KR20210058334A - 혈관외피줄기세포 배양액 또는 사이클로필린 a를 포함하는 아셔만 증후군 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군(Asherman syndrome) 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

혈관외피줄기세포 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는 아셔만 증후군 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING ASHERMAN SYNDROME COMPRISING PERIVASCULAR STEM CELL MEDIUM OR CYCLOPHILIN A}

본 발명은 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군(Asherman syndrome) 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

아셔만 증후군은 자궁내강유착증(子宮內腔癒着症)으로도 알려져 있으며, 자궁내막기저층의 박탈(剝奪), 결손이 생기고 자궁강의 부분적 또는 광범한 유착이 발생된 것으로, 불임증, 습관성 유산이나 조산, 무월경, 과소월경, 월경곤란증 등이 증상으로 나타난다.

치료방법으로 경질 또는 개복에 의한 유착박리, 자궁내피임기구(IUD)의 삽입, 호르몬제 투여 등이 있으나, 수술 후 상당수 자궁 내 재유착이 발생하게 되어 여러 번의 수술을 필요로 하기도 한다. 또한, 중증의 경우 반복적 수술을 필요로 하기도 하며, 임신이 불가능하게 되기도 한다.

또한, 통증완화를 위해 진통제, 소염제를 사용하는 보존적 요법, 및 다나졸(danazol), 프로게스테론(progesterone), 성선자극호르몬분비호르몬(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)을 사용하여 생리주기를 제어하는 호르몬치료 요법이 수행되고 있으나 이들은 근본적 치료법이 아닌 증상의 개선일 뿐인 한계점이 있으며, 이들 호르몬의 장기적 사용은 여러 가지 부작용(체중의 증가, 수분 축적, 피로, 여드름, 지성 피부, 조모증, 위축성 질염, 안면 홍조, 근육 경련, 불안정한 감정 상태, 간세포 독성)을 야기하고, 재발률도 매우 높다.

자궁유착은 극심한 통증으로 인해 일상 생활에 불편함을 발생시키며, 심한 경우 불임에까지 이르는 질환으로써, 여성의'삶의 질'과 '임신'의 문제에서 심각하게 인식되어야 하고 반드시 극복해야 할 질병임에도 불구하고 아직까지 근본적인 예방 및 치료방법이 존재하지 않으며, 관련 연구도 부족한 실정이다. 이에 따라, 단순 대증요법이 아닌 근본적인 치료가 가능한 치료용 조성물의 개발이 요구되고 있다.

미국공개특허 제2017-0128492호

본 발명의 목적은 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군(Asherman syndrome) 및/또는 아셔만 증후군 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈관외피줄기세포 배양액 또는 사이클로필린 A를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관외피줄기세포 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증의 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군(Asherman syndrome) 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, “혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액”은 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell)를 배지에서 배양하여 수득한 액을 말하며, 상기 배지는 혈청 배지, 무혈청 배지 등 세포를 배양할 수 있는 모든 형태의 배지를 말한다.

상기 배양액은 혈관외피줄기세포를 배양하면서 세포로부터 분비되어 나오는 성장인자(growth factor), 단백질 등을 포함할 수 있으며, 상기 단백질에는 사이클로필린 A가 포함될 수 있다.

또한, 상기 혈관외피줄기세포 배양액에는 혈관외피줄기세포가 포함되거나 포함되지 않은 형태 모두를 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 혈관외피줄기세포 배양액은 혈관외피줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 수득한 것일 수 있다. 일 예로, 혈관외피줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 조건배지(conditioned medium)를 수득하여 사용할 수 있으며, 상기 조건배지는 세포를 액체 현탁 배양하여 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 분열세포를 원심분리 또는 여과하여 제거하고 배양액만 채취하여 이를 배양기질에 혼합한 배지를 말한다.

본 발명 일 실시예에서는 상기 혈관외피줄기세포 배양액을 투여한 경우, 섬유화가 억제되며(도 2), 자궁조직 내에서 혈관내피세포 표지인자의 발현이 증가하고(도 9), 자궁 내 대식세포의 극성을 조절함으로써 혈관신생을 촉진함을 확인하였는 바(도 14 내지 도 18), 본 발명의 혈관외피줄기세포 배양액은 섬유화를 억제하고 혈관신생을 촉진함으로써 아셔만 증후군, 이의 관련 증상 및 합병증에 대한 예방, 치료 또는 개선 용도로 활용될 수 있다.

