KR20110057244A

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Publication number: KR20110057244A
Application number: KR1020117008801A
Authority: KR
Inventors: 바헤 베디언; 이안 폴츠; 데이비드 젠킨스
Original assignee: 메디뮨 엘엘씨
Priority date: 2008-09-19
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-05-31
Also published as: US8663636B2; US20100196385A1; US20120195905A1; JP5778577B2; RU2011115117A; US8192738B2; AU2009294415B2; CN102264763B; CA2735900A1; AU2009294415A1; US9206255B2; MX2011002837A; EP2927244A1; CN102264763A; HK1216028A1; JP2012502650A; RU2581962C2; WO2010032060A1; US20140206853A1; EP2344536A1

Abstract

본 발명은 DLL4에 대한 표적화된 결합제 및 당해 물질의 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 DLL4에 대한 완전한 인간 단클론 항체에 관한 것이다. 상기 기술된 표적화된 결합제는 DLL4의 활성 및/또는 과다생산과 관련된 질환의 치료 및 진단제로 유용하다.

Description

ＤＬＬ4에 대한 항체 및 이의 용도{Antibodies directed to DLL4 and uses thereof}

본 발명은 DLL4에 대한 표적화된 결합제 및 이의 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 DLL4에 대한 완전한 인간 단클론 항체들에 관한 것이다. 기술된 표적화된 결합제는 DLL4의 활성 및/또는 과다생산과 연관된 질환의 치료 및 진단물질로 유용하다.

Notch 신호생성(signaling) 캐스캐이드는 세포 운명 결정, 발생동안 많은 조직에서의 줄기 세포 유지 및 분화에 관련된 진화론적으로 보존된 경로다. 따라서, 포유류에게서 4개의 Notch 수용체 리간드 (Notch1-4) 및 5개 리간드 (Jagged-1/2 및 Delta-유사 리간드 (Dll) 1/3/4)가 확인되었다. Notch 수용체는 두 개의 비-공유적으로 연합된 세포외(extracellular) 서브유닛과 막통과 서브유닛으로 구성된 이형이량체로 존재한다. 세포외 서브유닛에 대한 리간드의 결합은 TNFα 전환 효소 (TACE) 및 감마-세크레타제와 같은 효소들에 의한 단백질 분해를 촉발시켜, Notch 세포내(intracellular) 도메인들 (NICD)을 생성하고, 이는 핵으로 전좌(translocate)되어 전사 인자들에 결합하여 결국 하류 표적 유전자들을 활성화시킨다 (Bray, 2006,Nat.Rev.Mol.Cell.Biol., 7, 678).

최근 증거들은 맥관구조내에서 Notch 다중 경로 성분들이 발현되고, 정상적인 Notch 신호생성의 이상은 맥관 표현형으로 나타난다는 것을 시사한다. 예를 들면, Jagged 1 및 Notch 3에서 돌연변이는 맥관 결함을 나타내는 두 가지 질환, 알라질 증후군(Alagille syndrome) 및 피질하부 경색과 백색질뇌증과 함께 대뇌 상염색체 우성 동맥병증(CADASIL)을 초래한다. 더욱이, 마우스에서 Notch1 및 DLL4의 유전적 결손은 맥관 이상과 배아 치사를 초래한다. 또한, 마우스에서 DLL4의 하나의 대립유전자의 결손은 대부분의 유전적 배경에서 심각한 맥관 결함을 가지는 배 치사를 초래한다 (Duarteetal., 2004,GenesDev., 18, 2474;Galeetal., 2004,Proc.Nat.Acad.Sci., 101, 15949). 이와 같은 표현형은 기존에 VEGF-A에 대해서만 보고되었으며, 맥관 발달에서 DLL4가 중요한 역할을 할 것이라고 보고 있다.

DLL4 발현은 인간의 투명세포 신장 세포 암종, 교아종 및 유방암 및 방광암 종양의 맥관구조에서 보고되었다(Mailhosetal., 2001,Differentiation, 69, 135;Pateletal., 2005,CancerRes., 65, 8690;Patelet al., 2006,Clin.CancerRes., 12, 4836;Lietal., 2007,CancerRes., 67, 11244). 최근 연구에서 인간 교아종의 종양 세포의 작은 부분에서 발현될 수 있다고 제안되었다(Liet al., 2007,CancerRes., 67, 11244). 종양 성장에서 DLL4 신호생성의 차단 효과는 몇 가지 선임상 모델에서 평가되었는데, 이때 면역결핍 마우스에서 종양 세포계는 피하를 통하여 성장하였다(Ridgwayetal., 2006,Nature, 444, 1083;Noguera-Troiseetal.,Nature, 444, 1032). 이와 같은 연구에서, 종양 성장의 감소가 보고되었다. 항-종양 효과는 혈중산소감소의 증가와 수반하여 종양에서 기능을 잘 하지 못하는 맥관의 밀도 증가와 관련되어 있다. 이를 함께 고려하면, 이들 데이타로부터 맥관 발생(development)에 있어서 DLL4의 역할에 추가하여, DLL4는 종양 맥관구조의 발생에도 역할을 할 수 있다고 제안된다.

맥관형성(angiogenesis)에 끼치는 영향에 추가하여, Notch 신호생성은 다중 종양 유형으로부터 암 줄기세포에 또한 관련되어있다 (Dontuetal., 2004,Breast Can.Res., 6,R605;Wilson &Radtke, 2006,FEBSLett., 580, 2860). 다양한 조혈 및 충실성 종양으로부터 암 줄기 세포들을 분리하였고,(Al-Hajjetal., 2003,Proc.Nat.Acad.Sci., 100, 3983;Lapidotetal., 1994, Nature, 17, 645;Tan etal., 2006,LaboratoryInvestigation, 86, 1203) 소집단의 종양 세포에 DLL4의 존재는 암 줄기 세포 생물학에 DLL4가 관련되어 있으며, DLL4 길항제들은 이들 세포 유형과 상호작용을 통하여 부분적으로 항-종양 효과를 중재할 것이라고 본다.

발명의 요약

본 발명은 DLL4에 특이적으로 결합하고, DLL4의 생물학적 활성을 저해하는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 본 발명의 구체예들은 DLL4에 특이적으로 결합하고, Notch 수용체 (가령, Notch 1, 2, 3 또는 4)에 DLL4의 결합을 저해하는 표적화된 결합제에 관한 것이다.

본 발명의 구체예들은 DLL4에 특이적으로 결합하고, Notch 수용체 (가령, Notch 1 또는 4)에 DLL4의 결합을 저해하는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 본 발명의 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 DLL4에 특이적으로 결합하고, Notch 수용체, 가령, Notch 1에 결합하는 것을 저해한다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 표적화된 결합제가 없을 경우 일어난 결합과 비교하였을 때, Notch 수용체(가령, Notch 1)에 DLL4이 결합하는 것을 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 저해한다.

본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 결합 특성들은 해리 또는 연합 속도(차례로 k_off 및 k_on)에 근거하여 측정될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 최소한 10⁴ M^-1S^-1, 최소한 5×10⁴ M^-1S^-1, 최소한 10⁵ M^-1S^-1, 최소한 2 ×10⁵ M^-1S^-1, 최소한 5 ×10⁵ M^-1S^-1, 최소한 10⁶ M^-1S^-1 최소한 5 × 10⁶ M^-1S^-1, 최소한 10⁷ M^-1S^-1, 최소한 5 × 10⁷ M^-1S^-1, 또는 최소한 10⁸ M^-1S^-1의 k_on 속도(항체(Ab)+항원(Ag)^kon→Ab-Ag)를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 5×lO^-1s^-1미만, lO^-1s^-1미만, 5×lO^-2s^-1미만, lO^-2s^-1미만, 5×lO^-3s^-1미만, lO^-3s^-1미만, 5×lO^-4s^-1미만, 4×lO^-4s^-1미만, 3×lO^-4s^-1미만, 2×lO^-4s^-1미만, lO^-4s^-1미만, 5×lO^-5s^-1미만, lO^-5s^-1미만, 5×lO^-6s^-1미만, lO^-6s^-1미만, 5×lO^-7s^-1미만, lO^-7s^-1미만, 5×lO^-8s^-1미만, lO^-8s^-1미만, 5×lO^-9s^-1미만, lO^-9s^-1미만, 또는 lO^-10s^-1미만의 k_off 속도((Ab-Ag)^koff→항체(Ab)+항원(Ag))를 가질 수 있다.

표적화된 결합제는 인간 DLL4에 특이적으로 결합한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 다른 종에서 기인된 다른 DLL4 단백질과 교차-반응성이 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 필리핀 원숭이(cynomolgus monkey) DLL4와 교차 반응성이 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 필리핀 원숭이 DLL4와 교차 반응성이 있으며, 다른 종의 DLL4과는 약한 교차 반응성이 있는데, 예를 들면, 마우스 DLL4와는 약한 교차 반응성이 있을 뿐이며, 표적화된 결합제는 BIAcore 기술을 이용하여 평가하였을 때, 360nM 이상의 K_D로 마우스 DLL4에 결합된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 다른 종의 DLL4 단백질들에 거의 동등한 친화력을 가진다. 한 특정 실시예에서, 본 발명의 인간 DLL4 표적화된 결합제는 필리핀 원숭이 DLL4에 대하여 거의 동등한 친화력을 가진다. 동등한 수준의 친화력이란, 인간 DLL4에 대한 친화력을 1로 하였을 때, 필리핀 원숭이 DLL4에 대한 친화력이 0.2-5 또는 0.2-2 사이가 된다는 것을 의미한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 인간 DLL4에 특이적이나 다른 Notch 리간드들에는 결합하지 않는다. 한 예로, 본 발명의 표적화된 결합제는 인간 DLL4에 특이적이지만 DLL1에는 유의적으로 결합하지 않으며, 가령, Dll1로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포 또는 인간 DLL1로 일시적으로 형질감염된 293T 세포에 결합하는 본원에 기술된 표적화된 결합제의 능력(15-300㎍/㎖)을 테스트함으로써 측정된 DLL1/mock 비율은 2.5미만이다. 또 다른 예로, 본 발명의 표적화된 결합제는 인간 DLL4에는 특이적이나, Jagged 1에는 유의적으로 결합하지 않으며, 가령, 인간 Jagged 1으로 안정적으로 형질감염된 HEK293 세포 또는 인간 Jagged 1로 일시적으로 형질감염된 293T 세포에 결합하는 본원에 기술된 표적화된 결합제의 능력(5㎍/㎖)을 테스트함으로써 측정된 DLL1/mock 비율은 1.5 미만이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 DLL4-Notch1 수용체-리간드 결합을 억제한다. 한 실시예에서, 표적화된 결합제가 보유하는 활성은 10 μM 이하의 IC₅₀ 농도 (50% 억제를 얻기 위한 농도)로 증명될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 5nM, 4nM, 2nM, 1nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM 또는 0.4 nM 미만의 IC₅₀농도를 가질 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 시험관내(invitro) 활성 및 생체내(invivo) 활성을 가질 수 있다. 한 가지 특정 구체예에서, 표적화된 결합제는 2D 배양물에서 HUVEC 세포 증식의 DLL4-자극된 억제를 역전시킨다. 한 예로, 본 발명의 항체는 대조(control)와 비교하였을 때(DLL4 첨가없이 실시예 9의 검사를 이용), HUVEC 세포 증식의 DLL4 자극된 억제를 70% 이상 가령, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 역전시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제, 가령, 본 발명의 항체는 2D 배양물에서 HUVEC 세관(tube) 형성을 억제시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체는 대조(대조는 동일 항체 20 ㎍/㎖를 이용하여 측정된 최대 억제 효과)과 비교하여 0.08 ㎍/㎖ 농도에서 50% 이상 가령, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 억제시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 t=0 대조와 비교하여 4시간 시점에서 50% 미만, 가령, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만의 내화(internalization)를 나타낼 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제는 t=0 대조와 비교하여 4시간 시점에서 5-50%, 10-40% 또는 20-40% 내화를 나타낼 수 있다(실시예 15 참고).

한 구체예에서, DLL4에 특이적으로 결합하는 본 발명의 표적화된 결합제는 다음 특성들 중 하나 이상을 나타낼 수 있다: 200 pM 미만의 K_D로 인간 DLL4에 결합하고; 필리핀 원숭이 DLL4와 교차반응하고; 마우스 DLL4와 약하게 교차반응하고; 필리핀 원숭이 DLL4에 거의 동등한 친화력으로 결합하고; DLL1 또는 Jagged 1에 유의적으로 결합하지 않으며; 대조와 비교하여 2D 배양물에서 HUVEC 세포 증식의 DLL4-자극된 억제를 85% 이상 역전시키고; 2D 배양물에서 대조와 비교하여 0.08 ㎍/㎖ 농도에서 HUVEC 세포의 세관 형성의 50% 이상 저해를 나타내고; t=0 대조에 비교하여 4시간 시점에서 50% 미만의 내화를 나타낸다.

또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합 단백질들은 유익한 효과, 대사 및/또는 약력학 특성을 보유한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 Notch 1에 결합하는 것에 대하여 완전한 인간 단클론 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 또는 21H3RK 중 어느 하나와 경쟁한다.

일부 본 발명의 구체예들에서, 표적화된 결합제는 포유류에서 종양 성장 및/또는 전이를 억제한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 맥관형성 관련된 이상을 치료할 수 있다.

일부 본 발명의 구체예들에서, 표적화된 결합제는 항체다. 일부 본 발명의 구체예들에서, 표적화된 결합제는 단클론 항체다. 본 발명의 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체들이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체들이다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 IgG2 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체들이다. 이 이소타입은 다른 이소타입들과 비교하여 효과물질 기능을 유도하는 능력이 감소되어, 감소된 독성을 유도할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 IgG1 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체들이다. 이 이소타입은 다른 이소타입들과 비교하여 ADCC를 유도하는 능력이 증가되어, 개선된 효과를 유도할 수 있다. IgG1 이소타입은 다른 이소타입, 가령 IgG4와 비교하여 개선된 안정성을 가지며, 이로 인하여 개선된 생체 이용성 또는 제조가 용이한 개선점 또는 더 긴 반감기들을 유도할 수 있다. 한 구체예에서, IgG1 이소타입의 완전한 인간 단클론 항체는 z, za 또는 f 알로타입(allotype)이다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제는 표 2에 나타낸 VH CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 표 2에 나타낸 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 DLL4에 면역특이적으로 결합하고, 표 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 상동성을 가지는 표 2에 나타낸 중쇄 가변 도메인과 표 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 90% 상동성을 가지는 표 2에 타나낸 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 DLL4에 결합 활성을 보유한다.

또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502, PTA-9517, PTA-9501, 또는 PTA-9508으로 기탁된 Mab2H10VHOP, Mab9G8VH, Mab21H3VH, 및 Mab4B4VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 가변 중쇄 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516, PTA-9500 또는 PTA-9520으로 기탁된 Mab9G8VLOPT1, Mab21H3VLOP, 및 Mab4B4VL 및 2009년 7월 7일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181으로 기탁된 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 가변 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2009년 7월 7일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181의 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2009년 7월 7일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181의 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2009년 7월 7일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181의 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516로 기탁된 Mab9G8VLOPT1로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516으로 기탁된 Mab9G8VLOPT1로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열, 및 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516으로 기탁된 Mab9G8VLOPT1로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열, 및 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9500로 기탁된 Mab21H3VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9500으로 기탁된 Mab21H3VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 및 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9500으로 기탁된 Mab21H3VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9508로 기탁된 Mab4B4VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9508로 기탁된 Mab4B4VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열과, 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9520로 기탁된 Mab4B4VL로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 CDR3을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9508로 기탁된 Mab4B4VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9520으로 기탁된 Mab4B4VL로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9508로 기탁된 Mab4B4VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열, 및 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9520으로 기탁된 Mab4B4VL로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 CDR 중 적어도 하나, 적어도 둘, 또는 적어도 세 개를 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9508로 기탁된 Mab4B4VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2009년 7월 7일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181로 기탁된 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516로 기탁된 Mab9G8VLOPT1로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9500로 기탁된 Mab21H3VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9520으로 기탁된 Mab4B4VL로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열, 및 2009년 7월 7일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181로 기탁된 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516로 기탁된 Mab9G8VLOPT1로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열, 및 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 중쇄 아미노산 서열, 및 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9500로 기탁된 Mab21H3VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9520으로 기탁된 Mab4B4VL로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열, 및 2008년 9월 17일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9520으로 기탁된 Mab4B4VL로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 항체의 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명 분야의 당업자는 CDR 결정을 용이하게 완성할 수 있을 것이다. 예를 들면,Kabatetal,SequencesofProteinofImmunologicalInterest,FifthEdition,NIHPublication 91-3242,BethesdaMD (1991),vols. 1-3 참고. Kabat는 다수의 특이적 종 항체 이소타입으로부터 면역글로블린 쇄의 다중 서열 배열들을 제공한다. Kabat 넘버링 시스템에 따라 배열된 서열들에 번호가 부여된다. Kabat 서열들은 1991 공개된 이후 업데이트되어, 전자 서열 데이터베이스(최근 다운로드가능한 버젼 1997)로 이용가능하다. Kabat 기준 서열과 함께 배열함으로써, Kabat에 따라 임의의 면역글로블린 서열에 번호를 부여할 수 있다. 따라서, Kabat 넘버링 시스템은 면역글로블린 쇄의 넘버링을 위한 불변(uniform) 시스템을 제공한다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 중쇄 서열들 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 항체 20G8, 21H3, 14B1, 18B7, 17B6, 17F3, 12A1, 17G12, 19G9, 21F7, 20D6, 1D4, 4B4, 2H10, 또는 21H3RK의 중쇄 서열 중 어느 하나 또는 표 5, 7, 9, 11 또는 13에 나타낸 이들 항체의 중쇄 서열의 임의의 최적화된 형태를 포함한다. 경쇄 혼합(promiscuity)은 본 기술 분야에 잘 확립된 것이며, 따라서, 항체 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK의 경쇄 서열 중 어느 하나 또는 표 6, 8, 10, 12 또는 13에 나타낸 바와 같은, 이들 항체의 경쇄 서열의 임의의 최적화된 형태, 또는 본원에 기술된 임의의 기타 항체를 포함한다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 중쇄 서열 중 어느 하나 또는 표 5, 7, 9, 11 또는 13에 나타낸 바와 같은, 이들 항체의 중쇄 서열의 임의의 최적화된 형태를 포함하고, 표 6, 8, 10, 12 또는 13에 나타낸 경쇄 서열의 임의의 최적화된 형태, 또는 본원에 기술된 임의의 기타 항체를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

일부 구체예에서, 표적화된 결합제는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 단클론 항체다: 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 하나 이상의 완전한 인간 단클론 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK을 포함한다. 특정 구체예에서, 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 4B4이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 21H3이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 2H10이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 9G8이다. 특정 기타 구체예에서, 표적 결합제는 단클론 항체 21H3RK이다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 서열 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 서열 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK의 CDR 중 어느 하나로부터 선택된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK의 CDR 중 어느 하나로부터 선택된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다

또 다른 구체예에서 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 것과 같이, 완전한 인간 단클론 항체들 4B4 또는 21H3, 2H10, 9G8, 또는 21H3RK 중 어느 하나의 가변 중쇄 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 것과 같이, 완전한 인간 단클론 항체들 4B4 또는 21H3, 2H10, 9G8, 또는 21H3RK 중 어느 하나의 가변 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 것과 같이, 완전한 인간 단클론 항체들 4B4 또는 21H3, 2H10, 9G8, 또는 21H3RK의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열과, 및 완전한 인간 단클론 항체들 4B4 또는 21H3, 2H10, 9G8, 또는 21H3RK의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 것과 같은, 완전한 인간 단클론 항체 4B4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열 및 표 2에 나타낸 것과 같은, 완전한 인간 단클론 항체 4B4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 것과 같은 완전한 인간 단클론 항체 21H3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열 및 표 2에 나타낸 것과 같은 완전한 인간 단클론 항체 21H3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2에 나타낸 것과 같은 완전한 인간 단클론 항체 2H10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열 및 표 2에 나타낸 것과 같은 완전한 인간 단클론 항체 2H10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

본 발명의 추가 구체예는 표 2 또는 표 13에 나타낸 것과 같이, 서열들 중 어느 하나의 프레임워크 및 CDR, 특히 하나의 FR1 내지 FR4 또는 CDR1 내지 CDR3까지 걸쳐져 있는 연속(continguous) 서열을 포함하는 서열로 구성된 표적화된 결합제 또는 항체다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 표 2 또는 표 13에 나타낸 것과 같이, 단클론 항체들 4B4 또는 21H3, 2H10, 9G8, 또는 21H3RK의 서열들 중 어느 하나의 프레임워크 및 CDR, 특히 하나의 FR1 내지 FR4 또는 CDR1 내지 CDR3까지 걸쳐져 있는 연속 서열을 포함하는 서열로 구성된다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호: 2의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호:4의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호: 6의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호:8의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호: 22의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호:24의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호: 30의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호:32의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

또 다른 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호: 30의 서열을 포함하는 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 결합제 또는 항체, 또는 이의 항원-결합 부위는 서열 번호:50의 서열을 포함하는 경쇄 폴리펩티드를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 본원에 기술된 CDRs 또는 중쇄 또는 경쇄 서열들내에 20개, 16개, 10개, 9개 만큼 또는 이보다 적은 가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 아미노산 추가, 치환, 결손 및/또는 삽입을 포함한다. 이와 같은 변형은 CDRs 내 임의의 잔기에서 잠재적으로 만들어질 수 있을 것이다. 일부 구체예들에서, 항체는 완전한 인간 단클론 항체다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 본원에 기술된 CDRs, 프레임워크 부위들 및 CDRs (특히 FR1 부터 FR4 또는 CDR1 부터 CDR3)을 연결하는 연속 서열들, 본원에 기술된 것과 같은 경쇄 또는 중쇄 서열들, 또는 본원에 기술된 것과 같은 항체들의 변이체 또는 유도체들을 포함한다. 변이체들은 표 2 또는 표 13에 나타낸 것과 같은 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것, 프레임워크 부위들 및 CDRs (특히 FR1 부터 FR4 또는 CDR1 부터 CDR3)을 연결하는 연속 서열들, 본원에 기술된 경쇄 또는 중쇄 서열들, 또는 본원에 기술된 단클론 항체들에 20개, 16개, 10개, 9개 만큼 또는 이보다 적은 가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산 추가, 치환, 결손 및/또는 삽입을 포함하는 서열들을 포함하는 표적화된 결합제 또는 항체들을 포함한다. 변이체들은 표 2 또는 표 13에 나타낸 것과 같은 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 임의의 것, 프레임워크 부위들 및 CDRs (특히 FR1 부터 FR4 또는 CDR1 부터 CDR3)을 연결하는 인접 서열들, 본원에 기술된 경쇄 또는 중쇄 서열들, 또는 본원에 기술된 단클론 항체들과 최소한 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 아미노산 서열 상동성을 가지는 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다. 두 개 아미노산 서열의 상동성 비율은 본 기술 분야의 당업자에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있는데, 단백질 쌍정열법(pairwise protein alignment)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 변이체들은 본원에 기술된 CDR 서열들 또는 경쇄 또는 중쇄 폴리펩티드내 변이를 포함하는데, 이는 자연적으로 발생되거나 재조합 DNA 기술 또는 돌연변이 생성 기술을 이용하여 시험관에서 고유 서열들을 조작하여 도입된 것이다. 자연 발생적 변이체들은 생체내에서 외부 항원에 대한 항체 발생 동안 대응하는 생식계열 뉴클레오티드 서열들에서 발생되는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 유도체는 두 개 이상의 항체들이 서로 링크된 이형(hetero) 항체가 될 수도 있다. 유도체들은 화학적으로 변형된 항체들을 포함한다. 예로는 하나 이상의 폴리머, 예를 들면 수용성 폴리머, N-링크된 또는 O-링크된 탄수화물, 슈가, 포스페이트 및/또는 기타 이와 같은 분자들의 공유적 부착을 포함한다. 유도체들은 부착된 분자의 유형 또는 위치에서 자연 발생적 또는 개시 항체와는 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 항체에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 화학기 결손을 더 포함한다.

한 구체예에서, 표적화된 결합제는 이중특이적(bispecific) 항체다. 이중특이적 항체는 최소한 두 가지 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지는 항체다. 이중특이적 항체들을 제조하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다(예를 들면,Millsteinetal,Nature, 20 305:537-539 (1983); Trauneckeretal,EMBO J, 10:3655-3659 (1991);Sureshetal,MethodsinEnzymology, 121:210 (1986);Kostelnyetal, J.Immunol, 148(5):1547-1553 (1992);Hollingeretal,Proc.Natl Acad.ScLUSA, 90:6444-6448 (1993);Gruberetal, J.Immunol, 152:5368 (1994);미국 특허4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,81; 95,731,168; 4,676,980; 및 4,676,980, WO 94/04690;WO 91/00360;WO 92/200373;WO 93/17715;WO 92/08802; 및EP 03089를 참고) .

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 비-생식계열 잔기를 생식계열 잔기로 돌연변이시키고/돌연변이시키거나 구조적 책임(liabilities)을 제거함으로써 최적화된 서열을 가진다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 6의 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 6은 표 7의 각 일부 열(row)에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합중 하나를 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 6은 표 7에 표시된 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯 또는 여섯 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 6은 표 7의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다.

