양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for drug delivery comprising cationic gelatin and alginate.
음이온성 약물, 특히 핵산, 펩타이드 등의 물질을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다.In the treatment using anionic drugs, especially substances such as nucleic acids and peptides, safe and efficient drug delivery technologies have been studied for a long time, and various carriers and delivery technologies have been developed.
miRNA(micro RNA)는 단일 서열로 구성된 보통 21개에서 24개의 뉴클리오티드로 구성된 매우 작은 크기의 비암호화 RNA이며, mRNA의 번역을 방해하는 과정을 통해 다른 유전자들을 조절함으로써 세포 분화, 배아 발생, 대사 조절 및 암 발생과정을 제어한다. 대략 인간 유전체는 전체 유전자의 30% 가량이 miRNA에 의해 조절되는 것으로 추정된다. 많은 종류의 miRNA와 이에 의해 조절되는 표적 유전자를 추적하여 다양한 질환에 대한 miRNA의 역할에 대한 연구가 수행되었다. 수많은 연구를 통해 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에서 miRNA가 비상적으로 발현됨을 확인함으로써, miRNA를 질환의 진단, 예측 및 예후 예측에 이용할 수 있음이 확인되었다.miRNA (micro RNA) is a very small noncoding RNA consisting of a single sequence, usually 21 to 24 nucleotides, and controls cell differentiation, embryonic development, metabolic regulation, and cancer development by regulating other genes through the process of interfering with the translation of mRNA. It is estimated that approximately 30% of the total genes in the human genome are regulated by miRNA. Research has been conducted on the role of miRNA in various diseases by tracking many types of miRNA and the target genes regulated by them. Numerous studies have confirmed that miRNA is abnormally expressed in various diseases such as cancer, diabetes, and cardiovascular disease, and thus it has been confirmed that miRNA can be used for the diagnosis, prediction, and prognosis of diseases.
siRNA(small interfering RNA)는 표적 mRNA와 같은 시퀀스를 가진 센스 가닥(sense strand)과 그와 상보적인 시퀀스를 가진 안티센스 가닥(antisense strand)으로 구성된다. siRNA는 19-21 bp의 짧은 이중가닥(duplex)을 가지며, siRNA는 세포 내로 들어가 표적 mRNA에 붙어 표적 mRNA를 분해시키며 표적 유전자의 발현을 억제하는 것이 가능하기 때문에 현재 치료가 어려운 암, 바이러스 감염, 유전병과 같은 질병의 치료를 가능하게 할 수 있다.siRNA (small interfering RNA) consists of a sense strand with the same sequence as the target mRNA and an antisense strand with a complementary sequence. siRNA has a short duplex of 19-21 bp, and siRNA can enter cells, bind to target mRNA, degrade the target mRNA, and suppress the expression of the target gene, making it possible to treat diseases such as cancer, viral infection, and genetic diseases that are currently difficult to treat.
miRNA 및 siRNA를 기반으로 한 치료제 개발이 활발히 진행되고 있으나, miRNA 및 siRNA의 경우 안전성 문제와 세포내 이입 등의 문제로 별도의 전달체에 봉입하는 형태로 연구가 진행되고 있다.The development of therapeutics based on miRNA and siRNA is actively underway, but in the case of miRNA and siRNA, research is being conducted in the form of encapsulating them in separate delivery vehicles due to safety issues and problems such as intracellular uptake.
이에, 코아세르베이트(Coacervate) 및 이에 적용되는 젤라틴을 전달체로 활용하고자 하는 많은 연구 및 개발이 진행되고 있으나(미국 등록특허: 13-648846), 젤라틴의 경우 생체내 pH 조건에서 양전하 밀도가 낮으므로, 음이온을 나타내는 miRNA 및 siRNA와 정전기적 상호작용이 약해진다. 따라서, 젤라틴 단독으로는 안정적으로 miRNA 및 siRNA를 전달하기 어렵다.Accordingly, many studies and developments are being conducted to utilize coacervate and gelatin applied thereto as a carrier (US Patent No. 13-648846). However, since gelatin has a low positive charge density under in vivo pH conditions, electrostatic interactions with miRNA and siRNA, which exhibit anions, are weak. Therefore, it is difficult to stably deliver miRNA and siRNA using gelatin alone.
본 발명자는 젤라틴을 에틸렌 다이아민(Ethylenediamine, ED)을 이용하여 양이온성 젤라틴으로 합성하였으며, 이렇게 합성한 양이온성 젤라틴을 알지네이트 및 약물과 정전기적 상호작용을 통해 코아세르베이트를 형성하도록 유도하였다. 이렇게 제조한 전달체는 안정성 측면이 크게 증진되었으며, 유기용매 혹은 염의 첨가 없이도 매우 간단하게 코아세르베이트를 제조할 수 있다.The inventors synthesized cationic gelatin using ethylenediamine (ED), and induced the synthesized cationic gelatin to form a coacervate through electrostatic interaction with alginate and a drug. The carrier thus manufactured has greatly improved stability, and the coacervate can be manufactured very simply without the addition of an organic solvent or salt.
일 양상은 양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.One aspect is to provide a drug delivery composition comprising cationic gelatin and alginate.
다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트(5-Aminosalicylic acid, 5-ASA), 비오틴(Biotin), 아르기닌(Arginine), 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF) 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for wound healing comprising cationic gelatin; alginate; and at least one selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate (5-ASA), biotin, arginine, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor (PDGF) and fibroblast growth factor (FGF).
또 다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌(Anthocyanin), 아피제닌(Apigenin), 나이아신아마이드(Niacinamide), 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, comprising cationic gelatin; alginate; and at least one selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, Anthocyanin, Apigenin, Niacinamide, Epidermal Growth Factor, Platelet-Derived Growth Factor and Fibroblast Growth Factor.
또 다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a health functional food for preventing or improving inflammatory diseases, comprising at least one selected from the group consisting of cationic gelatin; alginate; and miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor.
또 다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect provides an anti-inflammatory cosmetic composition comprising cationic gelatin; alginate; and at least one selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor.
또 다른 양상은 젤라틴 및 에틸렌 다이아민을 혼합하여 양이온성 젤라틴을 얻는 단계; 및Another aspect is a step of mixing gelatin and ethylene diamine to obtain cationic gelatin; and
상기 양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 약물 전달용 조성물을 얻는 단계를 포함하는 약물 전달용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method for producing a drug delivery composition, comprising the step of mixing the cationic gelatin and alginate to obtain a drug delivery composition.
또 다른 양상은 젤라틴 및 에틸렌 다이아민을 혼합하여 양이온성 젤라틴을 얻는 단계; 및Another aspect is a step of mixing gelatin and ethylene diamine to obtain cationic gelatin; and
상기 양이온성 젤라틴, 알지네이트 및 약물을 혼합하여 약학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method for preparing a pharmaceutical composition, comprising the step of mixing the cationic gelatin, alginate and a drug to obtain a pharmaceutical composition.
또 다른 양상은 젤라틴 및 에틸렌 다이아민을 혼합하여 양이온성 젤라틴을 얻는 단계;Another aspect is a step of mixing gelatin and ethylene diamine to obtain cationic gelatin;
상기 양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 약물 전달용 조성물을 얻는 단계; 및A step of obtaining a composition for drug delivery by mixing the cationic gelatin and alginate; and
상기 약물 전달용 조성물 및 약물을 혼합하여 약학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.The present invention provides a method for producing a pharmaceutical composition, comprising the step of mixing the drug delivery composition and a drug to obtain a pharmaceutical composition.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problems to be solved by the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned can be clearly understood by a person having ordinary skill in the relevant technical field from the description below.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Each description and embodiment disclosed in this application can also be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of various elements disclosed in this application fall within the scope of this application. In addition, the scope of this application cannot be considered limited by the specific description described below.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들이 이하에 정의된다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. For the purposes of this invention, the following terms are defined below.
용어 "한 (a)" 및 "하나 (an)"는, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 하나 이상을 나타낸다.The terms "a" and "an", unless specifically stated otherwise, indicate one or more.
"약"은 기준 분량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 만큼 가변적인 분량, 수준, 값, 수치, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다. 용어 "약"과 함께 사용된 수치의 맥락에서 논의된 임의의 실시예에서, 용어 약은 생략될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다."About" means a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight, or length that is variable by 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1% of a reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight, or length. In any of the embodiments discussed in the context of a numerical value used with the term "about," it is specifically contemplated that the term about may be omitted.
맥락이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위의 전반에서 용어 "포함하다" 및 이의 변형, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하는"은 "포함하지만, 이로 제한되지 않는" 것과 같은 개방형의 포괄적 의미인 것으로 해석되어야 한다.Unless the context requires otherwise, throughout this specification and claims, the term “comprise” and variations thereof, such as “comprises” and “comprising,” are to be construed in their open-ended, inclusive sense, such as “including, but not limited to.”
"이루어진"이란 "이루어진"이라는 구절을 수반하는 모든 것을 포함하고, 이로 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "이루어진"이라는 어구는 열거된 요소가 요구되거나 의무적이고 다른 요소는 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다. "본질적으로 이루어진"이란 이 어구 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하는 것을 의미하고, 열거된 요소에 대해 명세서에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 이에 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 요구되고 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이고 이들이 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라서 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.The phrase "consisting of" means including and limited to everything that follows the phrase "consisting of." Thus, the phrase "consisting of" indicates that the listed elements are required or mandatory and that no other elements may be present. The phrase "consisting essentially of" means including any of the elements listed after the phrase, but limited to other elements that do not interfere with or contribute to the activity or action specified in the specification for the listed elements. Thus, the phrase "consisting essentially of" indicates that the listed elements are required and mandatory, but that other elements are optional and may or may not be present, depending on whether they affect the activity or action of the listed elements.
"감소된" 또는 "줄어든" 또는 "더 적은" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의미한" 양이고, 본원에 기술된 양 또는 수준의 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그보다 적은 (예컨대, 100, 500, 1000배) 감소를 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서 이는 기준 양에 대해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% (그 사이의 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 15%, 26% 등을 포함함)의 감소를 나타낸다.A “decreased” or “reduced” or “lesser” amount is typically a “statistically significant” amount and can include a decrease of about 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, or 50-fold or less (e.g., 100, 500, 1000-fold) from the amount or level described herein. In one embodiment, this represents a reduction of at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% (including all integers and decimals therebetween, e.g., 15%, 26%) relative to a reference amount.