본 발명에서, “사이클로필린 A(Cyclophilin A)”은 면역억제 사이클로스포린 A(immunosuppressant Cyclosporin A, CsA)에 높은 친화력(high affinity)을 갖는 단백질로서, 이뮤노필린 패밀리(immunophilin family)에 속하는 도처에 편재한다. 사이클로필린 A의 기능은 암세포 저항, 알츠하이머 질환, C형 간염에 대한 치료 용도로 연구된 바 있으며, 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell)에서 성장 인자와 같은 역할을 하는 것으로도 보고된 바 있다.

본 발명 일 실시예에서는 사이클로필린 A를 투여한 경우, 자궁 내 섬유화가억제됨을 확인하였으며(도 6), 아셔만 증후군 생쥐모델에서 착상률 및 배아발달이 모두 개선됨을 확인하였다(도 7 및 도 8). 이에 따라, 본 발명의 사이클로필린 A는 아셔만 증후군, 이의 관련 증상 및 합병증에 대한 예방, 치료 또는 개선 용도로 활용될 수 있다.

본 발명에서, “아셔만 증후군(Asherman syndrome)”은 자궁내막 기저층이 떨어지고 정상적인 재생이 어려워지면서 자궁에 유착이 생긴 것을 말한다. 자궁내막소파술, 자궁경부 원추형 생검술, 전기소작술 등의 수술 병력이 있는 환자, 골반염, 자궁 내 피임장치 등으로 인한 감염 등 여러 종류의 감염으로 인해 자궁내막의 섬유화, 자궁경관의 손상, 자궁내막의 파괴, 자궁강의 유착이 나타나며, 이로 인하여 월경의 감소, 무월경, 자궁통증 등이 발생하는 일련의 증상을 모두 포함한다. 또한, 중증의 아셔만 증후군이 있는 경우, 불임이 생길 수 있으며, 중증의 아셔만 증후군은 난치성 난임의 원인으로 보고된 바 있다. 자궁 내에서의 아셔만 증후군 병변은 자궁파열, 생리 장애, 무월경, 불임 등의 합병증과 동반되는 경우가 많다.

구체적으로, 상기 약학적 조성물은 HIF-1α(hypoxia inducible transcriptional factor 1α) 안정제(stabilizer)를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 HIF-1α 안정제는 디메틸옥살로글리신(dimethyloxaloylglycine, DMOG)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명 일 실시예에서는 HIF-1α 안정제 중 하나인 디메틸옥살로글리신이 추가된 경우, 착상률이 증가하고(도 11), 배아발달이 촉진되는 것을 확인하였다(도 12).

또한 구체적으로, 본 발명 일 실시예에서는 사이클로필린 A를 투여한 경우, 자궁 내 섬유화가 억제됨을 확인하였는 바(도 6), 본 발명의 조성물은 섬유화를 억제하는 것일 수 있다.

또한 구체적으로, 본 발명 일 실시예에서는 혈관내피세포 표지인자의 발현이 증가함을 통해 혈관이 신생되는 것을 확인하였으며(도 9), 자궁 내 대식세포의 극성을 조절함으로써 혈관신생을 촉진함을 확인하였는 바(도 14 내지 도 18), 본 발명의 조성물은 혈관신생을 촉진하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, “아셔만 증후군 합병증”은 아셔만 증후군에 의해 동반된 모든 증상 및 질환을 말한다. 구체적으로, 상기 아셔만 증후군 합병증은 자궁유착, 자궁근종, 자궁내막증, 자궁외 임신유산, 난소낭종, 생리장애, 난임, 불임, 골반유착, 골반통 및 골반염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명 일 실시예에서는 혈관외피줄기세포 배양액 또는 사이클로필린 A를 투여한 경우, 자궁 내 섬유화가 억제됨을 확인하였으며(도 6), 아셔만 증후군 생쥐모델에서 착상률 및 배아발달이 모두 개선됨을 확인하였다(도 7 및 도 8). 또한, 혈관내피세포 표지인자의 발현이 증가함을 통해 혈관이 신생되는 것을 확인하였으며(도 9), 자궁 내 대식세포의 극성을 조절함으로써 혈관신생을 촉진함을 확인하였다(도 14 내지 도 18).

