본 발명은 재조합 지속형 호르몬 수용체 길항제, 특히 천연형 지속형 호르몬 수용체 길항제 또는 성숙된 지속형 호르몬 수용체 길항제, 또는 천연형 지속형 호르몬 수용체 길항제 또는 성숙된 지속형 호르몬 수용체 길항제의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함한 지속형 호르몬 수용체 길항제의 생산 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a recombinant long-acting hormone receptor antagonist, particularly a naturally occurring long-acting hormone receptor antagonist or a matured long-acting hormone receptor antagonist, or a long-acting hormone receptor antagonist comprising a substitution of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the naturally occurring long-acting hormone receptor antagonist or the matured long-acting hormone receptor antagonist.
본 연구는 과학기술정보통신부, 산업통상자원부, 보건복지부의 재원으로 국가신약개발사업단의 국가신약개발사업 지원에 의하여 이루어진 것임(과제고유번호: HN21C0535)을 밝힌다.This study was conducted with the support of the National New Drug Development Project of the National Drug Development Fund of the Korea Development Institute (KDFDA) with funding from the Ministry of Science and ICT, the Ministry of Trade, Industry and Energy, and the Ministry of Health and Welfare (Project Number: HN21C0535).
사람 성장 호르몬 수용체 길항제 (antagonists of the growth hormone receptor, GHR)는 인체의 성장 호르몬 수용체에 결합하여 성장 호르몬의 작용을 방해하는 화합물이다. 성장 호르몬은 인체에서 세포의 성장과 분열을 촉진하며, 조직의 성장과 수리에 관여하는 중요한 역할을 담당한다. 말단 비대증은 인슐린 유사성장인자-1의 비정상적인 과다분비를 유발하는 성장 호르몬 (growth hormone, GH)의 과다분비를 특징으로 하는 희귀질환으로 대부분 뇌하수체의 양성 종양으로 인해 발생한다. 이러한 성장호르몬 분비성 뇌하수체 종양은 말단 비대증의 가장 흔한 원인이다.Human growth hormone receptor antagonists (GHR) are compounds that bind to the growth hormone receptor in the body and block the action of growth hormone. Growth hormone plays an important role in stimulating cell growth and division in the body and in the growth and repair of tissues. Acromegaly is a rare disorder characterized by excessive secretion of growth hormone (GH), which causes abnormal oversecretion of insulin-like growth factor-1, and is most often caused by benign tumors of the pituitary gland. These growth hormone-secreting pituitary tumors are the most common cause of acromegaly.
말단비대증의 치료방법은 인슐린 유사성장인자-1의 생화학적 조절을 하는 것으로 성장 호르몬 수용체 길항제의 약물 치료가 방법이 될 수 있다. 부작용을 최소화한 성장호르몬 수용체 길항제의 개발은 매우 중요하다.Treatment of acromegaly involves biochemical regulation of insulin-like growth factor-1, and drug therapy with growth hormone receptor antagonists can be a method. The development of growth hormone receptor antagonists with minimal side effects is very important.
말단 비대증 치료를 위한 바이오의약품 개발에서는 재조합 단백질 기반의 치료 전략이 필요하다. 재조합 기술을 사용하여 생산된 단백질은 일관된 품질과 활성을 가지기 때문에, 치료제의 안전성과 효과를 높이고, 생산 과정에서의 변동성을 줄인다. 또한 타겟 단백질만을 고도로 정제할 수 있어 순도가 높은 의약품을 얻을 수 있고, 이로 인해 부작용 가능성이 줄어들고 치료 효과가 높아진다. 재조합 단백질 치료제는 대량의 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다. 이로 인해 치료제의 가격이 저렴해지고, 더 많은 환자들이 치료를 받을 수 있는 장점이 있다. 대량의 단백질을 생산하기 위해서는 세포 선별, 배지 최적화, 그리고 배양 공정을 개선하여 재조합 단백질의 생산 효율과 품질을 높일 수 있다. 현재 동물 세포 배양 조건을 최적화하여 치료에 적합한 단백질의 생산성과 안전성을 높이려는 노력이 진행되고 있다. 이 과정에서 생산성 증대와 더불어 탈아미드체와 아미노산 치환 및 결실체 생성을 억제하여 정제 과정을 개선하고, 얻어진 단백질 의약품의 치료 효과를 극대화할 수 있다.In the development of biopharmaceuticals for the treatment of acromegaly, a recombinant protein-based therapeutic strategy is required. Since proteins produced using recombinant technology have consistent quality and activity, they enhance the safety and efficacy of therapeutics and reduce variability in the production process. In addition, only the target protein can be highly purified, so a highly pure drug can be obtained, which reduces the possibility of side effects and increases the therapeutic effect. Recombinant protein therapeutics can efficiently produce large quantities of proteins. This has the advantage of lowering the price of therapeutics and allowing more patients to receive treatment. In order to produce large quantities of proteins, cell selection, media optimization, and improved culture processes can be used to improve the production efficiency and quality of recombinant proteins. Currently, efforts are being made to optimize animal cell culture conditions to increase the productivity and safety of proteins suitable for treatment. In this process, in addition to increasing productivity, the purification process can be improved by suppressing the production of deamidated bodies, amino acid substitutions, and deletions, and the therapeutic effect of the obtained protein pharmaceuticals can be maximized.
단백질의 생산성 증대는 동물 세포의 대사와 연관성이 있으며, 동물세포의 주요 대사경로에는 글루코스와 글루타민이 주요 탄소원 및 에너지원으로 사용된다. 동물세포에 의해 글루코스가 대사되면 박테리아의 경우와 마찬가지로 해당과정을 거쳐 피루브산이 된다. 또한 인산오탄당 경로 (pentose phosphate pathway)에 의해 오탄당을 만들어 핵산을 합성하는 것도 박테리아의 경우와 동일하다. 해당과정에서 만들어진 피루브산은 TCA 회로에 의해 CO2와 H2O로 분해되기도 하고 젖산이 되기도 하며, 또한 지방산이 되기도 한다. 동물세포 대사에 사용되는 탄소원 중에서 글루타민은 이물질이 대사되면 일부는 글루타메이트가 되고, 글루타메이트는 TCA 회로로 들어가 다른 아미노산 합성을 위한 탄소골격 (carbon skeleton)을 만든다. 동물세포 대사의 주요 배설물은 젖산과 암모니아이며 알라닌 (alanine)의 배출 또한 중요하다. 락테이트와 암모니아는 세포 내부와 리소좀의 pH를 변화시키기 때문에 세포에 유독하다. 따라서 이러한 물질을 효과적으로 제거하는 것도 고농도 동물세포 배양 시스템에서 중요한 문제이다. 또한, 동물세포 배양에서는 숙주세포 단백질 (Host cell protein; HCP)의 생성을 억제해야 하며, 이를 억제해야 하는 주된 이유는 제품의 순도와 안전성, 그리고 생산 효율을 향상시키기 위함이다. 세포배양 과정에서 생산되는 표적 생산물 (치료제, 백신 등)은 종종 숙주세포 단백질과 함께 추출되며, 이는 다양한 문제를 일으킬 수 있다. 숙주세포 단백질은 순도가 높아야 하는 제품에 대한 오염 요인이다. 숙주세포 단백질의 존재는 제품의 활성, 안정성 및 제형과 같은 중요한 품질 특성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서 숙주세포 단백질 수준을 최소화함으로써 제품의 순도와 품질을 높일 수 있다. 숙주세포 단백질은 종종 이종단백질로 인식되어, 체내에서 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이로 인해 약물의 효능이 감소하거나, 알레르기 반응 및 부작용이 발생할 수 있다.Increased protein productivity is related to animal cell metabolism, and glucose and glutamine are used as the main carbon and energy sources in the main metabolic pathways of animal cells. When glucose is metabolized by animal cells, it goes through the glycolysis process to become pyruvate, just like in bacteria. In addition, it is the same as in bacteria that pentose sugars are created through the pentose phosphate pathway to synthesize nucleic acids. The pyruvate created in the glycolysis process is decomposed intoCO2 andH2O by the TCA cycle, or it becomes lactic acid, or it becomes a fatty acid. Among the carbon sources used in animal cell metabolism, some of glutamine becomes glutamate when foreign substances are metabolized, and glutamate enters the TCA cycle to create a carbon skeleton for the synthesis of other amino acids. The main excretions of animal cell metabolism are lactic acid and ammonia, and the excretion of alanine is also important. Lactate and ammonia are toxic to cells because they change the pH inside cells and lysosomes. Therefore, effective removal of these substances is also an important issue in high-density animal cell culture systems. In addition, the production of host cell proteins (HCPs) must be suppressed in animal cell culture, and the main reason for suppressing them is to improve product purity and safety, as well as production efficiency. Target products (therapeutics, vaccines, etc.) produced during cell culture are often extracted together with host cell proteins, which can cause various problems. Host cell proteins are a contaminant for products that require high purity. The presence of host cell proteins can negatively affect important quality characteristics such as product activity, stability, and formulation. Therefore, product purity and quality can be improved by minimizing the level of host cell proteins. Host cell proteins are often recognized as foreign proteins, which can cause an immune response in the body. This can reduce the efficacy of the drug, or cause allergic reactions and side effects.