기타 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VH3-33, 6-13 및 JH4 도메인들을 가지는 생식계열 서열로부터 유도되는데, 이때 하나 이상의 잔기는 그 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들도록 돌연변이된다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 24는 구조적 책임을 제거하는 것을 포함하는 추가 변형을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 생식계열에 추가하여, C33은 S로 돌연변이될 수 있다. 서열 번호: 24는 표 10의 각 열에 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함할 수 있고, C33은 S로의 돌연변이를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 구체예는 DLL4에 결합하는 것에 대해 경합하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 Notch 1 또는 Notch 4 수용체에 결합하는데 있어서, 고유 DLL4와 경쟁하는 표적화된 결합제 또는 항체에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 Notch 1에 결합하는 것에 대해 완전한 인간 단클론 항체들 4B4 또는 21H3, 2H10, 9G8, 또는 21H3RK 중 어느 하나와 경쟁한다. "경합하다(Competes)"는 표적화된 결합제 또는 항체가 Notch 1에 결합하는 것에 대하여 완전한 인간 단클론 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK 중 어느 하나와 경쟁하는 것을 나타내며, 가령, 경합은 일방향성(unidirectional)이다.

본 발명의 구체예들은 DLL4에 결합하는 것에 대해 완전한 인간 단클론 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK 중 어느 하나와 교차 경쟁하는 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다. "교차 경합하다(Cross competes)"는 표적화된 결합제 또는 항체가 완전한 인간 단클론 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK 중 어느 하나와 Notch 1에의 결합에 대해 경쟁하고, 또한 이 역으로 경쟁하는 것을 나타내는데, 가령, 경쟁은 양방향성(bidirectional)이다.

본 발명의 추가 구체예는 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체와 DLL4 상의 동일한 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 본 발명의 구체예들은 완전한 인간 단클론 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK 중 어느 하나와 DLL4 상의 동일한 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제 또는 항체다. 교차-경쟁 분석에서, 본 발명의 항체들은 상이한 또는 부분적으로 오버랩되는 에피토프를 가진다는 것이 명백하였다. 예를 들면, 4B4는 21H3RK 및 21H3와 교차 경쟁한다. 또한, 4B4 및 21H3는 환원 및 변성 조건하에서 DLL4에 결합하지 않지만, 9G8 및 2H10는 상이한 에피토프에 결합을 암시한다.

한 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 항체와 마우스 교차 반응성 항체를 포함한다. 한 구체예에서, 항체의 가변 부위는 항체가 마우스 DLL4에 결합할 수 있도록 변형된다. 전형적으로, 마우스 교차-반응성 항체들은 본원에 기술된 항체와 유사한 특성, 가령, DLL4에 결합할 수 있고, DLL4가 Notch 수용체에 결합하는 것을 저해할 수 있다. 한 예에서, 21H3RK 항체의 가변 부위는 이 항체가 마우스 DLL4에 결합할 수 있도록 변형되며, 가령, 중쇄는 다음의 변형을 가지며: H31 Asn은 Lys으로, H52a Ala는 Pro으로, H97 Val은 Thr으로, H100b Val은 Trp으로, 및 H100e Glu은 Ala으로 변형(서열 번호:84 참고) 및 경쇄는 다음의 변형을 가진다: L30 Ser은 Asn으로, 및 L93 Asp은 Ser으로 변형(서열 번호:85 참고). 또 다른 구체예에서, 중쇄는 다음의 변형을 가진다: H30Thr은 Ile으로, H31Asn은 Met으로, H52a Ala은 Pro으로, H100b Val은 Trp으로, 및 H100e Glu은 Ala으로 변형(서열 번호:86 참고), 및 경쇄는 다음의 변형을 가진다: L93 Asp 은 Ser으로의 변형(서열 번호:87 참고). 또 다른 구체예에서, 중쇄는 다음의 변형을 가지며: H30 Thr은 Ile으로, H31 Asn은 His으로, H100b Val은 Trp으로, 및 H100e Glu은 Ala으로 변형(서열 번호:88 참고), 및 경쇄는 다음의 변형을 가진다: L30 Ser는 Asn으로, 및 L93 Asp는 Ser으로의 변형. (서열 번호:89 참고).

본 발명의 기타 구체예들은 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체중 임의의 것을 인코드하는 분리된 핵산 분자, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체중 임의의 것을 인코드하는 분리된 핵산 분자를 보유하는 벡터 또는 이와 같은 핵산 분자들 중 임의의 것으로 형질변환된 숙주 세포를 포함한다. 본 발명의 구체예들은 DLL4에 특이적으로 결합하고, Notch 수용체에 DLL4가 결합하는 것을 저해하는 완전한 인간의 분리된 표적화된 결합제를 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명은 여기에서 정의된 엄격성(stringent) 또는 낮은 엄격성 하이브리드반응 조건하에, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들 중 임의의 것을 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드되는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다. 본 발명의 구체예들은 또한 결합제를 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터도 포함한다. 추가 구체예들은 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포도 포함한다.

본 기술 분야에 알려진 바와 같이, 항체들은 예를 들면, 다클론 항체, 올리고클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 및/또는 완전한 인간 항체들이 유익할 것이다.

본 발명의 구체예들은 임의의 특정 형태의 항체 또는 생산 또는 생성 방법에 제한을 두는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체의 결합 단편이다. 예를 들면, 표적화된 결합제는 전장(full-length) 항체 (가령, 인간의 고유한 Fc 부위를 가지는) 또는 항체-결합 단편 (가령, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, FV 또는 dAb)이 될 수 있다. 추가로, 항체들은 dAb 단편과 같은, DLL4에 결합하는 Camelid 또는 인간의 단일 VH 또는 VL 도메인과 같은 단일-도메인 항체들이 될 수 있다.

본원에 기술된 본 발명의 구체예들은 이와 같은 항체들을 생산하는 세포들을 또한 제공한다. 세포의 예로는 하이브리도마 또는 재조합에 의해 생성된 세포 가령, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, CHO의 변이체들(예를 들면, DG44) 및 DLL4에 대한 항체를 생산하는 NSO 세포들을 포함한다. CHO 세포들의 변이체들에 대한 추가 정보는AndersenandReilly (2004) CurrentOpinioninBiotechnology 15, 456-462에서 볼 수 있으며, 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다. 항체는 항체를 분비하는 하이브리도마로부터 제조되거나 항체를 인코드하는 유전자로 형질변환 또는 형질감염된 유전공학적으로 조작된 세포로부터 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 한 구체예는 핵산 분자가 발현되어, 항체가 만들어지고, 이어서 항체를 회수하는 조건들하에서 숙주 세포를 배양함으로써, 본 발명의 항체를 생산하는 방법이다. 본 발명의 구체예들은 항체 생산을 위하여 숙주 세포로 형질감염될 때 항체 또는 이의 단편들의 생산율을 증가시키기 위해 최적화된 핵산 서열을 포함한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 인코드하는 임의의 핵산 분자 또한 포함한다는 것을 인지해야만 한다.

여기에서 추가 구체예는 DLL4에 특이적으로 결합하고, DLL4의 생물학적 활성을 억제시키는 항체를 생산하는 방법을 포함하는데, 이 방법은 인간 DLL4를 발현시키는 세포를 포유류에 면역주사하고, 인간 DLL4, 정제된 인간 DLL4 또는 이의 단편, 및/또는 하나 이상의 진화론적으로 유사한(orthologous) 서열들 또는 이의 단편들을 포함하는 세포막을 분리하는 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체 또는 이의 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가 구체예는 DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써 증식성 맥관형성 질환을 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 종양, 암, 및/또는 세포 증식성 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하고, DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써, 종양성 질환을 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 종양성 질환의 치료를 요하는 동물을 선택하고, DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써, 악성 종양을 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 악성 종양의 치료를 요하는 동물을 선택하고, DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예에서는 DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여함으로써, DLL4 발현과 연관된 질환 또는 이상을 앓고 있는 동물을 효과적으로 치료하는 방법들을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 방법은 DLL4 발현과 연관된 질환 또는 이상의 치료를 요하는 동물을 선택하고, DLL4에 특이적으로 결합하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 동물에 투여하는 것을 더 포함한다.

악성 종양은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

치료가능한 증식성 또는 맥관형성 질환은 종양성 질환 가령, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 담낭암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 난소암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암, 만성 골수성 백혈병을 포함하는 백혈병을 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 DLL4에만 의존적이거나 부분적으로 의존적인 종양을 가진 환자에서 DLL4를 억제시키는데 사용하기에 적합하다.

본 발명의 추가 구체예들은 증식성, 또는 맥관형성 유관 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 있어 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 증식성, 또는 맥관형성 - 관련 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 종양성 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 종양성 질환 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 비-종양성 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 있어 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 비-종양성 질환 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 악성 종양을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 악성 종양 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 DLL4 발현과 관련이 있는 질환 또는 이상을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물 제조에 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 포함한다. 특정 구체예에서, 용도는 DLL4 발현과 관련이 있는 질환 또는 이상의 치료를 요하는 동물을 선별하는 것을 더 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 증식성 또는 맥관형성-관련 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 종양성 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 악성 종양을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 DLL4 발현과 관련이 있는 질환 또는 이상을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

본 발명의 추가 구체예들은 DLL4 유도된 질환을 앓고 있는 동물을 치료하기 위한 약물로써 사용하기 위한 본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체를 포함한다.

한 구체예에서, 증식성 또는 맥관형성-관련 질환; 종양성 질환; 악성 종양; DLL4 발현과 관련이 있는 질환 또는 이상의 치료는 상기 언급된 질환 또는 이상 중 어느 하나를 관리, 개선, 예방하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 종양성 질환의 치료는 종양 성장의 억제, 종양 성장의 지연, 종양의 퇴보, 종양의 축소, 치료 중단시 종양의 재성장까지 소요되는 시간의 연장, 종양 재발까지 소용되는 시간의 연장, 질환 진행의 지연을 포함한다.

본 발명의 일부 구체예들에서, 치료될 동물은 인간이다.

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체다.

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 완전한 인간 단클론 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 구체예들은 본원에 기술된 표적화된 결합제와 치료제로 구성된 콘쥬게이트를 포함한다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 치료제는 톡신이다. 다른 구체예에서, 치료제는 방사성 동위 원소다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 약제학적 조성물이다.

또 다른 측면에서, 환자에서 암 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 환자에게 완전한 인간 항체 콘쥬게이트를 투여하는 것을 포함한다. 완전한 인간 항체 콘쥬게이트는 DLL4 및 물질에 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 결합제는 톡신, 방사성 동위 원소, 또는 암 세포를 죽일 수 있는 기타 물질이다. 따라서, 항체 콘쥬게이트는 암세포를 선택적으로 죽인다.

한 측면에서, DLL4에 특이적으로 결합하는 콘쥬게이트된 완전한 인간 항체가 제공된다. 물질이 항체에 부착되고, 항체가 세포에 결합되어, 결합제가 세포로 운반되게 된다. 한 구체예에서, 상기 콘쥬게이트된 완전한 인간 항체는 DLL4의 세포외 도메인에 결합한다. 또 다른 구체예에서, 항체 및 콘쥬게이트된 톡신은 DLL4를 발현시키는 세포에 의해 내화된다. 또 다른 구체예에서, 물질은 세포독성 물질이다. 또 다른 구체예에서, 물질은 예를 들면 사포린 또는 아우리스타틴, 슈도모나스 엑소톡신, 겔로닌, 리친, 칼리케미신 또는 메이탄신-계 면역콘쥬게이트 및 이와 유사한 것이 된다. 또 다른 구체예에서, 물질은 방사성 동위 원소다.

본 발명의 표적화된 결합제 또는 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 추가 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 세포 흡착, 침투, 맥관형성 또는 증식을 차단하는 DLL4의 단클론 항체, 올리고클론 항체 또는 다클론 항체 혼합물은 종양 세포 증식을 억제하는 것으로 알려진 약물과 복합하여 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 질환 또는 이상을 진단하는 방법을 포함하는데, 본원에 기술된 항체들은 환자 또는 환자의 시료에서 DLL4 수준을 탐지하는데 이용된다. 한 구체예에서, 환자 시료는 혈액 또는 혈청 또는 뇨가 된다. 추가 구체예에서, 위험 인자들의 확인 방법, 질환 진단 방법, 질환의 단계 진단 방법은 항-DLL4 항체들을 이용하여 DLL4의 발현 및/또는 과다발현을 확인하는 것과 관련된 것이다. 일부 구체예들에서, 이들 방법들은 세포에서 DLL4에 선택적으로 결합하는 완전한 인간 항체 콘쥬게이트를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 항체 콘쥬게이트는 DLL4에 특이적으로 결합하는 항체와 라벨을 포함한다. 이 방법들은 환자에서 라벨의 존부를 관찰하는 것을 더 포함한다. 상대적으로 많은 양의 라벨이 존재한다는 것은 질환의 위험이 상대적으로 높다는 것을 나타낼 것이며, 라벨의 상대적인 양이 적다는 것은 질환의 위험이 상대적으로 낮다는 것을 나타낼 것이다. 한 구체예에서, 라벨은 그린 형광 단백질이다.

본 발명은 또한 환자 시료에서 DLL4의 수준을 분석하는 방법을 더 제공하는데, 이 방법은 본원에 기술된 항체를 환자의 생물학적 시료에 접촉시키고, 항체와 시료내 DLL4 사이에 결합 수준을 탐지하는 것을 포함한다. 더욱 특이적 구체예에서, 생물학적 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 본원에 기술된 항체를 혈청 또는 세포에 접촉시키고, DLL4의 존재를 탐지함으로써, 세포에서 DLL4의 발현과 유관된 이상을 진단하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 이상은 종양성 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 증식성, 맥관형성, 세포 흡착 또는 침투 - 관련 질환이 될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 DLL4 -관련 질환을 스크리닝하기 위하여 포유류 조직, 세포 또는 유체내에 DLL4를 탐지하기 위한 분석 키트를 포함한다. 키트는 본원에 기술된 항체, 및 DLL4(존재한다면)와 항체의 반응을 표지하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 단클론 항체다. 한 구체예에서, DLL4에 결합하는 항체는 라벨링되어 있다. 또 다른 구체예에서, 항체는 비-라벨링된 1차 항체이며, 키트는 1차 항체를 탐지하는 수단을 더 포함한다. 한 구체예에서, 탐지 수단은 항-면역글로블린인 라벨링된 제2항체를 포함한다. 항체는 형광색소, 효소, 방사성핵종 및 방사선불투과성 물질로 구성된 군으로부터 선택된 마커로 라벨될 수 있다.

일부 구체예들에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여하는 능력을 강화시키기 위하여 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용(effector) 세포를 활성화시키고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 강화시키기 위하여 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용 세포를 활성화시키고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 강화시키고, 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여는 능력을 강화시키기 위하여 변형될 수 있다.

일부 구체예들에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여하는 능력을 감소시키기 위하여 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용 세포를 활성화시키고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 감소시키기 위하여 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체들은 작용 세포를 활성화시키는 능력, 및 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여하는 능력을 모두 감소시키고, 보체 고정 및 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여는 능력을 감소시키기 위하여 변형될 수 있다.

특정 구체예에서, 본원에 기술된 본 발명의 조성물의 표적화된 결합제 또는 항체의 반감기는 최소한 약 4일 내지 7 일이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 본 발명의 조성물의 표적화된 결합제 또는 항체의 평균 반감기는 최소한 약 2일 내지 5일, 3일 내지 6 일, 4 일 내지 7 일, 5 일 내지 8 일, 6 일 내지 9 일, 7 일 내지 10 일, 8 일 내지 11 일, 8 일 내지 12, 9 일 내지 13, 10 일 내지 14일, 11 일 내지 15일, 12 일 내지 16일, 13 일 내지 17일, 14 일 내지 18일, 15 일 내지 19일, 또는 16 일 내지 20 일이다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 본 발명의 조성물의 표적화된 결합제 또는 항체의 평균 반감기는 최소한 약 17 일 내지 21 일, 18 일 내지 22 일, 19 일 내지 23 일, 20 일 내지 24 일, 21 일 내지 25 일, 22 일 내지 26 일, 23 일 내지 27 일, 24 일 내지 28 일, 25 일 내지 29 일, 또는 26 일 내지 30 일이다. 추가 구체예에서, 본원에 기술된 본 발명의 조성물의 표적화된 결합제 또는 항체의 반감기는 최대 약 50 일이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체들 및 조성물의 항체들의 반감기는 본 기술 분야에 공지된 방법들에 의해 연장될 수 있다. 이와 같은 연장으로 항체 조성물의 양 및/또는 투약 빈도를 감소시킬 수 있다. 생체내 반감기가 개선된 항체들 및 이를 제조하는 방법들은 미국 특허 6,277,375; 및 국제 공개 WO 98/23289 및 WO 97/3461에 설명되어 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 용기를 포함하는 제품을 제공한다. 용기는 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체를 포함하는 조성물, 및 조성물이 세포 흡착, 침투, 맥관형성 및/또는 DLL4의 발현 또는 과다발현을 특징으로 하는 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 증식-관련 질환의 치료에 이용될 수 있다는 것을 표시한 포장 삽입물 또는 라벨을 포함한다.

다른 구체예들에서, 본 발명은 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체를 포함하는 조성물, 및 치료를 요하는 개체에게 조성물을 투여하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 변이체 Fc 부위를 포함하는 단백질 제제를 제공한다. 이것은 자연적으로 발생되지 않는 Fc 부위, 예를 들면, 하나 이상의 자연적으로 발생되지 않는 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 부위이다. 본 발명의 변이체 Fc 부분에는 아미노산 결손, 추가 및/또는 변형을 포함하는 Fc 부분들도 포함된다.

Fc 부분을 포함하는 단백질들의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 부분의 결합 친화력을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 한 구체예에서, Fc 변이체 단백질은 필적되는 분자와 비교하여 증가된 혈청 반감기를 가진다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239, 330 및 332으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산과 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234, 235 및 331로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 추가 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 및 331S 비-자연적으로 발생되는 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235Y, 및 331S 비-자연적으로 발생되는 아미노산 잔기를 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 추가적인 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산; 및 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239, 330 및 332로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 239D, 330L 및 332E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산, 및 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234, 235 및 331로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 선택적으로, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252, 254, 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 Fc 변이체 단백질 제제를 제공하는데, 여기서, Fc 부분은 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산; 및 Kabat에서 제시된 것과 같이 EU 색인에 의해 번호가 매겨진 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 최소한 한 개의 비-자연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다.

비-자연적으로 발생되는 Fc 부분을 제조하는 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 아미노산 치환 및/또는 결손은 부위-직접적인 돌연변이형성 (Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492 (1985)), PCR 돌연변이형성 (Higuchi,in "PCRProtocols: AGuidetoMethodsand Applications",AcademicPress,SanDiego,pp. 177-183 (1990)), 및 카세트 돌연변이형성 (Wells etal,Gene, 34:315-323 (1985))을 포함하나 이에 한정되지 않는 돌연변이형성 방법에 의해 만들어질 수 있다. 바람직하게는, 부위-직접적인 돌연변이형성은 오버랩-연장 PCR 방법(Higuchi,in "PCRTechnology:PrinciplesandApplicationsforDNAAmplification",StocktonPress,New York,pp. 61-70 (1989))에 의해 실행된다. 오버랩-연장 PCR (Higuchi,ibid.) 기술은 표적 서열(출발 DNA)에 임의의 원하는 돌연변이를 도입시킬 때 이용될 수도 있다. 예를 들면, 오버랩-연장법에서 제1라운드 PCR은 표적 서열을 아웃사이드 프라이머 (프라이머 1)와 내부 돌연변이형성 프라이머 (프라이머 3)로, 별도로 제2 아웃사이드 프라이머 (프라이머 4) 및 내부 프라이머 (프라이머 2)로 증폭시키고, 2개의 PCR 단편 (단편 A 및 B)을 만드는 것을 포함한다. 내부 돌연변이형성 프라이머 (프라이머 3)는 원하는 돌연변이를 가진 표적 서열에 미스매취를 포함하도록 고안된다. PCR 제2라운드에서, PCR의 제1라운드 산물(단편 A 및 B)은 두 개의 아웃사이드 프라이머(프라이머 1 및 4)를 이용한 PCR에 의해 증폭된다. 생성된 전장 PCR 단편 (단편 C)은 제한효소로 절단되고, 생성된 제한효소 절단 단편은 적절한 벡터내에 클론된다. 돌연변이 형성의 제1 단계로, 출발 DNA (가령, Fc 융합 단백질, 항체 또는 단순하게 Fc 부분을 인코드하는)는 돌연변이형성 벡터내로 작용가능하게 클론된다. 프라이머들은 원하는 아미노산 치환을 반영하도록 고안된다. 변이체 Fc 부분을 만드는데 유용한 기타 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있다(가령, 미국 특허 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375; U.S. 특허 공개 2004/0002587 및 PCT 공개 WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351 참고).

본 발명의 일부 구체예들에서, 여기에서 제공된 항체들의 글리코실화 패턴을 변형시켜 ADCC 및 CDC 작용체 기능을 강화시킨다.ShieldsRLetal, (2002)JBC. 277:26733;Shinkawa Tetal, (2003) JBC. 278:3466andOkazaki Aetal, (2004) J.MoI.Biol., 336: 1239 참고. 일부 구체예들에서, Fc 변이체 단백질은 하나 이상의 조작된 당형(glycoforms)을 포함하는데, 예를 들면, Fc 부분을 포함하는 분자에 공유적으로 부착된 탄수화물을 포함한다. 조작된(Engineered) 당형은 작용체 기능의 보강 또는 감소를 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 당형은 본 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 방법에 의해 만들어질 수 있는데, 예를 들면, 조작된 또는 변이체 발현 균주를 이용하여, 하나 이상의 효소, 예를 들면 DI N-아세틸글루코사아미닐트란스퍼라제 III (GnTI11)의 공동 발현에 의해, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체의 세포계에서 Fc 부분을 포함하는 분자의 발현에 의해, 또는 Fc 부분을 포함하는 분자가 발현된 후에 탄수화물의 변형에 의해 생성될 수 있다. 조작된 당형을 생성하는 방법들은 본 기술 분야에 공지되어 있으며,Umanaetal, 1999,Nat.Biotechnol 17:176-180;Daviesetal, 20017BiotechnolBioeng 74:288-294;Shieldsetal, 2002, JBiolChem 277:26733-26740;Shinkawaetal, 2003, JBiol Chem 278:3466-3473) U.S. Pat. No. 6,602,684; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ 기술(Biowa, Inc. Princeton, NJ.); GlycoMAb™ 글리코실화 조작 기술(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)을 포함하나 이에 한정되지 않는 것들에서 설명되어 있다. 가령, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614;Okazakietal, 2004,JMB, 336: 1239-49 참고.

Fc 부분의 글리코실화는 작용체 기능의 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다는 것 또한 본 기술 분야에 공지된 것이다 (예를 들면,Umanaetal, 1999,Nat.Biotechnol 17:176-180;Davies etal, 2001,BiotechnolBioeng 74:288-294;Shieldsetal, 2002, JBiolChem 277:26733-26740; Shinkawaetal, 2003, JBiolChem 278:3466-3473) U.S. Pat. No. 6,602,684; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140Al; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ 기술(Biowa,Inc.Princeton,NJ.); GlycoMAb™ 글리코실화 조작 기술(GLYCARTbiotechnologyAG,Zurich,Switzerland) 참고. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 항체들의 Fc 부분은 아미노산 잔기의 변형된 글리코실화를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 잔기의 변형된(altered) 글리코실화는 작용체 기능을 낮추게 한다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 잔기의 변형된 글리코실화는 작용체 기능을 증가시킨다. 특정 구체예에서, Fc 부분은 감소된 퓨코실화(fucosylation)를 가진다. 또 다른 구체예에서, Fc 부분은 퓨코실이 제거된다(예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 No.2005/0226867).

도 1은 HUVEC 증식의 DLL4-자극된 저해에 대한 IgG1 DLL4 항체의 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸다. 데이타는 n>2의 독립적인 실험들을 대표한다.
도 2는 맥관 길이(mm) 및 분지 수를 측정함으로써 평가된, 시험관내 HUVEC 튜브 형성에 대한 IgG2/4 DLL4 항체의 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸다.
도 3은 FACS 분석에서 측정된 바와 같이, 0.1 ㎍/㎖에서 Alexa-647 라벨링된 21H3RK의 결합을 대체하는 비-라벨링된 항-DLL4 항체의 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸다.
도 4는 12개 키메라 DLL4/DLL1 변이체를 직선 그림으로 나타낸 것이다. 모든 변이체들은 도면으로 나타낸 바와 같이, 개별 서브 도메인 또는 복합 도메인 단편들을 대체하는 인간 DLL1과 함께 인간 DLL4의 세포외 도메인들을 인코드한다.
도 5는 대응하는 DLL1 도메인으로 대체된 세포외 도메인의 단편들과, DLL4를 인코드하는 키메라 녹아웃("KO") 변이체들에 21H3RK의 결합을 보여주는 선그래프들이다.
도 6은 대응하는 DLL1 도메인으로 대체된 세포외 도메인의 단편들과 함께 DLL4를 인코드하는 키메라 녹아웃("KO") 변이체들과, DLL4 카운터파트로 대체된 부분을 가지는 DLL1을 인코드하는 키메라 녹인(“KI”) 변이체들에 21H3RK의 결합을 보여주는 선그래프들이다.

