KR20210056783A - Method for preparing a composition for evaluating the detection ability of a genetic variation detection means - Google Patents

Abstract

A production method provided as an aspect can produce a composition capable of evaluating the detection ability of a genetic mutation detection means with excellent efficiency. The composition provided as an aspect is used to evaluate whether each genetic mutation detection means can detect various genetic mutations with respect to various expected frequencies. An evaluation method provided as an aspect can effectively evaluate the detection ability of the genetic mutation detection means by using the composition.

Description

Translated fromKorean

유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물의 제조방법{Method for preparing a composition for evaluating the detection ability of a genetic variation detection means}TECHNICAL FIELD [Method for preparing a composition for evaluating the detection ability of a genetic variation detection means}

유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.It relates to a method for producing a composition for evaluating the detection ability of a genetic mutation detection means.

차세대 염기서열 분석(next-generation sequencing, NGS) 혹은 초병렬 염기서열 분석(massively parallel sequencing)은 염기서열 데이터 생산량을 증가시키기 위해 염기서열 분석법을 대규모로 병렬화한 방법이다. 흔히 '차세대 유전체 염기서열 분석'이라 한다. 이전의 거의 모든 염기서열 분석은 생어 분석법(Sanger Sequencing)에 기반하고 있었기 때문에 생어 염기서열 분석을 1세대 염기서열 분석이라 하고, 대략 2005년부터 상용화된 대용량 염기서열 분석법들을 2세대 염기서열 분석이라고 부르기도 한다. 2세대 염기서열 분석법이 상용화되기 이전부터 단일분자 DNA를 실시간으로 염기서열 분석할 수 있는 기술들이 제안되었다는 면에서 2세대 기술과 구분하여 3세대 염기서열 분석법이라고 부르기도 하지만, 여기서는 2세대/3세대 염기서열 분석법을 구분하지 않고 ‘차세대 염기서열 분석’ 혹은 ‘초병렬 염기서열 분석(massively parallel sequencing)’으로 통칭하기도 한다.Next-generation sequencing (NGS) or massively parallel sequencing is a massively parallelized method of sequencing to increase the amount of sequencing data produced. It is often referred to as'next-generation genome sequencing'. Since almost all previous sequencing was based on Sanger Sequencing, Sanger sequencing was called first-generation sequencing, and large-capacity sequencing methods that were commercialized from about 2005 were called second-generation sequencing. Also do. It is sometimes referred to as the third-generation sequencing method, separate from the second-generation technology in that technologies that can sequence single molecule DNA in real time have been proposed before the commercialization of the second-generation sequencing method. The sequencing method is not classified and is collectively referred to as'next-generation sequencing' or'massively parallel sequencing'.

진단 및 연구의 목적으로 NGS가 현재 많이 사용되고 있고, 진단의 목적으로 활용되기 위하여 임상 분야의 다양한 요구에 맞추어 기준 방법 외 다양한 시도들이 이뤄지고 있다. 진단기기로서의 개발 및 활용을 위해서는 변이검출의 성능평가가 중요한데, 진단기기로서 규제기관의 승인을 위해서는 분석적 성능평가 및 임상적 성능평가가 이루어져야 하고, 이를 위해서는 변이가 포함된 평가물질이 필요하다. 따라서, 진단기기 개발 및 관련 규제기관에서의 주기적인 품질관리를 위한 평가물질을 손쉽게 제작할 수 있는 방법이 필요하고, 더불어, 변이빈도를 조절 할 수 있는 평가물질의 제작방법이 요구된다.NGS is currently widely used for diagnostic and research purposes, and various attempts other than the standard method are being made to meet the various needs of the clinical field in order to be used for diagnostic purposes. For development and utilization as a diagnostic device, the performance evaluation of mutation detection is important. For approval by a regulatory agency as a diagnostic device, an analytical performance evaluation and clinical performance evaluation must be performed, and for this, an evaluation material containing the mutation is required. Therefore, there is a need for a method of easily manufacturing an evaluation material for the development of diagnostic devices and periodic quality control in a related regulatory agency, and a method of manufacturing an evaluation material capable of controlling the mutation frequency is required.

한국등록특허 제10-1990953호Korean Patent Registration No. 10-1990953

유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물의 제조방법, 이로부터 제조된 조성물 및 이를 이용한 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가방법을 제공함에 그 목적이 있다.An object thereof is to provide a method for preparing a composition for evaluating the detection ability of a genetic mutation detection means, a composition prepared therefrom, and a method for evaluating the detection ability of a genetic mutation detection means using the same.

일 양태로서, 유전자 변이의 기대 빈도를 설정하는 단계; 상기 유전자 변이를 포함하는 핵산 단편과 상기 유전자 변이를 포함하지 않는 세포주의 gDNA를 수득하는 단계; 및 상기 설정된 기대 빈도에 따라 상기 gDNA 대비 상기 핵산 단편의 몰비를 설정하여 혼합하는 단계를 포함하는 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물의 제조방법을 제공한다.In one aspect, setting an expected frequency of genetic variation; Obtaining a nucleic acid fragment containing the genetic mutation and gDNA of a cell line not containing the genetic mutation; And setting and mixing the molar ratio of the nucleic acid fragment to the gDNA according to the set expected frequency.

상기 유전자 변이는 구체적으로, 유전자 염기서열 상의 변이를 의미하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 염기서열을 구성하는 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실 등일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.The gene mutation may specifically mean a mutation in the gene sequence, and more specifically, may be a substitution, insertion, or deletion of a nucleotide constituting the base sequence, but is not necessarily limited thereto.

상기 유전자 변이는 하나 이상으로서, 1 내지 100, 2 내지 100, 5 내지 90, 8 내지 80, 10 내지 70, 15 내지 60 또는 20 내지 50개일 수 있고, 특별히 그 종류나 수에 제한이 없다.The gene mutation may be one or more, and may be 1 to 100, 2 to 100, 5 to 90, 8 to 80, 10 to 70, 15 to 60, or 20 to 50, and there is no particular limitation on the kind or number thereof.

상기 유전자 변이는 검출하고자 하는 유전자 변이로서 알려진 것이라면 특별히 제한이 없으나, 일 실시예에 따를 때, 암을 유발하는 유전자 변이일 수 있다. 이러한 경우, 상기 제조방법은 암을 유발하는 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물을 제조할 수 있다.The genetic mutation is not particularly limited as long as it is known as a genetic mutation to be detected, but according to an embodiment, it may be a genetic mutation that causes cancer. In this case, the manufacturing method can prepare a composition for evaluating the detection ability of a means for detecting a genetic mutation causing cancer.