따라서, 숙주세포 단백질 수준을 낮추어 제품의 안전성을 향상시킬 수 있다. 식품 및 의약품 규제 기관은 생물학적 제품의 숙주세포 단백질 수준에 대한 엄격한 기준을 설정하고 있다. 제품의 허가 및 상용화를 위해서는 이러한 규제 요건을 준수해야 하며, 숙주세포 단백질 수준을 낮추는 것이 필수적이다. 숙주세포 단백질은 생산 공정에서 크로마토그래피와 같은 정제 단계를 복잡하게 만들 수 있다. 숙주세포 단백질이 적게 함유된 제품은 정제 과정이 더 간단하고 효율적으로 진행될 수 있으며, 이는 생산 비용 절감 및 생산량 증가에 기여할 수 있다. 숙주세포 단백질 억제를 위한 다양한 전략이 사용되고 있으며, 이는 공정 개선, 세포배양 조건 최적화, 정제 기술 개발 등을 포함할 수 있다.Therefore, lowering the host cell protein level can improve the safety of the product. Food and drug regulatory agencies set strict standards for the host cell protein level of biological products. Compliance with these regulatory requirements is necessary for product approval and commercialization, and lowering the host cell protein level is essential. Host cell protein can complicate purification steps such as chromatography in the production process. Products with lower host cell protein content can be purified more simply and efficiently, which can contribute to reduced production costs and increased yield. Various strategies are being used to suppress host cell protein, and these can include process improvement, optimization of cell culture conditions, and development of purification techniques.
따라서, 재조합 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성 및 품질은 배양 조건에 따라 영향을 받으므로, 이를 조절하고 유지하여 산업적으로 유용한 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성을 높이는 방법에 대한 연구가 요구되고 있다.Therefore, since the productivity and quality of a recombinant sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof are affected by culture conditions, research is required on a method for controlling and maintaining these conditions to increase the productivity of an industrially useful sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof.
본 발명의 목적은 재조합 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 생산하는 숙주 세포의 배양 방법 및 이러한 방법으로 제조된 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 제공하는 것으로, 특히 생산성 및 품질이 향상된 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산방법을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a method for culturing a host cell producing a recombinant long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof and a long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof produced by the method, and in particular, to provide a method for producing a long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof with improved productivity and quality.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 본 발명 명세서의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problems to be achieved by the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description of the specification of the present invention.
본 발명에서는 재조합 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 생산하는 숙주세포를 특정한 배양 조건 하에서 배양할 경우, 재조합 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성이 현저하게 향상되고, 숙주세포 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다.In the present invention, it was confirmed that when a host cell producing a recombinant sustained-release growth hormone receptor antagonist or a variant thereof is cultured under specific culture conditions, the productivity of the recombinant sustained-release growth hormone receptor antagonist or a variant thereof is significantly improved and the host cell protein expression is reduced.
구체적으로 본 발명은 배지 내의 글루코스 농도 및/또는 배양 온도 변경 후 일정 기간 동안 배양함으로써 본 발명에서 목적하는 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.Specifically, the present invention confirmed that the productivity of a sustained growth hormone receptor antagonist or a variant thereof desired in the present invention can be significantly increased by culturing for a certain period of time after changing the glucose concentration and/or culture temperature in the medium.
본 발명은 유전자 재조합 방법으로 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 산업적으로 유용하게 사용하기 위하여 생산함에 있어, 동물 세포 배양 조건, 특히 배양 온도, 초기 세포 농도, 배양액 내 글루코스 농도가 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성에 매우 중요하다는 사실을 확인하여 완성된 것이다.The present invention was completed by confirming that, when producing a long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof for industrial use by a genetic recombination method, animal cell culture conditions, particularly culture temperature, initial cell concentration, and glucose concentration in the culture medium, are very important for the productivity of the long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof.
구체적으로 본 발명은Specifically, the present invention
(1) 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 발현하는 숙주 세포를 종배양하는 단계;(1) A step of culturing a host cell expressing a sustained growth hormone receptor antagonist or a mutant thereof;
(2) 종배양된 숙주세포를 약 1.5×106cells/mL 이상의 초기 세포농도로 배지에 접종하여 배양 온도 35℃~ 38℃에서 본배양하는 단계; 및(2) A step of inoculating the cultured host cells into the medium at an initial cell concentration of about 1.5×106 cells/mL or more and performing main cultivation at a culture temperature of 35°C to 38°C; and
(3) 상기 (2)의 본배양에서 생존세포농도 (Viable cell density)가 약 10x106 ~ 120x106 cells/mL가 되면 배양 온도를 28℃~ 32℃로 감소시킨 후 배양 온도를 유지하며 2 ~ 14일 동안 추가 본배양하는 단계;를 포함하며,(3) In the main culture of (2) above, when the viable cell density becomes about 10x106 to 120x106 cells/mL, the culture temperature is reduced to 28°C to 32°C, and then the main culture is performed for 2 to 14 days while maintaining the culture temperature;
상기 (2) 단계 및/또는 (3) 단계에서 배지 내의 잔류 글루코스 농도를 배양 기간 동안 0.001 g/L ~ 5.0 g/L로 유지하여 배양액에서의 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성을 높이는 것 및/또는 숙주세포 단백질 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof, characterized in that the productivity of a sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof in a culture medium is increased and/or host cell protein expression is reduced by maintaining the residual glucose concentration in the medium at 0.001 g/L to 5.0 g/L during the culturing period in step (2) and/or step (3).
상기 수치 및 이하에 제시되는 수치는 예컨대 20%, 바람직하게는 15%, 더욱 바람직하게는 10%의 오차 범위를 갖고 있는 실험값이다. 배양 조건을 설정하는 경우 배양에 사용하는 기기 및 시험자의 업무 숙달 정도 등등의 조건에 따라 편차가 발생하므로, 본 발명에서 설정한 수치는 제한된 의미에서보다는 편차를 고려하여 더 광범위한 의미에서 해석되어야 하기 때문이다.The above figures and figures presented below are experimental values having an error range of, for example, 20%, preferably 15%, and more preferably 10%. When setting culture conditions, deviations occur depending on conditions such as the equipment used for culture and the level of proficiency of the tester, and therefore the figures set in the present invention should be interpreted in a broader sense, taking into account the deviations, rather than in a limited sense.
또한, 본 명세서에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 뒤에 기재되는 숫자 값의 -15% 내지 +15% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.Additionally, in this specification, the term "about" may be presented before a specific numerical value. The term "about" as used in the present invention includes not only the exact number described after the term, but also a range that is approximately that number or close to that number. Whether the number is close to or close to the specific number mentioned can be determined by considering the context in which the number is presented. As an example, the term "about" may refer to a range of -15% to +15% of the numerical value described after the term. However, it is not limited thereto.
상기 (2) 단계에서 (3) 단계로의 배양 온도 감소는 생존세포농도 (Viable cell density)를 기준으로 약 10x106 ~ 120x106 cells/mL, 바람직하게는 약 13x106 ~ 100x106 cells/mL, 더욱 바람직하게는 약 15x106 ~ 80x106 cells/mL 일 경우에 이루어질 수 있다. 생존세포농도 (Viable cell density) 기준 약 10x106 cells/mL 미만에서 배양 온도를 감소시키는 경우 목표 단백질 생산량이 낮아지는 문제점이 있으며, 생존세포농도 (Viable cell density) 약 120x106 cells/mL를 초과한 이후 배양 온도를 감소시키면 세포 생존률이 빨리 저하되는 문제가 발생할 수 있다.The decrease in culture temperature from step (2) to step (3) can be achieved when the viable cell density is about 10x106 to 120x106 cells/mL, preferably about 13x106 to 100x106 cells/mL, and more preferably about 15x106 to 80x106 cells/mL. If the culture temperature is decreased below about 10x106 cells/mL in terms of viable cell density, there is a problem that the target protein production amount decreases, and if the culture temperature is decreased after the viable cell density exceeds about 120x106 cells/mL, the cell viability rate may rapidly decrease.
