙 (Brodalumab), 비메키주맙 (Bimekizumab), 익세키주맙 (Ixekizumab), 세쿠기누맙 (Secukinumab), 브라지쿠맙 (Brazikumab), 구셀쿠맙 (Guselkumab), 미리키주맙 (Mirikizumab), 리산키주맙 (Risankizumab), 틸드라키주맙 (Tildrakizumab), 네몰리주맙 (Nemolizumab), 임시돌리맙 (Imsidolimab), 스페솔리맙 (Spesolimab), 파스콜리주맙 (Pascolizumab), CBP201, 두필루맙 (Dupilumab), 데페모키맙 (Depemokimab), 메폴리주맙 (Mepolizumab), 레슬리주맙 (Reslizumab), 벤랄리주맙 (Benralizumab), 클라자키주맙 (Clazakizumab), 올로키주맙 (Olokizumab), 실툭시맙 (Siltuximab), 시루쿠맙 (Sirukumab), 질티베키맙 (Ziltivekimab), 레빌리맙 (Levilimab), 사릴루맙 (Sarilumab), 사트랄리주맙 (Satralizumab), 토씰리주맙 (Tocilizumab), HuMax-IL8, 아비투주맙 (Abituzumab), 파베젤리맙 (Favezelimab), 피안리맙 (Fianlimab), GSK2831781, 이에라밀리맙 (Ieramilimab), INCAGN02385, 렐라틀리맙 (Relatlimab), 심투주맙 (Simtuzumab), 아바고보맙 (Abagovomab), 오레고보맙 (Oregovomab), 타네주맙 (Tanezumab), BMS-986178, GSK3174998, INCAGN01949, 이븍솔리맙 (Ivuxolimab), 로카틴리맙 (Rocatinlimab), 타볼리맙 (Tavolimab), 델라조를리맙 (Telazorlimab), 본레롤리주맙 (Vonlerolizumab), 알리로쿠맙 (Alirocumab), 보코씨주맙 (Bococizumab), 에브로누씨맙 (Ebronucimab), 에볼로쿠맙 (Evolocumab), 프로보씨맙 (Frovocimab), 온게리씨맙 (Ongericimab), 타폴레씨맙 (Tafolecimab), 도스타를리맙 (Dostarlimab), 발스틸리맙 (Balstilimab), 캄렐리주맙 (Camrelizumab), 쎄미플리맙 (Cemiplimab), 겝타놀리맙 (Geptanolimab), MEDI0680, 니볼루맙 (Nivolumab), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab), 펜풀리맙 (Penpulimab), 피딜리주맙 (Pidilizumab), 프롤골리맙 (Prolgolimab), 레티판리맙 (Retifanlimab), 사산리맙 (Sasanlimab), 세르플루리맙 (Serplulimab), 신틸리맙 (Sintilimab), 스파르탈리주맙 (Spartalizumab), 티슬렐리주맙 (Tislelizumab), 토리팔리맙 (Toripalimab), 에자벤리맙 (Ezabenlimab), 짐베렐리맙 (Zimberelimab), 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 아벨루맙 (Avelumab), 코시벨리맙 (Cosibelimab), 수게말리맙 (Sugemalimab), 두르발루맙 (Durvalumab), IMC-001, 엔바폴리맙 (Envafolimab), 수브라톡수맙 (Suvratoxumab), 데노수맙 (Denosumab), 질로베르타맙 (Zilovertamab), NC318, 엘로투주맙 (Elotuzumab), NIS793, BMS-986207, 돔바날리맙 (Domvanalimab), EOS-448, 에티길리맙 (Etigilimab), 오씨페를리맙 (Ociperlimab), 티라골루맙 (Tiragolumab), 비보스톨리맙 (Vibostolimab), 수르제비씰리맙 (Surzebiclimab), 코볼리맙 (Cobolimab), 사바톨리맙 (Sabatolimab), TQB2618, 콘씨주맙 (Concizumab), 마르스타씨맙 (Marstacimab), 아달리무맙 (Adalimumab), 골리무맙 (Golimumab), 인플릭시맙 (Infliximab), 쎄르톨리주맙 페골 (Certolizumab pegol), 코나투무맙 (Conatumumab), 티가투주맙 (Tigatuzumab), 테제펠루맙 (Tezepelumab), 가티포투주맙 (Gatipotuzumab), 카비랄리주맙 (Cabiralizumab), 베바씨주맙 (Bevacizumab), 브롤루씨주맙 (Brolucizumab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 올린바씨맙 (Olinvacimab), 이크루쿠맙 (Icrucumab), 라무씨루맙 (Ramucirumab), 카프라씨주맙 (Caplacizumab), 아부릴루맙 (Abrilumab), 에트롤리주맙 (Etrolizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 인테투무맙 (Intetumumab), 나탈리주맙 (Natalizumab) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.Proteins comprising the above monoclonal antibodies and monoclonal antibody fragments include ADG-106, EU-101, LVGN6051, Urelumab, Utomilumab, Bebtelovimab, Aducanumab, Bapinezumab, Crenezumab, Donanemab, Gantenerumab, Lecanemab, Solanezumab, Nesvacumab, Evinacumab, Enoblituzumab, Omburtamab, Belimumab, Ianalumab, Tabalumab, Bertilimumab, Mogamulizumab, Leronlimab, Siplizumab, Foralumab, Muromonab-CD3, Otelixizumab, Teplizumab, Ibalizumab, Tregalizumab, Zanolimumab, Itolizumab, Efalizumab, Inebilizumab, Tafasitamab, Tositumomab, Ocrelizumab, Ofatumumab, Rituximab, Ublituximab (Ublituximab), Veltuzumab, Epratuzumab, Basiliximab, Daclizumab, Varlilumab, Lulizumab pegol, Iratumumab, BI-1206, Lintuzumab, Daratumumab, Felzartamab, GEN3014, Isatuximab, Mezagitamab, CDX-1140, Bleselumab, Dacetuzumab, Iscalimab, Lucatumumab, Mitazalimab, SEA-CD40, Sotigalimab, SAR441344, Tegoprubart, Dapirolizumab pegol, I-131-Apamistamab, AO-176, Ligufalimab, Magrolimab, Alemtuzumab, Crizanlizumab, Inclacumab, Cusatuzumab, Oleclumab, Milatuzumab, Galiximab, Carotuximab, Adecatumumab, Eptinezumab, Erenumab (Erenumab), Fremanezumab, Galcanezumab, TST001, ZL-1211, Zolbetuximab, Onartuzumab, Eculizumab, Pozelimab, Ravulizumab, Lacnotuzumab, PD-0360324, AMB-051, Axatilimab, Cabiralizumab, Emactuzumab, BA3071, Ipilimumab, Quavonlimab, Tremelimumab, Zalifrelimab, Cetuximab (Cetuximab), Depatuxizumab, Futuximab, Imgatuzumab, Matuzumab, Modotuximab, Necitumumab, Nimotuzumab, Panitumumab, Tomuzotuximab, Zalutumumab, MK-2060, Batoclimab, Nipocalimab, Rozanolixizumab, Burosumab, Farletuzumab, Dinutuximab, Dinutuximab beta, Naxitamab, BMS-986156, Ragifilimab, Gimsilumab, Lenzilumab, Mavrilimumab, Namilumab, Otilimab, Plonmarlimab, Codrituzumab, Margetuximab, Pertuzumab, Trastuzumab, HMBD-001, Patritumab, Seribantumab, Duligotuzumab, Ficlatuzumab, Rilotumumab, Alomfilimab, Anifrolumab, Emapalumab (Emapalumab), FB825, Ligelizumab, Omalizumab, Cixutumumab, Dalotuzumab, Figitumumab, Ganitumab, Teprotumumab, Bermekimab, Canakinumab, Gevokizumab, Briakinumab, Ustekinumab, Anrukinzumab, Cendakimab, Lebrikizumab, Tralokinumab, Brodalumab, Bimekizumab, Ixekizumab (Ixekizumab), Secukinumab, Brazikumab, Guselkumab, Mirikizumab, Risankizumab, Tildrakizumab, Nemolizumab, Imsidolimab, Spesolimab, Pascolizumab, CBP201, Dupilumab, Defemokimab, Mepolizumab, Reslizumab, Benralizumab, Clazakizumab, Olokizumab, Siltuximab, Sirukumab, Ziltivekimab (Ziltivekimab), Levilimab, Sarilumab, SatraliZumab, Tocilizumab, HuMax-IL8, Abituzumab, Fabezelimab, Fianlimab, GSK2831781, Ieramilimab, INCAGN02385, Relatlimab, Simtuzumab, Abagovomab, Oregovomab, Tanezumab, BMS-986178, GSK3174998, INCAGN01949, Ivuxolimab, Rocatinlimab, Tabolimab (Tavolimab), Delazorlimab, Vonlerolizumab, Alirocumab, Bococizumab, Ebronucimab, Evolocumab, Frovocimab, Ongericimab, Tafolecimab, Dostarlimab, Balstilimab, Camrelizumab, Cemiplimab, Geptanolimab, MEDI0680, Nivolumab, Pembrolizumab, Penpulimab, Pidilizumab, Prolgolimab, Retifanlimab, Sasanlimab, Serplulimab, Sintilimab, Spartalizumab, Tislelizumab, Toripalimab, Ezabenlimab, Zimberelimab, Atezolizumab, Avelumab, Cosibelimab, Sugemalimab, Durvalumab, IMC-001, Envafolimab, Suvratoxumab, Denosumab, Zilovertamab, NC318, Elotuzumab, NIS793, BMS-986207, Domvanalimab, EOS-448, Etigilimab, Ociferlimab, Tiragolumab, Vibostolimab, Surzebiclimab, Cobolimab, Sabatolimab, TQB2618, Concizumab, Marstacimab, Adalimumab, Golimumab, Infliximab, Certolizumab pegol, Conatumumab, Tigatuzumab, These include, but are not limited to, Tezepelumab, Gatipotuzumab, Cabiralizumab, Bevacizumab, Brolucizumab, Ranibizumab, Olinvacimab, Icrucumab, Ramucirumab, Caplacizumab, Abrilumab, Etrolizumab, Vedolizumab, Intetumumab, Natalizumab, etc.