상기와 같은 결과는 본 발명 조성물이 자궁 내 섬유화를 억제시키고, 자궁내막 재생을 촉진할 뿐 아니라 신생혈관 생성을 촉진함으로써 아셔만 증후군 및 아셔만 증후군의 자궁내막 섬유화, 조직 손상 등에 의한 합병증에까지 예방, 치료 또는 개선 효과를 나타낼 수 있음을 나타내는 것이다.

또한 구체적으로, 상기 조성물은 HIF-1α 안정제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. HIF-1α 안정제는 상기 설명된 바와 같다.

본 발명의 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 칼슘 카보네이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제의 예로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 있으며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로즈 또는 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은 단독으로, 또는 공지의 아셔만 증후군에 대한 치료제를 병용 투여하거나 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용하여 치료 효과를 증대시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

상기 “개체”는, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증을 가진 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 치료방법은 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 즉, 인간의 경우 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증을 가지는 것을 고려할 때, 인간의 치료에 있어서도 충분히 사용될 수 있다.

상기 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 혈관외피줄기세포 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

또한, 상기 식품 조성물은 아셔만 증후군 합병증을 개선시킬 수 있으며, 구체적인 아셔만 증후군 합병증은 상기 설명한 바와 같다.

구체적으로, 상기 혈관외피줄기세포 배양액은 혈관외피줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 수득한 것일 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 조성물은 HIF-1α 안정제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

혈관외피줄기세포 배양액, HIF-1α 안정제 등은 상기 설명된 바와 같다.

상기 “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증을 예방 또는 개선하기 위하여 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 질환 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물은 아셔만 증후군 자궁 내 섬유화를 개선하고 혈관신생을 촉진함으로써 아셔만 증후군 및/또는 아셔만 증후군 합병증에 대해 우수한 치료 효과를 나타내어 수술, 호르몬 요법 외 새로운 요법으로 활용될 수 있다.

또한, 자궁 내 대식세포의 극성 조절과 혈관신생 촉진 효과를 나타냄으로써 자궁내막 관련 질환에 광범위하게 적용될 수 있으며, 나아가 난임 또는 불임 치료용도로도 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 2-dimensional electrophoresis(2-DE)-LC/MS 기반 혈관외피줄기세포(PVCs), 골수유래중간엽줄기세포(BM-MSCs), 피부섬유세포(negative control)의 배양액 내 분비단백체 (secretome) 분석 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 아셔만 증후군 자궁에서의 섬유화 및 세포증식에 대한 혈관외피줄기세포 배양액의 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 LC/MS를 이용한 후보 유효 분비단백체 분석 및 CYP-A(사이클로필린 A) 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 웨스턴블롯을 이용한 CYP-A 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 아셔만 증후군 생쥐모델에 혈관외피줄기세포 배양액 투여 후 CYP-A 및 CD147 (CYP-A receptor)의 발현 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 CYP-A 투여에 의한 섬유화지표 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 CYP-A 투여에 의한 착상률 영향평가 결과를 나타낸 것이다(임신 12일째, I.S; implantation site).
도 8은 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 CYP-A 투여에 의한 배아발달 영향평가 결과를 나타낸 것이다(임신 12일째).
도 9는 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 혈관외피줄기세포 배양액 및 CYP-A 투여 후 자궁조직 내 혈관내피세포 표지인자 발현 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 혈관외피줄기세포 배양액 및 CYP-A 투여 후 자궁조직 내 CD31 발현 및 세포증식 영향 평가결과를 나타낸 것이다.
도 11은 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 HIF-1α을 매개로 한 CYP-A에 의한 착상률을 평가한 결과를 나타낸 것이다(임신 12일째).
도 12는 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 HIF-1α을 매개로 한 CYP-A에 의한 배아발달을 평가한 결과를 나타낸 것이다(임신 12일째).
도 13은 아셔만 증후군 생쥐모델에서 CYP-A의 자궁조직 내 투여가 임신 후 산자수에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 아셔만 증후군 생쥐모델에서 CYP-A 처리에 의한 자궁 내 대식세포 (F4/80, CD11b)의 양적 변화를 확인한 것이다.
도 15는 아셔만 증후군 생쥐모델에서 CYP-A 처리에 의한 자궁 내 대식세포 극성 관련 표지인자 (M1,iNOS, CD80, Il-12; M2,Arg-1, CD206, Il-10) mRNA 발현 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 아셔만 증후군 생쥐모델에서 CYP-A 처리에 의한 대식세포(M1, F4/80+CD80+; M2, F4/80+CD206+) 빈도 변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 대식세포 (RAW 264.7)에 대식세포 극성조절 인자(LPS, IFNγ, IL-4) 첨가 및 CYP-A에 의한 극성 조절을 mRNA 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 18은 CYP-A에 의해 극성이 변화한 대식세포(RAW 264.7)와 혈관내피세포 (HUVEC) 공배양 시 혈관신생 영향평가 결과를 나타낸 것이다(Tube formation assay).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell, PVC) 배양액의 제조

