본 발명의 조성물은 제제의 재구성 시간을 2분 이내로 단축시키고, 거품 발생을 감소시키며, 불완전 용해와 같은 문제를 피할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 나노입자의 기능적 구조 및 안정성을 그대로 유지할 수 있으며, 안전성 및 치료 효과도 동일하게 유지한다. 또한, 본 발명의 급속 현탁용 나노입자 조성물에서는 HSA의 양이 감소되기 때문에, HSA에 의해 유발되는 알레르기 반응을 감소시킬 수 있다.
2011년의 Ismael B들의 연구와 비교하면, 본 발명의 제조 방법은 나노입자의 형성을 수반하며, 시스템의 pH를 조정할 필요가 없다. 놀랍게도, 본 발명자들은 급속 현탁용 나노입자 조성물의 제조 중에 적절한 NaCl 농도를 채택할 뿐만 아니라, 최종적으로 얻어지는 급속 현탁용 나노입자 조성물 중의 NaCl 함량을 제어할 필요가 있음을 발견했다.
용어:
본 명세서에서 사용되는 용어 "나노입자"는 적어도 한 차원, 예를 들어, 1차원, 2차원 또는 3차원에서, 예를 들어, 약 1nm, 약 10nm 또는 약 100nm의 크기와 같은 나노스케일 크기를 갖는 입자를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정제된 나노입자"는 인간 혈청 알부민과 활성 성분으로 형성된 나노입자를 의미하며, 유리 인간 혈청 알부민이 원래 양의 5% 내지 50%까지 제거되었다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "급속 현탁용 나노입자 조성물"은 상기 언급된 정제된 나노입자를 동결건조하여 얻어지는, 용매 첨가 시에 신속하게 분산될 수 있는 나노입자 조성물을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약"은 특정 값의 10% 초과 또는 미만을 의미한다. 예를 들면, "약 50nm"는 45nm 내지 55nm를 의미한다.
"인간 혈청 알부민 단량체" 또는 "HSA 단량체"는 585개의 아미노산으로 구성되며, 분자량이 약 66,000달톤인 가용성 글로불린을 말한다. 그것은 인간 혈장 중에 가장 풍부한 단백질이며, 크기 배제 크로마토그래피에서 마지막 피크를 가지며, 정상적인 인간 혈청 알부민 제품의 대부분을 차지한다. HSA에는 여러 개의 소수성 결합 부위가 있으며, 다양한 약물, 특히 중성 또는 음전하를 띤 소수성 화합물과 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "활성 성분"은 약학적으로 활성인 성분을 의미한다. 특히, 활성 성분은 예를 들어 질병 및/또는 상태를 치료, 예방, 완화 또는 억제할 수 있는 등의 치료 효과를 발휘할 수 있는 물질 또는 실체를 의미한다.
"투석 배수"라는 용어는 동일한 부피를 사용하여 투석하는 동안에 변하지 않는 공급액의 부피, 소위 공급량에 대한 투석액 소비량의 비율을 말한다.
"동결건조 보호제"라는 용어는 동결건조 중에 나노입자를 보호하기 위해, 정제된 나노입자를 포함하는 약학 조성물에 첨가되는 물질을 지칭한다.
"치료" 또는 "요법"이라는 용어는 환자의 질병, 장애 또는 건강 상태에 대한 임상요법을 말한다(예를 들면, Stedman's Medical Dictionary 참조). 또한, "종양 치료"는 종양 증상의 수를 줄이거나, 종양 증상 중 하나 이상의 중증도를 줄이거나, 종양 진행을 늦추는 것을 의미한다.
특정 치료제의 "치료 유효량"이란 종양 증상의 수를 줄이거나, 하나 이상의 종양 증상의 중증도를 경감시키거나, 종양 진행을 늦추기에 충분한 치료제의 양을 말한다.
제1 측면에서, 본 발명은 활성 성분, 알부민, 입자 안정화제 및 임의로 동결건조 보호제를 포함하는, 급속 현탁용 나노입자 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 활성 성분, 알부민, 동결건조 보호제 및 입자 안정화제를 포함하는, 급속 현탁용 나노입자 조성물을 제공한다.
활성 성분은 인간 혈청 알부민에 포장되기에 적합한 활성 성분 중에서 선택되며, 물에 불용성이거나 약간 용해되고, 특정 유기 용매에 가용성이거나 쉽게 용해된다고 하는 특성을 가져야 한다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel) 및 도세탁셀의 친유성 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 탁산(taxanes); 라파마이신(rapamycin) 및 이의 유도체, 에포틸론(epothilone) B 및 이의 유도체, 타네스피마이신(tanespimycin) 및 이의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 마크롤라이드(macrolides); 10-히드록시캄프토테신(10-hydroxycamptothecin), SN38 및 이의 유도체 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 캄프토테신(camptothecins); 아클라루비신(aclarubicin), 피라루비신(pirarubicin) 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 안트라사이클린(anthracyclines); 및 콜히친(colchicine) 및 이의 유도체, 티오콜히친 다이머(thiocolchicine dimer), 아미오다론(amiodarone), 리오티로닌(liothyronine), 사이클로스포린(cyclosporine), 엑세메스탄(exemestane), 플루타미드(flutamide), 풀베스트란트(fulvestrant), 로미뎁신(romidepsin), 세무스틴(semustine), 이부프로펜(ibuprofen) 등을 포함한 기타 활성 성분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 탁산으로부터 선택되고, 바람직하게는 탁산은 파클리탁셀 또는 도세탁셀로 이루어진 그룹에서 선택된다.
알부민은 인간 혈청 알부민 및 소 혈청 알부민과 같이 담체 기능을 갖는 혈청 알부민 중에서 선택되며, 바람직하게는 인간 혈청 알부민이다.
동결건조 보호제는 만니톨, 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 덱스트란 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되며, 바람직하게는 만니톨과 수크로스의 조합이며, 이들의 비율은 바람직하게는 10:1 내지 1:1, 바람직하게는 8:1 내지 2:1, 바람직하게는 8:1 내지 3:1, 더욱 바람직하게는 5:1 내지 2:1, 더욱 바람직하게는 5:1 내지 3:1, 가장 바람직하게는 5:1이다.
입자 안정화제는 염화나트륨, 인산 수소 이나트륨, 인산 이수소 나트륨 및 염화칼륨으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 염화나트륨이다.
일부 실시형태에서, 급속 현탁용 나노입자 조성물은 중량 퍼센트로 1 내지 30%의 활성 성분, 0.1 내지 30%의 단백질, 0.00001 내지 3%의 입자 안정화제 및 나머지 동결건조 보호제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 급속 현탁용 나노입자 조성물은 중량 퍼센트로 0.00001 내지 3%, 바람직하게는 0.0001 내지 1%, 또는 이 범위 내의 임의의 하위 범위, 예를 들어, 0.0001 내지 1%, 0.0001 내지 0.1%, 0.0005 내지 0.5%, 0.001 내지 0.1%, 0.005 내지 0.05%, 0.008 내지 0.022%의 입자 안정화제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 급속 현탁용 나노입자 조성물은 중량 퍼센트로 1 내지 30%, 바람직하게는 2 내지 20% 또는 3 내지 15% 또는 5 내지 10%의 활성 성분을 포함한다.
일부 실시형태에서, 급속 현탁용 나노입자 조성물은 중량 퍼센트로 0.1 내지 30% 또는 1 내지 25% 또는 5 내지 20%의 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성 성분과 단백질의 결합율은 >90%이다.
상기 조성물에서, 단백질 대 활성 성분의 중량비는 0.1:1 내지 5:1, 바람직하게는 0.3:1 내지 3:1 또는 0.5:1 내지 3:1 또는 1:1 내지 3:1 또는 0.5:1 내지 2.5:1이고, 예를 들어 0.1:1, 0.2:1, 0.3:1, 0.4:1, 0.5:1, 0.6:1, 0.70:1, 0.8:1, 0.9:1, 0.95:1, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 2:1, 2.1:1, 2.2:1, 2.3:1, 2.4:1, 2.5:1, 2.6:1, 2.7:1, 2.8:1, 2.9:1, 3:1, 3.5:1, 4:1, 4.5:1, 5:1 또는 상기한 두 비율 사이의 범위로 이루어진 그룹에서 선택된다. 일부 특정 실시형태에서, 단백질은 인간 혈청 알부민이다.
일부 실시형태에서, 조성물 중의 급속 현탁을 위한 나노입자는 30 내지 200 nm, 바람직하게는 100 내지 180 nm, 바람직하게는 110 내지 170 nm, 더 바람직하게는 110 내지 160 nm, 더 바람직하게는 110 내지 140 nm, 더욱 바람직하게는 115 내지 130 nm, 더 바람직하게는 118 내지 125 nm, 가장 바람직하게는 118 내지 122 nm의 평균 입자 크기를 가지며, 예를 들어, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 nm 또는 상기 값 중 두 값 사이의 범위로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 활성 성분을 용해하기 위해 유기 용매가 사용된다. 당 업자는 활성 성분의 성질에 따라 적절한 유기 용매를 선택할 수 있다. 유기 용매는 낮은 수용해도 및 낮은 비등점을 갖는 순수 용매, 또는 이들과 저분자 알코올과의 혼합 용매로 이루어진 그룹에서 선택된다. 바람직하게는, 유기 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 에탄올 또는 tert-부틸 알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 클로로포름 또는 클로로포름과 에탄올의 조합이다. 본 발명에서는, 감압 증발, 투석 등과 같은 적절한 방법에 의해 에멀젼에서 유기 용매를 제거하여, 생성물 중의 잔류 유기 용매를 최소화할 수 있다. 급속 현탁용 나노입자 조성물에서, 유기 용매의 잔류량은 0.1 mg/ml 미만, 바람직하게는 0.08 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.02 mg/ml 또는 0.01 mg/ml 미만, 더욱 바람직하게는 5 mg/ml, 1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.05 mg/ml 또는 0.01 μg/ml 미만이다.
일부 실시형태에서, 급속 현탁용 나노입자 조성물은 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴록사머, 레시틴, 콜레이트 등과 같은 어떠한 계면활성제도 포함하지 않는다.
제2 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 급속 현탁용 나노입자 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물은 고체 또는 액체 형태이다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물은 대상에게 주사하기에 적합한 형태를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 액체 형태로 제공된다. 특정 실시형태에서, 약학 조성물은 주사액이다.
일부 특정 실시형태에서, 약학 조성물은 급속 현탁을 위한 나노입자가 약제학적으로 허용되는 담체에 현탁된 액체 형태로 제공된다. 약제학적으로 허용되는 담체에는 완충액, 방부제, 주사용수, 생리식염수 및 등장액이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 특정 실시형태에서, 본 발명의 액체 형태의 약학 조성물은 활성 성분(파클리탁셀 등)을 0.1 내지 100mg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 50mg/ml, 더 바람직하게는 1 내지 20mg/ml, 예를 들어 5mg/ml의 함량으로 포함한다.