또한, 상기 (3) 단계에서의 배양 기간은 2 ~ 15일, 바람직하게는 3 ~ 14일, 더욱 바람직하게는 4 ~ 13일일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.Additionally, the culture period in the step (3) may be 2 to 15 days, preferably 3 to 14 days, and more preferably 4 to 13 days, but is not limited thereto.
예시적으로 본 발명에 따른 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산에서 유가 배양법을 사용하는 경우에 있어, 본배양 직전 종배양에서 관류 배양법 또는 유가 배양법으로 일정 세포 농도에 도달할 때까지 33℃ ~ 38℃에서 배양한 이후 본배양으로 접종하여 33℃ 미만, 바람직하게는 28℃~ 32℃로 감소시킨 후 2 ~ 15일, 바람직하게는 3 ~ 14일, 더욱 바람직하게는 4 ~ 13일 배양함으로써 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성을 현저하게 증가시킬 수 있다.For example, in the case of using a fed-batch culture method in the production of a sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof according to the present invention, the productivity of the sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof can be significantly increased by culturing at 33°C to 38°C until a certain cell concentration is reached in the seed culture using a perfusion culture method or a fed-batch culture method immediately before the main culture, then inoculating the cells into the main culture and reducing the temperature to below 33°C, preferably to 28°C to 32°C, and then culturing for 2 to 15 days, preferably 3 to 14 days, and more preferably 4 to 13 days.
상기 (2) 단계의 본배양 세포접종 농도는 약 1x105 cells/mL 이상, 바람직하게는 약 1.5x105 cells/mL 이상, 더욱 바람직하게는 약 2x106 cells/mL 이상, 약 5x106 cells/mL 이하, 가장 바람직하게는 약 2.5x106 cells/mL 이상, 약 5x106 cells/mL 이하일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본배양 세포접종 농도가 약 1.5x105 cells/mL 미만인 경우 목표 단백질 생산량이 낮아지는 문제점이 있다. 또한, 본배양 세포접종 농도가 지나치게 높을 경우, 예컨대 약 5x106 cells/mL를 초과하는 경우 세포 성장 저하 및/또는 세포 생존률 저하가 빠르게 진행될 수 있다.The main culture cell inoculation concentration in the above step (2) may be, but is not limited to, about 1x105 cells/mL or more, preferably about 1.5x105 cells/mL or more, more preferably about 2x106 cells/mL or more and about 5x106 cells/mL or less, and most preferably about 2.5x106 cells/mL or more and about 5x106 cells/mL or less. If the main culture cell inoculation concentration is less than about 1.5x105 cells/mL, there is a problem that the target protein production amount is low. In addition, if the main culture cell inoculation concentration is too high, for example, if it exceeds about 5x106 cells/mL, cell growth decline and/or cell viability decline may rapidly progress.
또한, 본 발명은 상기 지속형 성장호르몬 수용체 또는 이의 변이체의 생산이 대규모 세포 배양으로 수행하는 것을 특징으로 하는 지속형 성장호르몬 수용체 또는 이의 변이체의 생산방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for producing a sustained growth hormone receptor or a variant thereof, characterized in that the production of the sustained growth hormone receptor or a variant thereof is performed by large-scale cell culture.
또한, 본 발명에 따른 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (2) 단계 및/또는 (3) 단계에서의 숙주세포의 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법에 의해 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, in the method for producing a sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof according to the present invention, the culture of the host cells in step (2) and/or step (3) may be performed by one or more methods selected from the group consisting of batch culture, repeated batch culture, fed-batch culture, repeated fed-batch culture, continuous culture, and perfusion culture, but is not limited thereto.
회분 배양법은 배양 중에 새롭게 배지를 추가하거나 또는 배양액을 배출하거나 하지 않고, 세포를 증식시키는 배양 방법이다. 연속 배양법은 배양 중에 연속적으로 배지를 추가하고, 또한 연속적으로 배출시키는 배양 방법이다. 또, 연속 배양법에는 관류 배양 (perfusion culture)도 포함된다. 유가 배양법은 회분 배양법과 연속 배양법의 중간에 해당되므로, 반(半) 회분 배양법 (semi-batch culture) 이라고도 불리고, 배양 중에 연속적으로 또는 축차적으로 배지가 추가되는데, 연속 배양법과 같은 연속적인 배양액의 배출이 실시되나 세포의 유출이 되지 않는 배양 방법이다. 본 발명에서 어느 배양 방법을 사용해도 되는데, 바람직하게는 유가 배양법 또는 연속 배양법이 사용되고, 더욱 바람직하게는 유가 배양법이 사용된다.The batch culture method is a culture method for proliferating cells without adding new medium or discharging the culture solution during culture. The continuous culture method is a culture method for continuously adding and also continuously discharging the medium during culture. In addition, the continuous culture method also includes perfusion culture. The fed-batch culture method is between the batch culture method and the continuous culture method, so it is also called a semi-batch culture method, and it is a culture method in which medium is continuously or sequentially added during culture, but continuous culture solution is discharged like the continuous culture method, but there is no outflow of cells. Any culture method may be used in the present invention, but the fed-batch culture method or the continuous culture method is preferably used, and the fed-batch culture method is more preferably used.
본 발명에 따른 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산에서 가장 바람직하게는 유가 배양법과 관류 배양법을 혼용하여 배양함으로써 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성을 극대화시킬 수 있을 뿐 아니라 생산된 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산성도 현저하게 증가시킬 수 있다.In the production of a sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof according to the present invention, it is most preferable to culture using a fed-batch culture method and a perfusion culture method in combination, thereby maximizing the productivity of the sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof, and also significantly increasing the productivity of the produced sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof.
본 발명에 있어, 상기 배지 내의 잔류 글루코스 농도는 0.001 g/L ~ 5.0 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L로 유지하면서 배양할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the culture can be performed while maintaining the residual glucose concentration in the medium at 0.001 g/L to 5.0 g/L, preferably 0.01 to 4.0 g/L, and more preferably 0.1 to 3.5 g/L, but is not limited thereto.
본 발명에 있어, 상기 “배지 내의 잔류 글루코스 농도를 0.001 g/L ~ 5.0 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L로 유지하면서 배양”한다는 의미는 배양 기간 동안 배지 내 잔류 글루코스 농도를 매 1 ~ 36 시간, 바람직하게는 매 3 ~ 30 시간, 더욱 바람직하게는 매 6 ~ 24 시간마다, 또는 실시간으로 측정하여 배지 내의 잔류 글루코스 농도가 0.001 g/L ~ 5.0 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L로 설정된 기준 농도 미만일 경우 해당 기준 농도가 되도록 배지에 글루코스 원액 (glucose stock solution)을 첨가하여 배양하는 것을 의미한다.In the present invention, the term “cultivating while maintaining the residual glucose concentration in the medium at 0.001 g/L to 5.0 g/L, preferably 0.01 to 4.0 g/L, and more preferably 0.1 to 3.5 g/L” means that during the culturing period, the residual glucose concentration in the medium is measured every 1 to 36 hours, preferably every 3 to 30 hours, and more preferably every 6 to 24 hours, or in real time, and if the residual glucose concentration in the medium is lower than the reference concentration set at 0.001 g/L to 5.0 g/L, preferably 0.01 to 4.0 g/L, and more preferably 0.1 to 3.5 g/L, a glucose stock solution is added to the medium to perform culturing so as to achieve the reference concentration.
본 발명에 있어, 상기 배지 내의 잔류 글루코스 기준 농도는 0.001 g/L ~ 5.0 g/L, 바람직하게는 0.01 ~ 4.0 g/L, 더욱 바람직하게는 0.1 ~ 3.5 g/L 범위 내에서 설정될 수 있으며, 배양 기간 동안 적절히 그 기준 농도가 변화될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 예를 들어 초기 1~2일째에는 배지 내의 잔류 글루코스 기준 농도를 2 g/L로 하여 배양하다가, 3~5일째에는 기준 농도를 1.5 g/L로 낮추어 배양하고, 이후에는 다시 기준 농도를 2 g/L로 하여 배양할 수도 있고, 1.5 g/L 보다 낮은 농도, 즉 1.0 g/L로 기준 농도를 설정하여 배양할 수도 있다.In the present invention, the standard concentration of residual glucose in the medium can be set within the range of 0.001 g/L to 5.0 g/L, preferably 0.01 to 4.0 g/L, and more preferably 0.1 to 3.5 g/L, and it is obvious to those skilled in the art that the standard concentration can be appropriately changed during the culturing period. For example, on the first 1 to 2 days, the standard concentration of residual glucose in the medium can be cultured at 2 g/L, and on the 3rd to 5th days, the standard concentration can be lowered to 1.5 g/L and the culture can be performed. Thereafter, the standard concentration can be set again to 2 g/L, or the culture can be performed by setting the standard concentration to a lower concentration than 1.5 g/L, that is, 1.0 g/L.