상기 유전자 변이는 구체적으로, ABL1 유전자의 E255K, ABL1 유전자의 E255V, ABL1 유전자의 F359C, ABL1 유전자의 F359I, ABL1 유전자의 F359V, ABL1 유전자의 Y253H, ALK 유전자의 C1156Y, ALK 유전자의 D1091N, ALK 유전자의 D1225N, ALK 유전자의 F1174C, ALK 유전자의 F1174L, ALK 유전자의 F1245V, ALK 유전자의 I1171N, BRAF 유전자의 V600E, BRAF 유전자의 V600G, BRAF 유전자의 V600K, BRAF 유전자의 V600M, BRAF 유전자의 V600R, EGFR 유전자의 G719A, EGFR 유전자의 L858R, EGFR 유전자의 L861Q, EGFR 유전자의 T790M, ERBB2 유전자의 D769Y, ERBB2 유전자의 L755S, ERBB2 유전자의 V842I, ESR1 유전자의 D538G, FLT3 유전자의 D835H, FLT3 유전자의 D835Y, GNAQ 유전자의 Q209L, HRAS 유전자의 Q61R, IDH1 유전자의 R132H, IDH2 유전자의 R140Q, JAK2 유전자의 V617F, KIT 유전자의 D816H, KIT 유전자의 D816V, KIT 유전자의 D816Y, KIT 유전자의 L576P, KIT 유전자의 V559D, KIT 유전자의 V560D, KRAS 유전자의 A146T, KRAS 유전자의 G12A, KRAS 유전자의 G12C, KRAS 유전자의 G12D, KRAS 유전자의 G12R, KRAS 유전자의 G12S, KRAS 유전자의 G12V, KRAS 유전자의 G13C, KRAS 유전자의 G13D, MET 유전자의 T1010I, MTOR 유전자의 E1799K, MTOR 유전자의 S2215Y, NRAS 유전자의 G12D, NRAS 유전자의 G13D, NRAS 유전자의 Q61R, PIK3CA 유전자의 E542K, PIK3CA 유전자의 E545K, PIK3CA 유전자의 H1047R, PIK3CA 유전자의 Q546K, PTEN 유전자의 R130G, RET 유전자의 M918T, SMAD4 유전자의 R361H, SMO 유전자의 W535L, EGFR 유전자의 p.E746 A750delELREA, EGFR 유전자의 p.A763 Y764insFQEA, MET 유전자의 c.3062 3082+7del28 및 ERBB2 유전자의 p.A775 G776insYVMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.Specifically, the gene mutations include E255K of the ABL1 gene, E255V of the ABL1 gene, F359C of the ABL1 gene, F359I of the ABL1 gene, F359V of the ABL1 gene, Y253H of the ABL1 gene, C1156Y of the ALK gene, D1091N of the ALK gene, and the ALK gene. D1225N, F1174C of ALK gene, F1174L of ALK gene, F1245V of ALK gene, I1171N of ALK gene, V600E of BRAF gene, V600G of BRAF gene, V600K of BRAF gene, V600M of BRAF gene, V600R of BRAF gene, EGFR gene G719A, EGFR gene L858R, EGFR gene L861Q, EGFR gene T790M, ERBB2 gene D769Y, ERBB2 gene L755S, ERBB2 gene V842I, ESR1 gene D538G, FLT3 gene D835H, FLT3 gene D835Y, GNAQ gene Q209L, Q61R of HRAS gene, R132H of IDH1 gene, R140Q of IDH2 gene, V617F of JAK2 gene, D816H of KIT gene, D816V of KIT gene, D816Y of KIT gene, L576P of KIT gene, V559D of KIT gene, KIT gene V560D, A146T of the KRAS gene, G12A of the KRAS gene, G12C of the KRAS gene, G12D of the KRAS gene, G12R of the KRAS gene, G12S of the KRAS gene, G12V of the KRAS gene, G13C of the KRAS gene, G13D of the KRAS gene, and the MET gene. T1010I, E1799K of MTOR gene, S2215Y of MTOR gene, G12D of NRAS gene, G13D of NRAS gene, Q61R of NRAS gene, E542K of PIK3CA gene, E545K of PIK3CA gene, H1047R of PIK3CA gene, Q546K of PIK3CA gene, PTEN gene R130G, RET gene M918T, SMAD4 gene R361H, SMO gene W535L, EGFR gene p.E746 A750delELREA, EGFR gene p.A763 Y764insFQEA, MET gene c.3062 3082+7del28 and ERBB2 gene p. .A775 G776insYVMA may be one or more selected from the group consisting of, but is not necessarily limited thereto.

상기 유전자 변이에 있어서, 변이의 수는 복수개일 수 있고, 이러한 경우, 상기 기대 빈도는 유전자 변이 각각의 기대 빈도일 수 있다.In the genetic mutation, the number of mutations may be plural, and in this case, the expected frequency may be an expected frequency of each of the genetic mutations.

상기 유전자 변이의 수가 복수개인 경우, 1 내지 100, 2 내지 100, 5 내지 90, 8 내지 80, 10 내지 70, 15 내지 60 또는 20 내지 50개일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.When the number of gene mutations is plural, it may be 1 to 100, 2 to 100, 5 to 90, 8 to 80, 10 to 70, 15 to 60, or 20 to 50, but is not limited thereto.

상기 기대 빈도에 있어서, 검출능력 평가 대상 검출수단이 검출할 수 있어야 하는 특정 유전자 변이의 빈도일 수 있고, 이는 2 내지 60%, 3 내지 59%, 4 내지 58%, 5 내지 57%, 5 내지 56%, 5 내지 55%, 6 내지 54%, 7 내지 53%, 8 내지 52%, 9 내지 51% 또는 10 내지 50%일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 55%일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.In the expected frequency, it may be the frequency of a specific gene mutation that must be detectable by the detection means to be evaluated for detection ability, which is 2 to 60%, 3 to 59%, 4 to 58%, 5 to 57%, 5 to 56%, 5 to 55%, 6 to 54%, 7 to 53%, 8 to 52%, 9 to 51%, or 10 to 50%, preferably 5 to 55%, but necessarily limited thereto It doesn't work.

상기 핵산 단편은 복수개일 수 있고, 이러한 경우, 각각 하나 이상의 유전자 변이를 포함할 수 있으며, 구체적으로는, 각각 하나의 유전자 변이만을 포함할 수도 있다.The nucleic acid fragment may be plural, and in this case, each may include one or more gene mutations, and specifically, each may include only one gene mutation.

상기 핵산 단편은 DNA 단편, RNA 단편 또는 PNA 단편일 수 있으나, 핵산을 구성요소로 포함하며 상기 유전자 변이를 포함하는 것이라면 이에 특별히 제한되지 아니하고, 이들로부터 추가적으로 개질된 구조들을 모두 포함하는 것을 의미할 수 있다.The nucleic acid fragment may be a DNA fragment, an RNA fragment, or a PNA fragment, but if it includes a nucleic acid as a constituent and includes the genetic mutation, it is not particularly limited thereto, and it may mean to include all structures additionally modified therefrom. have.

상기 핵산 단편에 있어서, 그 길이에 특별한 제한은 없으나, 구체적으로는, 100 내지 2000, 150 내지 1950, 200 내지 1900, 250 내지 1850, 300 내지 1800, 350 내지 1750, 400 내지 1700, 450 내지 1650, 500 내지 1600, 500 내지 1550 또는 500 내지 1500 뉴클레오티드의 길이일 수 있고, 바람직하게는 500 내지 1500 뉴클레오티드의 길이일 수 있다.In the nucleic acid fragment, there is no particular limitation on the length, but specifically, 100 to 2000, 150 to 1950, 200 to 1900, 250 to 1850, 300 to 1800, 350 to 1750, 400 to 1700, 450 to 1650, It may be 500 to 1600, 500 to 1550, or 500 to 1500 nucleotides in length, and preferably 500 to 1500 nucleotides in length.