다른 실시형태에서, 약학 조성물은 건조 분말 또는 동결건조 분말을 포함하나, 이에 한정되지 않는 고체 형태이다.
일부 특정 실시형태에서, 본 발명은 고체 형태의 약학 조성물을 제공한다. 급속 현탁용 나노입자 조성물은 활성 성분(예를 들면, 파클리탁셀)을 중량 기준으로 1 내지 30%, 바람직하게는 2 내지 20% 또는 3 내지 15% 또는 5 내지 10%의 함량으로 포함한다. 이러한 고체 형태의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 재현탁될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체에는 완충액, 방부제, 주사용수, 생리식염수 및 등장액이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 특정 실시형태에서, 이 고체는 주사용수에 재현탁되고, 바람직하게는 생성된 재현탁액에는 약 5mg/ml의 함량으로 활성 성분(예를 들면, 파클리탁셀)이 포함된다.
제3 측면에서, 본 발명은 또한 (1) 활성 성분을 유기 용매에 용해시켜 오일상을 형성하고, 단백질을 물에 용해시켜 수상을 형성하는 단계, (2) 오일상과 수상을 혼합하고 균질화하여 나노에멀젼을 형성하는 단계, (3) 나노에멀젼 중의 유기 용매를 제거하여 현탁액을 얻는 단계, (4) 투석하는 단계, 임의로 (5) 동결건조하는 단계를 포함하는, 상기 급속 현탁용 나노입자 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 단계(1)에서, 유기 용매는 낮은 수용해도 및 낮은 비등점을 갖는 순수 용매, 또는 이들과 저분자 알코올과의 혼합 용매로 이루어진 그룹에서 선택된다. 바람직하게는, 유기 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 에탄올 또는 tert-부틸 알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 클로로포름 또는 클로로포름과 에탄올의 조합이다. 당 업자는 활성 성분의 성질에 따라 적절한 유기 용매를 선택할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 활성 성분이 탁산인 경우, 사용될 수 있는 유기 용매는 클로로포름 및 에탄올로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상이다. 보다 구체적으로, 활성 성분이 파클리탁셀 또는 도세탁셀인 경우, 사용될 수 있는 유기 용매는 클로로포름 및 에탄올의 혼합계이다. 일부 특정 실시형태에서, 클로로포름 대 에탄올의 부피비는 1:1 내지 20:1, 바람직하게는 1:1 내지 15:1, 바람직하게는 1:1 내지 11:1이며, 예를 들어, 1:1, 4:1, 9:1 및 11:1로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 특정 실시형태에서, 오일상 중의 활성 성분의 농도는 20 내지 500mg/ml, 바람직하게는 50 내지 350mg/ml, 바람직하게는 60 내지 250mg/ml, 바람직하게는 80 내지 200mg/ml의 범위이다. 일부 특정 실시형태에서, 오일상 중의 활성 성분의 농도는 20mg/ml, 30mg/ml, 50mg/ml, 83mg/ml, 100mg/ml, 133mg/ml, 150mg/ml, 167mg/ml, 180mg/ml, 200mg/ml, 250mg/ml, 300mg/ml, 333mg/ml, 450mg/ml 및 500mg/ml로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 특정 실시형태에서, 수상 중의 단백질의 농도는 2% 내지 10%(w/v), 바람직하게는 2% 내지 7%(w/v), 바람직하게는 2% 내지 5%(w/v)이고, 예를 들어, 2%, 4%, 5% 및 10%로 이루어진 그룹에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 단계(2)에서, 오일상과 수상을 혼합하여 나노에멀젼을 형성하고, 오일상 대 수상의 부피비는 1:10 내지 1:100, 바람직하게는 1:10 내지 1:60, 더 바람직하게는 1:20 내지 1:40이다. 일부 특정 실시형태에서, 오일상 대 수상의 혼합비는 3:100 또는 1:25이다. 나노에멀젼은 균질화를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 당해 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 형성할 수 있다. 예를 들어, 오일상과 수상의 혼합물은 고전단 분산기에 의해 균질화하고, 이어서 고압 균질화기에 의해 균질화하여 수중유형 에멀젼을 얻는다. 특정 실시형태에서, 오일상과 수상의 혼합물을 고전단 분산기로 2 내지 10분간 균질화한 후, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000 psi에서 균질화하여 수중유형 에멀젼을 얻는다.
일부 실시형태에서, 단계(3)에서, 나노에멀젼 중의 유기 용매가 제거되며, 감압 증발, 투석 등과 같은 임의의 공지된 적합한 방법이 사용될 수 있다. 이들 중, 감압 증발에는 하강막 증발(falling-film evaporation)이 포함된다.
일부 특정 실시형태에서, 나노에멀젼 중의 유기 용매를 제거하기 위해 하강막 증발법이 사용된다. 특정 실시형태에서, 에멀젼은 하강막 증발기에 의해 60℃에서 40mbar의 감압 하에 증발되어 에멀젼 중의 유기 용매가 제거된다. 유기 용매를 제거한 후, 생성된 현탁액에는 본 발명의 나노입자가 포함된다. 그러나, 이 시점에서의 현탁액에는 나노입자의 형성에 실제로 관여하지 않는 과잉량의 알부민도 포함되어 있다.
일부 특정 실시형태에서, 나노에멀젼 중의 유기 용매를 제거하기 위해 투석이 사용된다. 이 경우, 단계(3)은 단계(4)와 조합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계(4)의 투석은 2 내지 10배, 바람직하게는 3 내지 6배의 투석 배수로 수행된다.
일부 특정 실시형태에서, 투석은 단계(3)에서 얻은 현탁액에 입자 안정화제를 첨가하여, 현탁액 중의 입자 안정화제의 농도가 0.01% 내지 1.4%(w/v)가 되도록 하고, 동결건조 보호제의 수용액 중에서 투석함으로써 수행된다. 바람직하게는, 현탁액 중의 입자 안정화제의 농도는 0.1% 내지 1.4%(w/v), 바람직하게는 0.1% 내지 0.9%(w/v)이다. 바람직하게는, 동결건조 보호제의 수용액은 동결건조 보호제를 1% 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 8%, 바람직하게는 5% 내지 6%를 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 투석은 동결건조 보호제의 수용액 중에서 투석함으로써 수행되고, 수용액은 0.01% 내지 1.4%(w/v), 바람직하게는 0.05% 내지 0.9%(w/v), 바람직하게는 0.05% 내지 0.5%(w/v), 더 바람직하게는 0.05% 내지 0.15% 농도의 입자 안정화제를 더 포함한다. 바람직하게는, 동결건조 보호제의 수용액은 동결건조 보호제 1% 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 8%, 바람직하게는 5% 내지 6%를 포함한다.
일부 특정 실시형태에서, 투석은 0.01% 내지 1.4%(w/v), 바람직하게는 0.1% 내지 1.4%(w/v), 바람직하게는 0.1% 내지 0.9%(w/v)의 적절한 농도를 갖는 입자 안정화제 용액 중에서 투석함으로써 수행된다. 임의로, 투석 후에 동결건조 보호제를 첨가하고, 바람직하게는 동결건조 보호제는 생성된 액체가 동결건조 보호제를 1% 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 8%, 더 바람직하게는 5% 내지 6% 포함할 때까지 첨가된다.
일부 특정 실시형태에서, 단계(4)의 동결 건조는 -20℃ 내지 -60℃에서 동결하고, 0℃ 내지 +40℃ 사이의 온도에서 건조함으로써 수행된다.
본 발명에 관련된 급속 현탁을 위한 나노입자는 정맥 내 주입을 통해 투여하도록 되어 있으므로, 제품의 무균성을 보장해야 한다. 나노입자와 인간 혈청 알부민은 모두 온도에 민감하므로, 가열 살균으로는 멸균할 수 없으며, 살균 방법으로서는 완전 무균 생산 또는 여과에 의한 멸균을 생각할 수 있다.
제4 측면에서, 본 발명은 또한, 상기 급속 현탁용 나노입자 또는 약학 조성물의 사용 방법을 제공한다. 급속 현탁용 나노입자 또는 약학 조성물은 다수의 활성 성분을 효과적으로 운반할 수 있기 때문에, 상기 활성 성분에 반응하는 질병을 치료하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 급속 현탁용 나노입자 또는 그 조성물은 간암, 전립선암, 폐암, 유방암, 다발성 골수종, 이식 거부 반응, 대장암 및 림프종과 같은 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 다른 질병에는 또한 발열 등이 포함된다.
제5 측면에서, 본 개시는 활성 성분에 반응하는 질병을 치료하기 위한 약물의 제조에서의 상기 급속 현탁용 나노 입자 또는 약학 조성물의 용도를 더 제공한다. 예를 들어, 질병에는 간암, 전립선암, 폐암, 유방암, 다발성 골수종, 이식 거부 반응, 대장암 및 림프종과 같은 암이 포함된다. 다른 질병에는 또한 발열 등이 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 해당 분야의 일반적인 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 나타난 수치 범위와 파라미터 근사치는 넓은 범위 내에 있지만, 구체적인 실시 예에 나타난 수치 값은 가능한 한 정확하게 기록되어 있다. 그러나 모든 수치 값은 본질적으로 각각의 측정에서 표준 편차로 인해 발생하는 특정 오류를 포함한다. 또한, 여기에 개시된 모든 범위는 여기에 포함된 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"으로 기록된 범위는 최소값 1 내지 최대값 10 사이의 모든 하위 범위(끝점 포함)를 포함하는 것으로 간주된다. 즉, 1 내지 6.1과 같이 최소값 1 이상으로 시작하는 모든 하위 범위와, 5.5 내지 10과 같이 최대값 10 이하로 끝나는 모든 하위 범위이다. 또한 "여기에 포함됨"으로 언급된 모든 참조는 그 전체적으로 통합된 것으로 이해해야 한다.
또한, 본 명세서에 사용된 단수형에는 달리 명시하지 않는 한, 또한 명확하게 하나의 지시 대상에 한정되어 있지 않는 한, 그 대상의 복수형도 포함된다는 점에 유의해야 한다. "또는"이라는 용어는 문맥상 명확히 달리 지시되지 않는 한, "및/또는"이라는 용어와 상호 교환하여 사용된다.
당 업자는 입자 크기가 침강, 체질, 현미경 관찰 또는 레이저 입자 크기 분석기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 기존 또는 미래의 적합한 방법으로 측정될 수 있음을 이해한다. 또한, 본 개시 내용의 나노입자가 여러 개인 경우, 각 나노입자의 입자 크기는 일정하지 않으며, 평균 입자 크기가 상기 제한 사항을 충족하는 한, 본 개시의 범위에 포함된다는 점도 이해해야 한다. 일부 특정 실시형태에서, 입자 크기는 레이저 입자 크기 분석기로 결정된다.