또한, 본 발명은 상기 (2) 단계 및/또는 (3) 단계에서의 숙주세포의 배양이In addition, the present invention relates to a method for culturing host cells in step (2) and/or step (3).
(i) 배지 내 잔류 글루코스 농도가 기준치 이하인 경우 배지에 글루코스를 약 5 g/L 이하로 첨가하는 조건;(i) Condition of adding glucose to the medium at about 5 g/L or less when the residual glucose concentration in the medium is below the standard value;
(ii) 글루타민 및 인슐린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 배지에 첨가하는 조건; 및(ii) a condition of adding one or more substances selected from the group consisting of glutamine and insulin to the medium; and
(iii) 락테이트를 배지에 첨가하지 않는 조건;으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 지속형 성장호르몬 수용체 또는 이의 변이체의 생산방법에 관한 것이다.(iii) a method for producing a sustained-release growth hormone receptor or a variant thereof, characterized in that the method is performed under one or more conditions selected from the group consisting of: a condition in which lactate is not added to a medium;
좀 더 구체적으로는 본 발명에 따른 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산방법에 있어, 상기 (2) 단계 및/또는 (3) 단계에서의 숙주세포의 배양은 상기 배지 내에 글루코스를 약 5 g/L 또는 그 이하로 첨가하고/하거나 배지 내의 락테이트를 감소시키고/감소시키거나 배지 내에 락테이트를 첨가하지 않는 배양, 및/또는 글루타민 및/또는 인슐린을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 동물 세포는 에너지를 얻기 위해 글루코스를 사용한다. 이 과정에서 발생하는 두가지 주요 경로가 존재하는데, 호기성 경로 는 글루코스가 완전히 산화되어 에너지를 효과적으로 생성한다. 이 과정을 통해 중합체 생성, 세포 분열, DNA 복제 등 세포 활동에 필요한 에너지를 제공하게 된다. 다른 하나는 혐기성 경로로서 이 경로에서는 글루코스가 부분적으로 산화되며 이 과정에서 락테이트가 생성된다. 과도하게 생성된 락테이트는 세포 외부로 배출되어 배양액의 pH를 낮추고 세포의 생장과 분열을 저해하게 되며 최악의 경우 세포 사멸을 유발한다. 따라서, 글루코스를 너무 많이 첨가하면 세포가 에너지를 생성하는 과정에서 락테이트가 과도하게 생성되어 세포에 해롭게 작용된다. 이에, 세포 배양에서는 이러한 문제를 방지하기 위해 글루코스의 첨가량을 적절히 조절해야 한다. 글루타민 및/또는 인슐린은 각각 세포의 에너지 생산, 단백질 합성, 세포 분열 등에 필요하며, 세포 배양에서 세포의 생장과 생존을 촉진하는 데 필수적이다. 글루타민은 세포에 필수적인 아미노산이다. 이는 세포의 에너지 생산에 필수적이며, 단백질 합성, 세포 분열, 항체 생산 등에 중요한 역할을 한다. 또한, 세포가 스트레스 상태에서 회복하는 데 도움을 주며, 세포 사멸을 예방하는 역할을 한다. 인슐린은 세포의 글루코스 흡수를 촉진하고, 세포의 에너지 대사를 촉진한다. 또한, 세포의 성장 및 분열을 촉진하는데, 이는 세포 내에서 DNA 합성을 촉진하고, 세포주기의 G1/S 전환을 촉진하여 세포 분열에 도움을 준다.More specifically, in the method for producing a sustained-release growth hormone receptor antagonist or a variant thereof according to the present invention, the culturing of the host cell in step (2) and/or step (3) may be characterized by, but is not limited to, culturing by adding about 5 g/L of glucose or less to the medium and/or reducing lactate in the medium and/or not adding lactate to the medium, and/or adding glutamine and/or insulin. Animal cells use glucose to obtain energy. There are two main pathways that occur in this process. The aerobic pathway is one in which glucose is completely oxidized to effectively generate energy. This process provides energy required for cell activities such as polymer production, cell division, and DNA replication. The other is the anaerobic pathway, in which glucose is partially oxidized and lactate is generated in the process. Excessively generated lactate is discharged outside the cell, lowering the pH of the culture medium, inhibiting cell growth and division, and in the worst case, causing cell death. Therefore, if too much glucose is added, lactate is excessively produced during the process of energy production by cells, which is harmful to the cells. Therefore, the amount of glucose added should be appropriately controlled to prevent this problem in cell culture. Glutamine and/or insulin are each necessary for energy production, protein synthesis, and cell division in cells, and are essential for promoting cell growth and survival in cell culture. Glutamine is an essential amino acid for cells. It is essential for energy production in cells, and plays an important role in protein synthesis, cell division, and antibody production. It also helps cells recover from stress conditions and plays a role in preventing cell death. Insulin promotes glucose uptake by cells and promotes cell energy metabolism. It also promotes cell growth and division, which promotes DNA synthesis in cells and promotes G1/S transition of the cell cycle, thereby helping cell division.
또한, 본 발명에서 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 단백질의 발현에 사용하는 숙주 세포로는 동물 세포 (Animal cell), 효모 (Yeast), 방선균 (Actinomycetes) 및 곤충 세포 (Insect cell) 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, host cells used for expression of the sustained growth hormone receptor antagonist protein in the present invention may include, but are not limited to, animal cells, yeast, actinomycetes, and insect cells.
동물 세포는 포유 동물 세포가 바람직하다. 더욱 바람직하게는 CHO 세포, HEK 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 등 일반적으로 세포 배양에 이용되고 있는 동물 배양 세포를 사용하고, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 또한, 원하는 단백질을 제조하기 위해서는, 특히 DHFR (Dihydrofolate reductase) 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr- CHO 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220)나 CHO K-1 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) 등 원하는 유전자를 도입하는 데에 적합한 세포인 것이 바람직하다. 상기 CHO 세포로는 특히, DG44 주, DXB-11 주, K-1 주 또는 CHO-S 주가 바람직하고, 숙주 세포로의 벡터의 도입은 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 실시할 수 있다.The animal cell is preferably a mammalian cell. More preferably, animal culture cells generally used for cell culture are used, such as CHO cells, HEK cells, COS cells, 3T3 cells, myeloma cells, BHK cells, HeLa cells, and Vero cells. CHO cells are particularly preferred when the purpose is mass expression. In addition, in order to produce a desired protein, cells suitable for introducing a desired gene, such as dhfr- CHO cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220), which are CHO cells lacking the DHFR (Dihydrofolate reductase) gene, or CHO K-1 cells (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275), are preferred. Among the above CHO cells, DG44 strain, DXB-11 strain, K-1 strain or CHO-S strain are particularly preferred, and introduction of the vector into the host cell can be carried out by a method such as calcium phosphate method, DEAE dextran method, electroporation method or lipofection.
효모로는 사카로마이세스 (Sacchromyces sp.), 한세눌라 (Hansenula sp.), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 및 피키아 (Pichia sp.) 등이 예시될 수 있으며, 방선균으로는 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.Examples of yeasts include, but are not limited to, Sacchromyces sp., Hansenula sp., Kluyveromyces, and Pichia sp., and examples of actinomycetes include, but are not limited to, Streptomyces.
앞에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체는 일반적인 방법에 의해 생산된 것에 비해 발현량이 10% 이상 증가될 수 있다. 이러한 발현량의 증가는 본 발명에 따른 생산방법에 의해 생산된 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 세포 배양 조건에 따른 것이다.As described above, the long-acting growth hormone receptor antagonist or variant thereof produced by the production method according to the present invention can have an expression amount increased by 10% or more compared to that produced by a general method. This increase in the expression amount is dependent on the cell culture conditions of the long-acting growth hormone receptor antagonist or variant thereof produced by the production method according to the present invention.