상기 이중/다중 특이성 항체 및 항체 유사 단백질로는 DSP107, RO7122290, 씬레바프스프 알파 (Cinrebafusp alfa), GEN1042, 로지바프스프 알파 (Rozibafusp alfa), GEN1044, 오브린다타맙 (Obrindatamab), GEN1047, 엘라나타맙 (Elranatamab), 린보셀타맙 (Linvoseltamab), 테클리스타맙 (Teclistamab), 엡코리타맙 (Epcoritamab), 글로피타맙 (Glofitamab), 모수네투주맙 (Mosunetuzumab), 오드로넥스타맙 (Odronextamab), 플로테투주맙 (Flotetuzumab), 비베코타맙 (Vibecotamab), 카투막소맙 (Catumaxomab), 씨비사타맙 (Cibisatamab), TAK-186, 탈쿠에타맙 (Talquetamab), 우바마타맙 (Ubamatamab), NVG-111, 엠피자타맙 (Emfizatamab), HPN536, AFM13, 블리나투모맙 (Blinatumomab), ISB1442, CPO107, AFM24, 아미반타맙 (Amivantamab), MCLA-129, SI-B001, 에미씨주맙 (Emicizumab), Mim8, 제노쿠투주맙 (Zenocutuzumab), 자니다타맙 (Zanidatamab), 티불리주맙 (Tibulizumab), GI-101, 보바릴리주맙 (Vobarilizumab), REGN5668, HX009, 카도닐리맙 (Cadonilimab), 부달리맙 (Vudalimab), EMB-02, RO7247669, 테보텔리맙 (Tebotelimab), IBI318, AZD2936, AZD7789, RO7121661, 이보네스씨맙 (Ivonescimab), IBI322, ES101, GEN1046, PRS-344, 에르폰릴리맙 (Erfonrilimab), FS118, 빈트라프스프 알파(Bintrafusp alfa), HB0036, HLX301, NM21-1480, 오조랄리주맙 (Ozoralizumab), BI836880, 파리시맙 (Faricimab), 바누씨주맙 (Vanucizumab ), 나비씩시주맙 (Navicixizumab), IBI302 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.The above bi/multispecific antibodies and antibody-like proteins include DSP107, RO7122290, Cinrebafusp alfa, GEN1042, Rozibafusp alfa, GEN1044, Obrindatamab, GEN1047, Elranatamab, Linvoseltamab, Teclistamab, Epcoritamab, Glofitamab, Mosunetuzumab, Odronextamab, Flotetuzumab, Vibecotamab, Catumaxomab, Cibisatamab, TAK-186, Talquetamab, Ubamatamab, NVG-111, Emfizatamab, HPN536, AFM13, Blinatumomab, ISB1442, CPO107, AFM24, Amivantamab, MCLA-129, SI-B001, Emicizumab, Mim8, Zenocutuzumab, Zanidatamab, Tibulizumab, GI-101, Vobarilizumab, REGN5668, HX009, Cadonilimab, Vudalimab, EMB-02, RO7247669, Tevotelimab (tebotelimab), IBI318, AZD2936, AZD7789, RO7121661, Ivonescimab, IBI322, ES101, GEN1046, PRS-344, Erfonrilimab, FS118, Bintrafusp alfa, HB0036, HLX301, NM21-1480, Ozoralizumab, BI836880, Faricimab, Vanucizumab, Navicixizumab, IBI302, etc., but are not limited thereto.
상기 항체-약물 접합체로는 나프투모맙 에스타페나톡스 (Naptumomab estafenatox), 벨란타맙 마포도틴 (Belantamab mafodotin), DS-7300, MGC018, 피베키맙 수니린 (Pivekimab sunirine), 프랄루자타맙 라브탄신 (Praluzatamab ravtansine), 콜툭시맙 라브탄신 (Coltuximab ravtansine), 데닌투주맙 마포도틴 (Denintuzumab mafodotin), 론카스툭시맙 테시린 (Loncastuximab tesirine), 이브리투모맙 티욱세탄 (Ibritumomab tiuxetan), 이노투주맙 오조가미신 (Inotuzumab ozogamicin), 에프라투주맙 씨스 테시린 (Epratuzumab-cys-tesirine), 목세투모맙 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox), 브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin), 겜투주맙 오조가미신 (Gemtuzumab ozogamicin), 바다스툭시맙 탈리린 (Vadastuximab talirine), STI-6129, FOR46, 로보투주맙 메르탄신 (Lorvotuzumab mertansine), 폴라투주맙 베도틴 (Polatuzumab vedotin), 투사마타맙 라브탄신 (Tusamitamab ravtansine), 텔리소투주맙 베도틴 (Telisotuzumab vedotin), 로발피투주맙 테시린 (Rovalpituzumab tesirine), 데파툭시주맙 마포도틴 (Depatuxizumab mafodotin), 파를레투주맙 에크테리불린 (Farletuzumab ecteribulin), 미르베툭시맙 소라브탄신 (Mirvetuximab soravtansine), ARX788, 트라스투주맙 데룩스테칸 (Trastuzumab deruxtecan), 트라스투주맙 듀오카르마진 (Trastuzumab duocarmazine), A166, 트라스투주맙 엠탄신 (Trastuzumab emtansine), DP303c, MRG002, BDC-1001, SHR-A1811, 디시타맙 베도틴 (Disitamab vedotin), 페르투주맙 주보톨리모드 (Pertuzumab zuvotolimod), 파트리투맙 데룩스테칸 (Patritumab Deruxtecan), 아네투맙 라브탄신 (Anetumab ravtansine), BMS-986148, 엔포르투맙 베도틴 (Enfortumab vedotin), NBE-002, MRG004, ABBV-3373, 사씨투주맙 고비테칸 (Sacituzumab Govitecan) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.The antibody-drug conjugates include Naptumomab estafenatox, Belantamab mafodotin, DS-7300, MGC018, Pivekimab sunirine, Praluzatamab ravtansine, Coltuximab ravtansine, Denintuzumab mafodotin, Loncastuximab tesirine, Ibritumomab tiuxetan, Inotuzumab ozogamicin, Epratuzumab-cys-tesirine, Moxetumomab pasudotox. (Moxetumomab pasudotox), Brentuximab vedotin, Gemtuzumab ozogamicin, Vadastuximab talirine, STI-6129, FOR46, Lorvotuzumab mertansine, Polatuzumab vedotin, Tusamitamab ravtansine, Telisotuzumab vedotin, Rovalpituzumab tesirine, Depatuxizumab mafodotin, Farletuzumab ecteribulin, Mirvetuximab soravtansine, ARX788, Trastuzumab deruxtecan, Trastuzumab duocarmazine, A166, Trastuzumab emtansine, DP303c, MRG002, BDC-1001, SHR-A1811, Disitamab vedotin, Pertuzumab zuvotolimod, Patritumab deruxtecan, Anetumab ravtansine, BMS-986148, Enfortumab vedotin, NBE-002, MRG004, ABBV-3373, Sacituzumab Govitecan, etc., but are not limited to these.
상기 다클론 항체는 이뮨글로블린(immune globulin) 등의 혈장 등에서 추출한 혈장 항체(serum antibody)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The above polyclonal antibody may be a serum antibody extracted from plasma, such as immune globulin, but is not limited thereto.
본 출원의 일 예에 따른 피하투여용 조성물은 안정화제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 안정화제는 상기 안정화제는 완충제, 비이온성 계면활성제, 킬레이팅제, 알칼리금속 염, 및 알칼리토금속 염으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.A composition for subcutaneous administration according to an example of the present application may further comprise a stabilizer. The stabilizer may comprise at least one selected from the group consisting of a buffer, a nonionic surfactant, a chelating agent, an alkali metal salt, and an alkaline earth metal salt.
상기 완충제는 숙시네이트 완충액, 아세테이트 완충액, 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, 말론산염 완충액, MES(2-(N-Morpholino)ethanesulphonic acid) 완충액, 트리스 완충액, 및 글리신 완충액으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.The above buffer may be at least one selected from the group consisting of a succinate buffer, an acetate buffer, a phosphate buffer, a citrate buffer, a malonate buffer, a MES (2-(N-Morpholino)ethanesulphonic acid) buffer, a Tris buffer, and a glycine buffer.
상기 비이온성 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-소르비탄 지방산 에스테르일 수 있다.The above nonionic surfactant may be a polyoxyethylene-sorbitan fatty acid ester.
상기 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 및 Triton X-100로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.The above nonionic surfactant may be at least one selected from the group consisting of polysorbate 20, polysorbate 80, and Triton X-100.
상기 킬레이팅제는 EDTA일 수 있다.The above chelating agent may be EDTA.
상기 알칼리토금속 염은 MgCl2 및/또는 MgSO4일 수 있다.The above alkaline earth metal salt may be MgCl2 and/or MgSO4 .
본 출원의 또 다른 일 예는, 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제 폴리펩티드 및 항암제를 포함하는, 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.Another example of the present application relates to a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising a hyaluronidase polypeptide according to an example of the present application and an anticancer agent.
상기 암은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 예를 들어, 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The above cancer is not particularly limited and includes both solid cancer and blood cancer. For example, it may be at least one selected from the group consisting of skin cancer such as melanoma, liver cancer, hepatocellular carcinoma, stomach cancer, breast cancer, lung cancer, ovarian cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, kidney cancer, esophageal cancer, biliary tract cancer, testicular cancer, rectal cancer, head and neck cancer, cervical spine cancer, ureteral cancer, osteosarcoma, neuroblastoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, astrocytoma, neuroblastoma, and glioma, but is not limited thereto.
본 출원의 일 예에 따른 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.A composition according to an example of the present application may additionally contain one or more effective ingredients exhibiting the same or similar function in addition to the above effective ingredient.
또한, 본 출원의 일 예에 따른 조성물, 예를 들어 피하투여용 조성물 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 명확하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 본 출원에서 용어 “담체”는, 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하고, 용어 “약학적으로 허용되는”이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.In addition, a composition according to an example of the present application, for example, a composition for subcutaneous administration or a pharmaceutical composition, can be manufactured in a unit dosage form or manufactured by introducing it into a multi-dose container by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier according to a method that can be clearly performed by a person having ordinary skill in the art to which the present invention pertains. The term “carrier” in this application means a compound that facilitates the addition of a compound into a cell or tissue, and the term “pharmaceutically acceptable” means a composition that is physiologically acceptable and does not typically cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder or dizziness or a similar reaction when administered to a human.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미결정셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutically acceptable carriers mentioned above are those commonly used in the preparation of formulations and include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
또한, 본 출원에 따른 조성물, 예를 들어 피하투여용 조성물 또는 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.In addition, the composition according to the present application, for example, a composition for subcutaneous administration or a pharmaceutical composition, may additionally contain additives such as fillers, anticoagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, and preservatives in addition to the above components. In the present application, the content of the additives contained in the composition is not particularly limited and may be appropriately adjusted within the content range used in conventional formulations.
본 명세서에서 용어 “부형제”는, 치료제가 아닌, 어느 물질을 의미하며, 치료제의 전달을 위한 담체 또는 매체로 이용되거나 또는 약학적 조성물에 추가되는 것을 의미한다. 이에 의해, 취급 및 저장 특성을 개선하거나 또는 조성물의 단위 투여량 형성을 허용 및 촉진시키게 된다.The term “excipient” as used herein means any substance, other than a therapeutic agent, which is used as a carrier or medium for the delivery of a therapeutic agent or which is added to a pharmaceutical composition, thereby improving handling and storage characteristics or permitting and facilitating formation of a unit dosage of the composition.
본 출원에 따른 조성물, 예를 들어 피하투여용 조성물 또는 약학 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 국소 투여, 예를 들어 피하 투여 또는 근육주사 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.The composition according to the present application, for example, a composition for subcutaneous administration or a pharmaceutical composition, can be formulated and used in various forms, such as an injection of a sterile injectable solution, according to a conventional method according to each intended use, and can be administered through various routes, including local administration, for example, subcutaneous administration or intramuscular injection.
본 출원에 따른 조성물, 예를 들어 피하투여용 조성물 또는 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.The preferred dosage of the composition according to the present application, for example, the composition for subcutaneous administration or the pharmaceutical composition, may vary depending on the patient's condition and weight, age, sex, health condition, dietary constitution, nature of the preparation, degree of disease, administration time of the composition, administration method, administration period or interval, excretion rate, and drug form, and may be appropriately selected by a person skilled in the art.
