본 개시는 출원일이 2021년 12월 16일인 중국 특허 출원 202111542797.4의 우선권을 청구하며, 본 개시는 상술한 중국 특허 출원의 전부 내용을 인용한다.This disclosure claims the priority of Chinese patent application 202111542797.4 with a filing date of December 16, 2021, and this disclosure cites the entire content of the above-mentioned Chinese patent application.
본 개시는 dsRNA에 관한 것이며, 해당 dsRNA는 세포 내로 표적 전달되어 RNA 간섭 작용을 발휘할 수 있다. 본 개시는 또한 dsRNA의 제조 방법 및 응용에 관한 것이다.The present disclosure relates to dsRNA, and the dsRNA can be targetedly delivered into cells to exert an RNA interference effect. The present disclosure also relates to methods and applications of dsRNA.
RNA 간섭(RNAi)은 유전자 발현을 침묵시키는 효과적인 방법이다. 통계에 따르면, 인체 내 질환에 관련된 단백질에 있어서, 약 80% 이상의 단백질은 현재의 일반적인 소분자 약물 및 생물학적 거대분자 제제에 의해 표적화될 수 없어 약으로 될 수 없는 단백질에 속한다. RNA 간섭 기술을 이용하면 이러한 단백질을 코딩하는 mRNA에 따라 적합한 siRNA를 설계하여 목표 mRNA 특이적으로 표적으로 하여 목표 mRNA를 분해함으로써 관련 단백질의 생성을 억제할 수 있다. 따라서 siRNA는 매우 중요한 약물개발 전망을 가지고 있다. 그러나 체내에서 치료를 목적으로 하는 RNA 간섭 효과를 얻으려면 체내 특정 세포에 siRNA 분자를 전달해야 한다.RNA interference (RNAi) is an effective method to silence gene expression. According to statistics, among proteins related to diseases in the human body, more than about 80% of the proteins belong to proteins that cannot be targeted by current common small molecule drugs and biological macromolecular agents and thus cannot be drugged. Using RNA interference technology, it is possible to design appropriate siRNAs according to the mRNA encoding these proteins and specifically target the target mRNA to degrade the target mRNA, thereby suppressing the production of the related protein. Therefore, siRNA has very important drug development prospects. However, to obtain RNA interference effects for therapeutic purposes in the body, siRNA molecules must be delivered to specific cells in the body.
표적화 리간드를 채택하여 siRNA를 접합하고 표적화 리간드를 이용하여 세포막 표면의 수용체 분자에 결합함으로써 세포내이입으로 세포 내로 진입하는 것은 효과적인 약물 전달 방식이다. 예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)는 간세포에 의해 특이적으로 발현되는 수용체이고 간세포 표면에 풍부하고 세포내 및 세포외 전환이 빠른 특징을 갖는다. 갈락토스, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민과 같은 단당류 및 다당류 분자는 ASGPR에 대해 높은 친화성이 있다. 문헌(10.16476/j.pibb.2015.0028)에서는 아미노갈락토스 분자 클러스터(GalNAc)를 사용하면 siRNA를 간 세포에 효과적으로 전달할 수 있고, GalNAc 분자가 3가 또는 4가의 분자 클러스터로 설계되면 1가 또는 2가 GalNAc 분자의 간 세포를 표적으로 하는 능력을 현저히 향상시킬 수 있다는 것을 보고하였다.Adopting a targeting ligand to conjugate siRNA and using the targeting ligand to bind to a receptor molecule on the cell membrane surface to enter the cell through endocytosis is an effective drug delivery method. For example, asialoglycoprotein receptor (ASGPR) is a receptor specifically expressed by hepatocytes, is abundant on the surface of hepatocytes, and has the characteristics of rapid intracellular and extracellular turnover. Monosaccharide and polysaccharide molecules such as galactose, galactosamine, and N-acetylgalactosamine have high affinity for ASGPR. In the literature (10.16476/j.pibb.2015.0028), siRNA can be effectively delivered to liver cells using aminogalactose molecule clusters (GalNAc), and if GalNAc molecules are designed as trivalent or tetravalent molecular clusters, monovalent or divalent GalNAc It has been reported that the ability of molecules to target liver cells can be significantly improved.
서로 다른 분자 클러스터 구조와 RNA와의 서로 다른 연결 방식은 체내에서 siRNA의 활성에 큰 영향을 미치며, 활성이 높을수록 치료 효과가 우수하거나 투약량이 낮아진다는 것을 의미한다. 동일한 약효로 더 낮은 투약 용량은 더 낮은 독성 반응을 의미한다.Different molecular cluster structures and different ways of connecting to RNA have a great impact on the activity of siRNA in the body, with higher activity meaning better therapeutic effect or lower dosage. A lower dosage for the same efficacy means a lower toxic response.
dsRNAdsRNA
일 측면에서, 본 개시는 dsRNA를 제공하며, 이는 siRNA와 이에 접합된 하나 이상의 리간드를 포함하며, 상기 siRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 포함되며, 상기 안티센스 가닥은 이의 5' 단으로부터 2번째 내지 8번째 위치 중 적어도 하나의 뉴클레오티드 위치에 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 변형 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:In one aspect, the disclosure provides a dsRNA, comprising a siRNA and one or more ligands conjugated thereto, wherein the siRNA comprises a sense strand and an antisense strand, wherein the antisense strand is 2 to 8 from its 5' end. At least one nucleotide position among the positions contains a chemical modification represented by formula (I), a tautomeric modification thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
여기서: Y는 O, NH 및 S로부터 선택되며;where: Y is selected from O, NH and S;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이며;J2 is H or C1 -C6 alkyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
Q1은이고, Q2는 R2이며; 또는Q1 is and Q2 is R2 ; or
Q1은 R2이고, Q2는이며;Q1 is R2 and Q2 is and;
여기서:here:
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 염기이며;B is a base;
상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형은이 아니며;The chemical modification represented by the formula (I), its tautomer, or its pharmaceutically acceptable salt modification is It is not;
상기 리간드는 식 (II)로 표시된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며,The ligand is a compound as represented by formula (II) or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
여기서, L1은 C1-C30 알킬 사슬이거나, 또는 하나 이상의 산소, 황, 질소 원자 또는 C=O에 의해 절단된 C1-C30 알킬 사슬을 포함하며;where L1 is a C1 -C30 alkyl chain or comprises a C1 -C30 alkyl chain cleaved by one or more oxygen, sulfur, nitrogen atoms or C=O;
R11 및 R12는 독립적으로 화학 결합, NR16, C=O 또는 -OC(=O)-이며;R11 and R12 are independently a chemical bond, NR16 , C=O or -OC(=O)-;
Q3은 또는이며;Q3 is or and;
은 단일 결합 또는 이중 결합이며,는 단일 결합인 경우, R13은 독립적으로 CR17R18, NR16, O 또는 S이고,is a single bond or double bond, When is a single bond, R13 is independently CR17 R18 , NR16 , O or S,
는 이중 결합인 경우, R13은 독립적으로 CR19 또는 N이며;is a double bond, R13 is independently CR19 or N;
R14는 독립적으로 CR19 또는 N이며;R14 is independently CR19 or N;
고리 A는 존재하거나 또는 존재하지 않는 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 고리 A가 존재하는 경우, R15는 독립적으로 CR19 또는 N이고, 고리 A가 존재하지 않는 경우, R15는 독립적으로 CR17R18, NR16 또는 O이며;Ring A is cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl or heteroaryl, which may or may not be present, and when Ring A is present, R15 is independently CR19 or N, and when Ring A is absent, R15 is independently CR17 R18 , NR16 or O;
R16 및 R19는 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R'')이며, 상기 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴은 선택적으로 할로겐, 히드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 시클로알킬, 3 내지 12원 헤테로시클로알킬, 6 내지 12원 아릴, 5 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R'')로부터 선택되는 하나 이상의 그룹에 의해 치환되며;R16 and R19 are independently hydrogen, deuterium, alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, SR', S(=O)R', S(=O)2 R', S( =O)2 NR'(R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' or C(=O)NR'(R''), The alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl or heteroaryl is optionally halogen, hydroxy, oxo, nitro, cyano, C1-6 alkyl, C1-6 alkoxy, C3-7 cycloalkyl, 3 to 12 membered heterocycloalkyl, 6 to 12 membered aryl, 5 to 12 membered heteroaryl, SR', S(=O)R', S(=O)2 R', S(=O)2 NR'( Substituted by one or more groups selected from R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' and C(=O)NR'(R'') and;
R17 및 R18은 독립적으로 수소, 중수소, 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' 또는 C(=O)NR'(R'')이고, 상기 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴은 선택적으로 할로겐, 히드록시, 옥소, 니트로, 시아노, C1-6 알킬, C1-6 알콕시, C3-7 시클로알킬, 3 내지 12원 헤테로시클로알킬, 6 내지 12원 아릴, 5 내지 12원 헤테로아릴, SR', S(=O)R', S(=O)2R', S(=O)2NR'(R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' 및 C(=O)NR'(R'')로부터 선택되는 하나 이상의 그룹에 의해 치환되며;R17 and R18 are independently hydrogen, deuterium, alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl, heteroaryl, SR', S(=O)R', S(=O)2 R', S( =O)2 NR'(R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' or C(=O)NR'(R''), The alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl or heteroaryl is optionally halogen, hydroxy, oxo, nitro, cyano, C1-6 alkyl, C1-6 alkoxy, C3-7 cycloalkyl, 3 to 12 membered heterocycloalkyl, 6 to 12 membered aryl, 5 to 12 membered heteroaryl, SR', S(=O)R', S(=O)2 R', S(=O)2 NR'( Substituted by one or more groups selected from R''), NR'(R''), C(=O)R', C(=O)OR' and C(=O)NR'(R'') and;
R' 및 R''는 독립적으로 수소, 중수소, 히드록시, 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 상기 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴은 선택적으로 할로겐, 히드록시, 옥소, 니트로 및 시아노로부터 선택되는 하나 이상의 치환기에 의해 치환되며;R' and R'' are independently hydrogen, deuterium, hydroxy, alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl or heteroaryl, wherein the alkyl, alkoxy, cycloalkyl, heterocycloalkyl, aryl or heteroaryl optionally substituted by one or more substituents selected from halogen, hydroxy, oxo, nitro and cyano;
m1, n1, p1 및 q1은 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며;m1, n1, p1 and q1 are independently 0, 1, 2, 3 or 4;
B1은 또는이며;B1 is or and;
Rb1, Rb2, Rb3, Rb4, Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이며;Rb1 , Rb2 , Rb3 , Rb4 , Rb5 , Rb6 and Rb7 are independently -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)O-, -C (=O)-(CH2 )z8 -O- or -NHC(=O)-(CH2 )z9 -O-;
z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0~10의 정수이며;z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 and z9 are independently integers from 0 to 10;
L2는 C1-C30 알킬 사슬이거나, 또는 하나 이상의 산소, 황, 질소 원자 또는 C=O에 의해 절단된 C1-C30 알킬 사슬을 포함하며;L2 is a C1 -C30 alkyl chain or comprises a C1 -C30 alkyl chain cleaved by one or more oxygen, sulfur, nitrogen atoms or C=O;
r1은 1~10의 정수이다.r1 is an integer from 1 to 10.
일부 실시양태에서, X가 NH-CO인 경우, R1은 H가 아니다.In some embodiments, when X is NH—CO, R1 is not H.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 식 (I-1)로 표시되는 화학적 변형이며:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is a chemical modification represented by formula (I-1):
여기서: Y는 O, NH 및 S로부터 선택되며;where: Y is selected from O, NH and S;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;Each J1 and J2 are each independently H or C1 -C6 alkyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I)에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I).
식 (I-1)의 일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I-1), B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
식 (I-1)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I-1), B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6-alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine , C5 modified pyrimidines, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
식 (I-1)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I-1), B is adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole and It is selected from 3-nitropyrole.
식 (I-1)의 일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments of Formula (I-1), B is the same as the base when the nucleotide is unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 식 (I-2)로 표시되는 화학적 변형이며:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is a chemical modification represented by formula (I-2):
여기서, Y는 O, NH 및 S로부터 선택되며;where Y is selected from O, NH and S;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;Each J1 and J2 are each independently H or C1 -C6 alkyl;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
R2는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고; r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, S-CH3 , NCH3 (CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R is selected from8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl; r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I)에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I).
식 (I-2)의 일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I-2), B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
식 (I-2)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I-2), B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6-alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine , C5 modified pyrimidines, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
식 (I-2)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I-2), B is adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole and It is selected from 3-nitropyrole.
식 (I-2)의 일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments of Formula (I-2), B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이며;Insomeembodiments,each C3 alkyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이며;Each J1 and J2 are each independently H or C1 -C3 alkyl;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C3 alkyl, C1 -C3 alkoxy, C2 -C4 alkenyl, C2 -C4 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
R1은 H, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알케닐 및 C2-C4 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C3 alkyl, C1 -C3 alkoxy, C2 -C4 alkenyl, C2 -C4 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C4 alkenyl and C2 -C4 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알케닐 및 C2-C4 알키닐로부터 선택되고, r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C3 alkyl, C1 -C3 alkoxy, C2 -C4 alkenyl, C2 -C4 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C4 alkenyl and C2 -C4 alkynyl, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I)에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I).
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필이며;Insomeembodiments,each , n-propyl or isopropyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 메틸이며;Each J1 and J2 is independently H or methyl;
R3은 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에티닐, 프로파르길, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에티닐 및 프로파르길로부터 선택되고, p=1 또는 2이며;R3 is H, OH, F, Cl, NH2 , methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, vinyl, allyl, ethynyl, propargyl , S-CH3 , NCH3 (CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-methylamino, -O-ethylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, F, Cl, methoxy, ethoxy, N3 , vinyl, allyl, ethynyl and propargyl, and p=1 or 2;
R1은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에티닐, 프로파르길 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에티닐 및 프로파르길로부터 선택되고, q=1 또는 2이며;R1 is selected from H, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, vinyl, allyl, ethynyl, propargyl and (CH2 )q R7 is selected; where R7 is selected from OH, F, Cl, methoxy, ethoxy, N3 , vinyl, allyl, ethynyl and propargyl, and q=1 or 2;
R2는 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에티닐, 프로파르길, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에티닐 및 프로파르길로부터 선택되고, r=1 또는 2이며;R2 is H, OH, F, Cl, NH2 , methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, vinyl, allyl, ethynyl, propargyl , S-CH3 , NCH3 (CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-methylamino, -O-ethylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, F, Cl, methoxy, ethoxy, N3 , vinyl, allyl, ethynyl and propargyl, and r=1 or 2;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I)에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I).
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O 또는 NH이고; 각 X는 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로부터 선택되며;In some embodiments, Y is O or NH; each X is independently selected from NH-CO, CH2 and NH;
n=0 또는 1; m=0 또는 1; s=0 또는 1;n=0 or 1; m=0 or 1; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이며;Each J1 and J2 is independently H;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R1 is selected from H, methyl and CH2 OH;
R2는 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R2 is selected from H, OH, NH2 , methyl and CH2 OH;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R3 is selected from H, OH, NH2 , methyl and CH2 OH;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I)에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I).
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O 또는 NH이고; 각 X는 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로부터 선택되며;In some embodiments, Y is O or NH; each X is independently selected from NH-CO, CH2 and NH;
n=0 또는 1; m=0 또는 1; s=0 또는 1;n=0 or 1; m=0 or 1; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이며;Each J1 and J2 is independently H;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R1 is selected from H, methyl and CH2 OH;
R2는 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R2 is selected from H, methyl and CH2 OH;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R3 is selected from H, OH, NH2 , methyl and CH2 OH;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I)에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I).
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O 또는 NH이며;In some embodiments, Y is O or NH;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이며;J2 is H or C1 -C6 alkyl;
n=0 또는 1; m=0 또는 1; s=0 또는 1;n=0 or 1; m=0 or 1; s=0 or 1;
R3은 H, OH, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고; R6은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, p=1, 2 또는 3이며;R3 is selected from H, OH, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy and (CH2 )p R6 ; R6 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and p=1, 2 or 3;
Q1은이고, Q2는 R2이며; 또는 Q1은 R2이고, Q2는이며;Q1 is and Q2 is R2 ; Or Q1 is R2 and Q2 is and;
R1은 H, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 및 (CH2)qR7로부터 선택되고; R7은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy and (CH2 )q R7 ; R7 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and q=1, 2 or 3;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 및 (CH2)rR8로부터 선택되고; R8은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, r=1, 2 또는 3이며;R2 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy and (CH2 )r R8 ; R8 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 3 내지 6원 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a 3- to 6-membered ring;
B는 염기이며;B is a base;
상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형은이 아니다.The chemical modification represented by the formula (I), its tautomer, or its pharmaceutically acceptable salt modification is This is not it.
일부 실시양태에서, X는 독립적으로 CR4(R4') 및 NH-CO로부터 선택된다.In some embodiments, X is independently selected from CR4 (R4 ') and NH-CO.
일부 실시양태에서, X는 독립적으로 CR4(R4')로부터 선택된다.In some embodiments, X is independently selected from CR4 (R4 ').
일부 실시양태에서, R3은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)pR6으로부터 선택된다.In some embodiments, R3 is selected from H, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )p R6 .
일부 실시양태에서, R3은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.In some embodiments, R3 is selected from H and C1 -C6 alkyl.
일부 실시양태에서, R1은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)qR7로부터 선택된다.In some embodiments, R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )q R7 .
일부 실시양태에서, R1은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.In some embodiments, R1 is selected from H and C1 -C6 alkyl.
일부 실시양태에서, R2는 H, OH, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택된다.In some embodiments, R2 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )r R8 .
일부 실시양태에서, R2는 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택된다.In some embodiments, R2 is selected from H, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )r R8 .
일부 실시양태에서, Y는 O이며;In some embodiments, Y is O;
각 X는 독립적으로 CR4(R4') 및 NH-CO로부터 선택되고, R4 및 R4'는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이며;J2 is H or C1 -C6 alkyl;
R3은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고; R6은 OH로부터 선택되며, p=1, 2 또는 3이며;R3 is selected from H, C1 -C6 alkyl and (CH2 )p R6 ; R6 is selected from OH and p=1, 2 or 3;
Q1은이고, Q2는 R2이며; 또는 Q1은 R2이고, Q2는이며;Q1 is and Q2 is R2 ; Or Q1 is R2 and Q2 is and;
R1은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)qR7로부터 선택되고; R7은 OH로부터 선택되며, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl and (CH2 )q R7 ; R7 is selected from OH and q=1, 2 or 3;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, OH, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택되고; R8은 OH로부터 선택되며, r=1, 2 또는 3이며;R2 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl and (CH2 )r R8 ; R8 is selected from OH, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 5 내지 6원 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a 5- to 6-membered ring;
B는 염기이다.B is a base.
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O이며;In some embodiments, Y is O;
각 X는 독립적으로 CR4(R4')로부터 선택되고, R4 및 R4'는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H이며;J2 is H;
R3은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;R3 is selected from H and C1 -C6 alkyl;
Q1은이고, Q2는 R2이며; 또는 Q1은 R2이고, Q2는이며;Q1 is and Q2 is R2 ; Or Q1 is R2 and Q2 is and;
R1은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;R1 is selected from H and C1 -C6 alkyl;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택되고; R8은 OH로부터 선택되며, r=1, 2 또는 3이며;R2 is selected from H, C1 -C6 alkyl and (CH2 )r R8 ; R8 is selected from OH, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 5 내지 6원 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a 5- to 6-membered ring;
B는 염기이다.B is a base.
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O이다.In some embodiments, Y is O.
일부 실시양태에서, X는 독립적으로 CR4(R4'), NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필이다. 일부 실시양태에서, X는 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 독립적으로 NH-CO 및 CH2로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 CH2이다.Insomeembodiments, It is isopropyl. In some embodiments, X is independently selected from NH-CO, CH2 and NH. In some embodiments, X is independently selected from NH-CO and CH2 . In some embodiments, X is CH2 .
일부 실시양태에서, J2는 H 또는 메틸이다. 일부 실시양태에서, J2는 H이다.In some embodiments, J2 is H or methyl. In some embodiments, J2 is H.
일부 실시양태에서, R3은 H, OH, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고, R6은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, p=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R3은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고, R6은 OH로부터 선택되며, p=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R3은 H 및 메틸로부터 선택된다.In some embodiments, R3 is selected from H, OH, NH2 , methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy and (CH2 )p R6 and R6 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and p=1 or 2. In some embodiments, R3 is selected from H, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and (CH2 )p R6 , R6 is selected from OH, and p=1 or 2. In some embodiments, R3 is selected from H and methyl.
일부 실시양태에서, R1은 H, OH, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 (CH2)qR7로부터 선택되고, R7은 OH로부터 선택되며, q=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R1은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 (CH2)qR7로부터 선택되고, R7은 OH로부터 선택되며, q=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R1은 H 및 메틸로부터 선택된다.In some embodiments, R1 is selected from H, OH, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy and (CH2 )q R7 and R7 is selected from OH, and q=1 or 2. In some embodiments, R1 is selected from H, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and (CH2 )q R7 and R7 is selected from OH, and q=1 or 2. In some embodiments, R1 is selected from H and methyl.
일부 실시양태에서, R2는 H, OH, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 (CH2)rR8로부터 선택되고, R8은 OH로부터 선택되며, r=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R2는 H, OH, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 (CH2)rR8로부터 선택되고, R8은 OH로부터 선택되며, r=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R2는 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택된다.In some embodiments, R2 is selected from H, OH, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy and (CH2 )r R8 , and R8 is selected from OH, and r=1 or 2. In some embodiments, R2 is selected from H, OH, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and (CH2 )r R8 , R8 is selected from OH, and r=1 or 2. In some embodiments, R2 is selected from H, methyl, and CH2 OH.
일부 실시양태에서, R1과 R2는 직접 연결되어 5 내지 6원 고리를 형성한다. 일부 실시양태에서, R1과 R2는 직접 연결되어 3 내지 6원 시클로알킬을 형성한다. 일부 실시양태에서, R1과 R2는 직접 연결되어 시클로펜틸 또는 시클로헥실을 형성한다.In some embodiments, R1 and R2 are directly connected to form a 5-6 membered ring. In some embodiments, R1 and R2 are directly connected to form a 3-6 membered cycloalkyl. In some embodiments, R1 and R2 are directly connected to form cyclopentyl or cyclohexyl.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is selected from any of the structures below:
여기서: B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.where: B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is selected from any of the structures below:
여기서: B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.where: B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is selected from any of the structures below:
,,,,,,,,,;, , , , , , , , , ;
여기서: B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.where: B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is selected from any of the structures below:
,,;, , ;
여기서: B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.where: B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same base as the nucleotide at that position in the antisense strand if the nucleotide were unmodified.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오티드, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 식(I')로 표시되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오티드, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며,In some embodiments, a nucleotide comprising a chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a nucleotide comprising a chemical modification represented by formula (I'), a tautomer thereof, or It is a pharmaceutically acceptable salt thereof,
여기서: Y는 O, NH 및 S로부터 선택되며;where: Y is selected from O, NH and S;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이며;J2 is H or C1 -C6 alkyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
Q1'은이고, Q2'는 R2이거나; 또는 Q1'은 R2이고, Q2'는이며;Q1' is and Q2' is R2 ; Or Q1' is R2 and Q2' is and;
여기서:here:
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 염기이며;B is a base;
M은 O 또는 S이며;M is O or S;
상기 식(I')로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은이 아니다.The chemical modification represented by the formula (I'), its tautomer, or its pharmaceutically acceptable salt is This is not it.
일부 실시양태에서, X가 NH-CO인 경우, R1은 H가 아니다.In some embodiments, when X is NH—CO, R1 is not H.
일부 실시양태에서, 식 (I')로 표시되는 화학적 변형은 식 (I'-1)로 표시되는 화학적 변형이다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I') is a chemical modification represented by formula (I'-1):
여기서: Y는 O, NH 및 S로부터 선택되며;where: Y is selected from O, NH and S;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;Each J1 and J2 are each independently H or C1 -C6 alkyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and r=1, 2 or 3;
M은 O 또는 S이며;M is O or S;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I')에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I').
식 (I'-1)의 일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I'-1), B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
식 (I'-1)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I'-1), B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine. , 2-aminopurine, N6-alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine. selected from dine, C5 modified pyrimidine, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
식 (I'-1)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I'-1), B is adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole. and 3-nitropyrole.
식 (I'-1)의 일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments of Formula (I'-1), B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 식 (I')로 표시되는 화학적 변형은 식 (I'-2)로 표시되는 화학적 변형이다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I') is a chemical modification represented by formula (I'-2):
여기서, Y는 O, NH 및 S로부터 선택되며;where Y is selected from O, NH and S;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;Each J1 and J2 are each independently H or C1 -C6 alkyl;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
R1은 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, C2 -C6 alkenyl, C2 -C6 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
R2는 H, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고; r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy, S-CH3 , NCH3 (CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R is selected from8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl; r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
M은 O 또는 S이며;M is O or S;
B는 식 (I')에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I').
식 (I'-2)의 일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I'-2), B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
식 (I'-2)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I'-2), B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine. , 2-aminopurine, N6-alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine. selected from dine, C5 modified pyrimidine, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
식 (I'-2)의 일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments of Formula (I'-2), B is adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole. and 3-nitropyrole.
식 (I'-2)의 일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments of Formula (I'-2), B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이며;Insomeembodiments,each C3 alkyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이며;Each J1 and J2 are each independently H or C1 -C3 alkyl;
R3은 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C6 알케닐 및 C2-C6 알키닐로부터 선택되고, p=1, 2 또는 3이며;R3 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C3 alkyl, C1 -C3 alkoxy, C2 -C4 alkenyl, C2 -C4 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C6 alkenyl and C2 -C6 alkynyl, and p=1, 2 or 3;
R1은 H, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알케닐 및 C2-C4 알키닐로부터 선택되고, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C3 alkyl, C1 -C3 alkoxy, C2 -C4 alkenyl, C2 -C4 alkynyl and (CH2 )q R7 ; where R7 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C4 alkenyl and C2 -C4 alkynyl, and q=1, 2 or 3;
R2는 H, OH, 할로겐, NH2, C1-C3 알킬, C1-C3 알콕시, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-알킬아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, 할로겐, 메톡시, 에톡시, N3, C2-C4 알케닐 및 C2-C4 알키닐로부터 선택되고, r=1, 2 또는 3이며;R2 is H, OH, halogen, NH2 , C1 -C3 alkyl, C1 -C3 alkoxy, C2 -C4 alkenyl, C2 -C4 alkynyl, S-CH3 , NCH3 ( CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-alkylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, halogen, methoxy, ethoxy, N3 , C2 -C4 alkenyl and C2 -C4 alkynyl, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I')에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I').
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 각 X는 독립적으로 CR4(R4'), S, NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, 여기서, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필이며;Insomeembodiments,each , n-propyl or isopropyl;
n=0, 1 또는 2; m=0, 1 또는 2; s=0 또는 1;n=0, 1 or 2; m=0, 1 or 2; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H 또는 메틸이며;Each J1 and J2 is independently H or methyl;
R3은 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에티닐, 프로파르길, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노 및 (CH2)pR6으로부터 선택되며; 여기서, R6은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에티닐 및 프로파르길로부터 선택되고, p=1 또는 2이며;R3 is H, OH, F, Cl, NH2 , methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, vinyl, allyl, ethynyl, propargyl , S-CH3 , NCH3 (CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-methylamino, -O-ethylamino and (CH2 )p R6 ; where R6 is selected from OH, F, Cl, methoxy, ethoxy, N3 , vinyl, allyl, ethynyl and propargyl, and p=1 or 2;
R1은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에티닐, 프로파르길 및 (CH2)qR7로부터 선택되며; 여기서, R7은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에티닐 및 프로파르길로부터 선택되고, q=1 또는 2이며;R1 is selected from H, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, vinyl, allyl, ethynyl, propargyl and (CH2 )q R7 is selected; where R7 is selected from OH, F, Cl, methoxy, ethoxy, N3 , vinyl, allyl, ethynyl and propargyl, and q=1 or 2;
R2는 H, OH, F, Cl, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, 비닐, 알릴, 에티닐, 프로파르길, S-CH3, NCH3(CH3), OCH2CH2OCH3, -O-메틸아미노, -O-에틸아미노 및 (CH2)rR8로부터 선택되며; 여기서, R8은 OH, F, Cl, 메톡시, 에톡시, N3, 비닐, 알릴, 에티닐 및 프로파르길로부터 선택되고, r=1 또는 2이며;R2 is H, OH, F, Cl, NH2 , methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, vinyl, allyl, ethynyl, propargyl , S-CH3 , NCH3 (CH3 ), OCH2 CH2 OCH3 , -O-methylamino, -O-ethylamino and (CH2 )r R8 ; where R8 is selected from OH, F, Cl, methoxy, ethoxy, N3 , vinyl, allyl, ethynyl and propargyl, and r=1 or 2;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I')에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I').
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O 또는 NH이고; 각 X는 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로부터 선택되며;In some embodiments, Y is O or NH; each X is independently selected from NH-CO, CH2 and NH;
n=0 또는 1; m=0 또는 1; s=0 또는 1;n=0 or 1; m=0 or 1; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이며;Each J1 and J2 is independently H;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R1 is selected from H, methyl and CH2 OH;
R2는 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R2 is selected from H, OH, NH2 , methyl and CH2 OH;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R3 is selected from H, OH, NH2 , methyl and CH2 OH;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I')에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I').
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O 또는 NH이고; 각 X는 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로부터 선택되며;In some embodiments, Y is O or NH; each X is independently selected from NH-CO, CH2 and NH;
n=0 또는 1; m=0 또는 1; s=0 또는 1;n=0 or 1; m=0 or 1; s=0 or 1;
각 J1 및 J2는 각각 독립적으로 H이며;Each J1 and J2 is independently H;
R1은 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R1 is selected from H, methyl and CH2 OH;
R2는 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R2 is selected from H, methyl and CH2 OH;
R3은 H, OH, NH2, 메틸 및 CH2OH로부터 선택되며;R3 is selected from H, OH, NH2 , methyl and CH2 OH;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring;
B는 식 (I')에 정의된 바와 같다.B is as defined in equation (I').
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O 또는 NH이며;In some embodiments, Y is O or NH;
각 X는 독립적으로 CR4(R4'), NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이며;J2 is H or C1 -C6 alkyl;
n=0 또는 1; m=0 또는 1; s=0 또는 1;n=0 or 1; m=0 or 1; s=0 or 1;
R3은 H, OH, NH2, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고; R6은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, p=1, 2 또는 3이며;R3 is selected from H, OH, NH2 , C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy and (CH2 )p R6 ; R6 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and p=1, 2 or 3;
Q1'은이고, Q2'는 R2이거나; 또는 Q1'은 R2이고, Q2'는이며;Q1' is and Q2' is R2 ; Or Q1' is R2 and Q2' is and;
R1은 H, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 및 (CH2)qR7로부터 선택되고; R7은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy and (CH2 )q R7 ; R7 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and q=1, 2 or 3;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, OH, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시 및 (CH2)rR8로부터 선택되고; R8은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, r=1, 2 또는 3이며;R2 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl, C1 -C6 alkoxy and (CH2 )r R8 ; R8 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 3 내지 6원 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a 3- to 6-membered ring;
M은 O 또는 S이며;M is O or S;
B는 염기이며;B is a base;
상기 식(I')로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은이 아니다.The chemical modification represented by the formula (I'), its tautomer, or its pharmaceutically acceptable salt is This is not it.
일부 실시양태에서, X는 독립적으로 CR4(R4') 및 NH-CO로부터 선택된다.In some embodiments, X is independently selected from CR4 (R4 ') and NH-CO.
일부 실시양태에서, X는 독립적으로 CR4(R4')로부터 선택된다.In some embodiments, X is independently selected from CR4 (R4 ').
일부 실시양태에서, R3은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)pR6으로부터 선택된다.In some embodiments, R3 is selected from H, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )p R6 .
일부 실시양태에서, R3은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.In some embodiments, R3 is selected from H and C1 -C6 alkyl.
일부 실시양태에서, R1은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)qR7로부터 선택된다.In some embodiments, R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )q R7 .
일부 실시양태에서, R1은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다.In some embodiments, R1 is selected from H and C1 -C6 alkyl.
일부 실시양태에서, R2는 H, OH, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택된다.In some embodiments, R2 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )r R8 .
일부 실시양태에서, R2는 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택된다.In some embodiments, R2 is selected from H, C1 -C6 alkyl, and (CH2 )r R8 .
일부 실시양태에서, Y는 O이며;In some embodiments, Y is O;
각 X는 독립적으로 CR4(R4') 및 NH-CO로부터 선택되고, R4 및 R4'는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H 또는 C1-C6 알킬이며;J2 is H or C1 -C6 alkyl;
R3은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고; R6은 OH로부터 선택되며, p=1, 2 또는 3이며;R3 is selected from H, C1 -C6 alkyl and (CH2 )p R6 ; R6 is selected from OH and p=1, 2 or 3;
Q1'은이고, Q2'는 R2이거나; 또는 Q1'은 R2이고, Q2'는이며;Q1' is and Q2' is R2 ; Or Q1' is R2 and Q2' is and;
R1은 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)qR7로부터 선택되고; R7은 OH로부터 선택되며, q=1, 2 또는 3이며;R1 is selected from H, C1 -C6 alkyl and (CH2 )q R7 ; R7 is selected from OH and q=1, 2 or 3;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, OH, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택되고; R8은 OH로부터 선택되며, r=1, 2 또는 3이며;R2 is selected from H, OH, C1 -C6 alkyl and (CH2 )r R8 ; R8 is selected from OH, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 5 내지 6원 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a 5- to 6-membered ring;
M은 O 또는 S이며;M is O or S;
B는 염기이다.B is a base.
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O이며;In some embodiments, Y is O;
각 X는 독립적으로 CR4(R4')로부터 선택되고, R4 및 R4'는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이며;each
J2는 H이며;J2 is H;
R3은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;R3 is selected from H and C1 -C6 alkyl;
Q1'은이고, Q2'는 R2이거나; 또는 Q1'은 R2이고, Q2'는이며;Q1' is and Q2' is R2 ; Or Q1' is R2 and Q2' is and;
R1은 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택되며;R1 is selected from H and C1 -C6 alkyl;
J1은 H 또는 C1-C6 알킬이며;J1 is H or C1 -C6 alkyl;
R2는 H, C1-C6 알킬 및 (CH2)rR8로부터 선택되고; R8은 OH로부터 선택되며, r=1, 2 또는 3이며;R2 is selected from H, C1 -C6 alkyl and (CH2 )r R8 ; R8 is selected from OH, and r=1, 2 or 3;
선택적으로, R1과 R2는 직접 연결되어 5 내지 6원 고리를 형성하며;Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a 5- to 6-membered ring;
M은 O 또는 S이며;M is O or S;
B는 염기이다.B is a base.
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, Y는 O이다.In some embodiments, Y is O.
일부 실시양태에서, X는 독립적으로 CR4(R4'), NR5 및 NH-CO로부터 선택되고, R4, R4', R5는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필이다. 일부 실시양태에서, X는 독립적으로 NH-CO, CH2 및 NH로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 독립적으로 NH-CO 및 CH2로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, X는 CH2이다.Insomeembodiments, It is isopropyl. In some embodiments, X is independently selected from NH-CO, CH2 and NH. In some embodiments, X is independently selected from NH-CO and CH2 . In some embodiments, X is CH2 .
일부 실시양태에서, J2는 H 또는 메틸이다. 일부 실시양태에서, J2는 H이다.In some embodiments, J2 is H or methyl. In some embodiments, J2 is H.
일부 실시양태에서, R3은 H, OH, NH2, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고, R6은 OH, 메톡시 및 에톡시로부터 선택되며, p=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R3은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 (CH2)pR6으로부터 선택되고, R6은 OH로부터 선택되며, p=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R3은 H 및 메틸로부터 선택된다.In some embodiments, R3 is selected from H, OH, NH2 , methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy and (CH2 )p R6 and R6 is selected from OH, methoxy and ethoxy, and p=1 or 2. In some embodiments, R3 is selected from H, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and (CH2 )p R6 , R6 is selected from OH, and p=1 or 2. In some embodiments, R3 is selected from H and methyl.
일부 실시양태에서, R1은 H, OH, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 (CH2)qR7로부터 선택되고, R7은 OH로부터 선택되며, q=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R1은 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 (CH2)qR7로부터 선택되고, R7은 OH로부터 선택되며, q=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R1은 H 및 메틸로부터 선택된다.In some embodiments, R1 is selected from H, OH, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy and (CH2 )q R7 and R7 is selected from OH, and q=1 or 2. In some embodiments, R1 is selected from H, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and (CH2 )q R7 and R7 is selected from OH, and q=1 or 2. In some embodiments, R1 is selected from H and methyl.
일부 실시양태에서, R2는 H, OH, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 (CH2)rR8로부터 선택되고, R8은 OH로부터 선택되며, r=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R2는 H, OH, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 (CH2)rR8로부터 선택되고, R8은 OH로부터 선택되며, r=1 또는 2이다. 일부 실시양태에서, R2는 H, 메틸 및 CH2OH로부터 선택된다.In some embodiments, R2 is selected from H, OH, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy and (CH2 )r R8 , and R8 is selected from OH, and r=1 or 2. In some embodiments, R2 is selected from H, OH, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, and (CH2 )r R8 , R8 is selected from OH, and r=1 or 2. In some embodiments, R2 is selected from H, methyl, and CH2 OH.
일부 실시양태에서, R1과 R2는 직접 연결되어 5 내지 6원 고리를 형성한다. 일부 실시양태에서, R1과 R2는 직접 연결되어 3 내지 6원 시클로알킬을 형성한다. 일부 실시양태에서, R1과 R2는 직접 연결되어 시클로펜틸 또는 시클로헥실을 형성한다.In some embodiments, R1 and R2 are directly connected to form a 5-6 membered ring. In some embodiments, R1 and R2 are directly connected to form a 3-6 membered cycloalkyl. In some embodiments, R1 and R2 are directly connected to form cyclopentyl or cyclohexyl.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I')로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I') is selected from any of the structures below:
여기서: M은 O 또는 S이며;Where: M is O or S;
B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I')로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I') is selected from any of the structures below:
여기서: M은 O 또는 S이며;Where: M is O or S;
B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I')로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I') is selected from any of the structures below:
여기서: M은 O 또는 S이며;Where: M is O or S;
B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 식 (I')로 표시되는 화학적 변형은 이하 임의의 구조로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I') is selected from any of the structures below:
및 이들의 구조에서의 아데닌이 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민으로 치환되어 형성된 것이다.and those formed by replacing adenine in these structures with guanine, cytosine, uracil, or thymine.
일부 실시양태에서, B는 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from purine bases, pyrimidine bases, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 이소구아닌, 히포크산틴, 크산틴, C2 변형 퓨린, N8 변형 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, N6-알킬아데닌, O6-알킬구아닌, 7-데아자퓨린, 시토신, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도시토신, 우라실, 슈도우라실, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, C5 변형 피리미딘, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is adenine, guanine, isoguanine, hypoxanthine, xanthine, C2 modified purine, N8 modified purine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, N6- Alkyladenine, O6-alkylguanine, 7-deazapurine, cytosine, 5-methylcytosine, isocytosine, pseudocytosine, uracil, pseudouracil, 2-thiouridine, 4-thiouridine, C5 modified pyrimidine, thymine. , indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, B is selected from adenine, guanine, 2,6-diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole, and 3-nitropyrrole. do.
일부 실시양태에서, B는 안티센스 가닥의 해당 위치에서 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is the same as the base if the nucleotide were unmodified at that position in the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 식 (II)로 표시된 바와 같은 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이며,In some embodiments, the ligand is a compound as represented by Formula (II), or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
, 여기서,, here,
L1은 C1-C30 알킬 사슬이거나, 또는 하나 이상의 산소, 황, 질소 원자 또는 C=O에 의해 절단된 C1-C30 알킬 사슬을 포함하며;L1 is a C1 -C30 alkyl chain or comprises a C1 -C30 alkyl chain cleaved by one or more oxygen, sulfur, nitrogen atoms or C=O;
R11 및 R12는 독립적으로 화학 결합, NR16 또는 C=O이며;R11 and R12 are independently a chemical bond, NR16 or C=O;
Q3은이며;Q3 is and;
R13은 CR17R18, NR16, O 또는 S이며;R13 is CR17 R18 , NR16 , O or S;
R14는 CR19이며;R14 is CR19 ;
R15는 독립적으로 CR17R18, NR16 또는 O이며;R15 is independently CR17 R18 , NR16 or O;
R16 내지 R19는 독립적으로 수소, 중수소 또는 알킬이며;R16 to R19 are independently hydrogen, deuterium, or alkyl;
m1, p1 및 q1은 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며;m1, p1 and q1 are independently 0, 1, 2, 3 or 4;
B1은이며;B1 is and;
Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이며;Rb5 , Rb6 and Rb7 are independently -C(=O)-, -NHC(=O)-, -C(=O)O-, -C(=O)-(CH2 )z8 -O - or -NHC(=O)-(CH2 )z9 -O-;
z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0~10의 정수이며;z5, z6, z7, z8 and z9 are independently integers from 0 to 10;
L2는 C1-C30 알킬 사슬이거나, 또는 하나 이상의 산소, 황, 질소 원자 또는 C=O에 의해 절단된 C1-C30 알킬 사슬을 포함하며;L2 is a C1 -C30 alkyl chain or comprises a C1 -C30 alkyl chain cleaved by one or more oxygen, sulfur, nitrogen atoms or C=O;
r1은 1~10의 정수이다.r1 is an integer from 1 to 10.
일부 실시양태에서, L1은 -(CH2)j11-C(=O)-(CH2)j12-이며;In some embodiments, L1 is -(CH2 )j11 -C(=O)-(CH2 )j12 -;
R11 및 R12는 독립적으로 화학 결합, NR16 또는 C=O이며;R11 and R12 are independently a chemical bond, NR16 or C=O;
R16은 수소 또는 C1-6 알킬이며;R16 is hydrogen or C1-6 alkyl;
Q3은이며;Q3 is and;
R13은 CR17R18 또는 O이며;R13 is CR17 R18 or O;
R14는 CR19이며;R14 is CR19 ;
R15는 독립적으로 CR17R18 또는 O이며;R15 is independently CR17 R18 or O;
R16 내지 R19는 독립적으로 수소 또는 알킬이며;R16 to R19 are independently hydrogen or alkyl;
m1, p1 및 q1은 독립적으로 0 또는 1이며;m1, p1 and q1 are independently 0 or 1;
B1은이며;B1 is and;
Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이며;Rb5 , Rb6 and Rb7 are independently -C(=O)-(CH2 )z8 -O- or -NHC(=O)-(CH2 )z9 -O-;
z8 및 z9는 독립적으로 0~10의 정수이며;z8 and z9 are independently integers from 0 to 10;
L2는 -(CH2)j15-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j16- 또는이며;L2 is -(CH2 )j15 -(OCH2 CH2 )1-4 -(CH2 )j16 - or and;
j15 및 j16은 독립적으로 0~4의 정수이며;j15 and j16 are independently integers from 0 to 4;
r1은 3, 4, 5 또는 6이다.r1 is 3, 4, 5 or 6.
일부 실시양태에서, L1은 L3 또는 L3-R110-R111-L3일 수 있으며, 여기서, L3은 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬, -(CH2)j11-C(=O)-(CH2)j12- 또는 -(CH2)j13-(CH2CH2O)1-4-(CH2)j14-이고, R110 및 R111은 독립적으로 화학 결합, -NR112-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이고, R112는 수소 또는 C1-C12 알킬이고, j11, j12, j13 및 j14는 독립적으로 0~10의 정수이다. 일부 실시양태에서, j11, j12, j13 및 j14는 독립적으로 0~2 또는 4~10의 정수이다. 일부 실시양태에서, j11, j12, j13 및 j14는 독립적으로 0, 1, 2, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.In some embodiments, L1 can be L3 or L3 -R110 -R111 -L3 , where L3 is independently a C1 -C12 alkyl chain, -(CH2 )j11 -C( =O)-(CH2 )j12 - or -(CH2 )j13 -(CH2 CH2 O)1-4 -(CH2 )j14 -, and R110 and R111 are independently a chemical bond, -NR112 -, -C(=O)- or -OC(=O)-, R112 is hydrogen or C1 -C12 alkyl, and j11, j12, j13 and j14 are independently integers from 0 to 10. In some embodiments, j11, j12, j13 and j14 are independently integers from 0 to 2 or from 4 to 10. In some embodiments, j11, j12, j13, and j14 are independently 0, 1, 2, 6, 7, 8, 9, or 10.