본 발명의 급속 현탁용 나노입자 또는 약학 조성물은 다음의 이점 중 하나 이상을 갖는다:
(1) 급속 현탁 및 거품 발생 감소
시판되는 알부민 결합 파클리탁셀 아브락산(Abraxane®)을 사용하기 전의 준비 과정에는 6단계가 있으며, 작업이 복잡하여 최소 8분이 필요하다. 제제의 분산 시간이 길고, 약물 준비 과정 중에 오염 위험이 증가한다. 준비 작업에 많은 공간과 시간이 걸려, 준비 인력의 작업 효율성에 영향을 미치며, 또한 준비 작업이 표준화되지 않으면, 거품이 많이 발생하고, 불완전한 용해가 발생하기 쉬우며, 액체 계량이 부정확해 지고, 주입 라인이 막히는 것과 같은 문제가 발생하며, 약물 안전성에 영향을 미치거나 의료 분쟁으로 이어질 수 있다.
본 발명의 동결건조물은 복잡한 조작을 하지 않고도, 신속하게 재현탁시킬 수 있어, 제제의 재구성 시간을 2분 이내, 심지어는 1분 이내로 단축시킬 수 있으며, 거품 발생을 줄이고, 불완전 용해와 같은 문제를 피할 수 있어, 임상 응용의 편의성과 작업 효율을 크게 향상시키고, 약물의 안전성을 확보하는 데 도움이 된다.
(2) 우수한 안정성
본 발명의 급속 현탁용 나노입자 또는 약학 조성물은 제조 과정 중, 또는 재구성 및 재현탁 후에도 우수한 안정성을 갖는다. 실온에서 24시간 또는 심지어 48시간 동안 방치해도, 액체 외관, 입자 크기, 광투과율 등에 눈에 띄는 변화가 없다. 급속 현탁용 나노입자 또는 약학 조성물을 가속 조건 하에 10일 동안 두어도, 입자 크기, 광투과율, 재구성 시간 등에 큰 변화는 없다.
(3) 향상된 안전성
본 발명은 기존 기술과 비교하여, 처방 제형을 최적화함으로써, 인간 혈청 알부민의 양을 크게 감소시키고, 나노입자의 기능적 구조와 안정성을 유지할 뿐만 아니라, HSA에 의해 유발되는 알레르기 반응을 상당히 경감시킬 수 있다. 아브락산(Abraxane®)과 비교하여, 본 발명의 제품은 치료 효과에 있어서 유의한 차이가 없고, 안전성이 상당히 향상되었다.
(4) 본 발명의 제조 방법은 실시가 간단하고 용이하며, 대량 생산에 적합하다.
검출 방법(I) 제품의 각 성분 함량 측정 방법
1. 인간 혈청 알부민 함량 측정
알부민 함량은 Tosohaas TSK G3000 SWXL 겔 크로마토그래피 컬럼이 장착된 UV 검출기에서, 228nm의 검출 파장에서 HPLC 방법으로 측정하였으며, 이동상으로 0.1mol/L 인산 수소 이칼륨 용액(염산으로 pH를 7.0±0.1로 조정)을 사용하여, 컬럼 온도 25℃, 유속 0.7ml/min, 주입량 10μl의 조건에서 측정하고, 외부 표준 방법을 사용하여 계산하였다.
시험 용액의 조제: 0.9% 염화나트륨 용액으로 시험 용액을 희석하여, 알부민 농도가 3 mg/ml 미만인 용액을 얻고, 이를 시험 용액으로 사용하였다.
2. 파클리탁셀 함량 측정
파클리탁셀 함량은 옥타데실실란 결합 실리카겔 크로마토그래피 컬럼을 장착한 UV 검출기를 사용한 HPLC법으로, 아세토니트릴-물(1:1, v/v)을 이동상으로 하여, 컬럼 온도 25℃, 유속 1.0ml/min, 주입량 10 μl로, 228nm의 검출 파장에서 측정하고, 외부 표준 방법을 사용하여 계산하였다.
시험 용액의 조제: 아세토니트릴을 사용하여 파클리탁셀이 완전히 용해될 때까지 시험 용액을 희석하여, 농도 20 내지 200 μg/ml의 용액을 얻고, 이를 시험 용액으로 사용하였다.
3. 만니톨 함량 측정
만니톨 함량은 Sepax Carbomix Ca-NP 크로마토그래피 컬럼을 장착한 시차 굴절률 검출기를 사용한 HPLC 방법으로 측정하였으며, 이동상으로 물을 사용하였고, 유속 0.5ml/min, 컬럼 온도 50℃, 시차 굴절률 검출기의 검출 온도 55℃, 주입량 20μl의 조건으로 하였으며, 외부 표준법을 사용하여 계산하였다.
4. 수크로스 함량 측정
수크로스 함량은 Agilent ZORBAX NH2 크로마토그래피 컬럼이 장착된 증발 광산란 검출기를 사용한 HPLC 방법으로, 이동상으로서 아세토니트릴-물(80:20, v/v)을 사용하고, 유량 1.5ml/min, 컬럼 온도 35℃, 네뷸라이저 온도 55℃, 드리프트 튜브 온도 55℃, 증발성 광산란 검출기의 가스 유량 1.0ml/min, 주입량 5μL로 측정하고, 표준 곡선에서 계산했다.
5. 나트륨 이온 측정
나트륨 이온 함량은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(DionexIonPacTM CS16)이 장착된 전도도 검출기에서 30mM 메틸설폰산 수용액을 이동상으로 하여, 유속 0.4ml/min, 컬럼 온도 30℃, 주입량 25μL로 측정하고, 외부 표준법을 사용하여 계산하였다.
검출 방법(II) 광투과율 측정 방법
광투과성 제품(투과 광 강도≥0.2%)의 광투과율 변화는 제품의 안정성 변화를 반영할 수 있다. 시간에 따른 광투과율 변화가 작을수록 안정성이 우수하다. 광투과율이 감소하면, 입자가 응집되었음을 나타내고, 광투과율이 증가하면, 입자가 침강되었음을 나타낸다.
측정은 다중 광 산란 장치(Turbiscan, Formulation)를 사용하여 수행하고, 제품을 다양한 시간에 스캔하여, 제품의 광투과율이나 후방 산란광의 변화를 모니터링하여, 제품에 응집, 침전, 박리 등의 불안정 현상이 있는지를 판단한다.
샘플 셀의 준비: 시험할 샘플을 균일하게 흔들어 샘플 셀에 넣고, 샘플량을 약 20ml 정도 채운 후, 샘플 셀을 샘플 홀더에 놓고, 캡으로 덮는다.
샘플 측정: 지능형 스캔을 사용하여, 스캔 시간을 24시간으로 설정하면, 30초마다 자동으로 측정을 실시하고, 고정된 위치와 다른 시간에 광투과율 값을 선택하였다.
다음 실시 예는 본 발명에 개시된 조성물을 더 잘 설명하기 위한 것이며, 어떠한 측면에서도 본 개시내용을 제한하려는 것은 아니다.
실시 예에서 사용된 시약과 기기는 동일한 모델 및/또는 동일한 제조업체에서 생산되었다는 점에 유의해야 한다.
실시 예 1 제조 중의 입자 안정화제 농도의 스크리닝
파클리탁셀(CAS: 33069-62-4, Hainan Yew Pharmaceutical Co., Ltd.) 20g을 클로로포름/에탄올(11:1, v/v) 120ml에 용해하여 오일상을 얻고, 인간 혈청 알부민용액(CAS: 70024-90-7, Hebei Daan Pharmaceutical Co., Ltd.) 800ml(20% w/v)를 물로 4L까지 가하여 수상을 얻었다. 오일상과 수상을 고전단 분산기(모델 F22E, FLUKO Equipment(Shanghai) Co., Ltd.)에 의해 온라인으로 유화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기(모델 M-110EH30K, Microfluidics Company)에 의해 10,000 내지 20,000 psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 가열 온도 50℃ 및 진공도 80mbar 미만의 하강막식 증발기(모델 APLS-70L, Shanghai Tofflon Science and Technology Co., Ltd.)로 옮기고, 감압 하에 증발시켜 용액 내의 유기 용매를 제거하여, 평균 직경 114nm의 파클리탁셀 알부민 나노입자를 갖는 반투명 현탁액을 얻었다.
얻어진 현탁액을 300kD 한외 여과막으로 투석하였다. 다음 표의 투석 물질로 각각 6회 투석한 후, 현탁액 중의 유리 인간 혈청 알부민의 대부분을 치환하여 정제된 나노입자 현탁액 1-1 내지 1-8을 얻었다.
정제된 나노입자 현탁액을 상기 "검출 방법(II) 광투과율 측정 방법"에 따라 광투과율 측정을 실시하고, 실온에서 24시간 방치하여 그 외관을 관찰하였다. 그 결과는 다음과 같다.
안정성에 대한 결과| 샘플명 | 정제된 나노
입자
현탁액
1-1 | 정제된 나노
입자 현탁액
1-2 | 정제된 나노
입자 현탁액
1-3 | 정제된 나노
입자 현탁액
1-4 | 정제된 나노
입자 현탁액
1-5 | 정제된 나노
입자 현탁액
1-6 | 정제된 나노
입자 현탁액
1-7 | 정제된
나노
입자
현탁액
1-8 |
| 투석용 물질 | 물 | 0.1%
NaCl | 0.9%
NaCl | 1.4%
NaCl | 2.0%
NaCl | 5.0%
NaCl | 8.0%
NaCl | 10%
NaCl |
입자
크기
(nm) | 0h | 114 | 110 | 111 | 111 | 110 | 111 | 112 | 113 |
| 24h | -- | 110 | 110 | 110 | -- | -- | -- | -- |
| 외관 | 0h | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 |
| 4h | 명백한 침전물 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 명백한 침전물 | 명백한 침전물 | 명백한 침전물 |
| 24h | -- | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 명백한 침전물 | -- | -- | -- |
| 광투과율 | 0h | -- | 10.59 | 18.97 | 11.73 | -- | -- | -- | -- |
| 24h | -- | 11.16 | 18.85 | 12.44 | -- | -- | -- | -- |
실험 결과, 제조 중에, 0.1 내지 1.4% 염화나트륨 용액으로 투석하고, 24시간 방치한 후에도 침전이 발생하지 않았으며, 제품의 광투과율은 투석 전의 파클리탁셀 알부민 나노입자와 비교해 큰 변화가 없었던 점에서, 특정 농도 범위의 염화나트륨은 제품을 안정화시킬 수 있음을 알 수 있었으며, 특히 0.9% NaCl 용액이 최적이며, NaCl 농도가 너무 높으면 입자의 안정성에 도움이 되지 않는 것으로 나타났다.실시 예 2 염화나트륨을 포함하는 급속 현탁용 나노입자의 제조 및 안정성 조사(다양한 투석 배수)
파클리탁셀 20g을 클로로포름/에탄올(11:1, v/v) 200ml에 용해하여 오일상을 얻고, 인간 혈청 알부민 용액(20% w/v) 800g을 물로 4L가 될 때까지 가하여 수상을 얻었다. 오일상과 수상을 고전단 분산기로 온라인으로 유화시켜 1차 에멀젼을 형성한 후, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 가열온도 50℃, 진공도 80mbar 미만의 하강막식 증발기로 옮긴 후, 감압 하에서 증발시켜 용액 중의 유기용매를 제거하여, 평균 직경이 112nm인 파클리탁셀 알부민 나노입자를 함유하는 반투명 현탁액을 얻었다.
