KR20160015893A - Polypeptides delivering biomolecules into the cytoplasm and use thereof - Google Patents

Abstract

Translated fromKorean

본 발명은 유용한 생체분자를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 다양한 분자를 진핵세포의 세포 내로 전달해 주는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 숙주세포 및 상기 재조합 숙주세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 생체분자를 높은 효율로 특정 세포 내로 전달할 수 있으므로, 의약품 개발 및 제조뿐만 아니라 기초 의과학 연구 분야에 유용하다.[0001] The present invention relates to a polypeptide that delivers a useful biomolecule into a cell, and more particularly to a polypeptide that transfers various molecules into the cells of eukaryotic cells, a polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide , A recombinant host cell transformed with the vector, and a method for producing the polypeptide by culturing the recombinant host cell.
Since the polypeptide of the present invention can deliver biomolecules into specific cells with high efficiency, it is useful in the fields of basic medicine research as well as drug development and manufacture.

Description

Translated fromKorean

생체분자를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드 및 그 용도 {Polypeptides delivering biomolecules into the cytoplasm and use thereof}Polypeptides that transfer biomolecules into cells and uses thereof [0002]

본 발명은 유용한 생체분자를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 다양한 분자를 진핵세포의 세포 내로 전달해 주는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 숙주세포 및 상기 재조합 숙주세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
[0001] The present invention relates to a polypeptide that delivers a useful biomolecule into a cell, and more particularly to a polypeptide that transfers various molecules into the cells of eukaryotic cells, a polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide , A recombinant host cell transformed with the vector, and a method for producing the polypeptide by culturing the recombinant host cell.

동물세포의 세포막은 많은 생체분자들을 통과시키지 않는다. 기초과학과 의약학 등의 분야에서 다양한 생체분자들이 사용되고 있지만, 세포막으로 인해 생체분자의 세포 내부에서의 사용은 많은 제약이 있었다.The cell membrane of animal cells does not pass through many biomolecules. Various biomolecules have been used in fields such as basic science and medicine, but there have been many restrictions on the use of biomolecules inside cells due to the cell membrane.

특히, 단백질을 세포 내로 전달하는 기술은 생명과학분야에 있어서 굉장히 중요한 기술이다. 단백질은 기초과학, 의약학 분야에 걸쳐서 광범위하게 사용되고 있는 중요한 물질로써, 소분자 물질에 비해 훨씬 다양하고 섬세한 작용을 할 수 있다. 하지만 단백질은 세포막을 통과하지 못하기 때문에 세포질 안에서의 연구에는 사용하기에 커다란 제약이 있었다.In particular, the technology of delivering proteins into cells is a very important technology in the field of life sciences. Protein is an important substance widely used in the basic science and medicine fields, and it can perform a much more diverse and delicate action than a small molecule substance. However, since proteins do not pass through cell membranes, they have great limitations for their use in cytoplasmic studies.

구체적으로, 세포 내에서 진행되는 생명 현상 및 질병의 원인을 분자 수준에서 규명하기 위해서는 세포 내 단백질의 상호 작용 네트워크와 신호 전달 체계를 이해해야 한다. 다양한 방법이 개발되었지만 세포 내 단백질의 상호 작용이나 신호 전달을 가역적으로 조절하고 세포의 반응을 연구하는 방법이 가장 효과적이다. 따라서, 복잡한 세포 내 신호 전달 네트워크와 메커니즘을 규명하기 위해서는 단백질 상호 작용이나 신호 전달을 강화 또는 억제하는 다양한 외래 단백질을 특정 세포 내로 안전하게 효율적으로 전달하는 기술이 필수적이다.Specifically, in order to identify the causes of life phenomena and diseases in cells at the molecular level, it is necessary to understand the interaction network and signal transmission system of intracellular proteins. Although various methods have been developed, the most effective method is to reversibly regulate protein interactions or signal transduction in cells and study cell responses. Therefore, in order to elucidate a complex intracellular signaling network and mechanism, techniques for safely and efficiently transferring a variety of exogenous proteins, which enhance or inhibit protein interactions or signal transduction, into specific cells are essential.

외래 단백질을 살아있는 특정 세포 내로 안전하게 전달할 수 있는 기술은 의약분야에도 반드시 필요하다. 암을 비롯한 질병의 효과적인 치료를 위하여 단백질 치료제가 활발히 개발되고 있지만, 단백질이 세포막을 통과할 수 없기 때문에 대부분 세포 밖의 질병 타겟에 한정되고 있다. 그러나, 세포 내에는 보다 많은 질병 타겟이 존재하기 때문에 이를 대상으로 한 단백질 치료제의 개발 중요성이 크게 부각되고 있다. 따라서, 광범위한 질병에 대해 치료 효과가 높은 단백질 치료제를 개발하기 위해서는 세포 내 질병 타켓을 표적하는 치료용 단백질을 특정 세포 안으로 안전하게 전달할 수 있는 기술의 개발이 우선적으로 요구된다.Techniques that can safely deliver exogenous proteins into living, specific cells are also necessary in the pharmaceutical field. Although protein therapeutics have been actively developed for the effective treatment of diseases such as cancer, they are mostly restricted to extracellular disease targets, since proteins can not pass through cell membranes. However, since there are more disease targets in the cells, the importance of developing a therapeutic agent for the protein has been greatly emphasized. Therefore, in order to develop a therapeutic agent having a therapeutic effect for a wide range of diseases, development of a technology capable of safely delivering a therapeutic protein targeting a target of an intracellular disease to a specific cell is a priority.

최근에는 이러한 한계를 극복하기 위하여 PTDs(protein transduction domains)를 사용하는 시도가 많이 이루어지고 있다. PTD는 translocatory protein의 일부분인데, translocatory protein은 독특한 secretory pathway를 통해서 세포 밖으로 나온 후, receptor-independent, non-endocytosis 방식을 통해서 다시금 세포의 cytosol로 들어가게 된다. 또한 이들 단백질은 서로 간의 공통적인 특징을 가지고 있는데, 대부분이 핵 내로 이동하는 성향을 보이며, 아미노산 서열 내에 높은 염기적 성격을 지닌 부분을 가지고 있다. 이러한 높은 염기적 성격을 지닌 부분이 바로 PTD로, translocatory protein이 세포 내로 쉽게 이동하도록 유도하는 부위이다. 최근 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus type-1) 단백질의 일종인 Tat(Transactivator of transcription) 단백질은 중간부위인 PTD의 특성 때문에 효율적으로 세포막을 통과하여 세포질 내로 쉽게 이동한다는 것이 밝혀졌다.In recent years, attempts have been made to use PTDs (protein transduction domains) to overcome these limitations. PTD is part of the translocatory protein, which translocates out of the cell through a unique secretory pathway and then enters the cytosol again through receptor-independent, non-endocytosis. In addition, these proteins share common features, most of which have a tendency to migrate into the nucleus, and have a portion with a high basicity within the amino acid sequence. These highly basic features are PTD, which is a site that allows the translocatory protein to migrate easily into the cell. Recently, Tat (Transactivator of transcription) protein, a type of Human Immunodeficiency Virus type-1 protein, has been found to be efficiently transferred through the cell membrane to the cytoplasm due to its characteristic PTD.

이외에도, 종래 PTD를 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결시킨 경우, 이러한 융합 단백질의 세포 내 수송이 효율적이라는 것이 밝혀졌고, 그 이후에 PTD를 이용한 다양한 응용이 시도되었다(대한민국 특허등록 제10-0568457호).In addition, when the conventional PTD is linked to another peptide or protein, it has been found that intracellular transport of such a fusion protein is efficient, and various applications using PTD have been attempted thereafter (Korean Patent Registration No. 10-0568457).