일부 실시양태에서, L1은 -(CH2)j11-C(=O)-(CH2)j12-일 수 있으며, j11 및 j12에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, L1 can be -(CH2 )j11 -C(=O)-(CH2 )j12 -, wherein the definitions for j11 and j12 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, L1은일 수 있으며, j12에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같으며, 여기서, a1 단은 B1에 연결되고, b1 단은 R11에 연결된다.In some embodiments, L1 is may be, and the definition of j12 is as described in any of the preceding embodiments, wherein the a1 end is connected to B1 and the b1 end is connected to R11 .
일부 실시양태에서, L1은,,, 또는일 수 있으며, 여기서, a1 단은 B1에 연결되고, b1 단은 R11에 연결된다.In some embodiments, L1 is , , , or It may be, where the a1 end is connected to B1 and the b1 end is connected to R11 .
일부 실시양태에서, R11은 화학 결합일 수 있고, R12는 C=O일 수 있다.In some embodiments, R11 can be a chemical bond and R12 can be C=O.
일부 실시양태에서, R11은 화학 결합일 수 있고, R12는 NR16일 수 있고, R16에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, R11 can be a chemical bond and R12 can be NR16 , with the definitions for R16 being as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, R11은 화학 결합일 수 있고, R12는 -OC(=O)-일 수 있다.In some embodiments, R11 can be a chemical bond and R12 can be -OC(=O)-.
일부 실시양태에서, R11은 NR16일 수 있고, R12는 C=O일 수 있으며, R16에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, R11 can be NR16 and R12 can be C=O, with the definitions for R16 as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, R1은 NR16일 수 있고, R12는 -OC(=O)-일 수 있으며, R16에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, R1 can be NR16 and R12 can be -OC(=O)-, with the definitions for R16 as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, R12는 NR16일 수 있고, R11은 C=O일 수 있으며, R16에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, R12 can be NR16 and R11 can be C=O, with the definitions for R16 as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, R12는 NR16일 수 있고, R11은 -OC(=O)-일 수 있으며, R16에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, R12 can be NR16 and R11 can be -OC(=O)-, with the definitions for R16 as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, R11은 NH일 수 있고, R12는 C=O일 수 있다.In some embodiments, R11 can be NH and R12 can be C=O.
일부 실시양태에서, R12는 NH일 수 있고 R11은 C=O일 수 있다.In some embodiments, R12 can be NH and R11 can be C=O.
일부 실시양태에서, R16은 수소 또는 C1-6 알킬일 수 있다.In some embodiments, R16 can be hydrogen or C1-6 alkyl.
일부 실시양태에서, R16은 수소, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필일 수 있다.In some embodiments, R16 can be hydrogen, methyl, ethyl, propyl, or isopropyl.
일부 실시양태에서, R16은 수소일 수 있다.In some embodiments, R16 can be hydrogen.
일부 실시양태에서, R17 및 R18은 수소일 수 있다.In some embodiments, R17 and R18 can be hydrogen.
일부 실시양태에서, R19는 수소일 수 있다.In some embodiments, R19 can be hydrogen.
일부 실시양태에서, 고리 A가 존재하는 경우, 고리 A는 C6-12 아릴일 수 있다.In some embodiments, when Ring A is present, Ring A may be C6-12 aryl.
일부 실시양태에서, 고리 A는 페닐일 수 있다.In some embodiments, Ring A can be phenyl.
일부 실시양태에서, m1은 0 또는 1일 수 있다.In some embodiments, m1 can be 0 or 1.
일부 실시양태에서, m1은 3일 수 있다.In some embodiments, m1 can be 3.
일부 실시양태에서, n1은 0 또는 1일 수 있다.In some embodiments, n1 can be 0 or 1.
일부 실시양태에서, p1 및 q1은 독립적으로 0 또는 1이다.In some embodiments, p1 and q1 are independently 0 or 1.
일부 실시양태에서, p1=1이고 q1=1이다.In some embodiments, p1=1 and q1=1.
일부 실시양태에서, p1=1이고 q1=0이다.In some embodiments, p1=1 and q1=0.
일부 실시양태에서, p1=0이고 q1=1이다.In some embodiments, p1=0 and q1=1.
일부 실시양태에서, p1=0이고 q1=0이다.In some embodiments, p1=0 and q1=0.
일부 실시양태에서, z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0~4의 정수일 수 있다. 일부 실시양태에서, z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8 및 z9는 독립적으로 0, 1 또는 2일 수 있다.In some embodiments, z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8, and z9 can independently be integers from 0 to 4. In some embodiments, z1, z2, z3, z4, z5, z6, z7, z8, and z9 can independently be 0, 1, or 2.
일부 실시양태에서, B1은일 수 있고, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 독립적으로 -C(=O)- 또는 -NHC(=O)-이고, N원자는 L1에 연결되며, z1, z2, z3 및 z4에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, B1 is may be, Rb1 , Rb2 , Rb3 and Rb4 are independently -C(=O)- or -NHC(=O)-, the N atom is connected to L1 , z1, z2, z3 and The definition for z4 is as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, B1은일 수 있고, Rb1, Rb2, Rb3 및 Rb4는 독립적으로 -C(=O)- 또는 -NHC(=O)-이고, N원자는 L1에 연결되고, Rb1, Rb3 및 Rb4는 동일하며, z1, z2, z3 및 z4에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, B1 is may be, Rb1 , Rb2 , Rb3 and Rb4 are independently -C(=O)- or -NHC(=O)-, the N atom is connected to L1 , and Rb1 , Rb3 and Rb4 is the same and the definitions for z1, z2, z3 and z4 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, B1은일 수 있다.In some embodiments, B1 is It can be.
일부 실시양태에서, B1은일 수 있다.In some embodiments, B1 is It can be.
일부 실시양태에서, B1은일 수 있고, Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고, N원자는 L1에 연결되며, z5, z6, z7, z8 및 z9에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, B1 is may be, and Rb5 , Rb6 and Rb7 are independently -C(=O)-(CH2 )z8 -O- or -NHC(=O)-(CH2 )z9 -O-, and the N atom is connected to L1 and the definitions for z5, z6, z7, z8 and z9 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, B1은일 수 있고, Rb5, Rb6 및 Rb7은 독립적으로 -C(=O)-(CH2)z8-O- 또는 -NHC(=O)-(CH2)z9-O-이고, N원자는 L1에 연결되고, Rb5, Rb6 및 Rb7은 동일하며, z5, z6, z7, z8 및 z9에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, B1 is may be, and Rb5 , Rb6 and Rb7 are independently -C(=O)-(CH2 )z8 -O- or -NHC(=O)-(CH2 )z9 -O-, and the N atom is connected to L1 , Rb5 , Rb6 and Rb7 are the same, and the definitions for z5, z6, z7, z8 and z9 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, B1은일 수 있다.In some embodiments, B1 is It can be.
일부 실시양태에서, L2는 L4 또는 L4-R13-R14-L4일 수 있고, 여기서, L4는 독립적으로 C1-C12 알킬 사슬 또는 -(CH2)j15-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j16-이고, R13 및 R14는 독립적으로 화학 결합, -NR115-, -C(=O)- 또는 -OC(=O)-이며, R115는 독립적으로 수소 또는 C1-C12 알킬이고, j15 및 j16은 독립적으로 0~10의 정수이다. 일부 실시양태에서, j15 및 j16은 독립적으로 0~6의 정수이다. 일부 실시양태에서, j15 및 j16은 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이다.In some embodiments, L2 can be L4 or L4 -R13 -R14 -L4 , where L4 is independently a C1 -C12 alkyl chain or -(CH2 )j15 -(OCH2 CH2 )1-4 -(CH2 )j16 -, R13 and R14 are independently a chemical bond, -NR115 -, -C(=O)- or -OC(=O)-, R115 is independently hydrogen or C1 -C12 alkyl, and j15 and j16 are independently integers from 0 to 10. In some embodiments, j15 and j16 are independently integers from 0 to 6. In some embodiments, j15 and j16 are independently 0, 1, 2, 3, or 4.
일부 실시양태에서, L2는 -(CH2)j15-(OCH2CH2)1-4-(CH2)j16-일 수 있으며, j15 및 j16에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, L2 can be -(CH2 )j15 -(OCH2 CH2 )1-4 -(CH2 )j16 -, and the definitions for j15 and j16 are as described in any of the preceding embodiments. .
일부 실시양태에서, L2는 또는일 수 있다. 일부 실시양태에서, L2는일 수 있고, 여기서, 한쪽은 O원자에 연결되고 다른 쪽은 B1에 연결된다.In some embodiments, L2 is or It can be. In some embodiments, L2 is It may be, where one side is connected to the O atom and the other side is connected to B1 .
일부 실시양태에서, L2는 C1-C12 알킬 사슬일 수 있다.In some embodiments, L2 can be a C1 -C12 alkyl chain.
일부 실시양태에서, L2는,,, 또는일 수 있다.In some embodiments, L2 is , , , or It can be.
일부 실시양태에서, L2는일 수 있다. 일부 실시양태에서, L2는일 수 있다. 일부 실시양태에서, L2는일 수 있다. 일부 실시양태에서, L2는일 수 있다. 여기서, a3 단은 O원자에 연결되고, b3 단은 B1에 연결된다.In some embodiments, L2 is It can be. In some embodiments, L2 is It can be. In some embodiments, L2 is It can be. In some embodiments, L2 is It can be. Here, the a3 end is connected to the O atom, and the b3 end is connected to B1 .
일부 실시양태에서, L2는일 수 있고, 여기서, a3 단은 O원자에 연결되고, b3 단은 B1에 연결된다.In some embodiments, L2 is It may be, where the a3 end is connected to the O atom, and the b3 end is connected to B1 .
일부 실시양태에서, r1은 3, 4, 5 또는 6일 수 있다. 일부 실시양태에서, r1은 3일 수 있다.In some embodiments, r1 can be 3, 4, 5, or 6. In some embodiments, r1 can be 3.
일부 실시양태에서, Q3은 또는일 수 있다. 일부 실시양태에서, Q3은일 수 있다. 여기서, R13, R14, R15 및 n1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Q3 is or It can be. In some embodiments, Q3 is It can be. Here, the definitions for R13 , R14 , R15 and n1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,는일 수 있고, 여기서, R13, R14, R15, p1 및 q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Is may be, wherein the definitions for R13 , R14 , R15 , p1 and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,은,, 또는일 수 있고, 여기서, R13, R14, R15, p1 및 q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, silver , , or may be, wherein the definitions for R13 , R14 , R15 , p1 and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,는, 또는일 수 있다. 일부 실시양태에서,는 또는일 수 있다. 일부 실시양태에서,는일 수 있다. p1 및 q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Is , or It can be. In some embodiments, Is or It can be. In some embodiments, Is It can be. The definitions for p1 and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,는,,,,,,,,,, 또는일 수 있다. 일부 실시양태에서,는,,,,,, 또는일 수 있다. 일부 실시양태에서,는,, 또는일 수 있다. p1 및 q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Is , , , , , , , , , , or It can be. In some embodiments, Is , , , , , , or It can be. In some embodiments, Is , , or It can be. The definitions for p1 and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,는일 수 있고, 여기서, R13, R14, n1, p1 및 q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Is may be, wherein the definitions for R13 , R14 , n1, p1 and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,는 또는일 수 있고, 여기서, R13, R14, n1, p1 및 q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Is or may be, wherein the definitions for R13 , R14 , n1, p1 and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,는 또는일 수 있고, 일부 실시양태에서,는일 수 있다. n1, p1, q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Is or may be, and in some embodiments, Is It can be. The definitions for n1, p1, and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서,는 또는일 수 있고, n1, p1 및 q1에 대한 정의는 앞서 임의의 양태에 기재된 바와 같다.In some embodiments, Is or may be, and the definitions for n1, p1, and q1 are as described in any of the preceding embodiments.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 이하 임의의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며,In some embodiments, the ligand may be any of the structures below or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
..
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 이하 임의의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며,In some embodiments, the ligand may be any of the structures below or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 이하 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택되며,In some embodiments, the ligand is selected from the following structure or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
일부 실시양태에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은, 또는이고, B는 구아닌, 아데닌, 시토신 및 우라실로부터 선택되며; 상기 리간드는 다음 임의의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염미며,In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is , or and B is selected from guanine, adenine, cytosine and uracil; The ligand is any of the following structures or pharmaceutically acceptable salts thereof,
일부 실시양태에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은, 또는이고, B는 구아닌, 아데닌, 시토신 및 우라실로부터 선택되며, 상기 리간드는 다음 임의의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염미며,In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is , or and B is selected from guanine, adenine, cytosine and uracil, and the ligand is any of the following structures or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
일부 실시양태에서, 상기 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은, 또는이고, B는 구아닌, 아데닌, 시토신 및 우라실로부터 선택되며, 상기 리간드는 다음 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염미며,In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is , or and B is selected from guanine, adenine, cytosine and uracil, and the ligand is the following structure or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
일부 실시양태에서, 위의 리간드 중의 N-아세틸-갈락토사민 부분은 N-트리플루오로아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부티릴갈락토사민 또는 N-이소부티릴갈락토사민으로 대체될 수 있다.In some embodiments, the N-acetyl-galactosamine moiety of the above ligand is N-trifluoroacetylgalactosamine, N-propionylgalactosamine, N-n-butyrylgalactosamine, or N-isobutyrylgalactosamine. can be replaced with
일부 실시양태에서, 상기 siRNA 및 상기 리간드는 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된다.In some embodiments, the siRNA and the ligand are covalently or non-covalently linked.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥의 3' 단 및/또는 5' 단은 상기 리간드에 접합될 수 있다.In some embodiments, the 3' end and/or 5' end of the sense strand may be conjugated to the ligand.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥의 3' 단은 상기 리간드에 접합될 수 있다.In some embodiments, the 3' end of the sense strand can be conjugated to the ligand.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 포스페이트 그룹 또는 포스포로티오에이트 그룹을 통해 상기 siRNA 말단에 연결된다.In some embodiments, the ligand is linked to the siRNA terminus through a phosphate group or phosphorothioate group.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 포스포디에스테르 그룹 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 그룹을 통해 상기 siRNA 말단에 연결된다.In some embodiments, the ligand is linked to the siRNA terminus through a phosphodiester group or a phosphorothioate diester group.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 포스포디에스테르 그룹을 통해 상기 siRNA 말단에 연결된다.In some embodiments, the ligand is linked to the siRNA terminus through a phosphodiester group.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 포스페이트 그룹 또는 포스포로티오에이트 그룹을 통해 상기 siRNA 말단에 간접적으로 연결된다.In some embodiments, the ligand is indirectly linked to the siRNA terminus through a phosphate group or phosphorothioate group.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 포스페이트 그룹 또는 포스포로티오에이트 그룹을 통해 상기 siRNA 말단에 직접적으로 연결된다.In some embodiments, the ligand is linked directly to the siRNA terminus via a phosphate group or phosphorothioate group.
일부 실시양태에서, 상기 리간드는 포스페이트 그룹 또는 포스포로티오에이트 그룹을 통해 상기 siRNA의 센스 가닥 3' 말단에 직접적으로 연결된다.In some embodiments, the ligand is linked directly to the 3' end of the sense strand of the siRNA via a phosphate group or phosphorothioate group.
일부 실시양태에서, 상기 포스페이트 그룹은 포스포에스테르 그룹 또는 포스포디에스테르 그룹이다. 일부 실시양태에서, 상기 포스페이트 그룹은 포스포디에스테르 그룹이다.In some embodiments, the phosphate group is a phosphoester group or a phosphodiester group. In some embodiments, the phosphate group is a phosphodiester group.
일부 실시양태에서, 상기 포스포로티오에이트 그룹은 포스포로티오에이트 에스테르 그룹 또는 포스포로티오에이트 디에스테르 그룹이다. 일부 실시양태에서, 상기 포스포로티오에이트 그룹은 포스포로티오에이트 디에스테르 그룹이다.In some embodiments, the phosphorothioate group is a phosphorothioate ester group or a phosphorothioate diester group. In some embodiments, the phosphorothioate group is a phosphorothioate diester group.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 임의의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며,In some embodiments, the dsRNA may be any of the structures below or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
, 여기서, Z는 siRNA이고, 상기 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단은 포스포로티오에이트 디에스테르 그룹을 통해 리간드에 직접적으로 연결되며, 상기 siRNA는 본 개시에 정의된 바와 같다., where Z is a siRNA, and the 3' end of the sense strand of the siRNA is directly linked to the ligand through a phosphorothioate diester group, and the siRNA is as defined in the present disclosure.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 임의의 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며,In some embodiments, the dsRNA may be any of the structures below or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
여기서, Z는 siRNA이고, 상기 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단은 포스포디에스테르 그룹을 통해 리간드에 직접적으로 연결되며, 상기 siRNA는 본 개시에 정의된 바와 같다.Here, Z is siRNA, the 3' end of the sense strand of the siRNA is directly linked to the ligand through a phosphodiester group, and the siRNA is as defined in the present disclosure.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며,In some embodiments, the dsRNA may be the structure below or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
여기서, Z는 siRNA이고, 상기 siRNA의 센스 가닥의 3' 말단은 포스포디에스테르 그룹을 통해 리간드에 직접적으로 연결되며, 상기 siRNA는 본 개시에 정의된 바와 같다.where Z is siRNA, the 3' end of the sense strand of the siRNA is directly linked to the ligand through a phosphodiester group, and the siRNA is as defined in the present disclosure.
일부 실시양태에서, siRNA가 세포 내로 진입하는 것을 촉진하기 위해, 콜레스테롤 등 친유성 그룹을 siRNA의 센스 가닥의 말단에 도입할 수 있고, 친유성 그룹은 공유 결합에 의해 siRNA와 결합하는, 예컨대, 말단에 도입된 콜레스테롤, 지질단백질, 비타민 E 등이 포함되어, 지질 이중 분자층으로 구성된 세포막을 통해 세포내 mRNA와 상호작용을 유리하게 한다. 동시에, siRNA는 또한 비공유 결합으로 변형되고, 예컨대 소수성 결합 또는 이온 결합을 통해 인지질 분자, 폴리펩티드, 양이온성 폴리머 등과 결합하여 안정성과 생물학적 활성을 향상시킬 수 있다.In some embodiments, to facilitate entry of the siRNA into cells, a lipophilic group, such as cholesterol, can be introduced to the end of the sense strand of the siRNA, and the lipophilic group covalently binds to the siRNA, e.g. It contains cholesterol, lipoprotein, vitamin E, etc. introduced into the cell and facilitates interaction with intracellular mRNA through the cell membrane composed of a lipid double molecule layer. At the same time, siRNA can also be non-covalently modified and bound to phospholipid molecules, polypeptides, cationic polymers, etc. through hydrophobic bonds or ionic bonds, for example, to improve stability and biological activity.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오티드, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 안티센스 가닥의 5' 단으로부터 5번째, 6번째 또는 7번째 위치에 위치한다.In some embodiments, the nucleotide comprising the chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is located at the 5th, 6th, or 7th position from the 5' end of the antisense strand. .
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오티드, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 안티센스 가닥의 5' 단의 7번째 위치에 위치한다.In some embodiments, the nucleotide comprising the chemical modification represented by Formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is located at the 7th position of the 5' end of the antisense strand.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형은 이의 5' 단으로부터 5번째 위치에 있는 경우, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt modification thereof is at the 5th position from the 5' end thereof, and B is adenine, guanine, 2,6- It is selected from diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형은 이의 5' 단으로부터 6번째 위치에 있는 경우, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt modification thereof is at the 6th position from the 5' end thereof, and B is adenine, guanine, 2,6- It is selected from diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형은 이의 5' 단으로부터 7번째 위치에 있는 경우, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt modification thereof is at the 7th position from the 5' end thereof, and B is adenine, guanine, 2,6- It is selected from diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형은 이의 5' 단으로부터 8번째 위치에 있는 경우, B는 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린, 6-디메틸아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 시토신, 우라실, 티민, 인돌, 5-니트로인돌 및 3-니트로피롤로부터 선택된다.In some embodiments, the chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt modification thereof is at the 8th position from the 5' end thereof, and B is adenine, guanine, 2,6- It is selected from diaminopurine, 6-dimethylaminopurine, 2-aminopurine, cytosine, uracil, thymine, indole, 5-nitroindole and 3-nitropyrrole.
일부 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 5번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is identical to the base at which the nucleotide at the 5th position from the 5' end of the antisense strand would be unmodified.
일부 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 6번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is identical to the base at which the nucleotide at the 6th position from the 5' end of the antisense strand would be unmodified.
일부 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 7번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is identical to the base at which the nucleotide at the 7th position from the 5' end of the antisense strand would be unmodified.
일부 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 8번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다.In some embodiments, B is identical to the base at which the nucleotide at the 8th position from its 5' end of the antisense strand would be unmodified.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형을 제외한 나머지 위치에서, 상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 중 적어도 하나의 다른 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다.In some embodiments, at positions other than the chemical modification represented by Formula (I), at least one other nucleotide of the sense strand and/or antisense strand is a modified nucleotide.
일부 실시양태에서, 상기 변형 뉴클레오티드는 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드, 2'-치환된 알콕시 변형 뉴클레오티드, 2'-알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-치환된 알킬 변형 뉴클레오티드, 2'-아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-치환된 아미노 변형 뉴클레오티드, 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 3'-데옥시-티민 뉴클레오티드, 이소뉴클레오티드, LNA, ENA, cET, UNA, GNA로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변형 뉴클레오티드는 서로 독립적으로 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드 또는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드로부터 선택된다.In some embodiments, the modified nucleotide is a 2'-methoxy modified nucleotide, a 2'-substituted alkoxy modified nucleotide, a 2'-alkyl modified nucleotide, a 2'-substituted alkyl modified nucleotide, a 2'-amino modified nucleotide, 2 '-Substituted amino modified nucleotide, 2'-fluoro modified nucleotide, 2'-deoxynucleotide, 2'-deoxy-2'-fluoro modified nucleotide, 3'-deoxy-thymine nucleotide, isonucleotide, LNA , ENA, cET, UNA, GNA. In some embodiments, the modified nucleotides are independently of each other selected from 2'-methoxy modified nucleotides or 2'-fluoro modified nucleotides.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥은 동일한 변형을 갖는 3개의 연속전인 뉴클레오티드를 포함한다.In some embodiments, the sense strand comprises three consecutive nucleotides with the same modification.
일부 실시양태에서, 상기 동일한 변형을 갖는 3개의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드이다.In some embodiments, the three nucleotides with the same modification are 2'-fluoro modified nucleotides.
일부 실시양태에서, 5' 단에서 3' 단으로의 방향에 따라, 상기 안티센스 가닥의 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16 및 18번째 위치의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드이다.In some embodiments, depending on the direction from the 5' end to the 3' end, the nucleotides at positions 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, and 18 of the antisense strand are each independently 2'-fluoro. It is a modified nucleotide.
일부 실시양태에서, 상기 안티센스 가닥은 표적 서열과 적어도 부분적으로 역상보적이다. 일부 실시양태에서, 상기 안티센스 가닥과 표적 서열 사이에는 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 미스매칭이 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 안티센스 가닥은 표적 서열과 완전히 역상보적이다.In some embodiments, the antisense strand is at least partially reverse complementary to the target sequence. In some embodiments, there are no more than 5, no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1 mismatch between the antisense strand and the target sequence. In some embodiments, the antisense strand is fully reverse complementary to the target sequence.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥은 이중 가닥 영역을 형성하도록 안티센스 가닥과 적어도 부분적으로 역상보적이다. 일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에는 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 1개 이하의 미스매칭이 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥은 안티센스 가닥과 완전히 역상보적이다.In some embodiments, the sense strand is at least partially reverse complementary to the antisense strand to form a double-stranded region. In some embodiments, there are no more than 5, no more than 4, no more than 3, no more than 2, no more than 1 mismatch between the sense and antisense strands. In some embodiments, the sense strand is completely reverse complementary to the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 16 내지 35개, 16 내지 34개, 17 내지 34개, 17 내지 33개, 18 내지 33개, 18 내지 32개, 18 내지 31개, 18 내지 30개, 18 내지 29개, 18 내지 28개, 18 내지 27개, 18 내지 26개, 18 내지 25개, 18 내지 24개, 18 내지 23개, 19 내지 25개, 19 내지 24개 또는 19 내지 23개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20, 21, 22, 23개의 뉴클레오티드)를 갖는다.In some embodiments, the sense strand and the antisense strand each independently have 16 to 35, 16 to 34, 17 to 34, 17 to 33, 18 to 33, 18 to 32, 18 to 31, 18 to 30, 18 to 29, 18 to 28, 18 to 27, 18 to 26, 18 to 25, 18 to 24, 18 to 23, 19 to 25, 19 to 24 or has 19 to 23 nucleotides (e.g., 19, 20, 21, 22, 23 nucleotides).
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥은 길이가 동일하거나 상이하며, 상기 센스 가닥의 길이는 19~23개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20, 21, 22, 23개의 뉴클레오티드)이며, 상기 안티센스 가닥의 길이는 19~26개의 뉴클레오티드이다. 본 개시에서 제공하는 dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 길이 비율은 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/19, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/23, 23/24, 23/25 또는 23/26일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이 비율은 19/21, 21/23 또는 23/25이다. 일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥의 길이 비율은 19/21이다.In some embodiments, the sense strand and the antisense strand are the same or different in length, and the sense strand is 19-23 nucleotides in length (e.g., 19, 20, 21, 22, 23 nucleotides), and The antisense strand is 19 to 26 nucleotides in length. The length ratio of the sense strand and antisense strand of the dsRNA provided in the present disclosure is 19/19, 19/20, 19/21, 19/22, 19/23, 19/24, 19/25, 19/26, 20/ 19, 20/20, 20/21, 20/22, 20/23, 20/24, 20/25, 20/26, 21/20, 21/21, 21/22, 21/23, 21/24, 21/25, 21/26, 22/20, 22/21, 22/22, 22/23, 22/24, 22/25, 22/26, 23/20, 23/21, 23/22, 23/ It could be 23, 23/24, 23/25 or 23/26. In some embodiments, the length ratio of the sense and antisense strands is 19/21, 21/23, or 23/25. In some embodiments, the length ratio of the sense strand and antisense strand is 19/21.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA는 1개 또는 2개의 평활 단을 포함한다.In some embodiments, the siRNA comprises one or two blunt ends.
일부 구체적인 실시양태에서, siRNA의 각 가닥은 각각 독립적으로 오버행 단을 형성하는 1 내지 2개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함한다.In some specific embodiments, each strand of siRNA comprises one to two unpaired nucleotides, each independently forming an overhang end.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA는 상기 안티센스 가닥의 3' 단에 위치한 오버행 단을 포함한다.In some embodiments, the siRNA comprises an overhanging end located at the 3' end of the antisense strand.
일부 실시양태에서, siRNA 센스 가닥에서 5' 단의 7~9번째 위치에 위치한 3개의 연속적인 뉴클레오티드는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드이다.In some embodiments, the three consecutive nucleotides located at positions 7-9 of the 5' end in the siRNA sense strand are 2'-fluoro modified nucleotides.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥은 하기 식으로 표시된 바와 같은 뉴클레오티드(5'-3')를 함유한다:In some embodiments, the sense strand contains nucleotides (5'-3') as represented by the formula:
NaNaNaNaXNaNbNbNbNaNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa Na Na Na XNa Nb Nb Nb Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na
여기서, 각 X는 독립적으로 Na 또는 Nb이고; Na는 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드이고, Nb는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드이다.where each X is independently Na or Nb ; Na is a 2'-methoxy modified nucleotide and Nb is a 2'-fluoro modified nucleotide.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥은 하기 식으로 표시된 바와 같은 뉴클레오티드를 함유한다:In some embodiments, the sense strand contains nucleotides as represented by the formula:
5'-NaNaNaNaNaNaNbNbNbNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa-3'; 또는,5'-Na Na Na Na Na Na Nb Nb Nb Na Na Na Na Na Na Na Na Na Na -3'; or,
5'-NaNaNaNaNbNaNbNbNbNaNaNaNaNaNaNaNaNaNa-3';5'-Na Na Na Na Nb Na Nb Nb Nb Na Na Na Na Na NaN a Na Na Na -3';
여기서, Na는 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드이고, Nb는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드이다.Here, Na is a 2'-methoxy modified nucleotide and Nb is a 2'-fluoro modified nucleotide.
일부 실시양태에서, 상기 안티센스 가닥은 하기 식으로 표시된 바와 같은 뉴클레오티드를 함유한다:In some embodiments, the antisense strand contains nucleotides as represented by the formula:
5'-Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'W'Na'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Nb'Na'Na'Na'-3';5'-Na 'Nb 'Na 'Nb 'Na 'Nb 'W'Na 'Na 'Nb 'Na 'Nb 'Na 'Nb 'Na 'Nb ' Na 'Nb 'Na 'Na 'Na '-3';
여기서, Na'는 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드이고, Nb'는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드이며; W'는 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드 또는 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.where Na ' is a 2'-methoxy modified nucleotide and Nb ' is a 2'-fluoro modified nucleotide; W' represents a 2'-methoxy modified nucleotide or a nucleotide comprising a chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt modification thereof.
일부 구체적인 실시양태에서, W'는 식 (I)로 표시되는 화학적 변형을 포함하는 뉴클레오티드, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 나타낸다.In some specific embodiments, W' represents a nucleotide comprising a chemical modification represented by Formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
일부 구체적인 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 다음으로부터 선택된다:In some specific embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is selected from:
, 및; 여기서: B는 구아닌, 아데닌, 시토신 및 우라실로부터 선택된다. 일부 구체적인 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 7번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다., and ; where: B is selected from guanine, adenine, cytosine and uracil. In some specific embodiments, B is the same as the base at which the nucleotide at the 7th position from the 5' end of the antisense strand is unmodified.
일부 구체적인 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 다음으로부터 선택된다:In some specific embodiments, the chemical modification represented by formula (I) is selected from:
, 및; 여기서: M은 O 또는 S이며; 여기서: B는 구아닌, 아데닌, 시토신 또는 우라실로부터 선택된다. 일부 구체적인 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 7번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다., and ; Where: M is O or S; where: B is selected from guanine, adenine, cytosine or uracil. In some specific embodiments, B is identical to the base at which the 7th position from the 5' end of the antisense strand would be unmodified.
일부 구체적인 실시양태에서, M은 S이다. 일부 구체적인 실시양태에서, M은 O이다.In some specific embodiments, M is S. In some specific embodiments, M is O.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥 중 적어도 하나의 포스페이트는 변형 그룹을 갖는 포스페이트이다. 상기 변형 그룹은 상기 siRNA로 하여금 생물학적 샘플 또는 환경에서 향상된 안정성을 갖도록 한다. 일부 실시양태에서, 상기 변형 그룹을 갖는 포스페이트는 포스포로티오에이트이다. 일부 실시양태에서, 상기 변형 그룹을 갖는 포스페이트는 포스포로티오에이트 디에스테르이다.In some embodiments, at least one phosphate of the sense strand and/or antisense strand is a phosphate with a modifying group. The group of modifications allows the siRNA to have improved stability in biological samples or the environment. In some embodiments, the phosphate having the modification group is phosphorothioate. In some embodiments, the phosphate bearing the modification group is a phosphorothioate diester.
일부 실시양태에서, 상기 포스포로티오에이트 디에스테르는 이하 위치 중 적어도 하나의 위치에 존재한다:In some embodiments, the phosphorothioate diester is at at least one of the following positions:
상기 센스 가닥의 5' 단의 1번째 뉴클레오티드와 2번째 뉴클레오티드 사이;Between the first and second nucleotides of the 5' end of the sense strand;
상기 센스 가닥의 5' 단의 2번째 뉴클레오티드와 3번째 뉴클레오티드 사이;Between the 2nd and 3rd nucleotides of the 5' end of the sense strand;
상기 안티센스 가닥의 5' 단의 1번째 뉴클레오티드와 2번째 뉴클레오티드 사이;Between the first and second nucleotides of the 5' end of the antisense strand;
상기 안티센스 가닥의 5' 단의 2번째 뉴클레오티드와 3번째 뉴클레오티드 사이;Between the 2nd and 3rd nucleotides of the 5' end of the antisense strand;
상기 안티센스 가닥의 3' 단의 1번째 뉴클레오티드와 2번째 뉴클레오티드 사이; 및Between the first and second nucleotides of the 3' end of the antisense strand; and
상기 안티센스 가닥의 3' 단의 2번째 뉴클레오티드와 3번째 뉴클레오티드 사이.Between the 2nd and 3rd nucleotides of the 3' end of the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에는 복수의 포스포로티오에이트 디에스테르가 포함되고, 상기 포스포로티오에이트 디에스테르는 다음에 존재한다:In some embodiments, the sense strand and/or antisense strand comprises a plurality of phosphorothioate diesters, wherein the phosphorothioate diesters are:
상기 센스 가닥의 5' 단의 1번째 뉴클레오티드와 2번째 뉴클레오티드 사이; 및,Between the first and second nucleotides of the 5' end of the sense strand; and,
상기 센스 가닥의 5' 단의 2번째 뉴클레오티드와 3번째 뉴클레오티드 사이; 및,Between the 2nd and 3rd nucleotides of the 5' end of the sense strand; and,
상기 안티센스 가닥의 5' 단의 1번째 뉴클레오티드와 2번째 뉴클레오티드 사이; 및,Between the first and second nucleotides of the 5' end of the antisense strand; and,
상기 안티센스 가닥의 5' 단의 2번째 뉴클레오티드와 3번째 뉴클레오티드 사이; 및,Between the 2nd and 3rd nucleotides of the 5' end of the antisense strand; and,
상기 안티센스 가닥의 3' 단의 1번째 뉴클레오티드와 2번째 뉴클레오티드 사이; 및,Between the first and second nucleotides of the 3' end of the antisense strand; and,
상기 안티센스 가닥의 3' 단의 2번째 뉴클레오티드와 3번째 뉴클레오티드 사이.Between the 2nd and 3rd nucleotides of the 3' end of the antisense strand.
일부 실시양태에서, 상기 센스 가닥은 하기 식으로 표시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다:In some embodiments, the sense strand comprises a nucleotide sequence as represented by the formula:
5'-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3', 또는,5'-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3', or,
5'-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3',5'-NmsNmsNmNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3',
여기서, Nm은 2'-메톡시 변형 C, G, U, A와 같은 임의의 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드를 나타내고, Nf는 2'-플루오로 변형 C, G, U, A와 같은 임의의 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드를 나타내며;where Nm represents any 2'-methoxy modified nucleotide such as 2'-methoxy modified C, G, U, A and Nf represents any 2'-fluoro modified nucleotide such as C, G, U, A. represents a 2'-fluoro modified nucleotide;
소문자 s는 해당 문자 s의 왼쪽과 오른쪽에 인접한 두 개의 뉴클레오티드 사이가 포스포로티오에이트 디에스테르에 의해 연결됨을 나타내고; 소문자 s가 3' 단의 1번째에 있는 경우, 해당 문자 s의 업스트림(5' 방향)에 인접한 뉴클레오티드의 말단이 포스포로티오에이트 디에스테르임을 나타낸다.The lowercase letter s indicates that the two adjacent nucleotides to the left and right of the letter s are linked by a phosphorothioate diester; When the lowercase letter s is in the first position of the 3' end, it indicates that the terminus of the nucleotide adjacent to the upstream (5' direction) of the letter s is a phosphorothioate diester.
일부 실시양태에서, 상기 안티센스 가닥은 하기 식으로 표시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한다:In some embodiments, the antisense strand comprises a nucleotide sequence as represented by the formula:
5'-Nm'sNf'sNm'Nf'Nm'Nf'W'Nm'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'sNm'sNm'-3';5'-Nm'sNf'sNm'Nf'Nm'Nf'W'Nm'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'Nf'Nm'sNm'sNm'-3';
여기서, Nm'는 2'-메톡시 변형 C, G, U, A와 같은 임의의 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드를 나타내고; Nf'는 2'-플루오로 변형 C, G, U, A와 같은 임의의 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드를 나타내며;where Nm' represents any 2'-methoxy modified nucleotide such as 2'-methoxy modified C, G, U, A; Nf' represents any 2'-fluoro modified nucleotide such as 2'-fluoro modified C, G, U, A;
소문자 s는 해당 문자 s의 왼쪽과 오른쪽에 인접한 두 개의 뉴클레오티드 사이가 포스포로티오에이트 디에스테르에 의해 연결됨을 나타내고, 소문자 s가 3' 단의 1번째에 있는 경우, 해당 문자 s의 업스트림에 인접한 뉴클레오티드의 말단이 포스포로티오에이트 디에스테르임을 나타내며;The lowercase letter s indicates that the two adjacent nucleotides to the left and right of the letter s are linked by a phosphorothioate diester, and if the lowercase letter s is in the first of the 3' end, the nucleotide adjacent to the upstream of the letter s. indicates that the terminus of is a phosphorothioate diester;
W'는 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드 또는 식 (I)로 표시되는 화학적 변형, 이의 호변 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.W' represents a 2'-methoxy modified nucleotide or a nucleotide comprising a chemical modification represented by formula (I), a tautomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt modification thereof.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 다음으로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by Formula (I) is selected from:
, 및; 여기서: B는 구아닌, 아데닌, 시토신 및 우라실로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 7번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다., and ; where: B is selected from guanine, adenine, cytosine and uracil. In some embodiments, B is identical to the base at which the nucleotide at the 7th position from the 5' end of the antisense strand would be unmodified.
일부 실시양태에서, 식 (I)로 표시되는 화학적 변형은 다음으로부터 선택된다:In some embodiments, the chemical modification represented by Formula (I) is selected from:
, 및; 여기서: M은 O 또는 S이며; 여기서: B는 구아닌, 아데닌, 시토신 또는 우라실로부터 선택된다. 일부 구체적인 실시양태에서, B는 상기 안티센스 가닥의 이의 5' 단으로부터 7번째 위치의 뉴클레오티드가 변형되지 않은 경우의 염기와 동일하다., and ; Where: M is O or S; where: B is selected from guanine, adenine, cytosine or uracil. In some specific embodiments, B is the same as the base at which the nucleotide at the 7th position from the 5' end of the antisense strand is unmodified.
일부 실시양태에서, M은 S이다. 일부 구체적인 실시양태에서, M은 O이다.In some embodiments, M is S. In some specific embodiments, M is O.
HBV를 표적으로 하는 dsRNAdsRNA targeting HBV
일부 실시양태에서, 상기 siRNA는 B형 간염 바이러스(HBV) 유전자를 표적으로 하는 siRNA이다.In some embodiments, the siRNA is an siRNA targeting the hepatitis B virus (HBV) gene.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA는 HBV-S를 표적으로 하는 siRNA이다.In some embodiments, the siRNA is an siRNA targeting HBV-S.
일부 구체적인 실시양태에서, HBV-S를 표적으로 하는 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some specific embodiments, the sense strand and antisense strand of the siRNA targeting HBV-S are selected from any of the following groups:
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2를 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6을 포함한다.The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO:2 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO:6.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA는 HBV-X를 표적으로 하는 siRNA이다.In some embodiments, the siRNA is an siRNA targeting HBV-X.
일부 구체적인 실시양태에서, HBV-X를 표적으로 하는 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some specific embodiments, the sense strand and antisense strand of the siRNA targeting HBV-X are selected from any of the following groups:
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4를 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 4 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8을 포함한다.The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 8.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA의 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4 중 임의의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열을 포함하며, 이는 적어도 15개(일부 실시양태에서, 적어도 19개로부터 선택됨)의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하며, 및/또는,In some embodiments, the sense strand of the siRNA comprises a sequence that differs by no more than 3 nucleotides from any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, which is at least 15 (in some embodiments , selected from at least 19) consecutive nucleotides, and/or,
안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 8 중 임의의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열을 포함하고, 이는 적어도 19개(일부 실시양태에서, 적어도 21개)의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다.The antisense strand comprises a sequence that differs by no more than 3 nucleotides from any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, which is a contiguous sequence of at least 19 (in some embodiments, at least 21) Contains negative nucleotides.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA의 센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4 중 임의의 하나를 포함하며, 및/또는, 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 8 중 임의의 하나를 포함하며;In some embodiments, the nucleotide sequence of the sense strand of the siRNA comprises any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and/or the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 5 to Contains any one of SEQ ID NO: 8;
일부 실시양태에서, 상기 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some embodiments, the sense strand and antisense strand of the siRNA are selected from any of the following groups:
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2를 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6을 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 6;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7을 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 7;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4를 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 4 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8을 포함한다.The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 8.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some embodiments, the sense strand and antisense strand of the siRNA are selected from any of the following groups:
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 6;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 7;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 4 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8이다.The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 8.
본 개시에서, 5'-3' 방향으로,In the present disclosure, in the 5'-3' direction,
SEQ ID NO: 1은 GUGUGCACUUCGCUUCACC이며;SEQ ID NO: 1 is GUGUGCACUUCGCUUCACC;
SEQ ID NO: 2는 CUUUUGUCUUUGGGUAUAU이며;SEQ ID NO: 2 is CUUUUGUCUUUGGGUAUAU;
SEQ ID NO: 3은 UUACCAAUUUUCUUUUGUU이며;SEQ ID NO: 3 is UUACCAAUUUUCUUUUGUU;
SEQ ID NO: 4는 GUGUGCACUUCGCUUCACU이며;SEQ ID NO: 4 is GUGUGCACUUCGCUUCACU;
SEQ ID NO: 5는 AGUGAAGCGAAGUGCACACGG이며;SEQ ID NO: 5 is AGUGAAGCGAAGUGCACACGG;
SEQ ID NO: 6은 AUAUACCCAAAGACAAAAGAA이며;SEQ ID NO: 6 is AUAUACCCAAAGACAAAAGAA;
SEQ ID NO: 7은 AACAAAAGAAAAUUGGUAACA이며;SEQ ID NO: 7 is AAAAAAGAAAAUUGGUAACA;
SEQ ID NO: 8은 IGUGAAGCGAAGUGCACACGG이다.SEQ ID NO: 8 is IGUGAAGCGAAGUGCACACGG.
일부 실시양태에서, 상기 siRNA는 TJR100381 및 TJR100382이다.In some embodiments, the siRNAs are TJR100381 and TJR100382.