얻어진 현탁액을, 투석액으로서 5% 만니톨 용액(각각 염화나트륨 0, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%을 함유)을 사용하여, 300kD 한외 여과막으로 4배 용량의 투석을 실시했다. 투석 후, 현탁액 중의 유리 인간 혈청 알부민의 대부분을 치환하고, 정제된 나노입자 현탁액 2-0 내지 2-6을 얻었다. 정제된 나노입자 현탁액을 각각 20ml씩 바이알에 넣고 동결건조하여, 급속 현탁용 나노입자 동결 건조 분말 2-0 내지 2-6을 흰색 케이크로 얻었다.
동결건조 분말의 가속 안정성을 조사하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.
위에서 얻은 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 2-0 내지 2-6에 각각 주사용수 20ml를 첨가했다. 바이알을 가볍게 돌리거나 거꾸로 뒤집거나 하여, 바이알에 있는 모든 동결건조 케이크/분말이 완전히 분산되어 용해되도록 했고, 흰색 케이크는 약 1분 이내에 완전히 용해했다. 동결건조 전의 나노입자 현탁액(입자 크기 112nm)과 비교하여, 동결건조 분말 2-1 내지 2-6을 재현탁시켜 얻은 현탁액의 입자 크기는 크게 변하지 않았지만, 동결건조 및 재구성 후의 샘플 2-0의 입자 크기는 137nm로 증가했다. 상기 샘플의 재구성된 현탁액을 실온에서 24시간 방치한 결과, 용액의 외관 및 광투과율 측면에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 이는 투석 중에 염화나트륨을 첨가하면, 동결건조 및 재구성 과정에서 입자 크기의 안정성을 유지하는 데 도움이 된다는 것을 나타낸다.
동결건조 분말 2-0 내지 2-6을 60℃의 고온에서 5일 동안 방치한 결과, 흰색 케이크가 2분 이내에 완전히 용해되었다. 재구성된 샘플은 24시간 동안 실온에서 방치했지만 모든 샘플의 외관에 뚜렷한 변화는 보이지 않았으며, 샘플 2-1과 2-2에서는 48시간 방치해도 침전은 보이지 않았다.
급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말의 가속안정성 결과| 샘플명 | 동결
건조
분말
2-0 | 동결
건조 분말
2-1 | 동결
건조 분말
2-2 | 동결
건조 분말
2-3 | 동결
건조 분말
2-4 | 동결
건조 분말
2-5 | 동결
건조 분말
2-6 |
| 최종 제품 중의 NaCl (%) | 0 | 0.8 | 1.6 | 3.1 | 4.6 | 6.0 | 7.4 |
동결
건조
분말
(0일) | 재구성
시간 (s) | 67 | 66 | 54 | 47 | 51 | 44 | 48 |
입자
크기(nm) | 137 | 125 | 116 | 117 | 117 | 119 | 121 |
| 외관 (48h) | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 | 유백색 현탁액 |
| 동결건조 분말(60℃,5일) | 재구성
시간 (s) | 61 | 58 | 40 | 40 | 31 | 57 | 32 |
입자
크기(nm) | 143 | 126 | 136 | 147 | 169 | 160 | 184 |
48시간 후의
외관 | 침전물 관찰됨 | 침전물없음 | 침전물 없음 | 명백한 침전물 | 명백한 침전물 | 명백한 침전물 | 명백한 침전물 |
실시 예 3 다양한 동결건조 보호제의 스크리닝파클리탁셀 20g을 클로로포름/에탄올(11:1, v/v) 200ml에 용해하여 오일상을 얻고, 인간 혈청 알부민 용액(20% w/v) 800g을 물로 4L까지 가하여 수상을 얻었다. 오일상과 수상을 고전단 분산기로 온라인 유화하여 1차 에멀젼을 형성한 후, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 가열온도 50℃, 진공도 80mbar 미만의 하강막식 증발기로 옮긴 후, 감압 하에서 증발시켜 용액 중의 유기용매를 제거하여, 평균 직경이 122nm인 파클리탁셀 알부민 나노입자를 함유하는 반투명 현탁액을 얻었다.
얻어진 현탁액에 적당한 양의 염화나트륨을 가하여, NaCl 농도가 0.9%가 되도록 하였다. 투석에는 300kD 한외 여과막을 사용하였다. 아래 표에 있는 다양한 동결건조 보호제를 포함하는 5가지 투석 용액을 사용하여, 3배의 용량으로 투석을 수행하여, 정제된 나노입자 현탁액 3-1 내지 3-5를 얻었다. 그 결과는 투석 중에 입자 크기가 크게 변하지 않았음을 나타냈다.
정제된 나노입자 현탁액 3-1 내지 3-5를 분취하여 동결건조기에서 넣고 40시간 동안 동결건조하여 안정한 흰색 케이크를 얻었으며, 이는 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-1 내지 3-5이다.
급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-1 내지 3-5를 물에 가하고, 재현탁하여 등장성 용액으로 만들었다. 흰색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해될 수 있었다. 재현탁된 동결건조 분말을 실온에 24시간 방치해도 유의한 변화가 없었고, 5% 만니톨+1% 수크로스 용액으로 투석하여 동결건조한 샘플의 재현탁 현탁액은 실온에 방치했을 때 더 안정적이었으며, 48시간 방치한 후에도 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
동결건조 보호제의 종류 및 조합의 스크리닝| 투석 용액의 종류 | 현탁액 | 재현탁 동결건조 분말 |
| 명칭 | 입자크기/nm | 명칭 | 입자크기/
nm |
| 5% 만니톨 | 정제된 나노입자 현탁액 3-1 | 122 | 급속현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-1 | 124 |
| 1% 만니톨 | 정제된 나노입자 현탁액 3-2 | 122 | 급속현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-2 | 123 |
| 5% 만니톨 + 1% 수크로스 | 정제된 나노입자 현탁액 3-3 | 121 | 급속현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-3 | 120 |
| 1% 만니톨 + 1% 수크로스 | 정제된 나노입자 현탁액 3-4 | 122 | 급속현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-4 | 123 |
| 4% 만니톨 + 2% 수크로스 | 정제된 나노입자 현탁액 3-5 | 122 | 급속현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-5 | 124 |
상기 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 3-1 내지 3-5를 60℃의 고온에서 10일간 방치한 후, "검출 방법(II) 광투과율 측정 방법"에 따라 광투과율을 측정하고, 평균 입자 크기를 측정하였으며, 그 결과를 아래 표에 나타내었다.
정제된 나노입자 현탁액과 동결건조 분말의 가속안정성 결과| 투석 용액의 종류 | 동결건조 분말 3-1 | 동결건조 분말 3-2 | 동결건조 분말 3-3 | 동결건조 분말 3-4 | 동결건조 분말 3-5 |
| 투석 후의 약물 | 약물농도
(mg/ml) | 5.91 | 5.77 | 6.15 | 6.23 | 6.05 |
단백질
농도(mg/ml) | 11.82 | 10.90 | 14.15 | 12.46 | 12.28 |
| 단백질:약물 | 2.10 | 1.89 | 2.30 | 2.00 | 2.03 |
| 입자보호제 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 |
| 입자 크기(nm) | 122 | 122 | 122 | 122 | 122 |
| 광투과율% (0h) | 11.29 | 13.68 | 13.45 | 13.78 | 11.99 |
| 광투과율% (24h) | 11.43 | 13.29 | 13.46 | 13.81 | 11.90 |
동결건조 분말
(0 일) | 케이크
외관 | 결정이
많이
들어간
흰색
케이크 | 작은 부피와 결정이 많이 들어간 흰색
케이크 | 흰색
케이크 | 흰색
케이크 | 흰색
케이크 |
재구성
시간(s) | 77 | 65 | 67 | 90 | 45 |
| 입자 크기(nm) | 124 | 123 | 120 | 124 | 123 |
| 광투과율% (0h) | 15.83 | 13.68 | 18.14 | 15.59 | 15.50 |
| 광투과율% (24h) | 15.94 | 13.29 | 18.42 | 15.39 | 15.32 |
| 동결건조 분말(60℃에서 가속, 5일) | 재구성
시간 (s) | 56 | 64 | 49 | 77 | 63 |
| 입자 크기(nm) | 129 | 129 | 123 | 126 | 124 |
| 광투과율% (0h) | 13.97 | 12.37 | 18.44 | 14.21 | 14.23 |
| 광투과율% (24h) | 14.78 | 13.28 | 18.76 | 14.46 | 14.32 |
| 동결건조 분말(60℃에서 가속, 10일) | 재구성 시간 (s) | 52 | 62 | 64 | 69 | 37 |
| 입자 크기(nm) | 132 | 132 | 121 | 128 | 125 |
| 광투과율% (0h) | 13.33 | 12.38 | 17.19 | 13.69 | 14.10 |
| 광투과율% (24h) | 14.09 | 13.58 | 17.23 | 14.26 | 14.23 |
결과는 만니톨을 동결건조 보호제로 사용함으로써, 정제된 파클리탁셀 알부민 나노입자를 보호할 수 있고, 수크로스를 첨가함으로써, 동결건조 중의 파클리탁셀 나노입자의 안정성을 보다 확실하게 할 수 있음을 보여주었다(0시간과 24시간 사이에 광투과율의 변화가 거의 없음). 동결건조 보호제로서의 만니톨/수크로스의 조합은 투석 중의 공급 용액과 동결건조 제품 모두에 좋은 보호 효과를 발휘했다.가속 조건에서 방치한 후, 동결건조 분말 3-1, 3-2, 3-4 및 3-5는 재구성 후 다양한 정도의 입자 크기의 증가를 보였으나, 동결건조 분말 3-3의 입자 크기와 광투과율은 변화가 없었다. 이는 5% 만니톨 + 1% 수크로스가 동결건조 보호제로서 가장 효과가 좋으며, 요구 사항을 충족시키기 위해 추가적인 삼투압 조절제가 필요하지 않음을 나타낸다.
또한 동결건조 분말 3-3과 유사하게, 동결건조 분말 3-4 및 3-5의 입자 크기와 광투과율은 기본적으로 변화가 없었고, 동결건조 보호제로서 1% 만니톨+1% 수크로스와 4% 만니톨+2% 수크로스가 가장 좋은 것으로 나타났다.