"증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의미한" 양이고, 본원에 기술된 양 또는 수준보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그 이상 더 큰 (예컨대, 100, 500, 1000배) (그 사이 및 1 초과하는 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 등을 포함함) 증가를 포함할 수 있다. 특별 실시예에서, 이는 기준 양에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500%, 또는 적어도 1000% (그 사이의 모든 정수 및 소수점, 예컨대, 15%, 26% 등을 포함함)의 증가를 나타낸다.An “increased” or “enhanced” amount is typically a “statistically significant” amount and can include an increase of at least 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, or 50 times or more (e.g., 100, 500, 1000 times) (including all integers and decimals therebetween and greater than 1, e.g., 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, etc.) over the amounts or levels described herein. In particular embodiments, this represents an increase of at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 150%, at least 200%, at least 500%, or at least 1000% (including all integers and decimals therebetween, e.g., 15%, 26%) relative to a reference amount.
일 양상은 양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 상기 젤라틴의 경우, 고분자 젤라틴 또는 저분자 젤라틴일 수 있다.One aspect provides a drug delivery composition comprising cationic gelatin and alginate. The gelatin may be high molecular weight gelatin or low molecular weight gelatin.
상기 용어 "약물 전달용 조성물"은 콜로이드(Colloids), 하이드로겔(Hydrogels) 및 코아세르베이트(Coacervates) 형태를 갖는 조성물을 의미한다. 또한, 상기 조성물은 액상 뿐만 아니라 분말(동결건조, 분무건조 등)의 형태로도 제조할 수 있다.The above term "drug delivery composition" means a composition in the form of colloids, hydrogels, and coacervates. In addition, the composition can be prepared in the form of not only a liquid but also a powder (lyophilized, spray-dried, etc.).
구체적으로, 상기 고분자 젤라틴은 고분자량 젤라틴 타입 A(High weight gelatin type A)일 수 있으며, 겔 강도가 250 내지 350, 250 내지 300 및 300 내지 350 g 블룸(bloom)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 저분자 젤라틴은 저분자량 젤라틴 타입 A(Low weight gelatin type A)일 수 있으며, 겔 강도가 80 내지 200, 80 내지 175, 80 내지 100, 100 내지 200, 100 내지 175 및 175 내지 200 g 블룸(bloom)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.Specifically, the high molecular weight gelatin may be a high molecular weight gelatin type A and may have a gel strength of at least one selected from the group consisting of 250 to 350, 250 to 300, and 300 to 350 g bloom. The low molecular weight gelatin may be a low molecular weight gelatin type A and may have a gel strength of at least one selected from the group consisting of 80 to 200, 80 to 175, 80 to 100, 100 to 200, 100 to 175, and 175 to 200 g bloom.
상기 양이온성 젤라틴은 젤라틴과 에틸렌 다이아민이 결합된 것일 수 있다. 상기 양이온성 젤라틴 제조시에 사용되는 에틸렌 다이아민(Ethylenediamine, ED)은 젤라틴의 카르복실기(carboxyl group)와 반응하여 젤라틴을 양이온화 시키는 것일 수 있다.The above cationic gelatin may be a combination of gelatin and ethylene diamine. Ethylene diamine (ED) used in the production of the above cationic gelatin may react with a carboxyl group of gelatin to cationize the gelatin.
따라서 에틸렌 다이아민의 몰 비는 젤라틴의 카르복실기를 기준으로 하여 실험을 진행하였고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 젤라틴의 카르복실기에 대한 에틸렌 다이아민의 몰 비는 1:5 내지 1:100, 1:5 내지 1:90, 1:5 내지 1:80, 1:5 내지 1:70, 1:5 내지 1:60, 1:5 내지 1:50, 1:5 내지 1:40, 1:5 내지 1:30, 1:5 내지 1:20 또는 1:5 내지 1:10일 수 있으며, 구체적으로는 1:5 내지 1:100, 1:5 내지 1:50, 1:5 내지 1:25, 1:25 내지 1:100, 1:25 내지 1:50 또는 1:50 내지 1:100일 수 있다.Therefore, the molar ratio of ethylene diamine was tested based on the carboxyl group of gelatin, and is not limited thereto, but the molar ratio of ethylene diamine to the carboxyl group of gelatin may be 1:5 to 1:100, 1:5 to 1:90, 1:5 to 1:80, 1:5 to 1:70, 1:5 to 1:60, 1:5 to 1:50, 1:5 to 1:40, 1:5 to 1:30, 1:5 to 1:20 or 1:5 to 1:10, and specifically, 1:5 to 1:100, 1:5 to 1:50, 1:5 to 1:25, 1:25 to 1:100, 1:25 to 1:50 or 1:50 to 1:100.
또한, 상기 약물 전달용 조성물 내 양이온성 젤라틴 및 알지네이트의 중량비는 이에 제한되는 것은 아니지만, 100:1 내지 200:1, 50:1 내지 150:1, 50:1 내지 140:1, 50:1 내지 130:1, 50:1 내지 120:1, 50:1 내지 110:1, 50:1 내지 100:1, 40:1 내지 100:1, 30:1 내지 100:1, 20:1 내지 100:1, 10:1 내지 100:1, 10:1 내지 80:1, 10:1 내지 70:1, 10:1 내지 60:1, 10:1 내지 50:1, 10:1 내지 40:1, 10:1 내지 30:1, 10:1 내지 20:1 또는 1:0 내지 100:1일 수 있다. 예를 들어, 10:1 내지 50:1, 10:1 내지 40:1, 10:1 내지 30:1, 10:1 내지 20:1, 20:1 내지 50:1, 20:1 내지 40:1, 20:1 내지 30:1, 30:1 내지 50:1, 30:1 내지 40:1 또는 40:1 내지 50:1일 수 있다.In addition, the weight ratio of cationic gelatin and alginate in the drug delivery composition is not limited thereto, but is 100:1 to 200:1, 50:1 to 150:1, 50:1 to 140:1, 50:1 to 130:1, 50:1 to 120:1, 50:1 to 110:1, 50:1 to 100:1, 40:1 to 100:1, 30:1 to 100:1, 20:1 to 100:1, 10:1 to 100:1, 10:1 to 80:1, 10:1 to 70:1, 10:1 to 60:1, 10:1 to 50:1, 10:1 to 40:1, 10:1 to 30:1, It can be 10:1 to 20:1 or 1:0 to 100:1. For example, it can be 10:1 to 50:1, 10:1 to 40:1, 10:1 to 30:1, 10:1 to 20:1, 20:1 to 50:1, 20:1 to 40:1, 20:1 to 30:1, 30:1 to 50:1, 30:1 to 40:1 or 40:1 to 50:1.
또한, 상기 코아세르베이트에 포함되는 고분자(양이온성 고분자 및 알지네이트의 합)의 양은 3 mg 이하인 것일 수 있다.Additionally, the amount of polymer (sum of cationic polymer and alginate) included in the coacervate may be 3 mg or less.
상기 범위 내의 중량비를 가지는 가지는 경우, 가장 작은 크기를 가질 수 있어 전달체로 사용하기에 유리하며, 높은 제타전위를 가질 수 있기에 다수의 코아세르베이트를 용이하게 형성할 수 있다.In the case where the weight ratio is within the above range, it can have the smallest size, which is advantageous for use as a carrier, and can have a high zeta potential, so that a large number of coacervates can be easily formed.
상기와 같은 특정한 조성비를 가지는 코아세르베이트의 경우, 80% 이상의 높은 약물 봉입률을 가지는 바, 다양한 질환에 대한 예방 또는 치료 효과를 갖는 약물 전달체로 활용 가능성이 매우 높다.In the case of coacervate having a specific composition ratio as described above, it has a high drug loading rate of over 80%, so it has a very high possibility of being utilized as a drug delivery vehicle having preventive or therapeutic effects on various diseases.
상기 약물 전달용 조성물은 약물을 더 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 약물은 화합물, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.The above drug delivery composition may further comprise a drug. Specifically, the drug may be at least one selected from the group consisting of compounds, polynucleotides, and polypeptides.
상기 화합물은 5-아미노살리실레이트(5-Aminosalicylic acid, 5-ASA), 히알루론산(Hyaluronic acid), 아스코르브산 (ascorbic acid), 알렌드로네이트 (alendronate), 비오틴(Biotin), 안토시아닌(Anthocyanin), 아피제닌(Apigenin), 아데노신(adenosine), 비타민 C, 알부틴(arbutin), 누룩산(kojic acid), 젖산 나트륨(sodium lactate), 소듐 피롤리돈(sodium pyrrolidone), 카복실산(Carboxilic acid) 및 나이아신아마이드(Niacinamide)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.The above compound may be at least one selected from the group consisting of 5-aminosalicylate (5-ASA), hyaluronic acid, ascorbic acid, alendronate, biotin, anthocyanin, apigenin, adenosine, vitamin C, arbutin, kojic acid, sodium lactate, sodium pyrrolidone, carboxylic acid, and niacinamide.
상기 폴리펩타이드는 아미노산, 항체, 에피토프, 단백질, 재조합 단백질, 융합 단백질 등일 수 있으며, 구체적으로, 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 인슐린(Insulin), GLP-1(Glucagon-Like Peptide-1), 혈소판 유래 성장인자(Platelet Derived Growth Factor, PDGF), 아르기닌(Arginine) 및 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.The above polypeptide may be an amino acid, an antibody, an epitope, a protein, a recombinant protein, a fusion protein, etc., and specifically, may be at least one selected from the group consisting of Fibroblast Growth Factor (FGF), Insulin, Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1), Platelet Derived Growth Factor (PDGF), Arginine, and Epidermal Growth Factor (EGF).