일부 실시양태에서, 본 개시에 기재된 dsRNA의 센스 가닥은 SEQ ID NO: 9 내지 SEQ ID NO: 15 중 임의의 하나를 포함하고, 및/또는,In some embodiments, the sense strand of the dsRNA described in this disclosure comprises any one of SEQ ID NO: 9 to SEQ ID NO: 15, and/or
안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 17 내지 SEQ ID NO: 20 중 임의의 하나를 포함한다.The nucleotide sequence of the antisense strand includes any one of SEQ ID NO: 17 to SEQ ID NO: 20.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some embodiments, the dsRNA is selected from any of the following groups:
센스 가닥은 SEQ ID NO: 9를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 17을 포함하며;The sense strand comprises SEQ ID NO: 9 and the antisense strand comprises SEQ ID NO: 17;
센스 가닥은 SEQ ID NO: 11을 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 18을 포함하며;The sense strand comprises SEQ ID NO: 11 and the antisense strand comprises SEQ ID NO: 18;
센스 가닥은 SEQ ID NO: 13을 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 19를 포함하며;The sense strand comprises SEQ ID NO: 13 and the antisense strand comprises SEQ ID NO: 19;
센스 가닥은 SEQ ID NO: 10을 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 17을 포함하며;The sense strand comprises SEQ ID NO: 10 and the antisense strand comprises SEQ ID NO: 17;
센스 가닥은 SEQ ID NO: 12를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 18을 포함하며;The sense strand comprises SEQ ID NO: 12 and the antisense strand comprises SEQ ID NO: 18;
센스 가닥은 SEQ ID NO: 14를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 19를 포함하며;The sense strand comprises SEQ ID NO: 14 and the antisense strand comprises SEQ ID NO: 19;
센스 가닥은 SEQ ID NO: 9를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 20을 포함하며;The sense strand comprises SEQ ID NO: 9 and the antisense strand comprises SEQ ID NO: 20;
센스 가닥은 SEQ ID NO: 15를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 17을 포함한다.The sense strand includes SEQ ID NO: 15 and the antisense strand includes SEQ ID NO: 17.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 임의의 하나 양태이다:In some embodiments, the dsRNA is any one of the following:
센스 가닥이 SEQ ID NO: 9이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 17이며;The sense strand is SEQ ID NO: 9 and the antisense strand is SEQ ID NO: 17;
센스 가닥이 SEQ ID NO: 11이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 18이며;The sense strand is SEQ ID NO: 11 and the antisense strand is SEQ ID NO: 18;
센스 가닥이 SEQ ID NO: 13이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 19이며;The sense strand is SEQ ID NO: 13 and the antisense strand is SEQ ID NO: 19;
센스 가닥이 SEQ ID NO: 10이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 17이며;The sense strand is SEQ ID NO: 10 and the antisense strand is SEQ ID NO: 17;
센스 가닥이 SEQ ID NO: 12이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 18이며;The sense strand is SEQ ID NO: 12 and the antisense strand is SEQ ID NO: 18;
센스 가닥이 SEQ ID NO: 14이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 19이며;The sense strand is SEQ ID NO: 14 and the antisense strand is SEQ ID NO: 19;
센스 가닥이 SEQ ID NO: 9이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 20이며;The sense strand is SEQ ID NO: 9 and the antisense strand is SEQ ID NO: 20;
센스 가닥이 SEQ ID NO: 15이고, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 17이다.The sense strand is SEQ ID NO: 15 and the antisense strand is SEQ ID NO: 17.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some embodiments, the dsRNA is selected from any of the following groups:
SEQ ID NO: 9와 SEQ ID NO: 17을 포함하며;It includes SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 11과 SEQ ID NO: 18을 포함하며;It includes SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 13과 SEQ ID NO: 19를 포함하며;It includes SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 19;
SEQ ID NO: 10과 SEQ ID NO: 17을 포함하며;It includes SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 12와 SEQ ID NO: 18을 포함하며;It includes SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 14와 SEQ ID NO: 19를 포함하며;It includes SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 19;
SEQ ID NO: 9와 SEQ ID NO: 20을 포함하며;It includes SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 20;
SEQ ID NO: 15와 SEQ ID NO: 17을 포함한다.Includes SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 17.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 임의의 하나 양태이다:In some embodiments, the dsRNA is any one of the following:
SEQ ID NO: 9와 SEQ ID NO: 17이며;SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 11과 SEQ ID NO: 18이며;SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 13과 SEQ ID NO: 19이며;SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 19;
SEQ ID NO: 10과 SEQ ID NO: 17이며;SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 12와 SEQ ID NO: 18이며;SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 14와 SEQ ID NO: 19이며;SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 19;
SEQ ID NO: 9와 SEQ ID NO: 20이며;SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 20;
SEQ ID NO: 15와 SEQ ID NO: 17이다.SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 17.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some embodiments, the dsRNA is selected from any of the following groups:
SEQ ID NO: 9에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 17에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택되며;It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 9 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 9에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 20에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택되며;It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 9 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 20;
SEQ ID NO: 11에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 18에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택되며;It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 11 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 13에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 19에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택되며;It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 13 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 19;
SEQ ID NO: 10에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 17에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택되며;It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 10 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 12에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 18에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택되며;It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 12 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 14에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 19에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택되며;It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 14 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 19;
SEQ ID NO: 15에 제시된 센스 가닥과 SEQ ID NO: 17에 제시된 안티센스 가닥을 포함하거나 이로부터 선택된다.It comprises or is selected from the sense strand set forth in SEQ ID NO: 15 and the antisense strand set forth in SEQ ID NO: 17.
일부 구체적인 실시양태에서, HBV-X를 표적으로 하는 dsRNA는 이하 임의의 하나 양태이다:In some specific embodiments, the dsRNA targeting HBV-X is any one of the following:
SEQ ID NO: 9와 SEQ ID NO: 17이며;SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 10과 SEQ ID NO: 17이며;SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 9와 SEQ ID NO: 20이며;SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 20;
SEQ ID NO: 15와 SEQ ID NO: 17이다.SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 17.
일부 구체적인 실시양태에서, HBV-S를 표적으로 하는 dsRNA는 이하 임의의 하나 양태이다:In some specific embodiments, the dsRNA targeting HBV-S is any one of the following:
SEQ ID NO: 11과 SEQ ID NO: 18이며;SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 13과 SEQ ID NO: 19이며;SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 19;
SEQ ID NO: 12와 SEQ ID NO: 18이며;SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 18;
SEQ ID NO: 14와 SEQ ID NO: 19이다.SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 19.
본 개시에서, 5'-3' 방향으로,In the present disclosure, in the 5'-3' direction,
SEQ ID NO: 9는SEQ ID NO: 9 is
GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG0052';GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG0052';
SEQ ID NO: 10은SEQ ID NO: 10 is
GmsUmsGmUmGfCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG0052';GmsUmsGmUmGfCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG0052';
SEQ ID NO: 11은SEQ ID NO: 11 is
CmsUmsUmUmUfGmUfCfUfUmUmGmGmGmUmAmUmAmUm-NAG0052';CmsUmsUmUmUfGmUfCfUfUmUmGmGmGmUmAmUmAmUm-NAG0052';
SEQ ID NO: 12는SEQ ID NO: 12 is
CmsUmsUmUmUmGmUfCfUfUmUmGmGmGmUmAmUmAmUm-NAG0052';CmsUmsUmUmUmGmUfCfUfUmUmGmGmGmUmAmUmAmUm-NAG0052';
SEQ ID NO: 13은SEQ ID NO: 13 is
UmsUmsAmCmCfAmAfUfUfUmUmCmUmUmUmUmGmUmUm-NAG0052';UmsUmsAmCmCfAmAfUfUfUmUmCmUmUmUmUmGmUmUm-NAG0052';
SEQ ID NO: 14는SEQ ID NO: 14 is
UmsUmsAmCmCmAmAfUfUfUmUmCmUmUmUmUmGmUmUm-NAG0052';UmsUmsAmCmCmAmAfUfUfUmUmCmUmUmUmUmGmUmUm-NAG0052';
SEQ ID NO: 15는SEQ ID NO: 15 is
GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmUm-NAG0052';GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmUm-NAG0052';
SEQ ID NO: 17은SEQ ID NO: 17 is
AmsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm;AmsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm;
SEQ ID NO: 18은SEQ ID NO: 18 is
AmsUfsAmUfAmCf(-)hmpNA(C)CmAmAfAmGfAmCfAmAfAmAfGmsAmsAm;AmsUfsAmUfAmCf(-)hmpNA(C)CmAmAfAmGfAmCfAmAfAmAfGmsAmsAm;
SEQ ID NO: 19는SEQ ID NO: 19 is
AmsAfsCmAfAmAf(-)hmpNA(A)GmAmAfAmAfUmUfGmGfUmAfAmsCmsAm;AmsAfsCmAfAmAf(-)hmpNA(A)GmAmAfAmAfUmUfGmGfUmAfAmsCmsAm;
SEQ ID NO: 20은SEQ ID NO: 20 is
ImsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm;ImsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm;
여기서, Af=아데닌 2'-F 리보뉴클레오시드(adenine 2'-F ribonucleoside)이고; Cf=시토신 2'-F 리보뉴클레오시드(cytosine 2'-F ribonucleoside)이며; Uf=우라실 2'-F 리보뉴클레오시드(uracil 2'-F ribonucleoside)이고; Gf=구아닌 2'-F 리보뉴클레오시드(guanine 2'-F ribonucleoside)이며; Am=아데닌 2'-OMe 리보뉴클레오시드(adenine 2'-OMe ribonucleoside)이고; Cm=시토신 2'-OMe 리보뉴클레오시드(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)이며; Gm=구아닌 2'-OMe 리보뉴클레오시드(guanine 2'-OMe ribonucleoside)이고; Um=우라실 2'-OMe 리보뉴클레오시드(uracil 2'-OMe ribonucleoside)이며; Im=히포크산틴 2'-OMe 리보뉴클레오시드(hypoxanthine 2'-OMe ribonucleoside)이다Here, Af=adenine 2'-F ribonucleoside; Cf = cytosine 2'-F ribonucleoside; Uf=uracil 2'-F ribonucleoside; Gf = guanine 2'-F ribonucleoside; Am=adenine 2'-OMe ribonucleoside; Cm = cytosine 2'-OMe ribonucleoside; Gm = guanine 2'-OMe ribonucleoside; Um=uracil 2'-OMe ribonucleoside; Im=hypoxanthine 2'-OMe ribonucleoside
s는 해당 문자 s의 왼쪽과 오른쪽에 인접한 두 개의 뉴클레오티드 사이가 포스포로티오에이트 디에스테르에 의해 연결됨을 나타내며;s indicates that the two adjacent nucleotides to the left and right of the letter s are linked by a phosphorothioate diester;
NAG0052'는를 나타내며,NAG0052' is represents,
(-)hmpNA(G)는를 나타내고, (-)hmpNA(C)는를 나타내며,(-)hmpNA(G) is represents, and (-)hmpNA(C) is represents,
(-)hmpNA(A)는를 나타낸다.(-)hmpNA(A) is represents.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 다음 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된다:In some embodiments, the dsRNA is selected from the following structure or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
여기서,here,
Af=아데닌 2'-F 리보뉴클레오시드(adenine 2'-F ribonucleoside)이며;Af=adenine 2'-F ribonucleoside;
Cf=시토신 2'-F 리보뉴클레오시드(cytosine 2'-F ribonucleoside)이며;Cf = cytosine 2'-F ribonucleoside;
Gf=구아닌 2'-F 리보뉴클레오시드(guanine 2'-F ribonucleoside)이며;Gf = guanine 2'-F ribonucleoside;
Uf=우라실 2'-F 리보뉴클레오시드(uracil 2'-F ribonucleoside)이며;Uf=uracil 2'-F ribonucleoside;
Am=아데닌 2'-OMe 리보뉴클레오시드(adenine 2'-OMe ribonucleoside)이며;Am=adenine 2'-OMe ribonucleoside;
Cm=시토신 2'-OMe 리보뉴클레오시드(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)이며;Cm = cytosine 2'-OMe ribonucleoside;
Gm=구아닌 2'-OMe 리보뉴클레오시드(guanine 2'-OMe ribonucleoside)이며;Gm = guanine 2'-OMe ribonucleoside;
Um=우라실 2'-OMe 리보뉴클레오시드(uracil 2'-OMe ribonucleoside)이며;Um=uracil 2'-OMe ribonucleoside;
Im=히포크산틴 2'-OMe 리보뉴클레오시드(Inosine 2'-OMe ribonucleoside)이며;Im=hypoxanthine 2'-OMe ribonucleoside (Inosine 2'-OMe ribonucleoside);
는 포스포로티오에이트 디에스테르를 나타내고,는 포스포디에스테르를 나타내며,represents phosphorothioate diester, represents phosphodiester,
NAG0052'는를 나타내며,NAG0052' is represents,
NAG1은를 나타내며,NAG1 is represents,
(-)hmpNA(G)는를 나타내고, (-)hmpNA(C)는를 나타내며,(-)hmpNA(G) is represents, and (-)hmpNA(C) is represents,
(-)hmpNA(A)는를 나타낸다.(-)hmpNA(A) is represents.
일부 실시양태에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 암모늄염, 아민염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계의 일반적인 염일 수 있다.In some embodiments, the pharmaceutically acceptable salts may be salts common in the art, including but not limited to sodium salts, potassium salts, ammonium salts, amine salts, etc.
일부 구체적인 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TRD007970, TRD007994, TRD007995, TRD007970-1, TRD007994-1, TRD007995-1, TJR100259 또는 TJR100260으로부터 선택된다.In some specific embodiments, the dsRNA is selected from TRD007970, TRD007994, TRD007995, TRD007970-1, TRD007994-1, TRD007995-1, TJR100259, or TJR100260.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TRD007970이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TRD007970, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TRD007994이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TRD007994, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TRD007995이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TRD007995, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TRD007970-1이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TRD007970-1, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TRD007994-1이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TRD007994-1, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TRD007995-1이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TRD007995-1, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TJR100259이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TJR100259, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TJR100260이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TJR100260, whose structure is:
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA는 TJR100410이고, 이의 구조는 다음과 같다:In some embodiments, the dsRNA is TJR100410, whose structure is:
여기서, Af=아데닌 2'-F 리보뉴클레오시드(adenine 2'-F ribonucleoside)이고; Cf=시토신 2'-F 리보뉴클레오시드(cytosine 2'-F ribonucleoside)이며; Gf=구아닌 2'-F 리보뉴클레오시드(guanine 2'-F ribonucleoside)이고; Uf=우라실 2'-F 리보뉴클레오시드(uracil 2'-F ribonucleoside)이며;Here, Af=adenine 2'-F ribonucleoside; Cf = cytosine 2'-F ribonucleoside; Gf = guanine 2'-F ribonucleoside; Uf=uracil 2'-F ribonucleoside;
Am=아데닌 2'-OMe 리보뉴클레오시드(adenine 2'-OMe ribonucleoside)이고; Cm=시토신 2'-OMe 리보뉴클레오시드(cytosine 2'-OMe ribonucleoside)이며; Gm=구아닌 2'-OMe 리보뉴클레오시드(guanine 2'-OMe ribonucleoside)이고; Um=우라실 2'-OMe 리보뉴클레오시드(uracil 2'-OMe ribonucleoside)이며; Im=히포크산틴 2'-OMe 리보뉴클레오시드(Inosine 2'-OMe ribonucleoside)이다.Am=adenine 2'-OMe ribonucleoside; Cm = cytosine 2'-OMe ribonucleoside; Gm = guanine 2'-OMe ribonucleoside; Um=uracil 2'-OMe ribonucleoside; Im=hypoxanthine 2'-OMe ribonucleoside (Inosine 2'-OMe ribonucleoside).
는 포스포로티오에이트 디에스테르를 나타내고,는 포스포디에스테르를 나타내며,represents phosphorothioate diester, represents phosphodiester,
NAG0052'는를 나타내며,NAG0052' is represents,
NAG1은를 나타내며,NAG1 is represents,
(-)hmpNA(G)는를 나타내고, (-)hmpNA(C)는를 나타내며(-)hmpNA(G) is represents, and (-)hmpNA(C) is represents
(-)hmpNA(A)는를 나타낸다.(-)hmpNA(A) is represents.
일부 실시양태에서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 암모늄염, 아민염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 당업계의 일반적인 염일 수 있다.In some embodiments, the pharmaceutically acceptable salts may be salts common in the art, including but not limited to sodium salts, potassium salts, ammonium salts, amine salts, etc.
다른 일 측면에서, 본 개시는 dsRNA를 제공하며, 이는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥은 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In another aspect, the present disclosure provides a dsRNA, comprising a sense strand and an antisense strand forming a double-stranded region, wherein the sense strand and the antisense strand are selected from any of the following groups:
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2를 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6을 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 6;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7을 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 7;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4를 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함하며;The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 4 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함하고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8을 포함한다.The nucleotide sequence of the sense strand includes SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand includes SEQ ID NO: 8.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 이하 임의의 그룹으로부터 선택된다:In some embodiments, the sense strand and antisense strand of the dsRNA are selected from any of the following groups:
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 2 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 6;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 7;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5이며;The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 4 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 5;
센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 8이다.The nucleotide sequence of the sense strand is SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence of the antisense strand is SEQ ID NO: 8.
본 개시에 기재된 siRNA, dsRNA는 합성 소스로부터 선택되거나 체외에서 제조된다.siRNA, dsRNA described in this disclosure are selected from synthetic sources or produced in vitro.
약학적 조성물pharmaceutical composition
다른 일 측면에서, 본 개시는 합성 소스의 화합물 또는 체외에서 제조된 화합물을 제공하며, 이는 본 개시에 기재된 dsRNA로부터 선택된다.In another aspect, the disclosure provides a compound from a synthetic source or prepared in vitro, which is selected from the dsRNAs described in the disclosure.
다른 일 측면에서, 본 개시는 약학적 조성물을 제공하며, 이는 상술한 dsRNA를 포함한다.In another aspect, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, comprising the dsRNA described above.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 또한 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다.In some embodiments, the pharmaceutical composition also includes one or more pharmaceutically acceptable excipients.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 또한 하나 이상의 기타 치료제를 포함한다.In some embodiments, the pharmaceutical composition also includes one or more other therapeutic agents.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 활성 성분으로서 본 개시에 기재된 dsRNA 및 하나 이상의 기타 치료제를 포함한다.In some embodiments, the pharmaceutical composition comprises a dsRNA described in this disclosure as an active ingredient and one or more other therapeutic agents.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물의 dsRNA는 하나 이상의 기타 치료제와 병용하여 사용된다.In some embodiments, the dsRNA of the pharmaceutical composition is used in combination with one or more other therapeutic agents.
일부 구체적인 실시양태에서, 상기 기타 치료제는 항바이러스제, 역전사 효소 억제제, 면역자극제, 치료백신, 바이러스 침입 억제제, HbsAg의 분비 또는 방출을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 캡시드 억제제, 공유결합폐환형(ccc) HBV DNA 억제제로부터 선택된다.In some specific embodiments, the other therapeutic agents include antiviral agents, reverse transcriptase inhibitors, immunostimulants, therapeutic vaccines, viral entry inhibitors, oligonucleotides that inhibit secretion or release of HbsAg, capsid inhibitors, covalently closed circular (ccc) HBV DNA. selected from inhibitors.
리포솜 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 해당 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체에 의해 매개되는 엔도사이토시스, 레트로바이러스 또는 기타 벡터의 일부로 구성된 핵산과 같은 다양한 약물 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 개시의 dsRNA 또는 약학적 조성물에 사용될 수 있다.A variety of drug delivery systems are known, such as encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing the compound of interest, receptor-mediated endocytosis, nucleic acids consisting of part of a retrovirus or other vector, and the present disclosure It can be used in dsRNA or pharmaceutical compositions.
일부 실시양태에서, 본 개시에 기재된 dsRNA 또는 약학적 조성물의 투약 방식은 일반적이며, 국소 투약(예를 들어, 직접 주사, 이식) 또는 전신 투약을 통해 투약할 수 있고, 경구, 직장 또는 비경구 경로를 통해 투약할 수 있으며, 상기 비경구 경로는 피하 주사, 정맥 주사, 근육 주사, 복강 주사, 경피 투약, 흡입 투약(예를 들어, 에어로졸), 점막 투약(예를 들어, 설하, 비강내 투약), 두개 내 투약 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.In some embodiments, the mode of administration of the dsRNA or pharmaceutical composition described in the present disclosure is general and can be administered via topical administration (e.g., direct injection, implantation) or systemic administration, and can be administered by oral, rectal, or parenteral routes. It can be administered through parenteral routes, including subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, inhalation administration (e.g., aerosol), and mucosal administration (e.g., sublingual, intranasal administration). , intracranial administration, etc., but is not limited thereto.
일부 실시양태에서, 본 개시에서 제공되는 dsRNA 또는 약학적 조성물은 정맥 내, 근육 내, 피내, 피하, 십이지장 내 또는 복강 내 주사와 같은 주사를 통해 투여될 수 있다.In some embodiments, the dsRNA or pharmaceutical compositions provided in the present disclosure can be administered via injection, such as intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraduodenal, or intraperitoneal injection.
일부 실시양태에서, 본 개시에서 제공되는 dsRNA 또는 약학적 조성물은 키트에 포장될 수 있다.In some embodiments, dsRNA or pharmaceutical compositions provided in the present disclosure may be packaged in a kit.
용도 및 치료 방법Uses and Treatment Methods
다른 일 측면에서, 본 개시는 본 개시에 기재된 dsRNA 또는 약학적 조성물이 약물의 제조에 있어서의 응용을 제공한다.In another aspect, the present disclosure provides an application of the dsRNA or pharmaceutical composition described herein in the preparation of drugs.
일부 실시양태에서, 상기 약물은 피험자의 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 것이다.In some embodiments, the drug is for preventing and/or treating hepatitis B virus (HBV) infection in a subject.
일부 실시양태에서, 상기 약물은 B형 간염 바이러스와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 B형 간염 바이러스와 관련된 질환은 만성 간염이고, 상기 피험자는 HBeAg 양성 또는 HBeAg 음성이다.In some embodiments, the drug is for preventing and/or treating diseases associated with the hepatitis B virus. In some embodiments, the disease associated with the hepatitis B virus is chronic hepatitis and the subject is HBeAg positive or HBeAg negative.
일부 실시양태에서, 상기 B형 간염 바이러스와 관련된 질환은 급성 B형 간염, 만성 B형 간염, D형 간염 바이러스 감염, D형 간염, 간섬유화, 말기 간질환 및 간세포암이다.In some embodiments, the disease associated with the hepatitis B virus is acute hepatitis B, chronic hepatitis B, hepatitis D virus infection, hepatitis D, liver fibrosis, end-stage liver disease, and hepatocellular carcinoma.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA 또는 약학적 조성물의 유효량 또는 유효 용량은 약 0.001mg/kg 체중 내지 약 200mg/kg 체중, 약 0.01mg/kg 체중 내지 약 100mg/kg 체중 또는 약 0.5mg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다.In some embodiments, the effective amount or dose of the dsRNA or pharmaceutical composition is from about 0.001 mg/kg body weight to about 200 mg/kg body weight, from about 0.01 mg/kg body weight to about 100 mg/kg body weight, or from about 0.5 mg/kg body weight to about 0.5 mg/kg body weight. It is approximately 50 mg/kg body weight.
다른 일 측면에서, 본 개시는 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 이는 피험자에게 유효량 또는 유효 용량의 본 개시에 기재된 dsRNA 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.In another aspect, the present disclosure provides a method of preventing and/or treating a disease, comprising administering to a subject an effective amount or an effective dose of the dsRNA or pharmaceutical composition described in the present disclosure.
일부 실시양태에서, 상기 질환은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 질환은 B형 간염 바이러스와 관련된 질환으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 B형 간염 바이러스와 관련된 질환은 만성 간염이고, 상기 피험자는 HBeAg 양성 또는 HBeAg 음성이다.In some embodiments, the disease is selected from hepatitis B virus (HBV) infection. In some embodiments, the disease is selected from diseases associated with hepatitis B virus. In some embodiments, the disease associated with the hepatitis B virus is chronic hepatitis and the subject is HBeAg positive or HBeAg negative.
일부 실시양태에서, 상기 B형 간염 바이러스와 관련된 질환은 급성 B형 간염, 만성 B형 간염, D형 간염 바이러스 감염, D형 간염, 간섬유화, 말기 간질환 및 간세포암이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 방법은 피험자에게 다른 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.In some embodiments, the disease associated with the hepatitis B virus is acute hepatitis B, chronic hepatitis B, hepatitis D virus infection, hepatitis D, liver fibrosis, end-stage liver disease, and hepatocellular carcinoma. In some embodiments, the methods of the present disclosure further include administering another therapeutic agent to the subject.
일부 실시양태에서, 상기 다른 치료제는 항바이러스제, 역전사 효소 억제제, 면역자극제, 치료백신, 바이러스 침입 억제제, HbsAg의 분비 또는 방출을 억제하는 올리고뉴클레오티드, 캡시드 억제제, cccDNA 억제제 및 상술한 임의의 하나의 조합으로부터 선택된다.In some embodiments, the other therapeutic agent is an antiviral agent, a reverse transcriptase inhibitor, an immunostimulant, a therapeutic vaccine, a viral entry inhibitor, an oligonucleotide that inhibits secretion or release of HbsAg, a capsid inhibitor, a cccDNA inhibitor, and a combination of any one of the foregoing. is selected from
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA 또는 약학적 조성물의 유효량 또는 유효 용량은 약 0.001mg/kg 체중 내지 약 200mg/kg 체중, 약 0.01mg/kg 체중 내지 약 100mg/kg 체중 또는 약 0.5mg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다. 다른 일 측면에서, 본 개시는 체내 또는 체외에서 세포의 표적 유전자 또는 이의 mRNA를 침묵시키는 방법을 제공하며, 이는 상술한 dsRNA 또는 상술한 약학적 조성물을 해당 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.In some embodiments, the effective amount or dose of the dsRNA or pharmaceutical composition is from about 0.001 mg/kg body weight to about 200 mg/kg body weight, from about 0.01 mg/kg body weight to about 100 mg/kg body weight, or from about 0.5 mg/kg body weight to about 0.5 mg/kg body weight. It is approximately 50 mg/kg body weight. In another aspect, the present disclosure provides a method of silencing a target gene or mRNA thereof in a cell in vivo or in vitro, which includes the step of introducing the above-described dsRNA or the above-described pharmaceutical composition into the cell.
일부 실시양태에서, 상기 표적 유전자는 HBV(예를 들어, HBV-S, HBV-X)를 표적으로 하는 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는다.In some embodiments, the target genes include, but are not limited to, genes targeting HBV (e.g., HBV-S, HBV-X).
표적 유전자를 억제하는 방법How to suppress target genes
다른 일 측면에서, 본 개시는 표적 유전자 또는 이의 mRNA 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 이는 피험자에게 유효량 또는 유효 용량의 본 개시에 기재된 dsRNA 또는 본 개시에 기재된 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.In another aspect, the present disclosure provides a method of inhibiting the expression of a target gene or its mRNA, comprising administering to a subject an effective amount or an effective dose of the dsRNA described in the present disclosure or the pharmaceutical composition described in the present disclosure. .
일부 실시양태에서, 상기 표적 유전자는 HBV(예를 들어, HBV-S, HBV-X)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.In some embodiments, the target gene includes, but is not limited to, HBV (e.g., HBV-S, HBV-X).
일부 실시양태에서, 상기 대상체는 표적 세포, 세포군, 조직 또는 피험자에서 표적 유전자 또는 이의 mRNA의 병리학적 상향 조절을 갖는 것으로 사전에 검정되었다.In some embodiments, the subject has been previously screened as having pathological upregulation of a target gene or mRNA thereof in a target cell, cell population, tissue or subject.
본 개시는 또한 세포에서 B형 간염 바이러스(HBV)의 복제를 억제하는 방법을 제공하며, 해당 방법은 세포를 본 개시의 dsRNA 및/또는 약학적 조성물과 접촉시켜 세포에서 HBV의 복제를 억제하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 피험자 체내에 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 체외에 있다.The present disclosure also provides a method of inhibiting replication of hepatitis B virus (HBV) in a cell, comprising contacting the cell with a dsRNA and/or pharmaceutical composition of the present disclosure to inhibit replication of HBV in the cell. Includes. In some embodiments, the cells are within the subject's body. In some embodiments, the cells are ex vivo.
본 개시는 또한 HBV에 감염된 피험자에서 B형 간염 바이러스(HBV) 항원 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 이는 피험자에게 치료 유효량의 본 개시에 기재된 dsRNA 및/또는 약학적 조성물을 투여함으로써 피험자에서 HBV 항원의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, HBV 항원은 HBsAg이다. 일부 실시양태에서, HBV 항원은 HBeAg이다. 일부 실시양태에서, 상기 피험자는 HBeAg 양성이다. 일부 실시양태에서, 상기 피험자는 HBeAg 음성이다.The present disclosure also provides a method of reducing hepatitis B virus (HBV) antigen levels in a subject infected with HBV, comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of the dsRNA and/or pharmaceutical composition described in the present disclosure. It includes steps to reduce the level of. In some embodiments, the HBV antigen is HBsAg. In some embodiments, the HBV antigen is HBeAg. In some embodiments, the subject is HBeAg positive. In some embodiments, the subject is HBeAg negative.
전달 방법Delivery method
다른 일 측면에서, 본 개시는 올리고뉴클레오티드를 간으로 전달하는 방법을 제공하며, 이는 피험자에게 유효량 또는 유효 용량의 상술한 dsRNA 또는 상술한 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.In another aspect, the present disclosure provides a method of delivering an oligonucleotide to the liver, comprising administering to a subject an effective amount or an effective dose of the dsRNA described above or the pharmaceutical composition described above.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA 또는 약학적 조성물의 유효량 또는 유효 용량은 약 0.001mg/kg 체중 내지 약 200mg/kg 체중, 약 0.01mg/kg 체중 내지 약 100mg/kg 체중 또는 약 0.5mg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다.In some embodiments, the effective amount or dose of the dsRNA or pharmaceutical composition is from about 0.001 mg/kg body weight to about 200 mg/kg body weight, from about 0.01 mg/kg body weight to about 100 mg/kg body weight, or from about 0.5 mg/kg body weight to about 0.5 mg/kg body weight. It is approximately 50 mg/kg body weight.
다른 일 측면에서, 본 개시는 RNAi(RNA 간섭) 시약을 제공하며, 이는 상술한 dsRNA 또는 상술한 약학적 조성물을 포함한다.In another aspect, the present disclosure provides an RNA interference (RNAi) reagent, which includes the dsRNA described above or the pharmaceutical composition described above.
일부 실시양태에서, 상기 dsRNA 또는 약학적 조성물의 유효량 또는 유효 용량은 약 0.001mg/kg 체중 내지 약 200mg/kg 체중, 약 0.01mg/kg 체중 내지 약 100mg/kg 체중 또는 약 0.5mg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중이다.In some embodiments, the effective amount or dose of the dsRNA or pharmaceutical composition is from about 0.001 mg/kg body weight to about 200 mg/kg body weight, from about 0.01 mg/kg body weight to about 100 mg/kg body weight, or from about 0.5 mg/kg body weight to about 0.5 mg/kg body weight. It is approximately 50 mg/kg body weight.
다른 일 측면에서, 본 개시는 또한 세포를 제공하며, 이는 상술한 dsRNA 또는 상술한 약학적 조성물을 포함한다.In another aspect, the present disclosure also provides a cell, comprising the dsRNA described above or the pharmaceutical composition described above.
다른 일 측면에서, 본 개시는 또한 키트 또는 부품 키트를 제공하며, 이는 상술한 dsRNA 또는 상술한 약학적 조성물을 포함한다.In another aspect, the present disclosure also provides a kit or kit of parts, which includes the dsRNA described above or the pharmaceutical composition described above.
본 개시에서, 상술한 dsRNA 또는 약학적 조성물이 표적 유전자를 발현하는 세포와 접촉하는 경우, 측정된 바와 같이(예를 들어, psiCHECK 활성 스크리닝, 루시퍼라제 리포터 유전자 검출법, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA)를 기반으로 하는 방법, 또는 면역형광 분석, Western Blot 또는 유세포 분석법과 같은 단백질을 기반으로 하는 방법), 상술한 dsRNA 또는 약학적 조성물은 표적 유전자의 발현의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 억제한다.In the present disclosure, when the above-described dsRNA or pharmaceutical composition is contacted with a cell expressing a target gene, as measured (e.g., psiCHECK activity screening, luciferase reporter gene detection, PCR, or branched DNA (bDNA) (or protein-based methods such as immunofluorescence analysis, Western Blot or flow cytometry), the dsRNA or pharmaceutical composition described above reduces the expression of the target gene by at least 5%, at least 10%, at least 15% , at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99%.
본 개시에서, 상술한 dsRNA 또는 약학적 조성물이 표적 유전자를 발현하는 세포에 접촉하는 경우, 측정된 바와 같이(예를 들어, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시퍼라제 리포터 유전자 검출법, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA)를 기반으로 하는 방법, 또는 면역형광 분석법, Western Blot 또는 유세포 분석법과 같은 단백질을 기반으로 하는 방법), 상술한 dsRNA 또는 약학적 조성물로 인해 유발하는 표적 유전자 mRNA의 잔여 발현 비율이 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하 또는 10% 이하이다.In the present disclosure, when the above-described dsRNA or pharmaceutical composition is contacted with a cell expressing a target gene, as measured (e.g., psiCHECK activity screening and luciferase reporter gene detection, PCR, or branched DNA (bDNA) (or protein-based methods such as immunofluorescence analysis, Western Blot, or flow cytometry), the residual expression rate of target gene mRNA caused by the above-described dsRNA or pharmaceutical composition is 99% or less, 95 % or less, 90% or less, 85% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, 55% or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less , 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, or 10% or less.
본 개시에서, 상술한 dsRNA 또는 약학적 조성물이 표적 유전자를 발현하는 세포에 접촉하는 경우, 측정된 바와 같이(예를 들어, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시퍼라제 리포터 유전자 검출법, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA)를 기반으로 하는 방법, 또는 면역형광 분석법, Western Blot 또는 유세포 분석법과 같은 단백질을 기반으로 하는 방법), dsRNA 또는 약학적 조성물은 온-표적 활성을 유지하는 동시에, 오프-표적 활성을 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 적어도 75% 감소시킨다.In the present disclosure, when the above-described dsRNA or pharmaceutical composition is contacted with a cell expressing a target gene, as measured (e.g., psiCHECK activity screening and luciferase reporter gene detection, PCR, or branched DNA (bDNA) (or protein-based methods such as immunofluorescence assay, Western Blot or flow cytometry), dsRNA or pharmaceutical composition maintains on-target activity while reducing off-target activity by at least 20%, Reduce by at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70% or at least 75%.
본 개시에서, 상술한 dsRNA 또는 약학적 조성물이 표적 유전자를 발현하는 세포에 접촉하는 경우, 측정된 바와 같이(예를 들어, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시퍼라제 리포터 유전자 검출법, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA)를 기반으로 하는 방법, 또는 면역형광 분석법, Western Blot 또는 유세포 분석법과 같은 단백질을 기반으로 하는 방법), dsRNA는 온-표적 활성을 최대 20%, 최대 19%, 최대 15%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1% 감소시키는 동시에, 오프-표적 활성을 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 적어도 75% 감소시킨다.In the present disclosure, when the above-described dsRNA or pharmaceutical composition is contacted with a cell expressing a target gene, as measured (e.g., psiCHECK activity screening and luciferase reporter gene detection, PCR, or branched DNA (bDNA) (or protein-based methods such as immunofluorescence, Western Blot, or flow cytometry), dsRNA increases on-target activity by up to 20%, up to 19%, up to 15%, up to 10%, up to 5% or up to 1% while reducing off-target activity by at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%. , at least 65%, at least 70% or at least 75%.
본 개시에서, 상술한 dsRNA 또는 약학적 조성물이 표적 유전자를 발현하는 세포에 접촉되는 경우, 측정된 바와 같이(예를 들어, psiCHECK 활성 스크리닝 및 루시퍼라제 리포터 유전자 검출법, PCR 또는 분지형 DNA(bDNA)를 기반으로 하는 방법, 또는 면역형광 분석법, Western Blot 또는 유세포 분석법과 같은 단백질을 기반으로 하는 방법), dsRNA는 온-표적 활성을 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 또는 적어도 80% 증가시키는 동시에, 오프-표적 활성을 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70% 또는 적어도 75% 감소시킨다.In the present disclosure, when the above-described dsRNA or pharmaceutical composition is contacted with a cell expressing a target gene, as measured (e.g., psiCHECK activity screening and luciferase reporter gene detection, PCR, or branched DNA (bDNA) (or protein-based methods such as immunofluorescence assay, Western Blot or flow cytometry), dsRNA reduces on-target activity by at least 1%, at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75% or at least 80% while increasing off-target activity by at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, at least 50%, at least 55%, at least 60%, at least 65%, at least Reduce by 70% or at least 75%.
본 개시는 또한 dsRNA 또는 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이는 본 개시에 기재된 리간드, siRNA, dsRNA 또는 약학적 조성물을 합성하는 단계를 포함한다.The disclosure also provides a method of making a dsRNA or pharmaceutical composition, comprising synthesizing a ligand, siRNA, dsRNA, or pharmaceutical composition described in the disclosure.
용어 설명Glossary of Terms
본 개시를 더욱 쉽게 이해하도록 하기 위하여, 이하에서 일부 기술적 및 과학적 용어를 구체적으로 정의한다. 본원에서 별도로 명확한 정의가 없는 한, 본원에 사용되는 모든 기타 기술적 및 과학적 용어는 모두 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다.In order to make the present disclosure easier to understand, some technical and scientific terms are specifically defined below. Unless otherwise clearly defined herein, all other technical and scientific terms used herein have meanings commonly understood by those skilled in the art to which this disclosure pertains.
본 개시의 화합물은 특정 기하학적 또는 입체 이성질체의 형태로 존재할 수 있다. 본 개시에서는, 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)- 거울상 이성질체, (R)- 및 (S)- 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, (D)- 이성질체, (L)- 이성질체 및 이의 라세미 혼합물, 및 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체가 농축된 혼합물과 같은 기타 혼합물이 포함되는 모든 이러한 유형의 화합물을 고려하며, 이러한 모든 혼합물은 모두 본 개시의 범위 내에 속한다고 생각한다. 알킬 등 치환기에 별도의 비대칭 탄소 원자가 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성질체 및 이들의 혼합물은 모두 본 개시의 범위 내에 포함된다. 비대칭 탄소 원자를 함유하는 본 개시의 화합물은 광학 활성이 순수한 형태 또는 라세미 형태로 분리될 수 있다. 광학 활성이 순수한 형태는 라세미 혼합물로부터 분리되거나 키랄 원료 또는 키랄 시약을 사용하여 합성할 수 있다.Compounds of the present disclosure may exist in certain geometric or stereoisomeric forms. In the present disclosure, cis and trans isomers, (-)- and (+)-enantiomers, (R )- and (S )-enantiomers, diastereomers, (D )-isomers, (L )-isomers, and their All of these types of compounds are contemplated, including racemic mixtures, and other mixtures such as enantiomeric or diastereomeric enriched mixtures, and all such mixtures are contemplated to be within the scope of this disclosure. Separate asymmetric carbon atoms may be present in substituents such as alkyl. All such isomers and mixtures thereof are included within the scope of this disclosure. Compounds of the present disclosure containing asymmetric carbon atoms can be isolated in optically active pure or racemic forms. Optically active pure forms can be isolated from racemic mixtures or synthesized using chiral raw materials or chiral reagents.
광학 활성의 (R)-와 (S)- 이성질체 및D 및L 이성질체는 키랄 합성 또는 키랄 시약 또는 기타 일반적인 기술을 통해 제조할 수 있다. 본 개시의 특정 화합물의 거울상 이성질체를 얻으려면, 비대칭 합성 또는 키랄 보조제를 사용한 유도체화에 의해 제조할 수 있으며, 여기서, 얻어진 부분입체 이성질체 혼합물을 분리하고 보조 그룹이 갈라져서 원하는 순수한 거울상 이성질체를 제공한다. 또는, 분자가 염기성 작용기(예컨대, 아미노) 또는 산성 작용기(예컨대, 카르복실)를 함유하는 경우, 적절한 광학 활성의 산 또는 염기로 부분입체 이성질체의 염을 형성한 다음, 당업계에 공지된 일반적인 방법으로 부분입체 이성질체를 분리한 다음 순수한 거울상 이성질체를 회수하여 얻는다. 또한, 거울상 이성질체와 부분입체 이성질체의 분리는, 통상적으로 키랄 고정상을 채택하는 크로마토그래피를 사용하고, 선택적으로 화학적 유도체화 방법(예를 들어, 아민으로부터 카바메이트 생성)과 결합하여 완성된다.The optically active (R )- and (S )- isomers andthe D andL isomers can be prepared through chiral synthesis or chiral reagents or other common techniques. To obtain enantiomers of certain compounds of the present disclosure, they can be prepared by asymmetric synthesis or derivatization with chiral auxiliaries, where the resulting diastereomeric mixture is separated and the auxiliary groups are cleaved to provide the desired pure enantiomer. Alternatively, if the molecule contains a basic functional group (e.g. amino) or an acidic functional group (e.g. carboxyl), diastereomeric salts can be formed with an appropriate optically active acid or base followed by general methods known in the art. After separating the diastereomers, pure enantiomers are recovered and obtained. Additionally, separation of enantiomers and diastereomers is usually accomplished using chromatography employing a chiral stationary phase, optionally combined with chemical derivatization methods (e.g., carbamate generation from amines).
본 개시에 기재된 화합물의 화학 구조에서, 결합 ""는 지정되지 않은 배열을 나타내며, 즉, 화학 구조에 키랄 이성질체가 존재하는 경우, 결합 ""는 "" 또는 ""일 수 있거나, 또는 동시에 "" 및 ""의 두 가지 구성을 포함할 수 있다. 본 개시에 기재된 화합물의 화학 구조에서, 결합 ""은 배열이 지정되지 않았고, 즉 결합 ""의 배열은E 형 또는Z 형일 수 있거나, 또는 동시에E 및Z의 두 가지 구성을 포함할 수 있다.In the chemical structures of the compounds described in this disclosure, the bond " " indicates an unspecified configuration, i.e., if chiral isomers exist in the chemical structure, the bond " "Is " " or " "can be, or at the same time" " and " In the chemical structure of the compounds described in this disclosure, it may include two configurations: a bond " "No array is specified, i.e. concatenation " The arrangement of "may be ofthe E type orthe Z type, or may include both configurations ofE andZ at the same time.
본 개시의 화학 구조식에서, "", "" 또는 ""는 본원에 기재된 본 발명의 범위에 따라 하나 이상의 임의의 그룹에 연결될 수 있으며, 별표 "*"는 키랄 중심을 나타낸다.In the chemical structural formula of the present disclosure, " ", " " or " " may be linked to one or more arbitrary groups according to the scope of the invention described herein, and the asterisk "*" indicates a chiral center.
배열이 지정되지 않는 경우, 본 개시의 화합물 및 중간체는 상이한 호변 이성질체 형태로도 존재할 수 있으며, 이러한 모든 형태는 본 개시의 범위 내에 포함된다. 용어 "호변 이성질체" 또는 "호변 이성질체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호 전환할 수 있는 상이한 에너지의 구조 이성질체를 가리킨다. 예를 들어, 양성자 호변 이성질체(양성자 전이 호변 이성질체라고도 함)는 케토-엔올 및 이민-에나민, 락탐-락팀 이성질체화와 같은 양성자 이동을 통한 상호 전화를 포함한다. 락탐-락팀 평형의 예시는 하기에 제시된 바와 같은 A와 B 사이이다.When no configuration is specified, the compounds and intermediates of this disclosure may also exist in different tautomeric forms, all of which are included within the scope of this disclosure. The term “tautomer” or “tautomeric form” refers to structural isomers of different energies that can interconvert through a low energy barrier. For example, proton tautomerism (also called proton transfer tautomerism) involves interconversion through proton transfer, such as keto-enol and imine-enamine, and lactam-lactim isomerization. An example of a lactam-lactim equilibrium is between A and B as shown below.
본 개시의 모든 화합물은 형태 A 또는 형태 B로 그려질 수 있다. 모든 호변 이성질체 형태는 본 발명의 범위 내에 있다. 화합물의 명명은 임의의 호변 이성질체를 배제하지 않는다.All compounds of the present disclosure can be drawn as either Form A or Form B. All tautomeric forms are within the scope of the present invention. The naming of a compound does not exclude any tautomerism.
본 개시는 또한 본원에 기재된 것과 동일하지만, 하나 이상의 원자가 자연에서 통상적으로 발견되는 원자량 또는 질량 수와 다른 원자량 또는 질량 수를 갖는 원자에 의해 치환된 동위원소 표지된 본 개시의 화합물을 포함한다. 본 개시의 화합물에 결합될 수 있는 동위원소의 예시는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 요오드 및 염소의 동위원소를 포함하며, 예컨대 각각2H,3H,11C,13C,14C,13N,15N,15O,17O,18O,31P,32P,35S,18F,123I,125I 및36Cl 등이다.The present disclosure also includes isotopically labeled compounds of the disclosure that are identical to those described herein, but where one or more atoms are replaced by an atom having an atomic weight or mass number different from that normally found in nature. Examples of isotopes that can be bound to the compounds of the present disclosure include isotopes of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, iodine, and chlorine, such as2 H,3 H,11 C, and13, respectively. C,14 C,13 N,15 N,15 O,17 O,18 O,31 P,32 P,35 S,18 F,123 I,125 I and36 Cl.