상기 유전자 변이를 포함하는 핵산 단편을 수득하는 단계에 있어서, 특별한 제한 없이 당업계 주지된 방법을 선택하여 수득할 수 있고, 구체적으로는, 인간 게놈 서열(human genome reference; hg19)을 참조하여 합성된 핵산 단편에 변이를 생성하는 방법을 통해 수득할 수 있으며, 상기 변이를 생성하는 방법으로는 PCR 프라이머 위치지정돌연변이(PCR primer site directed mutagenesis), 전장 플라스미드 돌연변이(Whole plasmid mutagenesis) 또는 크리스퍼 가위 돌연변이(CRISPR/Cas9 mutagenesis) 방법을 활용할 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.In the step of obtaining a nucleic acid fragment containing the genetic mutation, it can be obtained by selecting a method well known in the art without particular limitation, and specifically, synthesized with reference to a human genome reference (hg19). It can be obtained through a method of generating a mutation in a nucleic acid fragment, and as a method of generating the mutation, PCR primer site directed mutagenesis, whole plasmid mutagenesis, or CRISPR scissors mutation ( CRISPR/Cas9 mutagenesis) method may be used, but is not limited thereto.

상기 세포주로서 체세포주, 생식세포주 또는 면역세포주를 특별히 제한없이 사용하여 gDNA를 수득할 수 있으나, 특별한 제한없이 상기 유전자 변이를 포함하지 아니하는 gDNA를 수득할 수 있는 세포주를 사용할 수 있고, 자연적으로 존재하는 유전자 카피 수 변이(copy number variation), 전좌(translocation) 등의 활용가능성 측면에서 바람직하게는 체세포주를 사용할 수 있다.As the cell line, a somatic cell line, a germ cell line, or an immune cell line can be used without particular limitation to obtain gDNA, but a cell line capable of obtaining gDNA that does not contain the genetic mutation can be used without particular limitation, and exists naturally. Somatic cell lines may be preferably used from the viewpoint of availability of gene copy number variation, translocation, and the like.

상기 gDNA(genomic DNA)를 수득하는 단계에 있어서, 당업계 주지된 방법을 적절히 선택하여 수행하면 족하고, 그 방법에 특별히 제한이 있는 것은 아니다.In the step of obtaining the gDNA (genomic DNA), it suffices to appropriately select and perform a method well known in the art, and there is no particular limitation on the method.

상기 gDNA(genomic DNA)는 핵산 단편이 포함하는 상기 유전자 변이를 포함하지 않는 것이어야 하는데, 이는 유전자 변이를 갖는 경우에 대비되는 표준 염기 서열(reference genome)이 되는 것으로서, 상기 gDNA와 핵산 단편의 주입량을 결정함에 용이성을 확보하기 위한 목적일 수 있다.The gDNA (genomic DNA) should be one that does not contain the genetic mutation included in the nucleic acid fragment, which becomes a reference genome compared to the case of having the genetic mutation, and the injection amount of the gDNA and the nucleic acid fragment It may be for the purpose of securing ease of determination.

상기 설정된 기대 빈도에 따라 상기 gDNA 대비 상기 핵산 단편의 몰비를 설정하여 혼합하는 단계에 있어서, 구체적으로, 상기 기대 빈도가 높을수록, 상기 gDNA 대비 상기 핵산 단편의 몰비가 높게 설정되는 것일 수 있다.In the step of setting and mixing the molar ratio of the nucleic acid fragment to the gDNA according to the set expected frequency, specifically, the higher the expected frequency, the higher the molar ratio of the nucleic acid fragment to the gDNA may be set.

상기 몰비의 설정에 있어서, 상기 핵산 단편과 상기 gDNA가 이중 가닥(double strand) 또는 단일 가닥(single strand)인 상태에서 몰비를 설정할 수 있으나, 몰비 설정의 용이성 측면에서 바람직하게는 단일 가닥인 상태에서 몰비를 설정할 수 있다.In the setting of the molar ratio, the molar ratio can be set in a state in which the nucleic acid fragment and the gDNA are double stranded or single stranded, but in terms of ease of setting the molar ratio, preferably in a single stranded state You can set the molar ratio.

보다 구체적으로, 상기 기대빈도에 따르는 상기 gDNA 대비 상기 핵산 단편의 몰비의 설정은 하기 수학식 1에 의해 수행되는 것일 수 있다:More specifically, setting of the molar ratio of the nucleic acid fragment to the gDNA according to the expected frequency may be performed by Equation 1:

[수학식 1][Equation 1]

Y = X / (X+A)Y = X / (X+A)

(Y = 기대빈도 = 핵산 단편의 몰비, X = 변이를 포함하는 핵산 단편의 몰 수, A = gDNA의 몰 수).(Y = expected frequency = mole ratio of nucleic acid fragments, X = moles of nucleic acid fragments containing mutations, A = moles of gDNA).

상기 평가 대상 유전자 변이 검출수단에 있어서, 구체적으로는 유전자 서열 분석에 기반한 검출수단일 수 있고, 보다 구체적으로는, 차세대 염기서열 분석((Next-Generation Sequencing)에 기반한 검출수단일 수 있으나, 반드시 이에 제한되지는 않는다.In the evaluation target gene mutation detection means, specifically, it may be a detection means based on gene sequence analysis, more specifically, may be a detection means based on next-generation sequencing (Next-Generation Sequencing). It is not limited.

일 양상으로서, 상술한 제조방법에 의해 제조된 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물을 제공한다.As an aspect, there is provided a composition for evaluating the detection ability of a means for detecting genetic variation prepared by the above-described manufacturing method.

상기 조성물은 상술한 제조방법에 의해 제조되어, 유전자 변이 검출수단의 검출능력을 효과적으로 평가할 수 있는데, 예를 들면, 특정 유전자 변이 검출수단이 검출해야만 하는 유전자 변이 빈도를 검출해낼 수 있는지를 정확하게 평가할 수 있고, 평가해야 할 검출능력으로서의 유전자 변이 빈도는 상술한 제조방법에서 유전자 변이의 기대 빈도를 설정하는 단계에 의해 조절될 수 있는 것이다.The composition is prepared by the above-described manufacturing method, so that the detection ability of the gene mutation detection means can be effectively evaluated, for example, it is possible to accurately evaluate whether a specific genetic mutation detection means can detect the gene mutation frequency that must be detected. In addition, the frequency of gene mutation as a detection ability to be evaluated can be adjusted by the step of setting the expected frequency of gene mutation in the above-described manufacturing method.

상기 조성물은 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가를 우수한 효율로 수행하기 위해, 당업계 통상적으로 알려진 부가적인 물질을 더 포함하여 사용될 수 있다.The composition may further include an additional substance commonly known in the art in order to perform the evaluation of the detection ability of the genetic mutation detection means with excellent efficiency.

이 외, 유전자 변이, 핵산 단편, 유전자 변이 검출수단 등의 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.In addition, specific descriptions of genetic mutations, nucleic acid fragments, and means for detecting genetic mutations are as described above.

일 양상으로서, 평가 대상 유전자 변이 검출수단이 검출해야 하는 유전자 변이의 빈도를 청구항 15의 조성물의 유전자 변이의 기대 빈도로 설정하는 단계; 상기 검출수단를 이용하여 청구항 15의 조성물 내 상기 유전자 변이의 빈도를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 유전자 변이의 빈도와 상기 기설정된 유전자 변이의 기대빈도 간 상관도를 산출하는 단계를 포함하는 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가방법을 제공한다.As an aspect, the method comprising: setting the frequency of the gene mutation to be detected by the gene mutation detection means to be evaluated as an expected frequency of the gene mutation in the composition of claim 15; Measuring the frequency of the genetic variation in the composition of claim 15 using the detection means; And calculating a correlation between the measured frequency of the genetic mutation and the predetermined expected frequency of the genetic mutation.