실시 예 4 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말의 제조
파클리탁셀 50g을 클로로포름/에탄올(11:1, v/v) 500ml에 용해하여 오일상을 얻고, 인간 혈청 알부민 용액(20% w/v) 2.08kg을 물로 10L까지 가하여 수상을 얻었다. 오일상과 수상을 고전단 분산기로 온라인 유화시켜 1차 에멀젼을 형성한 후, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 가열온도 50℃, 진공도 80mbar 미만의 하강막식 증발기로 옮긴 후, 감압 하에서 증발시켜 용액 중의 유기용매를 제거하여, 평균 직경이 118nm인 파클리탁셀 알부민 나노입자를 함유하는 반투명 현탁액을 얻었다.
얻어진 현탁액에 적당한 양의 염화나트륨을 가하여, NaCl의 농도가 0.9%가 되도록 하였다. 5% 만니톨 + 1% 수크로스를 사용하여 300kD 한외 여과막으로 4배 용량의 투석을 수행하였다. 투석 후의 파클리탁셀 알부민 나노입자의 평균 직경은 121nm이고, 정제된 나노입자 4를 백색 반투명 액체로서 얻었다.
투석 후의 정제된 나노입자 현탁액을 0.22 미크론 살균 필터(Sartorius, Germany)를 통해 매끄럽게 여과했다. 여과 후에도 입자 크기는 크게 변하지 않았고, 현탁액을 실온에 48시간 방치해도 큰 변화가 관찰되지 않았다. 현탁액을 포장한 다음, 동결건조기에 넣고, 80시간 동안 동결건조하여 안정된 흰색 케이크를 얻었는데, 이는 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 4(동결건조 분말 4라고 함)이다.
동결건조로 얻은 흰색 케이크에 주사용수를 가하여 등장성 용액을 만들고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 약간의 거품이 생기면서 약 1분 만에 완전히 용해되었다. 재현탁된 현탁액은 실온에서 48시간 동안 방치하였으나, 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
실시 예 5 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말의 추가 배치 제조
실시 예 4의 방법을 사용하여, 각각 5-1, 5-2 및 5-3으로 명명된 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말의 3개 배치를 제조했다. 샘플명과 주요 제형 및 공정은 아래 표에 나타내었다.
급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 17, 18 및 19의 제조| 명칭 | 투석
용액 | 공정 | 입자
크기(nm) | 동결건조 후의 명칭 |
정제된 나노입자
현탁액 5-1 | 5% 만니톨 +
1% 수크로스 | 3배
투석 | 118 | 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-1 |
정제된 나노입자
현탁액 5-2 | 120 | 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-2 |
| 정제된 나노입자 현탁액 5-3 | 122 | 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-3 |
실시 예 6 단백질 대 약물비의 스크리닝실시 예 3에서 얻은 정제된 나노입자 현탁액 3-3을 다른 배율로 투석하였다. 각 투석 후, 인간 혈청 알부민 및 파클리탁셀의 함량을 "검출 방법(I) 제품 중의 각 성분 함량 측정 방법"에 따라 측정하여 단백질-약물비를 구하였다. 각 투석 후의 제품을 동결건조한 다음, 주사용수 20ml를 가하고, 완전히 용해될 때까지 가볍게 흔들었다. 다양한 투석 배율에서의 동결건조된 샘플의 재구성 분산 시간 및 거품 발생을 관찰하였다. 결과는 다음과 같다.
다양한 투석 배율에서의 동결건조 샘플의 분산 시간 및 발포 | 투석 전 | 1배
투석 | 2배
투석 | 3배
투석 | 4배
투석 | 5배
투석 | 6배
투석 |
| 단백질-약물비 | 8.95 | 5.63 | 3.69 | 2.30 | 1.49 | 1.03 | 0.70 |
| 발포 | +++ | +++ | + | ± | ± | ± | ± |
| 분산시간 (s) | 439 | 355 | 127 | 62 | 46 | 43 | 57 |
주: 거품은 +로 표시하며, +가 많을수록 거품이 많다는 의미한다. ±는 거품이 약간 있다는 것을 의미한다. -는 거품이 없다는 것을 의미한다.결과는 투석에 의해 정제된 나노입자 현탁액 중의 단백질 대 약물비를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 보여준다. 투석 배율이 증가함에 따라 제품의 재구성 시간이 상당히 단축되고, 거품이 상당히 개선된다. 실시 예 3과 조합하면, 알부민/파클리탁셀 비율이 3 미만일 때, 제품의 분산 시간은 약 1분이고, 거품 발생이 상당히 감소한다. 투석 배수를 더 증가시키면, 단백질 대 약물비를 더 줄일 수 있고, 분산 시간과 거품 발생의 명백한 개선은 보이지 않는다.
실시 예 7 고온에서의 안정성 조사
실시 예 4의 제1 단락에 기술된 바와 같이 제조된 파클리탁셀 알부민 나노입자 현탁액(투석 전)을 동결건조하고, 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 4와 함께 40℃ 및 60℃의 가속 조건에서 5일 및 10일 동안 방치했다. 꺼낸 후, 각각 0.9% 염화나트륨 용액과 20ml의 주사용수로 재구성했다. 분산 시간, 입자 크기 및 광투과율의 변화를 기록했으며, 그 결과는 다음과 같다.
가속 조건 하에서의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 및 파클리탁셀 알부민 나노입자의 안정성| 샘플명 | 저장 조건 | 재구성
시간 | 입자
크기 | 0시간에서의 광투과율 | 24시간에서의 광투과율 |
동결건조
분말 4 | 0일 | 1분 5초 | 115 | 18.13 | 18.14 |
| 40℃, 5일 | 51초 | 115 | 18.98 | 19.48 |
| 40℃, 10일 | 1분 14초 | 117 | 19.76 | 20.31 |
| 60℃, 5일 | 46초 | 116 | 18.95 | 19.53 |
| 60℃,10일 | 58초 | 117 | 19.49 | 20.20 |
| 파클리탁셀 알부민 나노입자 동결건조 분말(투석 전) | 0일 | 8분 9초 | 115 | 11.74 | 11.94 |
| 40℃, 5일 | 8분 11초 | 116 | 11.92 | 12.49 |
| 40℃, 10일 | 7분 45초 | 116 | 12.43 | 13.88 |
| 60℃, 5일 | 8분 32초 | 117 | 10.21 | 10.68 |
| 60℃, 10일 | 8분 7초 | 116 | 11.17 | 12.09 |
상기 결과로부터, 가속 조건 하에서 보관한 후, 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 4는 파클리탁셀 알부민 나노입자 동결건조 분말과 비교하여, 등장성 재구성 후의 입자 크기와 24시간 후의 광투과율에 유의한 차이가 없었고, 안정성에 있어서도 단점은 없었으며, 재구성 속도가 현저히 가속되고, 거품이 현저히 감소했음을 알 수 있다.실시 예 8 재구성 현상의 비교
실시 예 4의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 4에 주사용수 20ml를 가하고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 약간의 거품만 발생하면서, 24초 만에 완전히 용해되었다.
시판되고 있는 아브락산(Abraxane)의 바이알 2개를 취하였다. 그 중 하나에 표준 지침에 따라 0.9% 염화나트륨 용액 20ml를 가하여 분산시켰다. 샘플이 약간 거품이 발생하면서 완전히 용해되기까지 10분이 걸렸다. 다른 하나는 주입 각도와 속도를 제어하지 않고, 0.9% 염화나트륨을 가했고, 그 결과, 23분 후에도 여전히 완전히 분산되지 않았고, 흰색 고체가 보였으며, 거품이 더 많이 발생했다.
나노입자 동결건조분말 4와 아브락산의 재구성된 현탁액을 실온에 방치하여 안정성을 평가한 결과, 두 물질 모두 72시간 이내에 유의미한 변화가 없었다.
결과로부터, 아브락산(Abraxane)은 사용 전의 액상 제조 작업이 복잡하며, 부적절한 작업으로 인해 과도한 거품 발생 및 불완전한 용해와 같은 문제가 일어나기 쉬운 것을 알 수 있었다. 본 발명의 입자 분산액은 복잡한 작업 단계를 필요로 하지 않으며, 분산 시간이 1분 미만으로 아브락산(Abraxane)보다 상당히 짧으며, 거품 발생이 상당히 감소된다.
실시 예 9 품질에 대한 비교 연구
실시 예 5의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-1 내지 5-3을 시판의 아브락산과 품질을 비교하였으며, 비교 항목으로는 외관, pH, 수분, 분산 시간, 평균 입자 크기, 총 불순물, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 중합체, 파클리탁셀 결합율, 시험관 내 방출율 및 함량이 포함되었다.
급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말과 파클리탁셀 알부민 나노입자와의 품질 비교| 시험 항목 | 급속 현탁용
나노입자 동결
건조 분말 5-1 | 급속 현탁용
나노입자 동결
건조 분말 5-2 | 급속 현탁용
나노입자 동결건조 분말 5-3 | 아브락산
(Abraxane) |
| 외관 | 흰색 동결건조
케이크 | 흰색 동결건조
케이크 | 흰색 동결건조
케이크 | 흰색 동결건조
케이크 |
| pH | 7.2 | 7 | 7.2 | 6.8 |
| 수분 (%) | 1 | 0.8 | 1 | 1.7 |
| 분산시간 (분) | 1 | 1 | 1 | 10 |
| 평균 입자크기 | 121 | 121 | 120 | 132 |
| 총 불순물 | 0.08 | 0.12 | 0.13 | 0.44 |
| 인간 혈청 알부민(mg/vial) | 245 | 233 | 239 | 870 |
인간 혈청 알부민
중합체(mg/vial) | 21 | 21 | 21 | 27 |
| 파클리탁셀 결합율 (%) | 94 | 94 | 94 | 95 |
| 시험관내 방출율 (%) | 96 | 96 | 97 | 93 |
| 함량 (mg/vial) | 100.9 | 99.2 | 100.4 | 104.8 |
실험 결과에 따르면, 본 발명의 조성물은 인간 혈청 알부민 함량과 재구성 시간을 현저히 감소시켰고, 총 불순물과 인간 혈청 알부민 중합체 함량을 낮춰 아브락산보다 우수했으며, 다른 지표는 기본적으로 동일한 것으로 나타났다.실시 예 10 고온 안정성에 대한 비교 연구
실시 예 5의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-1을 60℃에서 방치하여 시판 중인 아브락산과 비교하였다. 비교 항목에는 외관, pH, 수분, 분산 시간, 평균 입자 크기, 관련 물질, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 중합체, 파클리탁셀 결합율, 시험관 내 방출율 및 함량이 포함되었다.