별도로 설명하지 않는 한, 하나의 위치가 중수소(D)로 특정적으로 지정될 경우, 해당 위치에는 중수소의 천연적인 풍부도(0.015%)보다 적어도 1000배 큰 풍부도의 중수소(즉, 적어도 10%의 중수소가 혼입됨)가 있는 것으로 이해해야 한다. 예시에서 천연 중수소 풍부도보다 큰 화합물의 풍부도는, 중수소 풍부도의 적어도 1000배, 중수소 풍부도의 적어도 2000배, 중수소 풍부도의 적어도 3000배, 중수소 풍부도의 적어도 4000배, 중수소 풍부도의 적어도 5000배, 중수소 풍부도의 적어도 6000배 또는 더 높은 중수소 풍부도일 수 있다. 본 개시는 또한 다양한 중수소 형태의 식 (I), 식 (I'), 식 (II)의 화합물을 포함한다. 탄소 원자에 연결된 각 사용 가능한 수소 원자는 독립적으로 중수소 원자에 의해 대체될 수 있다. 당업자는 관련 문헌을 참조하여 중수소 형태의 식 (I), 식 (I'), 식 (II)의 화합물을 합성할 수 있다. 중수소 형태의 식 (I), 식 (I'), 식 (II)의 화합물을 제조할 경우, 시판되는 중수소화 출발 물질을 사용하거나, 중수소화 보란, 삼중수소화 보란 테트라히드로푸란 용액, 중수소화 리튬알루미늄수소화물, 중수소화 요오드에탄 및 중수소화 요오드메탄 등이 포함되나 이에 한정되지 않는 중수소화 시약을 채택하여 일반적인 기술을 사용하여 합성할 수 있다.Unless otherwise noted, when a location is specifically designated as deuterium (D), that location contains deuterium at an abundance that is at least 1000 times greater than the natural abundance of deuterium (0.015%) (i.e., at least 10% It should be understood that there is deuterium mixed in. In the example, the abundance of the compound greater than the natural deuterium abundance is at least 1000 times the deuterium abundance, at least 2000 times the deuterium abundance, at least 3000 times the deuterium abundance, at least 4000 times the deuterium abundance, and at least 2000 times the deuterium abundance. It may be at least 5000 times the deuterium abundance, at least 6000 times the deuterium abundance or higher. The present disclosure also includes compounds of formula (I), formula (I'), and formula (II) in various deuterium forms. Each available hydrogen atom attached to a carbon atom can independently be replaced by a deuterium atom. Those skilled in the art can refer to relevant literature to synthesize compounds of formula (I), formula (I'), and formula (II) in deuterated form. When preparing the deuterated compounds of formula (I), formula (I'), and formula (II), commercially available deuterated starting materials can be used, or deuterated borane, tritiated borane tetrahydrofuran solution, or deuterated lithium. It can be synthesized using general techniques by adopting deuterated reagents, including but not limited to aluminum hydride, deuterated iodoethane, and deuterated iodomethane.
별도로 설명하지 않는 한, "선택적으로", "선택적", "선택할 수 있는" 또는 "선택 가능한"은 이어서 설명되는 사건 또는 환경이 발생할 수 있으나 반드시 발생하는 것은 아님을 의미하는 것으로서, 해당 설명은 해당 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않는 상황을 포함한다. 예를 들어, "선택적으로, R1과 R2가 직접 연결되어 고리를 형성한다"는 것은 R1과 R2가 직접 연결되어 고리를 형성하는 것이 발생할 수 있으나 반드시 존재하는 것은 아니며, 해당 설명은 R1과 R2가 직접 연결되어 고리를 형성하는 상황과, R1과 R2가 고리를 형성하지 않는 상황을 포함한다.Unless otherwise stated, “optionally,” “optional,” “selectable,” or “selectable” means that the subsequently described event or circumstance may, but is not required to occur, and such description means that the event or circumstance subsequently described may occur, but is not required to occur. It includes situations in which an event or circumstance occurs or does not occur. For example, "Optionally, R1 and R2 are directly connected to form a ring" means that R1 and R2 may be directly connected to form a ring, but this does not necessarily exist, and the description is This includes a situation where R1 and R2 are directly connected to form a ring, and a situation where R1 and R2 do not form a ring.
용어 "약" 및 "대략"은 수치가 당업자에 의해 측정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 가리키며, 상기 수치 부분은 측정 또는 시험 방법(즉, 측정 시스템의 한계)에 의해 결정된다. 예를 들어, "약"은 표준차 범위 내에 있음을 의미할 수 있다. 또는, "약" 또는 "실질적으로 포함하는"은 최대 20%의 범위를 의미할 수 있으며, 예를 들어 1% 내지 15% 사이, 1% 내지 10% 사이, 1% 내지 5% 사이, 0.5% 내지 5% 사이, 0.5% 내지 1% 사이 변화하며, 본 개시에서, 숫자 또는 수치 범위 앞에 용어 "약"이 있는 모든 경우, 주어진 수의 실시양태도 포함한다. 별도로 설명하지 않는 한, 본 출원 및 청구범위에 특정 값이 나타나는 경우, "약" 또는 "실질적으로 포함하는"의 의미는 해당 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.The terms “about” and “approximately” indicate that a numerical value is within an acceptable error range for a particular value as determined by a person of ordinary skill in the art, which portion of the numerical value is determined by a measurement or test method (i.e., the limits of the measurement system). For example, “about” can mean within a standard difference range. Alternatively, “about” or “substantially comprising” can mean a range of up to 20%, for example between 1% and 15%, between 1% and 10%, between 1% and 5%, between 0.5% and between 0.5% and 1%, and in this disclosure, wherever the term “about” precedes a number or range of values, it also includes the number of embodiments given. Unless otherwise stated, when a specific value appears in this application and claims, the meaning of “about” or “substantially comprising” should be assumed to be within an acceptable margin of error for that specific value.
본 개시에서, 용어 "포함한다"는 "……로 구성된다"로 대체될 수 있다.In the present disclosure, the term “comprises” may be replaced with “consisting of…”.
특별히 설명하지 않는 한, 본 개시의 "화합물", "화학적 변형", "리간드", "dsRNA", "핵산" 및 "RNAi"는 모두 독립적으로 염, 혼합 염 또는 염이 아닌 형태(예를 들어, 유리산 또는 유리염기)로 존재할 수 있다. 염 또는 혼합 염의 형태로 존재하는 경우, 이는 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.Unless specifically stated, “compound,” “chemical modification,” “ligand,” “dsRNA,” “nucleic acid,” and “RNAi” in the present disclosure all independently refer to a salt, mixed salt, or non-salt form (e.g. , free acid or free base). When present in the form of a salt or mixed salt, it may be a pharmaceutically acceptable salt.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 무기염 또는 유기염으로부터 선택될 수 있고, 약학적으로 허용 가능한 산 부가염 및 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염을 포함할 수도 있다.“Pharmaceutically acceptable salt” may be selected from inorganic salts or organic salts, and may include pharmaceutically acceptable acid addition salts and pharmaceutically acceptable base addition salts.
"약학적으로 허용 가능한 산 부가염"은 별도의 부작용 없이 유리 염기의 생물학적 유효성을 유지할 수 있는, 무기산 또는 유기산과 함께 형성된 염을 가리킨다. 무기산염은 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며; 유기산염은 포름산염, 아세트산염, 2,2-디클로로아세트산염, 트리플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 헥사노에이트, 카프릴레이트, 카프레이트, 운데실레네이트, 글리콜레이트, 글루코네이트, 젖산염, 세바케이트, 아디페이트, 글루타레이트, 말로네이트, 옥살산염, 말레산염, 숙신산염, 푸마르산염, 타르타르산염, 시트르산염, 팔미산염, 스테아르산염, 올레인산염, 신나산염, 라우르산염, 말산염, 글루타메이트, 피로글루타메이트, 아스파르트산염, 벤조에이트, 메실레이트, 벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염, 알지네이트, 아스코르베이트, 살리실산염, 4-아미노살리실레이트, 나프탈렌 디설폰산염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 염은 당업계에 알려진 방법을 통해 제조될 수 있다.“Pharmaceutically acceptable acid addition salt” refers to a salt formed with an inorganic or organic acid that can maintain the biological effectiveness of the free base without any side effects. Inorganic acid salts include, but are not limited to, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, phosphate, etc.; Organic acid salts include formate, acetate, 2,2-dichloroacetate, trifluoroacetate, propionate, hexanoate, caprylate, caprate, undecylenate, glycolate, gluconate, lactate, and seba. Cate, adipate, glutarate, malonate, oxalate, maleate, succinate, fumarate, tartrate, citrate, palmate, stearate, oleate, cinnaate, laurate, malate, glutamate. , pyroglutamate, aspartate, benzoate, mesylate, benzenesulfonate, p-toluenesulfonate, alginate, ascorbate, salicylate, 4-aminosalicylate, naphthalene disulfonate, etc. No. These salts can be prepared through methods known in the art.
"약학적으로 허용 가능한 염기 부가염"은 별도의 부작용 없이 유리산의 생물학적 유효성을 유지할 수 있는, 무기 염기 또는 유기 염기와 함께 형성된 염을 가리킨다. 무기 염기로부터 유래된 염은 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 암모늄염, 칼슘염, 마그네슘염, 철염, 아연염, 구리염, 망간염, 알루미늄염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 무기염은 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 및 마그네슘염이며, 바람직하게는 나트륨염이다. 유기 염기로부터 유도된 염은 1차 아민류, 2차 아민류 및 3차 아민류, 천연적으로 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민류, 고리형 아민류 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어, 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디메틸에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디시클로 헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루코사민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민수지 등 염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디시클로헥실아민, 콜린 및 카페인을 포함한다. 이러한 염은 당업계에 알려진 방법을 통해 제조될 수 있다.“Pharmaceutically acceptable base addition salt” refers to a salt formed with an inorganic or organic base that can maintain the biological effectiveness of the free acid without any side effects. Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, sodium salts, potassium salts, lithium salts, ammonium salts, calcium salts, magnesium salts, iron salts, zinc salts, copper salts, manganese salts, aluminum salts, etc. Preferred inorganic salts are ammonium salt, sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt, preferably sodium salt. Salts derived from organic bases include primary, secondary and tertiary amines, substituted amines including naturally substituted amines, cyclic amines and basic ion exchange resins such as ammonia and isopropylamine. , trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dimethylethanolamine, 2-dimethylaminoethanol, 2-diethylaminoethanol, dicyclohexylamine, lysine, Including, but not limited to, salts such as arginine, histidine, caffeine, procaine, choline, betaine, ethylenediamine, glucosamine, methylglucosamine, theobromine, purine, piperazine, piperidine, N-ethylpiperidine, polyamine resin, etc. No. Preferred organic bases include isopropylamine, diethylamine, ethanolamine, trimethylamine, dicyclohexylamine, choline, and caffeine. These salts can be prepared through methods known in the art.
"알킬"은 예를 들어 1 내지 30개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 및 분지쇄 그룹(C1-C30 알킬), 또한 예를 들어 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬(C1-C6 알킬), 또한 예를 들어 1 내지 3개의 탄소 원자의 알킬(C1-C3 알킬)인 포화 지방족 탄화수소 그룹을 가리킨다. 비제한적인 실시예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필 및 이들의 다양한 분지쇄 이성질체 등을 포함한다.“Alkyl” refers to straight and branched chain groups containing, for example, 1 to 30 carbon atoms (C1 -C30 alkyl), and also alkyl (C1 -C6 ) containing, for example, 1 to 6 carbon atoms. alkyl), also refers to a saturated aliphatic hydrocarbon group, for example alkyl (C1 -C3 alkyl) of 1 to 3 carbon atoms. Non-limiting examples include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, sec-butyl, n-pentyl, 1,1-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyl, Includes 2,2-dimethylpropyl and various branched chain isomers thereof.
용어 "알케닐"은 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 탄화수소를 가리킨다. 알케닐의 비제한적인 예시로는 비닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐 또는 2-부테닐 및 이들의 다양한 분지쇄 이성질체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.The term “alkenyl” refers to a hydrocarbon containing at least one double bond. Non-limiting examples of alkenyl include, but are not limited to, vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl or 2-butenyl and their various branched chain isomers.
용어 "알키닐"은 적어도 하나의 삼중 결합을 함유하는 탄화수소를 가리킨다. 알키닐의 비제한적인 예시로는 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐 또는 2-부티닐 및 이들의 다양한 분지쇄 이성질체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.The term “alkynyl” refers to a hydrocarbon containing at least one triple bond. Non-limiting examples of alkynyl include, but are not limited to, ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-butynyl or 2-butynyl and their various branched chain isomers.
용어 "알콕시"는 -O-(알킬)을 가리키며, 여기서 알킬의 정의는 위에 기재된 바와 같다. 알콕시의 비제한적인 예시로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시를 포함한다.The term “alkoxy” refers to -O-(alkyl), where alkyl is defined as above. Non-limiting examples of alkoxy include methoxy, ethoxy, propoxy, and butoxy.
"시클로알킬"은 포화 또는 부분적으로 불포화 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리탄화수소 치환기를 가리키며, 시클로알킬 고리는 3 내지 20개의 탄소 원자가 포함되고, 바람직하게 3 내지 6개의 탄소 원자가 포함되며, 보다 바람직하게는 5~6개의 탄소 원자가 포함된다. 모노시클릭 시클로알킬의 비제한적인 예시로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헥사디에닐 등을 포함하고; 폴리시클릭 시클로알킬은 스피로 고리, 축합 고리 및 브릿지된 고리의 시클로알킬을 포함한다.“Cycloalkyl” refers to a saturated or partially unsaturated monocyclic or polycyclic cyclic hydrocarbon substituent, wherein the cycloalkyl ring contains 3 to 20 carbon atoms, preferably 3 to 6 carbon atoms, more preferably Contains 5 to 6 carbon atoms. Non-limiting examples of monocyclic cycloalkyls include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclopentenyl, cyclohexyl, cyclohexenyl, cyclohexadienyl, etc.; Polycyclic cycloalkyls include cycloalkyls of spiro rings, condensed rings, and bridged rings.
"헤테로시클로알킬"은 포화 또는 부분적으로 불포화된 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리탄화수소 치환기를 가리키며, 이는 3 내지 20개의 고리 원자를 포함하며, 여기서, 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소 또는 S(O)m(여기서 m은 0 내지 2의 정수)으로부터 선택되는 헤테로원자이나, -O-O-, -O-S- 또는 -S-S-의 고리 부분은 포함되지 않고, 나머지 고리 원자는 탄소이다. 바람직하게는 3 내지 12개의 고리 원자를 포함하고, 여기서, 1~4개가 헤테로원자이며; 보다 바람직하게는 3 내지 7개의 고리 원자를 포함한다. "헤테로시클로알킬"의 비제한적인 예시로는 다음을 포함한다:“Heterocycloalkyl” refers to a saturated or partially unsaturated monocyclic or polycyclic cyclic hydrocarbon substituent containing from 3 to 20 ring atoms, wherein at least one ring atom is nitrogen, oxygen or S(O) It is a heteroatom selected fromm (where m is an integer from 0 to 2), but the ring portion of -OO-, -OS-, or -SS- is not included, and the remaining ring atoms are carbon. preferably contains 3 to 12 ring atoms, where 1 to 4 are heteroatoms; More preferably, it contains 3 to 7 ring atoms. Non-limiting examples of “heterocycloalkyl” include:
상기 헤테로시클로알킬 고리는 아릴 또는 헤테로아릴 고리에 축합될 수 있으며, 여기서, 모체 구조와 함께 연결된 고리는 헤테로시클로알킬이고, 이의 비제한적인 예시로는 다음을 포함한다:The heterocycloalkyl ring may be condensed to an aryl or heteroaryl ring, where the ring linked together with the parent structure is heterocycloalkyl, non-limiting examples of which include:
및 등. and etc.
"아릴"은 공액된 π 전자 시스템을 갖는 6 내지 14원 탄소로만 이루어진 모노시클릭 고리 또는 축합 폴리시클릭(즉, 인접한 탄소 원자의 쌍을 공유하는 고리) 그룹을 가리키며, 바람직하게는 6 내지 12원이며, 예를 들어 페닐 및 나프틸이다. 상기 아릴 고리는 헤테로아릴, 헤테로시클로알킬 또는 시클로알킬 고리에 축합될 수 있으며, 여기서 모체 구조와 함께 연결되는 고리는 아릴 고리이고, 이의 비제한적인 예시로는 다음을 포함한다:“Aryl” refers to a group of monocyclic rings or condensed polycyclic (i.e. rings that share pairs of adjacent carbon atoms) consisting only of 6 to 14 membered carbons with a conjugated π electron system, preferably 6 to 12 membered carbon atoms. and, for example, phenyl and naphthyl. The aryl ring may be condensed to a heteroaryl, heterocycloalkyl or cycloalkyl ring, where the ring linking together with the parent structure is an aryl ring, non-limiting examples of which include:
및. and .
"헤테로아릴"은 1 내지 4개의 헤테로원자 및 5 내지 14개의 고리 원자를 포함하는 헤테로방향족 시스템을 가리키며, 여기서 헤테로원자는 산소, 황 및 질소로부터 선택된다. 헤테로아릴은 바람직하게 6 내지 12원이고, 보다 바람직하게는 5원 또는 6원이다. 예를 들어, 이의 비제한적인 예시로는 이미다졸릴, 푸릴, 티에닐, 티아졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴(oxazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 피롤릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리미디닐, 티아디아졸, 피라지닐, 트리아졸릴, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, , , 등을 포함한다．“Heteroaryl” refers to a heteroaromatic system containing 1 to 4 heteroatoms and 5 to 14 ring atoms, where the heteroatoms are selected from oxygen, sulfur and nitrogen. Heteroaryl is preferably 6 to 12 members, more preferably 5 or 6 members. For example, non-limiting examples include imidazolyl, furyl, thienyl, thiazolyl, pyrazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, pyrrolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidi. Nyl, thiadiazole, pyrazinyl, triazolyl, indazolyl, benzimidazolyl, , , Includes etc.
상기 헤테로아릴 고리는 아릴, 헤테로시클로알킬 또는 시클로알킬 고리에 축합될 수 있으며, 여기서 모체 구조와 함께 연결되는 고리는 헤테로아릴 고리이고, 이의 비제한적인 예시로는 다음을 포함한다:The heteroaryl ring may be condensed to an aryl, heterocycloalkyl or cycloalkyl ring, where the ring joined together with the parent structure is a heteroaryl ring, non-limiting examples of which include:
및. and .
용어 "히드록시"는 -OH 그룹을 가리킨다.The term “hydroxy” refers to the -OH group.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 가리킨다.The term “halogen” refers to fluorine, chlorine, bromine or iodine.
용어 "시아노"는 -CN을 가리킨다.The term “cyano” refers to -CN.
용어 "아미노"는 -NH2를 가리킨다.The term “amino” refers to -NH2 .
용어 "니트로"는 -NO2를 가리킨다.The term “nitro” refers to -NO2 .
용어 "옥소"는 =O 치환기를 가리킨다.The term “oxo” refers to the =O substituent.
본 개시에서, "포스페이트 그룹"은 포스포에스테르 그룹, 포스포디에스테르 그룹 또는 포스포트리에스테르 그룹일 수 있고, 바람직하게는 포스포디에스테르 그룹이다.In the present disclosure, a “phosphate group” can be a phosphoester group, a phosphodiester group, or a phosphotriester group, and is preferably a phosphodiester group.
본 개시에서, 포스포로티오에이트 디에스테르는 비브릿지 산소 원자가 황 원자에 의해 대체되어 변형된 포스포디에스테르를 가리키며,,(M은 S 원자임)는 상호 교환적으로 사용될 수 있다.In the present disclosure, phosphorothioate diester refers to a phosphodiester modified by replacing the unbridged oxygen atom with a sulfur atom, , (M is an S atom) can be used interchangeably.
"치환"은 그룹 내에서 하나 이상의 수소 원자, 바람직하게는 최대 5개이고, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 수소 원자가 서로 독립적으로 상응하는 수의 치환기에 의해 치환됨을 가리킨다. 치환기가 케톤 또는 옥소(즉, =O)인 경우, 원자에 있는 두 개(2개)의 수소가 대체된다.“Substitution” indicates that one or more hydrogen atoms, preferably up to 5, and more preferably 1 to 3 hydrogen atoms within a group, are substituted independently of each other by a corresponding number of substituents. If the substituent is a ketone or oxo (i.e. =O), two (2) hydrogens on the atom are replaced.
본 개시의 맥락에서, 그룹 중의는 인접한 뉴클레오티드에 연결될 수 있는 임의의 그룹으로 대체될 수 있다.In the context of this disclosure, groups middle school can be replaced by any group that can be linked to an adjacent nucleotide.
용어 "연결"은 두 분자 사이의 관계를 나타낼 때, 두 분자가 공유 결합에 의해 연결되거나, 두 분자가 비공유 결합(예를 들어, 수소 결합 또는 이온 결합)에 의해 관련되는 것을 가리키며, 직접 연결, 간접 연결을 포함한다.The term "link", when referring to a relationship between two molecules, refers to either the two molecules being linked by a covalent bond, or the two molecules being related by a non-covalent bond (e.g., a hydrogen bond or an ionic bond), a direct link, Includes indirect connections.
용어 "직접 연결"은 제1 화합물 또는 그룹이 아무 개재 원자 또는 원자 그룹도 없는 상황에서 제2 화합물 또는 그룹에 연결되는 것을 가리킨다.The term “direct link” refers to a first compound or group being linked to a second compound or group in the absence of any intervening atoms or groups of atoms.
용어 "간접 연결"은 제1 화합물 또는 그룹이 개재 그룹, 화합물 또는 분자(예를 들어, 연결 그룹)를 통해 제2 화합물 또는 그룹에 연결되는 것을 가리킨다.The term “indirect linkage” refers to a first compound or group being linked to a second compound or group through an intervening group, compound or molecule (e.g., a linking group).
"약학적 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적 약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물과 기타 화학적 성분의 혼합물, 및 기타 성분 예를 들어, 생리학적 약학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제를 함유하는 혼합물을 나타낸다. 약학적 조성물은 생물체에 대한 투약을 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 촉진하여 생물학적 활성을 발휘하도록 하는 것을 목적으로 한다.“Pharmaceutical composition” refers to a mixture of one or more compounds described herein, or a physiologically pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof, with other chemical ingredients, and other ingredients such as physiologically and pharmaceutically acceptable carriers and excipients. Indicates a mixture containing The purpose of pharmaceutical compositions is to promote administration to living organisms and promote absorption of active ingredients to exert biological activity.
"약학적으로 허용 가능한 부형제"는 인간 또는 가축 동물에 대해 사용하도록 승인된 모든 보조제, 담체, 유동화제, 감미료, 희석제, 방부제, 염료/착색제, 향미제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장화제, 완충제, 용매 또는 유화제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.“Pharmaceutically acceptable excipient” means any adjuvant, carrier, glidant, sweetener, diluent, preservative, dye/colorant, flavoring agent, surfactant, wetting agent, dispersing agent, suspending agent, approved for use in humans or domestic animals; Including, but not limited to, stabilizers, isotonic agents, buffers, solvents, or emulsifiers.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "억제"는 "감소", "침묵", "하향 조절", "제지" 및 기타 유사한 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 임의의 수준으로 억제하는 것을 포함한다. 억제는 대조 수준과 비교하여 이러한 변수 중의 하나 이상의 절대적 또는 상대적 수준의 감소로 평가할 수 있다. 해당 대조 수준은 투약 전 기준 수준 또는 유사한 미처리 또는 대조(예를 들어, 완충액만 대조 또는 비활성제만 대조) 처리받는 피험자, 세포 또는 샘플로부터 결정된 수준과 같이 당업계에서 사용되는 임의 유형의 대조 수준일 수 있다. 예를 들어, mRNA의 잔여 발현량을 채택하여 표적 유전자 발현에 대한 siRNA(또는 dsRNA)의 억제 정도를 특성화할 수 있는데, 예컨대, mRNA의 잔여 발현량은 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하 또는 10% 이하이다. 표적 유전자 발현의 억제율은 Dual-Glo® Luciferase Assay System을 채택하여 검출할 수 있으며, 반딧불이(Firefly) 화학발광 값과 레닐라(Renilla) 화학발광 값을 각각 판독하여 상대값 Ratio=Ren/Fir을 계산하고, 억제율(%)=1-(Ratio+siRNA/리포터 유전자만)*100%이며; 본 개시에서, 잔여 mRNA 발현량 비율(또는 잔여 활성%)=100%-억제율(%)이다.As used herein, the term “inhibition” may be used interchangeably with “reduction,” “silence,” “downregulation,” “restraint,” and other similar terms, and includes inhibition to any level. . Inhibition can be assessed as a decrease in the absolute or relative level of one or more of these variables compared to control levels. The control level may be any type of control level used in the art, such as a pre-dose baseline level or a level determined from a subject, cell or sample treated with a similar untreated or control (e.g., buffer only control or inactivator only control) treatment. You can. For example, the residual expression level of mRNA can be adopted to characterize the degree of inhibition of siRNA (or dsRNA) on target gene expression, e.g., the residual expression level of mRNA is 99% or less, 95% or less, 90% or less. , 85% or less, 80% or less, 75% or less, 70% or less, 65% or less, 60% or less, 55% or less, 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25 % or less, 20% or less, 15% or less, or 10% or less. The inhibition rate of target gene expression can be detected by adopting the Dual-Glo® Luciferase Assay System, and the relative value Ratio=Ren/Fir is calculated by reading the chemiluminescence value of Firefly and Renilla respectively. And the inhibition rate (%) = 1-(Ratio+siRNA/reporter gene only)*100%; In the present disclosure, the residual mRNA expression level ratio (or residual activity %) = 100% - inhibition rate (%).
"유효량" 또는 "유효 용량"은 의학적 병증의 증상 또는 병증을 개선 또는 예방하기에 충분한 양이 포함된다. 유효량은 또한 진단에 허용되거나 진단을 촉진하는 데 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 수의학적 피험자에게 사용되는 유효량은 치료할 병증, 환자의 전반적인 건강 상태, 투약 방법 경로, 용량 및 부작용의 심각성과 같은 요소에 따라 변화될 수 있다. 유효량은 유의한 부작용이나 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투약 방안일 수 있다.“Effective amount” or “effective dose” includes an amount sufficient to improve or prevent the symptoms or symptoms of a medical condition. Effective amount also means an amount sufficient to permit or facilitate diagnosis. The effective amount used for a particular patient or veterinary subject may vary depending on factors such as the condition being treated, the patient's general health, route of administration, dosage, and severity of side effects. The effective amount may be the maximum dose or dosage regimen that avoids significant side effects or toxic effects.
본원에 사용된 바와 같이, "대상체", "환자", "피험자" 또는 "개체"는 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 인간 또는 원숭이와 같은 포유동물 등 비인간 동물을 포함한다.As used herein, “subject,” “patient,” “subject,” or “individual” may be used interchangeably and includes non-human animals, such as humans or mammals such as monkeys.
본원에 사용된 바와 같이, 센스 가닥(SS, SS 가닥 또는 센스 가닥이라고도 함)은 표적 mRNA 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 가닥을 가리키고; 안티센스 가닥(AS 또는 AS 가닥이라고도 함)은 표적 mRNA 서열과 상보적인 서열을 갖는 가닥을 가리킨다.As used herein, sense strand (also referred to as SS, SS strand or sense strand) refers to a strand comprising a sequence that is identical or substantially identical to a target mRNA sequence; The antisense strand (also called AS or AS strand) refers to the strand that has a sequence complementary to the target mRNA sequence.
본 개시에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 "5' 영역", 즉 "5' 단" 및 "5' 말단"은 상호 대체적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 가닥 5' 영역의 2번째 내지 8번째 위치의 뉴클레오티드는 안티센스 가닥 5' 단으로부터 2번째 내지 8번째 위치의 뉴클레오티드로 대체될 수도 있다. 마찬가지로, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 "3' 영역", "3' 말단" 및 "3' 단"도 상호 대체적으로 사용될 수 있다.In the present disclosure, the terms "5' region" of the sense strand or antisense strand, i.e., "5' end" and "5' end" may be used interchangeably. For example, the nucleotide at positions 2 to 8 of the 5' region of the antisense strand may be replaced with the nucleotide at positions 2 to 8 from the 5' end of the antisense strand. Likewise, "3' region", "3' end" and "3' end" of the sense or antisense strand may also be used interchangeably.
본원에 기재된 siRNA의 센스 가닥을 설명하는 맥락에서, 용어 "SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4 중 임의의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열을 포함하고, 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다"는, 본원에 기재된 siRNA 센스 가닥이 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4 중 임의의 센스 가닥의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4 중 임의의 센스 가닥의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드와 3개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열을 포함함을 나타내려고 하는 것이다(선택적으로, 2개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열, 선택적으로, 1개의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열). 선택적으로, 본원에 기재된 siRNA 센스 가닥은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4 중 임의의 센스 가닥의 적어도 16개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 4 중 임의의 센스 가닥의 적어도 16개의 연속적인 뉴클레오티드와 3개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열을 포함한다(선택적으로, 2개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열, 선택적으로 1개의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열).In the context of describing the sense strand of a siRNA described herein, the term "comprises a sequence that differs by no more than 3 nucleotides from any nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and has at least 15 contiguous sequences. “Comprising nucleotides” means that the siRNA sense strand described herein comprises at least 15 consecutive nucleotides of the sense strand of any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: is intended to indicate that it includes a sequence that differs by no more than 3 nucleotides from at least 15 consecutive nucleotides of the sense strand of any of the 4 (optionally, a sequence that differs by no more than 2 nucleotides, optionally, sequences that differ by 1 nucleotide). Optionally, the siRNA sense strand described herein comprises at least 16 consecutive nucleotides of the sense strand of any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. Comprises a sequence that differs by no more than 3 nucleotides from at least 16 consecutive nucleotides of any sense strand (optionally, a sequence that differs by no more than 2 nucleotides, optionally a sequence that differs by 1 nucleotide) ).
본원에 기재된 siRNA 안티센스 가닥을 설명하는 맥락에서, 용어 "SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 8 중 임의의 안티센스 가닥과 3개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열을 포함하고, 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다"는 본원에 기재된 siRNA 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 8 중 임의의 안티센스 가닥의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5 내지 SEQ ID NO: 8 중 임의의 안티센스 가닥의 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드와 3개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열을 포함함을 나타내려고 하는 것이다(선택적으로, 2개 이하의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열, 선택적으로, 1개의 뉴클레오티드로 차이가 있는 서열).In the context of describing the siRNA antisense strand described herein, the term "comprises a sequence that differs by no more than 3 nucleotides from any of the antisense strands of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, and has at least 15 consecutive sequences. “Comprising nucleotides” means that the siRNA antisense strand described herein comprises at least 15 consecutive nucleotides of the antisense strand of any of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO : is intended to indicate that it contains a sequence that differs by no more than 3 nucleotides from at least 15 consecutive nucleotides of the antisense strand of any of the 8 (optionally, a sequence that differs by no more than 2 nucleotides, optionally , sequences that differ by 1 nucleotide).
특별히 설명하지 않는 한, 본 개시의 맥락에서, "G", "C", "A", "T" 및 "U"는 각각 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 나타낸다.본 개시의 맥락에서, I는 핵염기 히포크산틴(nucleobase hypoxanthine)을 포함하는 뉴클레오티드와 동등하다. 일부 실시양태에서, 본 개시에 사용된 용어 이노신은 히포크산틴 및 당 또는 변형 당을 포함하는 뉴클레오시드(nucleoside comprising hypoxanthine and a sugar or modified sugar)와 동등하다.Unless specifically stated, in the context of this disclosure, “G”, “C”, “A”, “T” and “U” represent nucleotides containing the bases guanine, cytosine, adenine, thymidine and uracil, respectively. .In the context of the present disclosure, I is equivalent to a nucleotide comprising the nucleobase hypoxanthine. In some embodiments, the term inosine, as used in this disclosure, is equivalent to a nucleoside comprising hypoxanthine and a sugar or modified sugar.
특별히 설명하지 않는 한, 본 개시의 맥락에서, 소문자 d는 해당 문자 d의 다운스트림에 인접한 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 m은 해당 문자 m의 업스트림에 인접한 뉴클레오티드가 2'-메톡시 변형 뉴클레오티드임을 나타내며; 소문자 f는 해당 문자 f의 업스트림에 인접한 뉴클레오티드가 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드임을 나타내고; 소문자 s는 해당 문자 s의 왼쪽과 오른쪽에 인접한 두 개의 뉴클레오티드 사이가 포스포로티오에이트 디에스테르에 의해 연결되어 있음을 나타낸다.Unless specifically stated, in the context of this disclosure, a lowercase letter d indicates that the adjacent nucleotide downstream of that letter d is a deoxyribonucleotide; A lowercase letter m indicates that the nucleotide adjacent upstream of that letter m is a 2'-methoxy modified nucleotide; A lowercase letter f indicates that the adjacent nucleotide upstream of that letter f is a 2'-fluoro modified nucleotide; The lowercase letter s indicates that the two adjacent nucleotides to the left and right of the letter s are linked by a phosphorothioate diester.
본 개시에 사용된 바와 같이, 용어 "2'-플루오로(2'-F) 변형 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보실 2' 위치에 있는 히드록시가 플루오로에 의해 치환되어 형성된 뉴클레오티드를 가리키고, "비플루오로 변형 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 리보실 2' 위치에 있는 히드록시가 플루오로가 아닌 그룹에 의해 치환되어 형성된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 가리킨다.As used in this disclosure, the term "2'-fluoro(2'-F) modified nucleotide" refers to a nucleotide formed by replacing the hydroxy at the ribosyl 2' position of the nucleotide with fluoro, and "non- “Fluoro modified nucleotide” refers to a nucleotide or nucleotide analog formed by replacing the hydroxy at the ribosyl 2′ position of the nucleotide with a non-fluoro group.
본 개시에 사용된 바와 같이, 용어 "2'-메톡시(2'-OMe) 변형 뉴클레오티드"는 리보실의 2'-히드록시가 메톡시에 의해 치환되어 형성된 뉴클레오티드를 가리킨다.As used in this disclosure, the term “2'-methoxy (2'-OMe) modified nucleotide” refers to a nucleotide formed by substitution of the 2'-hydroxy of a ribosyl by methoxy.
본 개시의 맥락에서, 하나의 뉴클레오티드 서열과 다른 하나의 뉴클레오티드 서열은 "뉴클레오티드 차이"가 존재한다는 것은 전자가 후자에 비해 동일한 위치에 있는 뉴클레오티드의 염기 종류가 변경되는 것을 가리키며, 예를 들어, 후자의 하나의 뉴클레오티드 염기가 A인 경우, 전자의 동일한 위치의 대응하는 뉴클레오티드 염기가 U, C, G 또는 T인 경우 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 해당 위치에 뉴클레오티드 차이가 존재하는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 무염기 뉴클레오티드 또는 이의 등가물로 원래 위치의 뉴클레오티드를 대체하는 경우, 해당 위치에서 뉴클레오티드 차이가 생성하는 것으로 간주될 수도 있다.In the context of the present disclosure, the existence of a “nucleotide difference” between one nucleotide sequence and another nucleotide sequence refers to a change in the type of base in the nucleotide at the same position in the former compared to the latter, e.g. If one nucleotide base is A, a nucleotide difference is considered to exist at that position between two nucleotide sequences if the corresponding nucleotide base at the same position is U, C, G or T. In some embodiments, replacing a nucleotide at an original position with an abase nucleotide or its equivalent may be considered to create a nucleotide difference at that position.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적" 또는 "역상보적"은 상호 대체적으로 사용될 수 있으며, 당업자에게 잘 알려진 의미를 가지며, 즉, 이중 가닥 핵산 분자에서 한 가닥의 염기는 다른 가닥에 있는 염기와 상보적인 방식으로 쌍을 이룬다. DNA에서, 퓨린 염기인 아데닌은 항상 피리미딘 염기인 티민(또는 RNA에서는 우라실)과 쌍을 이루고; 퓨린 염기인 구아닌은 항상 피리미딘 염기인 시토신과 쌍을 이룬다. 각 염기쌍은 모두 하나의 퓨린과 하나의 피리미딘을 포함한다. 한 가닥에 있는 아데닌이 항상 다른 가닥에 있는 티민(또는 우라실)과 쌍을 이루고, 구아닌이 항상 시토신과 쌍을 이루는 경우, 이 두 가닥은 서로 상보적인 것으로 간주되며, 이들의 상보적 가닥의 서열로부터 해당 가닥의 서열을 추정할 수 있다. 이에 상응하여, 당업계에서 "미스매칭"은 이중 가닥 핵산에서 대응하는 위치에 있는 염기가 상보적인 방식으로 쌍을 이루지 않았음을 의미한다.As used herein, the terms "complementary" or "countercomplementary" may be used interchangeably and have meanings well known to those skilled in the art, i.e., in a double-stranded nucleic acid molecule, a base on one strand is present on the other strand. It pairs with bases in a complementary manner. In DNA, the purine base adenine is always paired with the pyrimidine base thymine (or uracil in RNA); Guanine, a purine base, always pairs with cytosine, a pyrimidine base. Each base pair contains one purine and one pyrimidine. If adenine on one strand always pairs with thymine (or uracil) on the other strand, and guanine always pairs with cytosine, then these two strands are considered complementary to each other, and from the sequences of their complementary strands The sequence of the corresponding strand can be estimated. Correspondingly, in the art, “mismatch” means that the bases at the corresponding positions in a double-stranded nucleic acid do not pair in a complementary manner.
용어 "화학적 변형" 또는 "변형"은 화학적 부분의 첨가 또는 제거, 또는 하나의 화학적 부분을 다른 화학적 부분으로 치환하는 것과 같은 화학적 수단에 거친 뉴클레오티드의 모든 변화를 포함한다.The term “chemical modification” or “transformation” includes any change in a nucleotide by chemical means, such as the addition or removal of a chemical moiety, or the substitution of one chemical moiety for another.
용어 "dsRNA"는 RNA 간섭을 수행할 수 있는 이중 가닥 RNA 분자를 가리키며, 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함한다.The term “dsRNA” refers to a double-stranded RNA molecule capable of RNA interference and includes a sense strand and an antisense strand.
용어 "염기"는 임의의 알려진 DNA 및 RNA 염기, 퓨린 또는 피리미딘과 같은 염기 유사체를 포함하며, 이는 또한 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신 및 천연 유사체를 포함한다. 염기 유사체는 범용 염기일 수도 있다.The term “base” includes any known DNA and RNA base, base analogs such as purine or pyrimidine, and also includes the natural compounds adenine, thymine, guanine, cytosine, uracil, inosine and their natural analogs. The base analog may also be a general-purpose base.
용어 "평활 단" 또는 "평활 말단"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, siRNA의 주어진 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 없으며, 즉 뉴클레오티드 오버행이 없음을 가리킨다. 대부분의 경우, 두 개의 말단이 모두 평활 말단인 siRNA는 이의 전체 길이 범위 내에서 이중 가닥으로 존재한다.The terms “blunt end” or “blunt end” may be used interchangeably and indicate that there are no unpaired nucleotides or nucleotide analogs at a given end of the siRNA, i.e., no nucleotide overhangs. In most cases, siRNAs with both blunt ends exist as double strands throughout their entire length.
본 개시에 제공하는 siRNA는 당업계에서 일반적인 제조 방법(예를 들어, 고체상 합성법 및 액체상 합성법)에 의해 제조될 수 있다. 여기서, 고체상 합성은 이미 상업적 맞춤화 서비스가 있다. 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오티드 단량체를 사용함으로써 본 개시에 기재된 siRNA에 변형된 뉴클레오티드 그룹을 도입할 수 있고, 상응하는 변형을 갖는 뉴클레오티드 단량체를 제조하는 방법 및 siRNA에 변형된 뉴클레오티드 그룹을 도입하는 방법도 역시 당업자에게 잘 알려져 있다.The siRNA provided in the present disclosure can be produced by production methods common in the art (for example, solid phase synthesis and liquid phase synthesis). Here, solid-phase synthesis already has commercial customization services. Modified nucleotide groups can be introduced into siRNAs described in the present disclosure by using nucleotide monomers with corresponding modifications, and methods for preparing nucleotide monomers with corresponding modifications and methods for introducing modified nucleotide groups into siRNA are also provided. It is well known to those skilled in the art.
본 개시에 기재된 "병용", "병용하여 사용되다"는 일종의 투약 방식이며, 특정 시간 기한 내에 적어도 하나의 용량의 dsRNA 및 적어도 하나의 용량의 다른 치료제를 투여하는 것을 가리키며, 여기서 투여된 약물은 모두 약리학적 효과를 나타낸다. dsRNA와 다른 치료제를 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 이러한 기한은 이러한 치료를 포함하며, 여기서 동일한 투약 경로 또는 다른 투약 경로를 통해 dsRNA와 다른 치료제를 투여한다. 본 개시에 기재된 병용한 투약 방식은 동시 투약, 독립적으로 배합하고 공동으로 투약 또는 독립적으로 배합하고 순차적으로 투약으로부터 선택된다.“Combined use” and “used in combination” described in the present disclosure are a type of administration method and refer to administering at least one dose of dsRNA and at least one dose of another therapeutic agent within a specific time period, wherein all the administered drugs are Shows pharmacological effects. dsRNA and other therapeutic agents can be administered simultaneously or sequentially. This time limit includes such treatments, wherein the dsRNA and the other therapeutic agent are administered via the same or different route of administration. The combined dosage regimen described in this disclosure is selected from simultaneous administration, independently formulated and administered jointly, or independently combined and sequentially administered.
도 1은 투약 후 7일째 TRD002218 및 TRD007205의 TTR에서 mRNA의 잔여 발현량이다.
도 2는 투약 후 28일째 TRD002218 및 TRD007205의 TTR에서 mRNA의 잔여 발현량이다.
도 3은 엑소뉴클레아제 안정성 겔전기영동 실험 결과이다.
도 4는 5' 엑소뉴클레아제 안정성 실험 정량적 결과이다.
도 5는 3' 엑소뉴클레아제 안정성 실험 정량적 결과이다.Figure 1 shows the residual expression level of mRNA in the TTR of TRD002218 and TRD007205 7 days after administration.
Figure 2 shows the residual expression level of mRNA in the TTR of TRD002218 and TRD007205 at 28 days after administration.
Figure 3 shows the results of an exonuclease stability gel electrophoresis experiment.
Figure 4 shows quantitative results of 5' exonuclease stability experiment.
Figure 5 shows quantitative results of 3' exonuclease stability experiment.
이하 실시예를 결합하여 본 개시를 추가적으로 설명할 것이나, 이들 실시예는 본 개시의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 개시의 실시예에서 구체적인 조건이 명시되지 않은 실험 방법은, 통상적으로 일반적인 조건에 따르거나, 원료 또는 상품의 제조업체에서 권장하는 조건에 따른다. 시약의 구체적인 출처가 명시되지 않으면, 해당 시약은 분자 생물학 응용에 적합한 질량/순도로 임의의 분자 생물학 시약 공급업체로부터 얻을 수 있다.The present disclosure will be further explained by combining examples below, but these examples do not limit the scope of the present disclosure. Experimental methods for which specific conditions are not specified in the examples of the present disclosure usually follow general conditions or conditions recommended by the manufacturer of the raw material or product. Unless the specific source of a reagent is specified, the reagent can be obtained from any molecular biology reagent supplier in a mass/purity suitable for molecular biology applications.