본 발명의 구체예들은 신규한 DLL4 차단분자 세트, 예를 들면, Notch 수용체 신호생성(signaling)을 억제하는 항체들에 관한 것이다. 이와 같은 분자들은 단일 물질로 사용되거나 대안으로 다른 결합 항체들/물질들과 복합하여 사용될 수 있다. 이들은 또한 임의의 표준 또는 신규한 항암제와 복합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 구체예들은 DLL4에 결합하는 표적화된 결합제에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제는 DLL4에 결합하여, DLL4가 Notch 수용체 (가령, Notch 1, Notch 2, Notch 3, 및/또는 Notch 4)에 결합하는 것을 방해한다. 일부 구체예들에서, 이와 같은 결합은 하나 이상의 DLL4-연합된 효과를 중화, 차단, 억제, 폐기 또는 간섭할 수 있다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 단클론 항체들, 또는 이의 결합 단편이다. 이와 같은 단클론 항체들은 여기에서 항-DLL4 항체들이라고 지칭될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예들은 완전한 인간 항-DLL4 항체들, 및 치료요법적으로 유용한 항체 제제(preparations)를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명의 항-DLL4 항체 제제는 DLL4에 대한 강력한 결합 친화력, DLL4 수용체-리간드 상호작용을 차단시키는 능력, DLL4 중재된 신호생성을 차단시키는 능력, 내피 세포 증식 및 비-기능성 혈관의 형성을 촉진시키는 능력, 맥관으로 혈관주위세포 보충을 조절하는 능력, 종양 성장을 억제하는 능력, 종양 혈중산소감소/괴사를 증가시키는 능력, 내피 팁/줄기 세포 운명을 변경시키는 능력, 및 종양 세포 생존 또는 암 줄기 세포 생존 및 자가 재생을 조절하는 능력을 포함하는 바람직한 치료요법적 특성들을 가진다.

또한, 본 발명의 구체예들은 질환을 치료하기 위하여 이들 항체들을 이용하는 방법들을 포함한다. 본 발명의 항-DLL4 항체들은 DLL4-매개된 종양 생성 및 건강한 조직으로의 종양 침투를 막는데 유용하다. 또한, DLL4 항체는 AMD와 같은 안구 질환, 류마타스 관절염과 같은 염증성 질환, 및 심혈관 질환 및 폐혈증 뿐만 아니라 종양성 질환과 같은 맥관형성과 연관된 질환의 치료에 유용할 수 있다. 전이성 암, 림프성 종양, 및 혈액 암을 포함한 임의의 유형의 악성 종양을 특징으로 하는 임의의 질환은 이와 같은 저해 기전에 의해 치료될 수도 있다. 인간에서 예시적인 암은 방광 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 기저세포 암종, 담관 암, 방광암, 뼈암, 뇌 및 CNS 암(가령, 신경교종 종양), 경부암, 융모막암종, 결장 및 직장 암, 연결조직 암, 소화계 암; 자궁내막암, 식도 암; 눈 암, 머리 및 목 암; 위암, 상피내 신생물; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암(가령, 소세포 및 비-소세포); 호지킨 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 림프종; 흑색종; 골수종, 신경아세포종, 구강 암 (가령, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암, 망막아종; 횡문근육종; 직장암, 신장암, 호흡기암; 육종, 피부암; 위암, 고환암, 갑상선암; 자궁암, 뇨도계암 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종을 포함한다. 개, 고양이 및 기타 애완동물에서 흔히 진단되는 악성 질환은 림프육종, 골육종, 유방 종양, 비만세포종, 뇌 종양, 흑색종, 선편평세포암종, 암양종 폐종양, 기관지 선 종양, 세기관지 선종, 섬유종, 점액연골종, 폐육종, 신경육종, 골종, 유두종, 망막아종, Ewing 육종, Wilm 종양, Burkitt 임파종, 소교종, 신경아세포종, 파골세포종, 경구 종양성, 섬유육종, 골육종 및 횡문근육종, 생식기 편평상피세포 암종, 전염가능한 성교 종양, 고환 종양, 선형고환종, Sertoli 세포 종양, 혈관주위세포종, 조직구종, 녹색종(가령, 과립구 육종), 각막 유두종, 각막 편평상피세포 암종, 혈관육종, 흉막 중피종, 기저 세포 종양, 흉선종, 위 종양, 부신 암종, 경구 유두종증, 혈관내피종 및 낭성선종, 소포성 림프종, 내장 림프종, 섬유육종 및 폐 편평상피세포 암종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 흰 족제비와 같은 설치류에서, 예시적인 암은 인슐린종, 림프종, 육종, 신경종, 췌장 섬 세포종, 위 MALT 림프종 및 위 선종을 포함한다. 농가 가축에 영향을 주는 종양성은 백혈병, 혈관외피종 및 소과 동물 안구 종양성(소에서); 음경 섬유육종, 궤양성 편평상피 세포 암종, 음경 암종, 결합 조직 종양성 및 비만세포종(말에서); 간세포 암종(돼지에서); 림프종 및 폐 선종증(양에서); 폐 육종, 림프종, Rous 육종, 세망-내피증, 섬유육종, 신아세포종, B-세포 림프종 및 암파구성 백혈병(조류 종에서); 망막아종, 간 종양성, 림프육종(림프아구성림프종), 형질구모양 백혈병 및 부레 육종(물고기에서), 건락성 임파선염 (CLA): 세균 코리네박테리움 슈도투베르클로시스(Corynebacteriumpseudotuberculosis)에 의한 양 및 염소의 만성, 감염성, 접촉성 질환, 및 jaagsiekte에 의한 양의 전염성 폐 종양을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예들은 생물학적 시료내 있는 DLL4의 양을 특이적으로 측정하는 진단 분석을 포함한다. 분석 키트는 본원에 기술된 표적화된 결합제 또는 항체와 함께, 이와 같은 항체들을 탐지하기 위한 필수적인 라벨을 포함할 수 있다. 이와 같은 진단 분석은 세포 흡착, 침투, 맥관형성 또는 종양성 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 증식 유관 질환을 스크리닝하는데 유용하다.

본 발명의 또 다른 측면은 DLL4의 생물학적 활성의 길항제인데, 여기서, 길항제는 DLL4에 결합한다. 한 구체예에서, 길항제는 항체와 같은 표적화된 결합제다. 길항제는 본원에 기술된 항체, 예를 들면, 항체 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK로부터 선택될 수 있다.

한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 DLL4에 결합하고, 이에 의해 Notch에 DLL4의 결합을 억제 또는 저해시켜, 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식을 억제할 수 있다.

한 구체예는 완전한 인간 단클론 항체 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK와 동일한 에피토프에 결합하는 표적화된 결합제다.

한 구체예는 완전한 인간 단클론 항체 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK와 동일한 에피토프에 결합하는 항체다.

한 구체예는 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 생산하는 하이브리도마다. 한 구체예는 상기에서 설명된 항체들의 중쇄 및/또는 경쇄를 생산하는 하이브리도마다. 한 구체예에서, 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산한다. 또 다른 구체예에서, 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK의 경쇄 및/또는 중쇄를 생산한다. 대안으로, 하이브리도마는 완전한 인간 단클론 항체 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 생산할 수 있다.

또 다른 구체예는 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 인코드하는 핵산 분자다. 한 구체예는 상기에서 설명된 항체의 경쇄 또는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자다. 한 구체예에서, 핵산 분자는 완전한 인간 단클론 항체의 경쇄 또는 중쇄를 인코드한다. 또 다른 구체예는 항체들 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4, 또는 21H3RK로부터 선택된 완전한 인간 단클론 항체의 경쇄 또는 중쇄를 인코드하는 핵산 분자다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기에서 설명된 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터이며, 여기서, 벡터는 상기에서 설명된 표적화된 결합제를 인코드한다. 본 발명의 한 구체예는 상기에서 설명된 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터이며, 여기서, 벡터는 상기에서 설명된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 인코드한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기에서 설명된 벡터를 포함하는 숙주 세포다. 대안으로, 숙주 세포는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.

추가로, 본 발명의 한 구체예는 핵산 분자는 표적화된 결합제를 생산하기 위해 발현되고, 이어서 표적화된 결합제가 회수되는 조건하에 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 표적화된 결합제를 생산하는 방법이다. 본 발명의 한 구체예는 핵산 분자는 항체를 생산하기 위해 발현되고, 이어서 항체가 회수되는 조건하에 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 생산하는 방법이다.

한 구체예에서, 본 발명은 최소한 하나의 숙주 세포를 상기 기술된 표적화된 결합제를 인코드하는 최소한 하나의 핵산 분자로 형질감염시키고, 상기 숙주 세포에서 핵산 분자를 발현시키고, 표적화된 결합제를 분리함으로써 표적화된 결합제를 제조하는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 최소한 하나의 숙주 세포에 상기에서 설명된 항체를 인코드하는 최소한 하나의 핵산 분자를 형질감염시키고, 숙주 세포에서 핵산 분자를 발현시키고, 항체를 분리함으로써 항체를 제조하는 방법을 포함한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본원에 기술된 길항제를 투여함으로써 DLL4의 생물학적 활성을 길항시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식 관련 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성의 길항제의 치료요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 표적화된 결합제를 투여함으로써, DLL4의 생물학적 활성을 길항시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식 관련된 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 설명된 것과 같이 항체를 투여함으로써 DLL4의 생물학적 활성을 길항시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련된 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성의 길항제의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성의 길항제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 표적화된 결합제는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련 질환의 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성의 길항제의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 암 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성의 길항제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 길항제는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 암 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 표적화된 결합제는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 암 치료를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 종양 세포 증식, 흡착, 침투 및/또는 맥관형성을 감소 또는 억제하는 치료방법이 제공된다. 이 방법은 종양 세포 증식, 흡착, 침투 및/또는 맥관형성을 감소 또는 억제를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료요법적 유효량을 투여함으로써 동물에서 종양 성장 및/또는 전이를 감소시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 종양 성장 및/또는 전이의 감소를 요하는 동물을 선별하고, 이 동물에 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 치료 요법적 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 항체들 또는 화학요법제 약물 또는 방사선 요법과 복합되어 투여될 수 있다.

본 발명의 한 또 다른 측면에 따르면, 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련 질환 치료용 약물의 제조를 위한 DLL4의 생물학적 활성의 길항제의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

본 발명의 한 또 다른 측면에 따르면, 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련 질환 치료용 약물로 사용하기 위한 용도로 DLL4의 생물학적 활성의 길항제를 제공한다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

본 발명의 한 또 다른 측면에 따르면, 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련된 질환의 치료용 약물의 제조를 위한 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 한 또 다른 측면에 따르면, 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련 질환 치료용 약물로 이용하기 위한 용도로 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체를 제공한다.

본 발명의 한 또 다른 측면에 따르면, 세포 흡착 및/또는 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식-관련 질환 치료용 약물로 이용하기 위한 용도의 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물 제조를 위한 DLL4의 생물학적 활성의 길항제의 용도를 제공한다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물로 사용하기 위한 용도의 DLL4의 생물학적 활성의 길항제를 제공한다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 표적화된 결합제다. 한 구체예에서, DLL4의 생물학적 활성의 길항제는 본 발명의 항체다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물 제조를 위한 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물로 사용하기 위한 용도의 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물 제조를 위한 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 암 치료용 약물로 사용하기 위한 용도로 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 증식, 세포 흡착, 침투 및/또는 맥관형성의 감소 또는 저해용 약물 제조를 위한 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 증식, 세포 흡착, 침투 및/또는 맥관형성의 감소 또는 저해용 약물로 사용하기 위한 용도로 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 종양 성장 및/또는 전이 감소용 약물 제조를 위한 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유류에서 종양 성장 및/또는 전이 감소용 약물로 사용하기 위한 용도로 DLL4의 생물학적 활성을 길항하는 표적화된 결합제 또는 항체를 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명은 DLL4에만 좌우되거나 이에 부분적으로 좌우되는 종양을 가진 환자에게서 DLL4를 길항시키는데 사용하기에 특히 적합하다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성의 길항제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 길항제는 항체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, DLL4의 생물학적 활성의 길항제, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 한 구체예에서, 길항제는 항체를 포함한다.

일부 구체예에서, DLL4에 특이적으로 결합하는 항체를 투여한 후, 혈액으로부터 과량의 순환 항체를 제거하기 위하여 제거제(clearing agent)가 투여된다.

항-DLL4 항체들은 환자 시료에서 DLL4를 탐지하는데 유용하며, 따라서 본원에 기술된 질환 상태의 진단제로 유용하다. 또한, DLL4-매개된 신호발생 활성을 유의적으로 억제하는 이들 능력에 근거하여(하기 실시예에서 설명됨), 항-DLL4 항체들은 DLL4 발현으로 인한 증상 및 이상의 치료에 치료요법적 효과를 가진다. 특정 구체예들에서, 본원에 기술된 항체들 및 방법들은 DLL4-유도된 세포 흡착, 침투, 맥관형성, 증식 및/또는 세포내 신호생성으로 인한 증상의 치료에 관한 것이다. 추가 구체예들은 종양성 질환, 가령, 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암과 같은 종양성 질환을 세포 흡착, 침투, 맥관형성 및/또는 증식-관련된 질환 치료를 위하여 본원에 기술된 항체 및 방법들을 이용하는 것을 포함한다. 항체는 또한 관절염, 아테롬성 경화증 및 맥관 형성 관련된 질환에서 세포 흡착 및/또는 침투를 치료하는데 유용할 수 있다.

한 특정 구체예에서, 항-DLL4 항체 또는 표적화된 결합제는 충실성 종양 치료에 치료요법적 효과를 가질 수 있는데, 충실성 종양 발생은 추가적인 종양 줄기 세포들, 가령, 급성 골수성 백혈병(AML) 및 유방 종양들의 세포들을 증식시키고 효과적으로 발생시키는 능력을 가진 줄기 세포 소집단에 의존한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 흡착-, 침투-, 맥관형성- 또는 증식 관련 질환을 스크리닝하기 위하여 포유류 조직, 세포 또는 유체에서 DLL4를 탐지하기 위한 분석 키트를 포함한다. 키트는 DLL4에 결합하는 표적화된 결합제, 및 DLL4(존재한다면)와 표적화된 결합제 사이의 반응을 표지하는 수단을 포함한다. 한 구체예에서, DLL4에 결합하는 표적화된 결합제는 라벨링된다. 또 다른 구체예에서, 표적화된 결합제는 라벨되지 않으며, 키트는 표적화된 결합제를 탐지하는 수단을 더 포함한다. 바람직하게는 표적화된 결합제는 형광색소, 효소, 방사성핵종 및 방사선불투과성 물질로 구성된 군으로부터 선택된 마커로 라벨될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 세포 흡착-, 침투-, 맥관형성- 또는 증식 관련 질환을 스크리닝하기 위하여 포유류 조직, 세포 또는 유체에서 DLL4를 탐지하기 위한 분석 키트를 포함한다. 키트는 DLL4에 결합하는 항체, 및 DLL4(존재한다면)와 항체의 반응을 표지하는 수단을 포함한다. 항체는 단클론 항체가 될 수 있다. 한 구체예에서, DLL4에 결합하는 항체는 라벨링되어 있다. 또 다른 구체예에서, 항체는 비-라벨링된 1차 항체이며, 키트는 1차 항체를 탐지하는 수단을 더 포함한다. 한 구체예에서, 수단은 항-면역글로블린이 라벨링된 제2항체를 포함한다. 항체는 형광색소, 효소, 방사성핵종 및 방사선불투과성 물질로 구성된 군으로부터 선택된 마커로 라벨될 수 있다.

본원에 기술된 항체에 대한 추가 구체예, 특징 및 이와 유사한 것들은 하기에서 더 상세하게 제공된다.

서열 리스트

본 발명의 구체예들은 표 1에서 열거된 특정 항체들을 포함한다. 이 표는 각 항-DLL4 항체의 식별 번호와 함께, 대응하는 중쇄 및 경쇄 유전자 및 폴리펩티드의 가변 도메인의 서열 번호를 차례로 함께 나타낸다. 각 항체는 식별번호로 제공된다.

[표 1]

표 2는 고유 생식계 중쇄 부위에 대해 항체 중쇄 부위를 비교하고, 고유 생식계 경쇄 부위에 대해 카파 경쇄 부위를 비교한 표이다.

[표 2]

정의

다른 정의가 없는 한, 여기에서 사용된 과학적 및 기술적 용어는 본 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 또한, 내용에서 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하며, 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 세포, 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 하이브리드 반응과 연관하여, 그리고 이들 기술에서 이용된 명명법은 본 기술 분야에 일반적으로 잘 알려지고 공지된 것들이다.

재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질변환(가령, 전기천공, 리포펙션)에 대해서 표준 기술이 이용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 설명 또는 본 기술 분야에 통상적으로 확립된 또는 본원에 기술된 것과 같이 실행된다. 전술한 기술 및 과정들은 본 기술 분야에 통상적으로 공지되고 본 명세서를 통하여 언급 및 논의된 다양한 일반적이고 좀더 특별한 참고자료에서 설명된 것과 같은 방법에 따라 일반적으로 실행된다. 가령,Sambrooketal.MolecularCloning: ALaboratoryManual (3rded.,ColdSpringHarbor LaboratoryPress,ColdSpringHarbor, N. Y. (2001)) 참고,-참조에 의해 본원에 통합됨. 본원에 기술된 실험 과정, 그리고 분석 화학, 합성 유기화학 및 의학 및 약리 화학의 기술과 연관되어 이용된 명명법은 본 기술 분야에 잘 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 조제물, 제제 및 운반 및 환자의 치료에는 표준 기술들이 이용된다.

본 내용과 관련하여 이용될 때, 다음의 용어들은 다른 언급이 없는 한 다음의 의미를 가지는 것으로 이해해야 한다:

길항제 또는 억제제는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 소분자량 화합물, 올리고뉴클레오티드, 올리고펩티드, RNA 간섭 (RNAi), 안티센스, 재조합 단백질, 항체, 또는 이의 단편들 또는 콘쥬게이트 또는 이의 융합 단백질들이 될 수 있다. RNAi에 대해서는Milhavet O,GaryDS,MattsonMP. (PharmacolRev. 2003Dec;55(4):629-48.Review)를 참고하며, 안티센스에 대해서는 (Opalinska JB,GewirtzAM. (SciSTKE. 2003Oct 28;2003 (206):pe47.)를 참고한다.

화합물은 약 2000 Daltons 미만의 분자량을 가지는 임의의 소분자량 화합물을 지칭한다.

"DLL4"는 Delta-유사 단백질 4 전구물질, 초파리(Drosophila) Delta homolog 4, hdelta2, MGC126344, 또는 UNQ1895/PRO4341로 알려진 DLL4인 분자를 말한다. 항체와 같은 표적화된 결합제를 언급할 때 “중화하는("neutralizing")” 또는 “억제하는("inhibits")”는 표적 항원의 활성을 제거하거나, 감소시키거나, 상당히 감소시키는 능력을 말한다. 따라서, 본 발명의 “중화” 항-DLL4 항체는 DLL4의 활성을 제거 또는 상당히 감소시키는 능력이다. DLL4 중화 항체는 고유 DLL4가 수용체 Notch, 예를 들면, Notch 1 또는 Notch 4에 결합하는 것을 차단시킴으로써 작용할 수도 있다. 이와 같은 결합의 차단에 의해, DLL4 신호-매개된 활성은 유의적으로 또는 완전하게 제거된다. DLL4에 대항하는 이상적인 중화 항체길항은 EC 증식을 촉진시킨다. 예를 들면, DLL4 중화 항체는 비-기능성 맥관 형성을 촉진시킴으로써 맥관형성을 증가시킬 수 있다.

“DLL4의 생물학적 활성의 길항제”는 DLL4의 활성을 제거, 감소 또는 상당히 감소시킬 수 있다. “DLL4의 생물학적 활성의 길항제”는 DLL4 신호생성을 제거, 감소 또는 상당히 감소시킬 수 있다. “DLL4의 생물학적 활성의 길항제”는 맥관형성 및/또는 증식을 제거, 또는 상당히 감소시킬 수 있다. .

"DLL4 신호생성의 감소"는 본 발명의 표적화된 결합제, 항체 또는 길항제가 없는 경우의 신호 생성과 비교하였을 때, 최소한 5%, 최소한 10%, 최소한 15%, 최소한 20%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 35%, 최소한 40%, 최소한 45%, 최소한 50%, 최소한 55%, 최소한 60%, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%의 DLL4 신호생성이 감소되는 것을 포함한다.

최적화된("optimized") 서열은 하나 이상의 비-생식계열 서열들이 하나 이상의 잔기에서 생식계열 서열로 되돌아가도록 돌연변이된 항체 서열(본원에 기술된 임의의 항체들의 가변 중쇄 또는 경쇄)되고, 글리코실화 부위 또는 쌍을 이루고 있지 않은 시스테인과 같은 서열에서 구조적인 책임(liability)이 제거된 것을 더 포함할 수 있다.

본원에 기술된 “폴리펩티드”는 고유 단백질, 단편 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 지칭하는 속명(generic term)으로 이용된다. 따라서, 고유 단백질, 단편들 및 유사체는 폴리펩티드류의 종들이다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간의 중쇄 면역글로블린 분자, 그리고 인간 카파(kappa) 경쇄 면역글로블린 분자, 뿐만 아니라 중쇄 면역글로블린 분자와 카파 또는 람다(lambda) 경쇄 면역글로블린 분자와 같은 경쇄 면역글로블린 분자를 포함하는 조합에 의해 형성된 항체 분자들, 그리고 이의 역, 뿐만 아니라 이의 단편들 및 유사체를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드는 인간 중쇄 면역글로블린 분자 또는 이의 단편들만으로 구성될 수도 있다.

여기에서 사용된 "고유한(native)" 또는 "자연적으로 발생되는(naturally-occurring)"은 물질에 적용되는 경우, 해당 물질이 자연계에서 발견될 수 있다는 사실을 나타낸다. 예를 들면, 자연에 있는 소스로부터 분리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은, 유기체(바이러스를 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 자연적으로 발생되는 것이다.

여기에서 사용된 “작용가능하게 링크된("operably linked")”은 설명된 성분들이 의도된 방식으로 기능을 할 수 있도록 서로 유관하게 위치된 것을 지칭한다. 예를 들면, 코딩 서열에 기준 서열이 “작용가능하게 링크”되어 있다는 것은 기준 서열과 필적되는 조건하에 코딩 서열의 발현이 실행되는 방식으로 연결되어 있다는 것을 말한다.

여기에서 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 임의의 변형된 유형, 또는 RNA-DNA 이형-이형체의 길이가 최소한 10개 염기의 뉴클레오티드로 된 폴리머 형태를 말한다. 이 용어는 DNA의 단일 및 이중 가닥형도 포함한다.

여기에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 발생되는, 그리고 비-자연적으로 발생되는 링키지에 의해 서로 연결된 자연적으로 발생되는, 그리고 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 길이가 200개 또는 이보다 적은 수의 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브셋이다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10개 내지 60개 염기, 그리고 가장 바람직하게는 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개 내지 40개 염기의 길이를 가진다. 올리고뉴클레오티드는 가령, 프로브용의 통상 단일 가닥이며, 올리고뉴클레오티드가 유전자 돌연변이체의 작제에 이용될 수 있도록 이중 가닥일 수도 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스(sense) 또는 안티센스(antisence) 올리고뉴클레오티드가 될 수도 있다.

여기에서 언급된 "자연적으로 발생되는 뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기술된 "변형된 뉴클레오티드"는 변형된 또는 치환된 당(sugar)기 및 이와 유사한 것을 가진 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에 기술된 "올리고뉴클레오티드 링키지"는 올리고뉴클레오티드 링키지 가령, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐라데이트, 포스포로아미데이트 및 이와 유사한 것들을 포함한다.LaPlancheetal.Nucl.AcidsRes. 14:9081 (1986); Stecetal. J.Am.Chem.Soc. 106:6077 (1984);Steinetal.Nucl.AcidsRes. 16:3209 (1988); Zonetal. 항-CancerDrugDesign 6:539 (1991);Zonetal.OligonucleotidesandAnalogues: A PracticalApproach,pp. 87-108 (F.Eckstein,Ed,OxfordUniversityPress,OxfordEngland (1991));Stecetal. U.S. 특허No. 5,151,510;UhlmannandPeymanChemicalReviews 90:543 (1990) 참고.-이들 내용은 참조에 의해 본원에 통합됨. 올리고뉴클레오티드는 필요하다면 탐지용 라벨을 포함할 수 있다.

여기에서 언급된 “선택적으로 하이브리드되는”은 탐지가능하게 그리고 특이적으로 결합한다는 의미다. 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이의 단편들은 비-특이적 핵산에 탐지가능한 결합의 가능한 양을 최소화시키는 하이브리드반응 및 세척 조건하에 핵산 가닥에 선택적으로 하이브리드된다. 본 기술 분야에 공지되고 여기에서 논의된 것과 같이, 선택적인 하이브리드 조건을 얻기 위해서 높은 엄격성 조건들(High stringency conditions)이 이용될 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 또는 항체 단편들과 관심대상의 핵산 서열간에 핵산 서열 상동성(homology)은 최소한 80%가 될 것이며, 좀더 일반적으로 바람직하게는 최소한 85%, 90%, 95%, 99%, 및 100%의 증가된 상동성을 가질 것이다.