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, miRNA(micro RNA), siRNA(small interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임 (ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme)등 일 수 있으며, 구체적으로, 상기 miRNA는 miRNA-497, miRNA-145, miRNA-143, miRNA-34a, miRNA-33a, miRNA-29b, miRNA-16 및 miRNA-7로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 miRNA는 miRNA-497 일 수 있으며, 상기 miRNA-497은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것 일 수 있다. 또한, 상기 siRNA는 IL-13(Interleukin-13) 발현을 억제하는 siRNA, IL-6(Interleukin-6) 발현을 억제하는 siRNA, TNFα 발현을 억제하는 siRNA, Braf(Serine/threonine-protein kinase) 발현을 억제하는 siRNA, Akt(AKT Serine/Threonine Kinase 1) 발현을 억제하는 siRNA, Hsp27(Heat shock protein 27) 발현을 억제하는 siRNA, CD44 발현을 억제하는 siRNA, P-glycoprotein 발현을 억제하는 siRNA, VEGF(Vascular endothelial growth factor) 발현을 억제하는 siRNA 및 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 발현을 억제하는 siRNA로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 siRNA는 IL-6 발현을 억제하는 siRNA일 수 있다.The above polynucleotide may be RNA, DNA, miRNA (micro RNA), siRNA (small interfering RNA), aptamer, antisense oligodeoxynucleotide (ODN), antisense RNA, ribozyme, DNAzyme, etc., and specifically, the miRNA may be at least one selected from the group consisting of miRNA-497, miRNA-145, miRNA-143, miRNA-34a, miRNA-33a, miRNA-29b, miRNA-16, and miRNA-7, and more specifically, the miRNA may be miRNA-497, and the miRNA-497 may be composed of a polynucleotide consisting of a base sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. In addition, the siRNA may be at least one selected from the group consisting of siRNA that suppresses IL-13 (Interleukin-13) expression, siRNA that suppresses IL-6 (Interleukin-6) expression, siRNA that suppresses TNFα expression, siRNA that suppresses Braf (Serine/threonine-protein kinase) expression, siRNA that suppresses Akt (AKT Serine/Threonine Kinase 1) expression, siRNA that suppresses Hsp27 (Heat shock protein 27) expression, siRNA that suppresses CD44 expression, siRNA that suppresses P-glycoprotein expression, siRNA that suppresses VEGF (Vascular endothelial growth factor) expression, and siRNA that suppresses STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) expression, and more specifically, the siRNA may be siRNA that suppresses IL-6 expression.
상기 약물은 암, 바이러스 감염증, 자가면역질환, 대사질환, 심혈관질환, 당뇨병, 염증질환, 상처(열상, 찰과상, 족부궤양 등) 및 유전병으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질병을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.The above drug may prevent or treat one or more diseases selected from the group consisting of cancer, viral infection, autoimmune disease, metabolic disease, cardiovascular disease, diabetes, inflammatory disease, wounds (burns, abrasions, foot ulcers, etc.), and genetic diseases.
다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트(5-Aminosalicylic acid, 5-ASA), 비오틴(Biotin), 아르기닌(Arginine), 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF) 및 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor, FGF)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for wound healing comprising cationic gelatin; alginate; and at least one selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate (5-ASA), biotin, arginine, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor (PDGF) and fibroblast growth factor (FGF).
상기 조성물은 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 상피세포성장인자를 더 포함하는 조성물의 경우, 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 비오틴, 아르기닌, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자)만 포함하는 조성물에 비해, 현저한 수준의 상처치료 효과가 발생함을 확인하였다. 또한, 상기 조성물은 전달체로서, 상처치료 효과를 나타내는 물질의 경우 제한없이 추가로 포함할 수 있다.The composition may further include Epidermal Growth Factor (EGF). In the case of a composition further including the epidermal growth factor, it was confirmed that a significant level of wound healing effect occurred compared to a composition including only drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, biotin, arginine, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor). In addition, the composition may additionally include, without limitation, a substance exhibiting a wound healing effect as a carrier.
상기 상처는 절개, 외상, 화상 등으로 피부가 손상된 상태를 의미하며, 절상, 화상, 찰과상, 자상, 열상, 욕창, 타박상 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 당뇨병 환자에 발생한 당뇨성 족부궤양일 수 있다.The above wound refers to a condition in which the skin is damaged by incision, trauma, burn, etc., and may include cuts, burns, abrasions, lacerations, lacerations, bedsores, contusions, etc., and is not limited to these, but may be a diabetic foot ulcer in a diabetic patient.
또 다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌(Anthocyanin), 아피제닌(Apigenin), 나이아신아마이드(Niacinamide), 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, comprising cationic gelatin; alginate; and at least one selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, Anthocyanin, Apigenin, Niacinamide, Epidermal Growth Factor, Platelet-Derived Growth Factor and Fibroblast Growth Factor.
본 명세서에 사용된 용어 “염증성 질환”의 용어 "염증(inflammation)"은 생체 조직의 유해한 자극원, 예를 들어 병원성 미생물, 손상된 세포, 자극물질 등에 대한 생체 반응 중 하나이다. 염증은 미생물에 의한 감염 또는 상처, 수술, 화상, 동상, 전기자극, 화학물질 등 다양한 원인에 의하여 발생할 수 있다. 상기 염증성 질환은 염증을 주요 병변으로 수반하는 질환을 말한다. 상기 염증성 질환은 예를 들어, 패혈증, 위염, 장염, 신장염, 간염, 만성 폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease: COPD), 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 세균 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글란딘 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 및 습진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.The term "inflammation" of the term "inflammatory disease" used in this specification is one of the biological responses to harmful stimuli of biological tissues, such as pathogenic microorganisms, damaged cells, and irritants. Inflammation can be caused by various causes, such as infection by microorganisms or wounds, surgery, burns, frostbite, electrical stimulation, and chemicals. The inflammatory disease refers to a disease that accompanies inflammation as a main lesion. The inflammatory disease may be selected from the group consisting of, for example, sepsis, gastritis, enteritis, nephritis, hepatitis, Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD), pulmonary fibrosis, irritable bowel syndrome, inflammatory pain, migraine, headache, back pain, fibromyalgia, myofascial disease, viral infection, bacterial infection, fungal infection, burns, wounds due to surgical or dental work, prostaglandin hyperactivity syndrome, atherosclerosis, gout, Hodgkin's disease, pancreatitis, conjunctivitis, iritis, scleritis, uveitis, and eczema.
본 명세서에서 용어, "항염증"이란 염증 유도된 세포에서의 염증유도 인자(pro-inflammatory factor)의 조절 및 염증 억제 인자(anti-inflammatory factor)의 조절 효능 여부를 통해 염증 유도를 방지하거나, 염증 억제를 증진시키는 것을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 항염증용 조성물을 처리하는 경우, 염증성 인자인 TNF-α, IL-1b 및 IL-6의 발현 수준이 감소되는 것을 확인하였다.The term "anti-inflammatory" as used herein includes preventing inflammation induction or promoting inflammation inhibition through the regulation of pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors in cells where inflammation is induced. In one embodiment, when the anti-inflammatory composition is treated, it was confirmed that the expression levels of inflammatory factors, TNF-α, IL-1b and IL-6, were reduced.
상기 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.The above term "prevention" refers to any action that inhibits the occurrence of an inflammatory disease or delays its onset by administering the above pharmaceutical composition. The above term "treatment" refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of an inflammatory disease by administering the above pharmaceutical composition.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제, 동결보호제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 트레할로즈, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition may comprise a pharmaceutically acceptable carrier. The carrier is used to mean an excipient, a diluent, a cryoprotectant or an adjuvant. The carrier may be selected from the group consisting of, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, trehalose, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, saline, a buffer such as PBS, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. The composition may comprise fillers, anticoagulants, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, preservatives, or a combination thereof.
상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예를 들면, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형, 피부도포 제형 또는 국소 제형으로 제조될 수 있다.The pharmaceutical composition described above can be prepared in any dosage form according to a conventional method. The composition can be formulated, for example, as an oral dosage form (e.g., powder, tablet, capsule, syrup, pill, or granule) or a parenteral dosage form (e.g., injection). In addition, the composition can be prepared as a systemic dosage form, a skin application dosage form, or a topical dosage form.
상기 약학적 조성물은 일 양상에 따른 조성물 및 약학적으로 허용가능한 염을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.5 ㎍ 내지 약 2 g, 약 1 ㎍ 내지 약 1 g, 약 10 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 100 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 50 mg일 수 있다.The pharmaceutical composition may contain an effective amount of the composition according to one aspect and a pharmaceutically acceptable salt. The term "effective amount" refers to an amount sufficient to exhibit a preventive or therapeutic effect when administered to a subject in need of prevention or treatment. The effective amount may be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the subject. It may be determined according to factors including the severity of the disease, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the excretion rate, the duration of treatment, drugs used in combination or simultaneously with the composition used, and other factors well known in the medical field. The effective amount may be about 0.5 ㎍ to about 2 g, about 1 ㎍ to about 1 g, about 10 ㎍ to about 500 mg, about 100 ㎍ to about 100 mg, or about 1 mg to about 50 mg per pharmaceutical composition.
상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered in a conventional manner via oral, transdermal, subcutaneous, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, topical, or intradermal routes. The dosage of the pharmaceutical composition may be, for example, in the range of about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg, about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg, or about 0.1 mg/kg to about 1 mg/kg on an adult basis. The administration may be once a day, multiple times a day, or once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks to once a year.
상기 조성물은 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor)를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 상피세포성장인자를 더 포함하는 조성물의 경우, 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌(Anthocyanin), 아피제닌(Apigenin), 나이아신아마이드(Niacinamide), 혈소판 유래 성장인자 및 섬유아세포성장인자)만 포함하는 조성물에 비해, 현저한 수준의 항염증 효과가 발생함을 확인하였다. 또한, 상기 조성물은 전달체로서, 항염증 효과를 나타내는 물질의 경우 제한없이 추가로 포함할 수 있다.The composition may further comprise an Epidermal Growth Factor. In the case of a composition further comprising an Epidermal Growth Factor, it was confirmed that a significant level of anti-inflammatory effect occurred compared to a composition comprising only drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, Anthocyanin, Apigenin, Niacinamide, Platelet-derived Growth Factor, and Fibroblast Growth Factor). In addition, the composition may additionally comprise, without limitation, a substance exhibiting an anti-inflammatory effect as a carrier.
또 다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.Another aspect provides a method of preventing or treating an inflammatory disease, comprising administering to a subject the pharmaceutical composition.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 염증성 질환을 앓거나 앓을 위험이 있는 것일 수 있다.The subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat. The subject may be suffering from or at risk of suffering from an inflammatory disease.
투여 방법은 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 투여 방법은 예를 들어, 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal), 또는 피내 경로일 수 있다. 상기 조성물은 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다.The route of administration may be oral or parenteral. The route of administration may be, for example, oral, transdermal, subcutaneous, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, topical, intranasal, intratracheal, or intradermal. The composition may be administered systemically or locally, and may be administered alone or in combination with other pharmaceutically active compounds.