본 명세서에서 용어 “약학적 조성물의 유효 투여량”은, 특정한 증상을 치료하기 위해 충분한 활성 성분의 조성물의 양을 의미한다. 이는 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있고, 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 일시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.The term “effective dosage of the pharmaceutical composition” as used herein means the amount of the composition of the active ingredient sufficient to treat a specific symptom. This may vary depending on the formulation method of the pharmaceutical composition, the administration method, the administration time, and/or the administration route, and may vary depending on various factors including the type and degree of the response to be achieved by the administration of the pharmaceutical composition, the type, age, weight, general health condition, symptoms or degree of the disease, sex, diet, excretion, drugs used simultaneously or at the same time in the subject, other components of the composition, and similar factors well known in the medical field, and a person having ordinary skill in the art can easily determine and prescribe an effective dosage for the intended treatment.
본 출원에 따른 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다. 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present application may be administered once a day or may be administered in several divided doses. The composition may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. Taking all of the above factors into consideration, it may be administered in an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without causing side effects.
본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드 또는 조성물은 야생형 히알루로니다제와 비교하여 높은 역가를 가져, 더 적은 투여량으로 동등한 효과를 달성하는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드 또는 조성물은 야생형 히알루로니다제의 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 또는 65% 이하의 일일 투여량을 가지는 것일 수 있다. 상기 투여량은 중량 또는 중량% 기준인 것일 수 있다. 또한, 일일 총 투여량을 분할하여 필요에 따라 연속적 또는 비연속적으로 투여할 수 있다.A polypeptide or composition according to an example of the present application may have a higher potency compared to wild-type hyaluronidase, thereby achieving an equivalent effect at a lower dosage. For example, a polypeptide or composition according to an example of the present application may have a daily dosage of 90% or less, 85% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less, or 65% or less of a wild-type hyaluronidase. The dosage may be on a weight or weight % basis. Additionally, the total daily dosage may be divided and administered continuously or discontinuously as needed.
본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제 폴리펩티드는 성숙된 야생형 PH-20보다 동물세포에서의 발현량과 안정성이 증가하며, 성숙된 야생형 PH-20과 비교하여 동등 이상의 효소 활성을 가진다. 따라서, 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제 폴리펩티드는 성숙된 야생형 PH-20과 비교하여 CHO 세포에서 발현되었을 때 단백질 발현량이 증가하며, 단백질의 안정성이 높아지기 때문에 다양한 용도의 산업상 이용가능성을 증대할 수 있는 효과가 있다.A hyaluronidase polypeptide according to an example of the present application has an increased expression amount and stability in animal cells compared to mature wild-type PH-20, and has an equivalent or higher enzymatic activity compared to mature wild-type PH-20. Therefore, a hyaluronidase polypeptide according to an example of the present application has an increased protein expression amount when expressed in CHO cells compared to mature wild-type PH-20, and has an increased protein stability, thereby having an effect of increasing industrial applicability for various purposes.
또한, 히알루로니다제는 세포 간극의 구성성분인 히알루론산을 분해하는 특성을 가지고 있어 조직의 결합력을 조절해 약물의 침투와 확산을 용이하게 하고, 조직에 과다하게 존재하는 체액의 재흡수를 촉진하는 효과가 있기 때문에 점차 사용범위와 응용 분야가 많아지고 있다. 하지만, 동물 유래의 야생형 PH-20의 경우 동물에서 유래된 물질로부터 감염의 가능성이 높다. 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제 폴리펩티드는 감염 가능성이 낮아 안전하며, 동물 유래의 야생형 PH-20과 비교하여 동량의 단백질 대비 활성이 높아, 다양한 용도의 산업적 이용 가능성을 더욱 높일 수 있다.In addition, hyaluronidase has the property of decomposing hyaluronic acid, a component of cell gaps, and thus regulates the binding force of tissues to facilitate drug penetration and diffusion, and has the effect of promoting reabsorption of body fluids that are excessively present in tissues, and therefore its scope of use and application fields are gradually expanding. However, in the case of wild-type PH-20 of animal origin, there is a high possibility of infection from materials derived from animals. A hyaluronidase polypeptide according to an example of the present application is safe because it has a low possibility of infection, and has a higher activity per unit amount of protein compared to wild-type PH-20 of animal origin, and thus can further increase the possibility of industrial use for various purposes.
도 1a 내지 도 1c는 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드의 pH 안정성을 SDS-PAGE를 통해 야생형 히알루로니다제와 비교한 결과를 나타낸 도면이다 (도 1a: 보관 0주차, 도 1b: 보관 2주차, 도 1c: 보관 4주차).
도 2a 내지 도 2c는 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드의 온도 안정성을 SDS-PAGE를 통해 야생형 히알루로니다제와 비교한 결과를 나타낸 도면이다 (도 2a: 보관 0주차, 도 2b: 보관 2주차, 도 2c: 보관 4주차; frozen: 냉동, refrig.: 냉장, high tem.: 고온).
도 3은 히알루론산 용액이 자체적 활성을 나타내는지 확인하고자 다양한 pH 및 온도 조건에서의 Plate 역가 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 야생형 히알루로니다제의 20 내지 60℃ 온도 조건에서 역가 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4b는 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드의 20 내지 60℃ 온도 조건에서 역가 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 야생형 히알루로니다제의 35 내지 40℃ 온도 조건에서 역가 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드의 35 내지 40℃ 온도 조건에서 역가 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 야생형 히알루로니다제의 pH 5 내지 7 조건에서 역가 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드의 pH 5 내지 7 조건에서 역가 시험 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 SD-랫트에서 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드와 Hirax의 시간 및 혈중농도의 상관관계를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드 및 약물을 포함하는 피하투여용 조성물의 생체이용률을 나타낸 도면이다.FIGS. 1A to 1C are drawings showing the results of comparing the pH stability of a polypeptide according to an example of the present application with wild-type hyaluronidase through SDS-PAGE (FIG. 1A: storage week 0, FIG. 1B: storage week 2, FIG. 1C: storage week 4).
FIGS. 2A to 2C are drawings showing the results of comparing the temperature stability of a polypeptide according to an example of the present application with wild-type hyaluronidase through SDS-PAGE ( FIG. 2A: storage week 0, FIG. 2B: storage week 2, FIG. 2C: storage week 4; frozen: frozen, refrig.: refrigerated, high tem.: high temperature).
Figure 3 is a drawing showing the results of a plate titer test under various pH and temperature conditions to confirm whether the hyaluronic acid solution exhibits its own activity.
Figure 4a is a diagram showing the results of a titer test of wild-type hyaluronidase at temperature conditions of 20 to 60°C.
FIG. 4b is a drawing showing the results of a titer test at temperature conditions of 20 to 60° C. of a polypeptide according to an example of the present application.
Figure 5a is a diagram showing the results of a titer test of wild-type hyaluronidase at temperature conditions of 35 to 40°C.
FIG. 5b is a drawing showing the results of a titer test at a temperature of 35 to 40° C. of a polypeptide according to an example of the present application.
Figure 6a is a diagram showing the results of a titer test under pH 5 to 7 conditions of wild-type hyaluronidase.
Figure 6b is a drawing showing the results of a titer test under pH 5 to 7 conditions of a polypeptide according to an example of the present application.
FIG. 7 is a diagram showing the correlation between time and blood concentration of a polypeptide according to an example of the present application and Hirax in SD rats.
FIG. 8 is a diagram showing the bioavailability of a composition for subcutaneous administration comprising a polypeptide and a drug according to an example of the present application.
이하, 본 출원을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present application will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are only intended to illustrate the present application, and the scope of the present application is not limited by these examples.
실시예 1. 히알루로니다제 제조Example 1. Preparation of hyaluronidase
서열번호 1의 Ovine 유래 야생형 히알루로니다제(CAS no.488712-31-8)의 아미노산 서열에서 C-말단을 기준으로 하여 34개 (실시예 1-2), 68개 (실시예 1-3), 102개 (실시예 1-4), 136개 (실시예 1-5), 170개 (실시예 1-6), 또는 204개 (실시예 1-7) 아미노산을 C-말단 절단하여 히알루로니다제를 제조하였다.Hyaluronidase was prepared by truncating 34 (Example 1-2), 68 (Example 1-3), 102 (Example 1-4), 136 (Example 1-5), 170 (Example 1-6), or 204 (Example 1-7) amino acids from the C-terminus of the amino acid sequence of ovine-derived wild-type hyaluronidase (CAS no. 488712-31-8) having the sequence number 1.
먼저 야생형 히알루로니다제의 아미노산 서열(CAS no.488712-31-8)을 토대로 cDNA 를 합성하였다. 야생형 히알루로니다제는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR)을 이용하여 히알루로니다제의 유전자를 증폭하고, CHO-DG44 세포에서 pcDNA 3.1 벡터를 이용하여 발현과 활성을 확인한 후 CHO-DG44 세포에 pOptiVEC 벡터를 이용하여 삽입하였다. CHO-DG44 세포의 세포수가 4~6 x 106 cells /mL이 되었을 때 히알루로니다제 cDNA가 pOptiVEC 벡터에 삽입된 플라스미드로 유전자 주입방법(Electroporation)을 이용하여 CHO-DG44 세포를 형질전환 시켰다. 형질주입 후 CHO-DG44 세포를 Power CHO 2CD(with L-Glutamine 4mM) 배지에서 배양완료 후 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 세포 상등액을 회수하였다. 회수된 배양액은 필요시 친화성 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피 등 다양한 방법을 통하여 정제하였으며, 정제된 히알루로니다제는 Ultafiltration 및 Microfiltration 등을 통하여 물로 치환하였다. 제조된 히알루로니다제의 서열을 표 1에 기재하였다.First, cDNA was synthesized based on the amino acid sequence of wild-type hyaluronidase (CAS no. 488712-31-8). Wild-type hyaluronidase was amplified by using polymerase chain reaction (PCR) to amplify the hyaluronidase gene, and after confirming its expression and activity in CHO-DG44 cells using pcDNA 3.1 vector, it was inserted into CHO-DG44 cells using pOptiVEC vector. When the cell number of CHO-DG44 cells became 4 to 6 x 106 cells /mL, CHO-DG44 cells were transformed using a gene injection method (electroporation) with a plasmid in which hyaluronidase cDNA was inserted into the pOptiVEC vector. After transfection, CHO-DG44 cells were cultured in Power CHO 2CD (with L-Glutamine 4 mM) medium, and centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to collect the cell supernatant. The collected culture medium was purified by various methods such as affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and ion exchange chromatography, if necessary, and the purified hyaluronidase was replaced with water by Ultafiltration and Microfiltration. The sequence of the manufactured hyaluronidase is described in Table 1.
(CAS no.488712-31-8)Example 1-1
(CAS no.488712-31-8)
(BMI2004)Example 1-3
(BMI2004)
실시예 2. 히알루로니다제 절단부위에 따른 안정성 확인Example 2. Confirmation of stability according to hyaluronidase cleavage site
(1) 절단부위에 따른 보관 pH별 효소 활성 또는 함량 비교(1) Comparison of enzyme activity or content by storage pH according to cut area
실시예 1에서 제조한 히알루로니다제 중 활성이 없는 실시예 1-7을 제외한 6종 히알루로니다제의 절단부위에 따른 pH 안정성을 확인하였다. 각각의 아미노산 서열을 Transient cell에서 발현한 후 배양액을 동일하게 농축하여 활성을 측정하였다. 실험 농도는 1,500 IU/mL(=100%)가 되도록 하였고, 물을 이용해 치환하여 표 2에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하고, 이를 37 ℃에서 pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0, pH 10.0으로 4주간 보관하여 2주마다 각 시점에서 역가 시험을 진행하였다.The pH stability according to the cleavage site of six hyaluronidases, excluding Examples 1-7 that had no activity among the hyaluronidases manufactured in Example 1, was confirmed. After each amino acid sequence was expressed in transient cells, the culture solution was concentrated in the same manner and the activity was measured. The experimental concentration was 1,500 IU/mL (=100%), and solutions were prepared according to the conditions described in Table 2 by substitution with water, and these were stored at 37°C at pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0, and pH 10.0 for 4 weeks, and a titer test was performed at each time point every 2 weeks.