급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 및 파클리탁셀 알부민 나노입자의 고온 안정성| 시험 항목 | 60℃, 5일 | 60℃, 10일 |
| 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-1 | 아브락산 | 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-1 | 아브락산 |
| 외관 | 흰색 동결건조
케이크 | 담황색
동결건조
케이크 | 흰색 동결건조
케이크 | 담황색
동결건조
케이크 |
| pH | 7.2 | 6.6 | 7.2 | 6.7 |
| 수분(%) | 0.99 | 2 | 1 | 1.7 |
| 분산시간 (분) | 1 | 11 | 1 | 10 |
| 평균 입자크기 | 121 | 145 | 121 | 147 |
| 관련 물질 | 0.54 | 0.85 | 0.71 | 1.19 |
| 인간 혈청 알부민 (mg/vial) | 241 | 815 | 242 | 790 |
| 인간 혈청 알부민 중합체 (mg/vial) | 18 | 33 | 19 | 32 |
| 파클리탁셀 결합율 (%) | 95 | 96 | 95 | 96 |
| 시험관내 방출율(%) | 94 | 95 | 96 | 95 |
| 함량(%) | 99.2 | 98.1 | 98.4 | 97 |
실험 결과에 따르면, 고온 하에서 10일간 방치한 후, 본 발명의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말과 아브락산은 모두 총 불순물이 증가하였으며, 증가 정도는 일치했고; 아브락산은 인간 혈청 알부민이 감소하고, 본 발명의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말은 단백질 함량에 유의미한 변화가 없었다. 이는 본 발명의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말이 고온 하에서 아브락산보다 인간 혈청 알부민이 더 안정적임을 나타낸다.실시 예 11 광 안정성에 대한 비교 연구
실시 예 5의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 5-1을 광 조건 하에 두고, 시판 중의 아브락산(Abraxane)과 비교하였다. 비교 항목에는 외관, pH, 수분, 분산 시간, 평균 입자 크기, 관련 물질, 인간 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민 중합체, 파클리탁셀 결합율, 시험관 내 방출율 및 함량이 포함되었다.
급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 및 파클리탁셀 알부민 나노입자의 광 안정성| 시험 항목 | 5일간 광조사 | 10일간 광조사 |
급속 현탁용 나노입자
동결건조
분말 5-1 | 아브락산 | 급속 현탁용
나노입자
동결건조
분말 5-1 | 아브락산 |
| 외관 | 흰색 동결
건조 케이크 | 담황색
동결 건조
케이크 | 흰색 동결
건조 케이크 | 담황색
동결 건조
케이크 |
| pH | 7.2 | 6.6 | 7.2 | 6.7 |
| 수분 (%) | 1 | 1.7 | 0.92 | 1.9 |
| 분산시간 (분) | 1 | 10 | 1 | 10 |
| 입자 크기(nm) | 120 | 141 | 120 | 141 |
| 총 불순물 | 0.09 | 0.69 | 0.12 | 0.67 |
| 인간 혈청 알부민(mg/vial) | 242 | 867 | 239 | 858 |
| 인간 혈청 알부민중합체 (mg/vial) | 19 | 35 | 19 | 34 |
| 파클리탁셀결합율 (%) | 95 | 96 | 95 | 96 |
| 시험관내방출율 (%) | 94 | 94 | 94 | 94 |
| 함량 (%) | 99.3 | 100.2 | 98.4 | 97.2 |
실험 결과에 따르면, 본 발명의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말은 10일 동안 광 조건에 노출시킨 후, 총 불순물이 유의하게 증가하지 않았으며, 아브락산보다 현저히 낮았고, 다른 지표에 대해서도 각 제품에 대한 큰 변화 추세는 없었다.실시 예 12 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 중의 각 성분 함량 측정
실시 예 4 내지 5의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말에 대해, "검출 방법(I) 제품 중의 각 성분 함량 측정 방법"에 따라, 만니톨, 수크로스 및 나트륨 이온의 함량을 측정하였다.
급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 중의 각 성분에 대한 시험 결과| 샘플 | 알부민 (mg/vial) | 파클리탁셀
(mg/vial) | 만니톨
(mg/vial) | 수크로스
(mg/vial) | 나트륨
이온
(mM) | 염화
나트륨
함량*(%) |
급속 현탁용 나노입자 동결건조
분말 2-1 | 153 | 100.5 | 933.7 | 0 | 170.9 | 0.8 |
급속 현탁용 나노입자 동결건조
분말 4 | 138 | 102.7 | 963.0 | 192.6 | 0.10 | 0.008 |
급속 현탁용 나노입자 동결건조
분말 5-1 | 245 | 100.9 | 923.9 | 189.2 | 0.28 | 0.022 |
급속 현탁용 나노입자 동결건조
분말 5-2 | 233 | 99.2 | 933.9 | 190.3 | 0.28 | 0.022 |
급속 현탁용 나노입자 동결건조
분말 5-3 | 239 | 100.4 | 925.9 | 190.7 | 0.28 | 0.022 |
주: *나트륨 이온 함량을 기준으로 계산됨.실시 예 13. 개에서의 약동학 연구
시험 약물은 시판 중인 제제 아브락산(Abraxane) 및 실시 예 4의 동결건조 분말 4이고, 비글견을 사용하여 두 제제의 생체 내 약동학 연구를 수행하였다. 투여량은 5 mg/kg이고, 투여 시간은 30분 이내로 조절하였다. 투여 전(0시간), 주입 중 15분(투여 시작 후 0.25시간), 바늘 빼는 시점(투여 시작 후 0.5시간), 및 투여 시작 후 각각 0.58, 0.75, 1.0, 1.5, 2.5, 3.5, 4.5, 6.5, 8.5, 24.5시간에 비글견 앞다리의 두정맥에서 각각 혈액 2ml를 채취하여, 헤파린 항응고제 튜브에 넣고, 고르게 흔들어 준 후, 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하였다. HPLC/MS/MS를 사용하여 혈장 중의 파클리탁셀 농도를 측정하여, 약동학적 파라미터를 얻었고, 약물 농도 대 시간 곡선을 도 1~2와 같이 그렸다. 주요 약동학적 파라미터는 표 12와 표13에 나타내었다. 두 제제의 약물 농도-시간 곡선을 보면, 생체 내 거동이 거의 동일함을 알 수 있다.
실시 예 14. 개의 약동학 연구에서의 알레르기 현상
실시 예 13에서 수행한 개에서의 약동학 연구에서, 투여 중에 개에 대한 두 제제의 부작용이 관찰되었다. 아브락산(Abraxan) 그룹에서는, 시험된 비글견 모두(100%)에서 다양한 정도의 명백한 알레르기 반응이 보였고, 주로 투여 중에 격렬한 몸부림, 과도한 침흘림, 입 주위 피부 홍반, 일부 실험 동물의 투여 중에 구토 및 요실금 등이었다. 그러나 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 4 그룹에서는 일부 동물(50%)만이 약간의 몸부림, 침흘림, 입 주위 피부 홍반을 보였고, 증상은 경미했다. 본 발명의 제품은 약물의 알레르기 반응을 상당히 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
실시 예 15 조직 분포
시험 약물은 시판 중인 제제 아브락산(Abraxane) 및 실시 예 4의 급속 현탁용 나노입자 동결건조 분말 4였다. 48마리의 인간 유방암 JIMT-1 종양을 가진 마우스를 무작위로 2개의 실험 그룹으로 나누어, 각 시점에서 각 실험 그룹의 마우스는 총 6마리로 하였다. 두 가지 제제 모두, 꼬리 정맥 주사를 통해 각 실험 마우스에 20mg/kg의 용량으로 투여했다. 투여 후, 0.25, 1, 3, 및 24시간에 각 실험 그룹에서 혈액 샘플을 채취하고, 마우스를 즉시 희생시켰다. 종양, 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 위, 소장, 췌장 및 난소 조직을 해부하여, 균질화와 같은 전처리를 거쳤고, 각 조직 샘플 중의 약물 농도를 단백질 침전-LC/MS/MS법으로 측정하고, 주요 약동학적 파라미터는 Phoenix WinNonlin 8.0 소프트웨어(Pharsight, USA)의 비구획 모델을 사용하여 계산했다. 조직 분포 결과는 도 3에 나타내었다.
결과에 따르면, 파클리탁셀은 마우스의 체내에 널리 분포되어 있고, 종양, 간, 폐, 심장, 위, 소장, 비장 및 신장 조직에서 검출되고, 간에서 가장 높은 노출이 있었다. 생체 내 약물 노출에 따르면, 두 제제는 마우스의 다양한 조직에서 기본적으로 일관된 노출을 보였으며, 유의한 차는 없었다.
실시 예 16 인간 유방암 JIMT-1 종양에 대한 억제 효과
실험 모델: 인간 유방암 JIMT-1을 보유한 NU/NU 누드 마우스 모델을 사용하여, 정제된 입자 동결 건조 분말 4가 인간 유방암 JIMT-1에 미치는 억제 효과를 조사하고, 동일한 용량의 아브락산(Abraxane)과 비교했다.
실험 방법: 70마리의 NU/NU 암컷 마우스의 오른쪽 앞다리 겨드랑이에 인간 유방암 JIMT-1 세포(1×107/0.1mL/마우스)를 피하 접종했다. 접종 후 10일째에 평균 종양 부피가 약 165 mm3로 성장했다. 종양 성장이 좋은 40마리의 동물을 선택하여 종양 부피에 따라 5개 그룹(Day0)으로 균등하게 나누어, 각 그룹마다 8마리씩으로 하여, 비히클 대조군, 동결건조 분말 4의 10, 20, 40mg/kg 그룹, 아브락산(Abraxane®) 20mg/kg 그룹을 포함시켰다. 약물은 일주일에 한 번씩 총 3회(qw×3으로 약칭, 즉 D0, D7, D14에 투여) 정맥 주사로 투여했고, 실험은 24일차에 종료했다.
데이터 처리에는 SPSS 19.0 통계 소프트웨어를 사용하였고, 반복 측정 프로세스를 사용하여 시간에 따른 여러 측정 간의 종양 부피 변화를 분석했다.
결과는 1) JIMT-1 종양을 가진 마우스에 qw×3으로 정맥 투여한 후, 각 투여 그룹의 동물은 이를 잘 견뎌내었고, 2) 시험 조건 하에서 동결건조 분말 4를 10, 20, 40mg/kg으로 정맥 투여하면, 비히클 대조군과 비교하여, 용량 의존적 방식으로 인간 유방암 JIMT-1 이종 이식편의 성장을 상당히 억제할 수 있었으며, 3) 동결건조 분말 4의 종양에 대한 억제 효과는 동일한 용량(20mg/kg)의 아브락산의 억제 효과와 동등한 것을 나타내었다. 각 그룹의 종양 성장 곡선은 도 4에 나타내었다.
실시 예 17 인간 유방암 KPL-4 종양에 대한 억제 효과
실험 모델: 인간 유방암 KPL-4를 지닌 NU/NU 누드 마우스 모델을 사용하여, 정제된 입자 동결 건조 분말 4의 인간 유방암 KPL-4에대한 억제 효과를 조사하고, 동일한 용량의 아브락산과 비교했다.