실시예 1: 화학적 변형의 제조Example 1: Preparation of chemical modifications
1.1 화합물 1-1a 및 화합물 1-1b의 합성1.1 Synthesis of Compound 1-1a and Compound 1-1b
화합물 1(500mg, 3.42mmol)과 트리에틸아민(Et3N, 692mg, 6.84mmol, 0.95mL)을 디클로로메탄(DCM, 10mL)에 용해시키고, 빙수욕에서 4-톨루엔설포닐 클로라이드(TsCl, 717mg, 3.76mmol)의 디클로로메탄(10mL) 용액을 드롭방식으로 첨가하고, 드롭방식으로 첨가 완료 후 실온에서 밤새 교반하면서 반응시키고, 반응 완료 후, 물로 ??칭하고 수상을 디클로로메탄(15mL)으로 3회 추출하고, 합한 유기상을 먼저 포화 탄산수소나트륨 수용액(10mL)으로 세척한 다음, 포화 식염수(20mL)로 세척하고, 이어서 용매를 감압 증발하여 건조시켜 조생성물2(820mg, 80%)를 얻었고, 다음 단계 반응에 바로 사용하였다. MS m/z: C14H21O5S, [M+H]+ 이론: 301.10 실측: 301.2.Compound 1 (500 mg, 3.42 mmol) and triethylamine (Et3 N, 692 mg, 6.84 mmol, 0.95 mL) were dissolved in dichloromethane (DCM, 10 mL), and 4-toluenesulfonyl chloride (TsCl, 717 mg) was dissolved in an ice-water bath. , 3.76 mmol) of dichloromethane (10 mL) solution was added dropwise, and after the addition was completed dropwise, the reaction was performed with stirring at room temperature overnight. After the reaction was completed, the solution was washed with water and the aqueous phase was washed with dichloromethane (15 mL) three times. After extraction, the combined organic phases were first washed with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (10 mL), then with saturated saline solution (20 mL), and then the solvent was evaporated under reduced pressure to dryness to obtain crude product2 (820 mg, 80%), and then It was used directly in the step reaction. MS m/z: C14 H21 O5 S, [M+H]+ Theory: 301.10 Actual: 301.2.
화합물3(239mg, 1.22mmol)을 디메틸포름아미드(DMF, 10mL)에 용해시키고, 빙수욕에서 NaH(미네랄 오일에 60% 용해시킴, 93mg, 2.33mmol) 용액을 첨가하고, 해당 반응을 30분 동안 교반하고, 그 다음, 화합물2(350mg, 1.16mmol)를 드롭방식으로 첨가하고, 드롭방식으로 첨가 완료 후 60℃에서 5시간 동안 교반하면서 반응시키고, 반응 완료 후, 물을 첨가하여 ??칭하고, 수상을 에틸 아세테이트(15mL)로 3회 추출하고, 합한 유기상을 먼저 물(10mL)로 3회 세척한 다음, 포화 식염수(10mL)로 세척하고, 이어서 용매를 감압 증발하여 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~50%(A: H2O, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후 220mg의 화합물4를 얻었다. MS m/z: C19H21N5O3Na, [M+Na]+ 이론: 390.16, 실측: 390.3.Compound3 (239 mg, 1.22 mmol) was dissolved in dimethylformamide (DMF, 10 mL), NaH (60% dissolved in mineral oil, 93 mg, 2.33 mmol) solution was added in an ice-water bath, and the reaction was allowed to proceed for 30 minutes. After stirring, Compound2 (350 mg, 1.16 mmol) was added dropwise, and after the addition was completed dropwise, the mixture was reacted with stirring at 60°C for 5 hours. After the reaction was completed, water was added and quenched. The aqueous phase was extracted three times with ethyl acetate (15 mL), and the combined organic phases were washed first three times with water (10 mL) and then with saturated saline solution (10 mL), then the solvent was evaporated under reduced pressure to dryness, and reversed-phase preparative HPLC. (C18 , conditions: 5 to 50% (A: H2 O, B: CH3 CN), flow rate: 70 mL/min) and lyophilized to obtain 220 mg of Compound4 . MS m/z: C19 H21 N5 O3 Na, [M+Na]+ Theory: 390.16, Act: 390.3.
실온에서 화합물4(1.50g, 4.08mmol)를 아세트산과 물(4:1)의 혼합 용액 20mL에 용해시키고, 60℃에서 30분 동안 교반하고, 반응 완료 후 용매를 감압 증발하여 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~25%(A: H2O, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후 1.10g의 화합물5를 얻었다. MS m/z: C16H18N5O3, [M+H]+ 이론: 328.13, 실측: 328.4.Compound4 (1.50 g, 4.08 mmol) was dissolved in 20 mL of a mixed solution of acetic acid and water (4:1) at room temperature, stirred at 60°C for 30 minutes, and after completion of the reaction, the solvent was evaporated under reduced pressure, dried, and reversed phase. After processing through HPLC (C18 , conditions: 5 to 25% (A: H2 O, B: CH3 CN), flow rate: 70 mL/min) and freeze-drying, 1.10 g of Compound5 was obtained. MS m/z: C16 H18 N5 O3 , [M+H]+ Theory: 328.13, Actual: 328.4.
화합물5(1.00g, 3.05mmol)를 피리딘(Py, 10mL)에 용해시키고, 빙수욕에서 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(DMTrCl, 1.50g, 4.58mmol)의 피리딘(5mL) 용액을 드롭방식으로 첨가하고, 드롭방식으로 첨가 완료 후 실온에서 밤새 교반하면서 반응시키고, 반응 완료 후, 물로 ??칭하고, 용매를 감압 증발하여 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~80%(A: H2O, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후 1.00g의 화합물6을 얻었다. MS m/z: C37H36N5O5, [M-H]+ 이론: 630.26, 실측: 630.5. 라세미 화합물6을 키랄 컬럼(Daicel CHIRALPAK® IE 250*4.6mm, 5μm, A: n-헥산, B: 에탄올)을 거쳐 분리하여 410mg 6A(-)와 435mg 6B(+)를 얻었다.Compound5 (1.00 g, 3.05 mmol) was dissolved in pyridine (Py, 10 mL), and a pyridine (5 mL) solution of 4,4'-dimethoxytrityl chloride (DMTrCl, 1.50 g, 4.58 mmol) was added dropwise in an ice-water bath. After the addition was completed in a drop manner, the reaction was carried out with stirring at room temperature overnight. After the reaction was completed, the reaction was quenched with water, the solvent was evaporated under reduced pressure, dried, and reversed phase preparative HPLC (C18 , conditions: 5 to 80%). (A: H2 O, B: CH3 CN), flow rate: 70 mL/min), and lyophilized to obtain 1.00 g of Compound6 . MS m/z: C37 H36 N5 O5 , [MH]+ Theory: 630.26, Actual: 630.5. Racemic compound6 was separated through a chiral column (Daicel CHIRALPAK® IE 250*4.6mm, 5μm, A: n-hexane, B: ethanol) to obtain 410mg 6A(-) and 435mg 6B(+).
화합물6A(-)(200mg, 0.32mmol), 테트라졸(11mg, 0.16mmol), N-메틸이미다졸(5mg, 0.06mmol), 및 3A 분자체(500mg)를 10mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 화합물7(144mg, 0.48mmol)을 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 완료 후, 분자체를 여과해 버리고 디클로로메탄(30mL)을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(10mL)으로 3회 세척한 다음, 포화 식염수(20mL)로 세척하고 여과액을 회전 건조시켜, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후 200mg의 화합물1-1a를 얻었다. MS m/z: C40H39N6O7P, [M-디이소프로필+OH]+ 이론: 747.26, 실측: 747.6. 1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 7.56, 7.54 (2s, 1H), 7.36-7.27 (m, 2H), 7.24-7.21 (m, 7H), 6.83-6.80 (m, 4H), 4.12-4.10 (m, 2H), 3.75-3.68 (m, 10H), 3.20-2.80 (m, 2H), 2.68-2.54 (m, 4H), 1.22-1.04 (m, 18H).Compound6A(-) (200 mg, 0.32 mmol), tetrazole (11 mg, 0.16 mmol), N-methylimidazole (5 mg, 0.06 mmol), and 3A molecular sieve (500 mg) were dissolved in 10 mL of acetonitrile; Compound7 (144 mg, 0.48 mmol) was added at room temperature and stirred at room temperature overnight. After completion of the reaction, the molecular sieve was filtered off, dichloromethane (30 mL) was added, and washed three times with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (10 mL), followed by washing with saturated saline solution (20 mL), and the filtrate was spin-dried and reversed phase. It was subjected to preparative HPLC (C18 , conditions: 5-100% (A: water, B: CH3 CN), flow rate: 70 mL/min), and lyophilized to obtain 200 mg of compound1-1a . MS m/z: C40 H39 N6 O7 P, [M-diisopropyl+OH]+ Theory: 747.26, Actual value: 747.6. 1H NMR (400 MHz, acetonitrile-d3 ) δ 7.56, 7.54 (2s, 1H), 7.36-7.27 (m, 2H), 7.24-7.21 (m, 7H), 6.83-6.80 (m, 4H), 4.12 -4.10 (m, 2H), 3.75-3.68 (m, 10H), 3.20-2.80 (m, 2H), 2.68-2.54 (m, 4H), 1.22-1.04 (m, 18H).
화합물6B(+)(200mg, 0.32mmol), 테트라졸(11mg, 0.16mmol), N-메틸이미다졸(5mg, 0.06mmol) 및 3A 분자체(500mg)를 10mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 화합물7(144mg, 0.48mmol)을 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 완료 후, 분자체를 여과해 버리고 디클로로메탄(30mL)을 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(10mL)으로 3회 세척한 다음, 포화 식염수(20mL)로 세척하고, 여과액을 회전 건조시켜, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후 200mg의 화합물1-1b를 얻었다. MS m/z: C40H39N6O7P, [M-디이소프로필+OH]+ 이론: 747.26, 실측: 747.5.Compound6B(+) (200 mg, 0.32 mmol), tetrazole (11 mg, 0.16 mmol), N-methylimidazole (5 mg, 0.06 mmol) and 3A molecular sieve (500 mg) were dissolved in 10 mL of acetonitrile and incubated at room temperature. Compound7 (144 mg, 0.48 mmol) was added and stirred at room temperature overnight. After completion of the reaction, the molecular sieve was filtered off, dichloromethane (30 mL) was added, washed three times with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (10 mL), then washed with saturated saline solution (20 mL), and the filtrate was spin-dried. It was subjected to reverse-phase preparative HPLC (C18 , conditions: 5-100% (A: water, B: CH3 CN), flow rate: 70 mL/min), and lyophilized to obtain 200 mg of compound1-1b . MS m/z: C40 H39 N6O7 P, [M-diisopropyl+OH]+ theory: 747.26, actual value: 747.5.
1.2 화합물 1-6a의 합성1.2 Synthesis of Compound 1-6a
화합물 1(10g, 68.404mmol), 화합물 2(15g, 62.186mmol) 및 트리페닐포스핀(32.62g, 124.371mmol)을 무수 THF(30mL)에 용해시키고, 0℃에서 DIAD(24.656mL, 124.371mmol)를 천천히 드롭방식으로 첨가하였다. 해당 반응액을 25℃에서 12 시간 동안 반응시켰다. LCMS로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 해당 반응액을 에틸 아세테이트(200mL) 및 물(200mL)로 추출하고 유기상을 건조시키고 여과액을 농축시켜, 얻어진 잔류물을 순상 컬럼(DCM/MeOH=10/1)으로 정제하여 목표 생성물 3(20g)을 얻었다.Compound 1 (10 g, 68.404 mmol), Compound 2 (15 g, 62.186 mmol) and triphenylphosphine (32.62 g, 124.371 mmol) were dissolved in anhydrous THF (30 mL) and DIAD (24.656 mL, 124.371 mmol) at 0°C. was added slowly dropwise. The reaction solution was reacted at 25°C for 12 hours. LCMS indicated that the reaction was complete. The reaction solution was extracted with ethyl acetate (200 mL) and water (200 mL), the organic phase was dried, and the filtrate was concentrated. The obtained residue was purified by normal phase column (DCM/MeOH=10/1) to obtain target product 3 (20 g). ) was obtained.
화합물3(20g, 28.585mmol)을 아세트산(24mL, 426.016mmol)과 H2O(12mL)에 용해시키고, 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음, 반응액을 회전 건조시키고, THF(12mL) 및 H2O(12mL)를 첨가하고, 80℃에서 7시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응액에 에틸 아세테이트(200mL) 및 물(100mL)을 첨가하여 추출하고, 대량의 고체가 석출될 때까지 수상에 탄산나트륨 고체를 첨가하였다. 고체를 여과하고, 물로 세척하고, 필터 케이크를 오일펌프로 건조시켜 목표 화합물5(9g)를 얻었다.Compound3 (20g, 28.585mmol) was dissolved in acetic acid (24mL, 426.016mmol) and H2 O (12mL), and stirred at 60°C for 1 hour. Then, the reaction solution was spin-dried, THF (12 mL) and H2 O (12 mL) were added, and stirred at 80°C for 7 hours. LCMS indicated that the reaction was complete. Ethyl acetate (200 mL) and water (100 mL) were added to the reaction solution for extraction, and sodium carbonate solid was added to the aqueous phase until a large amount of solid precipitated. The solid was filtered, washed with water, and the filter cake was dried with an oil pump to obtain target compound5 (9 g).
질소 보호 하에, 화합물 5(6.8g, 18.581mmol)를 피리딘(80mL)에 용해시키고, 0℃에서 TMSCl(14.250mL, 111.489mmol)을 천천히 첨가하고 2 시간 동안 교반하였다. 그 다음, 0℃에서 이소부티릴 클로라이드(2.044mL, 19.511mmol)를 첨가하고 25℃에서 1 시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 디클로로메탄(200mL) 및 물(200mL)로 추출하고, 유기상을 건조시키고 회전 건조시킨 다음 샘플을 교반하고, 순상 컬럼(DCM:MeOH=10:1, 컬럼을 거치게 하고, 4.8%에서 피크가 나타남)으로 정제하여 황색 오일 형태 화합물 6(12g)을 얻었다.Under nitrogen protection, compound 5 (6.8 g, 18.581 mmol) was dissolved in pyridine (80 mL), and TMSCl (14.250 mL, 111.489 mmol) was slowly added at 0°C and stirred for 2 hours. Then, isobutyryl chloride (2.044 mL, 19.511 mmol) was added at 0°C and stirred at 25°C for 1 hour. LCMS indicated that the reaction was complete. Extracted with dichloromethane (200 mL) and water (200 mL), dried the organic phase, spun to dry, then stirred the sample and passed through a normal phase column (DCM:MeOH=10:1, peak at 4.8%). was purified to obtain compound 6 (12g) in the form of a yellow oil.
질소 보호 하에, 화합물 6(5.5g, 12.392mmol)을 피리딘(30mL)에 용해시키고, MOLECULAR SIEVE 4A 1/16(7g, 12.392mmol)을 첨가한 다음, 0℃에서 DMTrCl(5.04g, 14.870mmol) 고체를 배치로 첨가하고, 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. TLC(PE:EtOAc=1:1, Rf=0.69)로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 해당 반응액과 TJN200879-040-P1을 합하고 함께 처리하였다. 반응액을 에틸 아세테이트(200mL) 및 물(200mL)로 추출하고, 유기상을 건조시키고 회전 건조시킨 다음 샘플을 교반하고, 순상 컬럼(PE: EtOAc 컴럼을 거치게 하고, 84%에서 피크가 나타남)으로 정제하여 황색 오일 형태 화합물 7(12g)을 얻었다.Under nitrogen protection, compound 6 (5.5 g, 12.392 mmol) was dissolved in pyridine (30 mL), MOLECULAR SIEVE 4A 1/16 (7 g, 12.392 mmol) was added, and DMTrCl (5.04 g, 14.870 mmol) was added at 0°C. Solids were added in batches and reacted at 25°C for 2 hours. TLC (PE:EtOAc=1:1, Rf=0.69) showed the reaction was complete. The reaction solution and TJN200879-040-P1 were combined and processed together. The reaction solution was extracted with ethyl acetate (200 mL) and water (200 mL), the organic phase was dried and spin-dried, and the sample was stirred and purified by normal phase column (PE: EtOAc column, peak appears at 84%). Thus, compound 7 (12g) in the form of a yellow oil was obtained.
화합물 7(12g, 15.389mmol)을 EtOAc(140mL)에 용해시키고, 함수 팔라듐 탄소 Pd/C(7g, 15.389mmol)를 첨가하고, 해당 반응액을 25℃에서 수소(15Psi)에서 2시간 동안 반응시켰다. TLC(PE:EtOAc=0:1, Rf=0.09)로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응액을 여과하고, 에틸 아세테이트(30mL)로 필터 케이크를 3회 세척한 후 여과액을 수집하였다. 여과액을 회전 건조시킨 후 50mL의 디클로로메탄 및 2mL의 트리에틸아민을 첨가하고 샘플을 교반하고, 순상 컬럼(DCM:MeOH=10:1 컬럼을 거치게 하고, 0.5%에서 피크가 나타남)으로 정제하여, 9g(황색 거품 형태 고체)을 얻었다. 얻어진 라세미 화합물을 SFC로 분리하여 제품 목적 화합물 7A(-)(3.9g)와 목표 화합물 7B(+)(3.8g)를 얻었다.Compound 7 (12g, 15.389mmol) was dissolved in EtOAc (140mL), hydrous palladium carbon Pd/C (7g, 15.389mmol) was added, and the reaction solution was reacted at 25°C in hydrogen (15Psi) for 2 hours. . TLC (PE:EtOAc=0:1, Rf=0.09) showed the reaction was complete. The reaction solution was filtered, the filter cake was washed three times with ethyl acetate (30 mL), and the filtrate was collected. After rotary drying the filtrate, 50 mL of dichloromethane and 2 mL of triethylamine were added, the sample was stirred, and the sample was purified using a normal phase column (DCM:MeOH=10:1 column, peak appears at 0.5%). , 9g (yellow foamy solid) was obtained. The obtained racemic compound was separated by SFC to obtain target compound 7A(-) (3.9g) and target compound 7B(+) (3.8g).
화합물 7A(-)(3.30g, 5.40mmol), 테트라졸(190mg, 2.70mmol), 1-메틸이미다졸(90mg, 1.10mmol), 3A 분자체(500mg)를 30mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 화합물 8(2.50g, 8.10mmol)을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 분자체를 여과해 버리고, DCM(150mL)를 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(30mL*3)으로 세척한 다음, 포화 식염수(30mL)로 세척하고, 여과액을 회전 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후1-6a(2.9g, 66%)를 얻었다. MS m/z: C43H55N7O7P [M+H]+, 이론: 812.38, 실측: 812.5. 1H NMR(400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 7.56, 7.54(2s, 1H), 7.36-7.27(m, 2H), 7.24-7.21(m, 7H), 6.83-6.80(m, 4H), 4.12-4.10(m, 2H), 3.75-3.68(m, 10H), 3.20-2.80(m, 2H), 2.68-2.54(m, 4H), 1.22-1.04(m, 18H).Compound 7A(-) (3.30g, 5.40mmol), tetrazole (190mg, 2.70mmol), 1-methylimidazole (90mg, 1.10mmol), and 3A molecular sieve (500mg) were dissolved in 30mL of acetonitrile, Compound 8 (2.50 g, 8.10 mmol) was added at room temperature, and stirred at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the molecular sieve was filtered out, DCM (150 mL) was added, washed with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (30 mL*3), then washed with saturated saline solution (30 mL), and the filtrate was spin-dried. After undergoing reverse-phase preparative HPLC (C18, conditions: 5~100% (A: water, B: CH3CN), flow rate: 70mL/min),1-6a (2.9g, 66%) was obtained after freeze-drying. MS m/z: C43H55N7O7P [M+H]+, theory: 812.38, actual: 812.5. 1H NMR (400 MHz, acetonitrile-d3) δ 7.56, 7.54 (2s, 1H), 7.36-7.27 (m, 2H), 7.24-7.21 (m, 7H), 6.83-6.80 (m, 4H), 4.12- 4.10 (m, 2H), 3.75-3.68 (m, 10H), 3.20-2.80 (m, 2H), 2.68-2.54 (m, 4H), 1.22-1.04 (m, 18H).
1.3 화합물 1-7a의 합성1.3 Synthesis of Compound 1-7a
질소 보호 하에, 화합물 1(5g, 23.1272mmol), 화합물 2(6.76g, 46.254mmol) 및 트리페닐포스핀(7.28g, 27.753mmol)을 30mL의 디옥산에 용해시키고, 0℃에서 DEAD(5.502mL, 27.753mmol)를 천천히 드롭방식으로 첨가하였다. 드롭방식으로 첨가 완료 후, 반응 온도를 25℃로 천천히 올리고 1시간 동안 계속 반응시켰다. 반응액에 100mL의 H2O 및 100mL의 EtOAc를 첨가하여 추출하고, 유기상을 합하여 건조시키고, 여과 농축한 후, 샘플을 교반하고 컬럼을 거치게 하고, 순상 컬럼으로 정제하여, (PE:EtOAc=1:1 컬럼을 거치게 하고, 목표 생성물(4g)을 얻었다.Under nitrogen protection, compound 1 (5 g, 23.1272 mmol), compound 2 (6.76 g, 46.254 mmol) and triphenylphosphine (7.28 g, 27.753 mmol) were dissolved in 30 mL of dioxane and incubated with DEAD (5.502 mL) at 0°C. , 27.753 mmol) was added slowly dropwise. After completion of addition by drop method, the reaction temperature was slowly raised to 25°C and the reaction was continued for 1 hour. 100 mL of H2 O and 100 mL of EtOAc were added to the reaction solution for extraction, the organic phases were combined, dried, filtered and concentrated, and the sample was stirred and passed through a column, purified using a normal phase column, (PE:EtOAc=1 :1 After passing through the column, the target product (4g) was obtained.
화합물 3(3.3g)을 HOAc(16mL)와 H2O(4mL)에 용해시키고, 유욕, 60℃에서 0.5시간 동안 가열하고, 반응액을 회전 건조시켜 얻어진 잔류물을 순상 컬럼(PE:EtOAc=0:1 컬럼 거치게 함)으로 정제하여 목표 생성물 4(3g)를 얻었다.Compound 3 (3.3 g) was dissolved in HOAc (16 mL) and H2 O (4 mL), heated in an oil bath at 60° C. for 0.5 hours, and the reaction solution was spin-dried. The resulting residue was purified on a normal phase column (PE:EtOAc= Purified by passing through a 0:1 column), the target product 4 (3g) was obtained.
화합물 4(3g, 8.873mmol)를 5mL의 피리딘에 용해시키고, 질소 보호 하에 0℃에서 DMTrCl(3.91g, 11.535mmol)의 피리딘 용액 10mL를 천천히 드롭방식으로 첨가하였다. 드롭방식으로 첨가 완료 후, 반응 온도를 25℃로 올리고 1시간 동안 계속 반응시켰다. 반응액에 50mL의 물과 100mL의 에틸 아세테이트를 첨가하여 추출하였다. 수상을 100mL의 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 유기상을 합하여 건조시키고, 여과 농축한 후 순상 컬럼(PE:EtOAc=2:1 사용)으로 정제하였다. 목표 생성물 5(4g)를 얻었다.Compound 4 (3 g, 8.873 mmol) was dissolved in 5 mL of pyridine, and 10 mL of a pyridine solution of DMTrCl (3.91 g, 11.535 mmol) was slowly added dropwise at 0°C under nitrogen protection. After completion of addition by drop method, the reaction temperature was raised to 25°C and the reaction was continued for 1 hour. The reaction solution was extracted by adding 50 mL of water and 100 mL of ethyl acetate. The aqueous phase was extracted three times with 100 mL of ethyl acetate, and the organic phases were combined, dried, filtered, concentrated, and purified by a normal phase column (using PE:EtOAc=2:1). The target product 5 (4g) was obtained.
화합물 5(4g, 5.769mmol)를 메탄올(10mL)에 용해시키고, 포화 NH3 메탄올 용액(40mL)을 첨가하고, 0℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응액을 회전 건조시킨 후 순상 컬럼(PE:EtOAc=0:1 사용)으로 정제하여, 라세미 화합물 2.4g을 얻었고, SFC로 분리하여 목표 생성물 6A(750mg, 순도 100%)와 목표 생성물 6B(400mg, 순도 99.16%)를 얻었다.Compound 5 (4g, 5.769mmol) was dissolved in methanol (10mL), saturated NH3 methanol solution (40mL) was added, and reaction was performed at 0°C for 6 hours. The reaction solution was spin-dried and purified using a normal phase column (using PE:EtOAc=0:1) to obtain 2.4 g of the racemic compound, which was separated by SFC to produce target product 6A (750 mg, purity 100%) and target product 6B ( 400 mg, purity 99.16%) was obtained.
화합물 6A(-)(700mg, 1.40mmol), 테트라졸(50mg, 0.70mmol), 1-메틸이미다졸(23mg, 0.28mmol), 3A 분자체(500mg)를 10mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 화합물 7(630mg, 2.10mmol)을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 분자체를 여과해 버리고, DCM(50mL)를 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(10mL*3)으로 세척한 후, 포화 식염수(20mL)로 세척하고, 여과액을 회전 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후1-7a(700mg, 72%)를 얻었다. MS m/z: C38H47N4O7PNa[M+Na]+, 이론: 725.32, 실측: 725.5.Compound 6A(-) (700 mg, 1.40 mmol), tetrazole (50 mg, 0.70 mmol), 1-methylimidazole (23 mg, 0.28 mmol), and 3A molecular sieve (500 mg) were dissolved in 10 mL of acetonitrile and incubated at room temperature. Compound 7 (630 mg, 2.10 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the molecular sieve was filtered out, DCM (50 mL) was added, washed with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (10 mL*3), then washed with saturated saline solution (20 mL), and the filtrate was spin-dried. After reverse-phase preparative HPLC (C18, conditions: 5~100% (A: water, B: CH3 CN), flow rate: 70 mL/min),1-7a (700 mg, 72%) was obtained after lyophilization. MS m/z: C38H47N4O7PNa[M+Na]+, theory: 725.32, actual: 725.5.
1.4 화합물 1-8a의 합성1.4 Synthesis of Compound 1-8a
화합물 1(8.5g, 76.508mmol) 및 화합물 2(30.64g, 91.809mmol)를 DMF(150mL)에 용해시키고, CS2CO3(29.91g, 91.809mmol)을 첨가하고, 질소 보호 하에 90℃에서 12시간 동안 반응시켰다. LCMS로 반응이 완료되었음을 검출하였다. 반응액을 여과하고 오일펌프로 회전 건조시킨 후, 순상 컬럼(80g, DCM/MeOH=10/1 내지 5/1)으로 분리 정제하여 목표 생성물 3(13.5g, 순도 80%)을 얻었다.Compound 1 (8.5g, 76.508mmol) and Compound 2 (30.64g, 91.809mmol) were dissolved in DMF (150mL), CS2CO3 (29.91g, 91.809mmol) was added, and reacted at 90°C for 12 hours under nitrogen protection. I ordered it. LCMS detected that the reaction was complete. The reaction solution was filtered, rotary dried with an oil pump, and then separated and purified using a normal phase column (80 g, DCM/MeOH=10/1 to 5/1) to obtain target product 3 (13.5 g, purity 80%).
화합물 3(10.5g, 35.105mmol)을 피리딘(65mL) 및 CH3CN(65mL)에 용해시키고, 용액에 BzCl(4.894mL, 42.126mmol)를 드롭방식으로 첨가하고, 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. LCMS로 대부분의 원료 반응이 완료되었음을 검출하고, H2O(100mL)를 첨가하여 ??칭하고, EtOAc(100mL×3)로 추출하고, 건조시키고 회전 건조시키고, 컬럼으로 분리(TJN200872-101을 합함)하고 정제(80g, PE/EtOAc=10/1 내지 0/1, DCM/MeOH=10/1)하여 목표 생성물4(14g, 순도 90%)를 얻었다.Compound 3 (10.5 g, 35.105 mmol) was dissolved in pyridine (65 mL) and CH3 CN (65 mL), and BzCl (4.894 mL, 42.126 mmol) was added dropwise to the solution and reacted at 25°C for 2 hours. . LCMS detected that most of the raw material reaction was completed, quenched by adding H2 O (100 mL), extracted with EtOAc (100 mL × 3), dried, spin-dried, and separated by column (TJN200872-101 combined) ) and purified (80g, PE/EtOAc=10/1 to 0/1, DCM/MeOH=10/1) to obtain the target product4 (14g, purity 90%).
화합물 4(14g, 36.694mmol)를 HOAc(56mL, 314.796mmol) 및 H2O(14mL)에 용해시키고, 60℃에서 2시간 동안 반응시키고, LCMS로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 오일펌프로 농축하고, 순상 컬럼(40g, DCM/MeOH=1/0 내지 5/1)으로 분리하여, 목표 생성물5(8.4g, 순도 90% & 2.4g, 순도 80%)를 얻었다.Compound 4 (14g, 36.694mmol) was dissolved in HOAc (56mL, 314.796mmol) and H2 O (14mL), reacted at 60°C for 2 hours, and LCMS showed that the reaction was complete. Concentrated with an oil pump and separated with a normal phase column (40g, DCM/MeOH=1/0 to 5/1) to obtain target product5 (8.4g, 90% purity & 2.4g, 80% purity).
화합물 5(7.4g, 21.957mmol), DMAP(0.54g, 4.391mmol), MOLECULAR SIEVE 4A(11.1g, 2.967mmol)를 피리딘(60mL)에 용해시키고, 빙수욕에서 10분 동안 교반한 다음, DMTrCl(8.93g, 26.348mmol)를 첨가하고, 1.8시간 동안 교반하면서 반응시켰다. LCMS로 약 19%의 원료 잔여물과 약 60%의 목표 MS를 검출하였다. (TJN200872-105&106)을 합하여 함께 정제하였다. 반응액에 H2O(50mL)를 첨가하고, DCM(50mL×3)으로 추출하고, 건조, 회전 건조시킨 후, 컬럼(120g, PE/(EA:DCM:TEA=1:1:0.05)=1/0 내지 0/1 내지 DCM/MeOH=10/1)으로 분리하여 목표 화합물 6(11g, 순도 89%, TJN200872-105&106&107)을 얻었고, 원료(3.0g, 순도 70%)를 회수하였다.Compound 5 (7.4 g, 21.957 mmol), DMAP (0.54 g, 4.391 mmol), and MOLECULAR SIEVE 4A (11.1 g, 2.967 mmol) were dissolved in pyridine (60 mL), stirred in an ice water bath for 10 minutes, and then dissolved in DMTrCl ( 8.93g, 26.348mmol) was added and reacted with stirring for 1.8 hours. About 19% of raw material residue and about 60% of target MS were detected by LCMS. (TJN200872-105&106) were combined and purified together. H2 O (50 mL) was added to the reaction solution, extracted with DCM (50 mL × 3), dried, spin-dried, and column (120 g, PE/(EA:DCM:TEA=1:1:0.05)= 1/0 to 0/1 to DCM/MeOH=10/1) to obtain the target compound 6 (11 g, purity 89%, TJN200872-105&106&107), and the raw material (3.0 g, purity 70%) was recovered.
화합물 6(15g, 22.041mmol)을 SFC(DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*50mm, 10um); 0.1% NH3H2O EtOH, B: 45%~45%; 200ml/분)로 분리하여 목표 생성물 6A(5.33g, 순도 94.29%), 목표 생성물 6B(6.14g, 순도 97.91%)를 얻었고, 1.0g의 화합물 6을 회수하였다.Compound 6 (15g, 22.041mmol) was separated by SFC (DAICEL CHIRALPAK AD (250mm*50mm, 10um); 0.1% NH3 H2 O EtOH, B: 45%~45%; 200ml/min) to produce target product 6A ( 5.33g, purity 94.29%), target product 6B (6.14g, purity 97.91%) was obtained, and 1.0g of compound 6 was recovered.
화합물 6B(-)(5.4g, 8.92mmol), 테트라졸(312mg, 4.46mmol), 1-메틸이미다졸(146mg, 1.78mmol), 3A 분자체(500mg)를 40mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 화합물 7(4g, 13.4mmol)을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 분자체를 여과해 버리고, DCM(200mL)를 첨가하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(30mL*3)으로 세척한 후, 포화 식염수(50mL)로 세척하고, 여과액을 회전 건조시킨 후, 역상 분취용 HPLC(C18, 조건: 5~100%(A: 물, B: CH3CN), 유속: 70mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후1-8a(5.8g, 80%)를 얻었다. MS m/z: C45H51N5O7P, [M+H]+, 이론: 804.36, 실측: 804.4.Compound 6B(-) (5.4g, 8.92mmol), tetrazole (312mg, 4.46mmol), 1-methylimidazole (146mg, 1.78mmol), and 3A molecular sieve (500mg) were dissolved in 40mL of acetonitrile, Compound 7 (4 g, 13.4 mmol) was added at room temperature and stirred for 2 hours at room temperature. After completion of the reaction, the molecular sieve was filtered out, DCM (200mL) was added, washed with saturated aqueous sodium bicarbonate solution (30mL*3), washed with saturated saline solution (50mL), and the filtrate was spin-dried. , reverse-phase preparative HPLC (C18, conditions: 5~100% (A: water, B: CH3 CN), flow rate: 70mL/min), freeze-dried, and then1-8a (5.8g, 80%). got it MS m/z: C45H51N5O7P, [M+H]+, theory: 804.36, actual: 804.4.
실시예 2: siRNA의 합성Example 2: Synthesis of siRNA
dsRNA의 합성은 통상적인 포스포라미다이트 고체상 합성법과 다른 점이 없으며, AS 가닥 5'의 7번째 위치가 변형된 뉴클레오티드를 합성할 때, 상술한 합성된 포스포라미다이트 단량체를 사용하여 모 서열의 원래 뉴클레오티드를 대체하였다. 합성 과정을 간략하게 설명하면 다음과 같다: Dr. Oligo48 합성기(Biolytic)에서 Universal CPG 담체를 시작으로, 합성 절차에 따라 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 하나씩 연결하였다. 상술 설병된 AS 가닥 5'의 7번째 위치의 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체를 제외하고, 나머지 뉴클레오시드 단량체 원료인 2'-F RNA, 2'-O-메틸 RNA 등 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체는 Hongene Biotech Corporation 또는 GenePharma로부터 구매하였다. 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)을 활성화제(0.6M 아세토니트릴 용액)로 사용하고, 0.22M의 PADS를 부피 비율이 1:1인 아세토니트릴과 트리메틸피리딘(Suzhou Croma) 용액에 용해시켜 황화제로 사용하고, 요오도피리딘/물 용액(Croma)을 산화제로 사용하였다.The synthesis of dsRNA is no different from the conventional phosphoramidite solid-phase synthesis method, and when synthesizing a nucleotide with a modified 7th position of the AS strand 5', the synthesized phosphoramidite monomer described above is used to restore the original sequence of the parent sequence. Nucleotides were replaced. The synthesis process is briefly described as follows: Dr. Starting with the Universal CPG carrier in an Oligo48 synthesizer (Biolytic), nucleoside phosphoramidite monomers were linked one by one according to the synthesis procedure. Excluding the nucleoside phosphoramidite monomer at the 7th position of the AS strand 5' described above, the remaining nucleoside monomer raw materials are nucleoside phosphoras such as 2'-F RNA and 2'-O-methyl RNA. Midite monomer was purchased from Hongene Biotech Corporation or GenePharma. 5-Ethylthio-1H-tetrazole (ETT) was used as an activator (0.6M acetonitrile solution), and 0.22M PADS was dissolved in acetonitrile and trimethylpyridine (Suzhou Croma) solution at a volume ratio of 1:1. was used as a sulfurizing agent, and iodopyridine/water solution (Croma) was used as an oxidizing agent.
고체상 합성 완료 후, 올리고리보뉴클레오티드는 50℃에서 16시간 동안 28% 암모니아와 에탄올의 3:1 용액에 담구어 해당 고체 지지체에서 분리하였다. 그 다음 원심분리하여, 상청액을 다른 원심분리 튜브로 옮기고 농축하고 증발하여 건조시킨 다음, C18 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하고 이동상은 0.1M TEAA 및 아세토니트릴이며, 3%의 트리플루오로아세트산 용액을 사용하여 DMTr을 제거하였다. 목표 올리고뉴클레오티드를 수집한 후 동결건조시키고, LC-MS에 의해 목표 생성물임을 식별한 후, UV(260nm)로 정량화하였다.After completion of solid-phase synthesis, oligoribonucleotides were separated from the corresponding solid support by immersing them in a 3:1 solution of 28% ammonia and ethanol for 16 hours at 50°C. Then centrifuged, the supernatant was transferred to another centrifuge tube, concentrated, evaporated to dryness, and purified using C18 reverse phase chromatography, the mobile phase was 0.1M TEAA and acetonitrile, and 3% trifluoroacetic acid solution. DMTr was removed using The target oligonucleotide was collected, lyophilized, identified as the target product by LC-MS, and quantified by UV (260 nm).
얻어진 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 등몰비를 기준으로 상보적인 쌍을 이루고, 어닐링되었으며, 최종적으로 얻어진 이중 가닥 dsRNA를 1×PBS에 용해시키고, 실험에 필요한 농도로 조정하여 사용을 위해 보관하였다.The obtained single-stranded oligonucleotides formed a complementary pair based on an equimolar ratio, were annealed, and the finally obtained double-stranded dsRNA was dissolved in 1×PBS, adjusted to the concentration required for the experiment, and stored for use.
실시예 3: psiCHECK 활성 스크리닝 실험Example 3: psiCHECK activity screening experiment
dsRNA 샘플 합성은 전술한 바를 참조하며, 플라스미드는 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.로부터 유래하였다. psiCHECK 실험용 소모품은 표 1에 나타난 바와 같다.dsRNA sample synthesis was described above, and the plasmid was from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Consumables for psiCHECK experiments are shown in Table 1.
표 1. psiCHECK 실험용 소모품 및 시약Table 1. psiCHECK lab supplies and reagents
실험 단계: 세포 플레이팅, 세포 형질감염, 여기서, 형질감염 복합체의 구체적인 배합량은 표 2에 나타난 바와 같다.Experimental steps: cell plating, cell transfection, where the specific mixing amount of the transfection complex is as shown in Table 2.
표 2. 96웰 플레이트의 웰당 필요한 형질감염 복합체의 용량Table 2. Volume of transfection complex required per well of 96-well plate.
비고: Lipo: 0.2μL/웰; 플라스미드: 0.05μL/웰; Opti-MEM: 10μL/웰.Remarks: Lipo: 0.2μL/well; Plasmid: 0.05 μL/well; Opti-MEM: 10 μL/well.
표 3에 따르면, 상이한 실험 요구에 따라 상이한 농도로 희석하여 작업 용액으로 준비하고, 즉석에서 배합하여 사용하였다. 형질감염 24시간 후, Dual-Glo® Luciferase Assay System 검출 키트의 실험 프로토콜에 따라 검출하였다. 상대값 Ratio=Ren/Fir(레닐라/반딧불 비율)을 계산하고; 억제율 1-(Ratio+dsRNA/리포터 유전자만)*100%=억제율(%)을 계산하며; 본 개시에서, 잔여 활성%(mRNA의 잔여 발현량% 또는 mRNA 잔여 발현 비율이라고도 함)=100%-억제율(%)이다.According to Table 3, the working solutions were prepared by diluting them to different concentrations according to different experimental needs, and were immediately mixed and used. 24 hours after transfection, detection was performed according to the experimental protocol of the Dual-Glo® Luciferase Assay System detection kit. Calculate the relative value Ratio=Ren/Fir (Renilla/firefly ratio); Inhibition rate 1-(Ratio+dsRNA/reporter gene only)*100%=Calculate the inhibition rate (%); In the present disclosure, % residual activity (also referred to as % residual expression amount of mRNA or residual expression ratio of mRNA)=100%-inhibition rate (%).
표 3. 다중 농도점 dsRNA 희석 방안Table 3. Multi-concentration point dsRNA dilution scheme.
실시예 4: 상이한 화학적 변형의 특성화Example 4: Characterization of different chemical modifications
여기서, 우리는 2-히드록시메틸-1,3-프로판디올을 출발 물질로 하여 합성된 뉴클레오티드를 hmpNA로 정의하며;Here, we define the nucleotide synthesized from 2-hydroxymethyl-1,3-propanediol as the starting material as hmpNA;
(+)hmpNA(A)는 실시예 1.1 섹션에서 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-1b의 고체상 합성에 의해 얻어지며, 절대 배열은 (S)-hmpNA(A)이며;(+)hmpNA(A) is obtained by solid-phase synthesis of nucleoside phosphoramidite monomer 1-1b in section Example 1.1, the absolute configuration is (S )-hmpNA(A);
(-)hmpNA(A)는 실시예 1.1 섹션에서 뉴클레오시드 포스포라미다이트 단량체 1-1a의 고체상 합성에 의해 얻어지며, 절대 배열은 (R)-hmpNA(A)이며;(-)hmpNA(A) is obtained by solid-phase synthesis of nucleoside phosphoramidite monomer 1-1a in section Example 1.1, the absolute configuration is (R )-hmpNA(A);
마찬가지로, hmpNA의 염기 종류를 대체하고, 고체상 합성에 의해 이하 구조를 얻었으며, 절대 배열을 확인한다:Similarly, the base types of hmpNA were replaced, the following structure was obtained by solid-phase synthesis, and the absolute configuration was confirmed:
(+)hmpNA(G), 절대 배열은 (S)-hmpNA(G)이며;(+)hmpNA(G), absolute configuration is (S )-hmpNA(G);
(-)hmpNA(G), 절대 배열은 (R)-hmpNA(G)이며;(-)hmpNA(G), absolute configuration is (R )-hmpNA(G);
(+)hmpNA(C), 절대 배열은 (S)-hmpNA(C)이며;(+)hmpNA(C), absolute configuration is (S )-hmpNA(C);
(-)hmpNA(C), 절대 배열은 (R)-hmpNA(C)이며;(-)hmpNA(C), absolute configuration is (R )-hmpNA(C);
(+)hmpNA(U), 절대 배열은 (R)-hmpNA(U)이며;(+)hmpNA(U), absolute configuration is (R )-hmpNA(U);
(-)hmpNA(U), 절대 배열은 (S)-hmpNA(U)이다.(-)hmpNA(U), absolute sequence is (S )-hmpNA(U).
(S)-hmpNA(G), (R)-hmpNA(G), (S)-hmpNA(C), (R)-hmpNA(C), (S)-hmpNA(U) 및 (R)-hmpNA (U)의 절대 배열은 이의 중간체 또는 유도체가 X선 회절을 통해 확인하였다.(S )-hmpNA(G), (R )-hmpNA(G), (S )-hmpNA(C), (R )-hmpNA(C), (S )-hmpNA(U), and (R )-hmpNA The absolute configuration of (U) was confirmed through X-ray diffraction of its intermediate or derivative.
중간체 또는 유도체의 구조는 다음과 같다:The structure of the intermediate or derivative is as follows:
TJ-NA067: 검출 결과, 결정은 무색 블록 형상(0.30×0.10×0.04mm3)이고, 단사정계 P21 공간군에 속한다. 단위정 파라미터 a = 16.0496(5)Å, b = 4.86260(10)Å, c = 16.4686(5)Å,α = 90°, β = 118.015(4)°,γ = 90°, V = 1134.65(7)Å3, Z = 4. 계산 밀도 Dc = 1.389g/cm3, 단위정의 전자 수F(000) = 504.0, 단위정의 선형 흡수 계수μ(Cu Kα) = 0.840mm-1, 회절 실험 온도 T = 150.00(11)K.TJ-NA067: As a result of detection, the crystal has a colorless block shape (0.30 × 0.10 × 0.04 mm3 ) and belongs to the monoclinic P21 space group. Unitary parameters a = 16.0496(5)Å, b = 4.86260(10)Å, c = 16.4686(5)Å,α = 90°, β= 118.015(4)°,γ = 90°, V = 1134.65(7) )Å3, Z = 4. Calculated density Dc = 1.389g/cm3 , unit-defined number of electronsF (000) = 504.0, unit-defined linear absorption coefficientμ (Cu Kα) = 0.840mm-1, diffraction experiment temperature T = 150.00 (11)K.
6A(+): 검출 결과, 결정은 무색 블록 형상(0.30×0.20×0.10mm3)이고, 단사정계 P21 공간군에 속한다. 단위정 파라미터 a = 22.6688(7)Å, b = 8.5595(2)Å, c = 23.3578(5)Å,α = 90°, β = 113.876(3)°,γ = 90°, V = 4144.3(2)Å3, Z = 2. 계산 밀도 Dc = 0.999g/cm3, 단위정의 전자 수F(000) = 1318.0, 단위정의 선형 흡수 계수μ(Cu Kα) = 0.570mm-1, 회절 실험 온도 T = 100.01(18)K.6A(+): As a result of detection, the crystal has a colorless block shape (0.30 × 0.20 × 0.10 mm3 ) and belongs to the monoclinic P21 space group. Unitary parameters a = 22.6688(7)Å, b = 8.5595(2)Å, c = 23.3578(5)Å,α = 90°, β= 113.876(3)°,γ = 90°, V = 4144.3(2) )Å3, Z = 2. Calculated density Dc = 0.999g/cm3 , unit-defined number of electronsF (000) = 1318.0, unit-defined linear absorption coefficientμ (Cu Kα) = 0.570mm-1, diffraction experiment temperature T = 100.01 (18)K.