각 시점에서 절단 부위에 따른 검체의 효소 활성 또는 함량은 하기 시험법에 따라 시험하였다:At each time point, the enzyme activity or content of the sample according to the cut site was tested according to the following test method:
1) 절단 부위에 따른 히알루로니다제의 활성은 EP STD와 비율 비교에 의하여 결정된다.1) The activity of hyaluronidase according to the cut site is determined by ratio comparison with EP STD.
1-1) pH 6.4 인산염완충액의 조제: 인산수소이나트륨십이수화물 2.5 g, 인산이수소나트륨 2.5 g 및 염화나트륨 8.2 g을 달아 물 950 mL를 넣어 녹인 후, 1 M 수산화나트륨시액 또는 1 M 염산시액 pH 6.4 로 조정하고 물을 넣어 1,000 mL로 한다.1-1) Preparation of pH 6.4 phosphate buffer solution: Dissolve 2.5 g of sodium dihydrogen phosphate dodecahydrate, 2.5 g of sodium dihydrogen phosphate, and 8.2 g of sodium chloride in 950 mL of water. Adjust to pH 6.4 with 1 M sodium hydroxide solution or 1 M hydrochloric acid solution, and add water to make 1,000 mL.
1-2) 희석액의 조제: pH 6.4 인산염완충액 100 mL와 물 100 mL를 혼합한 후 젤라틴 시약 0.140 g을 넣어 37 ℃에서 녹인다. 희석액은 2 시간 이내에 사용한다.1-2) Preparation of dilution solution: Mix 100 mL of pH 6.4 phosphate buffer and 100 mL of water, then add 0.140 g of gelatin reagent and dissolve at 37°C. Use the dilution solution within 2 hours.
1-3) 기질액의 조제: 히알루론산나트륨 0.5 g에 물 100 mL를 가지고 조금씩 넣으면서 교반한다. 히알루론산나트륨이 부풀어 오를 때까지 물을 천천히 넣어 준다. 4 ℃에서 12 시간 이상 교반한다. 기질액은 4 ℃에 보관하고 4 일 이내에 사용한다.1-3) Preparation of substrate solution: Add 100 mL of water to 0.5 g of sodium hyaluronate little by little while stirring. Slowly add water until sodium hyaluronate swells. Stir at 4℃ for more than 12 hours. Store the substrate solution at 4℃ and use within 4 days.
1-4) 표준액의 조제: EP STD(EDQM) 표준품을 가지고 희석액을 넣어 녹여 약 50 IU/mL로 한다. 이 액 3 mL를 정확하게 취하여 250 mL 용량플라스크에 넣고 희석액을 넣어 정확하게 250 mL로 하여 표준액으로 한다.1-4) Preparation of standard solution: Take the EP STD (EDQM) standard and dissolve it in diluent to make approximately 50 IU/mL. Take exactly 3 mL of this solution and place it in a 250 mL volumetric flask, add diluent to make exactly 250 mL, and use it as a standard solution.
1-5) 검액의 조제: 절단 부위에 따른 히알루로니다제 검액을 약 0.6 IU/mL로 조건에 맞게 pH를 조정하여 희석하여 사용한다.1-5) Preparation of test solution: Dilute the hyaluronidase test solution according to the cut site to approximately 0.6 IU/mL, adjust the pH as required, and use.
2) 조작법: 표준액 및 검액을 가지고 아래의 방법에 따라 시험한다.2) Operating method: Test using the standard solution and test solution according to the method below.
2-1) 항온수조를 37 ℃로 한 후에 pH 6.4 인산염완충액 7.5 mL와 기질액 5.0 mL를 50 mL Conical Tube에 넣고 혼화한 후 항온수조에 넣고 37 ℃가 되도록 방치한다.2-1) After setting the constant temperature water bath to 37℃, add 7.5 mL of pH 6.4 phosphate buffer solution and 5.0 mL of substrate solution to a 50 mL conical tube, mix, place in the constant temperature water bath, and leave until the temperature reaches 37℃.
2-2) pH 6.4 인산염완충액과 기질액이 들어 있는 Conical Tube에 검액 2.5 mL를 넣고 1 분간 혼화한다.2-2) Add 2.5 mL of the test solution to a conical tube containing pH 6.4 phosphate buffer and substrate solution and mix for 1 minute.
2-3) 우베르데 마이크로점도계 (DIN 51 562, Part 2, Calillary type MIII, 상수: 약 0.1 mm2/s2 또는 이와 동등한 점도계)에 Conical Tube의 혼화된 액 전량을 넣는다.2-3) Pour the entire amount of mixed liquid in the conical tube into the Uberde microviscometer (DIN 51 562, Part 2, Calillary type MIII, constant: approximately 0.1 mm2 /s2 or equivalent viscometer).
2-4) 초시계를 사용하여 우베르데 마이크로점도계의 상단 표시선에서 하단 표시선까지 액이 내려가는 시간을 측정한다.2-4) Using a stopwatch, measure the time it takes for the liquid to go down from the upper line to the lower line on the Uberde microviscometer.
2-5) 약 20 분 동안 수차례 반복하여 시간을 측정한다.2-5) Measure the time by repeating several times for about 20 minutes.
2-6) 위와 같은 과정을 3 회 반복하여 시험한다.2-6) Repeat the above process 3 times and test.
3) 계산: 다음의 계산식을 가지고 역가 (IU/mg)를 계산한다.3) Calculation: Calculate the potency (IU/mg) using the following formula.
3-1) 반응 시간: T1 + T2/ 23-1) Reaction time: T1 + T2 / 2
3-2) ηr-1 : {(k X T2) / 0.6915}-13-2) ηr-1 : {(k XT2 ) / 0.6915}-1
T1 : 우베르데 마이크로점도계의 상단 표시선까지 올라온 시간 (초)T1 : Time (sec) to reach the upper mark on the Uberde microviscometer
T2 : T - T1T2 : T - T1
T : 우베르데 마이크로점도계의 하단 표시선까지 내려온 시간 (초)T: Time (in seconds) until the lower mark on the Uberde microviscometer is reached.
k : 우베르데 마이크로점도계 상수 (mm2/s2), 우베르데 마이크로점도계 성적서 참조k: Uberde microviscometer constant (mm2 /s2 ), see Uberde microviscometer certificate
0.6915: 37 ℃에서 기질액의 운동점도 (mm2/s2)0.6915: Kinematic viscosity of the substrate liquid at 37°C (mm2 /s2 )
3-3) 활성도 계산 : (BT/BR)*(ER/ET)*A3-3) Activity calculation: (BT /BR )*(ER /ET )*A
BT : x 축을 반응시간, y 축을 ηr-1 의 자연로그하여 구한 검액의 회귀방정식 기울기BT : The slope of the regression equation of the test solution obtained by taking the reaction time on the x-axis and the natural logarithm of ηr-1 on the y-axis.
BR : x 축을 반응시간, y 축을 ηr-1 의 자연로그하여 구한 표준액의 회귀방정식 기울기BR : The slope of the regression equation of the standard solution obtained by plotting the x-axis as the reaction time and the y-axis as the natural log of ηr-1
ET : 검액의 농도 (mg/mL)ET : Concentration of test solution (mg/mL)
ER : 표준액의 농도 (mg/mL)ER : Concentration of standard solution (mg/mL)
A : 표준액의 역가 (IU/mg)A: Titer of standard solution (IU/mg)
pH 안정성 실험 결과를 하기 표 3에 나타냈다. 각 시험의 효소 활성은 0주차의 초기 효소 활성도인 1,500 IU/mL(=100%)를 기준으로 하여, 각 시점에서 측정된 활성도 (IU/mL)를 대비하여 표시한 퍼센트 수치이며, 효소 활성비는 하기 수학식에 따라 계산되었다:The results of the pH stability experiment are shown in Table 3 below. The enzyme activity of each test is expressed as a percentage value compared to the activity (IU/mL) measured at each time point based on the initial enzyme activity of 1,500 IU/mL (=100%) in week 0, and the enzyme activity ratio was calculated according to the following mathematical formula:
효소 활성비(%) = (측정시점의 효소 활성)/(초기 효소 활성) * 100Enzyme activity ratio (%) = (enzyme activity at the time of measurement) / (initial enzyme activity) * 100
표 3에 나타난 바와 같이, 약 4주간 히알루로니다제의 절단 부위에 따른 pH 안정성을 확인한 결과, pH 5.0 내지 7.0 범위에서 더 높은 효소 활성비(%)를 나타냈다. 실시예 1-2 내지 1-6의 히알루로니다제는 실시예 1-1의 야생형 히알루로니다제와 비교하여 현저히 높은 pH 안정성을 가졌으며, 특히 실시예 1-2 내지 실시예 1-4 히알루로니다제의 pH 안정성이 우수하였다. 100%를 초과하는 값은 백신, 재조합 단백질 (싸이토카인, 단일클론 항체 등) 등 생물학적 제제의 역가 시험에서 변화폭이 커서 일반적으로 발생하는 측정상 오차로 보였다.As shown in Table 3, the pH stability of hyaluronidase according to the cleavage site for about 4 weeks was confirmed, and a higher enzyme activity ratio (%) was shown in the range of pH 5.0 to 7.0. The hyaluronidases of Examples 1-2 to 1-6 had significantly higher pH stability compared to the wild-type hyaluronidase of Example 1-1, and in particular, the pH stability of the hyaluronidases of Examples 1-2 to 1-4 was excellent. A value exceeding 100% seemed to be a measurement error that generally occurs due to a large range of variation in potency tests of biological products such as vaccines and recombinant proteins (cytokines, monoclonal antibodies, etc.).
(2) 절단부위에 따른 보관 온도별 효소 활성 또는 함량 비교(2) Comparison of enzyme activity or content by storage temperature according to cut area
실시예 1-1 내지 1-6의 히알루로니다제의 온도 안정성을 실시예 2의 (1)과 동일한 방법으로 확인하였다. 상기 표 2에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하고, 이를 냉동 (-20 ℃), 냉장 (5 ℃), 및 고온 (40 ℃)에서 4주간 보관하고, 2주마다 각 시점에서 역가 시험을 진행하였다. 약 4주간 절단 부위에 따른 히알루로니다제의 온도에 따른 안정성을 확인하여 표 4에 나타냈다.The temperature stability of hyaluronidase of Examples 1-1 to 1-6 was confirmed in the same manner as (1) of Example 2. Solutions were prepared according to the conditions described in Table 2, and stored for 4 weeks in freezing (-20°C), refrigeration (5°C), and high temperature (40°C), and titer tests were conducted at each time point every 2 weeks. The temperature stability of hyaluronidase according to the cut site for about 4 weeks is shown in Table 4.
표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1 대비 실시예 1-2 내지 실시예 1-6의 히알루로니다제가 높은 온도 안정성을 가졌으며, 특히 냉동 및 냉장 보관 조건에서 실시예 1-2 내지 실시예 1-6 히알루로니다제의 효소 활성비(%)가 현저히 높게 유지되었다. 이후 실시예에는 재조합 히알루로니다제 중 활성이 가장 높게 나타난 약 12% 절단된 실시예 1-3에 해당하는 아미노산 D-S 히알루로니다제를 BMI2004로 명명하여 실험에 사용하였다.As shown in Table 4, the hyaluronidases of Examples 1-2 to 1-6 had higher temperature stability than those of Example 1-1, and in particular, the enzyme activity ratios (%) of the hyaluronidases of Examples 1-2 to 1-6 were maintained significantly high under frozen and refrigerated storage conditions. In the following examples, the amino acid D-S hyaluronidase corresponding to Example 1-3, which was truncated to about 12% and showed the highest activity among the recombinant hyaluronidases, was named BMI2004 and used in the experiments.