상기 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.The dosage may range, for example, from about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg, from about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg, or from about 0.1 mg/kg to about 1 mg/kg on an adult basis. The administration may be once daily, multiple times daily, or once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks, or once a year.
또 다른 양상은 상기 약학적 조성물의 염증성 질환 치료 용도를 제공한다.Another aspect provides a use of the pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases.
또 다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.Another aspect provides a health functional food for preventing or improving inflammatory diseases, comprising at least one selected from the group consisting of cationic gelatin; alginate; and miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor.
상기 "양이온성 젤라틴", "알지네이트", "염증성 질환", "염증", "예방", "개선", "건강기능식품" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.The above “cationic gelatin”, “alginate”, “inflammatory disease”, “inflammation”, “prevention”, “improvement”, “health functional food”, etc. may be within the above-mentioned scope.
용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 염증성 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질병의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.The term "improvement" may mean any action that at least reduces a parameter related to the condition being treated, for example, the degree of symptoms. In this case, the health functional food may be used before or after the onset of the disease, simultaneously with or separately from a drug for treatment, for the purpose of preventing or improving an inflammatory disease.
용어 "건강기능(성)식품(functional food)"이란 특정 보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.The term "functional food" is the same as food for special health use (FoSHU), and refers to food with high medical and healthcare effects that is processed to efficiently exhibit bioregulatory functions in addition to providing nutrition. "Functionality" here means obtaining useful effects for health purposes, such as regulating nutrients or physiological functions for the structure and function of the human body.
또한, "건강식품(health food)"이란 일반식품에 비해 적극적인 건강 유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, "건강보조식품(health supplement food)"이란 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 상기 "건강기능식품"은 건강기능식품, 건강식품 및 건강보조식품을 포함한다.In addition, "health food" means food that has a more active health maintenance or promotion effect than general food, and "health supplement food" means food for health supplement purposes. The above "health functional food" includes health functional food, health food, and health supplement food.
상기 건강기능식품에서, 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합되어 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 상기 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약물은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.In the above health functional food, the cationic gelatin; alginate; and at least one drug selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor may be added to the food as is or mixed with other foods or food ingredients and may be used appropriately according to a conventional method. The mixing amount of the cationic gelatin; alginate; and at least one drug selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor may be appropriately determined depending on the intended use (prevention or improvement). In general, when manufacturing a food or beverage, the cationic gelatin; alginate; And at least one drug selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor may be added to the raw material in an amount of specifically about 15 wt% or less, more specifically about 10 wt% or less. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health regulation, the amount may be below the above range.
상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.The above health functional food may be formulated as one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules, and liquid formulations, and may further include one or more of a carrier, a diluent, an excipient, and an additive. Foods to which the compound according to one aspect may be added include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, beverages, gum, tea, vitamin complexes, and health functional foods.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 일 수 있다.Specific examples of the carrier, excipient, diluent and additive may include at least one selected from the group consisting of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, erythritol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, water, sugar syrup, methylcellulose, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
상기 건강기능식품은 상기 양이온성 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약물을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.The above health functional food, in addition to containing one or more drugs selected from the group consisting of the cationic cationic gelatin; alginate; and miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor, may contain other ingredients as essential ingredients without special limitations. For example, it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like a typical beverage. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates may include typical sugars such as monosaccharides, such as glucose, fructose, etc.; disaccharides, such as maltose, sucrose, etc.; and polysaccharides, such as dextrin, cyclodextrin, etc., and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. In addition to the flavoring agents described above, natural flavoring agents (thaumatin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The ratio of the natural carbohydrates can be appropriately determined by a person skilled in the art.
상기 외에도 일 양상에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.In addition to the above, health functional foods according to the aspect may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc. These ingredients may be used independently or in combination, and the ratio of these additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
또 다른 양상은 양이온성 젤라틴; 알지네이트; 및 miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트, 안토시아닌, 아피제닌, 나이아신아마이드, 상피세포성장인자, 혈소판 유래 성장 인자 및 섬유아세포성장인자로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.Another aspect provides an anti-inflammatory cosmetic composition comprising cationic gelatin; alginate; and at least one selected from the group consisting of miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, anthocyanin, apigenin, niacinamide, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, and fibroblast growth factor.
상기 "양이온성 젤라틴", "알지네이트", "염증성 질환", "염증", "화장료 조성물" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.The above “cationic gelatin”, “alginate”, “inflammatory disease”, “inflammation”, “cosmetic composition”, etc. may be within the above-mentioned range.
상기 화장료 조성물은 본 명세서에 개시된 약물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 기능성 첨가물 등을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 분산제, 점증제, 방부제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제, 그리고 화장품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.The above cosmetic composition may additionally contain, in addition to the drug disclosed herein, ingredients commonly used in cosmetic compositions, functional additives, etc., and may contain, for example, conventional auxiliary agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, surfactants, dispersants, thickeners, preservatives, vitamins, pigments, fragrances, etc., and cosmetically acceptable carriers.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 화장료 조성물은 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 앰플, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 파운데이션, 립스틱, 마스카라, 또는 메이크업 베이스일 수 있다.The cosmetic composition may be prepared in any formulation that is commonly prepared. For example, the cosmetic composition may be a toner, a cream, an essence, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, an ampoule, a body lotion, a body oil, a body gel, a shampoo, a rinse, a hair conditioner, a hair gel, a foundation, a lipstick, a mascara, or a makeup base.
또 다른 양상은 젤라틴 및 에틸렌 다이아민을 혼합하여 양이온성 젤라틴을 얻는 단계; 및Another aspect is a step of mixing gelatin and ethylene diamine to obtain cationic gelatin; and
상기 양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 약물 전달용 조성물을 얻는 단계를 포함하는 약물 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.A method for producing a drug delivery composition is provided, comprising the step of mixing the cationic gelatin and alginate to obtain a drug delivery composition.
상기 "젤라틴", "에틸렌 다이아민" "양이온성 젤라틴", "알지네이트" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.The above “gelatin”, “ethylene diamine”, “cationic gelatin”, “alginate”, etc. may be within the above-mentioned range.
상기 제조방법은 상기 약물 전달용 조성물을 건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.The above manufacturing method may further include a step of drying the drug delivery composition.
용어 "건조"는 동결건조, 감압건조, 분무건조 등을 포함한다.The term "drying" includes freeze drying, reduced pressure drying, spray drying, etc.
또 다른 양상은 젤라틴 및 에틸렌 다이아민을 혼합하여 양이온성 젤라틴을 얻는 단계; 및Another aspect is a step of mixing gelatin and ethylene diamine to obtain cationic gelatin; and
상기 양이온성 젤라틴, 알지네이트 및 약물을 혼합하여 약학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.A method for preparing a pharmaceutical composition is provided, comprising the step of mixing the cationic gelatin, alginate, and a drug to obtain a pharmaceutical composition.
상기 "젤라틴", "에틸렌 다이아민" "양이온성 젤라틴", "알지네이트" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.The above “gelatin”, “ethylene diamine”, “cationic gelatin”, “alginate”, etc. may be within the above-mentioned range.
상기 제조방법은 상기 약학적 조성물을 건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.The above manufacturing method may further include a step of drying the pharmaceutical composition.
또 다른 양상은 젤라틴 및 에틸렌 다이아민을 혼합하여 양이온성 젤라틴을 얻는 단계;Another aspect is a step of mixing gelatin and ethylene diamine to obtain cationic gelatin;
상기 양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 약물 전달용 조성물을 얻는 단계; 및A step of obtaining a composition for drug delivery by mixing the cationic gelatin and alginate; and
상기 약물 전달용 조성물 및 약물을 혼합하여 약학적 조성물을 얻는 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.A method for producing a pharmaceutical composition is provided, comprising the step of mixing the drug delivery composition and the drug to obtain a pharmaceutical composition.
상기 "젤라틴", "에틸렌 다이아민" "양이온성 젤라틴", "알지네이트" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.The above “gelatin”, “ethylene diamine”, “cationic gelatin”, “alginate”, etc. may be within the above-mentioned range.
상기 제조방법은 상기 약학적 조성물을 건조하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.The above manufacturing method may further include a step of drying the pharmaceutical composition.
본 발명은 양이온성 젤라틴 및 알지네이트를 포함하는 약물 전달용 조성물에 관한 것이다. 일 실시예에 따른 양이온성 젤라틴, 알지네이트를 포함하는 약물 전달용 조성물은 생체적합성 및 생분해성으로 식품에서 사용될 수 있을 정도의 안전성을 가진 젤라틴을 사용하기에, 세포 독성이 없어 안전성이 뛰어나면서도, 현저한 수준으로 유효성분(화합물, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드)를 대상에 전달할 수 있는 바, 유효성분(화합물, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드)의 전달체로 활용도가 높다.The present invention relates to a drug delivery composition comprising cationic gelatin and alginate. According to one embodiment, a drug delivery composition comprising cationic gelatin and alginate uses gelatin that is safe enough to be used in foods due to its biocompatibility and biodegradability, so it is free of cytotoxicity and thus has excellent safety, while being able to deliver an active ingredient (compound, polynucleotide or polypeptide) to a target at a significant level, and thus has high utility as a delivery vehicle for an active ingredient (compound, polynucleotide or polypeptide).
도 1은 세포주에 miRNA가 봉입된 코아세르베이트(양이온성 젤라틴 대 알지네이트의 중량비는 30: 1)를 처리한 다음, miRNA의 세포내 이동을 확인한 도이다.
도 2는 상기 도 1의 코아세르베이트를 HCT 116 세포주에 처리한 다음, 코아세르베이트의 세포 내 이입을 확인한 도이다.
도 3은 상기 도 1의 코아세르베이트를 HDF 세포주에 처리한 다음, 코아세르베이트의 세포 내 이입을 확인한 도이다.
도 4는 형광물질인 cy5.5를 miRNA 접합시킨 다음 코아세르베이트를 HaCaT 세포에처리했을 때, 세포 내 세포기질(cytosol)에 miRNA 전달 여부를 확인한 도이다.
도 5는 MTT assay 및 PCR 분석을 통해 코아세르베이트의 안전성을 확인한 도이다.
도 6은 세포에 상기 코아세르베이트를 처리했을 때, 염증성 인자의 감소수준을 확인한 도이다.