상기 평가방법에 있어서, 평가 대상 유전자 변이 검출수단으로 측정되는 유전자 변이의 빈도와 상기 기설정된 유전자 변이의 기대빈도 간 기준 상관도를 설정하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 이러한 경우, 상기 산출된 상관도가 상기 기준 상관도 대비 같거나 높은 경우 평가 대상 유전자 변이 검출수단의 검출능력은 적합하고, 낮은 경우 부적합한 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.In the evaluation method, it may further include the step of setting a reference correlation between the frequency of the gene mutation measured by the gene mutation detection means to be evaluated and the expected frequency of the predetermined gene mutation, in this case, the calculated correlation If the degree is equal to or higher than the reference correlation, the detection capability of the gene mutation detection means to be evaluated is suitable, and if it is low, determining that the detection capability is inappropriate.

상기 평가방법에 있어서, 보다 구체적으로, 상기 상관도를 산출하는 단계는 회귀분석에 따른 결정계수(R²) 값의 도출을 포함할 수 있는데, 이러한 경우, 상기 도출된 결정계수 값이 0.9 이상인 경우 평가 대상 유전자 변이 검출수단의 검출능력은 적합하고, 0.9 미만인 경우 부적합한 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.In the evaluation method, more specifically, the step of calculating the correlation^{may include derivation of a coefficient of determination (R 2} ) value according to a regression analysis, in this case, when the value of the derived coefficient of determination is 0.9 or more. The detection capability of the gene mutation detection means to be evaluated is suitable, and if it is less than 0.9, determining that it is inappropriate.

이 외, 유전자 변이, 핵산 단편, 유전자 변이 검출수단 등의 구체적인 설명은 상술한 바와 같다.In addition, specific descriptions of genetic mutations, nucleic acid fragments, and means for detecting genetic mutations are as described above.

일 양상으로서 제공되는 제조방법은 우수한 효율로 유전자 변이 검출수단의 검출능력의 평가가 가능한 조성물을 제조할 수 있다.The manufacturing method provided as an aspect can produce a composition capable of evaluating the detection ability of the gene mutation detection means with excellent efficiency.

일 양상으로서 제공되는 조성물은 유전자 변이 검출수단이 다양한 유전자 변이에 대하여, 다양한 기대 빈도에 대하여 검출할 수 있는지를 평가하는데 이용될 수 있다.The composition provided as an aspect may be used to evaluate whether a means for detecting genetic mutations can detect for various genetic variants and for various expected frequencies.

일 양상으로서 제공되는 평가방법은 상기 조성물을 이용함으로써 유전자 변이 검출수단의 검출능력을 효과적으로 평가할 수 있다.The evaluation method provided as an aspect can effectively evaluate the detection ability of the genetic mutation detection means by using the composition.

도 1은 일 실시예에서 사용된 유전자 변이를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 일 실시예에서 사용된 유전자 변이를 포함하는 핵산 단편의 제작과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 일 실시예에서 사용된 유전자 변이 중 4종(EGFR L858R, HRAS Q61R, KRAS G12D, PIK3CA E542K)을 각각 포함하는 핵산 단편들의 서열분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 (a) 일 실시예에서 사용된 평가용 조성물의 제조과정, (b) 대체검출 방법인 droplet digital PCR 방식으로 주입된 유전자 변이를 포함하는 핵산 단편을 확인하였고, 실제 백본(backbone) gDNA와 혼합되어 변이를 나타내는 것을 확인한 결과, (c) 이론적인 몰비를 바탕으로 투입한 유전자 변이를 포함하는 핵산 단편의 실제 변이빈도 값을 측정하여, 백본 gDNA의 실제 분자 수(molecular count)를 계산하고, 이를 활용한 기대빈도 값을 예측할 수 있는 계산모델에 관련된 것이다.
도 5는 일 실시예에서 제조된 평가용 조성물의 평가 대상 유전자 변이 검출수단의 평가능력 검증결과를 나타낸 것이다(VAF: Variant Allele Frequency, site: 실험실(A, B, C 3곳))1 is a schematic diagram showing a process of selecting a gene mutation used in an embodiment.
Fig. 2 schematically shows a process of preparing a nucleic acid fragment containing a genetic mutation used in an embodiment.
3 shows the results of sequencing of nucleic acid fragments each containing four types of gene mutations used in an example (EGFR L858R, HRAS Q61R, KRAS G12D, PIK3CA E542K).
Figure 4 is (a) the manufacturing process of the composition for evaluation used in one embodiment, (b) a nucleic acid fragment containing the gene mutation injected by the droplet digital PCR method, an alternative detection method, was confirmed, and the actual backbone gDNA (C) Based on the theoretical molar ratio, the actual mutation frequency value of the nucleic acid fragment containing the gene mutation was measured, and the actual molecular count of the backbone gDNA was calculated. However, it is related to a computational model that can predict the expected frequency value using this.
Figure 5 shows the evaluation results of the evaluation ability of the evaluation target gene mutation detection means of the composition for evaluation prepared in an example (VAF: Variant Allele Frequency, site: laboratory (3 places A, B, C))

이하, 보다 구체적인 설명을 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 이는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, for a more detailed description, examples will be described in detail. This is only provided for easier understanding of the invention, and the content of the invention is not limited thereby.

실시예 1. 유전자 변이의 선별Example 1. Selection of genetic variation

질병과 관련된 변이, 특히 FDA에서 승인한 암 환자선별에 활용되는 유전자 변이 중 발생빈도가 높은 변이들을 대상으로 선별하였다. 구체적으로, 암과 관련된 유전자의 변이들을 문헌 등을 통해 조사하여 231개의 후보 변이를 선택하고, 이 중 한국 보건복지부에서 승인한 필수 유전자 14종에 포함된 변이, 미국 FDA승인된 항암제 투어 전 선별마커, CosmicDB에서의 발생빈도 등의 기준으로 최종적으로 72개 변이를 선택하였다(도 1).Disease-related mutations, especially those with high incidence among the genetic mutations used in the selection of cancer patients approved by the FDA, were selected as targets. Specifically, 231 candidate mutations were selected by examining mutations in genes related to cancer through literature, among them, mutations included in 14 essential genes approved by the Korean Ministry of Health and Welfare, and selection markers before the anticancer drug tour approved by the US FDA. , 72 mutations were finally selected based on the incidence frequency in CosmicDB (Fig. 1).

실시예 2. 유전자 변이를 포함하는 핵산 단편 제작Example 2. Preparation of nucleic acid fragments containing genetic mutations

선택한 변이를 포함하는 DNA 단편(fragment)을 제작하고자, 변이 위치를 정 가운데 두고 양쪽방향으로 500bp씩 인간 게놈 레퍼런스(human genome reference; hg19)를 참조하여 염기서열을 확보하였다.To prepare a DNA fragment containing the selected mutation, the nucleotide sequence was secured by referring to the human genome reference (hg19) by 500bp in both directions with the mutation location in the center.

확보된 서열을 바탕으로 DNA 올리고머(oligomer) 합성을 진행하였고, 생성된 단편은 플라스미드에 삽입하고, PCR 프라이머 위치 지정 돌연변이(PCR primer site directed mutagenesis) 방법을 활용하여 변이를 생성하였다. 같은 위치의 다른 변이들은 합성된 대표 올리고(oligo) 서열에 동일한 방법을 활용하여 변이를 생성하였다(도 2).Based on the obtained sequence, DNA oligomer synthesis was performed, and the generated fragment was inserted into a plasmid, and a mutation was generated using a PCR primer site directed mutagenesis method. Other mutations at the same position were generated using the same method for the synthesized representative oligo sequence (FIG. 2).