엄격한 하이브리드 조건은 약 45℃, 6×염화나트륨/구연산나트륨(SSC) (0.9 M NaCl, 90 mM 구연산나트륨염, pH 7.0)에서 필터에 결합된 DNA에 하이브리드되고, 이어서 약 50-65℃에서 0.2×SSC/0.1% SDS에서 1회 이상의 세척, 매우 엄격한 하이브리드 조건은 약 45℃, 6×SSC에서 필터에 결합된 DNA에 하이브리드되고, 이어서 약 60℃에서 0.1×SSC/0.2% SDS에서 1회 이상의 세척, 또는 본 기술 분야의 당업자에 공지된 임의의 기타 엄격한 하이브리드 조건들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.(예를 들면,Ausubel, F.M.etal,eds. 1989CurrentProtocolsinMolecularBiology, vol. 1,GreenPublishingAssociates,Inc.andJohnWileyandSons,Inc,NYatpages 6.3.1to 6.3.6and 2.10.3 참고). 두 개의 아미노산 서열들은 이들 서열들 사이에 부분적 또는 완전한 상동성이 있다면, 이들 두 아미노산 서열은 "상동(homologous)"하다. 예를 들면, 85% 상동성은 두 서열의 최대 매치(maximum matching)를 위해 배열시켰을 때, 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미한다. 매칭을 최대화로 하기 위하여 갭(gaps) (매치되는 두 서열 중 임의의 것에)이 허용된다; 갭 길이는 5개 또는 그 미만이 바람직하며, 2개 또는 그 미만이 더욱 바람직하다. 대안으로, 그리고 바람직하게는, 프로그램 ALIGN과, 돌연변이 데이터 매트릭스, 그리고 6개 또는 그 이상의 갭 페널티를 이용하여 이들 두 서열의 배열 스코어가 5이상(표준 편차 단위)인 경우, 여기에서 사용된 용어와 같이, 두 개의 단백질 서열들 (또는 길이가 최소한 약 30개 아미노산으로부터 유도된 폴리펩티드 서열들)은 상동하다.Dayhoff, M. O,inAtlasofProtein 서열sandStructure,pp. 101-110 (Volume 5,NationalBiomedicalResearchFoundation (1972))andSupplement 2tothisvolume, pp. 1-10 참고. ALIGN 프로그램을 이용하여 두 개의 서열들 또는 이의 일부분이 최적으로 배열되었을 때, 이들 아미노산이 50% 또는 그 이상으로 동일한 경우, 두 개의 서열들 또는 이의 일부분은 더욱 바람직한 상동성을 가진다. 두 개의 진화적 유사성 관계인 서열내에 상동성 부위가 상이할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 예를 들면, 마우스 및 인간의 진화론적 유사한 기능 부위는 비-기능 부위보다 더 높은 수준의 상동성을 가질 수 있다.

본원에 기술된, “대응하는("corresponds to")”은 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 모두 또는 일부분에 상동성(가령, 동일하거나 또는 엄격하게 진화론적으로 관련되지 않은)이거나 또는 폴리펩티드 서열이 기준 폴리펩티드 서열과 동일하다는 것을 의미한다.

대비를 위해, 본원에 기술된 용어 “~에 상보적인("complementary to")”이란 의미는 상보적 서열은 기준 폴리뉴클레오티드 서열의 모두에 또는 일부분에 상동성이라는 것을 의미한다. 설명하자면, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 기준 서열 "TATAC"에 대응하며, 그리고 기준 서열 "GTATA"에 상보적이다.

"서열 상동성(identity)"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열들이 비교 윈도우에서 동일하다(가령, 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 잔기-대-잔기 근거하여)는 의미다. “서열 상동성 비율”은 비교 윈도우에서 최적으로 배열된 두 개의 서열을 비교하고, 두 서열 모두에서 동일한 핵산 염기(가령, A, T, C, G, U, 또는 I) 또는 아미노산 잔기의 위치 수를 측정하고, 비교 윈도우에서 전체 위치수(가령, 윈도우 크기)를 일치된 위치수로 나누고, 결과값에 100을 곱하여 서열 상동성 비율을 산출함으로써, 계산된다. 본원에 기술된, “실질적 상동성”은 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특징을 표시한 것으로, 여기서, 최소한 18개 뉴클레오티드(6개 아미노산)의 비교 윈도우, 종종 최소한 24-48개 뉴클레오티드(8-16개 아미노산)의 윈도우에서 기준 서열과 비교하였을 때, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산은 최소한 85% 서열 상동성, 바람직하게는 최소한 90% 내지 95%, 더욱 바람직하게는 최소한 99% 서열 상동성을 가진 서열을 포함하며, 여기서 서열 상동성의 비율은 비교 윈도우에서 총 20% 또는 그 미만의 결손 또는 추가를 포함하는 서열을 기준 서열에 비교하여 계산된다. 기준 서열은 더 큰 서열의 부분(subset)이 될 수 있다.

여기에서 사용될 것과 같이, 20개 통상적인 아미노산 및 이의 약어는 통상적인 용도에 따른다.Immunology - ASynthesis (2^ndEdition, E. S.Goluband D.R.Gren,Eds.,SinauerAssociates, Sunderland,Mass. (1991)),-참고문헌에 통함됨. 20개 통상적인 아미노산의 입체이성질체(가령, D-아미노산), 비-자연적 아미노산 가령, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산 및 기타 비-통상적인 아미노산 또한 본 발명의 폴리하이브리드의 성분으로 적합할 수 있다. 비-통상적인 아미노산의 예로는 다음을 포함한다: 4-하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산(가령, 4-하이드록시프로린). 여기에서 사용된 폴리펩티드 표기에서, 표준 용도 및 관례에 따라 왼쪽 방향은 아미노 말단 방향이며, 오른쪽 방향은 카르복시 말단 방향이다.

유사하게, 다른 언급이 없는 한, 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드 서열들의 왼쪽 단부는 5' 말단이며; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 서열들의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 초기 RNA 전사에서 5'에서 3' 방향으로의 추가는 전사 방향으로 지칭된다; RNA와 동일한 서열을 가진 DNA 가닥상에서, 그리고 5' 에서 RNA 전사체의 5'이 되는 서열 부위들은 “상류(upstream) 서열들”이라고 하며; RNA와 동일한 서열을 가진 DNA 가닥상에서, 그리고 3' 에서 RNA 전사체의 3'가 되는 서열 부위들은 “하류(downstream) 서열들”이라고 한다.

폴리펩티드에 사용할 경우, "실질적인 상동성"은 두 개의 펩티드 서열이 최적으로 배열되었을 때(가령, 디폴트 갭 웨이트를 이용한 프로그램 GAP 또는 BESTFIT), 두 서열은 최소한 80 % 서열 상동성, 바람직하게는 최소한 90 % 서열 상동성, 좀더 바람직하게는 최소한 95 % 서열 상동성, 그리고 가장 바람직하게는 최소한 99 % 서열 상동성을 가진다는 의미다. 바람직하게는, 동일하지 않는 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 가진 잔기들의 상호교환을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 가진 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신이며; 지방족-하이드록실 측쇄를 가진 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 가진 아미노산 기는 아스파라진 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 가진 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 가진 아미노산 군은 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘이며; 그리고 황-함유 측쇄를 가진 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군들은 다음과 같다: 발린-루이신-이소루이신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타민산-아스파르트산, 그리고 아스파라진-글루타민.

본원에 기술된 것과 같이, 항체 또는 면역글로블린 분자에 최소한 75%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 90%, 95%, 그리고 가장 바람직하게는 99% 서열 상동성을 유지한다면, 항체들 또는 면역글로블린 분자의 아미노산 서열에 있는 약간의 변이들도 본 발명에 포함되는 것으로 간주된다. 특히, 보존적 아미노산 치환(replacements)도 고려된다. 보존적 치환은 관련된 측쇄를 가진 아미노산 패밀리내에서 일어난다. 유전학적으로 인코드된 아미노산은 다음과 같은 패밀리로 나뉜다: (1) 산성=아스파르트산, 글루타민산; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성=알라닌, 발린, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 그리고 (4) 비-하전 극성=글리신, 아스파라진, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 좀더 바람직한 패밀리는 다음과 같다: 세린 및 트레오닌은 지방족-하이드록시 패밀리이며; 아스파라진 및 글루타민은 아미드-함유 패밀리이며; 알라닌, 발린, 루이신 및 이소루이신은 지방족 패밀리이며; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 방향족 패밀리다. 예를 들면, 루이신을 이소루이신 또는 발린으로 대체, 아스파르트산을 글루타민산으로 대체, 트레오닌을 세린으로 대체 또는 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 대체시키면, 특히 이와 같은 치환이 프레임워크 부위내에 있는 아미노산에서 일어나는 것이 아닌 경우, 생성 분자의 결합 기능 또는 특성에 큰 영향이 없을 것이라고 기대해도 될 것이다. 아미노산 교환으로 기능적 펩티드가 야기되는지는 폴리펩티드 유도체의 특이 활성을 분석함으로써 바로 결정될 수 있다. 여기에서 분석법은 상세하게 설명된다. 항체들 또는 면역글로블린 분자의 단편들 또는 유사체는 본 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 준비될 수 있을 것이다. 단편들 또는 유사체들의 바람직한 아미노 및 카르복시-말단은 기능 도메인의 경계에 있다. 공개 또는 독점 서열 데이터베이스의 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 비교함으로써 구조적 그리고 기능적 도메인을 확인할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 서열 모티프 또는 공지의 구조 및/또는 기능을 가진 기타 단백질들에서 일어나는 예측된 단백질 형태 도메인을 확인하기 위하여 컴퓨터를 이용한 비교 방법들이 이용된다. 공지의 3차원적 구조로 폴드되는 단백질 서열들을 확인하는 방법들은 공지되어 있다.Bowieetal.Science 253:164 (1991). 따라서, 본 기술 분야의 당업자들이 본원에 기술된 항체에 따라 서열 모티프 및 구조적 및 기능적 도메인을 한정하는데 이용될 수 있는 구조적 형태를 인지할 수 있다는 것을 다음의 실시예들에서 설명한다.

글루타미닐 및 아스파라지닐 잔기는 종종 아미드가 제거되어(deamidate), 각각 상응하는 글루타민 및 아스파르틸 잔기가 된다. 이들 잔기들은 중성 또는 염기성 조건하에서 아미드가 제거된다. 이들 잔기의 아미드제거된 형태는 본 발명의 범위에 속한다.

일반적으로, 단백질에서 시스테인 잔기들은 시스테인-시스테인 이황화결합에 관여하거나 또는 폴드된 단백질 부위의 일부가 되는 경우 이황화 결합 형성으로부터 공간적으로 보호된다. 단백질에서 이황화 결합 형성은 복합 프로세스이며, 이는 환경의 산화환원 전위 및 특화된 티올-이황화 교환 효소들에 의해 결정된다(Creighton,MethodsEnzymol. 107, 305-329, 1984;Houee-Levin,Methods Enzymol. 353, 35- 44,2002). 시스테인 잔기가 단백질 구조에서 쌍을 가지지 않고, 폴딩에 의해 공간적으로 보호되지 않는 경우, 시스테인 잔기는 이황화 셔플링(shuffling)으로 공지된 프로세스에서 용액에 자유(free) 시스테인과 함께 이황화 결합을 형성할 수 있다. 이황화 스크램블링(scrambling)으로 알려진 또 다른 프로세스에서, 자유 시스테인은 자연적으로 발생되는 이황화 결합 (항체 구조내에 존재하는 것과 같은)을 방해하여, 낮은 결합, 낮은 생물학적 활성 및/또는 낮은 안정성을 유도할 수 있다.

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화력을 변경시키고, (4) 결합 친화력을 변경시키고, (4) 이와 같은 유사체의 기타 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 치환이다. 유사체는 자연적으로 발생되는 펩티드 서열을 제외한 서열의 다양한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 또는 다중 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 자연적으로-발생되는 서열 (바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인 외부에 있는 폴리펩티드 부위)에서 있을 수도 있다. 보존적 아미노산 치환은 부모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변경해서는 안된다 (가령, 치환 아미노산은 부모 서열에 있는 헬릭스를 파괴해서는 안되며, 또는 부모 서열의 특징이 되는 다른 유형의 2차 구조를 붕괴시켜서는 안된다). 기술 분야에서 확인된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예시들은Proteins,StructuresandMolecularPrinciples (Creighton,Ed, W. H.FreemanandCompany,NewYork (1984));IntroductiontoProteinStructure (C.Brandenand J.Tooze,eds,GarlandPublishing,NewYork, N.Y. (1991));andThorntonetal.Nature 354:105 (1991)에 설명되어 있으며, 이들 각각은 참조에 의해 본원에 통합된다.

추가적으로, 하나 이상의 주쇄(intrachain) 이황화 결합이 결손된 항체 분자를 생성시키기 위하여, 이와 같은 방법들을 이용하여 주쇄(intrachain) 이황화 결합에 참여하는 하나 이상의 가변 부위 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결손을 만들 수 있다.

"CDR 부위" 또는 "CDR"은 항체에 항원-결합 특이성을 부여하는 항체의 중쇄 및 경쇄의 초가변(hypervariation) 부위를 나타낸다. CDRs은 Kabat 시스템에 따라 한정될 수 있다(Kabat, E. A. etal. (1991) 서열sofProteinsofImmunologicalInterest, 5thEdition.USDepartmentof HealthandHumanServices,PublicService,NIH,Washington),andlatereditions). 항체는 일반적으로 3개의 중쇄 CDR과 3개의 경쇄 CDR을 포함한다. CDR 또는 CDRs은 경우에 따라 항체가 인지하는 항원 또는 에피토프에 대해 항체의 결합 친화력을 담당하는 아미노산 잔기의 대부분을 포함하는 부위들 중 하나 또는 몇 개 또는 전체를 지칭하는데 이용된다.

중쇄의 세 번째 CDR (HCDR3)은 더 큰 변이성(발생되는 유전자의 배열 기전에 따라 기본적으로 특히 더 큰 변이성)을 가진다. 알려진 가장 긴 것은 26개 아미노산이나, 2개 아미노산과 같이 짧을 수도 있다. CDR 길이는 특정 근원적 프레임워크에 의해 조절될 수 있는 길이에 따라 변화될 수 있다. 기능적으로, HCDR3는 항체의 특이성을 결정하는데 일부 역할을 한다(Segaletal,PNAS, 71:4298-4302, 1974,Amitetal,Science, 233:747-753, 1986,Chothiaetal, J.MoI.Biol, 196:901-917, 1987,Chothiaetal,Nature, 342:877- 883, 1989,Catonetal, J.Immunol, 144:1965-1968, 1990,Sharonetal,PNAS, 87:4814-4817, 1990,Sharonetal, J.Immunol, 144:4863-4869, 1990,Kabatetal, J.Immunol, 147:1709-1719, 1991).

여기에서 사용된 "CDRs 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDRs의 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 말하며, LCDRs 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 말한다.

여기에서 제시된 아미노산 서열을 가진 것들을 포함하며, DLL4에 대한 물질 및 항체의 표적화에 이용될 수 있는, 본 발명의 VH 및 VL 도메인 및 CDR의 변이체들은 서열 변경 또는 돌연변이 방법 및 원하는 특징을 가진 항원 표적에 대한 스크리닝에 의해 수득될 수 있다. 원하는 특징의 예로는 항원에 특이적인 공지의 항체들과 비교하여, 항원에 대한 결합 친화력이 증가; 활성이 공지된 경우, 항원에 특이적인 공지의 항체와 비교하여, 항원 활성의 중화능력의 증가; 특정 몰 비에서 항원에 대하여 공지의 항체 또는 리간드와 명시된 경쟁 능력; 리간드-수용체 복합체를 면역침전시키는 능력; 지정된 에피토프에 결합하는 능력; 선형 에피토프, 펩티드-결합 스캔, 가령 선형 및/또는 압박된 형태에서 스크린된 펩티드를 이용하여 확인된 펩티드 서열; 비-연속적 잔기들에 의해 형성된 형태학적 에피토프; DLL4의 새로운 생물학적 활성을 조절하는 능력 또는, 하류 분자를 조절하는 능력; DLL4에 결합하고 및/또는 DLL4를 중화시키는 능력 또는 임의의 기타 원하는 특성을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

CDRs의 아미노산 서열, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 항원 결합 부위내에 치환을 만드는데 요구되는 기술은 본 기술 분야에서 이용가능하다. 본원에 기술된 항체 분자들의 변이체들은 본 발명에서 생산되고, 이용될 수 있다. 구조/특성-활성 관계에 다변수 데이터 분석 기술을 적용함에 있어서 컴퓨터에 의한 화학의 주도하에(Wold,etal.Multivariatedataanalysisinchemistry. Chemometrics -MathematicsandStatisticsinChemistry (Ed.: B.Kowalski), D.Reidel PublishingCompany,Dordrecht,Holland, 1984) 항체들의 활성-특성 정량적 관계는 통계학적 회귀, 패턴 인식 및 분류와 같은 잘 알려진 수학적 기술을 이용하여 유도될 수 있다. (Normanetal. AppliedRegressionAnalysis.Wiley-Interscience; 3rdedition (April 1998);Kandel,Abraham & Backer,Eric.Computer-AssistedReasoninginClusterAnalysis.PrenticeHallPTR, (May 11, 1995);Krzanowski,Wojtek.PrinciplesofMultivariateAnalysis: AUser'sPerspective (Oxford StatisticalScienceSeries,No 22 (Paper)).OxfordUniversityPress; (December 2000); Witten,Ian H. &Frank,Eibe.DataMining:PracticalMachineLearningToolsandTechniques withJavaImplementations.MorganKaufmann; (October 11, 1999);DenisonDavid G. T. (Editor), Christopher C.Holmes,Bani K.Mallick,Adrian F. M.Smith.BayesianMethodsforNonlinear ClassificationandRegression (WileySeriesinProbabilityandStatistics).JohnWiley & Sons; (July 2002);Ghose,Arup K. &Viswanadhan,Vellarkad N.CombinatorialLibraryDesign andEvaluationPrinciples,Software,Tools,andapplicationsinDrugDiscovery). 일부 경우에, 항체들의 특징은 항체 서열의 실험적인 및 이론적인 모델에서 유도될 수 있으며(예를 들면, 있음직한 접촉 잔기 또는 계산된 물리화학적 특성의 분석), 기능적 및 3차원 구조 및 이들의 특성은 단독으로 및 복합적으로 고려될 수 있다.

VH 도메인과 VL 도메인으로 구성된 항체 항원-결합 부위는 폴리펩티드의 6개 루프에 의해 일반적으로 형성된다: 경쇄 가변 도메인 (VL)으로부터 세 개, 및 중쇄 가변 도메인 (VH)으로부터 세 개. 공지의 원자 구조를 가진 항체들의 분석으로 서열과 항체 결합 부위의 3차원 구조사이에 관련성을 밝혔다. 이들 상관관계는 VH 도메인에서 세 번째 부위(루프)을 제외하고, 결합 부위 루프는 소수의 주요-쇄 형태: 기본적인 5개 구조중 하나를 가진다는 것을 의미한다. 특정 루프에서 형성된 기본 구조는 루프와 프레임워크 부위 모두에 있는 주요 부위에서 특정 잔기들의 존부 및 크기에 의해 결정되는 것으로 밝혀졌다. 이들의 특성은 단독으로 및 복합적으로 고려될 수 있다.

서열-구조 상관 관계의 본 연구는 공지의 서열을 가진 항체 및 알려지지 않은 3차 구조의 항체에서 이들 잔기를 예측하는데 사용될 수 있는데, 이것은 CDR 루프의 3차원적 구조를 유지하고, 따라서 결합 특이성을 유지하는데 중요하다. 이와 같은 예측은 선두의 최적화 실험 결과의 예측과 비교됨으로써 뒷받침될 수 있다. 구조적 방식에서, WAM와 같은 임의로 자유롭게 이용가능한 또는 시판되는 패키지를 이용하여 항체 분자의 모델이 생성될 수 있다. 단백질 시각화(visualisation) 및 분석 소프트웨어 패키지 가령, Insight II (Accelrys, Inc.) 또는 Deep View는 CDR에서 각 위치에 가능한 치환을 평가하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 정보를 이용하여 활성에 최소한 또는 유익한 효과를 가지거나 또는 기타 바람직한 특성을 부여할 수 있는 치환을 만들 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, "폴리펩티드 단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결손을 가지지만, 나머지 아미노산 서열은 전장 cDNA 서열로부터 유추된 자연적으로 발생되는 서열에서 대응하는 위치에 동일한 폴리펩티드를 말한다. 단편은 일반적으로 최소한 5개, 6개, 8개 또는 10개 아미노산, 바람직하게는 최소한 14개 아미노산, 더 바람직하게는 최소한 20개 아미노산, 보통 최소한 50개 아미노산, 더욱 바람직하게는 최소한 70 개의 아미노산의 길이를 가진다. 여기에서 사용된 것과 같이 “유사체(analog)”는 유추된 아미노산 서열의 일부분에 실질적으로 동일한 최소한 25개 아미노산의 단편으로 구성되며, 다음의 특성들 중 최소한 하나를 가지는 폴리펩티드를 지칭한다: (1) 적절한 결합 조건하에서, DLL4에 특이적으로 결합하고, (2) VEGF/DLL4 결합을 적절하게 차단하는 능력, 또는 (3) DLL4 수용체 티로신 키나제 활성을 저해시키는 능력. 일반적으로, 폴리펩티드 유사체는 자연적으로 발생되는 서열에 대해 보존적 아미노산 치환(또는 결손 또는 추가)을 포함한다. 유사체는 일반적으로 최소한 20개의 아미노산, 바람직하게는 최소한 50개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 가지며, 자연적으로 발생되는 전장 폴리펩티드와 동일한 길이를 가지는 경우도 종종 있을 수 있다.

약학 산업에서 펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 가지는 비-펩티드 약물로 흔히 이용된다. 이와 같은 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체(mimetics)" 또는 "펩티도미메틱스(peptidomimetics)"이라고 칭한다(Fauchere, J.Adv.DrugRes. 15:29 (1986);Veberand FreidingerTINS p.392 (1985);andEvansetal. J.Med.Chem. 30:1229 (1987), 이들은 참조에 의해 본원에 통합됨). 이와 같은 화합물들은 흔히 컴퓨터에 의한 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료요법적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체가 이용되어 등가의 치료요법적 또는 예방적 효과를 만든다. 일반적으로 펩티드-모방체는 인간 항체와 같은 패러다임 폴리펩티드 (가령, 생화학적 특성 또는 약제학적 특성을 가진 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하나, 본 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해, 하나 이상의 펩티드 링키지가 -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-(cis 및 trans), - COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO-으로 구성된 군으로부터 선택된 링키지에 의해 임의적으로 치환되어 있다. 보전(consensus) 서열 중 하나 이상의 아미노산이 동일한 타입의 D-아미노산(가령, L-리신 위치에 D-리신)으로 치환되는 시스템을 이용하여 좀더 안정적인 펩티드를 만들 수 있다. 또한, 보전 서열 또는 실질적으로 동일한 보전 서열 변이를 포함하는 압박된(constrained) 펩티드는 본 기술 분양에 공지된 방법들에 의해 생성될 수 있다(RizoandGieraschAnn.Rev. Biochem. 61:387 (1992), -참조에 의해 본원에 통합됨); 예를 들면, 가령, 펩티드를 고리화시키는 분자내 이황화 결합을 만들 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성될 수 있다.

항체는 올리고클론 항체, 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, CDR-접목된 항체, 다중-특이적 항체, 이중특이적 항체, 촉매 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 완전한 인간 항체, 항-이디오타입 항체 및 가용성 또는 결합된 형의 라벨링된 항체들 뿐만 아니라 이들의 단편, 변이체 또는 유도체가 될 수 있으며, 이들은 단독으로 또는 공지의 기술에 의해 제공된 기타 아미노산 서열과 복합될 수 있다. 항체는 임의의 종으로부터 유도될 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "항체" 및 "항체들" (면역글로블린)은 단클론 항체들 (전장 단클론 항체들을 포함하는), 다클론 항체들, 카멜라이즈화된(camelised) 항체들 및 키메라 항체들을 포함한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "항체들"은 내부 표면 모양 및 항원의 항원 결정 부위 특징에 상보적인 전하 분포를 가지는 3차원 결합 공간을 보유하는 폴리펩티드 쇄의 폴딩에 의해 형성된 최소한 한 개의 결합 도메인으로 구성된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 지칭한다. 고유한 항체들은 두 개의 동일한 경쇄(L)와 두 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 daltons의 이형사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 한 개의 공유 이황화 결합에 의해 링크되어 있으며, 상이한 면역글로블린 이소타입의 중쇄간에 이황화 링키지의 수는 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적인 공간을 두고 주쇄(spaced intrachain) 이황화 브릿지를 가진다. 각 중쇄는 한 단부에 가변 도메인 (VH)과, 몇 개의 불변(constant) 도메인을 가진다. 각 경쇄는 한 단부에 가변 도메인(VL)과 다른 단부에 한 개의 불변 도메인을 가진다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 경쇄는 경쇄 불변 부위의 아미노산 서열에 근거하여람다 쇄 또는카파 쇄로 분류된다. 카파 경쇄의 가변 도메인은 VK로 표시할 수도 있다. "가변 부위"은 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인을 설명하는데 이용될 수도 있다. 특정 아미노산 잔기들은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 보인다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 부위가 항체 결합 부위를 형성한다. 이들 항체들은 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 포유류로부터 유도될 수 있다.

"항체" 또는 "항체들"은 본 발명의 항체들의 결합 단편들을 포함하는데, 예시적인 단편은 단일-쇄 Fvs (scFv), 단일-쇄 항체들, 단일 도메인 항체들, 도메인 항체들, Fv 단편, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')₂ 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편, 이황화-안정화된 가변 부위 (dsFv), 디아바디(Diabody), 항-이디오타입(항-Id) 항체들 (가령, 본 발명의 항체에 대한 항-Id), 인트라바디(intrabodies), 선형 항체들, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체들 및 상기 언급된 것들 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체들은 면역글로블린 분자 및 면역글로블린 분자의 면역학적으로 활성을 가진 단편, 가령, 항원-결합 부위를 포함하는 분자를 포함한다. 면역글로블린 분자는 임의의 유형(가령, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 부류(가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위 부류가 될 수 있다.

효소 파파인으로 항체를 절단하면, 두 개의 동일한 항원 결합 단편, 즉, "Fab" 단편, 그리고 항원-결합 활성은 없지만 결정화되는 능력을 보유하는 "Fc" 단편이 만들어진다. 항체들을 효소 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편이 생성되는데, 항체 분자의 두 개 팔(arm)이 서로 연결된 상태로 유지되며, 두 개-항원 결합 부위를 가진다. F(ab')₂ 단편은 항원에 가교결합되는 능력을 가진다.