실험 방법: 70마리의 NU/NU 암컷 마우스의 오른쪽 앞다리 겨드랑이에 인간 유방암 KPL-4 세포(1×107/0.1mL/마우스)를 피하 접종했다. 접종 후 12일째에, 평균 종양 부피가 약 105mm3로 성장했다. 종양 성장이 양호한 48마리의 동물을 선택하여, 종양 부피에 따라, 비히클 대조군, 동결건조 분말 4의 15, 30 및 60mg/kg 그룹, 아브락산(abraxane®)의 30 및 60mg/kg 그룹의 6개 그룹(Day0)으로 균등하게 나누었다. 투여 빈도는 qw×3이었고, 실험은 D22에 종료했다.
데이터 처리에는 SPSS 19.0 통계 소프트웨어를 사용하였고, 반복 측정 프로세스를 사용하여 시간에 따른 여러 측정 간의 종양 부피 변화를 분석했다.
결과는 1) 실험 조건 하에서 동결건조 분말 4를 15, 30, 60mg/kg으로 정맥 내 투여하면, 비히클 대조군과 비교하여, 용량 의존적으로 인간 유방암 KPL-4 이종 이식편의 성장을 유의하게 억제할 수 있었고, 2) 동결건조 분말 4의 종양에 대한 억제 효과는 동일한 용량(30mg/kg 및 60mg/kg)의 아브락산의 억제 효과와 동등한 것을 나타내었다. 각 그룹의 종양 성장 곡선은 도 5에 나타내었다.
실시 예 18 인간 췌장암 CFPAC-1 종양에 대한 억제 효과
실험 모델: 인간 췌장암 CFPAC-1을 보유한 NU/NU 누드 마우스 모델을 사용하여, 동결건조 분말 4의 인간 췌장암 CFPAC-1에 대한 억제 효과를 조사하고, 동일한 용량의 아브락산과 비교했다.
실험 방법: 70마리의 NU/NU 암컷 마우스의 오른쪽 앞다리 겨드랑이에 인간 췌장암 CFPAC-1 세포(1×107/0.1mL/마우스)를 피하 접종했다. 접종 후 7일째에, 평균 종양 부피가 약 195mm3로 성장했다. 종양 성장이 좋은 35마리의 동물을 선택하여, 종양 부피에 따라, 비히클 대조군, 동결건조 분말 4의 10, 20, 40mg/kg 그룹, 아브락산(abraxane®)의 20mg/kg 그룹의 5개 그룹(Day0)으로 균등하게 나누었다. 투여 빈도는 qw×3이었고, 실험은 D23에 종료했다.
데이터 처리에는 SPSS 19.0 통계 소프트웨어를 사용하였고, 반복 측정 프로세스를 사용하여 시간에 따른 여러 측정 간의 종양 부피 변화를 분석했다.
결과는 1) CFPAC-1 종양을 가진 마우스에 qw×3으로 정맥 투여한 후, 각 투여 그룹의 동물은 잘 견더내었고, 2) 실험 조건 하에서, 동결건조 분말 4를 10, 20, 40mg/kg으로 정맥 투여하면, 비히클 대조군과 비교하여, 용량 의존적으로 인간 췌장암 CFPAC-1 이종 이식편의 성장을 상당히 억제할 수 있었으며, 3) 동결건조 분말 4의 종양에 대한 억제 효과는 동일한 용량(20mg/kg)의 아브락산의 억제 효과와 동등한 것을 나타내었다. 각 그룹의 종양 성장 곡선은 도 6에 나타내었다.
실시 예 19 비글견에서의 3주간 반복 정맥 주사의 독성 시험
이 실험에서는, 비글견 42마리(수컷과 암컷이 반반)를 무작위로 7개 그룹으로 나누었으며, 동결건조 분말 4의 저용량 그룹(0.3mg/kg), 동결건조 분말 4의 중용량 그룹(0.6mg/kg), 동결건조 분말 4의 고용량 그룹(1.2mg/kg), 아브락산(Abraxane®) 그룹(1.2mg/kg), 음성 대조군(0.9% 염화나트륨 주사액), 부형제 대조군 1(인간 혈청 알부민 1.7mg/kg, 동결건조 분말 4의 고용량 그룹의 단백질 함량과 일치), 부형제 대조군 2(인간 혈청 알부민 10.8mg/kg, 아브락산(Abraxane®) 그룹의 단백질 함량과 일치)이다. 약물은 동일한 농도(5mg/ml)와 서로 다른 용량으로 주 1회, 총 3회 정맥 주사했다.
실험 결과에 따르면, 실험 중에 동물이 사망하거나 죽은 적이 없었고, 체중, 음식 섭취량, 체온, 혈액학 및 응고, 혈청 생화학, 소변, 분변 잠혈, 그리고 육안 해부학에서 유의미한 이상은 발견되지 않았다.
부형제 대조군 2에서는 투여 15일째에 암컷 동물 2/3가 황색 거품을 토했고, 시판 대조군에서는 수컷 동물 1/3이 서 있지 못하거나 활동이 감소하는 것과 같은 알레르기 반응을 보였다(응급 치료를 위해 덱사메타손을 근육 내 주사한 후 회복됨). 다른 투여군에서는 알레르기 관련 반응이 관찰되지 않았다.
동일한 용량에서는 D1 및 D15에 동결건조 분말 4와 아브락산(Abraxane®)을 투여한 후, 암컷 또는 수컷의 개에서 파클리탁셀 노출(Cmax 및 AUC(0-t))에 통계적 차이가 없었다.
결론: 실험 조건 하에서 동결건조 분말 4와 아브락산(Abraxane®)은 유사한 생체 내 PK 특성을 보였으며, 동결건조 분말 4는 알레르기 반응을 현저히 감소시켰다.
실시 예 20 시험관 내 용혈 실험
뉴질랜드 흰 토끼의 적혈구를 사용하여 시험관 내 용혈 실험을 수행했다. 샘플에 동결건조 분말 4를 5 mg/mL 농도로 가하고, 동시에 음성 대조군(0.9% 염화나트륨 주사액), 부형제 대조군(인간 혈청 알부민) 및 양성 대조군(탈이온수)을 설정했다.
결과는 음성 대조군(0.9% 염화나트륨 주사액)에서 적혈구의 용혈이나 응집이 없었고, 양성 대조군(탈이온수)에서 용혈이 발생하여 이 실험 시스템이 시험 샘플/대조군의 적혈구에 대한 용혈 효과를 정확하게 반영할 수 있음을 증명했다. 실험 동안, 시험 샘플 튜브와 부형제 대조 튜브에서 적혈구의 용혈이나 응집이 없었다.
실험 결과, 5 mg/mL 농도의 동결건조 분말 4는 적혈구의 용혈이나 응집을 일으키지 않는 것으로 나타났다.
실시 예 21 혈관/근육 자극 실험
본 실험에서는 성별에 관계없이 뉴질랜드 흰토끼 9마리를 선택하여, 무작위로 3개 그룹으로 나누었으며, 여기에는 부형제 대조군(인간 혈청 알부민 22.8mg/kg, 시험 샘플의 고용량 그룹의 단백질 함량과 일치함), 동결건조 분말 4의 11mg/kg 및 16.5mg/kg 그룹이 포함된다. 약물은 동일 농도(5mg/ml)와 다른 농도로, 주 1회 총 2회, 귀정맥에 볼러스 주사로 투여했다. 혈관 자극 실험의 마지막 투여일에 동결건조 분말 4를 뒷다리 근육 내 주사했다. 실험에서는 좌우 자가 동일성 대조군을 사용했으며, 0.9% 염화나트륨 주사를 정맥 내 또는 근육 내 주사했다.
실험 결과, 육안 및 조직병리학적 관찰을 통해 모든 동물에서 시험 샘플과 관련된 혈관이나 근육 자극이 관찰되지 않았음이 확인되었다.
실시 예 22 CD1 마우스에서의 급성 독성 실험
이 실험에서는, 80마리의 CD1 마우스(반은 수컷, 반은 암컷)를 선택하여 무작위로 8개 그룹으로 나누었으며, 음성 대조군(0.9% 염화나트륨 주사), 부형제 대조군(인간 혈청 알부민 103.5mg/kg, 시험 샘플의 고용량 그룹의 단백질 함량과 일치함), 시험 샘플 동결건조 분말 4의 25mg/kg, 75mg/kg 및 225mg/kg 그룹, 및 시판의 대조군 Abraxane®의 25mg/kg, 75mg/kg 및 225mg/kg 그룹이다. 약물은 동일한 농도(5mg/ml)와 서로 다른 용량으로, 각 투여 간격을 적어도 4시간으로 하여 정맥 주사로 3회 투여했다.
결과는 모든 그룹에서 동물이 사망 또는 사망하지 않을 수 있음을 보여주었다. 동결건조 분말 4와 아브락산(Abraxane®)은 최대 허용 용량(MTD)이 225mg/kg/일인 유사한 독성 프로파일을 보였다.
실시 예 23 급속 현탁용 도세탁셀 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
도세탁셀(docetaxel) 3g을 메틸렌클로라이드/에탄올(1:1, v/v) 15ml에 용해시킨 다음, 인간 혈청 알부민 용액(4% w/v) 500ml를 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000 psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 회전 증발기로 옮기고, 40℃의 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액 중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 도세탁셀 알부민 나노입자는 직경이 102nm이고, 현탁액은 반투명했다.
얻어진 도세탁셀 알부민 나노입자 현탁액을 0.9% 염화나트륨 용액을 사용하여 100kD 한외 여과막으로 5배 부피로 투석하였다. 투석 후, 나노입자의 평균 직경은 104nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 도세탁셀 나노입자 현탁액은 흰색 반투명 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 도세탁셀 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 도세탁셀 함량은 HPLC로 측정했으며, 현탁액은 함량에 따라 50 mg/바이알로 포장량을 조정하여 포장하고, 동결건조기에서 넣어 75시간 동안 동결건조하여 안정된 흰색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 흰색 케이크에 주사용수를 넣고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 반투명했으며, 약간의 거품만 생겼다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 유의한 변화가 없었고, 24시간 동안 실온에서 방치한 후에도 외관 및 광투과율에 유의한 변화가 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 도세탁셀의 함량을 각각 측정하였더니, 알부민과 도세탁셀의 비율은 0.83:1인 것으로 나타났다.
실시 예 24 급속 현탁용 카바지탁셀 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
500mg의 카바지탁셀(cabazitaxel)을 3ml의 클로로포름/에탄올(8:1, v/v)에 용해시킨 다음, 150ml의 인간 혈청 알부민 용액(5% w/v)을 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 회전 증발기로 옮기고, 40℃의 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액 중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 카바지탁셀 알부민 나노입자는 직경이 100nm이고, 현탁액은 반투명했다.