본 발명에 있어서, 세포를 배양하여 단백질을 발현시키기 위해 이용한 배지는 무혈청 배지가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 더욱 바람직하게는 DMEM/F12 배지 (DMEM과 F12의 혼합 배지)를 기본 배지로서 사용할 수 있다. 또한, 상업적으로 이용 가능한 무혈청 배지, 예를 들면, HycellCHO 배지, ActiPro 배지 (Hyclone사, 미국), CD OptiCHOTM 배지, CHO-S-SFM II 배지, CD CHO 배지 또는 Efficient-ProTM 배지 (Gibco사, 미국), IS CHO-VTM 배지 (Irvine Scientific사, 미국), EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch Medium (Sigma-Aldrich사, 미국) 등을 기본 배지로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the medium used to culture cells and express proteins is preferably a serum-free medium, but is not limited thereto, and more preferably, DMEM/F12 medium (a mixed medium of DMEM and F12) can be used as the basic medium. In addition, commercially available serum-free medium, for example, HycellCHO medium, ActiPro medium (Hyclone, USA), CD OptiCHOTM medium, CHO-S-SFM II medium, CD CHO medium or Efficient-ProTM medium (Gibco, USA), IS CHO-VTM medium (Irvine Scientific, USA), EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch Medium (Sigma-Aldrich, USA), etc. can be used as the basic medium, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 세포를 배양하여 당단백질을 발현시키기 위해 이용한 피드 배지는 무혈청 배지로서, 예를 들면, Cell BoostTM 1, Cell BoostTM 2, Cell BoostTM 3, Cell BoostTM 4, Cell BoostTM 5, Cell BoostTM 6, Cell BoostTM 7a/7b (Hyclone사, 미국), CD CHO EfficientFeedTM A AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM B AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM C AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM A plus AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM, CD CHO EfficientFeedTM C plus AGTTM(Gibco사, 미국), BalanCD® CHO Feed 4 (Irvine Scientific사, 미국), EX-CELL® Advanced CHO Feed (Sigma-Aldrich사, 미국), CHO-U Feed Mix U1B7/ CHO-U Feed Mix U2B13 (Kerry사, 미국) 등을 피드 배지로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the feed medium used to culture cells and express glycoproteins is a serum-free medium, and examples thereof include Cell BoostTM 1, Cell BoostTM 2, Cell BoostTM 3, Cell BoostTM 4, Cell Boost TM5 , Cell BoostTM 6, Cell BoostTM 7a/7b (Hyclone, USA), CD CHO EfficientFeedTM A AGTTM , CD CHO EfficientFeedTM B AGTTM , CD CHO EfficientFeedTM C AGTTM , CD CHO EfficientFeedTM A plus AGTTM , CD CHO EfficientFeedTM B plus AGTTM , CD CHO EfficientFeedTM C plus AGTTM (Gibco, USA), BalanCD® CHO Feed 4 (Irvine Scientific, USA), EX-CELL® Advanced CHO Feed (Sigma-Aldrich, Feed mixes such as CHO-U Feed Mix U1B7/ CHO-U Feed Mix U2B13 (Kerry, USA) can be used, but are not limited to these.
본 발명에서 사용된 "피드 배지" 및 "농축 영양물 배지" 란 용어는 아미노산, 비타민, 염, 미량 원소, 지질 및 글루코스 등의 특정 영양소 또는 복수의 영양소로 구성된 배지로서 기본 배지의 농축 산물일 수 있으며, 배양하는 세포에 따라 피드 배지의 구성 성분과 농도를 다양하게 제작하여 사용할 수 있다. 또한, 상업적으로 이용할 수 있는 피드 배지, 예를 들면, Cell Boost Series 보충 배지 (Hyclone사, 미국), EfficientFeed 보충 배지, GlycanTune 피드 배지 (Gibco사, 미국), BalanCD CHO 피드 배지 (Irvine Scientific사, 미국), Cellvento®CHO Cell Culture 피드 배지 (Merck사, 미국), EX-CELL®Advanced CHO 피드 배지 (Sigma-Aldrich사, 미국) 등을 피드 배지로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The terms "feed medium" and "concentrated nutrient medium" used in the present invention refer to a medium composed of specific nutrients or multiple nutrients such as amino acids, vitamins, salts, trace elements, lipids, and glucose, which may be a concentrated product of a basic medium, and the components and concentrations of the feed medium can be manufactured and used in various ways depending on the cells to be cultured. In addition, commercially available feed media, for example, Cell Boost Series supplement medium (Hyclone, USA), EfficientFeed supplement medium, GlycanTune feed medium (Gibco, USA), BalanCD CHO feed medium (Irvine Scientific, USA), Cellvento® CHO Cell Culture Feed Medium (Merck, USA), EX-CELL® Advanced CHO Feed Medium (Sigma-Aldrich, USA), etc., can be used as feed media, but are not limited thereto.
본 발명에서 사용된 식물 유래 가수분해물은 동물 유래 성분은 함유하지 않으면서, 가든피, 목화씨, 또는 밀글루텐, 대두 등에서 추출된 산물을 말하며, 아미노산, 펩타이드, 비타민, 탄수화물, 뉴클레오티드, 미네랄, 기타 성분이 풍부하게 함유되어 있는 보충제로서, 이 또한 배양하는 세포에 따라 식물 유래 가수분해물의 구성 성분과 성분 농도를 다양하게 제작하여 사용 가능하다. 또한, 상업적으로 이용 가능한 식물 유래 가수분해물, 예를 들면, Hy-Pea™7404, UltraPep™ Cotten, Hy-Pep™ 7504, Hy-Pep™ 4601N (Kerry사, 미국), Cotton 100, Cotton 200, Phytone™Soy 100 (Gibco사, 미국) 등을 보충제로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The plant-derived hydrolysate used in the present invention refers to a product extracted from garden pea, cottonseed, wheat gluten, soybean, etc., and does not contain animal-derived components, and is a supplement rich in amino acids, peptides, vitamins, carbohydrates, nucleotides, minerals, and other components. This can also be produced and used by varying the composition and concentration of the plant-derived hydrolysate depending on the cells to be cultured. In addition, commercially available plant-derived hydrolysates, such as Hy-Pea™7404, UltraPep™ Cotten, Hy-Pep™ 7504, Hy-Pep™ 4601N (Kerry, USA), Cotton 100, Cotton 200, Phytone™Soy 100 (Gibco, USA), can be used as supplements, but are not limited thereto.
본 발명에서 사용된 배지 첨가물은 세포 분열 및 세포 생존을 촉진하는 역할을 하면서 세포 내 ATP 합성을 촉진시키고, 핵산 합성에 필요한 인산화된 중간체를 공급하는 목적 외 단백질 합성을 촉진하는 역할 또는 산화 스트레스를 감소시키고 세포내 대사에서 중요한 역할을 할 수 있는 보충제로서, 이 또한 배양하는 세포에 따라 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 인슐린, IGF (Insulin-like Growth Factor) (Gibco, 미국), Long-R3 IGF-1 (Repligen, 미국), 트랜스페린 (Sigma-Aldrich사, 미국), CELLiSTTM Supplement Cys1, CELLiSTTM Supplement Cys2 (Ajinomoto Genexine, 한국) 등을 보충제로 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.The medium additives used in the present invention serve to promote cell division and cell survival, while promoting intracellular ATP synthesis, and in addition to the purpose of supplying phosphorylated intermediates required for nucleic acid synthesis, serve as supplements that promote protein synthesis or reduce oxidative stress and play an important role in intracellular metabolism, and these can also be selected and used depending on the cells to be cultured. For example, insulin, IGF (Insulin-like Growth Factor) (Gibco, USA), Long-R3 IGF-1 (Repligen, USA), transferrin (Sigma-Aldrich, USA), CELLiSTTM Supplement Cys1, CELLiSTTM Supplement Cys2 (Ajinomoto Genexine, Korea), etc. can be used as supplements, but are not limited thereto.