본원에 기술된 "Fv"는 항원-인지 및 항원-결합 부위를 모두 보유하는 항체의 최소 단편을 말한다. 이 부위는 한 개의 중쇄 및 한 개의 경쇄 가변 도메인이 서로 단단하게, 비-공유적으로 또는 공유적으로 연합된 것으로 구성된다. 이와 같은 배위(configuration)에서, 각 가변 도메인의 세 개 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면상에 항원-결합 부위를 한정시킨다. 집합적으로 6개의 CDR은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대한 특이성을 가지는 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인지하고 항원에 결합하는 능력을 보유하지만, 전체 결합 부위 보다는 낮은 친화력을 가진다.

여기에서 사용된, "Fab"는 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.

여기에서 사용된, "dAb"은 인간 항체의 최소 기능적 결합 단위가 되는 항체 단편을 지칭한다. "dAb"는 단일 도메인 항체이며, 항체 중쇄의 가변 도메인(VH 도메인) 또는 항체 경쇄의 가변 도메인(VL 도메인)으로 구성된다. 각 dAb는 6개의 자연적으로 발생되는 CDR 중 세 개를 포함한다(Wardetal,Bindingactivitiesof arepertoireofsingleimmunoglobulinvariabledomains secretedfromEscherichiacoli.Nature 341, 544-546 (1989);Holt,etal,Domainantibodies: proteinfortherapy,TrendsBiotechnol. 21, 484-49 (2003)). 11 내지 15 kDa 범위의 분자량을 가지며, 단편 항원 결합 단편 (Fab)2보다는 4배 더 작고, 단일 쇄 Fv (scFv) 분자 크기의 절반이다.

여기에서 사용된, "Camelid"는 경쇄가 없는, 그럼에도 불구하고 광역의 항원-결합 레파토리를 보유하는 중쇄-이량체로 구성된 항체 분자를 지칭한다. (Hamers-Casterman C,Atarhouch T, Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,SongaEB, Bendahman N,Hamers R (1993)Naturallyoccurringantibodiesdevoidoflight chains.Nature 363:446-448).

"디아바디(diabodies)"은 두 개의 항원-결합 부위를 가지는 작은 항체 단편을 말하는데, 이들 단편들은 경쇄 가변 도메인 (VL)에 중쇄 가변 도메인 (VH)이 동일한 폴리펩티드 쇄에서 연결(VH-VL)된 것을 포함한다. 동일한 쇄에서 두 개 도메인의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용하게 되면, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 짝을 이루도록 강요받게 되어, 두 개의 항원-결합 부위가 만들어진다. “디아바디(diabodies)”은 예를 들면, EP 404,097; WO 93/11161; 및Hollingeretal,Proc.Natl.Acad.ScLUSA, 90:6444-6448 (1993)에서 더욱 자세하게 설명되어 있다.

전체 항체의 단편들은 항원 결합 기능을 실행할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 결합 단편의 예는 (Ward, E. S.etal, (1989)Nature 341, 544-546) (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; (McCaffertyetal (1990)Nature, 348, 552-554) ; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (Holtetal (2003) TrendsinBiotechnology 21, 484-490); (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward, E.S.etal,Nature 341, 544-546 (1989),McCaffertyetal (1990)Nature, 348, 552-554,Holtetal (2003) TrendsinBiotechnology 21, 484-490]; (v) 분리된 CDR 부위; (vi) F(ab')₂ 단편, 두 개의 링크된 Fab 단편을 포함하는 이가(bivalent) 단편; (vii) 단일 쇄 Fv 분자 (scFv), 여기서, VH 도메인 및 VL 도메인은 두 개 도메인이 서로 연합하여 항원 결합 부위의 형성을 허용하는 펩티드 링커에 의해 링크되어 있다(Birdetal, (1988)Science, 242, 423-426,Hustonetal, (1988)PNASUSA, 85, 5879-5883); (viii) 이중특이적 단일 쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 디아바디("diabodies"), 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편(WO94/13804;Holliger, P. (1993)etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,)이 있다. Fv, scFv 또는 디아바디(diabody) 분자들은 VH 및 VL 도메인을 링크하는 이황화 브릿지를 결합시킴으로써 안정화될 수 있다(Reiter, Y.etal,NatureBiotech, 14, 1239-1245, 1996). CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함하는 미니바디(Minibodies)도 만들 수 있다(Hu, S.etal, (1996)CancerRes, 56, 3055- 3061). 결합 단편의 기타 예는 Fab', 이는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 몇 개의 잔기가 추가됨으로써 Fab 단편과 달라지는데, 항체 힌지 부위에서 하나 이상의 시스테인을 포함하며, Fab'-SH, 이는 Fab' 단편으로써, 불변 도메인의 시스테인 잔기에 자유 티올기를 보유하고 있다.

"가변(variable)"이란 가변 도메인의 특정 부위들은 항체들간에 서열에서 상당히 상이하며, 특정 항원에 대해 각 특정 항체의 결합 특이성을 담당하는 것을 지칭하다. 그러나, 항체들의 가변 도메인을 통하여 가변성이 고르게 분포되어 있지는 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 부위(CDR)라고 불리는 단편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 매우 보존된 부위는 프레임워크 부위(FR)이라고 한다. 고유한 중쇄 및 경쇄의 각 가변 도메인은 4개의 FR 부위를 포함하는데, 대부분 β-쉬트 형상을 취하며, 3개의 CDR에 의해 연결되어, 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 β-쉬트 구조의 일부분을 형성한다. 각 쇄의 CDR은 FR 부위에 의해 근접하게 함께 지탱되며, 다른 쇄의 CDR들과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 기여한다. (Kabatetal, 서열sofProteinsofImmunologicalInterest, 5thEd.PublicHealthService,National InstitutesofHealth,Bethesda,MD (1991)). 불변 도메인들은 항원 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항원 결합 친화력에 영향을 줄 수 있으며, 다양한 작용체 기능들 예를 들면, ADCC, CDC, 및/또는 자가-사멸에서 항체 참여와 같은 기능을 나타낸다.

"초가변부위"(hypervariable region)는 항원에 항체가 결합하는 것에 관여하는 항체의 아미노산 잔기들을 지칭하는 것이다. 초가변 부위는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDRs"의 아미노산 잔기 (가령, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및95-102 (H3);Kabatetal,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest, 5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD (1991)) 및/또는 "초가변 루프"의 이들 잔기 (가령, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3);ChothiaandLesk, J.MoI.Biol, 196:901- 917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDRs의 측면에 있는 가변 도메인 잔기들이다. FR 잔기는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간, 도메인 항체들, 디아바디(diabodies), 백신바디(vaccibodies), 선형(linear) 항체들, 및 이중특이적 항체들에서 존재한다.

여기에서 사용된 것과 같이, 표적화된 결합제, 표적화된 결합 단백질, 특이적 결합 단백질 및 이와 유사한 용어들은 표적 부위에 선호적으로 결합하는 항체, 또는 이의 결합 단편을 지칭한다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 오로지 한 개의 표적 부위에 특이적이다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제는 한 개이상의 표적 부위에 특이적이다. 한 구체예에서, 표적화된 결합제는 단클론 항체일 수 있으며, 표적 부위는 에피토프가 될 수 있다.

항체의 "결합 단편"은 재조합 DNA 기술 또는 고유 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 만들어진다. 결합 단편들은 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAb 및 단일-쇄 항체들을 포함한다. "이중특이적" 또는 "이기능적" 항체를 제외한 항체는 각 동일한 결합 부위를 가지는 것으로 이해되어야 한다. 과량의 항체가 카운터-수용체에 결합된 수용체의 양을 최소한 약 20%, 40%, 60% 또는 80%, 통상적으로 약 85% 이상 감소시킬 때(시험관내 경쟁 결합 분석에 의해 측정하였을 때), 항체는 수용체가 카운터-수용체에 흡착하는 것을 실질적으로 저해한다.

에피토프("epitope")는 면역글로블린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정부위를 포함한다. 에피토프 결정부위는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 항상 그런 것은 아니지만, 특이적인 3차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징도 가질 수 있다. 해리 상수가 ≤1 μM인 경우, 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM 인 경우, 항체는 항원에 특이적으로 결합한다고 말한다.

물질("agent")은 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 재료로부터 만든 추출물을 지칭할 때 사용된다.

DLL4 폴리펩티드에 대해 "활성이 있는(Active)" 또는 "활성(activity)"은 고유한 DLL4 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 면역학적 활성을 가지는 DLL4 폴리펩티드의 부위를 지칭한다. 여기에서 사용된“생물학적”이란 고유한 DLL4 폴리펩티드의 활성으로 인한 생물학적 기능을 지칭한다. 바람직한 DLL4의 생물학적 활성은 예를 들면, DLL4 유도된 세포 흡착 및 침투 및/또는 맥관형성 및/또는 증식을 포함한다.

여기에서 사용된“포유류”는 포유류로 간주되는 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

여기에서 사용된 "동물"은 포유류로 간주되는 동물을 포함한다. 바람직하게는 동물은 인간이다.

"mAb"는 단클론 항체를 지칭한다.

여기에서 사용된 "리포좀(Liposome)"은 본 발명의 DLL4 폴리펩티드 또는 DLL4 폴리펩티드에 대한 항체들을 포함하는 약물을 포유류에게 운반하는데 이용될 수 있는 소포를 말한다.

여기에서 사용된 "라벨" 또는 "라벨링된"은 폴리펩티드에 탐지가능한 모이어티의 부착을 의미하는 것으로, 예를 들면, 방사능라벨, 형광 라벨, 효소적 라벨 화학발광 라벨링된 또는 바이오티닐 기의 부착을 의미한다. 방사성 동위 원소 또는 방사능핵종은³H,¹⁴C,¹⁵N,³⁵S,⁹⁰Y,⁹⁹Tc,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I을 포함하고, 형광 라벨은 로다민, 란탄 인광체, 또는 FITC를 포함할 수 있으며, 효소적 라벨은 양고추냉이 과산화효소, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제를 포함할 수 있다.

추가적인 라벨로는 설명을 위하여 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 효소, 가령, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제("G6PDH"), α-D-갈락토시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코즈 아밀라제, 카르보닌 안하이드라제, 아세틸콜린에스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 및 퍼옥시다제; 염료; 추가적인 형광 라벨 또는 형광 물질은 플루오로레세인 및 이의 유도체들, 형광색소, GFP (GFP: "Green Fluorescent Protein"), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 및 플루오로스카민을 포함하고; 란탄 크립테이트와 같은 형광체, 및 킬레이트, 가령 Europium etc. (PerkinElmerandCis BioInternational); 화학발광(chemoluminescent) 라벨 또는 화학형광물질( chemiluminescers), 가령, 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄; 감작제(sensitisers); 코엔자임; 효소 기질; 라텍스 또는 탄소 입자와 같은 입자; 메탈 졸(metal sol); 정자(crystallite); 리포좀; 염료, 촉매 또는 기타 탐지가능한 군으로 추가 라벨될 수 있는 세포 등,; 바이오틴, 딕옥시게닌 또는 5-브로모데옥시우리딘과 같은 분자; 톡신 모이어티 예를 들면 슈도모나스 엑소톡신(PE 또는 세포독성 단편 또는 이의 돌연변이체), 디프테리아 톡신 또는 이의 세포독성 단편 또는 이의 돌연변이체, 보틀리늄 톡신 A, B, C, D, E 또는 F, 리친 또는 이의 세포독성 단편, 가령, 리친 A, 아브린 또는 이의 세포독성 단편, 사포린 또는 이의 세포독성 단편, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 톡신 또는 이의 세포독성 단편 및 브리요딘(bryodin) 1 또는 이의 세포독성 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 톡신 모이어티.

여기에서 사용된, “약제학적 물질 또는 약물”은 환자에게 적절하게 투여되었을 때, 원하는 치료요법적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 여기에서 사용된 기타 화학적 용어들은 분 기술 분야, 예를 들면,TheMcGraw-HillDictionaryofChemicalTerms (Parker, S,Ed,McGraw-Hill,SanFranCisco (1985)), (참조에 의해 본원에 통합됨)에서 예시된 바와 같은 통상적인 용도에 따라 이용된다.

여기에서 사용된 바와 같이, “실질적으로 순수한”은 대상 종이 우세한 종이며(가령, 몰량에 근거하여, 조성물에서 임의의 기타 개별 종보다 더 많은), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분취물은 조성물이며, 여기서, 대상 종은 존재하는 모든 거대분자 종의 최소한 약 50% (몰량에 근거하여)를 포함한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80% 이상, 더욱 바람직하게는 약 85%, 90%, 95%, 및 99%이상을 포함한다. 가장 바람직하게는, 대상 종은 필수적인 동질성을 가지도록 순수 분리되며(통상적인 탐지 방법에 의해 조성물에서 오염물질 종이 탐지되지 않는다), 여기서, 조성물은 기본적으로 단일 거대분자 종으로 구성된다.

"환자"는 인간 및 수의학적 개체를 포함한다.

"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 세포-매개된 반응을 지칭하는데, 이때 Ig Fc 수용체(FcRs)를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포(가령 자연 살해 세포(Natural Killer (NK)) 세포, 단핵세포, 호중구 및 대식세포)는 표적 세포에 있는 결합된 항체를 인지하고, 결과적으로 표적 세포를 용해시킨다. ADCC를 매개하는 1차 세포(primary cells), NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키지만, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈세포상에서 FcRs 발현은Ravetch andKinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92 (1991)의 464페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, U.S. 특허 No. 5,500,362, 또는 5,821,337에서 설명된 것과 같은 시험관 ADCC 분석을 실행할 수 있다. 이와 같은 분석에 유용한 작용체 세포들은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해 세포(NK)를 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은Clynesetal.PNAS (USA) 95:652-656 (1988)에서 설명된 것과 같이 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수도 있다. "보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"는 항체들이 이들의 세포-사멸 기능을 실행하는 기전을 말한다. 보체의 제1 구성 성분인 C1q가 Igs, IgG 또는 IgM의 Fc 도메인에 결합하여, 항원과 복합체가 됨으로써 이 기전이 개시된다, (Hughs-Jones, N.C,and B.Gardner. 1979.MoI. Immunol. 16:697). C1q은 인간 혈청에 70 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 ~410 kDa의 구조적으로 큰 복합적인 당단백질이다(Cooper, N.R. 1985.Adv.Immunol. 37:151). 두 개의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s와 함께, C1q은 보체의 제1성분인 복합체 C1을 형성한다. C1의 활성화, 이에 의해 보체 캐스캐이드를 개시하기 위해서, C1q의 N-말단 구형 머리중 적어도 2개는 Ig의 Fc에 결합되어야만 한다(Cooper, N.R. 1985.Adv.Immunol. 37:151).

여기에서 사용된 "항체 반감기"는 투여 후, 항체 분자의 평균 생존 시간의 측량이 되는 항체의 약동학적 특성을 의미한다. 항체 반감기는 환자의 신체 또는 특정 구역, 예를 들면, 혈장 또는 혈청에서 순환 반감기로 측정된 또는 기타 조직에서 측정된 양을 알고 있는 면역글로블린이 50% 제거되는데 요구되는 시간으로 표현될 수 있다. 반감기는 하나의 면역글로블린에서 또는 면역글로블린 종류 마다 가변적일 수 있다. 일반적으로, 항체 반감기의 증가는 투여된 항체에 대해 순환계에서 평균 체류 시간(MRT)의 증가를 초래한다.

"이소타입"은 항체의 중쇄 또는 경쇄 불변 부위의 분류를 말한다. 항체들의 불변 도메인은 항원 결합에는 관여하지 않지만, 다양한 작용체 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 부위의 아미노산 서열에 따라, 주어진 인간 항체 또는 면역글로블린은 5가지 주요 면역글로블린중 하나에 해당된다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. 이들 부류중 몇 개는 하위부류(이소타입)로 추가적으로 나뉠 수 있다, 가령, IgG1 (감마 1), IgG2 (감마 2), IgG3 (감마 3), 및 IgG4 (감마 4), 및 IgA1 및 IgA2. 상이한 부류의 면역글로블린에 상응하는 중쇄 불변 부위는 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로블린의 구조 및 3차원적 형태는 잘 알려져 있다. 다양한 인간 면역글로블린 부류중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 및 IgM 만이 보체를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 인간 IgG1 및 IgG3는 인간에서 조정되는 것으로 알려져 있다. 인간 경쇄 불변 부위는 카파 및 람다의 두 개 부류로 나뉠 수 있다.

필요하다면, DLL4에 특이적으로 결합하는 항체의 이소타입은 상이한 이소타입의 생물학적 활성의 장점을 가지도록 전환(switch)될 수 있다. 예를 들면, 일부 환경에서, DLL4에 대한 치료 항체로써 항체 생성과 연관하여, 항체들이 보체를 고정시킬 수 있고, 보체-의존적 세포독성(CDC)에 참여할 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다. 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 이와 같은 능력이 있는 다수의 항체 이소타입들이 있다: 뮤린 IgM, 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgA, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3. 다른 구체예들에서, DLL4에 대한 치료 항체로써 항체 생성과 연관하여, 항체들이 작용체 세포상에서 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 항체-의존적 세포독성(ADCC)에 참여할 수 있도록 하는 것이 바람직할 것이다. 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 이와 같은 능력이 있는 다수의 항체 이소타입들이 있다: 뮤린 IgG2a, 뮤린 IgG2b, 뮤린 IgG3, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3. 생성된 항체들은 처음부터 이와 같은 이소타입을 보유해야할 필요는 없지만, 다만 생성된 항체는 임의의 이소타입을 보유할 수 있고, 항체는 본 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 기술을 이용하여 전환된(switched) 이소타입이 될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 기술은 그중에서 직접적인 재조합 기술의 사용(가령, U.S. 특허 No. 4,816,397 참고), 세포-세포 융합 기술(가령, 미국 특허 5,916,771 및 6,207,418 참고)를 포함한다.

예를 들면, 본원에 기술된 항-DLL4 항체들은 완전한 인간 항체들이다. 항체가 DLL4에 대해 바람직한 결합을 보유한다면, 동일한 가변 부위를 보유하는(항체 특이성 및 이의 친화력의 일부를 한정시키는) 인간 IgM, 인간 IgG1, 또는 인간 IgG3 이소타입을 만들기 위해 용이하게 전환된 이소타입이 될 수 있다. 이와 같은 분자는 보체를 고정시키고, CDC에 참여할 수 있거나 및/또는 작용체 세포상의 Fc 수용체에 결합하고, ADCC에 참여할 수 있을 것이다.

"전혈 분석(Whole blood analysis)"은 천연 작용체의 소스로 분별되지 않은 혈액을 이용한다. 혈액은 혈장에 FcR-발현 세포작용체, 가령, 다형핵 세포(PMNs) 및 단핵 세포(MNCs)와 함께 보체를 포함한다. 따라서, 전혈 분석으로 시험관에서 ADCC 및 CDC 작용체 기전 모두의 공력작용의 동시 평가가 허용된다.

여기에서 사용된 "치료요법적 유효량(therapeutically effective amount)" 은 개체에게 약간의 개선 또는 이익을 주는 양이다. 또 다른 방식으로 표현하자면, “치료요법적 유효량”은 최소한 하나의 임상적 증후의 약간의 경감, 완화 및/또는 감소를 가져오는 양이다. 본 발명의 방법들에 의해 치료될 수 있는 질환과 연관된 임상적 증상은 본 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 더욱이, 개체에게 어느 정도의 이익이 제공되는 한, 치료요법적 효과가 완벽하거나 치유력이 있어야 한다는 것은 아니라는 것을 인지할 것이다.

여기에서 사용된 "및/또는"은 두 가지 명시된 특징 각각 또는 다른 것의 존부하에 성분들의 명시된 내용으로 받아들여야 한다. 예를 들면 "A 및/또는 B"는 마치 각각이 개별적으로 제시된 것과 같이, (i) A, (ii) B 및 (iii) A 와 B의 각각의 명시된 내용으로 받아들인다.

항체 구조

기본적인 항체 구조 단위는 사량체로 구성된다고 알려져 있다. 각 사량체는 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄의 쌍으로 구성되는데, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 가진다. 각 쇄의 아미노-말단 부위는 항원 인지를 주로 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 부위를 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 부위는 작용체 기능을 주로 담당하는 불변 부위가다. 인간 경쇄는 카파와 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤(mu), 델타, 감마, 알파, 또는 입실론으로 분류되고, 차례로 IgM, IgD, IgA, 및 IgE의 항체 이소타입으로 정의된다. 경쇄와 중쇄안에 가변 및 불변 부위는 약 12개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 “J”부위에 의해 연결되어 있으며, 중쇄는 또한 약 10개 또는 그 이상의 아미노산으로 된 "D" 부위를 가진다.Generally,FundamentalImmunologyCh. 7 (Paul, W,ed., 2nded.RavenPress, N. Y. (1989))을 참고 (모든 목적을 위해 전문이 참조에 의해 본원에 통합됨). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 부위들은 항체 결합 부위를 형성한다.

따라서, 고유한 항체는 두 개의 결합 부위를 가진다. 이기능성 또는 이중특이적 항체들을 제외하고, 두 개의 결합 부위는 동일하다.

쇄는 모두 세 개의 초가변부위에 의해 연결된 상대적으로 보존된, 동일한 전체 구조의 프레임워크 부위들 (FR)을 나타내는데, 이는 CDRs이라고 한다. 각 쌍의 두 쇄에 있는 CDR은 특정 에피토프에 결합될 수 있도록 프레임워크 부위들에 의해 배열된다. N-말단으로부터 C-말단에 이르기까지 경쇄 및 중쇄 모두 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 아미노산의 할당은Kabat, SequencesofProteinsofImmunologicalInterest (NationalInstitutesof Health,Bethesda,Md. (1987and 1991)), 또는Chothia &Lesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987); Chothiaetal.Nature 342:878-883 (1989)의 정의에 따른다.

이중특이적 또는 이기능적 항체는 두 개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 두 개의 상이한 결합 부위를 가지는 인위적인 하이브리드 항체다. 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편들의 링크를 포함하는 다양한 방법들에 의해 이중특이적 항체들을 만들 수 있다. 가령,Songsivilai &LachmannClin.Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990),Kostelnyetal. J.Immunol. 148:1547-1553 (1992) 참고. 이중특이적 항체들은 단일 결합 부위 (가령, Fab, Fab', 및 Fv)를 가지는 단편의 형태로는 존재하지 않는다.

일반적으로, VH 도메인은 VL 도메인과 짝을 이루어 항체 항원-결합 부위를 제공하지만, VH 또는 VL 도메인 단독으로 항원에 결합할 수도 있다. VH 도메인 (표 2 참고)는 VL 도메인 (표 2 참고)과 짝을 이루어, VH 및 VL 도메인 모두를 포함하는 항체 항원-결합 부위가 형성된다.

인간 항체들 및 항체들의 인간화(humanization)

인간 항체들은 뮤린 또는 쥐의 가변 및/또는 불변 부위를 보유하는 항체들에 관련된 일부 문제점들을 해소시킨다. 이와 같은 뮤린 또는 쥐에서 유도된 단백질들이 존재함으로써 항체들이 신속하게 제거되거나, 환자에 의해 항체에 대한 면역 반응이 유도될 수 있다. 뮤린 또는 쥐 유도된 항체들의 활용을 회피하기 위하여, 기능적 인간 항체 좌(loci)를 설치류, 기타 포유류 또는 동물에 도입시킴으로써, 설치류, 기타 포유류 또는 동물이 완전한 인간 항체들을 생산하게 만듦으로써, 완전한 인간 항체들을 만들 수 있다.

완전한 인간 항체들을 만드는 한 방법은 XenoMouse^®마우스 균주를 이용하는 것인데, 이 균주는 인간 중쇄 좌와 카파 경쇄 좌의 최대 1000kb 미만의 크기의 생식계열로 설정된 단편을 포함하도록 조작된 것이다.Mendezetal.NatureGenetics 15:146-156 (1997)andGreenandJakobovits J. Exp.Med. 188:483-495 (1998). XenoMouse^® 균주는Amgen,Inc. (Fremont,California, U. S. A)에서 구할 수 있다.

따라서, 이와 같은 마우스는 뮤린 면역글로블린 분자 및 항체들의 생산에서 결핍되는 인간 면역글로블린 분자 및 항체들을 생산할 수 있다. 이것을 실행하는데 이용되는 기술들은 U.S. 특허 출원 번호 08/759,620 (1996년 12월 3일자 제출됨) 및 국제 특허 출원 Nos. WO 98/24893, (1998년 6월 11일자 공개됨) 및 WO 00/76310 (2000년 12월 21일자 공개됨)-전문이 참조에 의해 본원에 통합됨-에 설명되어 있다.Mendezetal.NatureGenetics 15:146-156 (1997)도 참고한다-전문이 참조에 의해 본원에 통합됨.