얻어진 카바지탁셀 알부민 나노입자 현탁액에 적당한 양의 염화나트륨을 첨가하여 염화나트륨 농도가 0.4%가 되도록 하였다. 투석에는 100kD 한외 여과막과 5% 만니톨 + 1% 수크로스 용액을 사용하였다. 투석은 3배 부피로 하였다. 나노입자의 평균 직경은 101nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 카바지탁셀 나노입자 현탁액은 흰색 반투명 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 카바지탁셀 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 카바지탁셀 함량은 HPLC로 측정했다. 현탁액은 함량에 따라 5 mg/바이알로 포장량을 조정하여 포장하고, 동결건조기에 넣어 48시간 동안 동결건조하여 안정된 흰색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 흰색 케이크에 주사용수를 넣고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 반투명했으며, 약간의 거품만 생겼다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 유의한 변화가 없었고, 24시간 동안 실온에서 방치한 후에도 외관 및 광투과율에 유의한 변화가 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 카바지탁셀의 함량을 각각 측정하였더니, 알부민과 카바지탁셀의 비율은 2.53:1인 것으로 나타났다.
실시 예 25 급속 현탁용 도세탁셀 아세틸 유도체 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
200mg의 도세탁셀 아세틸 유도체를 2ml의 클로로포름/에탄올(1:1, v/v)에 용해시킨 다음, 100ml의 인간 혈청 알부민 용액(5% w/v)을 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 회전 증발기로 옮기고, 40℃의 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액 중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 도세탁셀 아세틸 유도체 알부민 나노입자는 직경이 122nm이고, 현탁액은 반투명했다.
얻어진 도세탁셀 아세틸 유도체 알부민 나노입자 현탁액을 5% 만니톨 + 0.2% NaCl 용액을 사용하여 1000kD 한외 여과막으로 투석하였다. 투석은 4배 부피로 하였다. 나노입자의 평균 직경은 161nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 도세탁셀 아세틸 유도체 나노입자 현탁액은 흰색 반투명 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 도세탁셀 아세틸 유도체 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 도세탁셀 아세틸 유도체 함량은 HPLC로 측정했으며, 현탁액은 함량에 따라 5 mg/바이알로 포장량을 조정하여 포장하고, 동결건조기에 넣어 48시간 동안 동결건조하여 안정된 흰색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 흰색 케이크에 주사용수를 가하고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 반투명했으며, 약간의 거품만 생겼다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 유의한 변화가 없었고, 24시간 동안 실온에서 방치한 후에도 외관 및 광투과율에 유의한 변화가 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 도세탁셀 아세틸 유도체의 함량을 각각 측정하였더니, 알부민과 도세탁셀 아세틸 유도체의 비율은 1.66:1인 것으로 나타났다.
실시 예 26 급속 현탁용 라파마이신 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
라파마이신(rapamycin) 166mg을 클로로포름 1ml에 용해시킨 다음, 인간 혈청 알부민 용액(5% w/v) 40ml을 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 회전 증발기로 옮기고, 40℃의 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액 중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 라파마이신 알부민 나노입자는 직경이 78nm이고, 현탁액은 반투명했다.
얻어진 라파마이신 알부민 나노입자 현탁액에 염화나트륨의 농도가 0.9%가 되도록 적당한 양의 염화나트륨을 첨가하였다. 투석에는 100kD 한외 여과막과 4% 만니톨 + 2% 수크로스 용액을 사용하였다. 투석은 4배 부피로 하였다. 나노입자의 평균 직경은 61nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 라파마이신 나노입자 현탁액은 흰색 반투명 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 라파마이신 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 라파마이신 함량은 HPLC로 측정했다. 현탁액은 함량에 따라 10mg/바이알로 포장량을 조정하여 포장하고, 동결건조기에 넣어 75시간 동안 동결건조하여 안정된 흰색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 흰색 케이크에 주사용수를 넣고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 반투명했으며, 약간의 거품만 생겼다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 유의한 변화가 없었고, 실온에서 24시간 방치한 후에도 외관 및 광투과율에 유의한 변화가 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 라파마이신의 함량을 각각 측정하였더니, 알부민과 라파마이신의 비율은 1.53:1인 것으로 나타났다.
실시 예 27 급속 현탁용 템시롤리무스 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
101mg의 템시롤리무스(temsirolimus)를 0.5ml의 디클로로메탄에 용해시킨 다음, 19.5ml의 인간 혈청 알부민 용액(5% w/v)을 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 회전 증발기로 옮기고, 40℃의 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액 중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 템시롤리무스 알부민 나노입자는 직경이 88nm이고, 현탁액은 반투명했다.
얻어진 템시롤리무스 알부민 나노입자 현탁액에 염화나트륨의 농도가 1.0%가 되도록 적당한 양의 염화나트륨을 가하였다. 투석에는 100kD 한외 여과막과 5% 만니톨 + 1% 수크로스 용액을 사용하였다. 투석은 3배 부피로 하였다. 나노입자의 평균 직경은 77nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 템시롤리무스 나노입자 현탁액은 흰색 반투명 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 템시롤리무스 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 템시롤리무스 함량은 HPLC로 측정했다. 현탁액은 함량에 따라 10 mg/바이알로 포장량을 조정하여 포장하고, 동결건조기에 넣어 66시간 동안 동결건조하여 안정된 흰색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 흰색 케이크에 주사용수 20ml를 넣고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 반투명했으며, 거품이 약간만 생겼다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 유의한 변화가 없었고, 실온에서 24시간 방치한 후에도 외관 및 광투과율에 유의한 변화가 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 템시롤리무스의 함량을 각각 측정한 결과, 알부민과 템시롤리무스의 비율은 2.27:1인 것으로 나타났다.
실시 예 28 급속 현탁용 에포틸론 B 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
127mg의 에포틸론(epothilone) B를 2ml의 클로로포름/에탄올(10:1, v/v)에 용해시킨 다음, 52ml의 인간 혈청 알부민 용액(5% w/v)을 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 회전 증발기로 옮기고, 40℃의 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액 중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 에포틸론 B 알부민 나노입자는 직경이 113nm이고, 현탁액은 반투명했다.
얻어진 에포틸론 B 알부민 나노입자 현탁액을 5% 수크로스 + 0.5% 염화나트륨 용액을 사용하여 300kD 한외 여과막으로 투석했다. 투석은 5배 부피로 하였다. 나노입자의 평균 직경은 102nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 에포틸론 B 나노입자 현탁액은 흰색 반투명 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 에포틸론 B 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 에포틸론 B 함량은 HPLC로 측정하고, 현탁액을 함량에 따라 10 mg/바이알로 포장량을 조정하여 포장하고, 동결건조기에 넣어 65시간 동안 동결건조하여 안정된 흰색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 흰색 케이크에 주사용수 20ml를 넣고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 흰색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 약간의 거품만 생기고, 반투명했다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 유의한 변화가 없었고, 24시간 동안 실온에서 방치한 후에도 외관 및 광투과율에 유의한 변화가 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 에포틸론 B의 함량을 각각 측정하였더니, 알부민과 에포틸론 B의 비율은 1.03:1인 것으로 나타났다.
실시 예 29 급속 현탁용 타네스피마이신 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
78mg의 타네스피마이신(tanespimycin)을 0.6ml의 클로로포름에 용해시킨 다음, 22ml의 인간 혈청 알부민 용액(8% w/v)을 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노에멀젼을 얻었다. 나노에멀젼을 회전 증발기로 옮기고, 40℃의 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액 중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 타네스피마이신 알부민 나노입자는 직경이 105nm이고, 현탁액은 반투명했다.
얻어진 타네스피마이신 알부민 나노입자 현탁액에 염화나트륨의 농도가 0.9%가 되도록 적당한 양의 염화나트륨을 가하였다. 투석에는 300kD 한외 여과막과 3% 만니톨 + 3% 수크로스 용액을 사용하였다. 투석은 4배 부피로 하였다. 나노입자의 평균 직경은 102nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 타네스피마이신 나노입자 현탁액은 보라색 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 타네스피마이신 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 타네스피마이신 함량은 HPLC로 측정했다. 현탁액은 함량에 따라 10mg/바이알로 포장량을 조정하여 포장하고, 동결건조기에서 45시간 동안 동결건조하여 안정된 보라색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 보라색 케이크에 주사용수를 넣고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 보라색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 약간의 거품만 있는 보라색이었다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 상당한 변화가 없었고, 24시간 동안 실온에서 방치한 후에도 외관 및 광투과율에 큰 변화가 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 타네스피마이신의 함량을 각각 측정하였더니, 알부민과 타네스피마이신의 비율은 1.76:1인 것으로 나타났다.
실시 예 30 급속 현탁용 10-히드록시캄프토테신 알부민 나노입자의 제조 및 이후의 특성 조사
10-히드록시캄프토테신(hydroxycamptothecin) 93mg을 디클로로메탄/에탄올(10:1, v/v) 2ml에 용해하고, 인간 혈청 알부민 용액(5% w/v) 48ml를 가했다. 혼합물을 고전단 분산기(fluko FZ-20)로 2분간 균질화하여 1차 에멀젼을 형성한 다음, 고압 균질화기로 10,000 내지 20,000psi에서 균질화하여 나노 에멀젼을 얻었다. 나노 에멀젼을 회전 증발기로 옮겨 40℃ 수조에서 가열한 다음, 40mbar의 감압 하에 증발시켜 용액중의 유기 용매를 제거했다. 생성된 10-히드록시캄프토테신 알부민 나노입자의 직경은 118nm였으며, 현탁액은 황색이고 반투명했다.
얻어진 10-히드록시캄프토테신 알부민 나노입자 현탁액을 5% 만니톨 + 0.1% 염화나트륨 용액을 사용하여 300kD 한외 여과막으로 투석했다. 투석은 4배 부피로 하였다. 나노입자의 평균 직경은 102nm였으며, 투석 중에 입자 크기에 유의한 변화는 없었다. 정제된 10-히드록시캄프토테신 나노입자 현탁액은 황색 반투명 액체로 얻어졌다.
투석 후의 정제된 10-히드록시캄프토테신 나노입자 현탁액은 0.22 미크론 필터 막을 매끄럽게 통과했다. 현탁액 중의 10-히드록시캄프토테신 함량을 HPLC로 측정하고, 함량에 따라 포장량을 20 mg/바이알로 조정하여 현탁액을 포장하고, 동결건조기에서 45시간 동안 동결건조하여 안정된 황색 케이크를 얻었다.
동결건조 후에 얻은 황색 케이크에 주사용수를 넣고, 가볍게 흔들어 완전히 용해시켰다. 황색 케이크는 2분 이내에 완전히 용해되었고, 현탁액은 약간의 거품만 생긴 황색으로 반투명했다. 재현탁된 현탁액은 동결건조 전과 비교하여, 입자 크기에 상당한 변화가 없었고, 실온에서 24시간 방치한 후에도 외관과 광투과율에 큰 변화는 발견되지 않았다. 제품 중의 인간 혈청 알부민과 10-히드록시캄프토테신의 함량을 각각 측정하였더니, 알부민과 10-히드록시캄프토테신의 비율은 1.49:1인 것으로 나타났다.