제작된 단편을 포함하는 플라스미드는 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)과 드롭렛 디지털 중합효소 연쇄반응(droplet digital PCR; ddPCR) 기법을 통해 생성된 변이를 확인하였다(도 3). 다만, 이 중 4개의 변이는 상기의 방법에 의한 생성에 실패하여, 최종 68종의 변이(표 1)를 확보하였다.The plasmid containing the prepared fragment was confirmed to be a mutation generated by Sanger sequencing and droplet digital polymerase chain reaction (droplet digital PCR; ddPCR) techniques (FIG. 3). However, four of these mutations failed to be generated by the above method, and the final 68 mutations (Table 1) were secured.

번호
(No)number
(No)유전자 명칭
(Gene Symbol)Gene name
(Gene Symbol)NM 번호
(NM_number)NM number
(NM_number)돌연변이
(Mutation )Mutation
(Mutation)염색체
(Chromosome)chromosome
(Chromosome)변이위치
(Position)Mutation location
(Position)정상
(ref)normal
(ref)변이
(alt)transition
(alt)1OneABL1ABL1NM_007313NM_007313E255KE255K99133738306133738306GGAA22ABL1ABL1NM_007313NM_007313E255VE255V99133738307133738307AATT33ABL1ABL1NM_007313NM_007313F359CF359C99133748415133748415TTGG44ABL1ABL1NM_007313NM_007313F359IF359I99133748358133748358TTAA55ABL1ABL1NM_007313NM_007313F359VF359V99133748358133748358TTGG66ABL1ABL1NM_007313NM_007313Y253HY253H99133738357133738357TTCC77ALKALKNM_004304NM_004304C1156YC1156Y222944525829445258CCTT88ALKALKNM_004304NM_004304D1091ND1091N222944629629446296CCTT99ALKALKNM_004304NM_004304D1225ND1225N222943692029436920CCTT1010ALKALKNM_004304NM_004304F1174CF1174C222944369629443696AACC1111ALKALKNM_004304NM_004304F1174LF1174L222944369729443697AAGG1212ALKALKNM_004304NM_004304F1245VF1245V222943686029436860AACC1313ALKALKNM_004304NM_004304I1171NI1171N222944521329445213AATT1414BRAFBRAFNM_004333NM_004333V600EV600E77140453136140453136AATT1515BRAFBRAFNM_004333NM_004333V600GV600G77140453136140453136AACC1616BRAFBRAFNM_004333NM_004333V600KV600K77140453137140453137ACACTTTT1717BRAFBRAFNM_004333NM_004333V600MV600M77140453137140453137CCTT1818BRAFBRAFNM_004333NM_004333V600RV600R77140453137140453137ACACCTCT1919EGFREGFRNM_005228NM_005228G719AG719A775524170855241708GGCC2020EGFREGFRNM_005228NM_005228L858RL858R775525951555259515TTGG2121EGFREGFRNM_005228NM_005228L861QL861Q775525952455259524TTAA2222EGFREGFRNM_005228NM_005228T790MT790M775524907155249071CCTT2323ERBB2ERBB2NM_004448NM_004448D769YD769Y17173788026137880261GGTT2424ERBB2ERBB2NM_004448NM_004448L755SL755S17173788022037880220TTCC2525ERBB2ERBB2NM_004448NM_004448V842IV842I17173788133237881332GGAA2626ESR1ESR1NM_001122742NM_001122742D538GD538G66152419926152419926AAGG2727FLT3FLT3NM_004119NM_004119D835HD835H13132859264228592642CCGG2828FLT3FLT3NM_004119NM_004119D835YD835Y13132859264228592642CCAA2929GNAQGNAQNM_002072NM_002072Q209LQ209L998040948880409488TTAA3030HRASHRASNM_005343NM_005343Q61RQ61R1111533874533874TTCC3131IDH1IDH1NM_005896NM_005896R132HR132H22209113112209113112CCTT3232IDH2IDH2NM_002168NM_002168R140QR140Q15159063193490631934CCTT3333JAK2JAK2NM_004972NM_004972V617FV617F9950737705073770GGTT3434KITKITNM_000222NM_000222D816HD816H445559932055599320GGCC3535KITKITNM_000222NM_000222D816VD816V445559932155599321AATT3636KITKITNM_000222NM_000222D816YD816Y445559932055599320GGTT3737KITKITNM_000222NM_000222L576PL576P445559366155593661TTCC3838KITKITNM_000222NM_000222V559DV559D445559361055593610TTAA3939KITKITNM_000222NM_000222V560DV560D445559361355593613TTAA4040KRASKRASNM_033360NM_033360A146TA146T12122537856225378562CCTT4141KRASKRASNM_033360NM_033360G12AG12A12122539828425398284CCGG4242KRASKRASNM_033360NM_033360G12CG12C12122539828525398285CCAA4343KRASKRASNM_033360NM_033360G12DG12D12122539828425398284CCTT4444KRASKRASNM_033360NM_033360G12RG12R12122539828525398285CCGG4545KRASKRASNM_033360NM_033360G12SG12S12122539828525398285CCTT4646KRASKRASNM_033360NM_033360G12VG12V12122539828425398284CCAA4747KRASKRASNM_033360NM_033360G13CG13C12122539828225398282CCAA4848KRASKRASNM_033360NM_033360G13DG13D12122539828125398281CCTT4949METMETNM_000245NM_000245T1010IT1010I77116411990116411990CCTT5050MTORMTORNM_004958NM_004958E1799KE1799K1One1119080411190804CCTT5151MTORMTORNM_004958NM_004958S2215YS2215Y1One1118457311184573GGTT5252NRASNRASNM_002524NM_002524G12DG12D1One115258747115258747CCTT5353NRASNRASNM_002524NM_002524G13DG13D1One115258744115258744CCTT5454NRASNRASNM_002524NM_002524Q61RQ61R1One115256529115256529TTCC5555PIK3CAPIK3CANM_006218NM_006218E542KE542K33178936082178936082GGAA5656PIK3CAPIK3CANM_006218NM_006218E545KE545K33178936091178936091GGAA5757PIK3CAPIK3CANM_006218NM_006218H1047RH1047R33178952085178952085AAGG5858PIK3CAPIK3CANM_006218NM_006218Q546KQ546K33178936094178936094CCAA5959PTENPTENNM_000314NM_000314R130GR130G10108969290489692904CCGG6060RETRETNM_020975NM_020975M918TM918T10104361741643617416TTCC6161SMAD4SMAD4NM_005359NM_005359R361HR361H18184859191948591919GGAA6262SMOSMONM_005631NM_005631W535LW535L77128850341128850341GGTT6363EGFREGFRNM_005228NM_005228p.E746_A750delELREAp.E746_A750delELREA775524246455242464AGGAATTAAGAGAAGCAGGAATTAAGAGAAGCAA6464EGFREGFRNM_005228NM_005228p.E746_A750delELREAp.E746_A750delELREA775524246555242465GGAATTAAGAGAAGCAGGAATTAAGAGAAGCAGG6565EGFREGFRNM_005228NM_005228p.A763_Y764insFQEAp.A763_Y764insFQEA775524899155248991CCCTCCAGGAAGCCTCTCCAGGAAGCCT6666METMETNM_000245NM_000245c.3062_3082+7del28c.3062_3082+7del2877116412022116412022TACCGAGCTACTTTTCCAGAAGGTATATTTACCGAGCTACTTTTCCAGAAGGTATATTTT6767ERBB2ERBB2NM_004448NM_004448p.A775_G776insYVMAp.A775_G776insYVMA17173788099537880995CCCATACGTGATGGCCATACGTGATGGC6868ERBB2ERBB2NM_004448NM_004448p.A775_G776insYVMAp.A775_G776insYVMA17173788099637880996TTTTACGTGATGGCTTTACGTGATGGCT

실시예 3. 백본 gDNA와의 혼합Example 3. Mixing with backbone gDNA

변이를 포함하는 단편을 SKBR3 세포주(유방암)에서 추출한 DNA와 혼합(spiking)하였다. SKBR3는 ERBB2 유전자 증폭(gene amplification)을 포함하고 있어, 이를 CNV 변이(copy number variation)로 활용할 수 있다.The fragment containing the mutation was spiked with DNA extracted from the SKBR3 cell line (breast cancer). Since SKBR3 contains ERBB2 gene amplification, it can be used as CNV copy number variation.