1-1. 인간 탯줄로부터 동맥혈관의 분리

37주 이상의 정상적 임신 기간을 거친 산모 및 태아 모두 내/외과적 질환 및 유전 질환이 없는 산모들에게서 제왕절개수술 후 폐기되는 탯줄을 채취하여 수집하였다. 본 과정은 강원대학교 윤리위원회의 승인 하에 해당 산모들의 동의를 받고 이루어졌다. 약 30cm씩 탯줄을 수집하여 멸균 상태의 pH 7.2 인산염 완충 용액(Phosphate Buffered Saline; PBS, Invitrogen)이 담겨져 있는 시험관에 담아 배양실로 운반하였으며, 수집된 탯줄을 멸균된 100U/mL penicillin(Sigma)과 100㎍/mL streptomycin(Sigma)이 첨가된 멸균된 PBS로 3회 수세(washing)하여 가능한 많은 탯줄 혈액을 제거한 후, 탯줄의 결합조직인 와튼 젤리(Wharton's jelly)를 제거하여 2개의 배꼽 동맥(umbilical artery)을 분리하였다.

1-2. 혈관외피세포(PVC)의 분리 및 배양

상기 1-1에 의해 분리된 배꼽 동맥혈관을 20% Fetal Bovine Serum(FBS,Invitrogen), 100U/mL penicillin, 100㎍/mL streptomycin, 2mM L-glutamine(Invitrogen)가 첨가된 α-Minimum Essential Medium(α-MEM; Invitrogen)이 포함된 배양접시에 옮겨 14일 동안 배양하였다. 동맥혈관으로부터 이동하여 형성된 혈관외피세포(perivascular cell, PVC) 군집을 0.125% trypsin-EDTA 1 mM(Sigma)을 처리하여 분리하였다. 상기 분리된 혈관외피세포를 PBS를 이용하여 2회 수세한 후 상기 배지에서 37℃의 온도 및 5% CO₂의 습윤 환경하에 계대배양하였다. 배양접시의 80-90% 정도의 밀집도(confluence)로 세포가 자라면 0.125% trypsin-EDTA 1mM을 첨가하여 세포를 떼어낸 후 PBS로 수세하여 배양접시 1cm² 당 2 x 10³개의 세포를 넣어 계대배양하고, 24시간 간격으로 새로운 배지로 교체하였다

1-3. 혈관외피세포를 이용한 무혈청 조건배지(conditioned medium, CM) 제조

상기 1-2에서 계대배양하여 증식된 혈관외피세포를 PBS 수세 후 무혈청배지인 Stemline^ⓡ II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium(Sigma)에서 배양하였다. 배양 시 온도는 37℃를 유지하고, 5% CO₂의 습윤 환경에서 배양하였다. 배양접시의 80-90% 정도의 밀집도(confluence)로 세포가 자라면 0.125% trypsin-EDTA 1 mM을 첨가하여 세포를 떼어낸 후 PBS로 수세하여 배양접시 1cm² 당 2 x 10³의 세포를 넣어 계대배양하고, 24시간 간격으로 새로운 배지로 교체하였으며, 배양액을 회수하였다. 회수된 배양액은 0.22 ㎛의 필터를 이용해 세포부유물을 여과 후 무혈청 조건배지를 완성하여 -80℃에 동결보존 하였다.