도 7은 고당의 HDF 세포에 LPS를 처리한 다음, EGF 단일제(EGF coacervate), miRNA 단일제(miRNA coacervate), 복합제(EGF/miRNA coacervate)을 처리한 다음, 염증인자의 수준을 확인한 도이다.
도 8은 당뇨 마우스 모델의 상처에 EGF 단일제(EGF coacervate), miRNA 단일제(miRNA coacervate), 복합제(EGF/miRNA coacervate)을 처리한 다음, 3일자에 상처 회복수준을 확인한 도이다.Figure 1 is a diagram showing the intracellular movement of miRNA after treatment with coacervate (weight ratio of cationic gelatin to alginate is 30:1) containing miRNA in a cell line.
Figure 2 is a diagram showing the intracellular uptake of the coacervate of Figure 1 after treating the HCT 116 cell line.
Figure 3 is a diagram showing the intracellular uptake of the coacervate of Figure 1 after treating the HDF cell line.
Figure 4 shows the results of conjugating the fluorescent material cy5.5 to miRNA and then coacervate it in HaCaT cells.When processed, it was confirmed whether miRNA was delivered to the cytosol within the cell.
Figure 5 is a diagram confirming the safety of coacervate through MTT assay and PCR analysis.
Figure 6 is a diagram confirming the level of reduction in inflammatory factors when cells were treated with the coacervate.
Figure 7 shows the levels of inflammatory factors after LPS treatment in HDF cells at high sugar content, followed by treatment with EGF single agent (EGF coacervate), miRNA single agent (miRNA coacervate), and combination agent (EGF/miRNA coacervate).
Figure 8 shows the level of wound healing after 3 days of treating the wound of a diabetic mouse model with EGF single agent (EGF coacervate), miRNA single agent (miRNA coacervate), and combination agent (EGF/miRNA coacervate).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are intended to exemplify the present invention and the scope of the present invention is not limited to these examples.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 “포함한다(comprise, include)”및/또는 “포함하는(comprising, including)”은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.As used herein, the singular forms include the plural forms unless the context clearly dictates otherwise. Also, as used herein, the words “comprise,” “include,” and/or “comprising,” and “including,” specify the presence of stated features, numbers, steps, operations, elements, elements, and/or groups thereof, but do not preclude the presence or addition of one or more other features, numbers, operations, elements, elements, and/or groups thereof.
실시예Example
실시예 1. 에틸렌다이아민(Ethylenediamine, ED)을 이용한 양이온성 젤라틴 합성Example 1. Synthesis of cationic gelatin using ethylenediamine (ED)
에틸렌다이아민, 촉매제(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC), 고분자 혹은 저분자 젤라틴 1 g을 인산버퍼 100 mL에 녹인 다음, 10 N HCl을 이용하여 pH를 5.0으로 맞춰 주었다. 37℃에서 18시간 동안 섞어준 다음, 실온에서 48시간 동안 물에서 투석을 수행하여, 합성된 양이온성 젤라틴을 수득하였다. 이때 양이온성 젤라틴 합성을 위해 사용된 젤라틴의 카르복실기에 대한 에틸렌 다이아민의 몰비는 1:50이다.Ethylenediamine, a catalyst (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDC), and 1 g of high or low molecular weight gelatin were dissolved in 100 mL of phosphate buffer, and the pH was adjusted to 5.0 using 10 N HCl. After mixing at 37°C for 18 hours, dialysis was performed in water at room temperature for 48 hours to obtain the synthesized cationic gelatin. The molar ratio of ethylenediamine to the carboxyl group of gelatin used for the synthesis of cationic gelatin was 1:50.
합성된 양이온성 젤라틴은 1차 아민(primary amine)과 반응해서 오렌지색을 나타내는 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)를 사용하여 유도체화 하였다. 유도체화된 양이온성 젤라틴을 335 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 합성을 통해 젤라틴의 아민기가 14.3 % 증가됨을 확인하였다.The synthesized cationic gelatin was derivatized using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), which reacts with primary amine to produce an orange color. The absorbance of the derivatized cationic gelatin was measured at a wavelength of 335 nm. As a result, it was confirmed that the amine group of the gelatin increased by 14.3% through the synthesis, as shown in Table 1 below.
또한, 상기 양이온성 젤라틴 및 대조군(native) 젤라틴을 1%의 농도로 pH 10, 10.5, 11, 및 11.5의 용액에 녹인 다음, 제타전위를 측정하여 젤라틴의 등전위점(Isoelectric point, pI)을 확인하였다.In addition, the cationic gelatin and the control (native) gelatin were dissolved in solutions of pH 10, 10.5, 11, and 11.5 at a concentration of 1%, and then the zeta potential was measured to confirm the isoelectric point (pI) of the gelatin.
(겔 90-100g 블룸)Low molecular weight gelatin type A
(Gel 90-100g bloom)
그 결과, 저분자량 젤라틴 타입 A 겔 90-100 g 블룸(low weight gelatin type A)의 경우 pI 값이 8.71에서 10.49로 175 g 블룸의 경우 pI 값이 8.79에서 10.56으로 향상되었고 고분자량 젤라틴 타입 A 겔 300 g 블룸(high weight gelatin type A)의 경우 pI 값이 9.08에서 10.8로 증가됨을 확인하였고, 이 결과로부터 수용액상에서 대조군 젤라틴 대비 합성된 젤라틴에서 양이온이 증가하였음을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the pI value improved from 8.71 to 10.49 for 90-100 g bloom of low weight gelatin type A gel, from 8.79 to 10.56 for 175 g bloom, and from 9.08 to 10.8 for 300 g bloom of high weight gelatin type A gel. From these results, it was confirmed that cations increased in the synthesized gelatin compared to the control gelatin in an aqueous solution.
이에, 합성된 젤라틴이 수용액 상에서 양이온 형태로 존재함을 확인하였으며, 이하 실험은 블룸이 가장 낮은 저분자량 젤라틴 타입 A 겔 90-100 g 블룸)과 가장 높은 고분자량 젤라틴 타입 A 겔 300 g 블룸으로 실험을 진행하였다.Accordingly, it was confirmed that the synthesized gelatin exists in a cationic form in an aqueous solution, and the following experiments were conducted with low molecular weight gelatin type A gel (90-100 g bloom) having the lowest bloom and with high molecular weight gelatin type A gel (300 g bloom) having the highest bloom.
실시예 2. 양이온성 젤라틴 및 알지네이트의 조성비에 따른 특성 확인Example 2. Confirmation of characteristics according to the composition ratio of cationic gelatin and alginate
상기 실시예 1에서 합성한 양이온성 젤라틴과 음이온성 알지네이트(Alginate) 및 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트(5-Aminosalicylic acid, 5-ASA) 및 섬유아세포성장인자)을 혼합한 다음, 양이온성 젤라틴 및 알지네이트의 조성비에 따른 혼탁도를 확인하였다. 사용된 약물 miRNA-497은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 것을 사용하였으며, IL-6 발현을 억제하는 siRNA는 (GenBank accession number: NM_012589)를 사용하였다. 또한, 5-아미노살리실레이트는 Sigma-Aldrich, 섬유아세포성장인자는 차메디텍에서 구매한 것을 사용하였다. 구체적으로 합성된 양이온성 젤라틴과 음이온성 알지네이트 및 상기의 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)을 수용액 상태에서 혼합할 때 정전기적 상호작용으로 코아세르베이트가 형성됨을 확인하기 위해 혼합물을 450 nm 파장에서 흡광도 측정하여 혼탁도를 얻었다. 코아세르베이트의 형성에 양이온성 젤라틴과 음이온성 알지네이트의 조성에 따른 영향을 확인하기 위해 약물의 농도는 100 nM로 고정한 다음, 양이온성 젤라틴과 음이온성 알지네이트의 전체 양을 1, 2, 3 mg으로 조절하면서 혼탁도를 측정하였다.In the above Example 1, the cationic gelatin and anionic alginate and drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate (5-ASA), and fibroblast growth factor) were mixed, and the turbidity according to the composition ratio of the cationic gelatin and alginate was confirmed. The drug miRNA-497 used was composed of the base sequence of sequence number 1 or 2, and the siRNA that inhibits IL-6 expression was (GenBank accession number: NM_012589). In addition, 5-aminosalicylate was purchased from Sigma-Aldrich, and fibroblast growth factor was purchased from Chameditech. To confirm the formation of coacervate by electrostatic interaction when specifically synthesized cationic gelatin, anionic alginate, and the above drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor) are mixed in an aqueous solution, the mixture was measured for absorbance at a wavelength of 450 nm to obtain turbidity. To confirm the effect of the composition of cationic gelatin and anionic alginate on the formation of coacervate, the concentration of the drugs was fixed at 100 nM, and the turbidity was measured while adjusting the total amounts of cationic gelatin and anionic alginate to 1, 2, and 3 mg.
그 결과, 실시예 1에서 합성한 양이온성 젤라틴과 음이온성 알지네이트(Alginate) 및 miRNA-497를 혼합한 경우, 고분자량 젤라틴 타입 A(high weight gelatin type A)이 저분자량 젤라틴 타입 A(low weight gelatin type A) 보다 높은 수준의 혼탁도를 보여주었다. 또한, 두 가지 젤라틴 모두에서 알지네이트의 비율이 작아질수록 혼탁도가 올라가는 경향성을 보여주었으며, 젤라틴과 알지네이트의 비율이 1:0.4 내지 1:0.01일 때, 높은 혼탁도를 보여주었다. 이는 IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자를 봉입한 경우에도 마찬가지 결과를 나타내었다. 다만 고분자(양이온 젤라틴 및 알지네이트의 총합)의 양이 3 mg을 넘어서는 경우 혼탁도를 보이다가 바로 응집이 되는 바, 적절한 전달체로 활용되기에 어렵다고 판단하여, 향후 실험에서 제외하였다.As a result, when the cationic gelatin synthesized in Example 1, anionic alginate, and miRNA-497 were mixed, high weight gelatin type A showed a higher level of turbidity than low weight gelatin type A. In addition, both gelatins showed a tendency for turbidity to increase as the alginate ratio decreased, and high turbidity was shown when the ratio of gelatin to alginate was 1:0.4 to 1:0.01. The same results were shown when siRNA, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor that suppress IL-6 expression were encapsulated. However, when the amount of polymer (total of cationic gelatin and alginate) exceeded 3 mg, turbidity was shown and then immediately aggregated, so it was judged difficult to utilize as a suitable carrier, and thus it was excluded from future experiments.