실시예 3. 야생형 히알루로니다제 및 BMI2004의 안정성 확인Example 3. Stability verification of wild-type hyaluronidase and BMI2004
(1) pH에 따른 효소 활성 또는 함량 비교(1) Comparison of enzyme activity or content according to pH
실시예 1에서 제조한 BMI2004의 pH 안정성을 야생형 히알루로니다제와 비교하였다. pH 안정성 시험에 사용된 BMI2004 및 야생형 히알루로니다제 (제조원; 한국비엠아이, 상품명; Hirax, 이하 Hirax로 명명)는 95% 이상 정제된 것이며, 실험 농도는 1,500 IU/mL(=100%)가 되도록 하였고, 물을 이용해 치환하여 표 5에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하고, 이를 5℃에서 pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0, pH 10.0으로 4주간 보관하고 2주마다 각 시점에서 역가 시험을 진행하였다. 각 시점에서 검체의 효소 활성 또는 함량은 실시예 2의 (1) 과 동일한 방법으로 확인하였다.The pH stability of BMI2004 manufactured in Example 1 was compared with that of wild-type hyaluronidase. BMI2004 and wild-type hyaluronidase (Manufacturer; BMI Korea, trade name; Hirax, hereinafter referred to as Hirax) used in the pH stability test were purified by 95% or more, and the experimental concentration was 1,500 IU/mL (=100%). Solutions were prepared by substitution with water according to the conditions described in Table 5, and these were stored at 5°C at pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0, and pH 10.0 for 4 weeks, and a titer test was performed at each time point every 2 weeks. The enzyme activity or content of the sample at each time point was confirmed by the same method as (1) of Example 2.
(1,500 IU/mL)BMI2004 / Hirax
(1,500 IU/mL)
pH 안정성 실험 결과를 표 6에 나타냈다. 각 시험의 효소 활성은 0주차의 초기 효소 활성도인 1,500 IU/mL(=100%)를 기준으로 하여, 각 시점에서 측정된 활성도 (IU/mL)를 대비하여 표시한 퍼센트 수치이며, 효소 활성비는 하기 수학식에 따라 계산되었다:The results of the pH stability experiment are shown in Table 6. The enzyme activity of each test is expressed as a percentage value compared to the activity (IU/mL) measured at each time point based on the initial enzyme activity of 1,500 IU/mL (=100%) in week 0, and the enzyme activity ratio was calculated according to the following mathematical formula:
효소 활성비(%) = (측정시점의 효소 활성)/(초기 효소 활성) *100Enzyme activity ratio (%) = (enzyme activity at the time of measurement) / (initial enzyme activity) * 100
표 6에 나타난 바와 같이, 약 4주간 BMI2004 및 Hirax의 pH에 따른 안정성을 확인하였다. pH 3.0 및 pH 10.0에 비해 pH 5.0 및 pH 7.0에서 더 높은 효소 활성비(%)을 가지고, 2주차 이후 BMI2004에 비해 Hirax의 함량(%)이 급격히 감소하는 경향을 보였다. 100%를 초과하는 값은 백신, 재조합 단백질 (싸이토카인, 단일클론 항체 등) 등 생물학적 제제의 역가 시험에서 변화폭이 커서 일반적으로 발생하는 측정상 오차로 보였다.As shown in Table 6, the pH-dependent stability of BMI2004 and Hirax was confirmed for about 4 weeks. It had a higher enzyme activity ratio (%) at pH 5.0 and pH 7.0 than at pH 3.0 and pH 10.0, and the content (%) of Hirax tended to decrease rapidly compared to BMI2004 after the 2nd week. The values exceeding 100% seemed to be a measurement error that generally occurs due to a large range of changes in the potency tests of biological products such as vaccines and recombinant proteins (cytokines, monoclonal antibodies, etc.).
Hirax 및 BMI2004의 pH에 따른 안정성 확인에 대한 효소 활성(또는 함량) 변화를 추가적으로 시험하고자, 상기 표 5의 조건으로 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)를 진행하였으며, 하기 시험법에 따라 시험하였다:To additionally test the change in enzyme activity (or content) for the stability confirmation according to pH of Hirax and BMI2004, SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) was performed under the conditions of Table 5 above, and the test was conducted according to the following test method:
1) Sample Buffer (5X) 의 조제 : Pierce™ Lane Marker Reducing Sample Buffer (Thermo Scientific™, Cat No. 39000)을 사용한다.1) Preparation of Sample Buffer (5X): Use Pierce™ Lane Marker Reducing Sample Buffer (Thermo Scientific™, Cat No. 39000).
2) Running Buffer (1X) 의 조제 : Novex™ Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X) (Invitrogen, Cat No. LC2675)을 사용한다. 100 mL를 정확하게 취하여 1,000 mL 용량플라스크에 넣고 물을 넣어 혼화하여 정확하게 1,000 mL로 한다.2) Preparation of Running Buffer (1X): Use Novex™ Tris-Glycine SDS Running Buffer (10X) (Invitrogen, Cat No. LC2675). Take exactly 100 mL, place in a 1,000 mL volumetric flask, add water and mix to make exactly 1,000 mL.
3) 검액의 조제 : Hirax 및 BMI2004 표준폼을 물로 치환하고 조건에 맞게 조정하여 사용한다. 이 약 20 μL, Sample Buffer (5X) 5 μL를 정확하게 취하여 EP 튜브에 넣고 혼화한다.3) Preparation of test solution: Replace Hirax and BMI2004 standard forms with water and adjust to the conditions. Take exactly 20 μL of this and 5 μL of Sample Buffer (5X), place in an EP tube, and mix.
4) 조작법 : 검액 및 PageRuler Prestained Protein Ladder 표준품 (Thermo, Cat No. 26616)을 가지고 아래의 조작조건으로 조작한다.4) Operating method: Operate under the operating conditions below using the test solution and PageRuler Prestained Protein Ladder standard (Thermo, Cat No. 26616).
4-1) NovexTM WedgewellTM 8 ∼ 16% Tris-Glycine Gel (Invitrogen, Cat No. XP08160BOX) 또는 이와 동등한 Gel 1장을 가지고 콤 (Comb)을 제거한 후 물로 겔의 보존액을 세척한다.4-1) Remove the comb from one sheet of NovexTM WedgewellTM 8-16% Tris-Glycine Gel (Invitrogen, Cat No. XP08160BOX) or equivalent gel and wash the preservative from the gel with water.
4-2) 세척된 겔을 Mini Gel Tank에 체결하고 Running Buffer (1X) 를 Mini Gel Tank의 Cathode 영역은 가득 채우고 Anode 영역은 2/3 정도 채운다.4-2) Attach the washed gel to the Mini Gel Tank and fill the cathode area of the Mini Gel Tank with Running Buffer (1X) until it is completely filled, and the anode area is filled about 2/3 full.
4-3) PageRuler Prestained Protein Ladder 표준품 7 μL, 검액 25 μL를 겔에 주입한다.4-3) Inject 7 μL of PageRuler Prestained Protein Ladder standard and 25 μL of test solution into the gel.
4-4) Mini Gel Tank에 전원공급장치를 연결하고 아래와 같이 조작한 후 겔의 90%까지 전개한다.4-4) Connect the power supply to the Mini Gel Tank and operate as shown below to expand the gel to 90%.
Volt : 140 VVolt : 140 V
Ampere : 400 mAAmpere: 400 mA
시간 : 60 분 (겔의 전개 상황을 보고 시간은 변경할 수 있다.)Time: 60 minutes (Time can be changed depending on gel development.)
4-5) 전개가 완료되면 겔을 캐스터에서 분리한 후 물로 세척한다.4-5) When the deployment is complete, separate the gel from the caster and wash it with water.
4-6) 세척이 완료된 겔을 염색시액 (Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution, BIO-RAD, Cat No. 1610436) 이 들어 있는 용기에 넣는다.4-6) Place the washed gel into a container containing staining solution (Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution, BIO-RAD, Cat No. 1610436).
4-7) 용기를 Rocker에 올려 놓고 30 rpm 으로 30 분간 염색한다.4-7) Place the container on the rocker and dye at 30 rpm for 30 minutes.
4-8) 염색이 완료되면 탈색시액 (Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution, BIO-RAD, Cat No. 1610438)이 들어있는 용기에 넣고 Rocker 에서 30 rpm 으로 겔이 탈색이 될 때까지 탈색시액을 교체하며 탈색한다. 탈색이 일부 완료되면 물에 넣어 탈색액을 세척한다.4-8) When staining is complete, place in a container containing a bleaching solution (Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution, BIO-RAD, Cat No. 1610438) and destain by replacing the bleaching solution on a rocker at 30 rpm until the gel is destained. When destaining is partially complete, place in water to wash off the bleaching solution.
4-9) 탈색액이 세척되면 겔을 흰색등 위에서 관찰한다.4-9) Once the bleaching solution is washed away, observe the gel on a white light.
실험 결과를 도 1a 내지 도 1c에 나타냈다. 도 1a 내지 도 1c에 나타난 바와 같이, SDS-PAGE의 결과로 물로 치환한 상태에서의 시간의 흐름에 따른 기타 밴드의 생성여부로 보아 BMI2004가 Hirax에 비해 pH에 대한 안정성이 높다고 해석할 수 있다.The experimental results are shown in Figs. 1a to 1c. As shown in Figs. 1a to 1c, based on the SDS-PAGE results and the presence or absence of other bands over time in a state of water substitution, it can be interpreted that BMI2004 has higher pH stability than Hirax.
(2) 보관 온도에 따른 효소 활성 또는 함량 비교(2) Comparison of enzyme activity or content according to storage temperature
실시예 1에서 제조한 BMI2004의 온도 안정성을 야생형 히알루로니다제 Hirax와 비교하였다. 온도 안정성 시험에 사용된 BMI2004 및 Hirax는 95% 이상 정제된 것이며, 실험 농도는 1,500 IU/mL(=100%)가 되도록 하였고, 물을 이용해 치환하여 표 7에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하고, 이를 냉동 (-20 ℃), 냉장 (5 ℃), 및 고온 (40 ℃)에서 4주간 보관하고 2주마다 각 시점에서 역가 시험을 진행하였다.The temperature stability of BMI2004 manufactured in Example 1 was compared with that of the wild-type hyaluronidase Hirax. BMI2004 and Hirax used in the temperature stability test were purified by 95% or more, and the experimental concentration was 1,500 IU/mL (=100%). Solutions were prepared by substitution with water according to the conditions described in Table 7, and these were stored for 4 weeks in the freezer (-20°C), refrigerator (5°C), and high temperature (40°C), and a titer test was performed at each time point every 2 weeks.
(1,500 IU/mL)Hirax / BMI2004
(1,500 IU/mL)
약 4주간 Hirax 및 BMI2004의 온도에 따른 안정성을 확인하여 하기 표 8 및 도 2에 나타냈다. -20℃ 이하 냉동 온도에서 가장 높은 함량(%)을 보였으며, 2주차 이후 모든 온도 조건에서 Hirax 대비 BMI2004의 함량(%)이 현저히 높게 유지되었다.The temperature stability of Hirax and BMI2004 for about 4 weeks was confirmed and shown in Table 8 and Fig. 2. The highest content (%) was observed at a freezing temperature of -20℃ or lower, and the content (%) of BMI2004 remained significantly higher than that of Hirax under all temperature conditions after the 2nd week.