이처럼, 세포 내로 외래 단백질을 전달하기 위해 많은 연구가 진행되었지만, 세포 막 때문에 큰 진전을 이루지 못하고 있었다. 현재는 주로 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide) 등을 단백질에 접합시켜 세포 내로 전달하거나 나노 입자에 외래 단백질을 부착하여 세포 내로 전달하는 방법 등이 사용되고 있으나 낮은 효율과 세포에 대한 특이성이 없는 것이 가장 큰 문제점으로 남아 있다.As such, many studies have been carried out to transfer foreign proteins into cells, but the cell membranes have not made great progress. At present, mainly, a method of transferring a cell penetrating peptide or the like into a cell and transferring it into a cell or attaching an exogenous protein to a nanoparticle and transferring the cell into a cell is used. However, the cell is not the most efficient and has low specificity It remains a problem.

이에, 본 발명자들은 박테리아가 생성하는 독소 단백질의 세포투과 도메인을 기반으로 외래 생체분자를 특정 세포 내로 안전하게 고효율로 전달할 수 있는 폴리펩타이드를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have developed a polypeptide capable of safely and efficiently delivering an exogenous biomolecule into a specific cell based on the cytotoxic domain of the toxin protein produced by the bacteria, and completed the present invention.

본 발명의 목적은 생체분자를 특정 세포 내로 안전하게 고효율로 전달할 수 있는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하여 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a recombinant microorganism capable of safely and efficiently delivering a biomolecule into a specific cell, a polynucleotide encoding the polypeptide, a vector containing the polynucleotide, a recombinant microorganism into which the vector is introduced, And culturing the same to produce the polypeptide.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 함유하는 세포 내 전달용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 생체분자의 세포 내 전달방법을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide an intracellular delivery composition containing the polypeptide, and a method for delivering a biomolecule into a cell using the composition.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포투과 도메인을 기본 골격으로, 상기 세포투과 도메인의 N말단 및 C말단에 수용체 인식 도메인 및 카르고 도메인이 각각 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing a biomolecule, which comprises binding a biomolecule to a cell, which is characterized in that the cell penetration domain is a basic skeleton, and a receptor recognition domain and a cargo domain are bound to the N- RTI ID = 0.0 > polypeptide < / RTI >

본 발명은 또한, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 상기 폴리뉴클레오타이드가 도입되어 있는 재조합 미생물; 및 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.The present invention also relates to a polynucleotide encoding said polypeptide; A recombinant vector comprising the polynucleotide; A recombinant microorganism into which the polynucleotide is introduced; And a recombinant microorganism into which the recombinant vector is introduced.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다.
(A) culturing the recombinant microorganism to produce a polypeptide; And (b) recovering the resulting polypeptide. The present invention also provides a method for producing a polypeptide capable of delivering a biomolecule into a cell.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 생체분자를 높은 효율로 특정 세포 내로 전달할 수 있으므로, 의약품 개발 및 제조뿐만 아니라 기초 의과학 연구 분야에 유용하다.
The polypeptide according to the present invention is capable of delivering biomolecules into specific cells with high efficiency, and thus is useful for drug development and manufacturing as well as for basic medical research.

도 1은 본 발명의 기본 개념도로, 세 도메인과 소포체 잔류 서열로 이루어진 상기 폴리펩타이드를 도식화한 것이다.
도 2는 도 1의 기본 개념을 토대로 만든 Gb3 세포막 수용체를 인식하여 eGFP를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드의 결정화 구조 개략도이다.
도 3은 도 2의 폴리펩타이드를 이용하여 eGFP를 Gb3 양성 세포 내로 전달에 성공한 공초점레이저주사현미경 사진이다.
도 4는 도 1의 기본 개념을 토대로 만든 EGFR 세포막 수용체를 인식하여 eGFP를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드의 결정화 구조 개략도이다.
도 5는 도 4의 폴리펩타이드를 이용하여 eGFP를 EGFR 양성 및 음성 세포 내로 전달한 공초점레이저주사현미경 사진이다.
도 6은 도 1의 기본 개념을 토대로 만든 Gb3 세포막 수용체를 인식하여 luciferase를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드가 성공적으로 luciferase를 전달한 것을 시간별로 그린 그래프이다. X축: 시간 (hour), Y축: 세포 내 luciferase의 상대적 활성, 파란색: 상기 폴리펩타이드, 녹색: 도메인 2 가 제거된 폴리펩타이드, 빨간색: 비활성 B-subunit 이 결합된 폴리펩타이드.Fig. 1 is a schematic view of the present invention, which is a schematic representation of the polypeptide consisting of three domains and an endoplasmic reticulum residual sequence.
FIG. 2 is a schematic diagram of the crystallization structure of a polypeptide that recognizes a Gb3 cell membrane receptor based on the basic concept of FIG. 1 and delivers eGFP into cells.
FIG. 3 is a confocal laser scanning microscope photograph showing the successful transfer of eGFP into Gb3-positive cells using the polypeptide of FIG.
FIG. 4 is a schematic diagram of a crystallization structure of a polypeptide that recognizes an EGFR cell membrane receptor based on the basic concept of FIG. 1 and delivers eGFP into cells.
FIG. 5 is a photograph of a confocal laser scanning microscope in which eGFP was delivered into EGFR positive and negative cells using the polypeptide of FIG.
FIG. 6 is a graph showing time course of successful delivery of luciferase by a polypeptide that recognizes Gb3 cell membrane receptor based on the basic concept of FIG. 1 and delivers luciferase into cells. X-axis: hour, Y-axis: relative activity of intracellular luciferase, blue: polypeptide, green: domain 2-removed polypeptide, red: inactive B-subunit-conjugated polypeptide.

본 발명에서는, 세포막의 특정 수용체를 인식하는 “수용체 인식 도메인”, 박테리아 독소 단백질에서 유래한 “세포투과 도메인”, 전달할 생체분자가 접합되는 “카르고 도메인”, 소포체 잔류 서열이 복합체를 이루어 세포 내로 전달되는 것을 확인하였다.In the present invention, a "receptor recognition domain" that recognizes a specific receptor of a cell membrane, a "cell permeation domain" derived from a bacterial toxin protein, a "cargo domain" to which a biomolecule to be delivered is conjugated, .

본 발명의 일 실시예에서는 세포투과 도메인으로 녹농균이 생성하는 독소 단백질의 도메인 2를 이용하고, 상기 세포투과 도메인의 N말단 및 C말단에 각각 수용체 인식 도메인 및 카르고 도메인을 결합하여 폴리펩타이드를 제조하였다.In one embodiment of the present invention,domain 2 of a toxin protein produced by P. aeruginosa is used as a cytotoxic domain, and a receptor recognition domain and a cargo domain are respectively bound to N-terminal and C-terminal of the cell permeation domain to produce a polypeptide Respectively.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 도메인 2의 구조 및 기능을 분석해 본 결과, 본 시스템은 “수용체 인식 도메인”, “도메인 2”, “카르고 도메인”, 소포체 잔류 서열 순으로 구성되는 것이 최적인 것을 확인할 수 있었다.In another embodiment of the present invention, the structure and function of the above-mentioneddomain 2 have been analyzed. As a result, it has been found that the present system is optimized in the order of "receptor recognition domain", "domain 2", "cargo domain" I could confirm.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 세포투과 도메인을 기본 골격으로, 상기 세포투과 도메인의 N말단 및 C말단에 수용체 인식 도메인 및 카르고 도메인이 각각 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다.Therefore, in one aspect, the present invention provides a method for producing a biomolecule, which comprises binding a biomolecule into a cell, wherein the receptor domain and the cargo domain are bound to the N-terminal and C-terminal of the cell- Lt; RTI ID = 0.0 > polypeptide. ≪ / RTI >

본 발명에서, “세포투과 도메인” 은 생체분자가 세포막을 통과하여 세포 내로 들어갈 수 있게 하는 부분을 의미한다. 상기 도메인은 박테리아의 독소 단백질에서 유래한 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 녹농균의 외독소(Pseudomonas Exotoxin A)의 일부, 장출혈성 대장균의 시가톡신(Shiga like toxin)의 일부 등이 사용될 수 있다.In the present invention, " cell permeation domain " refers to a moiety that allows a biomolecule to enter the cell through the cell membrane. The domain may be a polypeptide derived from the toxin protein of the bacteria. For example, a part of Pseudomonas exotoxin A, a part of Shiga like toxin of enterohemorrhagic Escherichia coli can be used.