실시예 3. 최적의 전달체 특성을 가지는 조성물 내 알지네이트의 조성비 확인Example 3. Confirmation of the composition ratio of alginate in a composition having optimal carrier properties
에틸렌 다이아민의 농도를 변화시키면서 양이온화 수준이 상이한 젤라틴을 합성하였다. 그 다음 높은 제타전위 및 작은 크기를 가지는 코아세르베이트가 전달체로 활용되기에 적합하기에, 실시예 2에서 확인한 코아세르베이트가 형성될 수 있는 범위에서 알지네이트(Sodium alginate, SA)의 비율을 달리하면서 제타전위, 코아세르베이트의 크기를 비롯한 특성을 확인하였다. 이 때, 양이온성 젤라틴 및 알지네이트을 혼합하여 반응시킨 코아세르베이트 용액 및 코아세르베이트 용액을 동결건조한 동결건조 코아세르베이트 모두에 대해 특성을 평가하였다.Gelatin with different cationization levels was synthesized by changing the concentration of ethylene diamine. Then, since a coacervate with a high zeta potential and a small size is suitable for use as a carrier, the characteristics including the zeta potential and the size of the coacervate were confirmed by changing the ratio of alginate (sodium alginate, SA) within the range in which the coacervate confirmed in Example 2 could be formed. At this time, the characteristics were evaluated for both a coacervate solution in which cationic gelatin and alginate were mixed and reacted and a freeze-dried coacervate in which the coacervate solution was freeze-dried.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 저분자 젤라틴의 경우, 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 양이 증가함에 따라 양성 제타전위를 나타내기 시작하는 코아세르베이트 조성, 즉, 양이온성 젤라틴에 대한 알지네이트의 조성비가 40:1, 30:1, 20:1 과 10:1로 달라지는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Table 3 below, in the case of low-molecular-weight gelatin, it was confirmed that the coacervate composition, which begins to exhibit a positive zeta potential as the amount of ethylenediamine to gelatin increases, i.e., the composition ratio of alginate to cationic gelatin, changes to 40:1, 30:1, 20:1, and 10:1.
또한, 제타전위는 실시예 1에서 사용한 젤라틴에 대한 에틸렌 다이아민 몰 비를 1:50으로 사용한 경우와 1:25 및 1:5의 몰 비로 에틸렌 다이아민을 사용한 경우는 크게 다르지 않으나 실시예 1의 2배인 1:100의 몰 비로 에틸렌다이아민을 사용한 경우에는 1.71배 정도 증가 확인하였다.In addition, the zeta potential was not significantly different when ethylene diamine was used at a molar ratio of 1:50 to gelatin as used in Example 1 and when ethylene diamine was used at molar ratios of 1:25 and 1:5, but it was confirmed to increase by approximately 1.71 times when ethylene diamine was used at a molar ratio of 1:100, which is twice that of Example 1.
그러나, 코아세르베이트의 크기의 경우 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 비율과 양이온성 젤라틴과 알지네이트의 조성비에 따른 경향성은 관찰되지 않았다. 다만, 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 몰 비가 1:5, 1:25 및 1:100일 때, 양성 제타전위를 나타내는 코아세르베이트 조성 중에서, 젤라틴과 알지네이트의 조성비가 50:1이면 가장 작은 크기를 보여주었으며, 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 몰 비가 1:50(실시예 1)인 경우, 양성 제타전위를 나타내는 코아세르베이트 조성 중에서, 젤라틴과 알지네이트의 조성비가 30:1일 때, 가장 작은 크기를 보임을 확인하였다.However, in the case of the size of the coacervate, no tendency was observed according to the ratio of ethylenediamine to gelatin and the composition ratio of cationic gelatin and alginate. However, when the molar ratios of ethylenediamine to gelatin were 1:5, 1:25, and 1:100, among the coacervate compositions exhibiting a positive zeta potential, the smallest size was observed when the composition ratio of gelatin to alginate was 50:1, and when the molar ratio of ethylenediamine to gelatin was 1:50 (Example 1), among the coacervate compositions exhibiting a positive zeta potential, the smallest size was observed when the composition ratio of gelatin to alginate was 30:1.
하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 고분자 젤라틴의 경우 에틸렌다이아민의 비율 증가와 양성 제타전위를 갖는 코아세르베이트 조성에서 양이온성 젤라틴에 대한 알지네이트의 조성비와의 상관성은 크게 보이지 않았다. 다만 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 비율이 1:5 및 1:25인 경우 양이온성 젤라틴에 대한 알지네이트의 조성비가 20:1부터 코아세르베이트는 양성의 제타전위를 나타내고, 젤라틴과 에틸렌다이아민의 비율이 1:50 및 1:100인 경우는 10:1에서 코아세르베이트는 양성 제타전위를 나타냈다.As shown in Table 4 below, in the case of polymer gelatin, there was no significant correlation between the increase in the ratio of ethylenediamine and the composition ratio of alginate to cationic gelatin in the composition of coacervate having a positive zeta potential. However, when the ratios of ethylenediamine to gelatin were 1:5 and 1:25, the coacervate exhibited a positive zeta potential when the composition ratio of alginate to cationic gelatin was 20:1 or higher, and when the ratios of gelatin and ethylenediamine were 1:50 and 1:100, the coacervate exhibited a positive zeta potential at 10:1.
코아세르베이트의 제타전위 크기 역시 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 양이 1:5 및 1:25인 경우가 1:50 및 1:100를 사용한 경우에 비해 낮고 1:50 및 1:100의 몰 비를 사용한 경우에서는 크게 다르지 않았다.The zeta potential magnitude of coacervate was also lower when the amount of ethylenediamine to gelatin was 1:5 and 1:25 than when 1:50 and 1:100 were used, and there was no significant difference when the molar ratios of 1:50 and 1:100 were used.
또한, 코아세르베이트의 크기의 경우 저분자 젤라틴에서와 같이, 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 비율과 양이온성 젤라틴과 알지네이트의 조성비에 따른 경향성은 관찰되지 않았다. 다만, 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 몰 비가 1:5 및 1:25일 때, 양성 제타전위를 나타내는 코아세르베이트 조성 중에서, 젤라틴과 알지네이트의 조성비가 30:1이면 가장 작은 크기를 보여주었으며, 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 몰 비가 1:50 및 1:100인 경우, 양성 제타전위를 나타내는 코아세르베이트 조성 중에서, 젤라틴과 알지네이트의 조성비가 20:1일 때, 가장 작은 크기를 보임을 확인하였다.In addition, in the case of the size of the coacervate, as in the case of low-molecular-weight gelatin, no tendency was observed according to the ratio of ethylenediamine to gelatin and the composition ratio of cationic gelatin and alginate. However, when the molar ratio of ethylenediamine to gelatin was 1:5 and 1:25, among the coacervate compositions exhibiting a positive zeta potential, the smallest size was observed when the composition ratio of gelatin to alginate was 30:1, and when the molar ratio of ethylenediamine to gelatin was 1:50 and 1:100, among the coacervate compositions exhibiting a positive zeta potential, the smallest size was observed when the composition ratio of gelatin to alginate was 20:1.
상기 코아세르베이트 용액과 같이, 동결건조 코아세르베이트의 경우에도 코아세르베이트 용액과 동일한 크기, PDI 및 제타 전위 특성을 나타냄을 확인하였다.As with the above coacervate solution, it was confirmed that the freeze-dried coacervate exhibited the same size, PDI, and zeta potential characteristics as the coacervate solution.
한편, 용액 코아세르베이트 및 동결건조 코아세르베이트 내 화합물, 단백질, siRNA 및 miRNA의 봉입률을 확인하기 위하여, 코아세르베이트를 원심 분리한 다음, 상층액을 수득하였고, 피코그린(picogreen) 용액을 첨가하였다.Meanwhile, to confirm the encapsulation rate of compounds, proteins, siRNA and miRNA in the solution coacervate and lyophilized coacervate, the coacervate was centrifuged, the supernatant was obtained, and picogreen solution was added.
형광 분광 광도계를 이용하여 488 nm과 520 nm에서 흡광도를 측정한 후 그 결과로부터 봉입된 miRNA(miRNA-497)의 농도를 정량하였다. 그 결과, 하기 miRNA-497를 봉입한 코아세르베이트의 봉입률을 나타낸 표 5 및 IL-6을 발현을 억제하는하는 siRNA를 봉입한 코아세르베이트의 봉입률을 나타낸 표 6에 나타낸 바와 같이, 대부분의 조성에서 80% 이상의 우수한 봉입률을 가짐을 확인하였다. 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자의 경우에도 siRNA 및 miRNA와 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 용액 및 동결건조 코아세르베이트 형태 간 봉입률에 있어서도 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.The absorbance was measured at 488 nm and 520 nm using a fluorescence spectrophotometer, and the concentration of the encapsulated miRNA (miRNA-497) was quantified from the results. As a result, as shown in Table 5 showing the encapsulation rate of the coacervate encapsulating the miRNA-497 below and Table 6 showing the encapsulation rate of the coacervate encapsulating siRNA that inhibits IL-6 expression, it was confirmed that most compositions had an excellent encapsulation rate of over 80%. It was also confirmed that 5-aminosalicylate and fibroblast growth factor showed similar results to siRNA and miRNA. In addition, it was confirmed that similar results were shown in the encapsulation rates between the solution and lyophilized coacervate forms.