대부분의 동물세포 배양에서는 주로 혈청이 포함된 배지를 사용하고 있지만 혈청이 포함된 배지는 화학적으로 성분이 명확하지 않은 복합 구성물이므로 단백질 생산에 적합한 배지를 설계하는데 어려움이 따른다. 혈청을 사용할 때는 비용이나 재현성 확보의 문제뿐만 아니라 분리 및 정제에도 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 무혈청 배지나 저혈청 배지를 주로 사용한다. 무혈청 배지에서는 탄소원인 글루코스 농도가 현저히 낮기 때문에 세포의 성장을 유지하고 높은 농도의 목적 단백질을 생산하기 위해서 배지에 추가로 주 탄소원인 글루코스를 첨가하여 배양하며, 추가로 글루타민을 첨가하여 배양할 수 있다. 특히, 단백질 의약품 생산에서는 단백질 의약품의 체내 반감기를 증가시키기 위한 목적으로 시알화 (Sialylation) 함량을 높이기 위하여 배지 내 글루코스 및 글루타민을 고갈시키지 않고 일정 농도 이상으로 유지하여야 한다. 배양액에서 측정된 글루코스 및 글루타민 농도는 세포가 사용하고 남아 있는 각각의 잔류 농도를 의미한다.Most animal cell cultures mainly use media containing serum, but since media containing serum are complex compositions with unclear chemical compositions, it is difficult to design media suitable for protein production. When using serum, not only are there issues with cost and reproducibility, but also with separation and purification, so serum-free media or low-serum media are mainly used. Since the concentration of glucose, a carbon source, is significantly low in serum-free media, in order to maintain cell growth and produce a high concentration of target protein, glucose, a major carbon source, is additionally added to the media and cultured, and glutamine can be additionally added. In particular, in protein pharmaceutical production, in order to increase the half-life of protein pharmaceuticals in the body, glucose and glutamine in the media should be maintained above a certain concentration without being depleted in order to increase the sialylation content. The glucose and glutamine concentrations measured in the culture medium indicate the residual concentrations used by the cells and remaining.
또한, 본 발명은 상기 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 생산하는 세포가 배양된 배양액으로부터 상기 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 회수하는 공정을 추가로 포함하는 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체의 생산방법에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a method for producing a long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof, which further comprises a process for recovering the long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof from a culture medium in which cells producing the long-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof are cultured.
또한, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체에 관한 것이다. 위 방법으로 생산된 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체는 숙주세포 단백질 함량이 낮아져 순도가 높아진 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention relates to a sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof, characterized by being produced by the above-mentioned production method. The sustained-acting growth hormone receptor antagonist or a variant thereof, produced by the above-mentioned method, is characterized by having a reduced host cell protein content and an increased purity.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 숙주세포 단백질 함량이 낮아져 순도가 높아진 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 또는 이의 변이체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a sustained-release growth hormone receptor antagonist or a variant thereof having a lower host cell protein content and higher purity, prepared by the above method.
본 발명에 따른 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 단백질 또는 이의 변이체의 생산방법에 의해 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 단백질 또는 이의 변이체를 높은 효율로 생산할 수 있어 지속형 성장호르몬 수용체 길항제 단백질 또는 이의 변이체의 대량 제조 및 공급이 가능하다.By the method for producing a sustained-acting growth hormone receptor antagonist protein or a variant thereof according to the present invention, a sustained-acting growth hormone receptor antagonist protein or a variant thereof can be produced with high efficiency, thereby enabling mass production and supply of a sustained-acting growth hormone receptor antagonist protein or a variant thereof.
도 1은 세포 배양 온도에 따른 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 생산하는 세포 성장 및 세포 생존율, 삼투압 농도 및 글루코스 농도 변화를 분석한 결과로서, 도 1의 A는 세포 성장, 도 1의 B는 세포 생존율, 도 1의 C는 배양액 삼투압 농도, 도 1의 D는 배양액 글루코스 농도의 변화를 나타낸다.
도 2는 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 생산하는 세포의 배양 온도에 대한 최종 발현량을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 3은 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 생산하는 초기 세포농도에 따른 세포 성장 및 세포 생존율, 누적 세포 농도 변화를 분석한 결과로서, 도 3의 A는 세포 성장, 도 3의 B는 세포 생존율, 도 3의 C는 누적 세포 농도의 변화를 나타낸다.
도 4는 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 생산하는 세포의 초기 세포농도에 대한 최종 발현량을 HPLC로 분석한 결과이다.
도 5a 내지 도 5f는 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 생산하는 세포에 대한 글루코스 농도 조건에 따른 세포 성장, 세포 생존율, pH, 삼투압, 글루코스 농도, 락테이트 농도 변화를 분석한 결과로, 도 5a는 세포 성장, 도 5b는 세포 생존율, 도 5c는 pH 변화, 도 5d는 삼투압 변화, 도 5e는 글루코스 농도의 변화, 도 5f는 락테이트 농도 변화를 나타낸다.
도 6은 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 생산하는 세포에 대한 글루코스 농도 조건에 따른 단백질 발현량 및 숙주세포 단백질 농도를 분석한 결과이다.Figure 1 shows the results of analyzing the cell growth and cell viability, osmotic pressure and glucose concentration changes that produce a sustained growth hormone receptor antagonist according to cell culture temperature. Figure 1A shows cell growth, Figure 1B shows cell viability, Figure 1C shows culture medium osmotic pressure, and Figure 1D shows culture medium glucose concentration changes.
Figure 2 shows the results of HPLC analysis of the final expression level with respect to the culture temperature of cells producing a sustained-release growth hormone receptor antagonist.
Figure 3 shows the results of analyzing cell growth, cell viability, and changes in cumulative cell concentration according to the initial cell concentration producing a sustained growth hormone receptor antagonist. Figure 3A shows cell growth, Figure 3B shows cell viability, and Figure 3C shows changes in cumulative cell concentration.
Figure 4 shows the results of HPLC analysis of the final expression level versus the initial cell concentration of cells producing a sustained-release growth hormone receptor antagonist.
FIGS. 5A to 5F show the results of analyzing cell growth, cell viability, pH, osmotic pressure, glucose concentration, and lactate concentration changes according to glucose concentration conditions for cells producing a sustained-acting growth hormone receptor antagonist. FIG. 5A shows cell growth, FIG. 5B shows cell viability, FIG. 5C shows pH changes, FIG. 5D shows osmotic pressure changes, FIG. 5E shows glucose concentration changes, and FIG. 5F shows lactate concentration changes.
Figure 6 shows the results of analyzing the protein expression level and host cell protein concentration according to glucose concentration conditions for cells producing a sustained growth hormone receptor antagonist.
본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 특별한 언급이 없는 경우 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.All technical and scientific terms used in this specification, unless otherwise specified, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the composition of the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.
실시예 1. 배양온도 조건Example 1. Culture temperature conditions
125 mL Flask 내에서 Efficient-Pro™AGT™ 배지 (Gibco사, 미국)에 8mM L-glutamine (Sigma-Aldrich사, 미국)와 2g/L Phytone (Gibco사, 미국)을 첨가한 배지에 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 과발현하는 세포를 2x106cells/mL로 접종하고, 35℃ CO2 인큐베이터에서 진탕 배양하였다. 배양 2일차에 농축 영양물 배지인 EX-CELL®Advanced™ CHO 피드배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)를 공급물 배지로 사용하고 유가 배양법 (fed-batch culture)을 진행하였다. 35℃ 초기 배양 온도와 35℃ 조건으로 초기 배양을 진행한 후 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 30℃로 배양 온도를 변화시키고 각각 유가 배양하였다. EX-CELL®Advanced™ CHO 피드배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)는 125 mL Flask내의 배양 시작 부피의 0.8%로 매일 공급하였다. 세포 생존율이 40% 이하가 되는 조건까지 배양을 진행하여 배양 13일 또는 14일에 종료하였고, 세포의 다양한 상태는 배양액으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, 배양액 삼투압, 글루코스 농도 수준을 매일 측정하였으며 배양 종료 후 4℃10,000 rpm으로 60분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 RP-HPLC 분석으로 발현량을 확인하였다. 감소된 배양 온도에서 성장하는 세포는 누적세포농도 (Integral viable cell density)는 낮지만, 발현량이 약 10% 증가하는 것으로 확인되었다 (도 1, 도 2).Cells overexpressing sustained-acting growth hormone receptor antagonists were inoculated at a density of 2x106 cells/mL in Efficient-Pro™AGT™ medium (Gibco, USA) supplemented with 8 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, USA) and 2 g/L Phytone (Gibco, USA) in a125 mL flask, and cultured in aCO2 incubator at 35°C with shaking. On the second day of culture, EX-CELL®Advanced™ CHO feed medium (Sigma-Aldrich, USA), a concentrated nutrient medium, was used as a feed medium and fed-batch culture was performed. After initial culture at 35°C and 35°C conditions, when the viable cell concentration reached the change range, the culture temperature was changed to 30°C and fed-batch culture was performed respectively. EX-CELL®Advanced™ CHO feed medium (Sigma-Aldrich, USA) was supplied daily at 0.8% of the starting culture volume in a 125 mL flask. Culture was performed until the cell viability became 40% or less and terminated on day 13 or 14. Various cell states were measured daily from the culture medium, and the number of viable cells, cell viability, culture medium osmotic pressure, and glucose concentration levels were measured daily. After the culture was terminated, the culture supernatant was secured by centrifugation at 4℃ and 10,000 rpm for 60 minutes. The expression level of the sample cultured under the above conditions was confirmed by RP-HPLC analysis. It was confirmed that the cells grown at the reduced culture temperature had a low integral viable cell density, but the expression level increased by about 10% (Fig. 1, Fig. 2).