본 발명에서, “수용체 인식 도메인” 은 전달하고자 하는 세포의 세포막에 있는 특정 수용체를 인식하는 부분을 의미한다. 상기 도메인에는 폴리펩타이드를 포함하여 세포막에 있는 특정 수용체를 인식할 수 있는 다양한 분자가 이용될 수 있다. 예를 들어, EGF, IL-6, Fc 등의 자연계 단백질, 단일체인항체(scFv), 리피바디(Repebody), DARPin, Monobody, Nanobody 등의 인공단백질, RGD, folate 등의 소분자 리간드 등을 사용할 수 있다.In the present invention, " receptor recognition domain " means a portion recognizing a specific receptor in the cell membrane of a cell to be delivered. A variety of molecules capable of recognizing a specific receptor in a cell membrane, including a polypeptide, may be used in the domain. For example, artificial proteins such as natural proteins such as EGF, IL-6 and Fc, single chain antibodies (scFv), Repebody, DARPin, Monobody and Nanobody, small molecule ligands such as RGD and folate have.

본 발명에서, “카르고 도메인”은 세포 내로 전달하고자 하는 생체분자를 의미한다. 상기 도메인은 다양한 생체분자가 다양한 방법으로 세포투과 도메인의 C말단에 접합될 수 있다. 예를 들어, 외래 단백질의 뉴클레오타이드가 상기 폴리펩타이드의 뉴클레오타이드에 접합되어 하나의 결합 폴리펩타이드 형태로 생산되도록 사용할 수 있다. 다른 예로, 시스테인(cysteine)을 삽입한 후 생체분자에 말레이미드(maleimide)를 결합하여 시스테인과 말레이미드 간의 접합반응을 이용하여 생체분자를 접합시킬 수 있다. 전달하고자 하는 생체분자의 예로는 치료 및 진단용 단백질, 단일나선 핵산, 이중나선 핵산, 소분자 약제 등이 대상이 될 수 있다.In the present invention, " cargo domain " means a biomolecule to be transferred into a cell. The domain may be conjugated to the C-terminus of the transmembrane domain in a variety of ways by various biomolecules. For example, a nucleotide of an exogenous protein can be used to bind to the nucleotide of the polypeptide and be produced in the form of a single binding polypeptide. As another example, a biomolecule can be conjugated using a cysteine-maleimide conjugation reaction by binding maleimide to a biomolecule after inserting cysteine. Examples of biomolecules to be delivered include therapeutic and diagnostic proteins, single-stranded nucleic acids, double-stranded nucleic acids, and small molecule drugs.

한편, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 생체분자의 세포 내 전달 효율을 높이기 위하여, 상기 카르고 도메인(생체분자)의 C말단에 소포체 잔류 서열이 추가로 연결되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.Meanwhile, the polypeptide according to the present invention may further be characterized in that an endoplasmic reticulum residue is further linked to the C-terminus of the cargo domain (biomolecule) to enhance the intracellular delivery efficiency of the biomolecule.

본 발명에서, 소포체 잔류 서열은 상기 폴리펩타이드가 세포의 소포체에 잔류하게 하여 외래분자가 세포 내로 투과되는 데 도움을 주는 서열을 의미한다. 상기 소포체 잔류 서열은 KDEL, REDLK 등의 서열을 포함하여 외래분자가 소포체에 잔류할 수 있도록 도움을 준다.In the present invention, the ER retention sequence refers to a sequence that allows the polypeptide to remain in the endoplasmic reticulum of the cell, thereby allowing the foreign molecule to penetrate into the cell. The ER retention sequence may include sequences such as KDEL, REDLK, etc. to help foreign molecules remain in the ER.

본 발명에서는, 수용체 인식 도메인과 도메인 2의 사이에 들어갈 링커를 여러 가지로 테스트 한 결과, 약 12개 아미노산 가량의 링커(서열번호 6)를 사용하는 것이 최적인 것을 확인할 수 있었다. 또한 도메인 2와 카르고 도메인의 사이 역시 같은 방법으로 테스트 한 결과, 약 8개 아미노산 가량의 링커(서열번호 7)를 사용하는 것이 최적인 것을 확인할 수 있었다.In the present invention, it has been confirmed that it is optimal to use about 12 amino acid linkers (SEQ ID NO: 6) as a result of various tests of the linker between the receptor recognition domain and thedomain 2. In addition, the same method was also used for thedomain 2 and the cargo domain. As a result, it was confirmed that it was optimal to use about 8 amino acid linkers (SEQ ID NO: 7).

본 발명에 있어서, 상기 도메인 2의 N말단과 수용체 인식 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, the N-terminus of thedomain 2 and the receptor recognition domain may be connected by a linker represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, but are not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 도메인 2의 C말단과 카르고 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, the C-terminus and the cargo domain of thedomain 2 may be linked by a linker represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, but are not limited thereto.

본 발명에서는 template의 구성요소인 수용체 인식 도메인 및 카르고 도메인을 합성하기 위해 상기 각각의 도메인을 코딩하는 핵산을 PCR을 통해 증폭한 다음, 대장균에 도입하였다.In the present invention, in order to synthesize a receptor recognition domain and a cargo domain which are components of a template, a nucleic acid encoding each of the above domains was amplified by PCR and then introduced into E. coli.

본 발명에서는, 도메인 2의 N말단의 수용체 인식 도메인으로 시가톡신의 B-Subunit을 사용하고, C말단의 카르고 도메인으로 eGFP를 사용하였다. 상기에서 완성된 유전자 구조체의 발현을 위해 pET계 벡터로 삽입한 다음, 대장균에 도입한 후 발현하였다. 발현된 폴리펩타이드는 Ni-NTA 컬럼과 겔침투크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC)를 이용하여 순수하게 정제하였다(서열번호 10). 상기에서 정제된 폴리펩타이드 1 μM을 HepG2(KCTC, No. HC18302)와 Vero cell(KCTC, No. AC28810)에 3시간씩 처리한 다음, 공초점레이저주사현미경으로 확인한 결과, 세포 내로 eGFP가 전달된 것을 확인할 수 있었다(도 3).In the present invention, the B-subunit of ciguatoxin was used as the receptor recognition domain at the N-terminus ofdomain 2, and the eGFP was used as the cargo domain at the C-terminus. For expression of the completed gene construct, the vector was inserted into a pET system vector and then introduced into Escherichia coli and then expressed. The expressed polypeptides were purified purely using a Ni-NTA column and gel permeation chromatography (GPC) (SEQ ID NO: 10). 1 μM of the purified polypeptide was treated with HepG2 (KCTC, No. HC18302) and Vero cell (KCTC, No. AC28810) for 3 hours, followed by confocal laser scanning microscopy. As a result, eGFP was transferred into the cells (Fig. 3).