Hirax 및 BMI2004의 온도에 따른 안정성 시험에 대한 함량 변화의 추가적 시험은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 상기 표 7의 조건으로 SDS-PAGE 를 진행하였다.Additional tests on the change in content for the stability test according to temperature of Hirax and BMI2004 were performed in the same manner as in Example 3, and SDS-PAGE was performed under the conditions of Table 7.
SDS-PAGE 실험결과를 도 2a 내지 도 2c에 나타냈다. 도 2a 내지 도 2c에 나타난 바와 같이, 물로 치환된 상태에서 냉동, 냉장, 및 고온 조건에서 시간의 흐름에 따라 초기 주 밴드 위치 이외의 기타 밴드의 생성으로 보아 Hirax에 비해 BMI2004가 보관 조건에 대한 안정성이 높다고 해석할 수 있다.The results of the SDS-PAGE experiment are shown in Figs. 2a to 2c. As shown in Figs. 2a to 2c, it can be interpreted that BMI2004 has higher stability under storage conditions than Hirax, judging from the generation of other bands other than the initial main band position over time under frozen, refrigerated, and high temperature conditions in a state substituted with water.
실시예 4. 온도에 따른 최적 효소 활성Example 4. Optimal enzyme activity according to temperature
본 실시예에서 Plate 역가 시험은 항생물질의 미생물학적 역가시험법 중 원통평판법을 바탕으로 고안되었다. 구체적으로, 일정량의 히알루로니다제가 분주된 페니실린더를 히알루론산이 함유된 고체 아가로스 Plate 위에 놓으면 히알루로니다제가 확산된다. 이러한 확산을 통해 히알루론산은 히알루로니다제에 의해 분해되고, 분해되지 않은 히알루론산은 세틸피리디늄 클로라이드에 의해 침전되어 투명한 환이 생긴다. 따라서, 본 실시예는 Plate를 이용한 간단한 방법을 통해 생성된 환의 크기로 히알루로니다제의 효소 활성을 확인할 수 있다. 각 조건에서 Plate 역가 시험은 하기 시험법에 따라 시험하였다:In this example, the plate titer test was designed based on the cylindrical plate method among microbiological titer test methods of antibiotics. Specifically, when a penicillin dispensed with a certain amount of hyaluronidase is placed on a solid agarose plate containing hyaluronidase, the hyaluronidase diffuses. Through this diffusion, the hyaluronic acid is decomposed by the hyaluronidase, and the non-decomposed hyaluronic acid is precipitated by cetylpyridinium chloride to form a transparent ring. Therefore, in this example, the enzymatic activity of hyaluronidase can be confirmed by the size of the ring formed through a simple method using a plate. The plate titer test was performed under each condition according to the following test method:
1) 히알루론산 용액 제조: 히알루론산 0.2 g 을 물에 넣어 완전히 녹인 후 100 mL 로 만든 후 염산 및 수산화나트륨을 넣어 pH 7.0 ± 0.1 로 조정한다.1) Preparation of hyaluronic acid solution: Dissolve 0.2 g of hyaluronic acid in water until completely dissolved, then make 100 mL and add hydrochloric acid and sodium hydroxide to adjust pH to 7.0 ± 0.1.
2) 1.5% 아가로스 제조: 물 100 mL 에 아가로스 (SIGMA, Cat No. A9539) 1.5 g 을 넣고 마이크로웨이브를 사용하여 녹인다.2) Preparation of 1.5% agarose: Add 1.5 g of agarose (SIGMA, Cat No. A9539) to 100 mL of water and dissolve using a microwave.
3) 10% 세틸피리디늄 클로라이드 제조: 물 100 mL 에 세틸피리디늄 클로라이드 (SIGMA, Cat No. C0732) 10 g 을 넣어 조제한다.3) Preparation of 10% cetylpyridinium chloride: Prepare by adding 10 g of cetylpyridinium chloride (SIGMA, Cat No. C0732) to 100 mL of water.
4) 검액: Hirax 및 BMI2004 표준폼을 물로 치환하고 조건에 맞게 조정하여 사용한다.4) Test solution: Replace Hirax and BMI2004 standard forms with water and adjust to suit the conditions.
5) 조작법: 검액을 가지고 아래의 조작조건으로 시험한다.5) Operating method: Test the test solution under the operating conditions below.
5-1) 히알루론산 용액은 1.5% 아가로스와 섞기 전에 37 ℃에서 약 20 분 정도 데운다.5-1) Warm the hyaluronic acid solution at 37°C for approximately 20 minutes before mixing with 1.5% agarose.
5-2) 1.5% Agarose 100 mL 이 약 60 ℃ 정도로 식으면 히알루론산 용액 100 mL 을 넣고 교반하여 섞어준다.5-2) When 100 mL of 1.5% agarose cools to about 60℃, add 100 mL of hyaluronic acid solution and stir to mix.
5-3) Petri Dish (SPL, Cat No. 10050)에 약 3 mm 두께로 부어준다.5-3) Pour into a Petri Dish (SPL, Cat No. 10050) to a thickness of about 3 mm.
5-4) 아가로스 겔이 완전히 굳으면 Petri Dish 동심원 상에 페니실린더 (KisanBio, Cat No. KS-P0161)를 90°가 되도록 올리고 검액 20 μL를 취하여 페니실린더 안에 분주한 후 각각의 표에 기재된 온도 조건으로 맞춘 Incubator에서 18~20시간 반응시킨다.5-4) When the agarose gel is completely hardened, place a penicillin (KisanBio, Cat No. KS-P0161) on a concentric circle of a Petri dish at a 90° angle, dispense 20 μL of the test solution into the penicillin, and react for 18 to 20 hours in an incubator adjusted to the temperature conditions listed in each table.
5-5) 반응이 끝나면 페니실린더를 제거한 후 10% 세틸피리디늄 클로라이드를 3 mL 넣고 약 20 분 후에 투명한 환을 확인한다.5-5) After the reaction is complete, remove the penicillin, add 3 mL of 10% cetylpyridinium chloride, and check for a transparent ring after about 20 minutes.
5-6) 환의 지름(mm)은 0.5 mm 이하까지 정확히 측정한다.5-6) The diameter of the ring (mm) is measured accurately to 0.5 mm or less.
(1) 히알루론산 용액의 활성 확인(1) Confirmation of activity of hyaluronic acid solution
최적 효소 활성 시험을 진행하기 전 히알루론산 용액이 자체적 활성을 나타내는지 확인하고자 다양한 pH 및 온도 조건에서 Plate 역가 시험을 진행하였다. pH 4.0, pH 7.0 또는 pH 10.0 조건에서 온도를 20℃, 25℃, 30℃, 35℃ 및 40℃로 조절하여 실험을 진행하였으며, 실험 결과를 도 3에 나타냈다. 도 3에 나타난 바와 같이, 히알루론산 용액은 자체적 활성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.Before conducting the optimal enzyme activity test, a plate titer test was conducted under various pH and temperature conditions to confirm whether the hyaluronic acid solution exhibited its own activity. The experiment was conducted at pH 4.0, pH 7.0, or pH 10.0, with the temperature adjusted to 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, and 40℃, and the experimental results are shown in Fig. 3. As shown in Fig. 3, it was confirmed that the hyaluronic acid solution did not exhibit its own activity.
(2) 20-40 ℃ 온도 조건에서 효소 활성 비교(2) Comparison of enzyme activity under temperature conditions of 20-40 ℃
효소 활성 시험에 사용된 Hirax 및 BMI2004는 95% 이상 정제된 것이며, 1,500 IU/mL(=100%)의 농도로 맞추어 물을 이용해 치환하였고, 하기 표 9에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하고, 이를 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 및 40℃의 각 온도 조건에서 Plate 역가 시험을 진행하였다.Hirax and BMI2004 used in the enzyme activity test were purified to a degree of 95% or higher, and were substituted with water to a concentration of 1,500 IU/mL (=100%). Solutions were prepared according to the conditions described in Table 9 below, and plate titer tests were performed at each temperature condition of 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, and 40°C.
(1,500 IU/mL)Hirax / BMI2004
(1,500 IU/mL)
실험결과를 도 4a 및 도 4b에 나타냈다. 20 내지 40 ℃ 온도 조건에서 Hirax 및 BMI2004의 효소 활성을 Plate 역가 시험으로 확인한 결과 35 ℃ 및 40 ℃에서 환의 크기가 크게 나타났다.The experimental results are shown in Fig. 4a and Fig. 4b. The enzyme activities of Hirax and BMI2004 were confirmed by plate titer test at temperature conditions of 20 to 40 ℃, and the ring sizes were large at 35 ℃ and 40 ℃.
효소 활성을 정량화하기 위해 도 4a 및 도 4b의 환의 지름을 측정하여 하기표 10에 나타냈다. 표 10에서 지름(mm)의 오차범위는 ±0.5 mm 이다.To quantify the enzyme activity, the diameters of the rings in Figs. 4a and 4b were measured and shown in Table 10 below. The error range of the diameter (mm) in Table 10 is ±0.5 mm.
표 10에 나타난 바와 같이, 20 내지 40℃ 온도 조건에서 효소 활성을 비교한 결과 Hirax에 비해 BMI2004의 활성이 더 높게 나타났다.As shown in Table 10, when comparing enzyme activities under temperature conditions of 20 to 40℃, the activity of BMI2004 was higher than that of Hirax.
(3) 35-40 ℃ 온도 조건에서 효소 활성 비교(3) Comparison of enzyme activity under temperature conditions of 35-40 ℃
상기 실시예 4의 (2)에서 확인한 Hirax 및 BMI2004의 활성 비교를 바탕으로 세분화된 온도 조건에서 추가적으로 시험하고자, 하기 표 11에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하고, 이를 35 ℃, 37 ℃, 40 ℃의 각 온도 조건에서 Plate 역가 시험을 진행하였다.Based on the activity comparison of Hirax and BMI2004 confirmed in (2) of the above Example 4, in order to conduct additional tests under detailed temperature conditions, solutions were prepared according to the conditions described in Table 11 below, and plate titer tests were performed at each temperature condition of 35°C, 37°C, and 40°C.
(1,500 IU/mL)Hirax / BMI2004
(1,500 IU/mL)
실험결과를 도 5a 및 도 5b에 나타냈다. Hirax 및 BMI2004의 35 ℃, 37 ℃, 40 ℃에서의 효소 활성을 Plate 역가 시험으로 확인한 결과 37 ℃에서 환의 크기가 가장 크게 나타났으며, 환의 지름을 하기 표 12에 나타냈다. 지름(mm)의 오차범위는 ±0.5 mm 이다.The experimental results are shown in Fig. 5a and Fig. 5b. The enzyme activities of Hirax and BMI2004 at 35°C, 37°C, and 40°C were confirmed by plate titer test. The ring size was largest at 37°C, and the ring diameters are shown in Table 12 below. The error range of the diameter (mm) is ±0.5 mm.
표 12에 나타난 바와 같이, 35℃, 37℃, 및 40℃의 온도 조건에서 효소 활성을 비교한 결과 Hirax에 비해 BMI2004의 활성이 더 높게 나타났다.As shown in Table 12, when the enzyme activity was compared at temperature conditions of 35℃, 37℃, and 40℃, the activity of BMI2004 was higher than that of Hirax.