실시예 2. 초기 세포 농도 조건Example 2. Initial cell concentration conditions
125 mL 플라스크 내에서 Efficient-Pro™AGT™ 배지 (Gibco사, 미국)에 8mM L-글루타민 (Sigma-Aldrich사, 미국)과 2g/L Phytone (Gibco사, 미국)을 첨가한 배지에 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 과발현하는 세포를 1.6x106cells/mL, 3.0x106cells/mL, 4.4x106cells/mL가 되도록 각각 접종하고, 35℃ CO2 인큐베이터 (incubator)에서 진탕 배양하였다. 배양 2일차에 농축 영양물 배지인 EX-CELL®Advanced™ CHO 피드배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)를 공급물 배지로 사용하고 유가 배양법 (fed-batch culture)으로 배양을 진행하였다. 35℃ 조건으로 초기 배양을 진행한 후 생존세포 농도가 변경 범위에 도달하면 30℃로 온도를 낮추어 유가 배양하였다. 피드 배지인 EX-CELL®Advanced™ CHO 피드배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)는 125 mL 플라스크 내의 배양 시작 부피의 1.25%로 매일 공급하였다. 배양 14일째에 배양을 종료하였고, 배양액을 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, 누적세포농도 (Integral viable cell density)를 측정하였으며 배양 종료 후 4℃, 10,000 rpm으로 60분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 RP-HPLC 분석으로 발현량을 확인하였다. 초기 세포농도가 증가한 조건에서 발현량이 45% 증가하는 것이 확인되었다 (도 3, 도 4).Cells overexpressing sustained-acting growth hormone receptor antagonists were inoculated at concentrations of 1.6 x 10 6 cells/mL, 3.0 x 106 cells/mL, and 4.4 x 106 cells/mL in Efficient-Pro™AGT™ medium (Gibco, USA) supplemented with 8 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich,USA ) and 2 g/L Phytone (Gibco, USA) in a 125 mL flask, and cultured in a CO2 incubator at 35°C with shaking. On the second day of culture, EX-CELL®Advanced™ CHO feed medium (Sigma-Aldrich, USA), a concentrated nutrient medium, was used as a feed medium and cultured using the fed-batch method. After initial culture under 35℃ conditions, when the viable cell concentration reached the change range, the temperature was lowered to 30℃ and fed-batch culture was performed. The feed medium, EX-CELL®Advanced™ CHO feed medium (Sigma-Aldrich, USA), was supplied daily at 1.25% of the starting culture volume in a 125 mL flask. The culture was terminated on the 14th day of culture, and the culture solution was collected daily to measure the number of viable cells, cell viability, and integral viable cell density. After the termination of culture, the culture supernatant was secured by centrifugation at 4℃ and 10,000 rpm for 60 minutes. The expression amount of the sample cultured under the above conditions was confirmed by RP-HPLC analysis. It was confirmed that the expression amount increased by 45% under the condition where the initial cell concentration increased (Fig. 3, Fig. 4).
실시예 3. 배양액 글루코스 농도 조절Example 3. Control of glucose concentration in culture medium
125 mL 플라스크 내에 Efficient-Pro™AGT™ 배지 (Gibco사, 미국)에 8mM L-글루타민 (Sigma-Aldrich사, 미국), 2g/L Phytone (Gibco사, 미국), 10 g/L 글루코스 (Sigma-Aldrich사, 미국), 10 mg/L 인슐린 (Gibco사, 미국)을 첨가한 배지에 지속형 성장호르몬 수용체 길항제를 과발현하는 세포를 3.0x106cells/mL가 되도록 각각 접종하고, 35℃ CO2 인큐베이터에서 진탕 배양하였다. 배양 2일차에 농축 영양물 배지인 EX-CELL®Advanced™ CHO 피드배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)에 cys1 supplement (Ajinomoto Genexine, 한국)를 공급물 배지로 사용하여 유가 배양하였다. 35℃ 조건으로 초기 배양을 진행한 후 생존세포농도가 변경 범위에 도달하면 30℃로 온도를 낮추어 유가 배양하였다. 피드 배지인 EX-CELL®Advanced™ CHO 피드배지 (Sigma-Aldrich사, 미국)는 125 mL 플라스크 내의 배양 시작 부피의 2.0% (v/v)를 매일 공급하였다.Cells overexpressing a sustained-acting growth hormone receptor antagonist were inoculated at a density of 3.0 x 10 6 cells/mL in Efficient-Pro™AGT™ medium (Gibco, USA) supplemented with 8 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, USA), 2 g/L Phytone (Gibco, USA), 10 g/L glucose (Sigma-Aldrich, USA), and 10 mg/L insulin (Gibco, USA) in a125 mL flask, and cultured in a CO2 incubator at 35°C with shaking. On the second day of culture, fed-batch culture was performed using EX-CELL®Advanced™ CHO feed medium (Sigma-Aldrich, USA), a concentrated nutrient medium, with cys1 supplement (Ajinomoto Genexine, Korea) as a feed medium. After initial culture under 35℃ conditions, when the viable cell concentration reached the change range, the temperature was lowered to 30℃ and fed-batch culture was performed. The feed medium, EX-CELL®Advanced™ CHO feed medium (Sigma-Aldrich, USA), was supplied daily at 2.0% (v/v) of the starting culture volume in a 125 mL flask.
배양액 내 글루코스 농도를 매일 측정하여 배지에 포함된 글루코스 농도가 세포 성장에 따라 소모되어 기준 농도 이하로 측정된 시점부터 글루코스 농도를 조절하였다. 측정된 글루코스 농도가 각각 기준 농도 이하일 때 200 g/L 글루코스 원액을 기준 농도에 달하는 양으로 3시간 이내에 첨가하고, 기준 농도 이상으로 측정이 되면 첨가하지 않는 방식으로 각각의 글루코스 농도 조건을 유지하였다. 일반적으로 동물 세포 배양에서 3시간 이내에는 글루코스의 함량의 변화가 세포 성장에 미치는 영향이 미미하다.The glucose concentration in the culture medium was measured daily, and the glucose concentration in the medium was measured to be below the reference concentration due to consumption of the glucose concentration by cell growth, and the glucose concentration was adjusted from the point at which it was measured. When the measured glucose concentration was below the reference concentration, 200 g/L glucose stock solution was added within 3 hours in an amount reaching the reference concentration, and when it was measured to be above the reference concentration, no addition was made, thereby maintaining each glucose concentration condition. In general, in animal cell culture, the effect of changes in glucose content on cell growth is minimal within 3 hours.
이 경우, 2 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 1 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하고, 4 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 3 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하고, 6 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 5 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하고, 8 g/L을 기준 농도로 유지하는 조건을 7 g/L (±1 g/L) 농도 조건이라 하였다. 예를 들면, 글루코스 농도 유지 조건 1 g/L (±1 g/L)농도 이란 의미는 글루코스 농도의 조절 범위의 하한선을 0 g/L로 설정하고, 글루코스의 농도 조절 범위의 상한선을 2 g/L로 설정한다는 의미이며 실제 배양에서는 배양액에서 측정된 글루코스 농도가 하한선인 0 g/L에 도달할 때, 최대 2 g/L의 글루코스 농도가 되도록 추가로 200 g/L의 글루코스 원액을 첨가하며, 배양액 내의 글루코스 농도가 상한선인 2 g/L에 도달할 때, 200 g/L의 글루코스 원액을 첨가하지 않는 것을 의미한다. 따라서, 1 g/L (±1 g/L) 농도, 3 g/L (±1 g/L) 농도의 2가지 농도조건에서 2 g/L의 농도 조건은 1 g/L (±1 g/L) 농도에서는 상한선 조건을 말하며, 3 g/L (±1 g/L) 농도에서는 하한선인 조건을 말하며 전혀 다른 작용이 진행되는 조건이므로 중복된 조건이라고 할 수 없다.In this case, the condition of maintaining 2 g/L as the reference concentration is referred to as the 1 g/L (±1 g/L) concentration condition, the condition of maintaining 4 g/L as the reference concentration is referred to as the 3 g/L (±1 g/L) concentration condition, the condition of maintaining 6 g/L as the reference concentration is referred to as the 5 g/L (±1 g/L) concentration condition, and the condition of maintaining 8 g/L as the reference concentration is referred to as the 7 g/L (±1 g/L) concentration condition. For example, the glucose concentration maintenance condition of 1 g/L (±1 g/L) means that the lower limit of the glucose concentration control range is set to 0 g/L, and the upper limit of the glucose concentration control range is set to 2 g/L. In actual culture, when the glucose concentration measured in the culture medium reaches the lower limit of 0 g/L, an additional 200 g/L of the glucose stock solution is added so that the glucose concentration becomes a maximum of 2 g/L, and when the glucose concentration in the culture medium reaches the upper limit of 2 g/L, the 200 g/L glucose stock solution is not added. Therefore, among the two concentration conditions of 1 g/L (±1 g/L) concentration and 3 g/L (±1 g/L) concentration, the concentration condition of 2 g/L refers to the upper limit condition at 1 g/L (±1 g/L) concentration and refers to the lower limit condition at 3 g/L (±1 g/L) concentration. Since these are conditions in which completely different actions occur, they cannot be considered overlapping conditions.