본 발명의 다른 실시예에서는, 수용체 인식 도메인이 교체 가능한 것을 증명하기 위해 카르고 도메인은 그대로 두고, 수용체 인식 도메인으로 hEGF를 사용하였다. 상기에서 완성된 유전자는 발현을 위해 pET계 벡터로 삽입한 다음, 대장균에 도입한 후 발현하였다. 발현된 폴리펩타이드는 Ni-NTA 컬럼과 겔침투크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC)를 이용하여 순수하게 정제되었다(서열번호 11). 상기에서 정제된 폴리펩타이드 1 μM을 Hcc827(ATCC, No. CRL-2868)과 Vero cell에 6시간씩 처리한 다음, 공초점레이저주사현미경으로 확인한 결과, EGFR을 발현하는 Hcc827 세포 내에서만 eGFP가 전달된 것을 확인할 수 있었다(도 5).In another embodiment of the present invention, hEGF was used as the receptor recognition domain, leaving the cargo domain intact to prove that the receptor recognition domain is interchangeable. The gene thus completed was inserted into a pET system vector for expression and then introduced into E. coli and then expressed. The expressed polypeptide was purified pure using a Ni-NTA column and gel permeation chromatography (GPC) (SEQ ID NO: 11). 1 μM of the purified polypeptide was treated with HCC827 (ATCC, No. CRL-2868) and Vero cell for 6 hours, followed by confocal laser scanning microscopy. As a result, eGFP was expressed only in HCC827 cells expressing EGFR (Fig. 5).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 카르고 도메인이 교체 가능한 것을 증명하기 위해 수용체 인식 도메인은 그대로 두고, 카르고 도메인으로 renilla luciferase를 사용하였다. 상기에서 완성된 유전자는 발현을 위해 pET계 벡터로 삽입한 다음, 대장균에 도입한 후 발현하였다. 발현된 폴리펩타이드는 Ni-NTA 컬럼과 겔침투크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC)를 이용하여 순수하게 정제되었다(서열번호 12). 상기에서 정제된 폴리펩타이드는 HepG2 cell을 이용하여 테스트 해 보았다. 세포 내 luciferase의 활성을 측정해 본 결과, 1시간 만에 세포 내로 충분한 양의 luciferase가 전달 된 것을 확인할 수 있었다(도 6).In another embodiment of the present invention, renilla luciferase was used as the cargo domain, leaving the receptor recognition domain intact to demonstrate that the cargo domain is interchangeable. The gene thus completed was inserted into a pET system vector for expression and then introduced into E. coli and then expressed. The expressed polypeptides were purified pure using a Ni-NTA column and gel permeation chromatography (GPC) (SEQ ID NO: 12). The purified polypeptides were tested using HepG2 cells. As a result of measuring the activity of intracellular luciferase, it was confirmed that sufficient amount of luciferase was delivered into the cell within 1 hour (FIG. 6).

본 발명은 다른 관점에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터; 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide; A recombinant vector comprising the polynucleotide; The polynucleotide or the recombinant microorganism into which the recombinant vector is introduced.

본 발명에서, 폴리뉴클레오타이드는 당과 인산기와 염기가 결합한 단위체인 뉴클레오타이드가 수천 개 이상 결합한 것을 의미한다. 뉴클레오타이드는 인산이에스테르 결합으로 긴 사슬을 형성한다. 이때 당과 인산의 골격이 반복적으로 들어가고, 사이사이로 염기의 순서가 불규칙하게 배치된다. 염기 배치의 불규칙성과 길이에 따라 유전자에 들어가는 핵심 정보가 형성된다. 폴리뉴클레오타이드는 한쪽 사슬의 끝이 5`말단이며 다른 쪽 사슬 끝은 반드시 3`말단으로 되어 방향성을 가진다. 이때 말단의 성격을 5`-인산기, 3`-히드록시기 등으로 함께 표시해준다. DNA와 RNA 모두 폴리뉴클레오타이드 형태로 되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 단백질 생합성에 중요한 역할을 한다.In the present invention, a polynucleotide means that several thousands of nucleotides, which are units in which a sugar, a phosphate group and a base are combined, are bonded. Nucleotides form long chains with phosphoric acid ester bonds. At this time, the skeleton of sugar and phosphoric acid repeatedly enters, and the order of the bases is intermittently arranged irregularly. Depending on the irregularity and length of the base arrangement, key information that enters the gene is formed. The polynucleotide has a 5 'end at one end and a 3' end at the other end. At this time, the character of the terminal is indicated together with 5'-phosphate group and 3'-hydroxy group. Both DNA and RNA are in polynucleotide form. Polynucleotides play an important role in protein biosynthesis.

본 발명에서, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환 된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.In the present invention, the term "vector" means a DNA product containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the desired protein operably linked to a suitable regulatory sequence so as to be capable of expressing the protein of interest in a suitable host cell. The regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for modulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation, And can be variously manufactured. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. The vector may be transcribed into a suitable host, then replicated or functional, independent of the host genome, and integrated into the genome itself.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합 된 상태의 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pACYC177, pCL, pCC1BAC 벡터를 사용할 수 있다.The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it is replicable in the host cell, and any vector known in the art can be used. Examples of commonly used vectors include plasmids in the natural or recombinant state, phagemids, cosmids, viruses and bacteriophages. For example, pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector, and pBR type, pUC type, pBluescriptII type , pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based, and the like. The vector usable in the present invention is not particularly limited, and known expression vectors can be used. Preferably, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector and the like can be used. Most preferably, pACYC177, pCL, pCC1BAC vectors can be used.

본 발명에서, “재조합 미생물”은 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 벡터가 숙주세포에 도입되거나, 하나 이상의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 미생물에 도입되어 폴리뉴클레오타이드가 염색체에 통합되어 목적 단백질을 발현시키도록 형질이 감염된 세포를 의미하며, 진핵세포, 원핵세포 등의 모든 세포가 될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포가 될 수 있다.In the present invention, " recombinant microorganism " means that a vector having a polynucleotide encoding at least one target protein is introduced into a host cell, or a polynucleotide encoding at least one target protein is introduced into a microorganism to integrate the polynucleotide into a chromosome Means a cell infected with a trait to express a protein, and may be any cell such as a eukaryotic cell, a prokaryotic cell, etc., but is not limited to, a bacterial cell such as Escherichia coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Yeast cells; Fungal cells such as Pichia pastoris; Insect cells such as Drosophila and Spodoptera Sf9 cells; CHO, COS, NSO, 293, and Bowmanlanoma cells.

본 발명에서, "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하거나 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포의 염색체에 통합 완성시켜 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.In the present invention, "transformation" means that a polynucleotide encoding polynucleotide encoding a target protein is introduced into a host cell or a polynucleotide encoding a target protein is integrated into the chromosome of a host cell, whereby the polynucleotide Which means that the protein to be encoded can be expressed. The transformed polynucleotide includes all of these, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, so long as it can be expressed in the host cell. In addition, the polynucleotide includes DNA and RNA encoding the target protein. The polynucleotide may be introduced in any form so long as it can be introduced into a host cell and expressed. For example, the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression. The expression cassette typically includes a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal. The expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication. The polynucleotide may also be introduced into the host cell in its own form and operably linked to a sequence necessary for expression in the host cell.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드 제조방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a polypeptide, comprising: (a) culturing the recombinant microorganism to produce a polypeptide; And (b) recovering the produced polypeptide. The present invention also relates to a method for producing a polypeptide capable of delivering a biomolecule into a cell.

본 발명에서, 재조합 미생물을 배양하는 단계는 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행됨이 바람직하고, 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양함이 바람직하다. 상기 배양에 의하여 생산된 상기 폴리펩타이드는 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.In the present invention, the step of culturing the recombinant microorganism is not particularly limited, but is preferably carried out by a known batch culture method, a continuous culture method, a fed-batch culture method and the like, and the culture conditions are not particularly limited. However, (PH 5 to 9, preferably pH 6 to 8, and most preferably pH 6.8) can be controlled using an acidic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia or an acidic compound such as phosphoric acid or sulfuric acid. The oxygen or oxygen-containing gas mixture can be introduced into the culture to maintain aerobic conditions and the incubation temperature can be maintained at 20 to 45 캜, preferably 25 to 40 캜, and incubated for about 10 to 160 hours . The polypeptide produced by the culture may be secreted into the medium or left in the cells.