실시예 2. 사이클로필린 A(CYP-A)의 동정

2-1. 배양액을 이용하여 LC/MS 수행 및 분비단백체 분석

상기 1-2에서 확보한 무혈청 혈관외피줄기세포 배양액에 존재하는 단백질을 동정하기 위해서 질량분석법 기반 프로테오믹스 (LC/MS)를 수행하였다. 단백질 동정을 위해서 단백질을 펩타이드로 만들어준 후 질량분석기를 이용하여 펩타이드들의 mass 데이터를 얻었다. 이렇게 얻은 펩타이드의 mass 정보와 데이터베이스에 존재하는 펩타이드들의 이론적인 mass 정보를 비교하여 가장 유사한 후보를 찾아낸 후, 후보 펩타이드를 포함하는 단백질을 데이터베이스내의 정보와 비교 분석하여 동정하였다. 동정된 단백질은 도 3에 나타난 바와 같으며, 사이클로필린 A(CYP-A)이 동정되었다.

2-2. 배양액 및 세포에서 LC/MS 검증을 통한 CYP-A 동정

상기 1-3의 무혈청 조건에서 배지 제조 방법으로 분석에 필요한 배지를 확보하여, 2-1에서 LC/MS로 확인된 분비단백체에 대한 검증실험을 수행하였다. 검증실험을 수행하기 위해서 계대배양시 사용하는 배지에서 자란 세포(도 4a), 무혈청배지에서 자란 세포(도 4b) 및 무혈청배지(도 4c)를 확보하였고, 이들을 이용하여 웨스턴 블랏을 진행하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 LC/MS 결과와 일치하게 혈관외피세포를 배양한 무혈청배지에서 CYP-A의 발현이 유의적으로 높게 나타남을 확인하였다.

실시예 3. 아셔만 증후군 생쥐모델의 제작

8주령 암컷 생쥐를 사용하여 아셔만 증후군 생쥐 모델을 만들었다. 이 연구는 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC, 승인 번호 160100)의 승인을 받아 실험을 진행하였다. 실험 동물에 대한 제도적 지침에 따라, 생쥐는 매일 12 시간 동안 온도 및 조명 제어 조건하에 차의과학대학교 실험동물센터에서 관리하였다. 복강 내 주사로 마취제(Avertin)를 투여한 후, 생쥐 외/내피를 수직 절개를 하고 자궁을 노출시켰다. 난관 접합부에 위치한 자궁에 작은 절개를 한 후, 자궁 내에 26 게이지 바늘을 삽입 및 회전을 통해 외상을 유도한 뒤 회수하였다. 섬유증을 평가하기 위해 바늘을 이용한 외상을 수행한 초기 실험에서, 섬유화 유도 후 3일, 7일, 14일차에 생쥐 자궁을 절취하여 손상정도를 확인하였다.

실험예 1. 아셔만 증후군 생쥐모델에서의 혈관외피줄기세포 배양액 투여 후 CYP-A 및 CD147(CYP-A receptor)의 발현 분석

상기 실시예 3의 방법으로 아셔만 증후군 생쥐 모델을 유도한 뒤 7일 후 상기 실시예 1-3에서 확보한 무혈청 혈관외피줄기세포 배양액을 투여하였다. 배양액을 투여한 후 7일차에 생쥐 자궁을 절취하고, 웨스턴 블랏을 이용하여 CD147의 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 세포 수준에서 확인한 결과 상기 실시예 2-2와 유사하게 동물 수준에서도 무혈청 혈관외피줄기세포 배양액을 투여한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 CYP-A의 양이 증가함을 웨스턴 블랏을 통해서 확인하였다. 또한 CYP-A의 수용체로 알려진 CD147의 양 또한 증가함을 확인하였다.