배양 14일째에 배양을 종료하였고, 매일 배양액을 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, 배양액 pH, 배양액 삼투압, 배양액 글루코스 농도 및 락테이트 농도를 매일 측정하였으며, 배양 종료 후 4℃, 10,000 rpm으로 60분간 원심분리하여 배양액 상등액을 확보하였다. 상기 조건으로 배양된 시료는 RP-HPLC 분석으로 발현량을 확인하였다. 배양액 내 글루코스 농도가 증가할수록 발현량이 감소하는 반면, 숙주세포 단백질 함량은 증가하는 결과를 확인하였다 (도 5a 내지 도 5f, 도 6).On the 14th day of culture, the culture was terminated, and the culture medium was collected every day to measure the number of viable cells, cell viability, culture medium pH, culture medium osmotic pressure, culture medium glucose concentration, and culture medium lactate concentration. After the termination of culture, the culture supernatant was secured by centrifugation at 4℃ and 10,000 rpm for 60 minutes. The expression amount of the sample cultured under the above conditions was confirmed by RP-HPLC analysis. It was confirmed that the expression amount decreased as the glucose concentration in the culture medium increased, whereas the host cell protein content increased (Figs. 5a to 5f, Fig. 6).
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230070948AKR20240172522A (en) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | Methods for producing long-acting hormone receptor antagonists |
| PCT/KR2023/012247WO2024248231A1 (en) | 2023-06-01 | 2023-08-18 | Method for producing long-acting hormone receptor antagonists |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020230070948AKR20240172522A (en) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | Methods for producing long-acting hormone receptor antagonists |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240172522Atrue KR20240172522A (en) | 2024-12-10 |
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230070948APendingKR20240172522A (en) | 2023-06-01 | 2023-06-01 | Methods for producing long-acting hormone receptor antagonists |
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240172522A (en) |
| WO (1) | WO2024248231A1 (en) |
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE851925T1 (en)* | 1995-09-21 | 2003-08-14 | Genentech Inc., San Francisco | VARIANTS OF HUMAN GROWTH HORMONE |
| CA2863499C (en)* | 2012-02-03 | 2022-06-21 | George Tachas | Combination therapy comprising a growth hormone variant and an oligonucleotide targeted to the growth hormone receptor |
| KR102167827B1 (en)* | 2017-12-20 | 2020-10-20 | 주식회사 알테오젠 | Novel Growth Hormone Receptor Antagonists and Fusion Proteins Thereof |
| KR20210005689A (en)* | 2018-05-01 | 2021-01-14 | 암젠 인크 | Antibodies with a regulated glycan profile |
| HUE066560T2 (en)* | 2018-07-03 | 2024-08-28 | Bristol Myers Squibb Co | Recombinant protein production procedures |
| BR112022019726A2 (en)* | 2020-08-07 | 2023-03-07 | Alteogen Inc | METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT HYALURONIDASE |
| Title |
|---|
| Arshad A., et al. "The effect of hypothermia on the viability of cells in vitro." J Surg Res. 2001 May 1; 97(1): 34-39. |
| Belzer FO., et al. "Organ preservation: II. Cold storage and perfusion of kidneys." Br J Surg. 1970 Jul; 57(7): 520-524. |
| Clark KJ, Chaplin FW, Harcum SW. Temperature effects on productquality-related enzymes in batch CHO cell cultures producing recombinant tPA. Biotechnol Prog. 2004 20:1888-1892. |
| Elbashir SM., et al. "Host cell protein testing using mass spectrometry." Trends Biotechnol. 2018 Apr; 36(4): 352-360. |
| H Tachibana 1, K Taniguchi, Y Ushio, K Teruya, K Osada, H Murakami. Changes of monosaccharide availability of human hybridoma lead to alteration of biological properties of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 1994 16(3):151-7. |
| Harris RJ, Shire SJ, Winter C. Commercial manufacturing scale formulation and analytical characterization of therapeutic recombinant antibodies. Drug Dev Res. 2004 61:137-154. |
| Huang L., et al. "The impact of host cell proteins on biologics characterization." Trends Biotechnol. 2018 Jun; 36(6): 629-643. |
| Kelley B. "Industrialization of mAb production technology: the bioprocessing industry at a crossroads." MAbs. 2009 Jul-Aug; 1(4): 443-452. |
| Kiyono T., et al. "Low-temperature preservation of animal cells and microorganisms." Cell Preserv Technol. 2004; 2(1): 9-23. |
| Li M., et al. "Host cell protein dynamics in the supernatant of a mAb producing CHO cell line." Biotechnol Prog. 2018 Mar; 34(2): 393-402. |
| Lindstrom J., et al. "Effects of hypothermia on mammalian cells in vitro: a review." In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1993 Aug; 29A(8): 543-550. |
| Liu H., et al. "Host-cell proteins in biologics development: Identification, quantification, and risk assessment." Biotechnol Bioeng. 2018 Sep; 115(9): 2175-2192. |
| Martins-Gomes C., et al. "The impact of hypothermia on cultured mammalian cells: a review." Cryobiology. 2014 Oct; 69(2): 241-251. |
| Ramanathan A., et al. "Hypothermia: is it still a therapeutic strategy for severe traumatic brain injury?" Front Neurol. 2013 Oct 25; 4: 167. |
| Smith BJ., et al. "Cellular responses to hypothermia (20°C) in CHO-K1 cells." J Biotechnol. 2004 Oct 14; 112(1-2): 105-115. |
| Veronica Restelli, Ming-Dong Wang, Norman Huzel, Martin Ethier, Helene Perreault, Michael Butler. The effect of dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from CHO cells. Biotechnol Bioeng. 2006 94:481-494. |
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024248231A1 (en) | 2024-12-05 |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101362805B1 (en) | Improved cell culture medium | |
| JP7034991B2 (en) | Improved cell culture medium | |
| Ljunggren et al. | Catabolic control of hybridoma cells by glucose and glutamine limited fed batch cultures | |
| CN107254499B (en) | Improved cell culture process | |
| US7390660B2 (en) | Methods for growing mammalian cells in vitro | |
| US20110189732A1 (en) | Process for the Fermentative Production of Erythropoietin | |
| JP6393267B2 (en) | Methods and systems for optimizing perfused cell culture systems | |
| WO2000003000A2 (en) | Serum-free medium for culturing animal cells | |
| JP2019514383A (en) | Cell culture medium | |
| CN102317440A (en) | Improved culture medium additive and application method thereof | |
| MX2010011356A (en) | Methods for enhanced production of bone morphogenetic proteins. | |
| KR20240172522A (en) | Methods for producing long-acting hormone receptor antagonists | |
| CN113862217B (en) | Methods for culturing mammalian cells | |
| CN112391431B (en) | Fermentation medium and fermentation method for recombinant leukocyte inhibitory factor and hirudin chimeric protein | |
| KR100255269B1 (en) | Do-stat fed batch culture for mass production of human growth hormone | |
| CN118956767A (en) | A culture method for improving the growth and metabolic expression of CHO cells | |
| Chevalot et al. | Interest of fed-batch culture for the production of a membrane-bound protein by an adherent animal cell | |
| Altamirano et al. | Bi-Phasic Culture Strategies Based on Medium Formulation: Substitution of Glucose by Galactose in CHO Culture |
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application | Patent event code:PA01091R01D Comment text:Patent Application Patent event date:20230601 | |
| PG1501 | Laying open of application |