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예:팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예:아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.In addition, the culture medium used may be a carbon source such as sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower seeds Alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid, etc. may be used individually or in combination with one or more of the following: ; Examples of nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, juice, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium nitrate) may be used individually or in combination; As the phosphorus source, potassium dihydrogenphosphate, dipotassium hydrogenphosphate and the corresponding sodium-containing salt may be used individually or in combination; Other metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate, amino acids and vitamins.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 폴리펩타이드를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 폴리펩타이드를 수집할 수 있다.
The method for recovering the polypeptide produced in the culturing step of the present invention can be carried out by culturing the desired polypeptide from the culture solution using a suitable method known in the art according to a culture method, for example, a batch method, a continuous method or a fed- Can be collected.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

단백질 구조 분석을 통한 기본 시스템 설계Basic system design through protein structure analysis

본 발명에서는 외래 생체분자를 세포 내로 전달하는 기술을 개발하기 위하여 박테리아가 생성하는 독소 단백질의 특성을 기반으로 기본 시스템을 설계하여 외래 생체분자를 특정 세포 내로 안전하게 고효율로 전달할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.In the present invention, in order to develop a technology for transferring foreign biomolecules into cells, a basic system is designed based on the characteristics of the toxin proteins produced by the bacteria to develop a technology capable of safely and efficiently delivering foreign biomolecules into specific cells .

본 발명의 핵심은 박테리아의 독소를 외래 단백질의 세포 내 전달 매개체로 이용하기 위해 숙주세포에 대한 독성이 제거된 비 독성 독소를 새롭게 구조 기반으로 설계하고 이를 기본 골격으로 하여 숙주세포의 세포막 수용체를 특이적으로 인식하는 “수용체 인식 도메인”, 그리고 외래 단백질이 연결되는 “카르고(cargo) 도메인” 을 포함한 새로운 생체분자 전달체를 개발하는 것이다.The core of the present invention is to design a non-toxic toxin that is toxic to the host cell to be used as a transduction medium for the exogenous protein, and to design the cell membrane receptor of the host cell to be specific Receptor recognition domain, which is recognized as a target protein, and a "cargo domain" to which foreign proteins are linked.

실시예 1-1: 도메인의 합성 방법Example 1-1: Synthesis of domain

본 발명에서는 template의 구성요소인 수용체 인식 도메인 및 카르고 도메인을 합성하기 위해 PCR을 수행하였다.In the present invention, PCR was performed to synthesize a receptor recognition domain and a cargo domain, which are components of a template.

PCR 조건은 100 μM primer를 각각 0.3 ㎕, 10X nPfu Buffer 5 ㎕, 2 mM dNTP 5 ㎕, 2 U nPfu Polymerase와 template를 넣어 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 각각의 도메인을 합성하기 위해 사용한 primer set는 서열번호 13 내지 20과 같다(표 1). PCR program은 첫 번째 단계에서 95℃ 30초를 1회 수행 후, 두 번째 단계 (95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30분)를 30회 반복 수행하고, 마지막으로 72℃ 2분을 한차례 수행하였다. PCR product는 카르고 도메인의 경우 HindIII와 NheI으로, 수용체 결합 도메인의 경우 NdeI과EcoRΙ을 이용하여 pET21a vector에 cloning하였다. 모든 유전자는 벡터를 이용하여 대장균 형질전환을 통해 합성하였다.
The PCR conditions were as follows: 0.3 μl of each 100 μM primer, 5 μl of 10 × nPfu Buffer, 5 μl of 2 mM dNTP, 2 μl of nPfu Polymerase and template to give a final volume of 50 μl. The primer sets used to synthesize the respective domains are shown in SEQ ID NOS: 13 to 20 (Table 1). The PCR program was repeated 30 times at 95 ° C for 30 seconds, followed by the second step (95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 minutes), and finally 72 ° C for 2 minutes . PCR product was cloning in pET21a vector using the NdeI andEco case of carboxylic and RΙ For a domain with HindIII and NheI, the receptor binding domain. All genes were synthesized by E. coli transformation using vector.

도메인과 해당 도메인의 Primer setPrimer set of domain and its domain증폭대상 도메인Target domain to be amplified도메인 이름Domain namePrimer Set(Forward/Reverse)Primer Set (Forward / Reverse)수용체 인식 도메인Receptor recognition domainB-SubunitB-SubunitATAACATATGaagaagatgtttatggcggtttta/ataa gaattc gtcattattaaactgcacATAACATATGaagaagatgtttatggcggtttta / ataa gaattc gtcattattaaactgcachEGFhEGFctg catatg aacagtgatagcgagtgt/
ataa gaattc gcgcagctcccaccatttctg catatg aacagtgatagcgagtgt /
ataa gaattc gcgcagctcccaccattt카르고 도메인Cargo domaineGFPeGFPAtaa aagctt gtgagcaagggcgaggag/
Ataa gctagc cttgtacagctcgtccatAtaa aagctt gtgagcaagggcgaggag /
Ataa gctagc cttgtacagctcgtccatRenilla luciferaseRenilla luciferaseAtaa aagctt tccaaggtgtacgacccc/
Ataa gctagc ctgctcgttcttcagcacAtaa aagctt tccaaggtgtacgacccc /
Ataa gctagc ctgctcgttcttcagcac

형질전환은 Origami B(DE3) strain(E. coli)을 이용하였다. 4℃ competent cell에 벡터를 섞고, 42℃ 항온수조에서 90초간 가열한 후, 얼음 위로 옮겨 3분간 냉각하여 실시하였다. 37℃ 진탕배양기에서 1시간 동안 배양한 후 고형배지에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 형질전환된 cell을 500 mL LB배지에 OD 0.5까지 배양한 후 18℃에서 24시간 발현하였다.
Transformation was performed using Origami B (DE3) strain (E. coli ). The vector was mixed with 4 ° C competent cells, heated in a constant temperature water bath at 42 ° C for 90 seconds, transferred onto ice and cooled for 3 minutes. Cultured in a 37 ° C shaking incubator for 1 hour, plated on a solid medium, and cultured at 37 ° C. The transformed cells were cultured in 500 mL of LB medium to OD 0.5 and then expressed at 18 ° C for 24 hours.

실시예 1-2: 세포투과 도메인 개발을 위한 박테리아 유래 독소 단백질 구조 및 기능 분석Example 1-2: Analysis of bacterial-derived toxin protein structure and function for developing a cell permeation domain

장출혈성 대장균이나 녹농균 등의 박테리아가 생성하는 독소 단백질들은 숙주의 특정 세포막 수용체와 결합한 후 숙주세포가 본래 갖고 있는 단백질 전달 시스템을 이용하여 초기 엔도솜을 거쳐 소포체로 이동한 후에 최종적으로 세포질로 침투하여 세포의 사멸을 일으킨다. 본 연구에서는 위와 같이 오랜 시간 동안 진화해온 박테리아 독소 단백질의 특성에 착안하여 외래 생체분자를 세포 내로 효율적으로 전달하는 새로운 기술을 개발하고자 하였다.The toxin proteins produced by bacteria such as enterohemorrhagic Escherichia coli and P. aeruginosa bind to a specific cell membrane receptor of the host, and then they migrate to the endoplasmic reticulum through the endo-somatic cells using the original protein transfer system of the host cell, Causing cell death. In this study, we focused on the characteristics of bacterial toxin proteins that have evolved for a long time and developed a new technology to efficiently transfer foreign biomolecules into cells.