HWCG/ED(mol/mol)LWCG/ED(mol/mol)
HWCG/ED(mol/mol)
HWCG/ED(mol/mol)LWCG/ED(mol/mol)
HWCG/ED(mol/mol)
실시예 4. 코아세르베이트 처리에 따른 miRNA의 세포내 전달 여부 확인Example 4. Confirmation of intracellular delivery of miRNA according to coacervate treatment
상기 실시예 3에서 확보한 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)을 봉입한 최적의 조성비를 가지는 구성 중, 양이온성 젤라틴에 대한 에틸렌다이아민의 비율이 실시예 1에서 사용한 양(1:50)이고, 젤라틴과 알지네이트의 중량비가 30:1인 코아세르베이트를 피부 상피 세포주(HaCaT)에 처리하였다. HaCaT는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가하여 배양하였다. 배지는 이틀마다 교체하였고 세포를 키우는 배양기는 37 ℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 세포는 6 well plate에 1.5 × 105 개의 세포를 배양한 다음, miRNA-497 mimic을 처리하였다. 6시간이 경과한 다음, 세포를 trizol®을 첨가하였고, total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA을 cDNA로 합성 후 primer를 추가하여 qRT-PCR을 분석을 수행하였다. 세포 내 증가된 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)의 양을 측정하여 세포내 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)의 형질감염 효율성(transfection efficiency)을 확인하였다.Among the compositions having the optimal composition ratio encapsulating the drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor) obtained in the above Example 3, the coacervate having the ratio of ethylenediamine to cationic gelatin being the amount used in Example 1 (1:50) and the weight ratio of gelatin to alginate being 30:1 was treated to a skin epithelial cell line (HaCaT). HaCaT was cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin. The medium was changed every two days, and the cells were cultured under the conditions of 37°C and 5%CO2 in an incubator. The cells were cultured at 1.5 × 105 cells in a 6-well plate, and then treated with miRNA-497 mimic. After 6 hours, trizol® was added to the cells, and total RNA was extracted. The extracted total RNA was synthesized into cDNA, and qRT-PCR analysis was performed by adding primers. The amount of intracellular increased drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor) was measured to confirm the transfection efficiency of intracellular drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor).
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 선정된 최적의 조성의 후보군인 LWCG/ED이 1:5일 때, LWCG/SA이 50:1, LWCG/ED이 1:25일 때, LWCG/SA이 40:1 및 50:1, LWCG/ED이 1:50일 때, LWCG/SA이 30:1, LWCG/ED이 1:100일 때, LWCG/SA이 20:1 내지 50:1인 경우와 HWCG/ED이 1:5일 때, HWCG/SA이 30:1 및 40:1, HWCG/ED이 1:25일 때, HWCG/SA이 30:1 및 40:1, HWCG/ED이 1:50일 때, HWCG/SA이 20:1 및 30:1, HWCG/ED이 1:100일 때, HWCG/SA이 20:1 및 30:1인 경우는 모두 약 4배 또는 그 이상의 형질감염 효율성을 나타냈으며 높은 양이온성 젤라틴으로 형성된 코아세르베이트에서 가장 높은 형질감염 효율성이 확인되었다. 다만, 너무 높은 양성 제타전위를 나타내는 코아세르베이트는 세포가 사멸됨이 관찰되었는 바, 세포내 독성이 있음을 확인하였고, 제타전위가 30 mV를 초과하는 경우(LWCG/ED이 1:100일 때, LWCG/SA이 30:1 내지 50:1)는 이후 실험에서 제외하였다.As a result, as shown in Fig. 1, the candidates for the selected optimal composition are LWCG/ED when 1:5, LWCG/SA when 50:1, LWCG/ED when 1:25, LWCG/SA when 40:1 and 50:1, LWCG/ED when 1:50, LWCG/SA when 30:1, LWCG/ED when 1:100, LWCG/SA when 20:1 to 50:1, and HWCG/ED when 1:5, HWCG/SA when 30:1 and 40:1, HWCG/ED when 1:25, HWCG/SA when 30:1 and 40:1, HWCG/ED when 1:50, HWCG/SA when 20:1 and 30:1, HWCG/ED when 1:100. When HWCG/SA was 20:1 and 30:1, both showed transfection efficiencies of about 4 times or more, and the highest transfection efficiency was confirmed in the coacervate formed with high cationic gelatin. However, it was confirmed that the coacervate showing too high a positive zeta potential had intracellular toxicity as it was observed that cells died, and cases where the zeta potential exceeded 30 mV (when LWCG/ED was 1:100 and LWCG/SA was 30:1 to 50:1) were excluded from subsequent experiments.
실시예 5. 최적의 조성비를 가진 코아세르베이트의 유효성분의 세포 내 전달 효율 확인Example 5. Confirmation of intracellular delivery efficiency of effective ingredients of coacervate with optimal composition ratio
상기 실시예 4에서 확인한 최적의 조성비를 가진 코아세르베이트들을 현재 상업적으로 판매되고 있는 전달체인 jetPRIME과 비교하는 실험을 수행하였다. 구체적으로, 코아세르베이트 및 jetPRIME에 봉입된 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)을 인간 대장암 세포주(Human colon cancer, HCT 116) 및 인간 피부 섬유아세포주(Human dermal fibroblast cells, HDF)에 처리하였다. HCT116의 경우 RPMI 배지에 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가하여 배양하였고 HDF는 DMEM 배지에 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가하여 배양하였다. 배지는 이틀마다 교체하였고 세포를 키우는 배양기는 37 ℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다.또한, 약물의 세포 내 전달을 이미지화 하기위해 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 통해 세포 내 약물 전달을 확인하였다. 구체적으로, 코아세르베이트에 봉입된 Cy5.5로 표지된 miRNA-497을 HaCaT에 투여 후, 공초점 주사 현미경(Confocal microscopy로 2, 6, 14 및 48 시간 경과 후의 세포 내 유효성분 전달을 확인하였다.An experiment was conducted to compare the coacervates having the optimal composition ratio confirmed in Example 4 with jetPRIME, a commercially available carrier. Specifically, drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor) loaded in the coacervates and jetPRIME were treated to human colon cancer cell lines (HCT 116) and human dermal fibroblast cells (HDF). HCT116 was cultured in RPMI medium supplemented with 10% FBS and 1% penicillin-streptomycin, and HDF was cultured in DMEM medium supplemented with 1% penicillin-streptomycin. The medium was replaced every two days, and the cells were cultured in an incubator at 37°C and 5%CO2 .In addition, intracellular drug delivery was confirmed by confocal microscopy to image the intracellular drug delivery. Specifically, after administration of Cy5.5-labeled miRNA-497 encapsulated in coacervate to HaCaT, intracellular active ingredient delivery was confirmed after 2, 6, 14, and 48 hours by confocal microscopy.
그 결과 HCT 116에 대한 결과를 나타낸 도 2 및 HDF에 대한 결과를 나타내는 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 양전하성 젤라틴 조성에 대한 알지네이트의 비율이 30:1인 코아세르베이트(이하, 실시예 1 조성 코아세르베이트)에 의한 miRNA-497의 세포 내 전달 효율은 HCT 116 및 HDF 세포주 모두에서 기존 전달체(jetPRIME) 대비 각각 약 1.5 배 및 약 2배 가량 증가하였다. 또한, 실시예 1 조성 코아세르베이트 이외의 상기 실시예 4에서 확인한 최적의 조성비를 가진 코아세르베이트들 모두 HCT 116 및 HDF 세포주 각각에 대해 jetPRIME 대비 최소 약 1.1배 이상의 세포 내 전달 효율을 나타냈으며, 이는 IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자를 봉입한 경우에서도 동일한 결과를 나타내었다.As a result, as shown in Fig. 2 showing the results for HCT 116 and Fig. 3 showing the results for HDF, the intracellular delivery efficiency of miRNA-497 by the coacervate having a ratio of alginate to the positively charged gelatin composition of Example 1 of 30:1 (hereinafter, “the coacervate of the composition of Example 1”) increased by about 1.5 times and about 2 times, respectively, compared to the existing carrier (jetPRIME), in both HCT 116 and HDF cell lines. In addition, all of the coacervates having the optimal composition ratio confirmed in Example 4 other than the coacervate of the composition of Example 1 showed an intracellular delivery efficiency that was at least about 1.1 times higher than jetPRIME, in both HCT 116 and HDF cell lines, respectively, and this result was the same when siRNA, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor that suppress IL-6 expression were encapsulated.
도 4에 나타낸 바와 같이, 공초점 현미경 결과 또한 코아세르베이트에 봉입된 Cy5.5로 labeling 된 miRNA-497이 세포 내에 효과적으로 전달되었고, 48시간까지 분해되지 않고, 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다.As shown in Fig. 4, the confocal microscopy results also confirmed that the Cy5.5-labeled miRNA-497 encapsulated in the coacervate was effectively delivered into the cells and was stably maintained without degradation for up to 48 hours.
또한, 형질감염 효율에 있어서, 용액 코아세르베이트 및 동결건조 코아세르베이트 모두에서 유의적인 차이 없이 유사한 결과를 나타낸 바, 동결건조하여도 전달체의 특성(크기, PDI, 제타전위 및 봉입률)이 용액상과 동일하며, 전달체로서의 기능(유효성분의 세포 내 전달 효율)도 유지됨을 확인하였다.In addition, in terms of transfection efficiency, both the solution coacervate and the freeze-dried coacervate showed similar results without significant differences, confirming that the characteristics of the carrier (size, PDI, zeta potential, and encapsulation rate) are the same as those of the solution phase even when freeze-dried, and that the function as a carrier (intracellular delivery efficiency of the active ingredient) is also maintained.
이에 기존 전달체보다 우수한 유효성분의 세포 내 전달 효과를 가져 기존의 제형을 대체할 수 있으며, 용액 형태의 코아세르베이트 뿐만 아니라 동결건조 등을 통해 분말화된 코아세르베이트 또한 전달체로서의 효능이 유지되는 바, 분말 형태로도 적용될 수 있음을 확인하였다.Accordingly, it has a superior intracellular delivery effect of effective ingredients than existing carriers, and can replace existing formulations. It was confirmed that not only the coacervate in solution form but also the coacervate powdered through freeze-drying, etc. maintains its efficacy as a carrier, and thus it can be applied in powder form as well.