XenoMouse^® 균주의 마우스의 생산에 대해서 U.S. 특허 출원 번호. 07/466,008 (1990년 1월 12일자 제출됨), 07/610,515 (1990년 11월 8일자 제출됨), 07/919,297 (1992년 7월 24일자 제출됨), 07/922,649 (1992년 7월 30일자 제출됨), 08/031,801 (1993년 3월 15일자 제출됨), 08/112,848 (1993년 8월 27일자 제출됨), 08/234,145 (1994년 4월 28일자 제출됨), 08/376,279 (1995년 1월 20일자 제출됨), 08/430,938 (1995년 4월 27일자 제출됨), 08/464,584 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/464,582 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/464,582 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/463,191 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/462,837 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,853 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,857 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/486,859 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/462,513 (1995년 6월 5일자 제출됨), 08/724,752 (1996년 10월 2일자 제출됨), 08/759,620 (1996년 12월 3일자 제출됨), U.S. 공개 2003/0093820 (2001년 11월 30일자 제출됨), 및 미국특허 6,162,963, 6,150,584, 6,144,598, 6,075,181, 및 5,939,593; 일본 특허 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, 및 3 068 507 B2에서 더 논의되고, 설명되며 제출되어 있다. 또한 유럽 특허 EP 0 463 151 Bl, (1996년 6월 12일자 등록됨), 국제 특허 출원 번호, WO 94/02602 (1994년 2월 3일자 공개됨), 국제 특허 출원 No, WO 96/34096 (1996년 10월 31일자 공개됨), WO 98/24893 (1998년 6월 11일자 공개됨), WO 00/76310, (2000년 12월 21일자 공개됨)을 참고한다. 상기 언급된 특허, 출원 및 참고문헌 각각의 내용의 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다.

대안적 방법에서, GenPharm Internatinal, Inc을 포함하는 기타 방법은 "미니로커스(minilocus) 방법을 이용한다. 미니로커스(minilocus) 방법에서, Ig 좌의 조각(개별 유전자들)을 함유하게 하여 외인성 Ig 좌가 모방된다. 따라서, 하나 이상의 V_H 유전자들, 하나 이상의 D_H 유전자들, 하나 이상의 J_H 유전자들, mu 불변 부위, 및 보통 제 2 불변 부위 (바람직하게는 감마 불변 부위)이 동물내에 삽입되기 위한 불변부위가 형성된다. 이와 같은 방법은 U.S. 특허 No. 5,545,807 (Suranietal.) 및 미국 특허 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, 및 6,255,458 (LonbergandKay) U.S. 특허 No. 5,591,669 및 6,023,010 (KrimpenfortandBerns), 미국 특허 5,612,205, 5,721,367, 및 5,789,215 (Bernsetal,) 및 U.S. 특허 5,643,763 (ChoiandDunn), 및 GenPharm International U.S. 특허 출원 번호. 07/574,748 (1990년 8월 29일자 제출됨), 07/575,962 (1990년 8월 31일자 제출됨), 07/810,279 (1991년 12월 17일자 제출됨), 07/853,408 (1992년 3월 18일자 제출됨), 07/904,068 (1992년 6월 23일자 제출됨), 07/990,860 (1992년 12월 16일자 제출됨), 08/053,131 (1993년 4월 26일자 제출됨), 08/096,762 (1993년 7월 22일자 제출됨), 08/155,301 (1993년 11월 18일자 제출됨), 08/161,739 (1993년 12월 3일자 제출됨), 08/165,699 (1993년 12월 10일자 제출됨), 08/209,741 (1994년 3월 9일자 제출됨)에서 설명되고 있으며, 상기 각 내용은 참조에 의해 본원에 통합된다. 유럽 특허 0 546 073 Bl, 국제 특허 출원 번호. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 및 U.S. 특허 5,981,175 또한 참고하며, 이들 각 내용의 전문은 참조에 의해 본원에 통합된다.Tayloretal, 1992,Chenetal, 1993,Tuaillonetal, 1993,Choietal, 1993,Lonbergetal, (1994),Tayloretal, (1994), 및Tuaillonetal, (1995),Fishwildetal, (1996)의 내용도 참고하며, 이는 각 내용의 전문은 참조에 의해 본원에 통합된다.

Kirin은 마우스로부터 인간 항체들의 생성을 설명하는데, 이때 미셀 융합을 통하여, 염색체의 큰 단편들 또는 전체 염색체가 도입되었다. 유럽 특허 출원 번호. 773 288 및 843 961을 참고하며, 이들 내용의 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다. 추가적으로, KM™-마우스: Kirin의 Tc 마우스에 Medarex의 minilocus (Humab)의 교배 결과물-가 생성되었다. 이들 마우스들은 Kirin 마우스의 인간 IgH 전이염색체(transchromosome)와 Genpharm 마우스의 카파 전이유전자(transgene)를 보유한다. (Ishida etal,CloningStemCells, (2002) 4:91-102).

시험관내 방법에 의해 인간 항체들이 또한 유도될 수 있다. 적합한 예로는 파아지 디스플레이(MedImmune,Morphosys,Dyax,Biosite/Medarex,Xoma,Symphogen,Alexion (formerly Proliferon),Affimed), 리보좀 디스플레이 (MedImmune), 이스트 디스플레이 및 이와 유사한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

항체의 제조

본원에 기술된 항체들은 하기에서 설명되는 것과 같이 XenoMouse^® 기술의 이용을 통하여 제조되었다. 이와 같은 마우스는 뮤린 면역글로블린 분자 및 항체들의 생산에서 부족한 인간 면역글로블린 분자 및 항체들을 생산할 수 있다. 이를 얻는데 이용되는 기술들은 여기에서 배경 기술 부분에 언급된 특허, 출원 및 참고문헌들에서 설명되고 있다. 그러나 특히, 마우스의 전이유전자 생산 및 이로부터 항체들을 생산하는 바람직한 예들이 U.S. 특허 출원 번호. 08/759,620, (1996년 12월 3일자 제출됨) 및 국제 특허 출원 번호 WO 98/24893 (1998년 6월 11일자 공개됨) 및 WO 00/76310 (2000년 12월 21일자 공개됨)-이들 각 내용은 참조에 의해 본원에 통합된다-에 설명되어 있다.Mendezet al.NatureGenetics 15:146-156 (1997) 또한 참고-이들 내용은 참조에 의해 본원에 통합된다.

이와 같은 기술들을 이용하여, 다양한 항원에 대한 완전한 인간 단클론 항체들이 만들어졌다. 기본적으로, 마우스의 XenoMouse^® 계는 관심 항원(가령, DLL4)으로 면역주사를 맞게 되고, 과-면역화된 생쥐로부터 임파세포 (가령, B 세포)가 회수되고, 회수된 임파세포는 골수-유형 세포와 융합되어, 불사화된(immortal) 하이브리도마 세포계를 만든다. 이와 같은 하이브리도마 세포계를 스크리닝하고, 선별하여 관심 항원에 특이적인 항체를 만드는 하이브리도마 세포계를 확인한다. DLL4에 특이적인 항체들을 생산하는 다중 하이브리도마 세포계를 생산하는 방법도 제공된다. 더욱이, 이와 같은 세포계에 의해 생산되는 항체들의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 분석을 포함하는 특징이 제공된다.

대안으로, 하이브리도마를 만들기 위하여 골수종 세포에 융합하는 대신, B 세포들을 바로 분석할 수도 있다. 예를 들면, 과면역 XenoMouse^® 마우스로부터 CD19+ B 세포를 분리하여, 증식시키고, 항체-방출 혈장 세포로 분화시킬 수 있다. 세포 현탁액으로부터 항체들은 DLL4 면역원에 대한 반응성에 대해 ELISA, FACS, 또는 FMAT에 의해 스크리닝된다. DLL4의 단편에 대항한 면역 반응성에 대하여 상청액을 스크리닝하여 DLL4 상에 기능적 관심 도메인에 결합하는 상이한 항체들에 대해서도 측량할 수 있다. 기타 관련된 인간 엔도글리코시다제에 대해, 및 쥐, 마우스, 및 종간 교차-반응성을 결정하기 위하여, 필리핀 원숭이와 같은 비-인간 영장류에 대항하여 DLL4의 진화론적 유사성에 대해 항체들은 스크리닝될 수 있다. 관심 항체들을 포함하는 웰의 B 세포들은 개별 또는 모음 웰로부터 하이브리도마를 만들기 위한 융합을 포함한 다양한 방법들에 의해 불사화될 수 있거나 또는 EBV으로 감염 또는 공지의 불사화 유전자에 의한 형질감염후, 적적한 배지에 도말함으로써 불사화될 수 있다. 대안으로, 원하는 특이성을 가진 항체들을 배출하는 단일 혈장 세포는 DLL4-특이적인 용혈 플락 분석을 이용하여 분리된다. (예를 들면Babcooketal,Proc.Natl.Acad.ScLUSA 93:7843-48 (1996) 참고). 용해를 위한 표적화된 세포는 DLL4 항원으로 피복된 양(sheep)의 적혈구 세포(SRBCs)다.

관심 면역글로블린 및 보체를 분비하는 혈장 세포를 포함하는 B-세포 배양물 존재하에, 플락 형성은 관심 혈장 세포를 에워싸는 양(sheep)의 적혈구 세포의 특이적 DLL4-매개된 용해를 나타낸다. 단일 항원-특이적인 혈장 세포가 플락의 중앙에서 분리될 수 있고, 항체 특이성을 인코드하는 유전자 정보는 단일 혈장 세포로부터 분리된다. 역-전사에 이어서 PCR (RT-PCR)를 이용하여, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위를 인코드하는 DNA가 클론될 수 있다. 이와 같은 클론된 DNA는 적절한 발현 벡터, 바람직하게는 pcDNA와 같은 벡터 카세트, 더욱 바람직하게는 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 포함하는 pcDNA 벡터안으로 추가 삽입될 수 있다, 생성된 벡터는 숙주 세포, 가령, HEK293 세포, CHO 세포로 형질감염되고, 전사를 유도하고, 형질변환체를 선별하거나 또는 바람직한 서열들을 인코드하는 유전자를 증폭시키는데 적절한 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다. .

이해하는 바와 같이, DLL4에 특이적으로 결합하는 항체들은 하이브리도마 세포계 이외의 세포계에서 발현될 수 있다. 특정 항체들을 인코드하는 서열들을 이용하여 적절한 포유류 숙주 세포를 형질변환시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내로 도입시키기 위한 임의의 공지의 방법을 이용하여 형질변환될 수 있는데, 바이러스(또는 바이러스 벡터)안에 폴리뉴클레오티드를 넣고, 숙주 세포에 바이러스(또는 벡터)를 형질도입시키거나 또는 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455 (이들 특허들은 참조에 의해 본원에 통합된다.)에서 예시화된 것과 같이, 본 기술 분야에 공지된 형질 감염 과정에 의해 형질도입시키는 것을 포함한다. 이용된 형질변환 과정은 형질변환되는 숙주에 따라 달라진다. 포유류 세포내로 이질성 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 방법은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 이들 방법은 덱스트란-매개된 형질감염, 인산칼슘 침전법, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질 융합, 전기천공, 리포좀에 폴리뉴클레오티드의 포집 및 핵으로 DNA의 직접적인 마이크로인젝션을 포함한다.

발현을 위하여 숙주로 이용가능한 포유류 세포계는 본 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, Chinese hamster ovary (CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(가령, Hep G2), 인간 상피 신장 293 세포 및 기타 다수의 세포계를 포함하나 이에 한정되지 않는, American Type Culture Collection (ATCC)로부터 이용가능한 많은 불사화된 세포계를 포함한다. 어떤 세포계가 DLL4의 구성적 결합 특성을 가진 항체를 높은 수준으로 발현하고, 생산하는 가를 결정하여 특히 바람직한 세포계를 선별한다.

세포-세포 융합 기술에서, 임의의 원하는 이소타입을 가진 중쇄를 보유하는 골수종, CHO 세포 또는 기타 세포계가 제조되고, 경쇄를 보유하는 또 다른 골수종, CHO 세포 또는 기타 세포계가 제조된다. 그 다음, 이와 같은 세포들이 융합되어, 고유 항체를 발현시키는 세포계가 분리될 수 있다.

따라서, 항기에서 논의된 바와 같이 원하는 “구조적”속성에 맞는 항체 후보물질이 생성되기 때문에, 이소타입 전환(switching)을 통하여 최소한 특정한 원하는 “기능적” 속성을 가지는 이들 항체들이 제공될 수 있다.

치료요법적 투여 및 제형

본 발명의 구체예들은 질환 치료에 유용한 항-DLL4 항체의 멸균된 약제학적 제형을 포함한다. 이와 같은 제형들은 고유 DLL4가 Notch 1 또는 Notch 4 수용체에 결합하는 것을 방해하여, 병리학적 이상, 예를 들면 혈청 또는 조직의 DLL4 발현이 비정상적으로 상승된 이상을 효과적으로 치료할 수 있다. 항-DLL4 항체들은 바람직하게는 천연 DLL4의 Notch 1 또는 Notch 4에의 결합을 강력하게 방해하는 적절한 친화력을 보유하고, 바람직하게는 적합한 작용 기간을 가짐으로써 인간에게 빈번하지 않은 투약 빈도를 제공한다. 연장된 작용 기간으로 덜 빈번하게, 피하 또는 근육 주사와 같은 대안적인 장관외 경로를 통하여 좀더 편리한 투약이 허용된다.

항체의 동결건조 또는 재구성 전 또는 후에 멸균 필터 막을 통하여 여과시킴으로써 멸균 제형이 만들어질 수 있다. 항체는 보통 동결건조된 형태로 또는 용액내에 보관될 것이다. 치료요법적 항체 조성물은 일반적으로 멸균 입구 포트를 가지는 용기, 예를 들면, 정맥 용액 주머니 또는 제형의 벌충을 허용하는 어뎁터 가령, 피하 주사 바늘로 찌를 수 있는 마개를 가진 바이알내에 둔다.

항체 투여 경로는 공지의 방법에 따르는데, 가령, 정맥, 복막, 대뇌, 근육, 안구, 동맥, 척수내 주사 또는 주입, 흡입 또는 병소내 경로, 종양 부위에 직접 주사 또는 하기에서 명시된 지연된 방출계를 이용한 주사 또는 주입이 될 수 있다. 항체는 바람직하게는 주입 또는 정맥주사(bolus injection)에 의해 연속적으로 투여된다.

치료요법적으로 이용되는 항체의 유효량은 치료 대상, 투여 경로, 환자의 상태 등에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료사는 약량을 적정하고, 최적의 치료 효과를 얻는데 요구되는 투여 경로를 변형시키는 것이 바람직하다. 일반적으로, 임상의는 원하는 효과를 얻게되는 약량에 도달할 때까지 항체를 투여할 것이다. 이와 같은 치료 과정은 통상적인 분석 또는 본원에 기술된 분석에 의해 용이하게 모니터된다.

본원에 기술된, 항체들은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합물로 제조될 수 있다. 이와 같은 치료 조성물은 정맥으로 또는 코 또는 폐를 통하여 바람직하게는 액체 또는 분말 에어로졸(동결건조된)로 투여될 것이다. 조성물은 원하는 경우, 장관외 또는 피하를 통하여 투여될 수도 있다. 전신으로 투여된 경우, 치료요법적 조성물은 멸균되고, 발열물이 없어야 하며, 그리고 pH, 등장성 및 안정성을 가진 장관외적으로 수용가능한 용액내에 있어야 한다. 이와 같은 조건들은 본 기술 분야의 당업자들에게 공지된 것이다. 간략하게 설명하면, 본원에 기술된 바람직한 수준의 순도를 가진 화합물과 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합함으로써 보관 또는 투여를 위한 화합물들의 투여량 제형이 제조된다. 이와 같은 물질들은 이용되는 투여량 및 농도에서 수용체에 비-독성이며, TRIS HCl, 인산염, 구연산염, 아세테이트 및 기타 유기산 염과 같은 완충액,; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 펩티드 가령, 폴리아르기닌, 혈청 알부민과 같은 단백질들, 젤라틴 또는 면역글로블린; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민산, 아스파르트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 셀룰로오즈 또는 이의 유도체, 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트 물질; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알코올; 나트륨과 같은 카운터이온 및/또는 TWEEN, PLURONICS 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.

주사용 멸균 조성물은Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy (20thed.,Lippincott Williams &WilkensPublishers (2003))에서 설명된 것과 같은 통상적인 약학적 과정에 따라 조제될 수 있다. 예를 들면, 활성 화합물을 물 또는 자연적으로 발생되는 식물성 오일 가령, 참깨, 땅콩 또는 면실유 또는 에틸 올레이트와 같은 합성 지방 비이클과 같은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해 또는 현탁시키는 것이 바람직할 수 있다. 완충액, 보존제, 항산화제 및 이와 유사한 것은 수용된 약학적 과정에 따라 결합될 수 있다.

지연-방출 제형의 적절한 예는 폴리펩티드를 포함하는 고형 소수성 폴리머의 반-투과성 매트릭스를 포함하는데, 이때 매트릭스는 모양을 갖춘 물품, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태다. 지연-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르,Langeretal, J.BiomedMater.Res, (1981) 15:167-277and Langer,Chem.Tech, (1982) 12:98-105에서 설명된 것과 같은 하이드로겔(가령, 폴리(2-하이드록시에틸-메타아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(U.S. Pat. 3,773,919, EP 58,481), L-글루타민산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머(Sidmanetal, Biopolymers, (1983) 22:547-556), 분해되지 않은 에틸렌-비닐 아세테이트(Langer etal,supra), 분해가능한 젖산-글리콜산 코폴리머, 예를 들면, LUPRON Depot™ (젖산-글리콜산 코폴리머와 루프로리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부틸산(EP 133,988)을 포함한다.

에틸렌-비닐 아세테이트 및 젖산-글리콜산과 같은 폴리머들은 100일 이상에 걸쳐 분자를 방출할 수 있으며, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 포집된(encapsulated) 단백질들은 긴 시간 동안 체내에 머무르며, 이들은 37℃에서 수분에 노출됨으로써 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성을 상실하게 되고, 면역원성이 변화될 가능성도 있다. 관련 기전에 따라 단백질의 안정화를 위한 이성적인 전략을 연구할 수 있다. 예를 들면, 응집(aggregation) 기전이 이황화 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성으로 밝혀진다면, 설퍼하이드릴잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 이용하여 수분 함량을 조절하고, 특정 폴리머 매트릭스 조성물을 개발하여 안정화를 얻을 수 있을 것이다.

지연-방출되는 조성물은 또한 현탁액에서 결정을 유지시킬 수 있는 적절한 제형내 현탁된 항체 결정물을 포함한다. 이와 같은 제조물이 피하 또는 복막으로 주사되었을 때, 지연된 방출 효과를 만들 수 있다. 기타 조성물은 또한 리포좀내에 포집된 항체를 포함한다. 이들 항체를 포함하는 리포좀은 공지된 방법에 의해 만들 수 있다:U.S.Pat.No.DE 3,218,121;Epsteinetal,Proc.Natl. Acad.ScLUSA, (1985) 82:3688-3692;Hwangetal,Proc.Natl.Acad.ScLUSA, (1980) 77:4030-4034;EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949; 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; U.S. Pat. 4,485,045 및 4,544,545; 및EP 102,324.

주어진 환자에 제공되는 항체 제형의 투여량은 질환의 중증도, 유형, 체중, 성별, 식이, 투여 기간 및 경로, 기타 의학적 및 관련 임상적 인자들을 포함하는 약물의 작용을 변형시키는 것으로 공지된 다양한 인자들을 고려하여 담당의사에 의해 결정될 수 있을 것이다. 치료요법적 유효한 투여량은 시험관 또는 생체내 방법에 의해 측정될 수 있다.

본원에 기술된, 치료요법적으로 이용되는 항체들의 유효량은 예를 들면, 치료 대상, 투여 경로, 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료사는 투여량을 적정하고, 최적의 치료요법적 효과를 수득하는데 요구되는 투여 경로를 수정하는 것이 바람직하다. 상기 언급된 인자들에 따라, 환자의 체중 kg당 일반적인 일일 투여량은 약 0.0001mg/kg, 0.001mg/kg, 0.01mg/kg, 0.1mg/kg, lmg/kg, 10mg/kg에서 최대 100mg/kg, 1000mg/kg, 10000mg/kg 또는 그 이상의 범위가 될 수 있다. 투여량은 상기 언급된 인자들에 따라, 환자의 체중 kg당 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg에서 0.25 mg/kg, 0.0001에서 0.15 mg/kg, 0.0001 mg/kg 에서 0.10 mg/kg, 0.001 mg/kg 에서 0.5 mg/kg, 0.01 mg/kg 에서 0.25 mg/kg 또는 0.01 mg/kg 에서 0.10 mg/kg의 범위가 될 수 있다. 일반적으로, 임상의는 원하는 효과를 얻게 되는 약량에 도달할 때까지 치료요법적 항체를 투여할 것이다. 이와 같은 치료 과정은 통상적인 분석 또는 본원에 기술된 분석에 의해 용이하게 모니터된다.

본 발명의 항체의 투여량은 반복 투여될 수 있는데, 투여는 최소한 1 일, 2 일, 3 일, 5 일, 10 일, 15 일, 30 일, 45 일, 2 개월, 75 일, 3 개월 또는 최소한 6 개월 간격을 둘 수 있다.

본원에 기술된 조성물 및 방법에 따른 치료요법적 물질은 개선된 운반, 이동, 내성 및 이와 유사한 것을 제공하기 위하여 제형내에 통합될 수 있는 적절한 담체, 부형제 및 기타 물질과 함께 투여될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이들 제형은 예를 들면, 분말, 페스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질 (양성 또는 음성)-함유 소포(가령, Lipofectin™), DNA 콘쥬게이트, 무수 흡수 페스트, 수중유 및 유중수 에멸젼, 에멸젼 카르보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형 겔, 카르보왁스를 포함하는 반고형 혼합물을 포함한다. 상기 혼합물중 임의의 것들은 제형내 활성 성분이 제형에 의해 비활성화되지 않고, 제형은 생리학적으로 양립되며, 그리고 투여 경로에 내성을 가진다면, 본 발명에 따른 치료 및 치료법에 적절할 수 있다.Baldrick P. "Pharmaceutical excipientdevelopment:theneedforpreclinicalguidance."Regul.Toxicol.Pharmacol. 32(2):210-8 (2000),Wang W. "Lyophilizationanddevelopmentofsolidprotein pharmaceuticals."Int. J.Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000),CharmanWN "lipids,lipophilic drugs,andoraldrugdelivery-someemergingconcepts." JPharmSci .89(8):967-78 (2000), Powelletal. "Compendiumofexcipientsforparenteralformulations" PDA JPharmSciTechnol. 52:238-311 (1998)을 참고하며, 제형, 부형제, 및 담체 관련된 추가 정보를 위해 언급된 문헌들도 제약사들에 잘 공지된 것이다.

기타 치료제 고안 및 생성

본 발명에 따라, 그리고 본원에 기술된 DLL4에 대한 특징화되고, 생산된 항체의 활성에 근거하여, 항체 모이어티에 대한 기타 치료요법적 양식의 기획이 실행된다. 이와 같은 양식은 이중특이적 항체들, 면역톡신, 및 방사능라벨링된 치료제, 단일 도메인 항체들, 항체 단편, 가령 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 또는 dAb, 펩티드 치료제 생성, 신규한 골격(scaffold)내 DLL4 결합 도메인, 유전자 요법, 특히, 인트라바디(intrabodies), 안티센스 요법 및 소(small) 분자와 같은 진보된 항체 치료제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

항원 결합 부위는 비-항체 단백질 골격, 가령, 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등의 골격상에 CDR을 배열하여 제공될 수 있거나 (Haan &Maggos (2004)BioCentury, 12(5): A1-A6;Koideetal. (1998)JournalofMolecularBiology, 284: 1141-1151;Nygrenetal. (1997)CurrentOpinionin StructuralBiology, 7: 463-469) 또는 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하기 위하여 단백질내 루프 아미노산 잔기를 무작위화 시키거나 또는 돌연변이시켜 항원 결합 부위가 제공될 수도 있다. 단백질에서 신규한 결합 부위를 조작하기 위한 골격(Scaffolds)은Nygrenetal. (Nygrenet al. (1997)CurrentOpinioninStructuralBiology, 7: 463-469)을 참고한다. 항체 모방체를 위한 단백질 골격은 WO/0034784에서 설명되고 있으며, 전문이 참조에 의해 본원에 통합되어 있으며, 이 자료의 발명자들은 최소한 하나의 무작위화된 루프를 가지는 피브로넥틴 타입 III 도메인을 포함하는 단백질들 (항체 모방체)을 설명한다. 하나 이상의 CDR, 가령 HCDRs 세트에 접목될 적절한 골격은 면역글로블린 유전자 슈퍼패밀리의 임의의 도메인 멤버에 의해 제공될 수 있다. 골격은 인간 또는 비-인간 단백질이 될 수 있다. 비-항체 단백질 골격의 장점은 적어도 일부 항체 분자보다 더 작고, 및/또는 제조에 더 용이한 골격 분자내에 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 결합 멤버의 작은 크기는 세포에 유입되고, 조직내 깊이 침투하고, 또는 기타 구조내에 있는 표적에 도달하고 또는 표적 항원의 단백질 구멍내에 결합하는 것과 같은 유용한 생리학적 특성을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 골격내 항원 결합 부위의 이용에 대해서Wess, 2004 (Wess, L.In:BioCentury, TheBernsteinReportonBioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004)을 참고한다. 안정적인 기본 골격 및 하나 이상의 가변 루프를 가진 단백질이 일반적인데, 루프의 아미노산 서열은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 만들기 위하여 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이된다. 이와 같은 단백질들은 S. 아루레우스(S. aureus)의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트란스페린, 알부민, 테트라넥틴, 피브로넥틴(가령, 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인), 리포칼린 뿐만 아니라 감마-결정 및 기타 Affilin™ 골격(Scil Proteins)을 포함한다. 기타 방법의 예로는 사이클로티드 상에 합성 "Microbodies" -단백질들 분자내 이황화 결합을 가지는 작은 단백질, Microproteins (Versabodies™, Amunix) 및 안키린(ankyrin) 반복 단백질들 (DARPins, Molecular Partners)을 포함한다.