녹농균이 생성하는 독소 단백질의 구조를 분석한 결과, 4가지의 도메인으로 나눌 수 있었으며, 그 중 도메인 2의 독소 단백질이 세포막을 투과시키는 기능을 갖고 있음을 알게 되었다. 도메인 2의 유전자를 합성한 후, 대장균을 형질전환하여 발현테스트를 한 결과, 성공적으로 발현 되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result of analyzing the structure of toxin protein produced by P. aeruginosa, it was divided into four domains, and it was found that the toxin protein ofdomain 2 had a function of permeating the cell membrane. After the gene of thedomain 2 was synthesized, E. coli was transformed and tested for expression, and it was confirmed that the gene was successfully expressed.

실시예 1-3: 수용체 인식 도메인 및 카르고 도메인 연결을 위한 연결체 및 소포체 잔류 서열 결합Examples 1-3: Linker and ER for the receptor recognition domain and cargo domain linkage Residual sequence binding

상기 도메인 2의 구조 및 기능을 분석해 본 결과, 본 시스템은 “수용체 인식 도메인”, “도메인 2”, “카르고 도메인”, 마지막으로 소포체 잔류 서열 순으로 구성되는 것이 최적으로 판단되었다. 수용체 인식 도메인과 도메인 2 사이에 들어갈 링커를 여러 가지로 테스트 한 결과, 약 12개 아미노산 가량의 링커(서열번호 6)를 사용하는 것이 최적인 것으로 확인되었다. 도메인 2와 카르고 도메인 사이 역시 같은 방법으로 테스트 한 결과, 약 8개 아미노산 가량의 링커(서열번호 7)를 사용하는 것이 최적인 것으로 확인되었다. 소포체 잔류 서열은 카르고 도메인의 카르복시 말단에 결합하는 것이 최적으로 판단되었기에 상기 순서로 유전자 수준으로 template 를 구축하였다.As a result of analyzing the structure and function of the above-mentioneddomain 2, it was determined that the present system was composed of "receptor recognition domain", "domain 2", "cargo domain", and lastly the ER retention sequence. A number of linkers between the receptor recognition domain anddomain 2 were tested and it was found to be optimal to use about 12 amino acid linkers (SEQ ID NO: 6). As a result of testing between thedomain 2 and the cargo domain in the same manner, it was confirmed that using about 8 amino acid linkers (SEQ ID NO: 7) was optimal. Since the endoplasmic reticulum residue sequence was best judged to bind to the carboxy terminus of the cargo domain, a template was constructed at the gene level in this order.

상기 template는 수용체 인식 도메인과 카르고 도메인이 제한효소 등을 이용하여 손쉽게 삽입되고 교체될 수 있도록 구성하였다. 상기 template의 발현과 정제의 편의성을 위하여 pET계 벡터에 삽입하여 기본 시스템의 template 구축을 완료하였다(도 1).
The template is constructed so that the receptor recognition domain and cargo domain can be easily inserted and replaced using restriction enzymes. For ease of expression and purification of the template, template construction of the basic system was completed by inserting it into a pET system (Fig. 1).

Gb3를 매개로 한 eGFP의 세포 내 전달Gb3 mediated intracellular delivery of eGFP

실시예 1에서 구축된 template를 기반으로 세포막 수용체인 Gb3를 매개로 eGFP를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드를 설계 및 실험하였다.
Based on the template constructed in Example 1, a polypeptide that transfers eGFP into cells via Gb3, a cell membrane receptor, was designed and tested.

실시예 2-1: Gb3를 매개로 한 eGFP의 세포 내 전달을 위한 유전자 및 폴리펩타이드 합성Example 2-1 Gene and Polypeptide Synthesis for Gb3-mediated Intracellular Delivery of eGFP

수용체 인식 도메인으로 시가톡신의 B-subunit을 사용하였다. B-subunit은 시가톡신의 일부로써, 동물세포의 세포막 수용체인 Gb3를 인식하는 것으로 알려져 있다. 그리하여 B-subunit과 eGFP의 유전자를 각각 수용체 인식 도메인과 카르고 도메인으로 사용하였다(도 2).The B-subunit of ciguatoxin was used as the receptor recognition domain. The B-subunit is known to recognize Gb3, a membrane receptor of animal cells, as part of a cytotoxin. Thus, the genes for B-subunit and eGFP were used as receptor recognition domains and cargo domains, respectively (Fig. 2).

상기에서 완성된 유전자 구조체의 발현을 위해 pET계 벡터로 삽입한 다음, 대장균에 도입한 후 발현하였다. 발현된 폴리펩타이드는 Ni-NTA 컬럼과 겔침투크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC)를 이용하여 순수하게 정제하였다(서열번호 10).
For expression of the completed gene construct, the vector was inserted into a pET system vector and then introduced into Escherichia coli and then expressed. The expressed polypeptides were purified purely using a Ni-NTA column and gel permeation chromatography (GPC) (SEQ ID NO: 10).

실시예 2-2: Gb3를 매개로 한 eGFP의 세포 내 전달 평가Example 2-2: Evaluation of intracellular delivery of eGFP mediated by Gb3

실시예 2-1에서 정제된 폴리펩타이드 1 μM을 HepG2(KCTC, No. HC18302)와 Vero cell(KCTC, No. AC28810)에 3시간씩 처리한 다음, 공초점레이저주사현미경으로 확인한 결과, 세포 내로 eGFP가 전달된 것을 확인할 수 있었다(도 3).
1 μM of the polypeptide purified in Example 2-1 was treated with HepG2 (KCTC, No. HC18302) and Vero cell (KCTC, No. AC28810) for 3 hours and then examined with a confocal laser scanning microscope. As a result, eGFP was transferred (Fig. 3).

EGFR를 매개로 한 eGFP의 세포 내 전달Intracellular delivery of EGFR mediated eGFP

수용체 인식 도메인이 교체 가능함을 증명하기 위하여, 실시예 1에서 구축된 template를 기반으로 세포막 수용체인 EGFR를 매개로 eGFP를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드를 설계 및 실험하였다.
In order to demonstrate that the receptor recognition domain can be replaced, a polypeptide that transmits eGFP into the cell via a cell membrane receptor, EGFR, based on the template constructed in Example 1, was designed and tested.

실시예 3-1: EGFR를 매개로 한 eGFP의 세포 내 전달을 위한 유전자 및 폴리펩타이드 합성Example 3-1: Genes and polypeptide synthesis for intracellular delivery of eGFR mediated by EGFR

수용체 인식 도메인으로 human Epidermal Growth Factor(hEGF)를 사용하였다. hEGF는 동물세포의 세포막 수용체인 EGFR을 인식하는 사람 유래 호르몬이다. 그리하여 hEGF와 eGFP의 유전자를 각각 수용체 인식 도메인과 카르고 도메인으로 사용하였다(도 4).Human epidermal growth factor (hEGF) was used as the receptor recognition domain. hEGF is a human-derived hormone that recognizes EGFR, a membrane receptor for animal cells. Thus, the genes for hEGF and eGFP were used as receptor recognition domains and cargo domains, respectively (Fig. 4).

상기에서 완성된 유전자 구조체의 발현을 위해 pET계 벡터로 삽입한 다음, 대장균에 도입한 후 발현하였다. 발현된 폴리펩타이드는 Ni-NTA 컬럼과 겔침투크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC)를 이용하여 순수하게 정제되었다(서열번호 11).
For expression of the completed gene construct, the vector was inserted into a pET system vector and then introduced into Escherichia coli and then expressed. The expressed polypeptide was purified pure using a Ni-NTA column and gel permeation chromatography (GPC) (SEQ ID NO: 11).

실시예 3-2: EGFR를 매개로 한 eGFP의 세포 내 전달 평가Example 3-2: Evaluation of intracellular delivery of eGFR mediated by EGFR

실시예 3-1에서 정제된 폴리펩타이드 1 μM을 Hcc827(ATCC, No. CRL-2868)과 Vero cell에 6시간씩 처리한 다음, 공초점레이저주사현미경으로 확인한 결과, EGFR을 발현하는 Hcc827 세포 내에서만 eGFP가 전달된 것을 확인할 수 있었다(도 5).
1 μM of the polypeptide purified in Example 3-1 was treated with HCC827 (ATCC, No. CRL-2868) and Vero cell for 6 hours and then examined by confocal laser scanning microscopy. As a result, HCC827 cells expressing EGFR (Fig. 5).