SKBR3 세포주에서 추출한 DNA에 상기 68종의 위치에 변이가 없음을 서열분석으로 확인하였고, 상기 DNA 및 단편을 형광(Fluorescence) 방식(Qubit Fluorometric Quantitation, Thermo Fisher Scientific)으로 정량하였으며, 이의 정량값을 이용하여 하기 표 2와 같이 분자수의 비율로 전환하였다.It was confirmed by sequencing that the DNA extracted from the SKBR3 cell line had no mutations at the positions of the 68 species, and the DNA and fragments were quantified by a fluorescence method (Qubit Fluorometric Quantitation, Thermo Fisher Scientific), and the quantitative value thereof was used. Then, it was converted to the ratio of the number of molecules as shown in Table 2 below.

상기 비율을 이용하여 50%, 40%, 30%, 20%, 10%의 변이빈도를 보일 수 있도록 평가용 조성물을 제조하였고, 각 변이별로 투입 단편의 용량별 변이빈도의 기대구간을 설정하였다. 구체적으로, 하기 수학식 1에 따라 설정하였고, 변이빈도의 기대구간을 5% 내지 50%로 설정하되, 각각 20종의 변이를 포함하는 단편을 포함하도록 제조하였다:Using the above ratio, a composition for evaluation was prepared so as to show a mutation frequency of 50%, 40%, 30%, 20%, and 10%, and an expected interval of the mutation frequency for each dose of the input fragment was set for each mutation. Specifically, it was set according toEquation 1 below, and the expected interval of the mutation frequency was set to 5% to 50%, but each was prepared to include a fragment containing 20 kinds of mutations:

[수학식 1][Equation 1]

Y = X / (X+A)Y = X / (X+A)

(Y = 기대빈도 = 핵산 단편의 몰비, X = 변이를 포함하는 핵산 단편의 몰 수, A = gDNA의 몰 수).(Y = expected frequency = mole ratio of nucleic acid fragments, X = moles of nucleic acid fragments containing mutations, A = moles of gDNA).

제조된 평가용 조성물은 드롭렛 디지털 중합효소 연쇄반응(droplet digital PCR)으로 확인하였다(도 4).The prepared composition for evaluation was confirmed by droplet digital polymerase chain reaction (FIG. 4).

　염기쌍Base pair
(bp)(bp)이중나선 1염기쌍의 분자량Molecular weight of single base pair of double helix
(g/mole)(g/mole)1반수체Haploid
(g/mole)(g/mole)몰수confiscation
(/mole)(/mole)분자량Molecular Weight
(pg/haploid)(pg/haploid)1:1몰비를 위한 용량Capacity for 1:1 molar ratio기대빈도 0.5를 위한 용량(50%)Capacity for expected frequency of 0.5 (50%)기대빈도 0.4를 위한 용량(40%)Capacity for an expected frequency of 0.4 (40%)기대빈도 0.3을 위한 용량(30%)Capacity for an expected frequency of 0.3 (30%)기대빈도 0.2를 위한 용량(20%)Capacity for expected frequency 0.2 (20%)기대빈도 0.1을 위한 용량(10%)Capacity for an expected frequency of 0.1 (10%)변이 검출 대상 DNA
(backbone gDNA)DNA to be mutated
(backbone gDNA) 3,080,000,000 3,080,000,0006606602.03E+122.03E+126.02E+236.02E+233.383.383.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng3.38 ng변이를 포함하는 단편(variant fragment)Variant Fragment 3,200 3,200660660211200021120006.02E+236.02E+230.000003510.000003513.51fg3.51fg3.51fg3.51fg2.34fg2.34fg1.50fg1.50fg0.87fg0.87fg0.39fg0.39fg

실시예 4. 제조된 평가용 조성물의 평가능력 확인Example 4. Confirmation of the evaluation ability of the prepared evaluation composition

제조된 3종의 평가용 조성물에 대한 검증을 위하여, 환경이 다른 3곳의 실험실에서 변이검출 및 변이빈도 검증을 각각 수행하였다. 각 실험실은 서로 다른 서열분석기(Sequencer)를 사용하였으며, 그 환경은 하기 표 3, 4와 같다.In order to verify the prepared three evaluation compositions, mutation detection and mutation frequency verification were performed in three laboratories with different environments, respectively. Each laboratory used a different sequencer, and the environment is shown in Tables 3 and 4 below.

그 결과, 하기 표 5 내지 7에서 확인할 수 있듯, 2종의 조성물에 대해서는 각 실험실별 검출범위에 포함되는 모든 변이를 검출하였으며, 나머지 1종의 조성물의 경우에는 2개의 실험실에서 각 1개씩 검출하지 못하였다.As a result, as can be seen in Tables 5 to 7 below, for the two compositions, all mutations included in the detection range of each laboratory were detected, and in the case of the remaining one composition, one each in two laboratories was not detected. I couldn't.

검출된 변이의 변이빈도 상관성을 살펴보면, 평균(기설정된 유전자 변이의 기대빈도)과의 상관도가 높음(회귀분석에 따른 결정계수 R²= 0.9893)을 확인한 바(도 5), 제안된 제조방법으로 만들어진 평가용 조성물이 제대로 작동하는지 검증되었다.Looking at the correlation of the mutation frequency of the detected mutation, it was confirmed that the correlation with the average (expected frequency of the preset gene mutation) was high (decision coefficient R² = 0.9893 according to regression analysis) (Fig. It was verified that the composition for evaluation made of is functioning properly.

각 실험실의 일반적인 환경조건General environmental conditions of each laboratory샘플유형Sample typeDNA 요구량(ng)DNA requirement (ng)검출 민감도(%)Detection sensitivity (%)보조정보Supplementary information단일 뉴클레오티드 변이
(Single nucleotide variation; SNV)Single nucleotide variation
(Single nucleotide variation; SNV)삽입/결실 변이
(In/Del)Insertion/deletion mutation
(In/Del)변이 대립유전자 빈도/깊이
(VAF/depth)Mutation allele frequency/depth
(VAF/depth)주석
(Annotation)Remark
(Annotation)실험실ALab A신선냉동, 포르말리으로 고정하고 파라핀이 포매됨(FFPE)Fresh-frozen, fixed with formali and embedded with paraffin (FFPE)> 200> 2002%2%5%5%OOOO실험실BLab B신선냉동, 포르말리으로 고정하고 파라핀이 포매됨(FFPE)Fresh-frozen, fixed with formali and embedded with paraffin (FFPE)100 - 200100-2002%2%2%2%OOOO실험실CLab C신선냉동, 포르말리으로 고정하고 파라핀이 포매됨(FFPE)Fresh-frozen, fixed with formali and embedded with paraffin (FFPE)> 300> 3002%2%5%5%OOOO