항체 서열들 및/또는 항원-결합 부위에 추가하여, 본 발명에 따른 표적화된 결합제는 기타 아미노산, 가령 폴드된 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는, 또는 항원에 결합하는 능력에 추가하여 또 다른 기능적 특징을 분자에 부여하기 위한 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 표적화된 결합제는 탐지가능한 라벨을 가지고 있을 수 있으며, 또는 톡신 또는 표적화된 모이어티 또는 효소에 콘쥬게이트(가령, 펩티드 결합 또는 링커를 통하여)될 수도 있다. 예를 들면, 표적화된 결합제는 촉매 부위(가령, 효소 도메인 안에) 뿐만 아니라 항원 결합 부위를 포함할 수 있는데, 여기서, 항원 결합 부위는 항원에 결합하고, 따라서, 항원에 촉매 부위가 표적된다. 촉매 부위는 절단에 의해 항원의 생물학적 기능을 저해시킬 수 있다.

진보된 항체 치료제 생성과 관련하여, 보체 고정(complement fixation)이 바람직한 속성이라면, 이중특이적 항체들, 면역톡신, 또는 방사능라벨과 같은 것들을 이용하여 세포 사멸에 대한 보체 의존성을 회피하는 것도 가능할 것이다.

예를 들면, (i) 두 개 항체, 즉 DLL4에 특이성이 있는 한 개의 항체와 함께 콘쥬게이트되는 제 2 분자에 특이성이 있는 다른 항체, (ii) DLL4에 특이적인 한 개의 쇄와 제 2 분자에 특이적인 제 2 쇄를 가지는 단일 항체, 또는 (iii) DLL4 및 기타 분자에 특이성을 가지는 단일 쇄 항체를 포함하는 이중특이적 항체들이 만들어질 수 있다. 이와 같은 이중특이적 항체들은 잘 공지된 기술들을 이용하여 만들어질 수 있는데; 예를 들면, (i) 및 (ii)와 관련해서Fangeretal.ImmunolMethods 4:72-81 (1994)andWrightandHarris,supra을 참고하며, (iii)과 관련해서,Trauneckeretal. Int. J.Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)을 참고한다. 각 경우에, CD16 또는 CD64 (가령,Deoet al.Immunol.Today 18:127 (1997)) 또는 CD89 (가령,Valeriusetal.Blood 90:4485-4492 (1997))를 포함하나 이에 한정되지 않는 중쇄 활성화 수용체에 대해 제 2 특이성이 만들어질 수 있다.

항체들은 또한 본 기술 분야에 잘 공지된 기술들을 이용하여 면역톡신으로 작용할 수 있도록 변형될 수 있다. 가령,VitettaImmunolToday 14:252 (1993). U.S. 특허 No. 5,194,594 참고. 방사능라벨링된 항체들을 제조하는 것과 관련하여, 이와 같은 변형된 항체들은 본 기술 분야에 잘 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있다. 가령,Junghansetal.inCancerChemotherapyandBiotherapy 655-686 (2dedition,ChafnerandLongo,eds,LippincottRaven (1996)) 참고. 미국 특허4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, 및5,697,902 참고. 각 면역톡신 또는 방사능라벨링된 분자는 원하는 다량체 효소 소단위 올리고머화 도메인을 발현하는 세포를 죽일 수 있을 것이다.

항체가 물질(가령, 방사성 동위 원소, 약제학적 조성물 또는 톡신)에 링크되어 있을 때, 물질은 세포분열억제, 알킬화, 대사길항, 항맥관형성, 자가-사멸, 알칼로이드, COX-2, 및 항생제 및 이의 복합으로 구성된 군으로부터 선택된 약학 특성을 보유하는 것으로 간주된다. 약물은 질소 머스터드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로조우레아, 트리아젠, 엽산 유사체, 안트라사이클린, 탁산, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 대사길항물질, 항생제, 효소, 에피도필로톡신, 백금 배위 복합체, 빈카 알칼로이드, 치환된 우레아, 메틸 하이드라진 유도체, 부신피질 억제제, 길항제, 엔도스타틴, 탁솔, 캄포테신, 옥살리플라틴, 독소루비신 및 이들의 유사체 및 이의 복합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

톡신의 예로는 겔로닌, 슈도모나스 엑소톡신 (PE), PE40, PE38, 디프테리아 톡신, 리친, 아브린, 알파 톡신, 사포린, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코커스 엔테로톡신-A, 미국자리공(pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌, 슈도모나스 엔도톡신, 칼리케마이신(calicheamicin) 및 에스페라마이신(esperamicin)과 같은 에네딘(enediyne) 패밀리 분자 멤버 뿐만 아니라, 이들의 유도체, 복합 및 변형을 더 포함한다. 화학적인 톡신은 듀오카르마이신(가령, U.S. 특허 5,703,080 및 U.S. 특허 No. 4,923,990), 메토트렉세이트, 독소루비신, 멜파란, 클로람부칠, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스-플라티늄, 에토포시드, 블레오마이신 및 5-플로오르우라실으로 구성된 군으로부터 취할 수 있다. 화학치료요법적 물질의 예는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플로오르우라실, 시토신 아라비노시드(Ara-C), 사이클로포스파미드, 티오테파, 탁소테레(독세탁셀), 부술판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜파란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미토산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라마이신(U.S. 특허 No. 4,675,187 참고), 멜파란 및 기타 관련 질소 머스타드를 또한 포함한다. 적절한 톡신 및 화학요법제는Remington'sPharmaceuticalSciences, 19thEd. (MackPublishingCo. 1995), 및Goodman AndGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics, 7thEd. (MacMillanPublishingCo. 1985)에서 설명된다. 기타 적절한 톡신 및/또는 화학치료제는 본 기술 분야의 당업자들에게도 알려져 있다.

방사성 동위 원소의 예로는 국소화 및/또는 치료에 이용될 수 있는 감마-방사체, 양전자-방사체, 및 x-선 방사체, 및 치료법에 이용될 수 있는 베타-방사체 및 알파-방사체를 포함한다. 진단, 예후 및 단계 확인에 유용한 것으로 이미 언급된 방사성 동위 원소 또한 치료제로 유용하다.

항암 또는 항-백혈병 치료제의 비-제한적인 예로는 안트라사이클린 가령, 독소루비신(아드리아마이신), 다우노루비신(다우노마이신), 이다루비신, 데토루부신, 카르미노마이신, 에피루비신, 에소루비신 및 몰포리노 및 치환된 유도체, 이의 복합물 및 변형물을 포함한다. 예시적인 약학 물질에는 시스-플라티늄, 탁솔, 칼리케아미신, 빈크리스틴, 사이타라빈(Ara-C), 사이클로포스파미드, 프데드니손, 다우노루비신, 이다루비신, 플루다라빈, 클로람부칠, 인터페론 알파, 하이드록시우레아, 테모졸로미드, 탈리도미드, 블레오마이신 및 이의 유도체, 복합물 및 변형물을 포함한다. 바람직하게는, 항암 또는 항백혈병제는 독소루비신, 몰포리노독소루비신 또는 몰포리노다우노루비신이다.

본 발명의 항체들은 포유류, 바람직하게는 인간에서 변형안된 항체의 것보다 큰 반감기(가령, 혈청 반감기)를 가지는 항체들 또한 포함한다. 상기 항체 반감기는 약 15 일 이상, 약 20 일 이상, 약 25 일 이상, 약 30 일 이상, 약 35 일 이상, 약 40 일 이상, 약 45 일 이상, 약 2 개월 이상, 약 3 개월 이상, 약 4 개월 이상, 또는 약 5 개월 이상이 될 수 있다. 포유류, 바람직하게는 인간에서 본 발명의 항체 또는 이들 단편의 반감기 증가는 포유류에서, 바람직하게는 인간에서 항체들 또는 항체 단편의 더 높은 혈청 역가를 초래하고, 따라서, 항체들 또는 항체 단편의 투여 빈도를 감소시키고 및/또는 투여되는 항체들 또는 항체 단편의 농도를 줄일 수 있게 한다. 생체내 증가된 반감기를 가지는 항체들 또는 이의 단편들은 본 기술 분야에 공지된 기술을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 증가된 반감기를 가지는 항체들 또는 이의 단편들은 Fc 도메인 및 FcRn 수용체 간에 상호작용에 관련된 것으로 확인된 아미노산 잔기들을 변형(가령, 치환, 결손 또는 추가)시켜 만들 수 있다(가령, 국제 공개 번호 WO 97/34631 및 WO 02/060919, 이들 내용은 전문이 참조에 의해 본원에 통합된다). 생체내 반감기가 증가된 항체들 또는 이의 단편들은 고분자량의 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 폴리머 분자에 항체 또는 항체 단편을 부착시켜 만들 수 있다. 항체들 또는 항체 단편에 다기능 링커 유무하에, PEG의 부위-특이적인 콘쥬게이트를 통하여 항체들 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에 PEG가 부착되거나 리신 잔기에 있는 입실론-아미노기를 통하여 PEG가 부착될 수 있다. 생물학적 활성의 상실을 최소화시키는 선형 또는 분지형 폴리머의 유도도 이용될 수 있을 것이다. PEG 분자가 항체에 적절하게 콘쥬게이트된 것을 확인하기 위하여 SDS-PAGE 및 질량 분석을 통하여 콘쥬게이트 정도를 긴밀하게 모니터할 수 있을 것이다. 반응안된 PEG는 가령, 크기-압출 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 콘쥬게이트로부터 분리될 것이다.

본 기술 분야에 당업자들이 인지할 수 있는 것과 같이, 친화력 값이 중요하나, 항체의 특정 기능에 따라 다른 인자들도 중요할 수 있다. 예를 들면, 면역톡신 (항체에 연합된 톡신)의 경우, 표적에 항체의 결합 작용이 유용할 것이나, 일부 구체예들에서, 톡신이 세포로 내화되는 것이 원하는 최종 결과다. 이와 같은 상황에서는 높은 내화율(%)을 가진 항체들이 바람직할 것이다. 따라서, 한 구체예에서, 내화에 고효율을 가진 항체들이 고려된다. 고효율의 내화는 내화된 항체%로 측정될 수 있는데, 낮은 수치부터 100% 까지 될 수 있다. 예를 들면, 다양한 구체예에서, 0.1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-45%, 45-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-99% 및 99-100%가 고효율이 될 것이다. 본 기술 분야의 당업자들이 인지할 수 있는 바와 같이, 바람직한 효과는 연합된 물질, 부위로 투여될 수 있는 항체의 양, 항체-물질 복합체의 부작용, 치료되어야 하는 문제가 되는 유형(가령, 암 유형) 및 중증도에 따라 상이한 구체예에서 달라질 수 있다.

다른 구체예들에서, 본원에 기술된 항체들은 DLL4 발현에서 변화와 관련된 질환 또는 이상을 스크리닝하기 위하여, 포유류 조직 또는 세포에서 DLL4 발현을 탐지하기 위한 분석 키트를 제공한다. 키트는 DLL4에 결합하는 항체, 및 항원(존재한다면)과 항체의 반응을 나타내는 수단을 포함한다.

배합(Combinations)

여기에서 정의된 바와 같이, 표적화된 결합제 또는 항체는 단독 요법으로 이용되거나 본 발명의 화합물에 추가하여, 통상적인 외과술 또는 방사능요법 또는 화학요법을 포함할 수 있다. 이와 같은 화학요법은 다음 범주의 하나 이상의 항종양 물질을 포함할 수 있다:

(i) 종양학에서 이용되는 것과 같이, 기타 항증식성/항종양성 약물 및 이의 복합물, 가령, 알킬화제(예를 들면, 시스-플라틴, 옥살플라틴, 카르보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜파란, 클로람부칠, 부술판, 테모졸아미드 및 니트로조우레아); 대사길항물질(예를 들면 겜시타빈, 항엽산제, 가령, 5-플루오르우라실 및 테가푸르와 유사한 플로오르피리미딘, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드 및 하이드록시우레아); 항종양 항생제 (예를 들면, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노미아신 및 미트로마이신과 유사한 안트라사이클린); 세포분열억제제(예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈과 유사한 빈카 알칼로이드 및 탁솔 및 탁소테레과 유사한 탁소이드 및 폴로키나제 억제제); 및 포토이소메라제 억제제 (예를 들면, 에토포시드 및 테니포시드와 유사한 에피도펠로톡신, 암사크린, 토포테칸 및 캄포테신);

(ii) 세포증식억제제, 가령, 항에스트로겐(예를 들면, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 랄옥시펜, 드롤로옥시펜, 및 이도옥시펜), 항안드로겐(예를 들면, 비칼루타미드, 플루타미드, 니루타미드 및 시프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 항진제(예를 들면, 고세레린, 루프로레린 및 부세레린), 프로게스테론 (예를 들면, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제 (예를 들면, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄) 및 피나스페리드와 같은 5α-환원효소 억제제;

(iii) 항침투제(예를 들면, 4-(6-클로로-2,3-메틸렌디옥시아닐로)-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]-5-테트라하이드로피란-4-일 옥시퀴나졸린(AZD0530; 국제 특허 출원 WO 01/94341) 및N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2- {6-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]-2-메틸피리미딘-4-일 아미노} 티아졸-5-카르복사미드(다사티니브,BMS-354825; J.Med.Chem, 2004, 47, 6658-6661)와 같은 c-Src 키나제 패밀리 억제제, 및 마리마스타트와 같은 금속단백질분해제 억제제, 유로키나제 플라스미노겐 작용제 수용체 기능 억제제, 카텝신 억제제, 세린 프로테아제 억제제, 예를 들면 마트리프타제, 헵신, 유로키나제, 헤파라나제 억제제);

(iv) 세포독성 물질, 가령, 플루다라빈, 2-클로로데옥시아데노신, 클로람부칠 또는 독소루비신 및 이의 복합물, 가령, 플루다라빈 + 사이클로포스파미드, CVP: 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손, ACVBP: 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈데신 + 블레오마이신 + 프레드니손, CHOP: 사이클로포스파미드 + 독소루비신 + 빈크리스틴 + 프레드니손, CNOP: 사이클로포스파미드 + 미토옥산트론 + 빈크리스틴 + 프레드니손, m-BACOD: 메토트렉세이트 + 블레오마이신 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 덱사메타손 + 루코보린, MACOP-B: 메토트렉세이트 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 빈크리스틴 + 프레드니손 고정된 약량 + 블레오마이신 + 루코보린, 또는 ProMACE CytaBOM: 프레드니손 + 독소루비신 + 사이클로포스파미드 + 에토폭시드 + 시타라빈 + 블레오마이신 + 빈크리스틴 + 메토트렉세이트 + 루코보린.

(v) 성장 인자 기능 억제제, 예를 들면, 이와 같은 억제제는 성장 인자 항체들 및 성장 인자 수용체 항체들 (예를 들면, 항-erbB2 항체 트라투주마브[Herceptin™], 항-EGFR 항체 파니투무마브, 항-erbB1 항체 세투시마브[Erbitux, C225] 및Sternetal.Criticalreviewsin oncology/haematology, 2005,Vol. 54,ppll-29)에서 설명하는 임의의 성장 인자 또는 성장 인자 수용체 항체들을 포함한다; 이와 같은 억제제는 또한 티로신 키나제 억제제, 예를 들면, 상피 성장 인자 패밀리의 억제제(예를 들면, EGFR 패밀리 티로신 키나제억제제, 가령N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-몰포리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민 (제피티니브, ZD1839),N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 (에르로티니브, OSI-774) 및 6- 아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플로오르페닐)-7-(3-몰포리노프로폭시)-퀴나졸린-4-아민 (CI 1033), erbB2 티로신 키나제억제제, 가령, 라파티니브, 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제, 혈소판-유도된 성장 인자 패밀리의 억제제, 가령 이마티니브, 세린/트레오틴 키나제의 억제제(예를 들면, Ras/Raf 신호발생 억제제, 가령 파르네실 트란스퍼라제 억제제, 예를 들면 소라페니브(BAY 43-9006)), MEK 및/또는 AKT 키나제를 통한 세포 신호발생 억제제, 간세포 성장 인자 패밀리 억제제, c-키트 억제제, ab1 키나제 억제제, IGF 수용체 (인슐린 유사 성장 인자) 키나제 억제제, 아우로라 키나제 억제제 (예를 들면 AZDl 152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 및 AX39459), 사이클린 의존적 키나제 억제제, 가령 CDK2 및/또는 CDK4 억제제, 및 생존 신호발생 단백질들 가령 Bcl-2, BcI-XL의 억제제, 예를 들면 ABT-737;

(vi) 맥관 내피 성장 인자를 저해시키는 항맥관형성제, [예를 들면 항-맥관 내피 세포 성장 인자 항체 베바치주마브 (Avastin™) 및 VEGF 수용체 티로신 키나제억제제, 가령, 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일 메톡시)퀴나졸린(ZD6474; WO 01/32651의 실시예 2), 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일 옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일 프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171; WO 00/47212의 실시예 240), 바타라니브(PTK787; WO 98/35985) 및 SU11248 (수니티니브; WO 01/60814: Sutent™), 소라페니브(Nexxavar™), 국제 특허 출원 WO97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO 00/47212 및 WO 01/32651에서 설명된 화합물, 및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물(예를 들면, 리노미드, 인테그린 αvβ3 기능 억제제 및 앙지오스타틴)] 또는 콜로니 자극 1 (CSF1) 또는 CSF1 수용체.;

(vii) 맥관 파괴 물질, 가령, 콤브레타스타틴 A4 및 국제 특허 출원 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213에서 설명된 화합물;

(viii) 안티센스 치료제, 예를 들면 상기에서 열거된 표적을 향하는 것들, 가령, G-3139 (Genasense), 항-bcl2 안티센스;

(ix) 유전자 치료 방법, 가령, 예를 들면 변종 p53 또는 변종 BRCA1 또는 BRCA2, GDEPT (효소 프로 드럭 치료에 대한 유전자)와 같은 변종 유전자를 대체하는 방법, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 세균성 니트로환원효소를 이용하는 것과 같은 방법, 및 다중 약물 저항성 유전자 치료와 같은 화학요법 또는 방사능요법에 대한 환자의 내성을 증가시키는 방법을 포함하는 방법; 및

(x) 면역치료 방법, 예를 들면, 알레투주마브(campath-1H™)로 치료, CD52에 대한 단클론 항체, 또는 CD22에 대한 항체로 치료, 생체외(exvivo) 및 생체내(invivo) 환자의 종양 세포의 면역성을 증가시키는 방법, 인터루킨 2, 인터루킨 4와 같은 사이토킨 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자를 이용한 형질감염, CTLA-4 기능을 억제시키는 단클론 항체들를 이용한 치료와 같은 T-세포 아네르기를 감소시키는 방법, 사이토킨 형질감염된 수지상 세포와 같은 형질감염된 면역 세포를 이용하는 방법, 사이토킨 형질감염된 종양 세포계를 이용하는 방법, 및 항-이디오타입 항체들을 이용하는 방법을 포함하는, 면역치료 방법;

(xi) 단백질 분해 억제제, 가령, Velcade (보르테조미브)와 같은 프로테아좀 억제제;

(xii) 생체요법적 치료요법적 방법, 예를 들면, 수용체 리간드를 격리시키고 수용체에 리간드 결합을 차단하거나 또는 수용체 신호발생을 감소시키는 (가령, 수용체 분해의 강화 또는 발현 수준이 낮아지기 때문) 펩티드 또는 단백질들 (가령, 항체 또는 가용성 외부 수용체 도메인 구조)을 이용하는 것을 포함하는 방법.

한 구체예에서, 여기에서 정의된 항종양 치료는 본 발명의 화합물에 추가하여, 종양학에서 이용되는 것과 같이, 항-증식성/항종양성 약물 및 이의 복합물을 이용하는 것을 포함할 수 있는데, 가령, 알킬화제(예를 들면, 시스-플라틴, 옥살리플라틴, 카르보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜파란, 클로람부칠, 부설판, 테모졸아미드, 및 니트로조우레아); 대사길항물질(예를 들면, 겜시타빈, 및 항엽산제, 가령 5-플루로오우라신 및 테가푸르와 유사한 플로오르피리미딘, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노사이드, 및 하이드록시우레아); 항종양 항생제(예를 들면, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티모마이신 및 미트라마이신과 같은 안트라사이클린); 세포분열억제제(예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈과 같은 빈카 알칼로이드, 및 탁솔 및 탁소테레와 같은 탁소이드, 그리고 폴로키나제 억제제); 및 토포이소메라제 억제제 (예를 들면, 에토폭시드 및 테니포시드와 같은 에피포도필로톡신, 그리고 테니포시드, 암스크린, 토포테칸 및 캄포테신).

한 구체예에서, 여기에서 정의된 항-종양 치료는 본 발명의 화합물에 추가하여 겜시타빈을 이용한 치료를 포함할 수 있다.

이와 같은 결합 치료는 치료를 위한 개별 성분의 동시, 연속 또는 별도 투여를 통하여 이루어질 수 있다. 이와 같은 복합 산물은 기존에 설명된 투여량 범위의 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과, 승인된 투약 범위내에 기타 약제학적으로 활성 물질을 이용한다.

실시예

실행된 실험들과 수득된 결과들을 포함한 다음의 실시예들은 단지 설명을 목적으로 제공된 것이며, 여기에서 교수되는 것에 한정하는 의도로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

면역화(Immunization) 및역가적정(TlTERING)

면역원

인간 DLL4 의 세포외 도메인 (아미노산 1-524)과 Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포에서 일과적으로 발현된 재조합 인간 DLL4를 면역화(immunizations)를 위한 항원으로 이용하였다. CHO 형질감염체를 만들기 위하여, 인간 DLL4 전장 cDNA (Yoneyaetal., 2001, J.Biochem., 129, 27-34)를 pcDNA3.1 벡터내로 삽입시키고 CHO 세포(American Type 조직 Collection, catalog # CCL-61)로 리포펙션시켰다. 면역화 목적을 위하여 세포 표면에서 인간 DLL4가 적절한 수준으로 발현된 것은 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석으로 확인하였다. 포워드 프라이머 5'-AAGCTGGCTAGCGCGAATGGCGGCAGCGTCCCGGAG 와 리버스 프라이머 5'-CAGCCTCGAGCGGCCGCCCAGGGGAAGCTGGGCGGCAAGC를 이용하여 전장 DLL4으로부터 인간 DLL4의 세포외 도메인을 서브클론시켰다. PCR 산물을 정제하고, pSecTag 발현 벡터(Invitrogen)에 결찰하였다. 후속적으로 클론은 293fectin 형질감염 시약을 이용하여 293T 세포로 형질감염시켰다. 7일 후, 표적 단백질을 포함하는 세포 상청액을 회수하였고, 사전에 평형화된 HisTrap 컬럼(GE Healthcare, catalog #17-5247)에 하룻밤 동안 런(run)시켰다. 20 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨 및 5 mM 이미다졸, pH 7.4를 포함하는 결합 완충액으로 컬럼을 세척한 후, 20 mM 인산나트륨, 500 mM 염화나트륨 및 500 mM 이미다졸, pH 7.4.을 포함하는 완충액으로 his-테그된 단백질을 용리하였다. 4℃에서 1시간 동안 단백질 시료를 결합 완충액에서 투석시켰고, PBS, pH 7.4에서 2시간 동안 더 투석시킨 후, 여과 멸균, SDS-PAGE에 의한 정량화 및 순도 평가에 이어서, Gelcode (Pierce, catalog #24950)으로 착색시켰다.

면역화(Immunization)

DLL4에 대한 단클론 항체는 XenoMouse^® 마우스(XenoMouse 균주: XMG2 (IgG2 카파/람다) 및 XMG4 (IgG4 카파/람다)Amgen,Inc.Vancouver,BritishColumbia, Canada)에게 실시예 1에서 설명된 것과 같은 재조합 인간 DLL4를 과다발현시키는 DLL4 또는 CHO 세포의 세포외 도메인을 잇달아 면역주사하여 생성되었다. XenoMouse 동물은 통상적인 수단을 이용하여 모든 주사에 대해 복막 및 꼬리 경로를 기초로하여 면역주사를 맞았다. 어주번트(adjuvant)는 Titermax Gold™(Sigma, catalog #T2684), 인산 알루미늄염 겔 어주번트, HCL Biosector, (catalog #1452-250) 및 ImmuneEasy 마우스 어주번트(qCpG, Qiagen catalog #303105)를 포함한다. 가용성 이뮤노겐을 위하여, 10 ㎍ DLL4 세포외 도메인의 첫 주사는 Titermax Gold™ (Day 0)와 함께 투여되었고, 교대(alternate) 부스트는 인산 알루미늄염 겔 어주번트 및 qCpG 또는 Titremax Gold™ 와 5㎍의 DLL4 세포외 도메인을 이용하여 투여되었다. 세포-기반의 면역원의 경우, 첫 주사는 인산 알루미늄염 겔 어주번트와 2E6 세포와 함께 투여되었다. 연속적인 부스트 동안 2E6 세포는 동일한 어주번트를 이용하여 투여되었다. 면역화 과정 동안 부스팅(boosting)은 2일, 6일, 10일, 16일, 23일, 30일, 37일, 44일, 50일, 64일, 71일, 75일, 89일, 104일 및 108일에 있었다.

역가(Titer)에 의해 포획할 동물의 선별

인간 DLL4에 대한 항체 역가 적정은 형광측정 미용적 분석 기술(Fluorometric microvolume assay technology:FMAT) 세포 탐지 장치를 이용하여 293T 세포에서 발현된 인간 및 마우스 DLL4에 결합에 대해 테스트되었다. DLL4에 특이적인 것으로 보이는 역가를 가지는 일부 마우스가 있다는 것을 이 분석에서 보여주었다. 따라서, 면역화 프로그램 종료시, 수거용으로 17마리 마우스가 선별되었고, 하기 실시예 2에서 설명된 것과 같이 면역주사를 맞은 마우스의 비장 및 림프절로부터 림프구가 분리되었다.