Gb3를 매개로 한 luciferase의 세포 내 전달Intracellular delivery of luciferase mediated by Gb3

본 발명이 다양한 단백질의 세포 내 전달이 가능함을 증명하기 위하여, 실시예 1에서 구축된 template를 기반으로 세포막 수용체인 Gb3를 매개로 luciferase를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드를 설계 및 실험하였다.In order to demonstrate that the present invention is capable of intracellular delivery of various proteins, a polypeptide that transfers luciferase into cells via a cell membrane receptor, Gb3, was designed and tested based on the template constructed in Example 1.

수용체 인식 도메인으로 실시예 2와 같이 시가톡신의 B-subunit을 사용하였고, renilla luciferase를 카르고 도메인으로 사용하였다. 완성된 유전자 구조체의 발현을 위해 pET계 벡터로 삽입한 다음, 대장균에 도입한 후 발현하였다. 발현된 폴리펩타이드는 Ni-NTA 컬럼과 겔침투크로마토그래피(Gel permeation chromatography, GPC)를 이용하여 순수하게 정제되었다(서열번호 12).As the receptor recognition domain, the B-subunit of ciguatoxin was used and the renilla luciferase was used as the cargo domain as in Example 2. Inserted into a pET system vector for expression of the completed gene construct, and then introduced into E. coli and then expressed. The expressed polypeptides were purified pure using a Ni-NTA column and gel permeation chromatography (GPC) (SEQ ID NO: 12).

상기에서 정제된 폴리펩타이드는 HepG2 cell을 이용하여 테스트 해 보았다. 세포 내 luciferase의 활성을 측정한 결과, 1시간 만에 세포 내로 충분한 양의 luciferase가 전달된 것을 확인할 수 있었다(도 6).
The purified polypeptides were tested using HepG2 cells. As a result of measuring the activity of intracellular luciferase, it was confirmed that sufficient amount of luciferase was delivered into the cell within 1 hour (FIG. 6).

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments, It will be obvious. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology<120> Polypeptides delivering biomolecules into the cytoplasm and use thereof<130> P14-B223<160> 20<170> KopatentIn 2.0<210> 1<211> 113<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Domain 2<400> 1Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu 1 5 10 15 Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln 20 25 30 Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu 35 40 45 Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala 50 55 60 Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser 85 90 95 Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala 100 105 110 Asn <210> 2<211> 73<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Receptor binding domain(B-Subunit)<400> 2Met Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu 1 5 10 15 Asn Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Ala Gly Lys Glu Tyr 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His Met 65 70 75 80 Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln 85 90 95 Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala 100 105 110 Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys 115 120 125 Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu 130 135 140 Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys145 150 155 160 Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly 165 170 175 Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp 180 185 190 Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala 195 200 205 Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu 210 215 220 Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225 230 235 240 Ala Ser <210> 5<211> 313<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Cargo domain(Rluc8)<400> 5Lys Leu Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr 1 5 10 15 Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn 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eGFP<400> 10Met Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu 1 5 10 15 Asn Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Ala Gly Lys Glu Tyr Trp Thr Ser 20 25 30 Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met 35 40 45 Thr Val Thr Ile Lys Ser Ser Thr Cys Glu Ser Gly Ser Gly Phe Ala 50 55 60 Glu Val Gln Phe Asn Asn Asp Glu Phe Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His 85 90 95 Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro 100 105 110 Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu 115 120 125 Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln 130 135 140 Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly145 150 155 160 Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu 165 170 175 Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp 180 185 190 Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu 195 200 205 Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 210 215 220 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu225 230 235 240 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 245 250 255 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu 260 265 270 Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln 275 280 285 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 290 295 300 Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val305 310 315 320 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 325 330 335 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 340 345 350 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 355 360 365 Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 370 375 380 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro385 390 395 400 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 405 410 415 Lys Asp Pro Asn 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Thr Leu Ala145 150 155 160 Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu 165 170 175 Ala Gly Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu Val 180 185 190 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 195 200 205 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 210 215 220 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr225 230 235 240 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr 245 250 255 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His 260 265 270 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 275 280 285 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys 290 295 300 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp305 310 315 320 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 325 330 335 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 340 345 350 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln 355 360 365 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 370 375 380 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys385 390 395 400 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 405 410 415 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Ser His 420 425 430 His His His His His Lys Asp Glu Leu 435 440 <210> 12<211> 529<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> B-Subunit - Domain 2 - Rluc8<400> 12Met Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu 1 5 10 15 Asn Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Ala Gly Lys Glu Tyr Trp Thr Ser 20 25 30 Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met 35 40 45 Thr Val Thr Ile Lys Ser Ser Thr Cys Glu Ser Gly Ser Gly Phe Ala 50 55 60 Glu Val Gln Phe Asn Asn Asp Glu Phe Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His 85 90 95 Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro 100 105 110 Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu 115 120 125 Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln 130 135 140 Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly145 150 155 160 Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu 165 170 175 Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp 180 185 190 Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu 195 200 205 Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly Pro 210 215 220 Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser Phe Ile225 230 235 240 Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe Leu 245 250 255 His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val Pro His 260 265 270 Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly 275 280 285 Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp His Tyr 290 295 300 Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys Ile305 310 315 320 Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His Tyr Ala 325 330 335 Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu Ser Val 340 345 350 Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu Asp 355 360 365 Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn 370 375 380 Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu385 390 395 400 Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys Gly 405 410 415 Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu Val 420 425 430 Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala 435 440 445 Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu Ser Asp 450 455 460 Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro465 470 475 480 Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln Glu Asp 485 490 495 Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val 500 505 510 Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ser His His His His His His Lys Asp Glu 515 520 525 Leu <210> 13<211> 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PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Cargo domain (Rluc8)<400> 5Lys Leu Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr  1 5 10 15Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser             20 25 30Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile         35 40 45Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val     50 55 60Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly 65 70 75 80Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp                 85 90 95His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys            100 105 110Lys Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His        115 120 125Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu    130 135 140Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu145 150 155 160Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu                165 170 175Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg            180 185 190Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu        195 200 205Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro    210 215 220Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr225 230 235 240Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu                245 250 255Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys            260 265 270Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln        275 280 285Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu    290 295 300Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ser305 310<210> 6<211> 12<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Amino acid Linker between domain 2 and receptor binding domain<400> 6Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser  1 5 10<210> 7<211> 8<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Amino acid Linker between domain 2 and cargo domain<400> 7Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser  1 5<210> 8<211> 4<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> ER signal sequence 1<400> 8Lys Asp Glu Leu  One<210> 9<211> 5<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> ER signal sequence 2<400> 9Arg Glu Asp Leu Lys  1 5<210> 10<211> 458<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> B-Subunit - Domain 2 - eGFP<400> 10Met Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu  1 5 10 15Asn Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Ala Gly Lys Glu Tyr Trp Thr Ser             20 25 30Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met         35 40 45Thr Val Thr Ile Lys Ser Ser Thr Cys Glu Ser Gly Ser Gly Phe Ala     50 55 60Glu Val Gln Phe Asn Asn Asp Glu Phe Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His                 85 90 95Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His His Gln Pro            100 105 110Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu        115 120 125Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln    130 135 140Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly145 150 155 160Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu                165 170 175Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp            180 185 190Gly Aly Gly Aly Aly Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu        195 200 205Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val    210 215 220Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu225 230 235 240Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys                245 250 255Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu            260 265 270Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln        275 280 285His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg    290 295 300Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val305 310 315 320Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile                325 330 335Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn            340 345 350Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly        355 360 365Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val    370 375 380Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro385 390 395 400Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser                405 410 415Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val            420 425 430Thr Ala Gly Ily Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Ser        435 440 445His His His His His Lys Asp Glu Leu    450 455<210> 11<211> 441<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> hEGF-Domain 2 - eGFP<400> 11Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu  1 5 10 15His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys             20 25 30Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu         35 40 45Lys Trp Trp Glu Leu Arg Glu Phe Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser     50 55 60Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln 65 70 75 80Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg                 85 90 95Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val            100 105 110Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val        115 120 125Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu    130 135 140Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala145 150 155 160Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu                165 170 175Ala Gly Ala Ala Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu Val            180 185 190Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu        195 200 205Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly    210 215 220Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr225 230 235 240Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr                245 250 255Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His            260 265 270Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr        275 280 285Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys    290 295 300Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp305 310 315 320Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr                325 330 335Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile            340 345 350Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln        355 360 365Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val    370 375 380Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys385 390 395 400Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr                405 410 415Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Ser His            420 425 430His His His His His Lys Asp Glu Leu        435 440<210> 12<211> 529<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> B-Subunit - Domain 2 - Rluc8<400> 12Met Ala Asp Cys Ala Lys Gly Lys Ile Glu Phe Ser Lys Tyr Asn Glu  1 5 10 15Asn Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Ala Gly Lys Glu Tyr Trp Thr Ser             20 25 30Arg Trp Asn Leu Gln Pro Leu Leu Gln Ser Ala Gln Leu Thr Gly Met         35 40 45Thr Val Thr Ile Lys Ser Ser Thr Cys Glu Ser Gly Ser Gly Phe Ala     50 55 60Glu Val Gln Phe Asn Asn Asp Glu Phe Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His                 85 90 95Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His His Gln Pro            100 105 110Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu        115 120 125Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln    130 135 140Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly145 150 155 160Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu                165 170 175Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp            180 185 190Gly Aly Gly Aly Aly Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Lys Leu        195 200 205Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr Gly Pro    210 215 220Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser Phe Ile225 230 235 240Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile Phe Leu                245 250 255His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val Pro His            260 265 270Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly        275 280 285Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp His Tyr    290 295 300Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys Lys Ile305 310 315 320Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His Tyr Ala                325 330 335Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu Ser Val            340 345 350Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu Glu Asp        355 360 365Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu Glu Asn    370 375 380Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg Lys Leu385 390 395 400Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu Lys Gly                405 410 415Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro Leu Val            420 425 430Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala        435 440 445Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu Ser Asp    450 455 460Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro465 470 475 480Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln Glu Asp                485 490 495Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val            500 505 510Leu Lys Asn Glu Gln Ala Ser His His His His His Lys Asp Glu        515 520 525Leu   <210> 13<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> eGFP Forward Primer set<400> 13ataaaagctt gtgagcaagg gcgaggag 28<210> 14<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> eGFP Reverse Primer set<400> 14ataagctagc cttgtacagc tcgtccat 28<210> 15<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Rluc Forward Primer set<400> 15ataaaagctt tccaaggtgt acgacccc 28<210> 16<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Rluc Reverse Primer set<400> 16ataagctagc ctgctcgttc ttcagcac 28<210> 17<211> 34<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> B-Subunit Forward Primer set<400> 17ataacatatg aagaagatgt ttatggcggt ttta 34<210> 18<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> B-Subunit Reverse Primer set<400> 18ataagaattc gtcattatta aactgcac 28<210> 19<211> 27<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> hEGF Forward Primer set<400> 19ctgcatatga acagtgatag cgagtgt 27<210> 20<211> 28<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> hEGF Reverse Primer set<400> 20ataagaattc gcgcagctcc caccattt 28