실험예 2. CYP-A 투여에 의한 섬유화지표 변화 분석

상기 실시예 1에서 투여한 무혈청 혈관외피줄기세포 배양액을 대신하여 이의 분비단백체로 확인된 CYP-A를 동일한 시점에 주입하였다. 이를 웨스턴 블랏을 통하여 섬유화 관련 인자인 COL1A1, TGFβ1을 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 상기 섬유화 관련 인자들의 발현이 CYP-A를 주입한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 현저하게 감소함을 확인하였으며, CYP-A를 투여한 경우에도 혈관외피줄기세포 및 무혈청 혈관외피줄기세포 배양액을 투여시와 유사한 효과를 보임을 확인하였다.

실험예 3. CYP-A 투여에 의한 착상률 및 배아발달 영향평가

상기 실험예 2에서 확인한 조직학적 개선효과를 기반으로 기능적 개선효과를 확인하고자 아셔만 증후군 생쥐 모델 유도 후 7일차에 CYP-A를 투여하였다. 이후 7일 뒤에 숫컷 생쥐와의 교배를 위해 합사를 시작하였고, 정상적인 교배 후 암컷의 생식기에서 관찰되는 플러그를 매일 아침 확인하였다. 플러그가 확인된 날을 1일로 하였을 때, 임신 12일차(임신 중기)에 착상된 배아의 수와 무게를 관찰하였다. 임신 12일차 오전에 CO₂를 이용하여 생쥐를 희생시키고, 복부면에서 외/내피를 수직 절개하여 자궁을 완전히 노출시켰다. 자궁에 착상된 배아의 수를 파악하여 그래프화 하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 혈관외피줄기세포 배양액(PVCs) 또는 CYP-A를 투여한 경우 아셔만 증후군 생쥐 모델에서 자궁에 착상된 배아의 수가유의적으로 증가되었음을 확인하였다.

또한, 자궁 내에 있는 배아를 양막과 태반으로부터 분리하여 무게 측정 후 그래프화 하였으며, 도 8에 나타난 바와 같이, 혈관외피줄기세포 배양액(PVCs) 또는 CYP-A를 투여한 경우 아셔만 증후군 생쥐 모델에서 배아의 무게(embryo weight)가 유의하게 증가되었음을 확인하였다.

실험예 4. 혈관외피줄기세포 배양액 및 CYP-A 투여 후 자궁조직 내 혈관내피세포 표지인자 발현 측정

상기 실험예 2에서 섬유화 감소가 확인된 혈관외피줄기세포 배양액 또는 CYP-A를 주입한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 혈관세포증식과 관련된 표지인자들의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

혈관세포증식 관련 표지인자로 HIF-1α, HIF-2α, VEGF, ANG-1, pTIE-2 및 CD31을 확인하였으며, 그 결과 도 9에 나타난 바와 같이 혈관세포증식과 관련된 표지인자들의 발현이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다.

실험예 5. 혈관외피줄기세포 배양액 및 CYP-A 투여 후 자궁조직 내 CD31 발현 및 세포증식 영향 평가

상기 실험예 4와 동일한 조건하에 혈관세포의 증식을 확인하고자 혈관세포에서 발현하는 CD31과 증식하는 세포에서 발현하는 KI67 항체를 이용하여 면역형광염색을 수행하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 혈관외피 줄기세포 배양액 또는 CYP-A를 주입한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 세포 증식이 왕성하게 일어나는 것을 KI67 항체의 발광을 통해서 확인하였으며, 특히 CD31이 발현하는 혈관세포의 증식이 유의적으로 증가함을 확인하였다.

실험예 6. HIF-1α을 매개로 한 혈관외피줄기세포 배양액 및 CYP-A에 의한 착상률 및 배아발달 평가

상기 실험예 3과 동일한 방법으로 본 실험을 수행하였다. HIF-1α의 중요성을 확인하고자 HIF-1α 억제제인 Echinomycin(EC)와 안정제인 Dimethyloxaloylglycine (DMOG)를 이용하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, EC에 의해서 HIF-1α가 억제된 경우, 혈관외피줄기세포 배양액을 주입하여도 착상된 배아의 수가 현저하게 감소한 것을 확인하였다.