각 실험실의 서열분석 환경Each laboratory's sequencing environment서열분석기Sequencer분석길이(bp)Analysis length (bp)분석유형Analysis type유형type깊이의 평균(x)Mean of depth (x)실험실ALab AIlluminaIlluminahiseq2500hiseq2500100100쌍(paired)Paired수동패널Manual panel800800실험실BLab BnextSeqnextSeq7575750750실험실CLab CmiSeqDxmiSeqDx10010010001000

평가용 조성물 1Composition forevaluation 1변이의 종류Kind of variation테스트 커버율
(Test cover rate; %)Test coverage rate
(Test cover rate; %)양성 검출율
(Rate of positive; %)Positive detection rate
(Rate of positive; %)MTOR E1799KMTOR E1799K100100100100NRAS Q61RNRAS Q61R100100100100ALK F1245VALK F1245V100100100100ALK C1156YALK C1156Y100100100100IDH1 R132HIDH1 R132H100100100100PIK3CA E545KPIK3CA E545K100100100100PIK3CA H1047RPIK3CA H1047R100100100100KIT D816YKIT D816Y100100100100ESR1 D538GESR1 D538G100100100100EGFR L858REGFR L858R100100100100SMO W535LSMO W535L100100100100BRAF V600EBRAF V600E100100100100JAK2 V617FJAK2 V617F6767100100ABL1 E255VABL1 E255V6767100100ABL1 F359IABL1 F359I6767100100HRAS Q61RHRAS Q61R100100100100KRAS Q61HKRAS Q61H100100100100KRAS G12DKRAS G12D100100100100FLT3 D835HFLT3 D835H6767100100EGFR p.E746 A750dEGFRp.E746 A750d100100100100

평가용 조성물 2Evaluation composition 2변이의 종류Kind of variation테스트 커버율
(Test cover rate; %)Test coverage rate
(Test cover rate; %)양성 검출율
(Rate of positive; %)Positive detection rate
(Rate of positive; %)MTOR S2215YMTOR S2215Y100100100100NRAS G13DNRAS G13D100100100100ALK I1171NALK I1171N100100100100PIK3CA E542KPIK3CA E542K100100100100KIT L576PKIT L576P100100100100KIT D816HKIT D816H100100100100ESR1 D538GESR1 D538G100100100100EGFR T790MEGFR T790M100100100100EGFR L858REGFR L858R100100100100BRAF V600MBRAF V600M100100100100ABL1 Y253HABL1 Y253H6767100100ABL1 F359CABL1 F359C6767100100RET M918TRET M918T100100100100PTEN R130GPTEN R130G100100100100KRAS G12RKRAS G12R100100100100FLT3 D835YFLT3 D835Y6767100100IDH2 R140QIDH2 R140Q100100100100ERBB2 L755SERBB2 L755S100100100100ERBB2 p.A775 G776ERBB2p.A775 G776100100100100EGFR p.E746 A750dEGFRp.E746 A750d100100100100

평가용 조성물 3Evaluation composition 3변이의 종류Kind of variation테스트 커버율
(Test cover rate; %)Test coverage rate
(Test cover rate; %)양성 검출율
(Rate of positive; %)Positive detection rate
(Rate of positive; %)NRAS G12DNRAS G12D100100100100ALK F1174CALK F1174C100100100100ALK D1091NALK D1091N100100100100PIK3CA Q546KPIK3CA Q546K100100100100KIT V559DKIT V559D100100100100KIT D816VKIT D816V100100100100EGFR G719AEGFR G719A100100100100EGFR L858REGFR L858R100100100100MET T1010IMET T1010I1001006767MET Chr 7: 116412022-116412050 deletionMET Chr 7: 116412022-116412050deletion100100100100BRAF V600GBRAF V600G100100100100GNAQ Q209LGNAQ Q209L6767100100ABL1 F359VABL1 F359V6767100100KRAS Q61HKRAS Q61H100100100100KRAS G12AKRAS G12A100100100100ERBB2 D769YERBB2 D769Y6767100100ERBB2 V842IERBB2 V842I100100100100SMAD4 R316HSMAD4 R316H100100100100EGFR p.A763 Y764inEGFRp.A763 Y764in100100100100ERBB2 p.A775 G776iERBB2p.A775 G776i1001006767

Claims (20)