또한, 세포 독성을 확인하기 위하여, 96 well plate에 HaCaT 세포를 5 × 103개로 분주한 후, 코아세르베이트, 리포펙타민(lipofectamine) 및 JetPRIME(PEI)에 봉입된 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)을 24, 48, 72시간 처리 후 시약을 이용하여 MTT assay를 측정하였다.In addition, to confirm cytotoxicity, HaCaT cells were seeded at 5 × 103 in a 96-well plate, and then treated with drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor) encapsulated in coacervate, lipofectamine, and JetPRIME (PEI) for 24, 48, and 72 hours, and then the MTT assay was measured using the reagent.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, miRNA-497 mimic를 봉입한 실시예 1 조성 코아세르베이트은 대조군과 유사한 수준의 세포 독성을 보여주었으며, 기존에 사용되던 전달체인 리포펙틴 및 jetPEI보다 2배 수준의 안전성을 보여주었다. 또한, 실시예 1 조성 코아세르베이트 이외의 상기 실시예 4에서 확인한 최적의 조성비를 가진 코아세르베이트들 모두 기존에 사용되던 전달체인 리포펙틴 및 jetPEI보다 높은 안전성을 보여주었다. 이는 IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자를 봉입한 경우에서도 동일한 결과를 나타내었다.As a result, as shown in Fig. 5, the coacervate of Example 1 encapsulating miRNA-497 mimic showed a similar level of cytotoxicity to the control group, and showed a safety level twice that of the previously used carriers, lipofectin and jetPEI. In addition, all of the coacervates with the optimal composition ratio confirmed in Example 4 other than the coacervate of Example 1 showed higher safety than the previously used carriers, lipofectin and jetPEI. The same results were shown in the case of encapsulating siRNA, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor that inhibit IL-6 expression.
상기와 같은 결과를 통해 일 실시예의 코아세르베이트는 안전성은 높으면서도 miRNA 전달 수준은 기존 전달체 이상일 수 있음을 확인하였다.Through the above results, it was confirmed that the coacervate of one embodiment has high safety while delivering miRNA at a level higher than that of existing delivery vehicles.
실시예 6. siRNA 또는 miRNA 봉입한 코아세르베이트의 처리에 따른 항염증 효과 확인Example 6. Confirmation of anti-inflammatory effect by treatment with coacervate loaded with siRNA or miRNA
상기 실시예 4에서 확인한 최적의 조성비를 가진 코아세르베이트들에 봉입된 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)의 항염증 효과를 확인하기 위해 용액 코아세르베이트 및 동결건조 코아세르베이트 각각에 대한 염증인자 발현 감소 효과를 측정하였다. 이하, 실험은 실시예 1 조성 코아세르베이트를 사용하여 수행하였다.In order to confirm the anti-inflammatory effect of drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor) encapsulated in coacervates having the optimal composition ratio confirmed in the above Example 4, the effect of reducing the expression of inflammatory factors for each of the solution coacervate and the freeze-dried coacervate was measured. Hereinafter, the experiment was performed using the coacervate having the composition of Example 1.
구체적으로, 실시예 1 조성 코아세르베이트에 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)을 봉입한 다음, LPS 및 고당으로 염증을 유도한 피부 상피 세포주에 처리한 다음, 염증인자의 수준을 확인하였다. qRT-PCR 분석을 통해 세포 내 IL-6 발현을 억제하는 siRNA 또는 miRNA-497의 수준을 확인하였다. 또한, 염증인자 감소 효과를 확인하기 위하여 추출된 RNA를 cDNA로 합성 후 TNF-α, IL-1b 및 IL-6와 같은 cytokine의 primer를 추가하여 qRT-PCR을 수행하였다.Specifically, drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor) were loaded into the coacervate composition of Example 1, and then treated with a skin epithelial cell line induced with inflammation by LPS and high glucose, and the level of inflammatory factors was confirmed. The level of siRNA or miRNA-497 that inhibits intracellular IL-6 expression was confirmed through qRT-PCR analysis. In addition, in order to confirm the effect of reducing inflammatory factors, the extracted RNA was synthesized into cDNA, and then primers for cytokines such as TNF-α, IL-1b, and IL-6 were added to perform qRT-PCR.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 miRNA-497을 봉입한 실시예 1 조성 코아세르베이트 처리 시, 염증성 인자인 TNF-α, IL-1b 및 IL-6의 발현 수준이 LPS 처리군의 약 60% 수준으로 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, IL-6 발현을 억제하는 siRNA 및 5-아미노살리실레이트를 봉입한 경우에도, miRNA와 마찬가지로 LPS 처리군 대비 염증성 인자들의 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 동결건조 코아세르베이트를 적용하였을 때에도 동일하게 나타났다.As a result, as shown in Fig. 6, when the Example 1 composition coacervate encapsulating miRNA-497 was treated, it was confirmed that the expression levels of inflammatory factors TNF-α, IL-1b, and IL-6 were reduced to about 60% of that of the LPS treatment group. In addition, when siRNA and 5-aminosalicylate that suppress IL-6 expression were encapsulated, it was confirmed that the expression of inflammatory factors was reduced compared to the LPS treatment group, similar to miRNA. These results were the same when freeze-dried coacervate was applied.
상기와 같은 결과를 통해 일 실시예의 약물이 봉입된 코아세르베이트는 세포 내 전달되어 우수한 항염증 효과를 나타내는 바, 염증 치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다.Through the above results, it was confirmed that the drug-encapsulated coacervate of one embodiment can be delivered into cells and exhibits excellent anti-inflammatory effects, and thus can be used as an anti-inflammatory agent.
실시예 7. 상피세포성장인자를 더 포함하는 코아세르베이트의 처리에 따른 항염증 효과 확인Example 7. Confirmation of anti-inflammatory effect by treatment with coacervate containing epidermal growth factor
siRNA, miRNA 뿐만 아니라 상피세포성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)를 추가적으로 포함하는 코아세르베이트의 효과를 확인하기 위한 실험을 실시예 1 조성 코아세르베이트를 사용하여 진행하였다. 구체적으로 고당의 섬유아세포(HDF) 세포에 LPS 처리하여 염증을 유발시킨 다음, EGF만 포함하는 코아세르베이트, 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)만 포함하는 코아세르베이트 및 EGF와 약물(miRNA-497, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)을 모두 포함하는 코아세르베이트를 처리한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, EGF 및 miRNA를 모두 포함하는 실시예 1 조성 코아세르베이트에서 시너지 효과가 발생함을 확인할 수 있었다. 또한, IL-6 발현을 억제하는 siRNA, 5-아미노살리실레이트 및 섬유아세포성장인자)를 봉입한 경우에도, miRNA와 마찬가지로 EGF와 siRNA를 모두 포함하는 코아세르베이트에서 시너지 효과가 발생함을 확인하였다. 이러한 결과는 동결건조 코아세르베이트를 적용하였을 때에도 동일하게 나타났다.An experiment was conducted to confirm the effect of a coacervate additionally containing Epidermal Growth Factor (EGF) as well as siRNA and miRNA using the coacervate of Example 1. Specifically, HDF cells were treated with LPS to induce inflammation, and then treated with a coacervate containing only EGF, a coacervate containing only drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor), and a coacervate containing both EGF and drugs (miRNA-497, siRNA that inhibits IL-6 expression, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor). As shown in FIG. 7, it was confirmed that a synergistic effect occurred in the coacervate of Example 1 containing both EGF and miRNA. In addition, when siRNA, 5-aminosalicylate, and fibroblast growth factor that suppress IL-6 expression were encapsulated, it was confirmed that a synergistic effect occurred in the coacervate containing both EGF and siRNA, similar to miRNA. These results were also observed when freeze-dried coacervate was applied.
상기와 같은 결과를 통해 일 실시예의 약물이 봉입된 코아세르베이트는 상피세포성장인자와 함께 전달 시, 항염증 효과에 있어서 시너지 효과가 나타남을 확인하였다.Through the above results, it was confirmed that the coacervate loaded with the drug of one embodiment exhibited a synergistic anti-inflammatory effect when delivered together with epidermal growth factor.
실시예 8. 코아세르베이트의 상처 치료 효과 확인Example 8. Confirmation of wound healing effect of coacervate
코아세르베이트의 상처 치료 효과를 확인하기 위한 용액 코아세르베이트 및 동결건조 코아세르베이트 각각에 대한in vivo 실험을 수행하였다. 구체적으로 당뇨가 유발된 마우스에 상처를 낸 다음, 상처 부위 위에 EGF만 포함하는 실시예 1 조성 코아세르베이트, 약물만 포함하는 실시예 1 조성 코아세르베이트 및 EGF와 약물을 모두 포함하는 실시예 1 조성 코아세르베이트를 처리하였다. 당뇨가 유발되지 않은 마우스에 상처를 낸 군을 control 군(대조군)으로 하였으며, 당뇨 마우스 모델에 상처를 유발 후 약물을 처리하지 않은 실험군을 negative 군(음성대조군)으로 설정하여 실험을 수행하였다.In vivo experiments were performed on each of the solution coacervate and the freeze-dried coacervate to confirm the wound healing effect of the coacervate. Specifically, diabetic mice were wounded, and the coacervate of Example 1 containing only EGF, the coacervate of Example 1 containing only the drug, and the coacervate of Example 1 containing both EGF and the drug were treated on the wounded area. The group in which non-diabetic mice were wounded was set as the control group, and the experimental group in which a diabetic mouse model was wounded but not treated with the drug was set as the negative group, and the experiment was performed.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, EGF 및 miRNA를 모두 포함하는 코아세르베이트를 처리하는 경우, EGF 코아세르베이트 또는 miRNA 코아세르베이트를 단독으로 처리하는 경우보다 당뇨가 유발된 쥐의 상처 치료에 현저한 효과를 보여줌을 확인할 수 있었으며, 이러한 치료 효과는 정상 쥐의 상처치료 효과와 유사한 수준으로 확인되었다. 또한, 섬유아세포성장인자를 봉입한 경우에도, miRNA와 마찬가지로 EGF와 섬유아세포성장인자를 모두 포함하는 코아세르베이트에서 시너지 효과가 발생함을 확인하였다. 이러한 결과는 동결건조 코아세르베이트를 적용하였을 때에도 동일하게 나타났다.As a result, as shown in Fig. 8, it was confirmed that when treating the coacervate containing both EGF and miRNA, it showed a remarkable effect on the wound healing of diabetic mice compared to when treating the EGF coacervate or miRNA coacervate alone, and this therapeutic effect was confirmed to be at a similar level to the wound healing effect of normal mice. In addition, when fibroblast growth factor was encapsulated, it was confirmed that a synergistic effect occurred in the coacervate containing both EGF and fibroblast growth factor, similar to miRNA. These results were the same when freeze-dried coacervate was applied.
상기와 같은 결과를 통해 일 실시예의 약물이 봉입된 코아세르베이트는 코아세르베이트를 통해 세포 내 전달되어 우수한 상처치료 효과를 나타내는 바, 상처치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다.Through the above results, it was confirmed that the coacervate loaded with the drug of one embodiment can be used as a wound healing agent because it exhibits an excellent wound healing effect by being delivered into cells through the coacervate.
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