반면, DMOG를 통해 HIF-1α를 안정화한 경우, 혈관외피줄기세포 배양액 또는 CYP-A의 시너지 효과로 착상된 배아의 수가 유의적으로 증가함을 확인하였다.

또한, 도 12에 나타난 바와 같이 HIF-1α가 억제된 경우, 혈관외피줄기세포 배양액을 주입하여도 배아의 무게가 유의하게 감소한 것을 확인하였다.

반면, DMOG를 통해 HIF-1α를 안정화한 경우, 혈관외피줄기세포 배양액 또는 CYP-A의 시너지 효과로 착상된 배아의 수가 유의적으로 증가함을 확인하였다.

실험예 7. CYP-A의 자궁조직 내 투여에 의한 임신 후 산자수(litter size)에 미치는 영향 평가

상기 실험예 6과 유사하게 CYP-A를 투여한 뒤 7일 후에 숫컷 생쥐와 교배를 시작하여 출산까지 유도하였다. 교배가 확인된 날을 1일로 하였을 때, 임신 18-19일차에 출산이 이루어졌으며 산자수(litter size)를 확인하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 HIF-1α 안정제인 DMOG 를 함께 주입한 경우, CYP-A와의 시너지 효과에 의해 산자수가 유의적으로 증가함을 확인하였다.

실험예 8. CYP-A에 의한 대식세포(macrophage) 유입(infiltration) 및 극성(polarity) 조절 확인

8-1. CYP-A에 의한 대식세포의 유입 조절

CYP-A를 주입한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 대식세포의 유입을 확인하였다. 자궁 조직을 하나의 세포단위로 분리한 후 형광물질이 탐침된 대식세포의 대표항체(F4/80, CD11b)를 부착하고, 유세포 분석법을 이용하여 특정 항체에 반응하여 항체 특이적 형광물질을 발광하는 각각의 세포를 분류 및 집단화하였다. 프로그램에서 히스토그램을 만들어서 형광물질에 기초하여 분류된 세포들을 좌표로 나타냈으며, 전체 세포 중 각 집단의 비중을 퍼센트로 표기하였다.

그 결과, 도 14에서 나타난 바와 같이 CYP-A를 주입한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 대식세포의 유입양이 증가함을 확인하였다.

8-2. CYP-A에 의한 대식세포 극성 조절

CYP-A를 주입한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 대식세포의 M1/M2 극성을 대표하는 인자들의 발현을 확인하였다. M1 대식세포의 대표인자로 iNOS, CD80, Il-12가 사용되었고, M2 대식세포의 대표인자로 Arg1, CD206, Il-10이 사용되었다. 실시간 RT-PCR을 통해서 mRNA 수준을 확인하였으며, RT-PCR 사용시 이용한 프라이머는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 CYP-A를 주입한 아셔만 증후군 생쥐 모델의 자궁에서 M1 대식세포의 대표인자들의 발현은 감소하고, M2 대식세포의 대표인자들의 발현은 증가함을 확인하였다.

또한, 자궁 조직을 하나의 세포단위로 분리한 후 형광물질이 탐침된 M1/M2 대식세포의 대표항체(F4/80, CD80, CD2016)를 부착하고, 유세포 분석법을 이용하여 특정 항체에 반응하여 항체 특이적 형광물질을 발광하는 각각의 세포를 분류 및 집단화하였다. 프로그램에서 히스토그램을 만들어서 형광물질에 기초하여 분류된 세포들을 좌표로 나타내었으며, 전체 세포 중 각 집단의 비중을 퍼센트로 표기하였다.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 CYP-A를 주입한 경우, 침윤 단핵구(infiltrated monocytes) 또는 대식세포(macrophage)를 M2-유사 표현형을 가지는 대식세포로 분극(polarize)될 수 있음을 확인하였다.

실험예 9. CYP-A에 의한 혈관신생 촉진 확인

상기 8-2와 동일한 생쥐 모델을 이용하여 CYP-A에 의해 대식세포의 극성이 조절됨을 확인하였다. 이를 기반으로 세포 수준에서 지질다당류 (Lipopolysaccharide, LPS)와 인터페론 감마(IFN)로 자극시켜 M1 대식세포를, IL-4로 자극시켜 M2 대식세포를 준비하였다. 대식세포주는 RAW 264.7 세포주를 사용하였다.