실시예 5. pH에 따른 최적 효소 활성Example 5. Optimal enzyme activity according to pH
최적 효소 활성 시험에 사용된 Hirax 및 BMI2004는 95% 이상 정제된 것이며, 1,500 IU/mL(=100%)의 농도로 맞추어 물을 이용해 치환하였고, 하기 표 13에 기재된 조건에 따라 용액을 제조하였다. 효소 활성은 실시예 4의 시험법에 따라 수행하였으며, 실시예 4의 (3)에서 확인한 온도에 따른 활성 결과를 바탕으로 환의 크기가 가장 크게 나타난 37℃의 조건에서 각 pH에 따른 Plate 역가 시험을 진행하였다.Hirax and BMI2004 used in the optimal enzyme activity test were purified by more than 95%, and were substituted with water to a concentration of 1,500 IU/mL (=100%), and solutions were prepared according to the conditions described in Table 13 below. The enzyme activity was performed according to the test method of Example 4, and based on the activity results according to temperature confirmed in (3) of Example 4, a plate titer test according to each pH was performed under the condition of 37℃ where the ring size was the largest.
(1,500 IU/mL)Hirax / BMI2004
(1,500 IU/mL)
실험결과를 도 6a 및 도 6b에 나타냈다. Hirax 및 BMI2004의 37 ℃에서 pH 5.0-10.0에 대한 효소 활성을 Plate 역가 시험으로 확인한 결과 pH 7.0-10.0에서 환의 크기가 특히 크게 나타나는 경향을 보였으며, 환의 지름에 대한 비교는 하기 표 14에 나타냈다. 지름(mm)의 오차범위는 ±0.5 mm 이다.The experimental results are shown in Fig. 6a and Fig. 6b. The enzyme activities of Hirax and BMI2004 at 37℃ and pH 5.0-10.0 were confirmed by plate titer test. The ring size tended to be particularly large at pH 7.0-10.0, and a comparison of the ring diameters is shown in Table 14 below. The error range of the diameter (mm) is ±0.5 mm.
상기 표 14에 나타난 바와 같이, 37 ℃에서 pH 5.0-10.0에 대한 효소 활성을 비교한 결과 물로 치환된 BMI2004는 pH 5.0 이상에서 Hirax 대비 효소 활성이 우수했고, 특히 pH 7.0 이상에서 우수한 활성을 나타냈다.As shown in Table 14 above, when comparing the enzyme activities for pH 5.0-10.0 at 37°C, BMI2004 substituted with water showed superior enzyme activity compared to Hirax at pH 5.0 or higher, and particularly excellent activity at pH 7.0 or higher.
실시예 6. 히알루로니다제의 역가 확인Example 6. Confirmation of hyaluronidase activity
실시예 2의 (1)과 동일한 방법으로 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제및 종래의 Hirax의 역가를 측정하여 표 15에 나타냈다.The titers of hyaluronidase according to one example of the present application and conventional Hirax were measured in the same manner as in (1) of Example 2, and are shown in Table 15.
표 15에 나타난 바와 같이, BMI2004는 단백질 mg 당 활성 약 122,433 내지 134,678 IU을 나타내고, Hirax는 단백질 mg 당 활성 약 80,538 내지 81,528 IU을 나타냈다. 따라서, 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제는 종래의 Hirax 대비 약 63% 단백질 양으로도 동등한 활성을 달성할 수 있다.As shown in Table 15, BMI2004 exhibited an activity of about 122,433 to 134,678 IU per mg of protein, and Hirax exhibited an activity of about 80,538 to 81,528 IU per mg of protein. Therefore, the hyaluronidase according to one example of the present application can achieve equivalent activity with about 63% of the protein amount compared to the conventional Hirax.
실시예 7. 히알루로니다제의 약물 흡수 및 확산 촉진 효과 (1)Example 7. Effect of hyaluronidase on promoting drug absorption and diffusion (1)
본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제가 약물의 흡수 및 확산을 촉진하는 효과를 확인하기 위하여 Trypan Blue를 이용한 약물의 흡수 및 확산 촉진 시험을 진행하였다.In order to confirm the effect of hyaluronidase according to an example of the present application on promoting drug absorption and diffusion, a drug absorption and diffusion promotion test was conducted using Trypan Blue.
구체적으로, Hirax 및 BMI2004를 각각 0.2% Trypan blue 용액에 혼합하여 balb/c 누드 마우스에 단회 피하 투여를 한 후, Trypan blue의 확산 정도를 비교하였다. 하기 표 16에 기재된 조건과 표 15에 기재된 역가를 바탕으로 모든 약물은 10 IU/mL 또는 100 IU/mL로 조제하여 0.05 mL씩 투여하였고, 각 시점에서 확산된 면적(πmm2)을 확인하였다.Specifically, Hirax and BMI2004 were each mixed in a 0.2% Trypan blue solution and administered subcutaneously once to balb/c nude mice, and the extent of Trypan blue diffusion was compared. Based on the conditions described in Table 16 below and the titers described in Table 15, all drugs were prepared at 10 IU/mL or 100 IU/mL and administered at 0.05 mL each, and the diffusion area (πmm2 ) was confirmed at each time point.
(IU/mL)Specimen
(IU/mL)
(ug/mL)Peptide Dosage
(ug/mL)
(10 IU/mL)Hirax
(10 IU/mL)
(100 IU/mL)Hirax
(100 IU/mL)
(10 IU/mL)BMI2004
(10 IU/mL)
(100 IU/mL)BMI2004
(100 IU/mL)
1) Mean ± SD1) Mean ± SD
2) *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to saline treated group by SPSS (one-way ANOVA, LSD test)2) *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 compared to saline treated group by SPSS (one-way ANOVA, LSD test)
상기 표 16에 나타낸 바와 같이, 2.5 내지 20 분 동안 확산된 면적을 확인하였다. 투여 5분 이후부터 음성 대조군인 Saline 대비 Hirax 및 BMI2004에서 확산된 면적이 유의미하게 증가하였다.As shown in Table 16 above, the diffused area was confirmed for 2.5 to 20 minutes. From 5 minutes after administration, the diffused area significantly increased in Hirax and BMI2004 compared to the negative control group, Saline.
실시예 8. 히알루로니다제의 약물 흡수 및 확산 촉진 효과 (2)Example 8. Effect of hyaluronidase on promoting drug absorption and diffusion (2)
본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제가 약물의 흡수 및 확산을 촉진하는 효과를 확인하기 위하여 무동증 모델 (Akinesia Model)을 이용한 약물의 흡수 및 확산 촉진 시험을 진행하였다.In order to confirm the effect of hyaluronidase according to an example of the present application on promoting drug absorption and diffusion, a drug absorption and diffusion promotion test was conducted using an akinesia model.
구체적으로, Akinesia Model을 이용한 약물의 침투력 증가를 확인하기 위하여 Cynomolgus Monkey를 사용하였다. 시험물질로는 표 15에 기재된 BMI2004 및 Hirax를 사용하였고, 음성대조군으로는 Saline을 사용하였다. 검체와 혼합 제조된 마취제로는 Lidocaine 및 Bupivacaine을 사용하였다. 투여는 6마리의 원숭이 오른쪽 눈과 왼쪽 눈의 둘레(Peribulbar)에 각각 2 mL씩 투여하여 움직임을 관찰하였다.Specifically, Cynomolgus Monkey was used to confirm the increase in drug penetration using Akinesia Model. BMI2004 and Hirax described in Table 15 were used as test substances, and Saline was used as a negative control group. Lidocaine and Bupivacaine were used as anesthetics mixed with the sample. 2 mL was administered to each of the right and left eye peribulbars of six monkeys, and the movement was observed.
마취제를 시험물질과 함께 투여 후 눈동자의 움직임이 없어질 때까지의 시간 (마취 소요 시간; Time to Akinesia)을 측정하고, 눈동자가 마취되었을 때부터 마취가 풀려 눈동자의 움직임이 관찰될 때 까지의 시간 (마취 지속 시간; Duration of Akinesia)을 측정하여 표 17에 나타냈다.The time until eye movement disappeared after administering the anesthetic along with the test substance (Time to Akinesia) was measured, and the time from when the pupils were anesthetized until the anesthesia wore off and eye movement was observed (Duration of Akinesia) was measured, and these are shown in Table 17.
(ug/mL)Peptide Dosage
(ug/mL)
(Monkey)Model
(Monkey)
(500 IU/0.2 mL)Hirax
(500 IU/0.2 mL)
(500 IU/0.2 mLBMI2004
(500 IU/0.2 mL
1) Drug; Lidocaine 2% (0.9 mL), Bupivacaine 0.5% (0.9 mL) and the dosing article (0.2 mL)1) Drug; Lidocaine 2% (0.9 mL), Bupivacaine 0.5% (0.9 mL) and the dosing article (0.2 mL)
상기 표 17에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군인 Saline에서는 Akinesia 효과가 나타나지 않았으나, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드를 마취제와 함께 투여 시 마취제의 침투력이 향상되어 눈동자의 마비 효과가 나타났으며, 종래의 Hirax와 동등한 Akinesia 효과를 나타내어 약물 흡수 및 확산을 유도할 수 있는 효과를 가졌다. 또한, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 종래의 Hirax 보다 약 63% 정도의 단백질 투여량으로 동등한 활성을 나타내었다.As shown in Table 17 above, the Akinesia effect was not observed in the negative control group, Saline, but when a polypeptide according to an example of the present application was administered together with an anesthetic, the penetration power of the anesthetic was improved, resulting in a paralyzing effect on the pupil, and it exhibited an Akinesia effect equivalent to that of the conventional Hirax, thereby having the effect of inducing drug absorption and diffusion. In addition, the polypeptide according to an example of the present application exhibited equivalent activity at a protein dosage of about 63% of that of the conventional Hirax.
실시예 9. 히알루로니다제의 과도한 체액의 재흡수 촉진 확인Example 9. Confirmation of promotion of reabsorption of excess fluid by hyaluronidase
본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제가 과도한 체액의 재흡수를 촉진하는 효과를 확인하기 위하여 부종 모델(Edema Model)로 시험을 진행하였다. 본 실시예에서는 C57BL/6 마우스를 사용하여 Lymph의 부종을 인위적으로 유발하여 Lymphedema Model로 효과를 확인하였다. 시험물질로는 표 15에 기재된 Hirax 및 BMI2004를 사용하였고, 음성대조군으로는 Saline을 사용하였다. 검체 및 투여량은 하기 표 18에 기재된 바와 같이 실시하였다.In order to confirm the effect of hyaluronidase according to an example of the present application on promoting reabsorption of excessive body fluid, a test was conducted using an edema model. In this example, C57BL/6 mice were used to artificially induce lymph edema and the effect was confirmed using a lymphedema model. Hirax and BMI2004 described in Table 15 were used as test substances, and Saline was used as a negative control group. The samples and dosages were performed as described in Table 18 below.