TJ-NA048:검출 결과, 결정은 무색 바늘 형상(0.30×0.04×0.04mm3)이고, 단사정계 P1 공간군에 속한다. 단위정 파라미터 a = 7.6165(4)Å, b = 11.3423(5)Å, c = 17.3991(8)Å,α = 85.007(4)°, β = 88.052(4)°,γ = 70.532(4)°, V = 1411.75(12)Å3, Z = 2. 계산 밀도 Dc = 1.366g/cm3, 단위정의 전자 수F(000) = 620.0, 단위정의 선형 흡수 계수μ(Cu Kα) = 0.856mm-1, 회절 실험 온도 T = 150.00(13)K.TJ-NA048: As a result of detection, the crystal has a colorless needle shape (0.30 × 0.04 × 0.04 mm3) and belongs to the monoclinic P1 space group. Unit definition parameters a = 7.6165(4)Å, b = 11.3423(5)Å, c = 17.3991(8)Å,α = 85.007(4)°, β = 88.052(4)°,γ = 70.532(4)° , V = 1411.75(12)Å3, Z = 2. Calculated density Dc = 1.366g/cm3, unit-defined number of electronsF (000) = 620.0, unit-defined linear absorption coefficientμ (Cu Kα) = 0.856mm-1, diffraction Experimental temperature T = 150.00(13)K.
TJ-NA092: 검출 결과, 결정은 무색 프리즘 형상(0.30×0.10×0.10mm3)이고, 삼사정계 P1 공간군에 속한다. 단위정 파라미터 a = 5.17960(10)Å, b = 8.0667(2)Å, c = 12.4077(2)Å,α = 93.146(2)°, β = 101.266(2)°,γ = 96.134(2)°, V = 503.993(18)Å3, Z = 2. 계산 밀도 Dc = 1.412g/cm3, 단위정의 전자 수F(000) = 228.0, 단위정의 선형 흡수 계수μ(Cu Kα) = 0.945mm-1, 회절 실험 온도 T = 100.00(10)K.TJ-NA092: As a result of detection, the crystal has a colorless prism shape (0.30 × 0.10 × 0.10 mm3) and belongs to the triclinic P1 space group. Unit definition parameters a = 5.17960(10)Å, b = 8.0667(2)Å, c = 12.4077(2)Å,α = 93.146(2)°, β = 101.266(2)°,γ = 96.134(2)° , V = 503.993(18)Å3, Z = 2. Calculated density Dc = 1.412g/cm3, number of electronsF (000) = 228.0, linear absorption coefficientμ (Cu Kα) = 0.945mm-1, diffraction Experimental temperature T = 100.00(10)K.
실시예 5: 상이한 화학적 변형을 포함하는 siRNA의 서열 의존성 실험Example 5: Sequence dependence experiments of siRNA containing different chemical modifications
Abasic 변형이 dsRNA 서열 의존성을 갖는 것을 알고 있으므로, 발명자는 여러 개의 상이한 서열에서 본 개시의 화학적 변형을 시험하였다. 세 개의 상이한 유전자의 (ANGPTL3, HBV-S, HBV-X) mRNA를 표적으로 하는 siRNA(서열은 표 4에 나타난 바와 같음)를 사용하였으며, 실시예 1의 화합물(+)hmpNA(A),(-)hmpNA(A) 및 대조군인 GNA(A) 화합물을 사용하여 AS 가닥의 5' 단 7번째 위치(서열은 표 5에 나타난 바와 같음)를 변형시킨 다음, 모 서열과 온-표적 활성 및 오프-표적 활성을 비교하였다.Knowing that Abasic modifications are dsRNA sequence dependent, the inventors tested the chemical modifications of the present disclosure on several different sequences. siRNAs (sequences as shown in Table 4) targeting the (ANGPTL3, HBV-S, HBV-X) mRNA of three different genes were used, and the compounds of Example 1(+)hmpNA(A) ,( -)hmpNA (A) and control GNA(A) compounds were used to modify the 5' only 7th position of the AS strand (sequences are as shown in Table 5), and then combined with the parent sequence for on-target activity and off-target activity. -Target activity was compared.
표 4. 상이한 유전자를 표적으로 하는 siRNA 서열Table 4. siRNA sequences targeting different genes.
위의 표에서 대문자 G, A, C, U는 각각 구아닌, 아데닌, 시토신 및 우라실을 포함하는 뉴클레오티드를 나타내고, 소문자 m은 2'-메톡시 변형을 나타내고, 소문자 f는 2'-플루오로 변형을 나타내며, 소문자 s는 해당 문자 s의 왼쪽과 오른쪽에 인접한 두 개의 뉴클레오티드 사이가 포스포로티오에이트 디에스테르에 의해 연결되어 있음을 나타내며; 이하 모두 이와 동일하다.In the table above, the uppercase letters G, A, C, and U represent nucleotides containing guanine, adenine, cytosine, and uracil, respectively, the lowercase letter m represents the 2'-methoxy modification, and the lowercase letter f represents the 2'-fluoro modification. The lowercase letter s indicates that the two adjacent nucleotides to the left and right of the letter s are linked by a phosphorothioate diester; Everything below is the same.
표 5. 상이한 유전자를 표적으로 하는 화학적 변형을 포함하는 siRNA 서열Table 5. siRNA sequences containing chemical modifications targeting different genes.
온-표적 활성의 실험 결과는 표 6를 참조하면, GNA(A)는 유의한 서열 의존성을 나타내며, 상이한 서열의 온-표적 활성은 유의한 차이가 있는 것으로 나타났다. 본 개시의 실험 화합물은 유의한 서열 의존성을 나타내지 않았으며, 일반적 적용성이 더 강하였다.Referring to Table 6 for the experimental results of on-target activity, GNA(A) shows significant sequence dependence, and the on-target activity of different sequences appears to be significantly different. The experimental compounds of the present disclosure did not show significant sequence dependence and had stronger general applicability.
오프-표적 활성의 실험 결과는 표 7을 참조하며, 본 개시의 실험 화합물은 모 서열에 비해 siRNA의 오프-표적 활성을 유의하게 감소시키는 것을 알 수 있다.Refer to Table 7 for the experimental results of off-target activity, and it can be seen that the experimental compound of the present disclosure significantly reduces the off-target activity of siRNA compared to the parent sequence.
표 6. 상이한 표적 서열에 대한 siRNA의 온-표적 활성 결과Table 6. Results of on-target activity of siRNA against different target sequences.
표 7. 상이한 표적 서열에 대한 siRNA의 오프-표적 활성 결과Table 7. Off-target activity results of siRNAs against different target sequences.
실시예 6: 리간드의 제조(NAG0052, L96)Example 6: Preparation of Ligand (NAG0052, L96)
화합물 NAG0024 및 NAG0026은 Tianjin Wuxi Apptec Co., Ltd.로부터 구입하였다. 특별히 설명하지 않는 한, 이하 실시예에 사용되는 시약은 모두 시판되는 제품이다.Compounds NAG0024 and NAG0026 were purchased from Tianjin Wuxi Apptec Co., Ltd. Unless otherwise specified, all reagents used in the examples below are commercially available products.
화합물 NAG0052의 합성Synthesis of compound NAG0052
출발 물질 화합물 1은 Jiangsu Beida Pharmaceutical Technology Co., Ltd.로부터 구입하였다.Starting material Compound 1 was purchased from Jiangsu Beida Pharmaceutical Technology Co., Ltd.
화합물 2compound 2
0℃, 질소 보호 하에, 화합물1(12.3mL, 101mmol)의 THF(300mL) 용액에 NaH(12.2g, 304mmol, 순도 60%)를 배치로 첨가하였다. 해당 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반한 후, 다시 0℃로 냉각시키고, 이어서 시스템에 벤질 브로마이드(36.3mL, 304mmol)를 드롭방식으로 첨가하고, 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 해당 반응액을 H2O(100mL)로 ??칭한 다음, EtOAc(200mL×2)로 추출하였다. 합한 유기상을 포화 식염수(100mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축하여 얻어진 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 목표 화합물2(20.0g, 51.8mmol, 수율 51%)를 얻었다.NaH (12.2 g, 304 mmol, 60% purity) was added in batches to a solution of Compound1 (12.3 mL, 101 mmol) in THF (300 mL) at 0°C, under nitrogen protection. The mixture was stirred at 20°C for 1 hour, cooled again to 0°C, and then benzyl bromide (36.3 mL, 304 mmol) was added dropwise to the system and stirred at 20°C for 12 hours. The reaction solution was quenched with H2 O (100 mL) and then extracted with EtOAc (200 mL x 2). The combined organic phases were washed with saturated saline solution (100 mL), dried over Na2 SO4 , filtered, and concentrated. The resulting residue was separated by silica gel column chromatography to obtain target compound2 (20.0 g, 51.8 mmol, yield 51%). got it
LCMS: tR = 2.615 and 2.820 min in 30-90AB_7 min_220&254_Shimadzu.lcm (Xtimate C18, 3um, 2.1*30mm), MS (ESI) m/z = 351.2 [M+Na]+.LCMS: tR = 2.615 and 2.820 min in 30-90AB_7 min_220&254_Shimadzu.lcm (Xtimate C18, 3um, 2.1*30mm), MS (ESI) m/z = 351.2 [M+Na]+ .
1H NMR:(400 MHz, CDCl3)δppm 7.35-7.12 (m, 10H), 5.06-4.95 (m, 1H), 4.51-4.39 (m, 4H), 4.24-3.87 (m, 2H), 3.50-3.40 (m, 2H), 3.38-3.20 (m, 3H), 2.20-1.91 (m, 2H).1H NMR: (400 MHz, CDCl3 )δ ppm 7.35-7.12 (m, 10H), 5.06-4.95 (m, 1H), 4.51-4.39 (m, 4H), 4.24-3.87 (m, 2H), 3.50 -3.40 (m, 2H), 3.38-3.20 (m, 3H), 2.20-1.91 (m, 2H).
화합물 3 및 화합물 4Compound 3 and Compound 4
20℃, 질소 보호 하에, 화합물2(13.0g, 33.6mmol)의 DCM(300mL) 용액에 TMSCN(13.5mL, 101mmol)을 한번에 첨가하고, 이어서 TMSOTf(9.14mL, 50.5mmol)의 DCM(30mL) 용액을 드롭방식으로 첨가하였다. 해당 반응액을 20℃에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 포화 NaHCO3 수용액(80mL)으로 해당 시스템을 ??칭하고, DCM(150mL×2)로 추출하고, 합한 후의 유기상을 포화 식염수(80mL)로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과 및 농축한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 목표 화합물3(3.30g, 9.18mmol, 수율 27%) 및 담황색 오일 형태의 액체 화합물4(8.50g, 9.18mmol, 수율 70%)를 얻었다.At 20°C, under nitrogen protection, TMSCN (13.5 mL, 101 mmol) was added in one portion to a DCM (300 mL) solution of Compound2 (13.0 g, 33.6 mmol), followed by a DCM (30 mL) solution of TMSOTf (9.14 mL, 50.5 mmol). was added by drop method. The reaction solution was stirred at 20°C for 15 hours. After completion of the reaction, the system was quenched with saturated aqueous NaHCO3 solution (80 mL), extracted with DCM (150 mL × 2), and the combined organic phases were washed with saturated saline solution (80 mL), dried over Na2 SO4 and filtered. and concentrated and separated by silica gel column chromatography to obtain target compound3 (3.30 g, 9.18 mmol, yield 27%) and light yellow oil liquid compound4 (8.50 g, 9.18 mmol, yield 70%).
화합물 3Compound 3
1H NMR:(400 MHz, CDCl3)δppm 7.42-7.29 (m, 10H), 4.81 (t,J =7.8 Hz, 1H), 4.65-4.49 (m, 4H), 4.30-4.21 (m, 2H), 3.65-3.57 (m, 1H), 3.57-3.49 (m, 1H), 2.49-2.40 (m, 2H).1H NMR: (400 MHz, CDCl3 )δ ppm 7.42-7.29 (m, 10H), 4.81 (t,J = 7.8 Hz, 1H), 4.65-4.49 (m, 4H), 4.30-4.21 (m, 2H) ), 3.65-3.57 (m, 1H), 3.57-3.49 (m, 1H), 2.49-2.40 (m, 2H).
화합물 4Compound 4
1H NMR:(400 MHz, CDCl3)δppm 7.42-7.26 (m, 10H), 4.93-4.87 (m, 1H), 4.65-4.48 (m, 4H), 4.43-4.38 (m, 1H), 4.21-4.17 (m, 1H), 3.79-3.70 (m, 1H), 3.54 (d,J =4.0 Hz, 1H), 2.45-2.37 (m, 2H).1H NMR: (400 MHz, CDCl3 )δ ppm 7.42- 7.26 (m, 10H), 4.93- 4.87 (m, 1H), 4.65- 4.48 (m, 4H), 4.43- 4.38 (m, 1H), 4.21- 4.17 (m, 1H), 3.79- 3.70 (m, 1H), 3.54 (d,J = 4.0 Hz, 1H), 2.45- 2.37 (m, 2H).
화합물 5Compound 5
0℃, 질소 보호 하에, 화합물4(3.00g, 9.28mmol)의 THF(15mL) 용액을 LiAlH4(0.79g, 20.9mmol)의 THF(15mL) 용액에 드롭방식으로 첨가하고. 드롭방식으로 첨가한 후 시스템을 0℃에서 1시간 동안 반응시켰다. TLC(PE:EtOAc=3:1)로 원료가 완전히 사라졌음을 모니터링하였다. 반응액에 거품이 나타나지 않을 때까지 황산나트륨 십수화물을 천천히 첨가하였다. 그 다음, 반응액을 여과하고 필터 케이크를 디클로로메탄(60mL)으로 3회 세척한 다음, 여과액을 수집하여 회전 건조시켜 목표 화합물5(3.00g, 수율 90%)를 얻었다At 0°C, under nitrogen protection, a THF (15 mL) solution of compound4 (3.00 g, 9.28 mmol) was added dropwise to a THF (15 mL) solution of LiAlH4 (0.79 g, 20.9 mmol). After addition by drop method, the system was reacted at 0°C for 1 hour. Complete disappearance of raw materials was monitored by TLC (PE:EtOAc=3:1). Sodium sulfate decahydrate was slowly added until no bubbles appeared in the reaction solution. Next, the reaction solution was filtered, the filter cake was washed with dichloromethane (60 mL) three times, and the filtrate was collected and spin-dried to obtain target compound5 (3.00 g, yield 90%).
1H NMR:(400 MHz, DMSO-d6) δppm 7.40-7.14 (m, 10H), 4.54-4.38 (m, 4H), 4.06-3.99 (m, 2H), 3.91 (q,J = 6.4 Hz, 1H), 3.48-3.37 (m, 2H), 2.67-2.52 (m, 2H), 2.21-2.18 (m, 1H), 1.77-1.73 (m, 1H).1H NMR: (400 MHz, DMSO-d6 )δ ppm 7.40-7.14 (m, 10H), 4.54-4.38 (m, 4H), 4.06-3.99 (m, 2H), 3.91 (q,J = 6.4 Hz) , 1H), 3.48-3.37 (m, 2H), 2.67-2.52 (m, 2H), 2.21-2.18 (m, 1H), 1.77-1.73 (m, 1H).
화합물 6Compound 6
질소 보호 하에, 화합물5(3.00g, 8.25mmol)를 DCM(30mL)에 용해시키고, TEA(3.44mL, 24.7mmol) 및 CbzCl(1.76mL, 12.4mmol)를 첨가하고, 20℃에서 2시간 동안 반응시켰다. LCMS로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응액에 디클로로메탄(30mL) 및 물(60mL)을 첨가하여 추출하였다. 유기상을 물(60mL×3)로 3회 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 농축한 후 순상 컬럼(PE:EtOAc=1:1)으로 정제하여 목표 화합물6(2.5g, 수율 90%)을 얻었다.Under nitrogen protection, compound5 (3.00 g, 8.25 mmol) was dissolved in DCM (30 mL), TEA (3.44 mL, 24.7 mmol) and CbzCl (1.76 mL, 12.4 mmol) were added, and reacted at 20°C for 2 hours. I ordered it. LCMS indicated that the reaction was complete. Dichloromethane (30 mL) and water (60 mL) were added to the reaction solution for extraction. The organic phase was washedthree times with water (60mL .
LCMS:tR = 0.810 min in 5-95AB_1min, MS (ESI) m/z =462.2 [M+H]+.LCMS: tR = 0.810 min in 5-95AB_1min, MS (ESI) m/z =462.2 [M+H]+ .
1H NMR:(400 MHz, CDCl3) δppm 7.39-7.29 (m, 15H), 5.35 (s, 1H), 5.15-5.01 (m, 2H), 4.72 (d,J = 6.0 Hz, 1H), 4.54-4.40 (m, 3H), 4.26 (s, 1H), 4.23-4.18 (m, 1H), 4.11-4.04 (m, 1H), 3.54-3.41 (m, 3H), 3.37-3.25 (m, 1H), 2.34-2.23 (m, 1H), 1.85-1.79 (m, 1H).1H NMR: (400 MHz, CDCl3 )δ ppm 7.39-7.29 (m, 15H), 5.35 (s, 1H), 5.15-5.01 (m, 2H), 4.72 (d,J = 6.0 Hz, 1H), 4.54-4.40 (m, 3H), 4.26 (s, 1H), 4.23-4.18 (m, 1H), 4.11-4.04 (m, 1H), 3.54-3.41 (m, 3H), 3.37-3.25 (m, 1H) ), 2.34-2.23 (m, 1H), 1.85-1.79 (m, 1H).
화합물 7Compound 7
질소 보호 하에, 화합물6(2.00g, 3.90mmol)을 DCM(5mL)에 용해시키고, -78℃에서 BCl3의 THF 용액(1M, 27.3mL)을 첨가하고 1시간 동안 반응시켰다. TLC(DCM:MeOH=10:1)로 원료가 완전히 사라졌음을 모니터링하였다. 반응액에 -78℃에서 메탄올(20mL)을 첨가하여 ??칭하고, 농축한 후 순상 컬럼(DCM:MeOH=10:1)으로 정제하여 목표 화합물7(2.00g, 수율 60%)을 얻었다.Under nitrogen protection, compound6 (2.00 g, 3.90 mmol) was dissolved in DCM (5 mL), and a THF solution of BCl3 (1 M, 27.3 mL) was added at -78°C and reacted for 1 hour. Complete disappearance of the raw material was monitored by TLC (DCM:MeOH=10:1). The reaction solution was quenched by adding methanol (20 mL) at -78°C, concentrated, and purified using a normal phase column (DCM:MeOH=10:1) to obtain target compound7 (2.00 g, yield 60%).
1H NMR:(400 MHz, CD3OD)δppm 7.41-7.23 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.25-4.07 (m, 2H), 3.85-3.75 (m, 1H), 3.63-3.56 (m, 1H), 3.54-3.48 (m, 1H), 3.30-3.27 (m, 2H), 2.34-2.21 (m, 1H), 1.71-1.64 (m, 1H).1H NMR: (400 MHz, CD3 OD)δ ppm 7.41-7.23 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 4.25-4.07 (m, 2H), 3.85-3.75 (m, 1H), 3.63- 3.56 (m, 1H), 3.54-3.48 (m, 1H), 3.30-3.27 (m, 2H), 2.34-2.21 (m, 1H), 1.71-1.64 (m, 1H).
화합물 8compound 8
질소 보호 하에, 화합물 7(0.50g, 1.78mmol)을 피리딘(5mL)에 용해시키고, 0℃에서 4A 분자체(500mg) 및 DMTrCl(0.66mL, 2.13mmol)을 첨가한 후, 온도를 20℃로 올리고 1.5시간 동안 반응시켰다. TLC(PE:EtOAc=2:1)로 원료가 완전히 사라졌음을 모니터링하였다. 반응액에 에틸 아세테이트(60mL) 및 물(60mL)을 첨가하여 추출하고, 유기상을 물(60mL×3)로 3회 세척한 다음, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 농축한 후, 순상 컬럼(PE:EtOAc=1:1)으로 정제하여 목표 화합물8(800mg, 수율 90%)을 얻었다.Under nitrogen protection, compound 7 (0.50 g, 1.78 mmol) was dissolved in pyridine (5 mL), 4A molecular sieve (500 mg) and DMTrCl (0.66 mL, 2.13 mmol) were added at 0 °C, and the temperature was lowered to 20 °C. oligo and reacted for 1.5 hours. Complete disappearance of raw materials was monitored by TLC (PE:EtOAc=2:1). The reaction solution was extracted by adding ethyl acetate (60 mL) and water (60 mL), the organic phase was washed three times with water (60 mL 1:1) to obtain target compound8 (800mg, yield 90%).
1H NMR:(400 MHz, CDCl3)δppm 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.37-7.23 (m, 11H), 7.22-7.15 (m, 1H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.09 (s, 2H), 4.31-4.17 (m, 2H), 4.02-3.91 (m, 1H), 3.84-3.73 (m, 6H), 3.33 (s, 1H), 3.28 (s, 1H), 3.19-3.01 (m, 2H), 2.34-2.25 (m, 1H), 1.70-1.62 (m, 1H).1H NMR: (400 MHz, CDCl3 )δ ppm 7.44 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.37-7.23 (m, 11H), 7.22-7.15 (m, 1H), 6.84 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.09 (s, 2H), 4.31-4.17 (m, 2H), 4.02-3.91 (m, 1H), 3.84-3.73 (m, 6H), 3.33 (s, 1H), 3.28 (s, 1H), 3.19-3.01 (m, 2H), 2.34-2.25 (m, 1H), 1.70-1.62 (m, 1H).
화합물 9Compound 9
화합물 8(800mg, 1.234mmol)을 EtOAc(5mL)에 용해시키고, Pd/C 10%(800mg, 7.517mmol)를 첨가하고, H2 조건(15Psi) 하, 20℃에서 1시간 동안 반응시켰다. LCMS로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응액을 여과하고 필터 케이크를 디클로로메탄(100mL) 및 메탄올(100mL)로 3회 세척하고, 농축하여, 역상 컬럼으로 분리하여 화합물 9(300mg, 54%)를 얻었다.Compound 8 (800 mg, 1.234 mmol) was dissolved in EtOAc (5 mL), Pd/C 10% (800 mg, 7.517 mmol) was added, and reacted at 20°C for 1 hour under H2 conditions (15 Psi). LCMS indicated that the reaction was complete. The reaction solution was filtered, and the filter cake was washed three times with dichloromethane (100 mL) and methanol (100 mL), concentrated, and separated using a reversed-phase column to obtain compound 9 (300 mg, 54%).
LCMS:tR = 2.586 min in 10-80CD_3min MS (ESI) m/z = 450.2 [M+H]+.LCMS: tR = 2.586 min in 10-80CD_3min MS (ESI) m/z = 450.2 [M+H]+ .
화합물 11Compound 11
화합물10(435mg, 1.780mmol)을 DCM(10mL)에 용해시키고, DIEA(0.441mL, 2.67mmol) 및 HATU(677mg, 1.78mmol)를 첨가한 후, 화합물9(400mg, 0.890mmol)를 첨가하고 20℃에서 1시간 동안 반응시켰다. TLC(DCM:MeOH=10:1)로 반응이 완료되었음을 모니터링하였다. 반응액에 디클로로메탄(60mL) 및 물(60mL)을 첨가하여 추출하고, 유기상을 물(60mL×3)로 3회 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 농축하여 순상 컬럼(PE:EtOAc=0:1 컬럼을 거치게 하고, 100%에서 제품 피크가 나타남)으로 정제하여 목표 화합물11(600mg, 수율 90%)을 얻었다.Compound10 (435 mg, 1.780 mmol) was dissolved in DCM (10 mL), DIEA (0.441 mL, 2.67 mmol) and HATU (677 mg, 1.78 mmol) were added, and then compound9 (400 mg, 0.890 mmol) was added and It was reacted at ℃ for 1 hour. The completion of the reaction was monitored by TLC (DCM:MeOH=10:1). The reaction solution was extracted by adding dichloromethane (60 mL) and water (60 mL), and the organic phase was washed three times with water (60 mL×3), dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated, and purified on a normal phase column (PE:EtOAc=0:1). The target compound11 (600 mg, yield 90%) was obtained by purifying the product through a column (product peak appears at 100%).
LCMS:tR = 2.745 min in 30-90CD_3min, MS (ESI) m/z =698.4 [M+Na]+.LCMS: tR = 2.745 min in 30-90CD_3min, MS (ESI) m/z =698.4 [M+Na]+ .
1H NMR:(400 MHz, CD3OD)δppm 7.46-7.38 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.22-7.16 (m, 1H), 6.90-6.78 (m, 4H), 4.29-4.21 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.66-3.62 (m, 3H), 3.41 (s, 1H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.36-2.17 (m, 5H), 1.71-1.50 (m, 5H), 1.39-1.25 (m, 14H).1H NMR: (400 MHz, CD3 OD)δ ppm 7.46-7.38 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.22-7.16 (m, 1H), 6.90-6.78 (m, 4H), 4.29-4.21 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.66-3.62 (m, 3H), 3.41 (s, 1H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.36-2.17 (m, 5H), 1.71-1.50 (m, 5H), 1.39-1.25 (m, 14H).
화합물 12Compound 12
화합물11(600mg, 0.799mmol)을 THF(3mL) 및 H2O(1mL)에 용해시키고, LiOH.H2O(134mg, 3.20mmol)를 첨가하고 20℃에서 12시간 동안 반응시켰다. TLC(DCM:MeOH=10:1)로 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응액을 회전 건조시키고, 물(5mL) 및 메탄올(5mL)로 용해시키고, 역상 컬럼(H2O:CH3CN=1:1, 약 35%에서 피크가 나타남)으로 정제하여, 목표 화합물12(460mg, 수율 100%, 리튬염)를 얻었다.Compound11 (600 mg, 0.799 mmol) was dissolved in THF (3 mL) and H2 O (1 mL), LiOH.H2 O (134 mg, 3.20 mmol) was added and reacted at 20°C for 12 hours. TLC (DCM:MeOH=10:1) showed that the reaction was complete. The reaction solution was spin-dried, dissolved in water (5 mL) and methanol (5 mL), and purified by reverse-phase column (H2 O:CH3 CN=1:1, peak appears at about 35%) to obtain target compound12. (460 mg, 100% yield, lithium salt) was obtained.
LCMS:tR = 1.346 min in 10-80CD_3min, MS (ESI) m/z =684.3 [M+Na]+.LCMS: tR = 1.346 min in 10-80CD_3min, MS (ESI) m/z =684.3 [M+Na]+ .
HPLC:tR = 1.879 min in 10-80CD_6min.HPLC: tR = 1.879 min in 10-80CD_6min.
1H NMR:(400 MHz, CD3OD)δppm 7.47-7.39 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.22-7.15 (m, 1H), 6.91-6.79 (m, 4H), 4.31-4.18 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.44-3.33 (m, 2H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.35-2.27 (m, 1H), 2.24-2.10 (m, 4H), 1.70-1.51 (m, 5H), 1.31-1.23 (m, 12H).1H NMR: (400 MHz, CD3 OD)δ ppm 7.47-7.39 (m, 2H), 7.35-7.24 (m, 6H), 7.22-7.15 (m, 1H), 6.91-6.79 (m, 4H), 4.31-4.18 (m, 2H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.44-3.33 (m, 2H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.35-2.27 (m, 1H) ), 2.24-2.10 (m, 4H), 1.70-1.51 (m, 5H), 1.31-1.23 (m, 12H).
화합물 13Compound 13
실온 환경, 질소 보호 하에, 화합물NAG0024(271mg, 0.151mmol)를 무수 THF(2mL)와 무수 DMF(4mL)에 용해시키고, 3A 분자체를 첨가한 후, 화합물12(100mg, 0.151mmol), HOBt(25mg, 0.181mmol), DCC(38mg, 0.181mmol) 및 DIEA(39mg, 0.302mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 반응액을 45℃에서 16시간 동안 반응시켰다. LC-MS로 반응이 완료되었음을 나타낸 후, 물을 첨가하여 ??칭하고 여과하였다. 여과액을 농축한 후, C18 역상 컬럼(H2O/MeCN)으로 정제하여 화합물13(210mg, 수율: 57%)을 얻었다.Under room temperature environment and nitrogen protection, compoundNAG0024 (271 mg, 0.151 mmol) was dissolved in anhydrous THF (2 mL) and anhydrous DMF (4 mL), and 3A molecular sieve was added, followed by compound12 (100 mg, 0.151 mmol) and HOBt ( 25 mg, 0.181 mmol), DCC (38 mg, 0.181 mmol), and DIEA (39 mg, 0.302 mmol) were added sequentially. The reaction solution was reacted at 45°C for 16 hours. After LC-MS showed that the reaction was complete, water was added, quenched, and filtered. The filtrate was concentrated and purified using a C18 reverse-phase column (H2 O/MeCN) to obtain compound13 (210 mg, yield: 57%).
화합물 NAG0052Compound NAG0052
실온 환경에서, 화합물13(230mg, 0.094mmol)을 피리딘(5mL)에 용해시키고, 분자체를 첨가하고, DMAP(12mg, 0.283mmol) 및 숙신산 무수물(28mg, 0.283mmol)을 첨가하였다. 질소 보호 하에, 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. LCMS로 반응이 완료되었음을 검출하고, 여과하여 회전 건조시켰다. C18 역상 컬럼으로 정제한 후, 분취용 HPLC로 2회 정제하여 목표 화합물 NAG0052(123mg, 0.048mmol, 수율: 51%)를 얻었다.In a room temperature environment, compound13 (230 mg, 0.094 mmol) was dissolved in pyridine (5 mL), molecular sieves were added, and DMAP (12 mg, 0.283 mmol) and succinic anhydride (28 mg, 0.283 mmol) were added. Under nitrogen protection, it was stirred at 50°C for 16 hours. The completion of the reaction was detected by LCMS, filtered, and spin-dried. After purification using a C18 reverse-phase column, the product was purified twice using preparative HPLC to obtain the target compound NAG0052 (123 mg, 0.048 mmol, yield: 51%).
MS(ESI)m/z = 2535.3 [M-1]-. 이론: 2536.2.MS(ESI)m/z = 2535.3 [M-1]- . Theory: 2536.2.
1H NMR (400 MHz, 아세토니트릴-d3) δ 7.48-7.43 (m, 2H), 7.37-7.12 (m, 11H), 7.00-6.85 (m, 10H), 6.66 (s, 1H), 5.31 (dd,J = 3.4, 1.1 Hz, 3H), 5.20-5.13 (m, 1H), 5.05 (dd,J = 11.3, 3.4 Hz, 3H), 4.56 (d,J = 8.5 Hz, 3H), 4.30 (dd,J = 7.7, 5.3 Hz, 1H), 4.18-3.93 (m, 14H), 3.79 (s, 10H), 3.65 (q,J = 4.7, 3.6 Hz, 13H), 3.56-3.07 (m, 24H), 2.56 (s, 6H), 2.37 (t,J = 5.8 Hz, 10H), 2.17 (t,J = 7.5 Hz, 9H), 2.02-1.96 (m, 20H), 1.88 (s, 8H), 1.82-1.73 (m, 2H), 1.60 (dt,J = 15.0, 7.3 Hz, 16H), 1.27 (s, 13H).1 H NMR (400 MHz, acetonitrile-d3 ) δ 7.48-7.43 (m, 2H), 7.37-7.12 (m, 11H), 7.00-6.85 (m, 10H), 6.66 (s, 1H), 5.31 ( dd,J = 3.4, 1.1 Hz, 3H), 5.20-5.13 (m, 1H), 5.05 (dd,J = 11.3, 3.4 Hz, 3H), 4.56 (d,J = 8.5 Hz, 3H), 4.30 (dd ,J = 7.7, 5.3 Hz, 1H), 4.18-3.93 (m, 14H), 3.79 (s, 10H), 3.65 (q,J = 4.7, 3.6 Hz, 13H), 3.56-3.07 (m, 24H), 2.56 (s, 6H), 2.37 (t,J = 5.8 Hz, 10H), 2.17 (t,J = 7.5 Hz, 9H), 2.02-1.96 (m, 20H), 1.88 (s, 8H), 1.82-1.73 (m, 2H), 1.60 (dt,J = 15.0, 7.3 Hz, 16H), 1.27 (s, 13H).
화합물 NAG0052는 고체상 합성에 의해 서열에 연결된 다음, 아미노 분해를 거쳐 NAG0052 구조의 작용기 일부가 제거되어 NAG0052'로 된다.Compound NAG0052 is linked to the sequence by solid-phase synthesis, and then undergoes amino decomposition to remove some of the functional groups in the NAG0052 structure, resulting in NAG0052'.
L96의 합성Synthesis of L96
특허 출원 WO2014025805A1에 기재된 방법에 따라 제조하였다.It was prepared according to the method described in patent application WO2014025805A1.
실시예 7: dsRNA의 합성Example 7: Synthesis of dsRNA
1. 담체가 있는 수지를 직접 제조하기1. Directly manufacture resin with carrier
카르복실산 그룹을 함유한 화합물NAG0052(157mg, 0.062mmol)를 무수 DMF(3mL)에 용해시키고, 기질이 완전히 용해된 후, 무수 아세토니트릴(4mL), DIEA(0.03mL, 0.154mmol, 2.5eq) 및 HBTU(35mg, 0.093mmol, 1.5eq)를 순차적으로 첨가하였다. 반응액을 균일하게 혼합한 후, 큰 구멍의 아민 메틸 수지(476mg, 블랭크 로딩량은 0.41mmol/g이고, 목표 로딩량은 0.1mmol/g임)를 첨가하였다. 반응액을 진탕기(온도: 25℃, 회전 속도: 200rpm)에 놓고 밤새 진탕하였다. 반응액을 여과하고 필터 케이크를 각각 DCM 및 무수 아세토니트릴로 순차적으로 세척하고, 고체를 수집하여 밤새 진공 건조시켰다.The compoundNAG0052 (157 mg, 0.062 mmol) containing a carboxylic acid group was dissolved in anhydrous DMF (3 mL), and after the substrate was completely dissolved, it was added to anhydrous acetonitrile (4 mL) and DIEA (0.03 mL, 0.154 mmol, 2.5 eq). and HBTU (35mg, 0.093mmol, 1.5eq) were added sequentially. After mixing the reaction solution uniformly, large-pore amine methyl resin (476 mg, blank loading amount was 0.41 mmol/g, target loading amount was 0.1 mmol/g) was added. The reaction solution was placed on a shaker (temperature: 25°C, rotation speed: 200 rpm) and shaken overnight. The reaction solution was filtered, the filter cake was washed sequentially with DCM and anhydrous acetonitrile, respectively, and the solid was collected and dried under vacuum overnight.
이전 단계의 고체를 무수 아세토니트릴(5mL)에 분산시키고, 피리딘(0.18mL), DMAP(3mg), NMI(0.12mL) 및 CapB1(2.68mL)을 순차적으로 첨가하였다. 반응액을 진탕기(온도: 25℃, 회전 속도: 200rpm)에 놓고 2시간 동안 진탕하였다. 반응액을 여과하고, 필터 케이크를 무수 아세토니트릴로 세척하고, 고체를 수집하여 밤새 진공 건조시켜 담체가 있는 수지를 얻었다. 로딩량은 0.1mmol/g인 것으로 측정되었다.The solid from the previous step was dispersed in anhydrous acetonitrile (5 mL), and pyridine (0.18 mL), DMAP (3 mg), NMI (0.12 mL), and CapB1 (2.68 mL) were sequentially added. The reaction solution was placed on a shaker (temperature: 25°C, rotation speed: 200 rpm) and shaken for 2 hours. The reaction solution was filtered, the filter cake was washed with anhydrous acetonitrile, and the solid was collected and dried under vacuum overnight to obtain a resin with a carrier. The loading amount was measured to be 0.1 mmol/g.
2. 이미 수지에 연결된NAG0052의 경우, 해당 수지를 시작으로 하여 뉴클레오티드 배열 순서에 따라 3'-5' 방향으로 뉴클레오시드 단량체를 하나씩 연결하였다. 뉴클레오시드 단량체의 각 연결에는 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화 또는 황화의 네 반응 단계가 포함된다. 조작은 당업계에서 일반적인 조작이다.2. In the case ofNAG0052 already linked to the resin, nucleoside monomers were linked one by one in the 3'-5' direction according to the nucleotide sequence, starting from the resin. Each linkage of a nucleoside monomer involves four reaction steps: deprotection, coupling, capping, and oxidation or sulfurization. The operation is a common operation in the art.
제조된 dsRNA는표 8 및 표 9-1에 나타난 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는다.The prepared dsRNA has the sense strand and antisense strand shown in Table 8 and Table 9-1.
표 8. dsRNA 목록Table 8. List of dsRNAs
표 9-1. dsRNA 센스 가닥과 안티센스 가닥의 핵산 서열Table 9-1. Nucleic acid sequences of dsRNA sense strand and antisense strand
위의 dsRNA의 구조는 다음과 같다:The structure of the above dsRNA is as follows:
표 9-2. dsRNA의 구조Table 9-2. Structure of dsRNA
여기서, TRD002218을 기준 양성 화합물로 사용하였다.Here, TRD002218 was used as the reference positive compound.
실시예 8: 체내에서 표적 유전자 mRNA 발현량에 대한 dsRNA의 억제Example 8: Inhibition of dsRNA on target gene mRNA expression level in the body
본 실험에서는, 체내에서 표적 유전자 mRNA 발현량에 대한 본 개시의 상이한 구조가 접합된 dsRNA의 억제 효율을 조사하였다.In this experiment, the inhibition efficiency of dsRNA conjugated with different structures of the present disclosure on the level of target gene mRNA expression in the body was investigated.
6~8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 무작위로 각 군당 6마리, 각 시점에 3마리씩 나누고, 각 군의 마우스에 각각 TRD007205, 기준 양성 TRD002218 및 PBS를 투여하였다.Male C57BL/6 mice aged 6 to 8 weeks were randomly divided into 6 mice in each group and 3 mice at each time point, and mice in each group were administered TRD007205, baseline positive TRD002218, and PBS, respectively.
모든 동물의 투약량은 전체 체중을 기준으로 계산하였으며, 단회 투약은 피하 주사 방식을 취하였으며, dsRNA 투약량(리간드를 포함하지 않는 siRNA의 양으로 계산)은 1mg/kg이고, 투약 부피는 5mL/kg이다. 투약 7일, 28일 후 마우스를 죽이고, 간을 수집하여 RNA later(Sigma Aldrich 회사)로 보존하였고; 이어서 조직 균질기로 간 조직을 균질화한 후, 조직 RNA 추출 키트(FireGen Biomedicals, FG0412)를 사용하여 프로토콜에 표시되는 조작 단계에 따라 간 조직의 총 RNA를 추출하여 얻었다. 총 RNA를 cDNA로 역전사시키고 실시간 형광 정량 PCR 방법을 채택하여 간 조직에서 TTR mRNA의 발현량을 검출하였다. 해당 형광 정량 PCR 방법에서는, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(GAPDH) 유전자를 내부 기준 유전자로 사용하였고, TTR 및 GAPDH에 대한 Taqman 프로브 프라이머를 사용하여 TTR 및 GAPDH의 mRNA 발현량을 각각 검출하였다.The dosage of all animals was calculated based on the total body weight, single dosage was administered by subcutaneous injection, the dsRNA dosage (calculated as the amount of siRNA without ligand) was 1 mg/kg, and the dosage volume was 5 mL/kg. . Mice were killed 7 and 28 days after administration, and livers were collected and preserved with RNA later (Sigma Aldrich company); Then, after homogenizing the liver tissue with a tissue homogenizer, total RNA of the liver tissue was extracted and obtained using a tissue RNA extraction kit (FireGen Biomedicals, FG0412) according to the operating steps indicated in the protocol. Total RNA was reverse transcribed into cDNA, and real-time fluorescence quantitative PCR method was adopted to detect the expression level of TTR mRNA in liver tissue. In the corresponding fluorescence quantitative PCR method, the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was used as an internal reference gene, and the mRNA expression levels of TTR and GAPDH were detected using Taqman probe primers for TTR and GAPDH, respectively.
표 10. 마우스 체내에서 실험 화합물의 각 군당 정보:Table 10. Information for each group of tested compounds in mouse body:
검출 프라이머의 서열은 표 11을 참조한다:See Table 11 for sequences of detection primers:
표 11. 프라이머 서열Table 11. Primer sequences
TTR mRNA 발현량은 다음과 같은 등식에 따라 계산한다:TTR mRNA expression level is calculated according to the following equation:
TTR mRNA 발현량=[(시험군의 TTR mRNA 발현량/시험군의 GAPDH mRNA 발현량)/(대조군의 TTR mRNA 발현량/대조군의 GAPDH mRNA 발현량)]×100%.TTR mRNA expression level = [(TTR mRNA expression level of test group/GAPDH mRNA expression level of test group)/(TTR mRNA expression level of control group/GAPDH mRNA expression level of control group)] × 100%.
투약 7일 및 28일 후에, 체내에서 표적 유전자 mRNA 발현량에 대한 본 개시의 상이한 구조가 접합된 dsRNA의 억제 효율은 각각 도 1 및 도 2를 참조한다. 도 1의 결과로부터 알 수 있듯이, TRD007205는 투약한 후 7일째에 TTR mRNA의 발현에 대한 억제 효과가 모두 우수하다. 도 2로부터 알 수 있듯이, 투약 28일 후, 표적 유전자 mRNA 발현량에 대한 TRD007205의 억제 효과는 TRD002218보다 더 우수하다.After 7 and 28 days of administration, the inhibition efficiency of dsRNA conjugated with different structures of the present disclosure on the target gene mRNA expression level in the body is shown in Figures 1 and 2, respectively. As can be seen from the results in Figure 1, TRD007205 has an excellent inhibitory effect on the expression of TTR mRNA at 7 days after administration. As can be seen from Figure 2, after 28 days of administration, the inhibitory effect of TRD007205 on the target gene mRNA expression level is better than that of TRD002218.
실시예 9: dsRNA의 합성Example 9: Synthesis of dsRNA
1. 담체가 있는 수지를 직접 제조하기1. Directly manufacture resin with carrier
구체적인 조작은 실시예 7과 동일하다.The specific operation is the same as Example 7.
2.NAG0052가 있는 수지를 시작으로 하여, 뉴클레오티드 배열 순서에 따라 3'-5' 방향으로 뉴클레오시드 단량체를 하나씩 연결하였다. 뉴클레오시드 단량체의 각 연결에는 탈보호, 커플링, 캡핑, 산화 또는 황화의 네 반응 단계가 포함된다. 구체적으로는 실시예 2의 합성 방법을 참조한다.2. Starting with the resin containingNAG0052 , nucleoside monomers were linked one by one in the 3'-5' direction according to the nucleotide sequence. Each linkage of a nucleoside monomer involves four reaction steps: deprotection, coupling, capping, and oxidation or sulfurization. Specifically, refer to the synthesis method in Example 2.
제조된 dsRNA는 표 12 및 표 14에 나타난 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는다.The dsRNA prepared has the sense strand and antisense strand shown in Table 12 and Table 14.
표 12. dsRNA 목록Table 12. List of dsRNAs
비고: TRD007970, TRD007970-1, TJR100259 및 TJR100260은 HBV-X를 표적으로 하며;Remarks: TRD007970, TRD007970-1, TJR100259 and TJR100260 target HBV-X;
TRD007994, TRD007995, TRD007994-1 및 TRD007995-1은 HBV-S를 표적으로 한다.TRD007994, TRD007995, TRD007994-1 and TRD007995-1 target HBV-S.
표 13. dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 대응하는 네이키드 서열Table 13. Corresponding naked sequences of the sense and antisense strands of dsRNA.