Translated fromKorean

유전자 변이의 기대 빈도를 설정하는 단계;
상기 유전자 변이를 포함하는 핵산 단편과 상기 유전자 변이를 포함하지 않는 세포주의 gDNA를 수득하는 단계; 및
상기 설정된 기대 빈도에 따라 상기 gDNA 대비 상기 핵산 단편의 몰비를 설정하여 혼합하는 단계를 포함하는 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물의 제조방법.
Setting an expected frequency of genetic variation;
Obtaining a nucleic acid fragment containing the genetic mutation and gDNA of a cell line not containing the genetic mutation; And
A method for preparing a composition for evaluating the detection ability of a genetic mutation detection means comprising the step of setting and mixing the molar ratio of the nucleic acid fragment to the gDNA according to the set expected frequency.
청구항 1에 있어서, 상기 유전자 변이는 뉴클레오티드의 치환, 삽입 또는 결실인 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the gene mutation is a substitution, insertion or deletion of a nucleotide.
청구항 1에 있어서, 상기 유전자 변이는 암을 유발하는 변이인 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the genetic mutation is a mutation that causes cancer.
청구항 1에 있어서, 상기 유전자 변이는 ABL1 유전자의 E255K, ABL1 유전자의 E255V, ABL1 유전자의 F359C, ABL1 유전자의 F359I, ABL1 유전자의 F359V, ABL1 유전자의 Y253H, ALK 유전자의 C1156Y, ALK 유전자의 D1091N, ALK 유전자의 D1225N, ALK 유전자의 F1174C, ALK 유전자의 F1174L, ALK 유전자의 F1245V, ALK 유전자의 I1171N, BRAF 유전자의 V600E, BRAF 유전자의 V600G, BRAF 유전자의 V600K, BRAF 유전자의 V600M, BRAF 유전자의 V600R, EGFR 유전자의 G719A, EGFR 유전자의 L858R, EGFR 유전자의 L861Q, EGFR 유전자의 T790M, ERBB2 유전자의 D769Y, ERBB2 유전자의 L755S, ERBB2 유전자의 V842I, ESR1 유전자의 D538G, FLT3 유전자의 D835H, FLT3 유전자의 D835Y, GNAQ 유전자의 Q209L, HRAS 유전자의 Q61R, IDH1 유전자의 R132H, IDH2 유전자의 R140Q, JAK2 유전자의 V617F, KIT 유전자의 D816H, KIT 유전자의 D816V, KIT 유전자의 D816Y, KIT 유전자의 L576P, KIT 유전자의 V559D, KIT 유전자의 V560D, KRAS 유전자의 A146T, KRAS 유전자의 G12A, KRAS 유전자의 G12C, KRAS 유전자의 G12D, KRAS 유전자의 G12R, KRAS 유전자의 G12S, KRAS 유전자의 G12V, KRAS 유전자의 G13C, KRAS 유전자의 G13D, MET 유전자의 T1010I, MTOR 유전자의 E1799K, MTOR 유전자의 S2215Y, NRAS 유전자의 G12D, NRAS 유전자의 G13D, NRAS 유전자의 Q61R, PIK3CA 유전자의 E542K, PIK3CA 유전자의 E545K, PIK3CA 유전자의 H1047R, PIK3CA 유전자의 Q546K, PTEN 유전자의 R130G, RET 유전자의 M918T, SMAD4 유전자의 R361H, SMO 유전자의 W535L, EGFR 유전자의 p.E746 A750delELREA, EGFR 유전자의 p.A763 Y764insFQEA, MET 유전자의 c.3062 3082+7del28 및 ERBB2 유전자의 p.A775 G776insYVMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the genetic mutation is E255K of the ABL1 gene, E255V of the ABL1 gene, F359C of the ABL1 gene, F359I of the ABL1 gene, F359V of the ABL1 gene, Y253H of the ABL1 gene, C1156Y of the ALK gene, D1091N of the ALK gene, and ALK. D1225N of gene, F1174C of ALK gene, F1174L of ALK gene, F1245V of ALK gene, I1171N of ALK gene, V600E of BRAF gene, V600G of BRAF gene, V600K of BRAF gene, V600M of BRAF gene, V600R of BRAF gene, EGFR Gene G719A, EGFR gene L858R, EGFR gene L861Q, EGFR gene T790M, ERBB2 gene D769Y, ERBB2 gene L755S, ERBB2 gene V842I, ESR1 gene D538G, FLT3 gene D835H, FLT3 gene D835Y, GNAQ Q209L of gene, Q61R of HRAS gene, R132H of IDH1 gene, R140Q of IDH2 gene, V617F of JAK2 gene, D816H of KIT gene, D816V of KIT gene, D816Y of KIT gene, L576P of KIT gene, V559D of KIT gene, KIT V560D of gene, A146T of KRAS gene, G12A of KRAS gene, G12C of KRAS gene, G12D of KRAS gene, G12R of KRAS gene, G12S of KRAS gene, G12V of KRAS gene, G13C of KRAS gene, G13D of KRAS gene, MET T1010I of gene, E1799K of MTOR gene, S2215Y of MTOR gene, G12D of NRAS gene, G13D of NRAS gene, Q61R of NRAS gene, E542K of PIK3CA gene, E545K of PIK3CA gene, H1047R of PIK3CA gene, Q5 of PIK3CA gene 46K, PTEN gene R130G, RET gene M918T, SMAD4 gene R361H, SMO gene W535L, EGFR gene p.E746 A750delELREA, EGFR gene p.A763 Y764insFQEA, MET gene c.3062 3082+7del28 and ERBB2 gene A method of manufacturing one or more selected from the group consisting of p.A775 G776insYVMA.
청구항 1에 있어서, 상기 유전자 변이는 복수개이고, 상기 기대 빈도는 유전자 변이 각각의 기대 빈도인 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the genetic variation is plural, and the expected frequency is an expected frequency of each of the genetic variation.
청구항 1에 있어서, 상기 기대 빈도는 5 내지 55%인 제조방법.
The method of claim 1, wherein the expected frequency is 5 to 55%.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 단편은 복수개로서, 각각 하나 이상의 유전자 변이를 포함하는 것인 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the nucleic acid fragment is a plurality, each comprising one or more gene mutations.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 단편은 DNA 단편, RNA 단편 또는 PNA 단편인 제조방법.
The method of claim 1, wherein the nucleic acid fragment is a DNA fragment, an RNA fragment, or a PNA fragment.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 단편은 길이가 500 내지 1500 뉴클레오티드인 제조방법.
The method of claim 1, wherein the nucleic acid fragment is 500 to 1500 nucleotides in length.
청구항 1에 있어서, 상기 핵산 단편과 상기 gDNA는 단일가닥인 제조방법.
The method of claim 1, wherein the nucleic acid fragment and the gDNA are single-stranded.
청구항 1에 있어서, 상기 세포주는 체세포주인 제조방법.
The method of claim 1, wherein the cell line is a somatic cell line.
청구항 1에 있어서, 상기 몰비의 설정은 하기 수학식 1에 따라 수행되는 것인 제조방법:
[수학식 1]
Y = X / (X+A)
(Y = 기대빈도 = 핵산 단편의 몰비, X = 변이를 포함하는 핵산 단편의 몰 수, A = gDNA의 몰 수).
The method of claim 1, wherein the molar ratio is set according to Equation 1 below:
[Equation 1]
Y = X / (X+A)
(Y = expected frequency = mole ratio of nucleic acid fragments, X = moles of nucleic acid fragments containing mutations, A = moles of gDNA).
청구항 1에 있어서, 상기 유전자 변이 검출수단은 유전자 서열 분석에 기반한 것인 제조방법.
The method of claim 1, wherein the gene mutation detection means is based on gene sequence analysis.
청구항 1에 있어서, 상기 유전자 변이 검출수단은 차세대 염기서열 분석(Next-Generation Sequencing)에 기반한 것인 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the gene mutation detection means is based on Next-Generation Sequencing.
청구항 1 내지 14 중 어느 하나의 제조방법에 의해 제조된 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가용 조성물.
A composition for evaluating the detection ability of a means for detecting genetic variation prepared by any one of the manufacturing methods of claim 1 to 14.
평가 대상 유전자 변이 검출수단이 검출해야 하는 유전자 변이의 빈도를 청구항 15의 조성물의 유전자 변이의 기대 빈도로 설정하는 단계;
상기 검출수단을 이용하여 청구항 15의 조성물 내 상기 유전자 변이의 빈도를 측정하는 단계; 및
상기 측정된 유전자 변이의 빈도와 상기 기설정된 유전자 변이의 기대빈도 간 상관도를 산출하는 단계를 포함하는 유전자 변이 검출수단의 검출능력 평가방법.
Setting the frequency of the genetic mutation to be detected by the genetic mutation detection means to be evaluated as an expected frequency of the genetic mutation of the composition of claim 15;
Measuring the frequency of the genetic variation in the composition of claim 15 using the detection means; And
And calculating a correlation between the measured frequency of the genetic mutation and the expected frequency of the predetermined genetic mutation.
청구항 16에 있어서, 평가 대상 유전자 변이 검출수단으로 측정되는 유전자 변이의 빈도와 상기 기설정된 유전자 변이의 기대빈도 간 기준 상관도를 설정하는 단계를 더 포함하는 평가방법.
The evaluation method according to claim 16, further comprising setting a reference correlation between the frequency of the gene mutation measured by the gene mutation detection means to be evaluated and the expected frequency of the predetermined gene mutation.
청구항 17에 있어서, 상기 산출된 상관도가 상기 기준 상관도 대비 같거나 높은 경우 평가 대상 유전자 변이 검출수단의 검출능력은 적합하고, 낮은 경우 부적합한 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 평가방법.
The evaluation method according to claim 17, further comprising determining that the detection capability of the gene mutation detection means to be evaluated is suitable when the calculated correlation is equal to or higher than the reference correlation, and is unsuitable when it is low.
청구항 16에 있어서, 상기 상관도를 산출하는 단계는 회귀분석에 따른 결정계수(R²) 값의 도출을 포함하는 평가방법.
The method of claim 16, wherein the calculating of the correlation includes derivation of a^{coefficient of determination (R 2) value according to a regression analysis.}
청구항 19에 있어서, 상기 도출된 결정계수 값이 0.9 이상인 경우 평가 대상 유전자 변이 검출수단의 검출능력은 적합하고, 0.9 미만인 경우 부적합한 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는 평가방법.
The evaluation method according to claim 19, further comprising determining that the detection capability of the gene mutation detection means to be evaluated is suitable when the derived coefficient of determination value is 0.9 or more, and is determined to be inappropriate when it is less than 0.9.

Images