그 결과, 도 17에서 나타난 바와 같이 CYP-A에 의해서 M1 대식세포로 유도된 RAW 264.7 세포에서 M2 대식세포로의 변화를 확인하였다. 이는 상기 실험예 8-2와 유사한 결과임을 확인할 수 있다.

상기와 같이 준비된 M1/M2 대식세포를 혈관내피세포(HUVEC)와 공배양 하였으며, 신생혈관생성의 효과를 확인하기 위하여 HUVEC 세포의 튜브 형성을 분석하였다(Tube formation assay). 구체적으로, M1 및 M2의 유사 극성을 유도하고, 형성된 튜브-유사구조의 수를 세었다(도 18 내 녹색 구조). 본 결과는 3중 샘플의 mean ± SEM으로 나타내었다. 또한, 형성된 튜브의 수는 도 18 내의 그래프로 나타내었다.

그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이 M2 대식세포가 혈관내피세포의 혈관신생을 촉진시키며, CYP-A를 처리함에 따라 혈관신생이 촉진되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 조성물은 혈관신생을 촉진함으로써 아셔만 증후군 및 이의 합병증에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 나타내는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation<120> COMPOSITION FOR TREATING ASHERMAN SYNDROME COMPRISING PERIVASCULAR STEM CELL MEDIUM OR CYCLOPHILIN A<130> 19PP30595<160> 12<170> KoPatentIn 3.0<210> 1<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> iNOS forward primer<400> 1ttcacccagt tgtgcatcga ccta 24<210> 2<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> iNOS reverse primer<400> 2tccatggtca cctccaacac aaga 24<210> 3<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> CD80 forward primer<400> 3gctgtgtcgt tcaaaagaag ga 22<210> 4<211> 23<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> CD80 reverse primer<400> 4tgggaaattg tcgtattgat gcc 23<210> 5<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Il-12 forward primer<400> 5tggtttgcca tcgttttgct g 21<210> 6<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Il-12 reverse primer<400> 6ccggagtaat ttggtgcttc ac 22<210> 7<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Arg1 forward primer<400> 7aacacggcag tggctttaac c 21<210> 8<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Arg1 reverse primer<400> 8ggttttcatg tggcgcattc 20<210> 9<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> CD206 forward primer<400> 9tctcccggaa ccgactcttc 20<210> 10<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> CD206 reverse primer<400> 10ggtcgagcac ataggtcttc t 21<210> 11<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Il-10 forward primer<400> 11gctcttgtag acaccttggt 20<210> 12<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Il-10 reverse primer<400> 12gctcttactg actggcatga g 21

Claims (12)

1. 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군(Asherman syndrome) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 혈관외피줄기세포 배양액은 혈관외피줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 수득한 것인, 아셔만 증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 HIF-1α(hypoxia inducible transcriptional factor 1α) 안정제(stabilizer)를 추가로 포함하는 것인, 아셔만 증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 HIF-1 안정제는 디메틸옥살로글리신(dimethyloxaloylglycine, DMOG)인 것인, 아셔만 증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 섬유화를 억제하는 것인, 아셔만 증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 혈관신생을 촉진하는 것인, 아셔만 증후군 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 혈관외피줄기세포(perivascular stem cell) 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 아셔만 증후군 합병증은 자궁유착, 자궁근종, 자궁내막증, 자궁외 임신, 유산, 난소낭종, 생리장애, 난임, 불임, 골반유착, 골반통 및 골반염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 아셔만 증후군 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 제7항에 있어서,
   상기 조성물은 HIF-1α 안정제를 추가로 포함하는 것인, 아셔만 증후군 합병증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
10. 혈관외피줄기세포 배양액 또는 사이클로필린 A를 포함하는, 아셔만 증후군 개선용 식품 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 혈관외피줄기세포 배양액은 혈관외피줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 수득한 것인, 아셔만 증후군 개선용 식품 조성물.
12. 제10항에 있어서,
    상기 조성물은 HIF-1α 안정제를 추가로 포함하는 것인, 아셔만 증후군 개선용 식품 조성물.

Images