유발 여부Lymphedema
Whether it causes
(/site)Dosage
(/site)
Lymphedema 유도는 측정이 정확하고 용이한 꼬리(Tail)에서 진행하였다. 마우스의 꼬리 기저부에서 1 cm 떨어진 곳에 2 mm 너비로 피부를 고리 모양으로 도려내었고, 이 때 복부 방향(Ventral side)의 4 mm2 정도는 도려내지 않고 남겨두었다. Edema 감소 효과를 확인하기 위하여 유도 15일차에 하기 표 19에 기재된 바와 같이, 투여 전(0 시간)부터 첫 번째 투여 후 각 시점에서 꼬리(Tail)의 지름(mm)을 측정하였으며, 24 시간 후 두 번째 투여를 진행하였고, 48 시간 후 세 번째 투여를 진행하였다. 시험은 결손 부위의 10 mm 지점에서 Caliper를 사용하여 꼬리(Tail)의 지름(mm)을 측정하였다.Lymphedema induction was performed on the tail, which is easy and accurate to measure. A 2 mm wide skin was cut in a ring shape 1 cm away from the base of the mouse tail, leaving about 4 mm2 on the ventral side intact. In order to confirm the edema reduction effect, on the 15th day of induction, the diameter (mm) of the tail was measured at each time point from before administration (0 hour) to after the first administration, as described in Table 19 below. The second administration was performed 24 hours later, and the third administration was performed 48 hours later. The diameter (mm) of the tail was measured using a caliper at a point 10 mm from the defect site.
상기 표 19에 나타낸 바와 같이, BMI2004 투여에 의해 Lymphedema가 감소되어, 과도한 체액의 재흡수를 촉진하는 효과를 확인하였다. 또한, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 종래의 Hirax 대비 약 63% 단백질 투여량으로 동등한 활성을 나타냈다.As shown in Table 19 above, it was confirmed that lymphedema was reduced by administration of BMI2004, thereby promoting the reabsorption of excessive body fluid. In addition, the polypeptide according to one example of the present application showed equivalent activity at a protein dosage of about 63% compared to the conventional Hirax.
실시예 10. 히알루로니다제의 체내 안정성 확인Example 10. Confirmation of in vivo stability of hyaluronidase
본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제가 체내에서의 안정성을 확인하기 위하여 정맥투여하여 약동력(Pharmacokinetics)을 확인하였다. 본 실시예에서 시험동물은 SD-랫트를 사용하였으며, Hirax와 BMI2004를 각각 30분간 정맥에 infusion 방법으로 약 180,000IU가 되도록 투여하고, 채혈은 투여 전, 투여 개시 후 15분 (mid-infusion), 투여 개시 후 30분 (infusion 종료 시점) 및 31, 33, 36, 40, 45, 60, 75, 90분과 2.5시간, 4.5시간, 24.5시간, 48.5시간에 진행하였다.In order to confirm the stability of hyaluronidase according to an example of the present application in the body, pharmacokinetics were confirmed by intravenous administration. In this example, SD rats were used as test animals, and Hirax and BMI2004 were each administered by intravenous infusion for 30 minutes to a dose of about 180,000 IU, and blood collection was performed before administration, 15 minutes after the start of administration (mid-infusion), 30 minutes after the start of administration (infusion end point), and at 31, 33, 36, 40, 45, 60, 75, and 90 minutes and 2.5 hours, 4.5 hours, 24.5 hours, and 48.5 hours.
본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드와 Hirax의 약동력학(Pharmacokinetics) 변수를 표 20에 나타내고, 시간에 따른 폴리펩티드의 혈중농도를 도 7에 나타냈다. 도 7과 표 20에서 보는 바와 같이, Hirax의 경우 체내 반감기를 측정할 수 없을 정도로 급격하게 분해되는 반면, 본 출원의 일 예에 따른 폴리펩티드는 약 0.272시간(약 16.3분)으로 Hirax 보다 긴 반감기를 가져 체내에서 오래 머물러 있음으로써 Hirax 보다 큰 효과를 보일 수 있는 가능성을 보였다. 또한, 체내 혈중농도에서도 차이를 보이는데, Hirax의 경우 0.25시간(15분) 이내에 최고점에 도달하는 반면, BMI2004는 0.5시간(30분)으로 Hirax 보다 완만한 혈중농도 상승과 더불어 더 오랜 시간 동안 체내에서 머물러 있음으로써 Hirax 보다 더 큰 효과를 나타낼 수 있는 가능성을 보였다.Pharmacokinetic parameters of a polypeptide according to an example of the present application and Hirax are shown in Table 20, and the blood concentration of the polypeptide over time is shown in FIG. 7. As seen in FIG. 7 and Table 20, in the case of Hirax, it is decomposed so rapidly that the half-life in the body cannot be measured, whereas the polypeptide according to an example of the present application has a half-life of about 0.272 hours (about 16.3 minutes) that is longer than Hirax, showing the possibility of showing a greater effect than Hirax by remaining in the body for a longer time. In addition, there is a difference in the blood concentration in the body; in the case of Hirax, it reaches the peak within 0.25 hours (15 minutes), whereas BMI2004 shows a more gradual increase in blood concentration than Hirax at 0.5 hours (30 minutes), and shows the possibility of showing a greater effect than Hirax by remaining in the body for a longer time.
실시예 11. 피하투여 약물의 제조Example 11. Preparation of a drug for subcutaneous administration
본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제 및 약물을 포함하는 피하투여용 조성물을 제조하였다. 히알루로니다제로서 실시예 1-3의 BMI2004와 약물로서 시판 중인 허셉틴(Herceptin)을 사용하였다. 구체적으로, 실시예 1-3의 BMI2004 히알루로니다제를 제형버퍼 (5 mM 아세트산나트륨수화물, 1 mM 염화마그네슘수화물, 0.9 % 염화나트륨, 1.33 % 유당수화물, 0.01 % 폴리소르베이트 80, pH 5.0)에 2,000 IU/mL가 되도록 첨가하고, 허셉틴주 (트라스투주맙, ㈜한국로슈) 분말 120 mg을 혼합하여, 허셉틴 120 mg/BMI2004 2,000 IU/mL 비율의 피하투여 약물을 제조하였다.A composition for subcutaneous administration containing hyaluronidase and a drug according to one example of the present application was prepared. BMI2004 of Example 1-3 was used as the hyaluronidase and Herceptin, which is commercially available, was used as the drug. Specifically, BMI2004 hyaluronidase of Example 1-3 was added to a formulation buffer (5 mM sodium acetate hydrate, 1 mM magnesium chloride hydrate, 0.9% sodium chloride, 1.33% lactose hydrate, 0.01% polysorbate 80, pH 5.0) to be 2,000 IU/mL, and 120 mg of Herceptin injection (trastuzumab, Roche Korea Co., Ltd.) powder was mixed to prepare a subcutaneous administration drug at a ratio of Herceptin 120 mg/BMI2004 2,000 IU/mL.
실시예 12. 피하투여 약물의 생체 이용률 향상 효과Example 12. Effect of improving bioavailability of subcutaneous drug administration
실시예 11에서 제조한 피하투여 제제의 약물의 체내 흡수 촉진 효과를 확인하기 위하여, 피하투여 후 약동력(Pharmacokinetics)을 확인하였다. 본 실시예에서 시험동물은 마우스(ICR, Female)를 사용하였으며, 단회 투여 연구에서는 총 90마리의 마우스에 Herceptin을 투여하여 시점 당 2마리의 마우스로부터 혈액을 채취하였다.In order to confirm the effect of promoting drug absorption in the body of the subcutaneous administration preparation manufactured in Example 11, the pharmacokinetics after subcutaneous administration were confirmed. In this example, mice (ICR, Female) were used as test animals, and in the single administration study, Herceptin was administered to a total of 90 mice, and blood was collected from 2 mice per time point.
표 21에 기재된 바와 같이, 투여 용량은 대조군 1인 Group 1의 Herceptin IV는 6mg, 대조군 2인 Group 2의 Herceptin Hylecta는 6mg Herceptin/100IU rHuPH20, 마지막으로 시험물질인 Group 3는 6mg Herceptin/100IU BMI2004로 제제화 되어 각각 피하투여 되었다. 구체적으로, 음성 대조군인 약물 단독 투여군 (Group 1)에는 허셉틴주 (트라스투주맙, ㈜한국로슈) 150 mg/vial 분말을 제형버퍼 (5 mM 아세트산나트륨수화물, 1 mM 염화마그네슘수화물, 0.9 % 염화나트륨, 1.33 % 유당수화물, 0.01 % 폴리소르베이트 80, pH 5.0) 1.25 mL에 녹여 120 mg/mL 농도로 제조하여 마우스당 0.05mL 투여하였다. 양성 대조군인 Herceptin Hylecta 투여군 (Group 2)에는 시판 중인 rHuPH20 히알루로니다제가 첨가되어 제제화된 허셉틴 약물인 Herceptin HylectaTM 600 mg/10,000 IU/5 mL (120 mg/2,000 IU/mL, 액상)을 마우스 당 0.05 mL 투여하였다. 실험군인 Group 3은 실시예 11에서 제조한 허셉틴 120 mg/BMI2004 2,000 IU/mL 피하투여 약물을 마우스 당 0.05 mL 투여하였다. 투여 후 0시간(투여 전)부터 0.17, 0.5, 0.83, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 240, 336, 504, 672, 및 840시간 (총 21시점)의 각 시점에서 혈액을 채취한 후, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)를 사용하여 Herceptin 농도를 측정하였다.As described in Table 21, the administered dose was 6 mg of Herceptin IV in Group 1, the control group, 6 mg of Herceptin Hylecta in Group 2, and 6 mg of Herceptin/100 IU rHuPH20 in Group 2, the test substance, and lastly, 6 mg of Herceptin/100 IU BMI2004 in Group 3, which were administered subcutaneously. Specifically, in the negative control group administered drug alone (Group 1), 150 mg/vial of Herceptin injection (trastuzumab, Roche Korea Co., Ltd.) powder was dissolved in 1.25 mL of formulation buffer (5 mM sodium acetate hydrate, 1 mM magnesium chloride hydrate, 0.9% sodium chloride, 1.33% lactose hydrate, 0.01% polysorbate 80, pH 5.0) to prepare a concentration of 120 mg/mL and administered 0.05 mL per mouse. The Herceptin Hylecta administration group (Group 2), which is a positive control group, was administered 0.05 mL per mouse of Herceptin HylectaTM 600 mg/10,000 IU/5 mL (120 mg/2,000 IU/mL, liquid), a Herceptin drug formulated with commercially available rHuPH20 hyaluronidase. The experimental group, Group 3, was administered 0.05 mL per mouse of Herceptin 120 mg/BMI2004 2,000 IU/mL subcutaneously administered drug manufactured in Example 11. Blood samples were collected at each time point: 0 hour (before administration) and 0.17, 0.5, 0.83, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 240, 336, 504, 672, and 840 hours (total of 21 time points) after administration, and Herceptin concentrations were measured using ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay).
표 22 및 도 8에 나타난 바와 같이, 히알루로니다제가 첨가된 Herceptin은 히알루로니다제가 첨가되지 않은 Herceptin보다 빨리 체내 흡수가 되었다. 또한, 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제와 함께 제제화된 허셉틴 약물은 시판중인 rHuPH20 히알루로니다제가 첨가된 Herceptin hylecta와 유사한 약동학 결과를 보였다. 따라서, 본 출원의 일 예에 따른 히알루로니다제는 약물의 피하투여 제형화에 사용될 수 있으며, 약물의 체내 흡수를 촉진하는 효과를 가졌다.As shown in Table 22 and FIG. 8, Herceptin with added hyaluronidase was absorbed into the body faster than Herceptin without added hyaluronidase. In addition, the Herceptin drug formulated with hyaluronidase according to an example of the present application showed pharmacokinetic results similar to Herceptin hylecta with added commercially available rHuPH20 hyaluronidase. Therefore, the hyaluronidase according to an example of the present application can be used in the subcutaneous administration formulation of drugs and has the effect of promoting the absorption of drugs into the body.
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