Claims (16)

Translated fromKorean

세포투과 도메인을 기본 골격으로, 상기 세포투과 도메인의 N말단 및 C말단에 수용체 인식 도메인 및 카르고 도메인이 각각 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
A polypeptide capable of delivering a biomolecule into a cell, characterized in that the cell penetration domain is a basic skeleton, and a receptor recognition domain and a cargo domain are bound to the N terminal and C terminal of the cell permeation domain, respectively.
제1항에 있어서, 상기 세포투과 도메인은 녹농균 유래 독소 단백질의 일부 또는 장출혈성 대장균의 시가톡신(Shiga like toxin)인 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
[Claim 2] The polypeptide according to claim 1, wherein the cytotoxic domain is a part of a toxin protein derived from a pseudomonas sp. Or a shiga-like toxin of an intestinal hemorrhagic Escherichia coli.
제2항에 있어서, 상기 녹농균 유래 독소 단백질의 일부는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 도메인 2인 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
3. The polypeptide according to claim 2, wherein part of the Pseudomonas aeruginosa-derived toxin protein is domain 2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서, 상기 수용체 인식 도메인은 EGF, IL-6, Fc, 단일체인항체(scFv), 리피바디(Repebody), DARPin, Monobody, Nanobody, RGD 및 folate로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
The method of claim 1, wherein the receptor recognition domain is selected from the group consisting of EGF, IL-6, Fc, single chain antibody (scFv), Repebody, DARPin, Monobody, Nanobody, RGD and folate A polypeptide capable of transferring a biomolecule into a cell.
제4항에 있어서, 상기 수용체 인식 도메인은 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
5. The polypeptide according to claim 4, wherein the receptor recognition domain is represented by SEQ ID NO: 2 or 3. 3. A polypeptide capable of delivering a biomolecule into a cell.
제1항에 있어서, 상기 카르고 도메인은 치료용 단백질, 단일나선 핵산, 이중나선 핵산 및 소분자 약제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
The polypeptide according to claim 1, wherein the cargo domain is selected from the group consisting of a therapeutic protein, a single stranded nucleic acid, a double stranded nucleic acid and a small molecule drug.
제1항에 있어서, 상기 도메인 2의 N말단과 수용체 인식 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
2. The polypeptide according to claim 1, wherein the N-terminus of the domain 2 and the receptor recognition domain are linked by a linker represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
제1항에 있어서, 상기 도메인 2의 C말단과 카르고 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 링커에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
The polypeptide according to claim 1, wherein the C-terminus of the domain 2 and the cargo domain are linked by a linker represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
제1항에 있어서, 상기 카르고 도메인의 C말단에 소포체 잔류서열이 추가로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
The polypeptide according to claim 1, wherein an endoplasmic reticulum residue is further linked to the C-terminus of the cargo domain.
제9항에 있어서, 상기 소포체 잔류서열은 서열번호 8 또는 9로 표시되는 것을 특징으로 하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드.
10. The polypeptide according to claim 9, wherein the endoplasmic reticulum residual sequence is represented by SEQ ID NO: 8 or 9. 9. A polypeptide capable of delivering a biomolecule into a cell.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
11. A polynucleotide encoding the polypeptide of any one of claims 1 to 10.
제11항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
12. A recombinant vector comprising the polynucleotide of claim 11.
제11항의 폴리뉴클레오타이드가 도입되어 있는 재조합 미생물.
11. A recombinant microorganism into which the polynucleotide of claim 11 is introduced.
제12항의 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
12. A recombinant microorganism into which the recombinant vector of claim 12 is introduced.
다음의 단계를 포함하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드의 제조방법:
(a) 제13항의 재조합 미생물을 배양하여 제1항의 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
A method for producing a polypeptide capable of delivering a biomolecule into a cell, comprising the steps of:
(a) culturing the recombinant microorganism of claim 13 to produce the polypeptide of claim 1; And
(b) recovering the resulting polypeptide.
다음의 단계를 포함하는, 생체분자를 세포 내로 전달할 수 있는 폴리펩타이드의 제조방법:
(a) 제14항의 재조합 미생물을 배양하여 제1항의 폴리펩타이드를 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
A method for producing a polypeptide capable of delivering a biomolecule into a cell, comprising the steps of:
(a) culturing the recombinant microorganism of claim 14 to produce the polypeptide of claim 1; And
(b) recovering the resulting polypeptide.

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