표 14. dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥Table 14. Sense and antisense strands of dsRNA.
여기서, (-)hmpNA(A), (-)hmpNA(G), (-)hmpNA(C), (-)hmpNA(U)의 구조는 실시예 4를 참조한다.Here, the structures of (-)hmpNA(A), (-)hmpNA(G), (-)hmpNA(C), and (-)hmpNA(U) refer to Example 4.
NAG0052'의 구조는 다음과 같다:The structure of'NAG0052' is as follows:
실시예 10: HBV에 대한 dsRNA의 온-표적 활성Example 10: On-target activity of dsRNA against HBV
표 15는 양성 대조 화합물이다.Table 15 is a positive control compound.
표 15. 양성 대조 화합물 서열 정보Table 15. Positive control compound sequence information
여기서, AD81890은 CN201980053789.8을 참조하여 제조되며; L96의 구조는이다.Here, AD81890 is manufactured with reference to CN201980053789.8; The structure of L96 is am.
HEK293A 세포에서 11개의 농도 구배를 채택하여 표 14 및 표 15의 dsRNA 서열에 대한 체외 분자 수준 시뮬레이션 온-표적 활성에 대해 스크리닝하였다.Eleven concentration gradients were adopted in HEK293A cells and screened for in vitro molecular level simulated on-target activity against the dsRNA sequences in Tables 14 and 15.
HBV 유전자로 dsRNA에 대응하는 온-표적 서열을 구축하여 psiCHECK-2 플라스미드에 삽입하였다. 해당 플라스미드는 레닐라 루시퍼라제 유전자 및 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 포함하였다. 이중 리포터 유전자 시스템으로서, dsRNA의 표적 서열을 레닐라 루시퍼라제 유전자의 3'UTR 영역에 삽입하고, 표적 서열에 대한 dsRNA의 활성은 반딧불이 루시퍼라제에 의해 보정된 레닐라 루시퍼라제 발현 상황을 검출함으로써 반영할 수 있으며, 검출은 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega, E2940)을 사용하였다.An on-target sequence corresponding to dsRNA was constructed using the HBV gene and inserted into the psiCHECK-2 plasmid. The plasmid contained the Renilla luciferase gene and the firefly luciferase gene. As a dual reporter gene system, the target sequence of dsRNA is inserted into the 3'UTR region of the Renilla luciferase gene, and the activity of dsRNA against the target sequence is reflected by detecting the Renilla luciferase expression status corrected by firefly luciferase. It can be detected using the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, E2940).
HEK293A 세포를 37℃, 5% CO2 조건 하, 10% 소태아 혈청을 함유한 DMEM 고글루코스 배지에서 배양하였다. 형질감염하기 24시간 전에, HEK293A 세포를 96웰 플레이트에 웰당 8×103개 세포의 접종 밀도, 웰당 100μL의 배지로 접종하였다.HEK293A cells were cultured in DMEM high glucose medium containing 10% fetal bovine serum at 37°C under 5% CO2 conditions. 24 hours before transfection, HEK293A cells were seeded in a 96-well plate at a seeding density of 8 × 103 cells per well and 100 μL of medium per well.
설명서에 따라, Lipofectamine2000(ThermoFisher, 11668019)을 사용하여 dsRNA 및 대응하는 플라스미드를 세포에 공동 형질감염시키고, 웰당 0.2μL의 Lipofectamine2000을 사용하였다. 플라스미드의 형질감염량은 웰당 20ng이다. 온-표적 서열 플라스미드에 대해, dsRNA는 총 11개의 농도점을 설정하고, 최고 농도점의 최종 농도는 20nM으로 3배 구배 희석(20nM, 6.6667nM, 2.2222nM, 0.7407nM, 0.2469nM, 0.0823nM, 0.0274nM, 0.0091nM, 0.0030nM, 0.0010nM 및 0.0003nM)이다. 형질감염 후 24시간에, Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega, E2940)을 채택하여 온-표적 수준을 검출하였다.According to the instructions, dsRNA and the corresponding plasmid were co-transfected into cells using Lipofectamine2000 (ThermoFisher, 11668019), using 0.2 μL of Lipofectamine2000 per well. The transfection amount of plasmid is 20ng per well. For the on-target sequence plasmid, dsRNA was set to a total of 11 concentration points, with a final concentration of 20 nM at the highest concentration point, followed by 3-fold gradient dilution (20 nM, 6.6667 nM, 2.2222 nM, 0.7407 nM, 0.2469 nM, 0.0823 nM, 0.0274nM, 0.0091nM, 0.0030nM, 0.0010nM and 0.0003nM). At 24 hours after transfection, the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, E2940) was adopted to detect on-target levels.
psiCHECK 활성 스크리닝 실험의 단계는 구체적으로 다음과 같다:The steps of the psiCHECK activity screening experiment are specifically as follows:
HEK293A 세포주에서 psi-CHECK를 수행하여 dsRNA 서열의 온-표적 활성을 스크리닝하였다. 실험 재료와 기기에 대한 자세한 내용은 표 16 및 표 17를 참조한다.psi-CHECK was performed in HEK293A cell line to screen the on-target activity of dsRNA sequences. For detailed information on experimental materials and equipment, see Table 16 and Table 17.
Psi-CHECK 플라스미드는 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.로부터 구입하였다.Psi-CHECK plasmid was purchased from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
표 16. psi-CHECK 실험용 소모품 및 시약Table 16. Consumables and reagents for psi-CHECK labs.
표 17. psi-CHECK 실험 기기Table 17. psi-CHECK experimental equipment
psiCHECK 실험 단계:psiCHECK experiment steps:
(가) 세포 플레이팅(A) Cell plating
1. 실험 준비:1. Experiment preparation:
1.1 HEK293A 세포 준비:1.1 HEK293A cell preparation:
Nanjing Kebai로부터 구매되며, 부착 세포가 완전히 소화된 후 계수해야 하며, 세포생존율이 95%보다 크거나 같은 경우 사용할 수 있다.Purchased from Nanjing Kebai, adherent cells must be counted after complete digestion and can be used when the cell viability is greater than or equal to 95%.
1.2 DMEM 완전 배지(DMEM+10% FBS)를 4℃에 보관하고 실험 전에 꺼내어 실온으로 균형을 잡는다.1.2 Store DMEM complete medium (DMEM + 10% FBS) at 4°C and take out and equilibrate to room temperature before the experiment.
1.3 96웰 플레이트 세포 플레이트.1.3 96-well plate cell plate.
2. 세포 플레이팅2. Cell plating
형질감염하기 18시간 전, 계수 완료 후 HEK293A 세포를 96웰 플레이트에 8×103개 세포/웰의 접종 밀도, 100μL의 배지/웰로 접종하며;18 hours before transfection, after completion of counting, HEK293A cells were inoculated into a 96-well plate at a seeding density of 8×103 cells/well and 100 μL of medium/well;
2.1 나중에 사용을 위해 배지를 37℃ 수조에 넣고 20분 동안 인큐베이션하며;2.1 For later use, place the medium in a 37°C water bath and incubate for 20 minutes;
2.2 균일한 세포 현탁액 100μL를 취하여 5μL의 세포 계수 염료와 고르게 혼합하고 1분 동안 정지 염색하고 15μL의 현탁액을 취하여 세포 계수 플레이트에 주입하여 살아있는 세포의 수(녹색)를 계산하고, 세포 생존율은 98.7%이며;2.2 Take 100μL of homogeneous cell suspension and mix evenly with 5μL of cell counting dye, stop staining for 1 minute, take 15μL of suspension and inject into cell counting plate to count the number of living cells (green), cell survival rate is 98.7% and;
2.3 세포 계수 결과에 따라 적합한 부피의 배지를 첨가하고, 100μL를 취하여 96웰 플레이트에 플레이팅하여 세포량이 8×103개 세포/웰이 보장되고, 세포 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 방치하여 배양한다.2.3 Add an appropriate volume of medium according to the cell counting results, take 100 μL and plate it in a 96-well plate to ensure a cell volume of 8 × 103 cells/well, and leave the cell plate in an incubator at 37°C and 5% CO2. and culture it.
(나) 세포 형질감염 실험(B) Cell transfection experiment
1. 실험 준비:1. Experiment preparation:
1.1 dsRNA 샘플 및 플라스미드의 준비: dsRNA 샘플은 20μM로 정량화하고 psi-CHECK 플라스미드로 이의 농도를 측정하고 나중에 사용하기 위해 -20℃에서 보관하며, 사용하기 전에 짧게 원심분리해야 하였으며;1.1 Preparation of dsRNA samples and plasmids: dsRNA samples were quantified to 20 μM, their concentration was measured with psi-CHECK plasmid, stored at -20°C for later use, and centrifuged briefly before use;
1.2 형질감염 시약 Lipofectamine 2000은 4℃에서 보관되며;1.2 Transfection reagent Lipofectamine 2000 is stored at 4℃;
1.3 PCR 96웰 플레이트 튜브 및 8-스트립 PCR 튜브;1.3 PCR 96-well plate tubes and 8-strip PCR tubes;
1.4 Opti-MEM 배지.1.4 Opti-MEM medium.
2. 세포 형질감염 실험2. Cell transfection experiments
2.1 형질감염하기 전에 Opti-MEM 배지를 예열하고 세포 플레이트를 Opti-MEM 배지(80μL 배지/웰)로 교체한다.2.1 Before transfection, preheat the Opti-MEM medium and replace the cell plate with Opti-MEM medium (80μL medium/well).
2.2 형질감염 복합체의 배합: 각 농도 2개의 복공을 설치하고, 형질감염 복합체의 구체적인 배합량은 표 18에 나타난 바와 같으며;2.2 Formulation of transfection complex: Two pores for each concentration were installed, and the specific mixing amount of transfection complex was as shown in Table 18;
형질감염 복합체 성분:Transfection Complex Components:
표 18. 웰 플레이트의 웰당 필요한 형질감염 복합체의 용량Table 18. Dose of transfection complex required per well of well plate.
배합된 플라스미드를 다응하는 8-스트립 튜브(22μL/튜브)에 나누어 담고, Tube A로 명명하며;The combined plasmids were divided into multiple 8-strip tubes (22 μL/tube) and named Tube A;
2.3 액체 교환: 웰에 있는 10% FBS가 함유된 H-DMEM 완전 배지를 흡인하여 버리고, 80μL Opti-MEM으로 교체하고 1.5시간 동안 기아 처리한다.2.3 Liquid exchange: Aspirate and discard the H-DMEM complete medium containing 10% FBS in the wells, replace with 80 μL Opti-MEM and starve for 1.5 hours.
2.4 dsRNA 희석: dsRNA를 -20℃에서 꺼내어 해동하고 고르게 혼합하고 표 19에 따라 상이한 실험 요구에 따라 상이한 농도로 희석하여 작업 용액으로 준비하고, 즉석에서 배합하여 사용한다.2.4 dsRNA dilution: Take out the dsRNA from -20℃, thaw, mix evenly, and dilute to different concentrations according to different experimental needs according to Table 19 to prepare a working solution, and mix and use on the spot.
표 19. dsRNA 샘플의 다중 농도 희석 방안Table 19. Multiple concentration dilution schemes for dsRNA samples.
2.5 희석된 dsRNA를 Tube A에 대응하는 8-스트립 튜브에 첨가하고(2.2μL/튜브), 즉석에서 배합하여 사용하며;Add 2.5 diluted dsRNA to the 8-strip tube corresponding to Tube A (2.2μL/tube), mix and use immediately;
2.6 Lipofectamine 2000 Mix의 배합: Opti-MEM으로 Lipofectamine 2000을 희석하고 5분 동안 방치하며, Lipo Mix의 구체적인 배합량은 표 19와 같으며;2.6 Formulation of Lipofectamine 2000 Mix: Dilute Lipofectamine 2000 with Opti-MEM and leave for 5 minutes. The specific mixing amount of Lipo Mix is as shown in Table 19;
2.7 그 다음 배합된 Lipo Mix를 Tube A에 대응하는 8-스트립 튜브에 나누어 담고(22μL/튜브) 피펫팅하여 고르게 혼합한(거품이 발생하지 않음) 후 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다.2.7 Next, divide the blended Lipo Mix into 8-strip tubes corresponding to Tube A (22μL/tube), mix evenly by pipetting (no bubbles), and incubate at room temperature for 20 minutes.
2.8 상술한 Tube A 혼합물을 각 웰의 세포에 20μL/웰로 첨가하고 원래의 80μL Opti-MEM과 합하면 각 웰의 최종 부피는 100μL이다. 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 후, 각 웰에 20% FBS를 함유하는 H-DMEM 배지 100μL를 첨가한다.2.8 Add the above-mentioned Tube A mixture to the cells in each well at 20 μL/well and combine with the original 80 μL Opti-MEM, so that the final volume of each well is 100 μL. After culturing in the incubator for 4 hours, add 100 μL of H-DMEM medium containing 20% FBS to each well.
2.9 37℃ CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한다.2.9 Incubate in a 37°C CO2 incubator for 24 hours.
(다) Dual-Glo® Luciferase Assay System 검출(c) Dual-Glo® Luciferase Assay System detection
1. 실험 준비:1. Experiment preparation:
1.1 Dual luciferase reporter gene assay kit(Promega, cat.E2940) 성분 및 배합 방법: Dual-Glo®Luciferase Buffer 및 vial Dual-Glo® Luciferase Substrate (lyophilized)를 미리 혼합한 다음 각 튜브 7.5mL로 15mL 원심분리 튜브에 나누어 담는다. Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer는 미리 각 튜브 12mL로 나누어 담는다. 실험하기 전에 혼합된 Dual-Glo®Luciferase를 다시 녹이고 실온으로 균형을 잡고 각 튜브에 DMEM 7.5mL를 첨가하고 배합하며, 즉석에서 배합하여 사용한다. Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer를 다시 녹이고 실온으로 균형을 잡고 Dual-Glo® Stop & Glo®Substrate와 100:1로 배합하며, 즉석에서 배합하여 사용한다.1.1 Dual luciferase reporter gene assay kit (Promega, cat.E2940) ingredients and mixing method: Premix Dual-Glo®Luciferase Buffer and vial Dual-Glo® Luciferase Substrate (lyophilized), then pour into 15mL centrifuge tubes with 7.5mL in each tube. Divide it into Divide Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer into 12mL each tube. Before the experiment, re-dissolve the mixed Dual-Glo®Luciferase, balance it at room temperature, add 7.5 mL of DMEM to each tube, mix, and use immediately. Re-melt Dual-Glo® Stop & Glo® Buffer, balance to room temperature, mix 100:1 with Dual-Glo® Stop & Glo®Substrate, and use immediately.
2. 신호 수집2. Signal acquisition
2.1 액체 흡입: 96웰 배양 플레이트에 있는 원래의 배지를 흡입하며;2.1 Liquid aspiration: Aspirate the original medium in the 96-well culture plate;
2.2 기질 첨가(Dual-Glo®Luciferase): 각 웰에 150μL LARII 기질을 첨가하고 진탕기에서 10분 동안 진탕하며;2.2 Substrate addition (Dual-Glo®Luciferase): Add 150 μL LARII substrate to each well and shake on shaker for 10 minutes;
2.3 피펫팅: 기질(Dual-Glo®Luciferase Mix) 120μL를 취하여 96웰 엘리사 플레이트에 옮기고 Firefly 화학발광 값을 판독하며;2.3 Pipetting: Take 120μL of substrate (Dual-Glo®Luciferase Mix) and transfer to 96-well ELISA plate and read Firefly chemiluminescence value;
2.4 기질 첨가(Dual-Glo® Stop & Glo): 각 웰에 60μL Dual-Glo® Stop & Glo 기질을 다시 첨가하고 진탕기에서 10분 동안 진탕하고 Renilla 화학발광 값을 판독하며;2.4 Substrate addition (Dual-Glo® Stop & Glo): Add back 60 μL Dual-Glo® Stop & Glo substrate to each well, shake on shaker for 10 minutes and read Renilla chemiluminescence value;
2.5 상대값 Ratio=Ren/Fir(레닐라/반딧불 비율)을 계산하며;2.5 Calculate the relative value Ratio=Ren/Fir (Renilla/firefly ratio);
2.6 억제율 1-(Ratio+dsRNA/리포터 유전자만)*100%=억제율(%)을 계산하며;2.6 Inhibition rate 1-(Ratio+dsRNA/reporter gene only)*100%=Calculate the inhibition rate (%);
본 개시에서, 잔여 활성%(mRNA의 잔여 발현량% 또는 mRNA의 잔여 발현 비율이라고도 함)=100%-억제율(%)이다.In the present disclosure, % residual activity (also referred to as % residual expression amount of mRNA or residual expression ratio of mRNA)=100%-inhibition rate (%).
2.7 GraphPad Prism5를 이용하여 그래프를 그린다.2.7 Draw a graph using GraphPad Prism5.
결과는 표 20에 나타난 바와 같다.The results are as shown in Table 20.
표 20. dsRNA의 psi-CHECK 온-표적 활성의 스크리닝 결과Table 20. Screening results of psi-CHECK on-target activity of dsRNA.
위의 결과는 기준 대조 화합물 AD81890, TRD007970, TRD007994, TRD007995가 psiCHECK 시스템에서 HBV 유전자에 대해 높은 수준의 온-표적 억제 활성을 갖는 것으로 나타낸다.The above results show that the reference control compounds AD81890, TRD007970, TRD007994, TRD007995 have a high level of on-target inhibition activity against HBV genes in the psiCHECK system.
다른 배치의 결과는 표 21에 나타난 바와 같다.The results of different batches are shown in Table 21.
표 21. dsRNA의 psi-CHECK 온-표적 활성의 스크리닝 결과Table 21. Screening results of psi-CHECK on-target activity of dsRNA.
위의 결과는 기준 대조 AD81890, 본 개시에 따른 TRD007970, TJR100259, TJR100260이 psiCHECK 시스템에서 HBV 유전자에 대해 더 높은 수준의 온-표적 억제 활성을 가짐을 나타낸다.The above results indicate that the reference control AD81890, TRD007970, TJR100259, and TJR100260 according to the present disclosure have a higher level of on-target inhibition activity against HBV genes in the psiCHECK system.
실시예 11: HepG2.2.15 세포를 응용한 dsRNA의 채외 항-HBV 활성 평가Example 11: Evaluation of in vitro anti-HBV activity of dsRNA using HepG2.2.15 cells
HepG2.2.15 세포에서 8개의 농도 구배를 채택하여 체외에서 dsRNA의 항-HBV 활성을 평가하였다.Eight concentration gradients were adopted in HepG2.2.15 cells to evaluate the anti-HBV activity of dsRNA in vitro.
1일째에 HepG2.2.15 세포를 웰당 2만 개의 세포로 96웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 접종하는 동시에 RNAiMax로 상이한 농도의 dsRNA를 HepG2.2.15 세포로 옮기고; 4일째에 세포 배양 상청액을 수집하고 ELISA로 HBsAg(나머지 상청액은 나중에 사용하기 위해 냉동 보관)를 검출하였다. 마지막으로 세포를 수집하고 세포 내 RNA를 추출하고 RT-PCR로 각각 총 HBV RNA(3.5kb+2.4kb+2.1kb+0.7kb RNA를 포함함) 및 3.5kb HBV RNA(pgRNA+preCore RNA를 포함함)를 검출하고, 동시에 GAPDH 유전자 RNA를 내부 참조로 검출하였다. 시험 대상 화합물은 8개의 농도점이고, 2개의 복공이 평행으로 측정되었다. 배양액에서 DMSO의 최종 농도는 0.5%이다.On day 1, HepG2.2.15 cells were seeded in 96-well plates at 20,000 cells per well. Different concentrations of dsRNA were transferred to HepG2.2.15 cells with RNAiMax at the same time as inoculating the cells; On day 4, cell culture supernatants were collected and HBsAg was detected by ELISA (the remaining supernatants were stored frozen for later use). Finally, cells were collected, intracellular RNA was extracted, and total HBV RNA (containing 3.5kb+2.4kb+2.1kb+0.7kb RNA) and 3.5kb HBV RNA (containing pgRNA+preCore RNA) by RT-PCR, respectively. ) was detected, and at the same time, GAPDH gene RNA was detected as an internal reference. The compound to be tested had 8 concentration points, and 2 double holes were measured in parallel. The final concentration of DMSO in the culture medium is 0.5%.
억제 백분율 계산 공식은 다음과 같다:The formula for calculating percent inhibition is:
% HBsAg 억제율=(1-샘플에서 HBsAg 함량/DMSO 대조군에서 HBsAg의 함량)×100이며% HBsAg inhibition rate = (1-HBsAg content in sample/HBsAg content in DMSO control)×100
% HBV RNA 억제율=(1-샘플에서 HBV의 RNA 함량/DMSO 대조군에서 HBV의 RNA 함량)×100이며% HBV RNA inhibition rate = (1-RNA content of HBV in sample/RNA content of HBV in DMSO control)×100
% 세포 생존율=(샘플의 흡광도 값-배양액 대조의 흡광도 값)/(DMSO 대조의 흡광도 값-배양액 대조의 흡광도 값)×100이다.% cell viability = (absorbance value of sample - absorbance value of culture medium control)/(absorbance value of DMSO control - absorbance value of culture medium control) x 100.
Graphpad Prism 소프트웨어 분석(four parameter logistic equations)을 사용하여 EC50 값을 계산하였다.EC50 values were calculated using Graphpad Prism software analysis (four parameter logistic equations).
결과는 표 22에 나타난 바와 같이, 기준 대조 AD81890, 항바이러스 활성 검출 지표를 결합하면 TRD007970, TRD007994 및 TRD007995가 HepG2.2.15 세포에서 우수한 항바이러스 활성을 나타낸다는 것으로 테스트된다.The results show that, as shown in Table 22, combining the reference control AD81890, antiviral activity detection index, TRD007970, TRD007994 and TRD007995 are tested to show excellent antiviral activity in HepG2.2.15 cells.
표 22. HepG2.2.15에서 dsRNA의 항바이러스 활성Table 22. Antiviral activity of dsRNA in HepG2.2.15.
실시예 12: AS 가닥의 9번째와 10번째 위치에서 상이한 변형 평가Example 12: Evaluation of different modifications at the 9th and 10th positions of the AS strand
1. 고체상 담체에 연결된 아미노갈락토스 화합물 1-t의 합성:1. Synthesis of aminogalactose compound 1-t linked to solid carrier:
합성 경로는 다음과 같다:The synthetic route is as follows:
1) 화합물1-g의 합성 경로1) Synthetic route of compound1-g
2) 화합물1-h의 합성 경로2) Synthetic route of compound1-h
3) 화합물1-l의 합성 경로3) Synthetic route of compound1-l
4) 화합물1-q의 합성4) Synthesis of compound1-q
5) 고체상 담체에 연결된 아미노갈락토스 화합물1-t의 합성5) Synthesis of aminogalactose compound1-t linked to solid carrier
단계 1Step 1
원료1-a(297g, 763mmol) 및 원료1-b(160g, 636mmol)를 960mlDCE에 용해시키고, 15℃에서 Sc(OTf)3(15.6g, 31.8mmol)을 첨가한 다음, 반응 온도를 85℃로 올리고 2시간 동안 교반하면서 반응시키고, 반응 완료 후 포화 NaHCO3 1.5L를 첨가하여 반응을 중지하고 유기상을 분리한 후 1.5L의 포화 식염수로 세척하고, 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과된 용액을 감압 증류한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제(석유 에테르:에틸 아세테이트 5:1~0:1)하여 목표 생성물1-c(328g, 544mmol, 수율은 85.5%이고, 순도는 96.4%임)를 얻었다.Raw material1-a (297g, 763mmol) and raw material1-b (160g, 636mmol) were dissolved in 960mlDCE, Sc(OTf)3 (15.6g, 31.8mmol) was added at 15°C, and the reaction temperature was adjusted to 85°C. and reacted with stirring for 2 hours. After the reaction was completed, 1.5 L of saturated NaHCO3 was added to stop the reaction, the organic phase was separated, washed with 1.5 L of saturated saline solution, and the organic phase was dried over anhydrous Na2 SO4 . The filtered solution was distilled under reduced pressure and purified by silica gel column chromatography (petroleum ether: ethyl acetate 5:1 to 0:1) to obtain the target product1-c (328 g, 544 mmol, yield 85.5%, purity 96.4%). ) was obtained.
1HNMR:(400 MHz, CDCl3) δ 7.44-7.29 (m, 5H), 5.83 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.40-5.23 (m, 2H), 5.18-5.06 (m, 2H), 4.86 (s, 1H), 4.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.21-4.07 (m, 2H), 4.04-3.77 (m, 3H), 3.51-3.45 (m, 1H), 3.31-3.11 (m, 2H), 2.18 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.03-1.99 (m, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.64-1.46 (m, 4H), 1.43-1.29 (m, 4H).1 HNMR: (400 MHz, CDCl3 ) δ 7.44-7.29 (m, 5H), 5.83 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.40-5.23 (m, 2H), 5.18-5.06 (m, 2H), 4.86 (s, 1H), 4.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.21-4.07 (m, 2H), 4.04-3.77 (m, 3H), 3.51-3.45 (m, 1H), 3.31-3.11 ( m, 2H), 2.18 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 2.03-1.99 (m, 3H), 1.95 (s, 3H), 1.64-1.46 (m, 4H), 1.43-1.29 (m, 4H).
MS, C28H40N2O11, 실측 M+581.3.MS, C28 H40 N2 O11 , actual M+ 581.3.
단계 2Step 2
단계 1에서 얻어진 화합물을 평행 두 부분으로 나누어 수행한다: 각 반응은 432mL의 THF에 화합물1-c(72.0g, 124mmol)를 첨가하고, 아르곤 보호 하에 Pd/C(20.0g, 순도 10%)를 첨가한 다음 TFA(14.1g, 124mmol, 9.18mL)를 첨가하고 반응 용액에 수소를 주입하고 기체 압력을 30Psi로 유지하고 30℃로 가열하고 16시간 동안 교반하면서 반응시키는 것이 포함되었다. 반응 완료 후, 두 개의 평행으로 수행되는 반응을 합하여 여과하고 여과액을 감압 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄으로 희석하고 감압 농축을 3회 반복하였다. 감압 드레인한 후 목표 화합물1-d(139g)를 얻었다.The compound obtained in step 1 was carried out in two parallel portions: each reaction was performed by adding compound1-c (72.0 g, 124 mmol) to 432 mL of THF and adding Pd/C (20.0 g, 10% purity) under argon protection. This included adding TFA (14.1 g, 124 mmol, 9.18 mL), injecting hydrogen into the reaction solution, maintaining the gas pressure at 30 Psi, heating to 30°C, and reacting while stirring for 16 hours. After completion of the reaction, the two reactions performed in parallel were combined, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was diluted with dichloromethane and concentration under reduced pressure was repeated three times. After draining under reduced pressure, the target compound1-d (139 g) was obtained.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d6)δ 7.85 (d,J = 9.2 Hz, 1H), 7.74 (s, 3H), 5.21 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 4.97 (dd,J = 2.8, 10.8 Hz, 1H), 4.48 (d,J = 8.8 Hz, 1H), 4.06-3.98 (m, 3H), 3.93-3.82 (m, 1H), 3.73-3.68 (m, 1H), 3.63-3.56 (m, 1H), 3.43-3.38 (m, 1H), 2.82-2.71 (m, 2H), 2.13-2.09 (m, 3H), 2.01-1.97 (m, 3H), 1.91-1.87 (m, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.76-1.73 (m, 1H), 1.52-1.44 (m, 4H), 1.28 (s, 4H).1 HNMR (400 MHz, DMSO-d6 )δ 7.85 (d,J = 9.2 Hz, 1H), 7.74 (s, 3H), 5.21 (d,J = 3.6 Hz, 1H), 4.97 (dd,J = 2.8) , 10.8 Hz, 1H), 4.48 (d,J = 8.8 Hz, 1H), 4.06-3.98 (m, 3H), 3.93-3.82 (m, 1H), 3.73-3.68 (m, 1H), 3.63-3.56 ( m, 1H), 3.43-3.38 (m, 1H), 2.82-2.71 (m, 2H), 2.13-2.09 (m, 3H), 2.01-1.97 (m, 3H), 1.91-1.87 (m, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.76-1.73 (m, 1H), 1.52-1.44 (m, 4H), 1.28 (s, 4H).
단계 3Step 3
DMF 용액(834mL)에 화합물1-d(139g, 247mmol) 및 화합물1-e(75.3g, 223mmol)를 첨가하고, 0℃에서 DIPEA(41.6g, 322mmol, 56.1mL), HOBt(36.8g, 272mmol) 및 EDCI(52.2g, 272mmol)를 첨가하고, 15℃를 유지하고 16시간 동안 교반하면서 반응시키고, 반응 완료 후, 반응액을 디클로로메탄(400mL)으로 희석한 다음, 포화 염화암모늄 용액(1L), 포화 NaHCO3(1.00L), 포화 식염수로 순착적으로 세척하고 유기상을 분리하여 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과한 후 용매를 감압 증류하여 제거하고, 잔류물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제(석유 에테르:에틸 아세테이트=5:1~0:1)하여 목표 화합물1-f(108g, 수율 56.8%)를 얻었다.Compound1-d (139g, 247mmol) and Compound1-e (75.3g, 223mmol) were added to DMF solution (834mL), and DIPEA (41.6g, 322mmol, 56.1mL) and HOBt (36.8g, 272mmol) were added at 0°C. ) and EDCI (52.2 g, 272 mmol) were added, the reaction was maintained at 15°C and stirred for 16 hours, and after completion of the reaction, the reaction solution was diluted with dichloromethane (400 mL) and then added with saturated ammonium chloride solution (1 L). , saturated NaHCO3 (1.00L), and saturated saline solution were sequentially washed, the organic phase was separated, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was removed by distillation under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether: Ethyl acetate = 5:1~0:1) to obtain the target compound1-f (108g, yield 56.8%).
1HNMR(40 (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.89-7.78 (m, 2H), 7.41-7.27 (m, 6H), 5.21 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 5.08-4.92 (m, 3H), 4.48 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.07-3.99 (m, 3H), 3.97-3.81 (m, 2H), 3.75-3.64 (m, 1H), 3.42-3.37 (m, 1H), 3.13-2.93 (m, 2H), 2.20 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.87-1.79 (m, 1H), 1.76 (s, 3H), 1.74-1.64 (m, 1H), 1.48-1.41 (m, 2H), 1.38 (s, 12H), 1.29-1.20 (m, 4H), 1.19-1.14 (m, 1H).1 HNMR(40 (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 7.89-7.78 (m, 2H), 7.41-7.27 (m, 6H), 5.21 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 5.08-4.92 (m, 3H), 4.48 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.07-3.99 (m, 3H), 3.97-3.81 (m, 2H), 3.75-3.64 (m, 1H), 3.42-3.37 (m, 1H) , 3.13-2.93 (m, 2H), 2.20 (t,J = 8.0 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.87-1.79 (m, 1H) ), 1.76 (s, 3H), 1.74-1.64 (m, 1H), 1.48-1.41 (m, 2H), 1.38 (s, 12H), 1.29-1.20 (m, 4H), 1.19-1.14 (m, 1H) ).
MS, C37H55N3O14, 실측치 M+766.4.MS, C37 H55 N3 O14 , found value M+ 766.4.
단계 4Step 4
상술한 얻어진 화합물1-f를 평행 두 부분으로 나누어 수행한다: 각 반응은 280mL THF에 화합물 6(47.0g, 61.3mmol)을 첨가하고 아르곤 보호 하에 Pd/C(15.0 g, 순도 10%)를 첨가한 다음, TFA(7.00g, 61.3mmol, 4.54mL)를 첨가하고 반응 용액에 수소를 주입하고 기체 압력을 30Psi로 유지하고 30℃로 가열하고 16시간 동안 교반하변서 반응시키는 것이 포함되었다. 반응 완료 후, 두 개의 평행으로 수행되는 반응을 합하여 여과하고 여과액을 감압 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄으로 희석하고 감압 농축을 3회 반복하였다. 감압 드레인한 후 목표 화합물1-g(94.0g, 조생성물)를 얻었다.The obtained compound1-f described above was carried out in two parallel parts: each reaction was performed by adding compound 6 (47.0 g, 61.3 mmol) to 280 mL THF and adding Pd/C (15.0 g, 10% purity) under argon protection. Then, TFA (7.00 g, 61.3 mmol, 4.54 mL) was added, hydrogen was injected into the reaction solution, the gas pressure was maintained at 30 Psi, heated to 30 ° C., and the reaction was stirred for 16 hours. After completion of the reaction, the two reactions performed in parallel were combined, filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was diluted with dichloromethane and concentration under reduced pressure was repeated three times. After draining under reduced pressure, 1-g (94.0 g, crude product) of the target compound was obtained.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d6)δ 8.38 (s, 1H), 8.10 (s, 3H), 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 3.6, 11.2 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.06-3.98 (m, 3H), 3.92-3.82 (m, 1H), 3.75-3.67 (m, 2H), 3.60 (s, 1H), 3.43-3.37 (m, 1H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.30-2.24 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.95-1.90 (m, 2H), 1.89 (s, 3H), 1.78-1.75 (m, 3H), 1.49-1.41 (m, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.26 (s, 4H).1 HNMR (400 MHz, DMSO-d6)δ 8.38 (s, 1H), 8.10 (s, 3H), 7.83 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 3.6, 11.2 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.06-3.98 (m, 3H), 3.92-3.82 (m, 1H), 3.75-3.67 (m, 2H) ), 3.60 (s, 1H), 3.43-3.37 (m, 1H), 3.18-3.04 (m, 2H), 2.30-2.24 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.95-1.90 (m, 2H), 1.89 (s, 3H), 1.78-1.75 (m, 3H), 1.49-1.41 (m, 3H), 1.40 (s, 9H), 1.26 (s, 4H).
단계 5Step 5
상술한 얻어진 화합물1-f를 평행 두 부분으로 나누어 수행한다: 각 반응은 HCl-EtOAc(2.00M, 276mL)에 화합물1-f(46.0g, 60mmol)를 첨가하고 15℃에서 16시간 동안 교반하면서 반응시키는 것이 포함되었다. 반응 완료 후, 두 개의 반응 용액을 합하여 감압 증류 및 농축하며, 잔류물을 디클로로메탄으로 희석하고 감압 농축을 3회 반복하였다. 감압 드레인한 후 목표 화합물1-h(91.0g, 조생성물)를 얻었다.The obtained compound1-f described above was divided into two parallel parts and carried out: each reaction was performed by adding compound1-f (46.0 g, 60 mmol) to HCl-EtOAc (2.00 M, 276 mL) and stirring at 15°C for 16 hours. It involved reacting. After completion of the reaction, the two reaction solutions were combined, distilled and concentrated under reduced pressure, the residue was diluted with dichloromethane, and concentration under reduced pressure was repeated three times. After draining under reduced pressure, the target compound1-h (91.0 g, crude product) was obtained.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d6)δ 7.91-7.80 (m, 2H), 7.42-7.26 (m, 6H), 5.21 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 5.07-4.92 (m, 4H), 4.48 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.06-3.98 (m, 3H), 3.98-3.82 (m, 3H), 3.73-3.65 (m, 1H), 3.44-3.35 (m, 1H), 3.12-2.94 (m, 2H), 2.22 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.01-1.97 (m, 4H), 1.94-1.90 (m, 1H), 1.89 (s, 3H), 1.87-1.79 (m, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.74-1.67 (m, 1H), 1.49-1.40 (m, 2H), 1.40-1.32 (m, 2H), 1.24 (d,J = 4.0 Hz, 4H), 1.19-1.13 (m, 1H).1 HNMR (400 MHz, DMSO-d6 )δ 7.91-7.80 (m, 2H), 7.42-7.26 (m, 6H), 5.21 (d,J = 3.2 Hz, 1H), 5.07-4.92 (m, 4H) , 4.48 (d,J = 8.4 Hz, 1H), 4.06-3.98 (m, 3H), 3.98-3.82 (m, 3H), 3.73-3.65 (m, 1H), 3.44-3.35 (m, 1H), 3.12 -2.94 (m, 2H), 2.22 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.01-1.97 (m, 4H), 1.94-1.90 (m, 1H), 1.89 (s, 3H) ), 1.87-1.79 (m, 2H), 1.76 (s, 3H), 1.74-1.67 (m, 1H), 1.49-1.40 (m, 2H), 1.40-1.32 (m, 2H), 1.24 (d,J = 4.0 Hz, 4H), 1.19-1.13 (m, 1H).
MS, C33H47N3O14, 실측 M+710.3.MS, C33 H47 N3 O14 , actual M+ 710.3.
단계 6Step 6
평행으로 두 개의 반응을 수행한다: 각 반응은 270mL DMF에 화합물1-g(45.0g, 60.3mmol) 및 화합물1-h(38.5g, 54.3mmol)를 첨가한 다음, 0℃에서 DIPEA(10.1g, 78.4mmol, 13.6mL)를 첨가한 다음, HOBt(8.97g, 66.3mmol) 및 EDCI(12.7g, 66.3mmol)를 첨가하는 것이 포함되었다. 15℃에서 16시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 완료 후, 두 개의 반응 용액을 합하고 300mL DCM을 첨가하여 희석하고, 포화 염화암모늄(800mL), 포화 NaHCO3(800mL) 및 포화 식염수(800mL)로 순차적으로 세척하며, 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과한 후, 가압 증발 및 농축하고, 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제(석유 에테르:에틸 아세테이트=5:1~0:1)하여 목표 화합물1-i(66.0g, 47.4mmol, 수율은 39.3%이고, 순도는 95.1%임)를 얻었다.Two reactions are performed in parallel: each reaction involves adding compound1-g (45.0 g, 60.3 mmol) and compound1-h (38.5 g, 54.3 mmol) to 270 mL DMF, followed by adding DIPEA (10.1 g) at 0°C. , 78.4 mmol, 13.6 mL), followed by the addition of HOBt (8.97 g, 66.3 mmol) and EDCI (12.7 g, 66.3 mmol). The reaction was performed with stirring at 15°C for 16 hours. After completion of the reaction, the two reaction solutions were combined and diluted by adding 300 mL DCM, washed sequentially with saturated ammonium chloride (800 mL), saturated NaHCO3 (800 mL), and saturated saline solution (800 mL), and the organic phase was washed with anhydrous Na2 SO4 dried. After filtration, evaporation and concentration under pressure, the residue was purified by silica gel column chromatography (petroleum ether: ethyl acetate = 5:1 to 0:1) to obtain the target compound1-i (66.0 g, 47.4 mmol, yield 39.3). %, and the purity was 95.1%).
1HNMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 7.96-7.78 (m, 5H), 7.41-7.25 (m, 6H), 5.21 (d,J = 3.6 Hz, 2H), 5.05-4.92 (m, 4H), 4.48 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 4.22-4.12 (m, 1H), 4.02 (s, 6H), 3.94-3.80 (m, 3H), 3.74-3.64 (m, 2H), 3.45-3.35 (m, 2H), 3.11-2.92 (m, 4H), 2.20-2.12 (m, 4H), 2.10 (s, 6H), 1.99 (s, 6H), 1.89 (s, 6H), 1.82-1.79 (m, 2H), 1.76 (s, 6H), 1.74-1.63 (m, 2H), 1.44 (d,J = 6.0 Hz, 4H), 1.37 (s, 12H), 1.24 (s, 9H).1 HNMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 7.96-7.78 (m, 5H), 7.41-7.25 (m, 6H), 5.21 (d,J = 3.6 Hz, 2H), 5.05-4.92 (m, 4H) , 4.48 (d,J = 8.8 Hz, 2H), 4.22-4.12 (m, 1H), 4.02 (s, 6H), 3.94-3.80 (m, 3H), 3.74-3.64 (m, 2H), 3.45-3.35 (m, 2H), 3.11-2.92 (m, 4H), 2.20-2.12 (m, 4H), 2.10 (s, 6H), 1.99 (s, 6H), 1.89 (s, 6H), 1.82-1.79 (m , 2H), 1.76 (s, 6H), 1.74-1.63 (m, 2H), 1.44 (d,J = 6.0 Hz, 4H), 1.37 (s, 12H), 1.24 (s, 9H).
MS: C62H94N6O25, 실측치 m/z 1323.8.MS: C62 H94 N6 O25 , actual value m/z 1323.8.
단계 7Step 7
11개의 반응으로 나누어 수행한다: 각 반응에서 화합물1-i(5.00g, 3.78mmol) 및 톨루엔(300mL)을 첨가하고, 실리카겔(45.0g)을 첨가하였다. 100℃에서 40시간 동안 교반하면서 반응시키고, 반응 완료 후 11개의 반응 혼합물을 합하였다. 감압 증류하여 용매를 제거한 후, 잔류물에 이소프로판올 및 디클로로메탄을 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 불용 물질을 여과하여 제거하고 생성물이 용출되지 않을 때까지 이소프로판올로 필터 케이크를 세척하고, 얻어진 용액은 용매를 제거하고 드레인하여 목표 화합물1-j(43.2g, 34.0mmol, 수율은 82.0%임)를 얻었다.The reaction was divided into 11 reactions: Compound1-i (5.00 g, 3.78 mmol) and toluene (300 mL) were added in each reaction, and silica gel (45.0 g) was added. The reaction was performed with stirring at 100°C for 40 hours, and after completion of the reaction, 11 reaction mixtures were combined. After distillation under reduced pressure to remove the solvent, isopropanol and dichloromethane were added to the residue and stirred for 20 minutes. Insoluble substances were removed by filtration and the filter cake was washed with isopropanol until the product no longer eluted. The solvent was removed and the resulting solution was drained to obtain target compound1-j (43.2 g, 34.0 mmol, yield 82.0%). got it
1HNMR: (400 MHz, DMSO-d6)δ 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.93-7.79 (m, 2H), 7.39-7.27 (m, 3H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.06-4.91 (m, 2H), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.07-3.97 (m, 3H), 3.94-3.82 (m, 2H), 3.73-3.65 (m, 1H), 3.45-3.36 (m, 2H), 3.10-2.94 (m, 2H), 2.15 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.86-1.79 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.74-1.65 (m, 1H), 1.44 (s, 2H), 1.37 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 1.24 (s, 4H).1 HNMR: (400 MHz, DMSO-d6)δ 8.01 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.93-7.79 (m, 2H), 7.39-7.27 (m, 3H), 5.21 (d, J = 3.2 Hz) , 1H), 5.06-4.91 (m, 2H), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.07-3.97 (m, 3H), 3.94-3.82 (m, 2H), 3.73-3.65 (m, 1H) ), 3.45-3.36 (m, 2H), 3.10-2.94 (m, 2H), 2.15 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.86-1.79 (m, 1H), 1.77 (s, 3H), 1.74-1.65 (m, 1H), 1.44 (s, 2H), 1.37 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 1.24 (s) , 4H).
MS: C58H86N6O25, 실측 m/z=1267.8.MS: C58 H86 N6 O25 , actual m/z=1267.8.
단계 8Step 8
이 단계는 평행 두 개의 반응으로 나누어 수행한다: 각 반응은 70mL DMF에 화합물1-d(11.8g, 21.0mmol) 및 화합물1-j(21.3g, 16.8mmol)를 첨가한 다음, 0℃에서 DIPEA(3.54g, 27.3mmol, 4.77mL)를 첨가한 다음, HOBt(3.13g, 23.1mmol) 및 EDCI(4.44g, 23.1mmol)를 첨가하는 것이 포함되었다. 15℃에서 16시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 완료 후, 두 개의 반응 용액을 합하고 500mL DCM을 첨가하여 희석하고, 포화 염화암모늄(1.5L), 포화 NaHCO3(1.5mL) 및 포화 식염수(1.5mL)로 순착적으로 세척하며, 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 여과한 후, 가압 증발 및 농축하고, 잔류물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제(디클로로메탄:메탄올=50:1~10:1)하여 목표 화합물1-k(54.0g, 31.8mmol, 수율은 75.6%임)를 얻었다.This step is performed in two parallel reactions: each reaction involves adding compound1-d (11.8 g, 21.0 mmol) and compound1-j (21.3 g, 16.8 mmol) to 70 mL DMF, followed by DIPEA at 0°C. (3.54 g, 27.3 mmol, 4.77 mL), followed by the addition of HOBt (3.13 g, 23.1 mmol) and EDCI (4.44 g, 23.1 mmol). The reaction was performed with stirring at 15°C for 16 hours. After completion of the reaction, the two reaction solutions were combined and diluted by adding 500 mL DCM, washed sequentially with saturated ammonium chloride (1.5 L), saturated NaHCO3 (1.5 mL), and saturated saline solution (1.5 mL), and the organic phase was washed with anhydrous water. It was dried with Na2 SO4 . After filtration, evaporation and concentration under pressure, the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane:methanol=50:1~10:1) to obtain target compound1-k (54.0g, 31.8mmol, yield 75.6%). Lim) was obtained.
1HNMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 7.91 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.87-7.78 (m, 5H), 7.73 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.42-7.24 (m, 6H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 3H), 5.06-4.92 (m, 5H), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.19-4.09 (m, 2H), 4.07-3.97 (m, 10H), 3.94-3.80 (m, 4H), 3.76-3.64 (m, 3H), 3.42-3.37 (m, 4H), 3.08-2.94 (m, 6H), 2.20-2.12 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.08-2.01 (m, 2H), 1.99 (s, 9H), 1.89 (s, 9H), 1.87-1.79 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.74-1.63 (m, 2H), 1.44 (d, J = 5.6 Hz, 6H), 1.40-1.31 (m, 6H), 1.24 (s, 13H).1 HNMR (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 7.91 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.87-7.78 (m, 5H), 7.73 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.42-7.24 (m , 6H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 3H), 5.06-4.92 (m, 5H), 4.48 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.19-4.09 (m, 2H), 4.07-3.97 ( m, 10H), 3.94-3.80 (m, 4H), 3.76-3.64 (m, 3H), 3.42-3.37 (m, 4H), 3.08-2.94 (m, 6H), 2.20-2.12 (m, 2H), 2.10 (s, 9H), 2.08-2.01 (m, 2H), 1.99 (s, 9H), 1.89 (s, 9H), 1.87-1.79 (m, 2H), 1.77 (s, 9H), 1.74-1.63 ( m, 2H), 1.44 (d, J = 5.6 Hz, 6H), 1.40-1.31 (m, 6H), 1.24 (s, 13H).
MS: C78H118N8O33, 실측치 m/z=1696.1.MS: C78 H118 N8 O33 , actual value m/z=1696.1.
단계 9Step 9
이 단계는 평행 3개의 반응으로 나누어 수행한다: 각 반응에서 화합물1-k(17.0g, 10.0mmol) 및 THF(100mL)를 첨가하고, 아르곤 보호 하에 Pd/C(5.0g, 순도 10%)를 첨가한 다음 TFA(1.14g, 10.0mmol, 742μl)를 첨가하고, 반응 용액에 수소를 주입하고 기체 압력을 15Psi로 유지하고 30℃로 가열하고 4시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 완료 후, 3개의 평행으로 수행되는 반응을 합하여 여과하고, 여과액을 감압 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄으로 희석하고 감압 농축을 3회 반복하였다. 잔류물을 분취용 액체 크로마토그래피(C18, 이동상 A 0.1%TFA-물, 이동상 B: 10~40% CAN, 20분)로 정제하여 목표 화합물1-l(17.3g, 10.2mmol, 수율 34.0%)를 얻었다.This step is performed in three parallel reactions: in each reaction, compound1-k (17.0 g, 10.0 mmol) and THF (100 mL) are added, and Pd/C (5.0 g, 10% purity) is added under argon protection. After addition, TFA (1.14 g, 10.0 mmol, 742 μl) was added, hydrogen was injected into the reaction solution, the gas pressure was maintained at 15 Psi, heated to 30°C, and reaction was performed while stirring for 4 hours. After completion of the reaction, the three reactions performed in parallel were combined and filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The residue was diluted with dichloromethane and concentration under reduced pressure was repeated three times. The residue was purified by preparative liquid chromatography (C18, mobile phase A 0.1% TFA-water, mobile phase B: 10-40% CAN, 20 minutes) to obtain target compound1-l (17.3 g, 10.2 mmol, yield 34.0%). got it
1HNMR: (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.45 (t,J = 5.2 Hz, 1H), 8.14 (d,J = 5.2 Hz, 3H), 7.97 (t,J = 5.2 Hz, 1H), 7.90-7.77 (m, 4H), 5.21 (d,J = 2.8 Hz, 3H), 4.96 (dd,J = 3.2, 11.6 Hz, 3H), 4.47 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.20-4.10 (m, 1H), 4.02 (s, 8H), 3.87 (q,J = 9.6 Hz, 3H), 3.75-3.61 (m, 4H), 3.46-3.34 (m, 3H), 3.21-2.93 (m, 6H), 2.21 (s, 2H), 2.14-2.02 (m, 11H), 1.99 (s, 9H), 1.96-1.82 (m, 12H), 1.80-1.65 (m, 10H), 1.44 (d,J = 5.6 Hz, 8H), 1.36 (d,J = 6.4 Hz, 4H), 1.30-1.17 (m, 12H)1 HNMR: (400 MHz, DMSO-d6 ) δ 8.45 (t,J = 5.2 Hz, 1H), 8.14 (d,J = 5.2 Hz, 3H), 7.97 (t,J = 5.2 Hz, 1H), 7.90 -7.77 (m, 4H), 5.21 (d,J = 2.8 Hz, 3H), 4.96 (dd,J = 3.2, 11.6 Hz, 3H), 4.47 (d,J = 8.4 Hz, 3H), 4.20-4.10 ( m, 1H), 4.02 (s, 8H), 3.87 (q,J = 9.6 Hz, 3H), 3.75-3.61 (m, 4H), 3.46-3.34 (m, 3H), 3.21-2.93 (m, 6H) , 2.21 (s, 2H), 2.14-2.02 (m, 11H), 1.99 (s, 9H), 1.96-1.82 (m, 12H), 1.80-1.65 (m, 10H), 1.44 (d,J = 5.6 Hz) , 8H), 1.36 (d,J = 6.4 Hz, 4H), 1.30-1.17 (m, 12H)
MS: C70H112N8O31, 실측치 m/2z=781.8.MS: C70 H112 N8 O31 , actual value m/2z=781.8.
단계 10Step 10
화합물1-m(2g, 12.64mmol)을 피리딘(10mL)에 용해시키고, 실온에서 DMTrCl(4.71g, 13.90mmol)의 피리딘(10mL) 용액을 드롭방식으로 첨가하고, 실온에서 5시간 동안 교반하면서 반응시키고, 반응 완료 후 메탄올로 ??칭하고 감압 농축하여 조생성물을 얻고 실리카겔로 정제하고(석유 에테르:에틸 아세테이트=10:1 용리), 생성물 용리액을 수집하고 용매를 감압 증발하여 건조시켜 4g의 화합물1-n을 얻었다.Compound1-m (2g, 12.64mmol) was dissolved in pyridine (10mL), and a solution of DMTrCl (4.71g, 13.90mmol) in pyridine (10mL) was added dropwise at room temperature and reacted with stirring for 5 hours at room temperature. After completion of the reaction, the crude product was obtained by purifying it with methanol and concentrating under reduced pressure, purifying it with silica gel (eluted with petroleum ether: ethyl acetate = 10:1), collecting the product eluent, and drying the solvent by evaporating under reduced pressure to obtain 4 g of Compound1. I got-n .
MS m/z: C29H32O5, [M+H]+ 실측: 461.3.MS m/z: C29 H32 O5 , [M+H]+ actual measurement: 461.3.
단계 11Step 11
화합물1-n(2g, 4.34mmol), N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA, 1.43mL, 8.68mmol) 및 HATU(2.47g, 6.51mmol)를 DMF(10mL)에 용해시키고, 실온에서 화합물1-o의 DMF(5mL) 용액을 첨가하며, 해당 반응은 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후 물을 첨가하여 ??칭하고, 수상을 에틸 아세테이트로 추출하고, 합한 유기상을 먼저 물로 세척한 다음 포화 식염수(20mL)로 세척하고, 이어서 용매를 감압 증발하여 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, 조건: 25~80% (A: 물 0.075% NH3.H2O, B: CH3CN), 유속: 55mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후 화합물1-p 2.4g를 얻었다.Compound1-n (2g, 4.34mmol), N,N-diisopropylethylamine (DIEA, 1.43mL, 8.68mmol) and HATU (2.47g, 6.51mmol) were dissolved in DMF (10mL), and the compounds were incubated at room temperature. A solution of1-o in DMF (5 mL) was added, and the reaction was stirred at room temperature for 8 hours. After completion of the reaction, water was added and quenched, the aqueous phase was extracted with ethyl acetate, and the combined organic phases were first washed with water and then with saturated saline solution (20 mL), then the solvent was evaporated under reduced pressure to dryness, and reversed-phase preparative HPLC ( Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, conditions: 25~80% (A: water 0.075% NH3. H2 O, B: CH3 CN), flow rate: 55 mL/min), and then freeze-dried. 2.4g of compound1-p was obtained.
MS m/z: C33H39NO7, [M+H]+ 실측: 562.4.MS m/z: C33 H39 NO7 , [M+H]+ actual measurement: 562.4.
단계 12Step 12
화합물1-p(2.4g, 4.27mmol)를 15mL의 메탄올 및 물(2:1)의 혼합 용액에 용해시키고, 실온에서 LiOH(0.36g, 8.54mmol)를 첨가하고 밤새 교반하였다. 반응 완료 후 용매를 감압 증발하여 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, 조건: 25~75%(A: 물 0.075% NH3.H2O, B: CH3CN), 유속: 55mL/분)를 거치고, 동결건조시킨 후 화합물1-q 2g를 얻었다.Compound1-p (2.4 g, 4.27 mmol) was dissolved in 15 mL of a mixed solution of methanol and water (2:1), LiOH (0.36 g, 8.54 mmol) was added at room temperature and stirred overnight. After completion of the reaction, the solvent was evaporated under reduced pressure, dried, and reversed phase preparative HPLC (Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, conditions: 25~75% (A: water 0.075% NH3. H2 O, B: CH3 CN), flow rate: 55 mL/min), and lyophilized to obtain 2 g of compound1-q .
MS m/z: C32H37NO7, [M+H]+ 실측: 548.6.MS m/z: C32 H37 NO7 , [M+H]+ actual measurement: 548.6.
단계 13Step 13
화합물1-q(0.37g, 0.69mmol), DIEA(0.19mL, 1.15mmol) 및 HATU(0.32g, 0.86mmol)를 2mL의 DMF에 용해시키고, 실온에서 화합물1-l(0.9g, 0.69mmol)의 DMF(2mL) 용액을 첨가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 완료 후, 디클로로메탄(10mL)으로 반응액을 희석하고, 포화 NaHCO3(20mL) 및 포화 식염수(20mL)로 순착적으로 세척하고, 유기상을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과한 후 감압 농축하였다. 역상 분취용 HPLC(Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, 조건: 25~65% (A: 물 0.075% NH3.H2O, B: CH3CN), 유속: 45mL/분)로 정제하고, 동결건조시킨 후 화합물1-r0.5g를 얻었다.Compound1-q (0.37 g, 0.69 mmol), DIEA (0.19 mL, 1.15 mmol) and HATU (0.32 g, 0.86 mmol) were dissolved in 2 mL of DMF, and compound1-l (0.9 g, 0.69 mmol) was dissolved at room temperature. A solution of DMF (2 mL) was added and stirred at room temperature overnight. After completion of the reaction, the reaction solution was diluted with dichloromethane (10 mL), washed sequentially with saturated NaHCO3 (20 mL) and saturated saline solution (20 mL), and the organic phase was dried over anhydrous Na2 SO4 , filtered, and reduced pressure. Concentrated. Purified by reverse phase preparative HPLC (Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, conditions: 25~65% (A: water 0.075% NH3. H2 O, B: CH3 CN), flow rate: 45 mL/min) After freeze-drying, 0.5 g of compound1-r was obtained.
MS m/z: C102H147N9O37, [M-H]+ 실측: 2088.5.MS m/z: C102 H147 N9 O37 , [MH]+ actual measurement: 2088.5.
단계 14Step 14
화합물1-r(300mg, 0.14mmol) 및 숙신산 무수물(28.70mg, 0.28mmol)을 테트라히드로푸란에 용해시키고, 반응액에 DMAP(3.50mg, 0.028mmol)를 첨가하고 40℃에서 밤새 교반하였다. 반응 완료 후, 반응 완료 후, 메탄올(18.8mg)을 첨가하고 10분 동안 교반하면서 반응시킨 다음, 반응액을 디클로로메탄(3mL)으로 희석하고 포화 NaHCO3(5mL)으로 2회 세척하였다. 유기상을 감압 농축하여 건조시키고, 역상 분취용 HPLC(Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, 조건: 25~65% (A: 물 0.075% NH3.H2O, B: CH3CN), 유속: 35mL/분)로 정제하고, 동결건조시킨 후 화합물1-s 140mg를 얻었다.Compound1-r (300 mg, 0.14 mmol) and succinic anhydride (28.70 mg, 0.28 mmol) were dissolved in tetrahydrofuran, and DMAP (3.50 mg, 0.028 mmol) was added to the reaction solution and stirred at 40°C overnight. After completion of the reaction, methanol (18.8 mg) was added and the reaction was stirred for 10 minutes, and then the reaction solution was diluted with dichloromethane (3 mL) and washed twice with saturated NaHCO3 (5 mL). The organic phase was concentrated under reduced pressure, dried, and reversed phase preparative HPLC (Column: Boston Green ODS 150*30mm*5um, conditions: 25~65% (A: water 0.075% NH3. H2 O, B: CH3 CN), After purification (flow rate: 35 mL/min) and freeze-drying, 140 mg of compound1-s was obtained.
MS m/z: C106H151N9O40, [M-H]+ 실측: 2189.4.MS m/z: C106 H151 N9 O40 , [MH]+ actual measurement: 2189.4.
단계 15Step 15
이전 단계에서 얻어진 화합물1-r(140mg, 64ummol)를 아세토니트릴(5mL)에 첨가한 다음 HBTU(48.7mg, 128umol)를 첨가하고, 표면 아미노 변형 고체상 지지체(CPG-NH2, 2.3g)을 첨가하고, DIEA(41.5mg, 320umol, 55μl)를 첨가한 후, 30℃로 유지하고 16시간 동안 진탕 반응시켰다. 반응 완료 후, 여과하고 메탄올(8mL×4), 디클로로메탄(8mL×4)으로 순착적으로 세척하였다. 고체를 피리딘:무수 아세트산(v:v=4:1, 10.0mL)에 첨가하고 30℃로 계속 유지하고 16시간 동안 진탕 반응을 반응시켰다. 반응 완료 후, 여과하고 메탄올(8mL×4), 디클로로메탄(8mL×4)으로 순착적으로 세척하였다. 고체상 담체에 연결된 화합물1-t 2.1g를 얻었다.Compound1-r (140mg, 64umol) obtained in the previous step was added to acetonitrile (5mL), then HBTU (48.7mg, 128umol) was added, and the surface amino-modified solid support (CPG-NH2, 2.3g) was added. , DIEA (41.5mg, 320umol, 55μl) was added, maintained at 30°C, and shaken for 16 hours. After completion of the reaction, it was filtered and sequentially washed with methanol (8 mL × 4) and dichloromethane (8 mL × 4). The solid was added to pyridine:acetic anhydride (v:v=4:1, 10.0 mL), maintained at 30°C, and shaken for 16 hours. After completion of the reaction, it was filtered and sequentially washed with methanol (8 mL × 4) and dichloromethane (8 mL × 4). 2.1 g of compound1-t linked to the solid carrier was obtained.
2. dsRNA의 합성2. Synthesis of dsRNA
포스포라미다이트 고체상 합성법을 채택하여 표 23의 dsRNA를 합성하였다.The dsRNA shown in Table 23 was synthesized by adopting the phosphoramidite solid phase synthesis method.
3. 시험3. Test
본 실험은 체내에서 표적 유전자 mRNA 발현량에 대한 본 개시의 상이한 부위에서 2'-플루오로 변형 dsRNA의 억제 효율을 조사하였다. 6~8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 무작위로 각 군당 6마리, 각 시점에 3마리씩 나누고, 각 군의 마우스에 각각 시험 샘플(2개, TRD007047 및 TRD006870), 대조 샘플(TRD002218) 및 PBS를 투여하였다. 모든 동물의 투약량은 전체 체중을 기준으로 계산하였으며, 단회 투약은 피하 주사 방식을 취하였으며, dsRNA 투약량(리간드를 포함하지 않는 siRNA의 양으로 계산)은 1mg/kg이고, 투약 부피는 5mL/kg이다. 투약 7일 후 마우스를 죽이고, 간을 수집하여 RNA later(Sigma Aldrich 회사)로 보존하였고, 이어서, 조직 균질기로 간 조직을 균질화한 후, 조직 RNA 추출 키트(FireGen Biomedicals, FG0412)를 사용하여 프로토콜에 표시되는 조작 단계에 따라 간 조직의 총 RNA를 추출하여 얻었다. 총 RNA를 cDNA로 역전사시키고 실시간 형광 정량 PCR 방법을 채택하여 간 조직에서 TTR mRNA의 발현량을 검출하였다. 해당 형광 정량 PCR 방법에서는, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(GAPDH) 유전자를 내부 기준 유전자로 사용하였고, TTR 및 GAPDH에 대한 Taqman 프로브 프라이머를 사용하여 TTR 및 GAPDH의 mRNA 발현량을 각각 검출하였다. 화합물 정보는 표 23을 참조하고, 마우스 체내에서 실험 화합물의 각 군당 정보는 표 24를 참조하며, 프라이머는 표 11과 같다.This experiment investigated the inhibition efficiency of 2'-fluoro modified dsRNA at different sites of the present disclosure on the target gene mRNA expression level in the body. Male C57BL/6 mice aged 6 to 8 weeks were randomly divided into 6 mice in each group and 3 mice at each time point. Mice in each group were given test samples (2, TRD007047 and TRD006870), control samples (TRD002218), and PBS, respectively. administered. The dosage of all animals was calculated based on the total body weight, single dosage was administered by subcutaneous injection, the dsRNA dosage (calculated as the amount of siRNA without ligand) was 1 mg/kg, and the dosage volume was 5 mL/kg. . After 7 days of dosing, the mice were killed, the liver was collected and preserved with RNA later (Sigma Aldrich company), and the liver tissue was then homogenized with a tissue homogenizer and extracted according to the protocol using a tissue RNA extraction kit (FireGen Biomedicals, FG0412). Total RNA from liver tissue was extracted and obtained according to the indicated manipulation steps. Total RNA was reverse transcribed into cDNA, and real-time fluorescence quantitative PCR method was adopted to detect the expression level of TTR mRNA in liver tissue. In the corresponding fluorescence quantitative PCR method, the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was used as an internal reference gene, and the mRNA expression levels of TTR and GAPDH were detected using Taqman probe primers for TTR and GAPDH, respectively. Refer to Table 23 for compound information, Table 24 for information on each group of experimental compounds in the mouse body, and Table 11 for primers.
표 23. AS 가닥의 9번째와 10번째 위치 변형 화합물Table 23. Compounds modified at positions 9 and 10 of the AS strand.
여기서, NAG1의 구조는이다.Here, the structure of NAG1 is am.
표 24. 마우스 체내에서 실험 화합물의 각 군당 정보:Table 24. Information for each group of tested compounds in mouse body:
투약 28일 후, 체내에서 표적 유전자 mRNA 발현량에 대한 본 개시의 상이한 부위에서 2'-플루오로 변형 dsRNA의 억제 효율은 표 25를 참조한다. 기준 양성 대조 TRD002218, 상이한 부위에서 2'-플루오로 변형 dsRNA는 기준 양성 대조군에 비해 투약한 후 28일째에 TTR mRNA의 발현에 대한 억제는 더 높은 것으로 나타났으며, 두 가지 변형 방법은 모두 높은 억제 효율을 나타냈으며 유의한 차이가 없었고, 이는 두 가지 변형 방법이 보다 효율적인 억제 효율을 매개할 수 있음을 설명한다.See Table 25 for the inhibition efficiency of 2'-fluoro modified dsRNA at different sites of the present disclosure on the target gene mRNA expression level in the body after 28 days of administration. The reference positive control TRD002218, 2'-fluoro modified dsRNA at different sites, showed higher inhibition of TTR mRNA expression at 28 days after dosing compared to the reference positive control, with both modification methods showing high inhibition. efficiency, and there was no significant difference, which explains that the two modification methods can mediate more efficient inhibition efficiency.
표 25. 7일과 28일의 검출 결과Table 25. Detection results on days 7 and 28
TTR mRNA 발현량은 다음과 같은 등식에 따라 계산한다:TTR mRNA expression level is calculated according to the following equation:
TTR mRNA 발현량=[(시험군의 TTR mRNA 발현량/시험군의 GAPDH mRNA 발현량)/(대조군의 TTR mRNA 발현량/대조군의 GAPDH mRNA 발현량)]×100%.TTR mRNA expression level = [(TTR mRNA expression level of test group/GAPDH mRNA expression level of test group)/(TTR mRNA expression level of control group/GAPDH mRNA expression level of control group)] × 100%.
실시예 13: PHH 세포를 응용하여 dsRNA 체외 항-HBV 활성을 평가(자유 섭취)Example 13: Evaluation of dsRNA in vitro anti-HBV activity by applying PHH cells (free uptake)
각각 TRD007970, TJR100259 및 AD81890에 대해 체외 항-HBV 활성을 평가하였다.In vitro anti-HBV activity was evaluated for TRD007970, TJR100259 and AD81890, respectively.
0일째에 먼저 dsRNA를 PBS로 7개의 농도(100, 25, 6.25, 1.563, 0.391, 0.098, 0.024nM)로 구배 희석하고 48웰 플레이트에 첨가하였다. 동결된 PHH를 부활시킨 다음 PHH를 48웰 플레이트에 플레이팅하고; 플레이팅하는 동시에 시험 화합물이 세포 내로 자유롭게 흡수되었다(free uptake).On day 0, dsRNA was first gradient diluted with PBS to 7 concentrations (100, 25, 6.25, 1.563, 0.391, 0.098, 0.024 nM) and added to a 48-well plate. Frozen PHHs were revived and then PHHs were plated in 48-well plates; At the same time as plating, the test compound was freely uptaken into the cells.
1일째에 dsRNA가 없는 배지를 교체하고 HBV를 첨가하여 PHH를 감염시켰다.On day 1, the medium without dsRNA was replaced and HBV was added to infect PHH.
2일째, 4일째, 6일째에 dsRNA가 없는 신선한 배지를 교체하였다.On days 2, 4, and 6, fresh medium without dsRNA was replaced.
8일째에 상청액을 수집하고, 수집된 세포 상청액을 ELISA 방법으로 HBsAg 및 HBeAg를 검출하고, qPCR로 HBV DNA 수준을 검출하였다. 실험 결과는 표 26을 참조한다.Supernatants were collected on day 8, and HBsAg and HBeAg were detected in the collected cell supernatants by ELISA method, and HBV DNA levels were detected by qPCR. See Table 26 for experimental results.
표 26. PHH에서 dsRNA의 항바이러스 활성Table 26. Antiviral activity of dsRNA in PHH.
결과는 대조 AD81890에 비해 TRD007970과 TJR100259가 PHH에 대해 더 우수하는 항바이러스 활성을 갖는 것으로 나타난다.The results show that TRD007970 and TJR100259 have better antiviral activity against PHH compared to the control AD81890.
실시예 14: 엑소뉴클레아제의 안정성 실험으로 dsRNA의 안정성 평가Example 14: Evaluation of dsRNA stability through exonuclease stability experiment
각각 TRD007970과 TJR100259의 siRNA 네이키드 서열 TJR100381과 TJR100382(표 27을 참조)에 대해 엑소뉴클레아제 안정성 평가를 수행하며, 실험의 반응 시스템에 따라 상응하는 반응액을 배합하여 실험을 수행하며 , 표 28을 참조한다.Exonuclease stability evaluation is performed on the siRNA naked sequences TJR100381 and TJR100382 (see Table 27) of TRD007970 and TJR100259, respectively, and the experiment is performed by mixing the corresponding reaction solution according to the reaction system of the experiment, Table 28 See .
표 27. 네이키드 서열 TJR100381 및 TJR100382Table 27. Naked sequences TJR100381 and TJR100382
표 28. 5' 엑소뉴클레아제(PDII) 안정성 반응 시스템(100μl)Table 28. 5' exonuclease (PDII) stability reaction system (100 μl)
표 29. 3' 엑소뉴클레아제(SVPD) 안정성 반응 시스템(100μl)Table 29. 3' Exonuclease (SVPD) Stability Reaction System (100 μl)
5' 엑소뉴클레아제(PDII, Worthington, cat #LS003602)의 최종 농도는 500U/mL이고, 3' 엑소뉴클레아제(SVPD, Worthington, cat #LS003926)의 최종 농도는 0.5U/mL이다. 배합 완료 후, 시간 0시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 4시간의 5개의 시점에 따라 상이한 8-스트립 튜브(웰당 16μl)에 나누어 담고 37℃에서 인큐베이션하고, 시점이 된 후 반응액을 즉시 꺼내 9M 요소가 함유된 로딩 완충액(웰당 32μl)을 첨가하고 -80℃ 냉장고에 보관하였다. 후속 20%(7M 요소) PAGE 겔을 통해 전기영동을 수행하였다. 전기영동 완료 후 겔을 gelred 염료에 담그고 진탕기에서 10분 동안 염색한 후 겔 이미징(312nm UV)으로 관찰하고 사진을 찍었다. 실험 결과는 도 3(겔전기영동 결과), 도 4(5' 엑소뉴클레아제 정량적 결과) 및 도 5(3' 엑소뉴클레아제 정량적 결과)를 참조하며, 결과는 TJR100382의 안정성이 TJR100381에 비해 현저히 우수한 것으로 나타난다.The final concentration of 5' exonuclease (PDII, Worthington, cat #LS003602) is 500 U/mL, and the final concentration of 3' exonuclease (SVPD, Worthington, cat #LS003926) is 0.5 U/mL. After completion of the combination, the mixture was divided into different 8-strip tubes (16 μl per well) according to the five time points of 0 hours, 1.5 hours, 2 hours, 3 hours, and 4 hours, and incubated at 37°C. After the time point, the reaction solution was Immediately taken out, loading buffer containing 9 M urea (32 μl per well) was added and stored in a -80°C refrigerator. Subsequent electrophoresis was performed through a 20% (7 M urea) PAGE gel. After completion of electrophoresis, the gel was immersed in gelred dye and stained for 10 minutes on a shaker, then observed and photographed using gel imaging (312 nm UV). The experimental results refer to Figure 3 (gel electrophoresis results), Figure 4 (5' exonuclease quantitative results), and Figure 5 (3' exonuclease quantitative results), and the results show that the stability of TJR100382 is higher than that of TJR100381. It appears to be remarkably excellent.
실시예 15: 간 S9 대사 안정성 분석Example 15: Analysis of liver S9 metabolic stability
각각 TRD007970, TJR100259 및 AD81890에 대해 시노몰구스 원숭이의 간 S9(시노몰구스 원숭이의 간 S9, 수컷, 공급자 Xenotech, 배치 번호 1510192)를 사용하여 dsRNA에 대해 대사 안정성을 분석하며, 실험 과정은 다음과 같다:Metabolic stability is assayed for dsRNA using cynomolgus monkey liver S9 (cynomolgus monkey liver S9, male, supplier Xenotech, batch number 1510192) for TRD007970, TJR100259 and AD81890, respectively. same:
1. 8개의 96웰 샘플 플레이트를 제조하고, T0, T60, T120, T240, T360, T1440, T2880, 블랭크로 명명하였다.1. Eight 96-well sample plates were prepared and named T0, T60, T120, T240, T360, T1440, T2880, and blank.
2. 각 플레이트에 190μL/웰 S9 현탁액(또는 블랭크 완충액)을 첨가한 다음, 37℃에서 약 10분 동안 인큐베이션하였다.2. Add 190 μL/well S9 suspension (or blank buffer) to each plate and then incubate at 37°C for about 10 minutes.
3. 기질 웰을 제외하고 각 플레이트(T0, T60, T120, T240, T360, T1440, T2880)의 각 웰에 10μL의 샘플 또는 블랭크 완충액을 첨가하였다.3. 10 μL of sample or blank buffer was added to each well of each plate (T0, T60, T120, T240, T360, T1440, T2880) except for the substrate well.
4. T0을 제외하고 각 시점(60, 120, 240, 360, 1440, 2880분)의 TRD007970, TJR100259 및 AD81890 샘플은 모두 37℃ 수조에서 인큐베이션하였다.4. Except for T0, TRD007970, TJR100259, and AD81890 samples at each time point (60, 120, 240, 360, 1440, and 2880 minutes) were all incubated in a 37°C water bath.
5. 각 시점 완료 시 200μL(100mM NH4Ac pH 10.0, 1mM EDTA 및 750ng/mL 물에 내부 표준)을 첨가하고 볼텍스 믹서에서 60초 동안 진탕하였다.5. At the completion of each time point, 200 μL (100 mM NH Ac pH 10.0, 1 mM EDTA, and 750 ng/mL internal standard in water) was added and shaken for 60 seconds in a vortex mixer.
6. 각 웰에 200μL의 PCI(페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1)) 시약과 400μL의 디클로로메탄을 첨가하고 볼텍스 믹서에서 10분 동안 진탕한 후 원심분리(4℃, 3220g, 20분)하여 상청액을 얻었다.6. Add 200 μL of PCI (phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)) reagent and 400 μL of dichloromethane to each well, shake in a vortex mixer for 10 minutes, and centrifuge (4°C, 3220g, 20 minutes) to obtain a supernatant.
7. 상청액을 새 플레이트로 옮기고 LC-MS 분석을 수행하기 전에 4℃에서 보관하였다.7. The supernatant was transferred to a new plate and stored at 4°C before performing LC-MS analysis.
8, AS 가닥과 SS 가닥의 단일 가닥 잔여 백분율을 각각 검출하여 TRD007970, TJR100259 및 AD81890의 잔여 함량을 특성화하였다.8, the residual content of TRD007970, TJR100259, and AD81890 was characterized by detecting the single-strand residual percentage of AS strand and SS strand, respectively.
9. 다음 공식을 사용하여 계산한다:9. Calculate using the following formula:
잔여%=각 시점에서 내부 표준에 대한 분석물의 피크 면적 비율/T0에서 내부 표준 물질에 대한 분석물의 피크 면적 비율×100%Residual %=ratio of peak area of analyte to internal standard at each time point/ratio of peak area of analyte to internal standard at T0×100%
Ct=C0*e-ke*tCt =C0 *e-ke*t
T1/2=Ln2/ke=0.693/keClint(s9)=0.693/체외 T1/2*1/(mg/mL반응 시스템에서 S9 단백질)T1/2 =Ln2/ke =0.693/ke Clint (s9)=0.693/in vitro T1/2 *1/(mg/mLS9 protein in reaction system)
Clint(liver)=Clint(S9)*(mgS9)/g 간*g 간/(kg 체중).Clint (liver)=Clint (S9)*(mgS9)/g liver*g liver/(kg body weight).
실험 결과는 표 30을 참조하며, 결과는 시노몰구스 원숭이의 간 S9를 48h 동안 인큐베이션한 후, TJR100259 안티센스 가닥이 93.8%로 잔여하고, AD81890 안티센스 가닥이 70.2%로 잔여하고, TRD007970 안티센스 가닥이 61.0%로 잔여한 것으로 나타난다. 데이터에 따르면 시노몰구스 원숭이의 간 S9를 48시간 동안 인큐베이션한 후, TJR100259에서의 안티센스 가닥이 AD81890에서의 안티센스 가닥과 TRD007970에서의 안티센스 가닥보다 더 안정적인 것으로 나타났다.Refer to Table 30 for the experimental results, which show that after incubating cynomolgus monkey liver S9 for 48h, the TJR100259 antisense strand remains at 93.8%, the AD81890 antisense strand remains at 70.2%, and the TRD007970 antisense strand remains at 61.0%. It appears as a percentage remaining. Data showed that after incubating cynomolgus monkey liver S9 for 48 hours, the antisense strand from TJR100259 was more stable than the antisense strand from AD81890 and the antisense strand from TRD007970.
시노몰구스 원숭이의 간 S9를 48시간 동안 인큐베이션한 후, TJR100259 센스 가닥은 21.0%로 잔여하고, AD81890 센스 가닥은 12.2%로 잔여하고, TRD007970 센스 가닥은 8.9%로 잔여하였다. 데이터에 따르면 시노몰구스 원숭이의 간 S9를 48시간 동안 인큐베이션한 후, TJR100259에서의 센스 가닥이 AD81890에서의 센스 가닥과 TRD007970에서의 센스 가닥보다 더 안정적인 것으로 나타났다.After incubating cynomolgus monkey liver S9 for 48 hours, the TJR100259 sense strand remained at 21.0%, the AD81890 sense strand remained at 12.2%, and the TRD007970 sense strand remained at 8.9%. Data showed that after incubating cynomolgus monkey liver S9 for 48 hours, the sense strand in TJR100259 was more stable than the sense strand in AD81890 and the sense strand in TRD007970.
단일 가닥의 잔여율은 dsRNA의 안정성을 반영할 수 있으며, 잔여율이 높을수록 안정성이 우수하다. 따라서, TJR100259는 AD81890과 TRD007970보다 시노몰구스 원숭이의 간 S9 대사 안정성 실험 조건에서 안정성이 더 우수하다.The single-strand residual rate can reflect the stability of dsRNA, and the higher the residual rate, the better the stability. Therefore, TJR100259 has better stability than AD81890 and TRD007970 under the conditions of the cynomolgus monkey liver S9 metabolic stability test.
표 30. 시노몰구스 원숭이의 간 S9 대사 안정성 분석Table 30. Analysis of liver S9 metabolic stability in cynomolgus monkeys.
실시예 16: 조직 분포 실험Example 16: Tissue distribution experiment
TRD007970, TJR100410 및 TJR100259에 대해 조직 분포 실험을 수행하며, 실험 과정은 다음과 같다:Tissue distribution experiments are performed on TRD007970, TJR100410 and TJR100259, and the experimental process is as follows:
72마리의 수컷 C56BL/6J 마우스(7~8w, Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.)를 약 1주 동안 적응시킨 후 각 군에 24마리씩 3개의 군으로 나누었다. TRD007970, TJR100259 및 TJR100410의 용량은 모두 10mg/kg이며, 투약 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 72시간, 168시간(n=3)에 샘플을 수집하였다. 안락사 후 심장에서 혈액을 채취하고, 왼쪽 신장과 왼쪽 간에서 가장 큰 잎을 채취하고, 수집한 장기를 생리 식염수로 세척하였다. 간 및 신장 샘플을 전처리한 후 고분해능 질량분석법을 사용하여 간 및 신장의 AS 가닥 농도를 분석하여 TRD007970, TJR100259 및 TJR100410의 농도를 특성화하였다.Seventy-two male C56BL/6J mice (7-8w, Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.) were acclimatized for about 1 week and then divided into three groups with 24 mice in each group. The doses of TRD007970, TJR100259, and TJR100410 were all 10 mg/kg, and samples were collected at 0.5 hours, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 24 hours, 72 hours, and 168 hours (n=3) after administration. After euthanasia, blood was collected from the heart, the largest leaf was collected from the left kidney and left liver, and the collected organs were washed with physiological saline solution. After pretreatment of liver and kidney samples, the AS strand concentration in liver and kidney was analyzed using high-resolution mass spectrometry to characterize the concentrations of TRD007970, TJR100259, and TJR100410.
실험 결과는 표 31을 참조한다. 결과는 C56BL/6J 마우스의 조직 분포 실험에서 TRD007970, TJR100259 및 TJR100410 안티센스 가닥 간 및 신장 노출 비율이 각각 9.44, 29.38 및 3.49인 것으로 나타난다. 간 및 신장 노출 비율이 크다는 것은 온-표적 기과(간장)의 농도가 높고 비표적 기관(신장)의 농도가 낮다는 것을 제시한다. 따라서 동일한 용량에서 TJR100259는 TRD007970보다 높은 간-신장 비율을 나타내고, TRD007970은 TJR100410보다 높은 간-신장 비율을 나타내며, 이는 TJR100259의 신장 독성 발생 위험이 TRD007970보다 낮고, TRD007970의 신장 독성 발생 위험이 TJR100410보다 낮다는 것을 지시한다.See Table 31 for experimental results. The results show that the TRD007970, TJR100259 and TJR100410 antisense interstrand and renal exposure ratios are 9.44, 29.38 and 3.49, respectively, in tissue distribution experiments in C56BL/6J mice. Large liver and kidney exposure ratios suggest high concentrations in on-target organs (liver) and low concentrations in non-target organs (kidneys). Therefore, at the same dose, TJR100259 has a higher liver-kidney ratio than TRD007970, and TRD007970 has a higher liver-kidney ratio than TJR100410, which means that the risk of developing nephrotoxicity of TJR100259 is lower than that of TRD007970, and the risk of developing nephrotoxicity of TRD007970 is lower than that of TJR100410. Instructs that
표 31. 조직 분포 결과Table 31. Tissue distribution results
실시예 17: 간 균질액 안정성Example 17: Liver Homogenate Stability
TJR100410과 TJR100259의 간 균질액 안정성을 분석하며, 실험 과정은 다음과 같다:The liver homogenate stability of TJR100410 and TJR100259 was analyzed, and the experimental process was as follows:
1. Apricot로 시노몰구스 원숭이의 간 균질액(실험 단위 Wuxi Apptec에서 제공)을 190μL/웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션하였다.1. Cynomolgus monkey liver homogenate (provided by the experimental unit Wuxi Apptec) was added to Apricot at 190 μL/well and the plate was incubated at 37°C for approximately 30 minutes.
2. 기질 웰을 제외하고 각 플레이트의 각 웰(T0, T1, T2, T4, T6, T24, T48, 표 32)에 10μL dsRNA 또는 대조 완충 용액을 첨가하고 타이밍을 시작하였다.2. 10 μL dsRNA or control buffer solution was added to each well of each plate (T0, T1, T2, T4, T6, T24, T48, Table 32) except for the substrate well, and timing was started.
표 32. 각 시점 표Table 32. Table at each time point
2.1 샘플 준비2.1 Sample preparation
(1) 지정된 웰에 dsRNA 200μL을 첨가한다.(1) Add 200 μL of dsRNA to the designated well.
(2) Clarify OTX 용해 완충액 1000μL을 첨가한다.(2) Add 1000 μL of Clarify OTX lysis buffer.
(3) 800rpm의 속도로 5분 동안 진탕한다.(3) Shake for 5 minutes at a speed of 800 rpm.
2.2, SPE2.2, S.P.E.
(1) 조건: Phenomenex Clarity OTX SPE 플레이트(8e-s103-cga)를 통해 MeOH 600μL로 세척한다.(1) Conditions: Wash with 600 μL of MeOH through Phenomenex Clarity OTX SPE plate (8e-s103-cga).
(2) 평형: SPE 플레이트를 통해 600μL의 평형 완충액(pH 5.5의 50mM NH4Ac는 0.0025% Triton X-100 및 0.01mg/mL의 시스테인이 함유됨)으로 세척한다.(2) Equilibration: Wash with 600 μL of equilibration buffer (50mM NH4Ac at pH 5.5 containing 0.0025% Triton X-100 and 0.01 mg/mL of cysteine) through the SPE plate.
(3) 로딩: SPE 플레이트를 통해 2.1의 샘플을 세척한다.(3) Loading: Wash the sample from 2.1 through the SPE plate.
(4) 세척 1: 세척 완충액 1(25mM NH4Ac pH 5.5) 600μL을 고체상 추출 플레이트를 통해 세척하고 상술한 단계를 다시 반복한다.(4) Wash 1: Wash 600 μL of Wash Buffer 1 (25mM NH4Ac pH 5.5) through the solid phase extraction plate and repeat the above-mentioned steps again.
(5) 세척 2: 세척 완충액 2(25mM NH4Ac pH 5.5, 50% CAN) 600μL을 고체상 추출 플레이트를 통해 세척하고 상술한 단계를 다시 반복한다.(5) Wash 2: Wash 600 μL of Wash Buffer 2 (25mM NH4Ac pH 5.5, 50% CAN) through the solid phase extraction plate and repeat the above-mentioned steps again.
(6) 용리: 용리 완충액 150μL(100mM NH4HCO3, 1mM TCEP pH 9.5는 40% ACN 및 10% THF가 함유됨)으로 샘플을 용리하고 이 단계를 반복한다.(6) Elution: Elute the sample with 150 μL of elution buffer (100mM NH4HCO3, 1mM TCEP pH 9.5 containing 40% ACN and 10% THF) and repeat this step.
(7) N2 증발기를 사용하여 샘플을 45℃에서 건조시킨다(약 2시간).(7) Dry the sample at 45°C using an N2 evaporator (about 2 hours).
(8) 70μL의 이동상 A로 샘플을 재조합한다. 51(8) Reconstitute the sample with 70 μL of mobile phase A. 51
(9) LC-MS/MS 분석 전에 800rpm의 속도로 0.5시간 동안 부드럽게 진탕한다.(9) Before LC-MS/MS analysis, shake gently for 0.5 hours at a speed of 800 rpm.
(10) 다음 공식을 사용하여 계산한다.(10) Calculate using the following formula.
Ct=C0*e-ke*t Ct=1/2C0 T1/2=Ln2/(-ke)=0.693/(-ke).Ct =C0 *e-ke*t Ct =1/2C0 T1/2 =Ln2/(-ke )=0.693/(-ke ).
여기서, TJR100410는 대조 dsRNA이고, 이의 센스 가닥은:Here, TJR100410 is a control dsRNA, whose sense strand is:
GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG1(SEQ ID NO: 53);GmsUmsGmUmGmCmAfCfUfUmCmGmCmUmUmCmAmCmCm-NAG1 (SEQ ID NO: 53);
안티센스 가닥은:The antisense strand is:
AmsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm(SEQ ID NO: 54);AmsGfsUmGfAmAf(-)hmpNA(G)CmGmAfAmGfUmGfCmAfCmAfCmsGmsGm (SEQ ID NO: 54);
NAG1의 구조는이다.The structure of NAG1 is am.
실험 결과는 표 33를 참조한다.See Table 33 for experimental results.
결과에 따르면, 시노몰구스 원숭이의 간 균질액을 48시간 동안 인큐베이션한 후, TJR100259에서의 안티센스 가닥은 94.6%로 잔여하고; TJR100410에서의 안티센스 가닥은 42.7%로 잔여하며; TJR100259에서의 센스 가닥은 18.3%로 잔여하고, TJR100410에서의 센스 가닥은 4.3%로 잔여한 것으로 나타난다. 데이터에 따르면, 시노몰구스 원숭이의 간 균질액을 48시간 동안 인큐베이션한 후, TJR100259에서의 안티센스 가닥은 TJR100410에서의 안티센스 가닥보다 더 안정적이고; TJR100259에서의 센스 가닥은 TJR100410에서의 센스 가닥보다 더 안정적인 것으로 나타난다.According to the results, after incubating cynomolgus monkey liver homogenate for 48 hours, the antisense strand in TJR100259 remained at 94.6%; The antisense strand in TJR100410 remains at 42.7%; The sense strand in TJR100259 appears to remain at 18.3%, and the sense strand in TJR100410 appears to remain at 4.3%. According to the data, after incubating cynomolgus monkey liver homogenates for 48 hours, the antisense strand in TJR100259 is more stable than the antisense strand in TJR100410; The sense strand in TJR100259 appears to be more stable than the sense strand in TJR100410.
단일 가닥의 잔여율은 dsRNA의 안정성을 반영할 수 있으며, 잔여율이 높을수록 안정성이 우수하다. 따라서, TJR100410에 비해 TJR100259는 시노몰구스 원숭이의 간 균질액이 실험 조건에서 안정성이 더 우수하다.The single-strand residual rate can reflect the stability of dsRNA, and the higher the residual rate, the better the stability. Therefore, compared to TJR100410, TJR100259 has better stability in cynomolgus monkey liver homogenate under experimental conditions.
표 33. 시노몰구스 원숭이의 간 균질액의 안정성 분석Table 33. Stability analysis of cynomolgus monkey liver homogenate.
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