실시예 2

림프구 회수, B-세포 분리, 융합 및하이브리도마 생성

경추 탈구를 통하여 면역주사를 맞은 마우스를 죽이고, 각 군으로부터 유출 림프절을 수거하여 모아두었다. 조직으로부터 세포가 방출되도록 림프구 세포들을 DMEM에서 글라인딩시켜 해리시켰고, 세포를 DMEM에 현탁시켰다. CD19 라벨링된 Dynal 비드를 이용하여 포지티브 선별을 통하여 B 세포들을 농축시켰다. 상기 세척되고, 농축된 B 세포와 ATCC 로부터 구입한 비분비성 골수종 P3X63Ag8.653 세포(catalog #CRL 1580) (Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550)를 1:1로 혼합하여 융합을 실시하였다. 세포 혼합물은 800 × g에서 원심분리에 의해 부드럽게 펠렛화되었다. 상청액을 완전하게 제거한 후, 세포를 2-4㎖의 Pronase 용액(CalBiochem, catalog #53702; 0.5 mg/㎖ PBS)으로 2분간만 처리하였다. 그 다음 3-5㎖의 FBS를 첨가하여 효소 활성을 중단시켰고, 전기 세포 융합 용액, ECFS (0.3 M 슈크로즈, Sigma, catalog #S7903, 0.1 mM 아세테이트 마그네슘, Sigma, catalog #M2545, 0.1 mM 아세테이트 칼슘, Sigma, catalog #C4705)을 이용하여 현탁액의 총 용적이 40㎖이 되도록 조정하였다. 원심분리후 상청액을 제거하였고, 세포는 40 ㎖ ECFS에 재현탁되었다. 이와 같은 세척 단계가 반복되었고, 세포들은 다시 ㎖당 2E6 세포의 농도로 ECFS에 재현탁되었다. 전기-세포 융합(ECF)은 융합 발생기 모델 ECM2001,(Genetronic,Inc.,SanDiego,CA)를 이용하여 실시하였다. 이용된 융합 쳄버의 크기는 2.0 ㎖이었고, 다음과 같은 기구 세팅이 이용되었다: 조정 조건(alignment condition): 전압: 50 V, 시간: 50 초; 3000 V의 전압, 30μ초에서 막 파열; 융합후 홀딩 시간: 3 초. ECF 이후, 세포 현탁액을 멸균 상태에서 융합 쳄버로부터 조심스레 빼내고, 2 mM L-글루타민 (Sigma, catalog #G2150), 10 U/㎖ 페니실린/0.1 mg/㎖ 스트렙토마이신 (Sigma, catalog #P7539), 1 vial/L OPI (옥살로아세테이트, 피루베이트, 소의 인슐린; Sigma catalog #05003) 및 10 U/㎖ 인간의 재조합 인간 IL-6 (Boehringer Mannheim, catalog #1131567)이 보충된 동량의 Hybridoma Culture Medium (DMEM (JRH Biosciences),15% FBS (Hyclone)를 포함하는 멸균 튜브로 옮겼다. 세포는 37℃에서 15-30 분간 항온처리되었고, 그 다음 5분간 400×g에서 원심분리되었다. 소량의 Hybridoma Selection Medium (Hybridoma Culture Medium+ 0.5×HA (Sigma, catalog #A9666))에 세포를 부드럽게 재현탁시켰고, 96개 웰 플레이트당 총 5E6 B세포 및 웰당 200㎕에 근거하여 Hybridoma Selection Medium로 용적을 적절히 조정하였다. 세포들을 부드럽게 혼합한 후, 96 웰 플레이트상에 피펫하여 성장하도록 하였다. 항-DLL 항체를 잠재적으로 생산하는 세포들로부터 모든(Exhaustive) 상청액을 수거하여, 하기에서 예를 든 것과 같이 스크리닝 분석을 하였다.

실시예 3

인간 및 필리핀 원숭이DLL4 및 인간Jagged1이결합된 세포에의 결합

인간 또는 필리핀 원숭이의 전장 DLL4 또는 인간 Jagged1를 일과적으로 과발현시키는 293T 세포에 분비된 항체들이 결합하는 능력을 평가하기 위하여, 수확된 세포로부터 수거한 상청액을 테스트하였다. 허위-형질감염된 293T 세포계를 네가티브 대조군으로 이용하였다. 2% FBS를 포함하는 PBS에 희석된 세포를 384 세포 플레이트(Corning Costar, catalog #3712)에서 웰당 3000개 발현 및 15000 허위 형질감염된 세포의 밀도로 접종하였다. 플레이팅 직후, 하이브리도마 상청액 15㎕/well 또는 20 ㎕/well 및 10 ㎕/well의 2차 항체(염소 항-인간 IgG Fc Cy5, 최종 농도 750 ng/㎖)를 첨가하였고, FMAT 8200 기구(Applied Biosystems)에서 형광을 판독하기 전 실온에서 3시간 동안 플레이트를 항온처리하였다. 2.86 ㎍/㎖로부터 1:2로 희석된 인간 Notch1/Fc 키메라(R&D systems, catalog #3647-TK)의 결합을 DLL4에 대한 포지티브 대조군으로 이용하였고, 10 ㎍/㎖으로부터 희석된 인간 Notch3/Fc 키메라는 Jagged1에 결합에 대한 포지티브 대조군으로 이용되었다. 인간/필리핀 원숭이 DLL4 및 인간 Jagged에 대한 하이브리도마 상청액의 결합을 보여주는 12개 하이브리도마 상청액에 대한 결과는 표 3에 나타낸다.

[표 3]

실시예 4

Notch1-DLL4 수용체-리간드 결합의 억제

상청액을 포함하는 항체의 상대적인 효능을 측정하기 위하여, 293T 세포에서 일과적으로 과발현된 인간 DLL4에 인간 Notch1/Fc의 결합을 억제하는 능력이 평가되었다. 형질감염된 그리고 형질감염안된 239T 세포는 2% FCS을 포함하는 PBS에서 재구성되었고, 5000개의 형질감염된 세포 및 17500개의 비-형질감염된 세포는 384-웰 조직 배양 플레이트(Corning Costar, catalog #3712)의 웰에 20㎕ 씩 플레이트되었다. 그 다음, 20 ㎕의 하이브리도마 상청액이 첨가되었고, 플레이트는 1시간 동안 4℃에서 항온처리되었고, 이때 20 ㎕의 Alexa-647 라벨링된 인간 Notch1/Fc가 6.7 ng/㎖의 최종농도로 첨가되었다. 4℃에서 추가 3시간 동안 배양한 후, FMAT 8200 기구(Applied Biosystems)를 이용하여 각 웰에서 형광을 판독하여 결합된 Notch1/Fc의 양을 측정하였다. 표 4에 12개의 하이브리도마 상청액에 대한 결과를 나타낸다. 실시예 2에서 설명된 것과 유사한 방식으로 제조된 비-DLL4 결합 상청액의 효과를 측정하는 분석에서 최저 억제를 저해 %로 결과를 나타내고, 최대 억제는 비-라벨링된 Notch1/Fc의 출발 농도 존재하에서 수득된 신호로 정의된다. N.T.=테스트 안됨

[표 4]

실시예 5

항-DLL4 항체의 구조적 분석

항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 이들 서열을 결정하기 위해 서열화되었다. 항-DLL4 항체에 대한 완전한 서열 정보는 각 감마 및 카파 쇄 조합의 핵산 및 아미노산 서열의 서열 리스트로 제공된다. VH 패밀리, D-부위 서열 및 J-부위 서열을 결정하기 위하여 가변 중쇄 서열을 분석하였다. 그 다음 1차 아미노산 서열을 결정하기 위하여 서열을 해독하였고, 체세포 초돌연변이를 평가하기 위하여 생식계열 VH, D 및 J-부위 서열과 비교하였다.

표 2에서 항체 중쇄 부위는 이의 동족 생식 계열 중쇄 부위과 비교하고, 카파 경쇄 부위는 동족 생식 계열 경쇄 부위과 비교한 것이다. 면역글로블린 쇄의 가변(V) 부위는 다중 생식 계열 DNA 단편에 의해 인코드되며, 이들은 B 세포 개체발생 동안 기능을 하는 가변 부위(V_HDJ_H 또는 V_KJ_K)에 결합된다. DLL4에 대한 항체 반응의 분자적 및 유전적 다양성은 상세하게 연구되었다.

특정 항체가 아미노산 수준에서 이의 생식계열 서열과 상이한 구체예에서, 항체 서열은 이의 생식계열 서열로 되돌리는 돌연변이될 수 있다. 이와 같은 교정적 돌연변이는 표준 분자생물학적 기술을 이용하여, 돌연변이된 위치중 하나, 둘, 셋 이상의 위치 또는 임의의 복합 위치에서 일어날 수 있다. 비-제한적인 예를 들자면, 2H10의 중쇄 서열 (서열 번호: 6)은 위치 18에서 V는 A 로 돌연변이(돌연변이 1), 위치 32에서 V은 A로 돌연변이(돌연변이 2), 위치 50에서 E는 D로의 돌연변이(돌연변이 3), 위치 65에서 S는 N으로의 돌연변이(돌연변이 4), 위치 89에서 T는 A로의 돌연변이(돌연변이 5) 그리고 위치 94에서 L은 T로의 돌연변이(돌연변이 6)를 통하여, 이의 대응 생식계열 서열과 상이하다는 것을 표 8에서 볼 수 있다. 따라서, 2H10의 경쇄를 인코드하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 이들 임의의 부위 또는 이들 모든 부위에서 변형될 수 있다. 아래 표 2-9는 2H10, 9G8, 21H3 및 4B4의 생식계열로부터 이와 같은 변이 부위를 설명하고 있다. 각 열은 굵게 표시된 부위에서 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합을 나타낸다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 이질성(heterogeneity)에 영향을 줄 수 있는 서열에 임의 구조적 책임을 대체하는 것을 포함한다. 이와 같은 책임은 글리코실화 부위, 쌍을 이루지 않은 시스테인, 표면 노출된 메티오닌 등을 포함한다. 이와 같은 이질성의 위험을 감소시키기 위하여, 하나 이상의 구조적 책임을 제거하도록 변화를 만드는 것이 제안된다.

한 실시예에서, 쌍을 이루지 않은 시스테인은 단독으로 대체되거나 다른 구조적 변화와 결합하여 대체될 수 있다. 쌍을 이루지 않은 시스테인은 항체 2H10 또는 9G8의 경쇄 CDR1의 위치 33에서 일어난다. 이와 같은 쌍을 이루지 않은 시스테인은 세린과 같은 필적되는 측쇄 특성을 가진 적합한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 쌍을 이루지 않은 시스테인은 항체 20G8의 중쇄 FR4의 위치 203에서 일어난다. 이와 같은 쌍을 이루지 않은 시스테인은 세린과 같은 필적되는 측쇄 특성을 가진 적합한 아미노산으로 돌연변이될 수 있다.

[표 5]

표시된 잔기 번호에서 21H3 중쇄 (서열 번호: 30)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 30을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 30은 표 5의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 30은 표 5에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 또는 6개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 30은 표 5에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VH1-18, D2-15 및 JH3 도메인을 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다. 특정 생식계열 서열로 돌연변이된 21H3 가변 중쇄 도메인의 예는 표 13에서 볼 수 있는 21H3 VHOP (비-생식계열 서열에서 위치 45에서 L로 돌연변이되었고, 위치 70에서 M으로 돌연변이되어 최적화되었다)을 포함한다.

[표 6]

표시된 잔기 번호에서 21H3 경쇄 (서열 번호: 32)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 32을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 32은 표 6의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 32은 표 6에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯 또는 5개 모두를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VL, 1g, JL2 도메인들 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다. 특정 생식계열 서열로 돌연변이된 21H3 가변 경쇄 도메인의 예는 21H3 VLOP1 (비-생식계열 서열에서 위치 107에서 K로 돌연변이되어 최적화되었다) 및 21H3 VLOP2 (비-생식계열 서열에서 위치 67 및 107에서 K로 돌연변이되어 최적화되었다)을 포함한다. 표 13 참고.

[표 7]

표시된 잔기 번호에서 4B4 중쇄 (서열 번호: 2)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 2를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 2는 표 7의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 2는 표 7에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 임의의 일곱, 임의의 여덟, 임의의 아홉, 임의의 열, 임의의 열하나 또는 11개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 2는 표 7에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VH1-18, D7-27 및 JH4 도메인들 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다.

[표 8]

표시된 잔기 번호에서 4B4 경쇄 (서열 번호: 4)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 4를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 4는 표 8의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 4는 표 8에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯 또는 5개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 4는 표 8에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VL, 3p 및 JL2 도메인들 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다.

[표 9]

표시된 잔기 번호에서 2H10 중쇄 (서열 번호: 6)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 6을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 6은 표 9의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 6은 표 9에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯 또는 6개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 6은 표 9에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 Vh3-33, D6-13 및 JH4 도메인들 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다. 돌연변이된 서열의 예로는 위치 93에서 M이 V로 돌연변이된 2H10 VHOP가 있다. 표 13 참고.

[표 10]

표시된 잔기 번호에서 2H10 경쇄 (서열 번호: 8)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 8을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 8은 표 10의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 8은 표 10에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯 또는 6개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 8은 표 10에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VL, 3r 및 JL2 도메인들 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다. 특정 구체예들에서, 서열 번호: 8은 구조적 책임을 제거하는 것을 포함하는 변형을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 생식계열에 추가하여, C33은 S로 돌연변이될 수 있다-표 13의 2H10 VLOP1 참고. 따라서, 서열 번호: 8 은 표 10의 각 열에서 표시된 바와 같이, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함하고, C33이 S로 돌연변이된 것을 더 포함할 수 있다. C33에서 구조적 책임을 제거하기 위하여 경쇄가 돌연변이되고, 생식 계열 서열로 되돌아가도록 돌연변이된 서열의 예는 표 13에 나타낸 것과 같은 2H10 VLOP2이며 이때, C33은 S 로 돌연변이되고, 위치 18에서 V는 A로 돌연변이되고, 위치 65에서 S는 N으로 돌연변이되었다.

[표 11]

표시된 잔기 번호에서 9G8 중쇄 (서열 번호: 22)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 22를 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 22는 표 11의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 22은 표 11에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 임의의 일곱 또는 7개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 22는 표 11에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VH4-39, D4-23 및 JH3 도메인들 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다. 중쇄가 생식 계열 서열로 되돌아가도록 돌연변이된 서열의 예는 표 13에 나타낸 것과 같은 9G8 VHOP1이며, 이때 위치 38의 L은 W로 돌연변이되었다. 중쇄가 생식 계열 서열로 되돌아가도록 돌연변이된 서열의 또 다른 예는 표 13에 나타낸 것과 같은 9G8 VHOP2이며, 이때 위치 21의 S는 T로 돌연변이되었으며, 위치 38의 L은 W로 돌연변이되었으며, 위치 70의 S는 T로 돌연변이되었으며, 그리고 위치 96의 F는 Y로 돌연변이되었다.

[표 12]

표시된 잔기 번호에서 9G8 경쇄 (서열 번호: 24)가 생식계열의 서열로 복귀되는 예시적 돌연변이

본 발명의 일부 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 서열 번호: 8을 포함하는 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 24는 표 12의 각 열에서 나타낸 것과 같은, 생식계열 및 비-생식계열 잔기들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 서열 번호: 24은 표 12에 나타낸 것과 같은, 생식계열 잔기의 임의의 하나, 임의의 둘, 임의의 셋, 임의의 넷, 임의의 다섯, 임의의 여섯, 임의의 일곱, 임의의 여덟, 임의의 아홉, 임의의 열, 임의의 열하나 또는 11개 모두를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 24는 표 12에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함한다. 다른 구체예들에서, 표적화된 결합제 또는 항체는 VL, 3r 및 JL2 도메인들 가진 생식계열 서열로부터 유도되는데, 여기서, 하나 이상의 잔기는 해당 위치에서 대응하는 생식계열 잔기를 만들기 위하여 돌연변이되었다. 특정 구체예들에서, 서열 번호: 24는 구조적 책임을 제거하는 것을 포함하는 변형을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열 번호 :24는 표 12에 나타낸 것과 같은, 생식계열과 비-생식계열 잔기의 독특한 조합중 어느 하나를 포함하고, C33이 S로의 돌연변이를 더 포함한다. 9G8 VLOP1이 예가 되며, 이것은 C33에서 구조적 책임을 제거하기 위해 경쇄가 돌연변이되었고, 생식계열 서열로 복귀하기 위하여 더 돌연변이되었는데, 이때, 위치 7에서 S는 P로 돌연변이되었고, 위치 79에서 V는 A로 돌연변이되었다. 또 다른 예는 9G8 VLOP2이며, C33은 S로 돌연변이되었고, 위치 2의 S는 Y로 돌연변이되었고, 위치 7의 S는 P로 돌연변이되었고, 위치 19의 R은 S로 돌연변이되었고, 위치 39의 T는 P로 돌연변이되었고, 위치 79의 V는 A로 돌연변이되었다. 특히 표 13 참고.

당업자는 CDR 경계를 한정하는 대안법이 있다는 것을 인지할 것이다. 표 2와 표 13의 모든 CDR 경계는Kabat 정의에 따라 한정된다.

[표 13]

실시예 6

DLL4 항체가Notch1-DLL4 수용체-리간드 결합을 저해하는 능력 측정

전장의 재조합 DLL4과 가용성 Notch1/Fc 사이에 상호작용을 방해하는 이들의 능력에 근거하여 정제된 항체들을 구별하기 위하여, 다음의 분석들이 실행되었다. 형질감염된 그리고 형질감염안된 239T 세포들을 2% FCS을 포함하는 PBS에서 재구성시키고, 5000개의 형질감염된 세포와 17500개의 비-형질감염된 세포를 30 ㎕으로 384-웰 조직 배양 플레이트 (Corning Costar, catalog #3712)에 도말하였다. 그 다음, 5 ㎍/㎖ 하이브리도마 상청액으로부터 연속 희석된 30 ㎕의 정제된 항체들을 첨가하였고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였으며, 이때 100 ng/㎖ Alexa-647 라벨링된 인간 Notch1/Fc 20 ㎕을 첨가하였다. 4℃에서 추가 3시간 동안 항온처리한 후, FMAT 8200 기구(Applied Biosystems)를 이용하여 각 웰에서 형광을 판독함으로써 Notch1/Fc의 양을 측정하였다. 12개의 정제된 항체에 대한 데이터는 표 14에 나타나 있으며, 이 표에서는 전장의 재조합 인간 DLL4 및 Notch1/Fc 키메라 사이의 상호작용을 저해하는 정제된 항체의 능력을 보여준다.

추가적으로, 유사한 실험을 하였으며, FACSCalibur (BD Biosciences) 기구를 이용하여 정량화하였다. 이 실험을 위하여, 부모 293T 세포 또는 인간 DLL4으로 일과적으로 형질감염된 세포는 2% FCS을 포함하는 PBS에서 재구성되었으며, 웰당 25000개의 세포의 농도로 정제된 항체들을 10 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 또는 0.1 ㎍/㎖의 최종 농도로 포함된 웰에 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, Alexa-647 라벨링된 인간 Notch1/Fc를 227 ng/㎖의 최종 농도로 첨가하였고, 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 2% FCS를 포함하는 PBS로 세척한 후, FACSCalibur 기구를 이용하여 각 웰에서 형광을 판독하여 결합된 Notch1/Fc의 양을 측정하였다. 이와 같은 조건들아래, DLL4-Notch1 상호작용을 저해시키는 20가지 정제된 항체들의 능력은 FMAT 기구를 이용하였을 때 관찰된 것과 유사하였다(데이타 제공하지 않음). 가용성 인간 DLL4 및 가용성 인간 Notch1을 이용하여 ELISA 포맷에서 실험을 실행하였을 경우 또한 유사한 결과를 얻었다(데이타 제공하지 않음).

레트로바이러스 구조체를 이용하여 인간, 마우스 또는 필리핀 원숭이 DLL4 에 의해 안정적으로 형질감염된 HEK293세포를 이용하여 선별된 항체들에서 추가 실험을 실행하였다. 이들 실험에서, 2% FCS를 포함하는 PBS에서 희석된 항-DLL4 항체(최종 농도: 10-0.01 ㎍/㎖)를 DLL4-발현시키는 HEK 293 세포(2% FCS를 포함하는 PBS에 희석된 50000개의 세포/웰)에 첨가하였고, 4℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 후속적으로, Alexa-647 라벨링된 인간, 쥐 또는 APC 라벨링된 마우스 Notch1/Fc (가령, R&D Systems, 차례로 catalog #3647-TK-050, 1057-TK-050, 5267-TK-050)를 0.01-0.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였으며, 그리고 플레이트를 4℃에서 추가 2시간 동안 항온처리한 후, 세척하고, FACSCalibur 기구상에서 판독하였다. 표 15에서는 재조합 전장인간, 필리핀 원숭이 및 마우스 DLL4와, 0.1 또는 0.25 ㎍/㎖ 인간, 쥐 또는 0.5 ㎍/㎖ 마우스 Notch1/Fc 키메라 사이의 상호작용을 저해하는 상이한 이소타입의 정제된 항체들의 능력을 나타낸다(FACS 분석에 의해 측정됨).

[표 14]

[표 15] * 인간 Notch1/Fc 0.25㎍/ml의 농도 N.T.=테스트되지 않음

실시예 7

인간Jagged1 및DLL1에 대한DLL4 항체의 교차 반응성

FACS 분석을 통하여, 정제된 항체들이 인간 Jagged1 및 Dll1에 결합하는 능력을 측정하였다. 간단하게 설명하자면, 293T 세포는 허위-형질감염된 또는 Lipofectamine 2000을 이용하여 인간 Jagged1 (accession #: NMDll4000214) 또는 Dll1 (accession #: NMDll4005618)으로 일과적으로 형질감염된 것이다. 2% FCS를 포함하는 PBS에 세포를 재현탁하였고, 웰당 50000개의 세포를 V-자 바닥의 플레이트에 접종하였다. 2% FCS를 포함하는 PBS에 희석된 항-DLL4 항체를 5 ㎍/㎖ 또는 15 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였고, 플레이트는 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 2% FCS를 포함하는 PBS로 세척한 후, 2차 항체 (염소 항-인간 Fc Cy5, Jackson Immunoresearch, catalog #109-175-098, 5 ㎍/㎖) 및 7-AAD (5 ㎍/㎖)를 첨가하였고, 플레이트를 4℃에서 15분간 항온처리한 후, 2% FCS를 포함하는 PBS로 다시 세척한 후, FACSCalibur 기구에서 판독하였다. 마우스 항-인간 Jagged 1 항체 (R&D systems, catalog #mAB1277, 인간 Notch3/Fc 키메라(R&D systems, catalog #1559-NT-050, 상기에서 설명된 염소 항-인간 Fc Cy5 항체로 탐지됨)) 또는 염소 항-인간 Dll1 항체 (R&D systems cat #AF1818, 항-염소 Fc Cy5로 탐지됨, Jackson Immunoresearch, catalog #305-175-046 (5 ㎍/㎖))는 형질감염을 확인하는 기준으로 이용되었다. Jagged1- 또는 Dll1-형질감염된 세포에서 관찰된 것에 대해 허위-형질감염된 세포에서 상승 평균 형광의 전이(shift)를 비교하여 데이터를 분석하였고, 결과를 표 16 및 17에 나타내었다. 표 16은 인간 Jagged1으로 일과적으로 형질감염된 293T 세포에 결합하는 정제된 항체(5 ㎍/㎖)의 능력을 나타낸다. 표 17은 인간 Dll1로 일과적으로 형질감염된 293T 세포에 결합하는 정제된 항체(15 ㎍/㎖)의 능력을 나타낸다. 21H3RK, 4B4, 9G8 또는 2H10를 최대 300 ㎍/㎖의 농도로 이용한 추가 FACS 결합 연구에서 인간 Jagged1 또는 인간 Dll1을 안정적으로 발현시키는 HEK-293 세포에 최소 결합(배경보다 <2.5배)이 설명되었다.

[표 16]

[표 17]

실시예 8

DLL4매개된HUVEC 증식에 대한DLL4 항체의 효과 측정

HUVEC 증식의 DLL4-자극된 억제를 차단하는 DLL4 항체의 능력이 평가되었다. DLL4 세포외 도메인 (R&D systems, catalog #1506-D4/CF)을 0.1% BSA를 포함하는 PBS에서 원액(stock) ㎖ 당 50 ㎍의 양으로 제조하였다. 중탄산 완충액(Sigma #C3041-50CAP)에서 1 ㎍/㎖으로 희석시킨 후, 웰당 100 ㎕를 검정 벽으로 된 96웰 플레이트(Perkin Elmer, catalog #6005182)에 첨가하였고, 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리하였다. 기준 웰은 0.1% BSA를 포함하는 PBS로 피복시켜 흉내내었다. PBS으로 세척한 후, 10% FCS 및 2 mM 글루타민을 포함하는 MCDB 113 (Gibco catalog #10372)에서 ㎖ 당 4E4 세포 농도로 100 ㎕ HUVEC 세포를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 바로, 연속적으로 희석된 항-DLL4 항체 (20-0.027 ㎍/㎖)를 DLL4/허위 피복된 웰에 3중 반복적으로 첨가하였고, 세포는 37℃/5% CO₂에서 96시간 동안 항온처리하였다. 이와 같은 항온처리후, 15 ㎕의 Cell Counting Kit 8 (CCK8, NBS, catalog #CK-04-11)를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃/5% CO₂에서 4시간 동안 항온처리하였다. 각 웰에 있는 상대적인 세포 수를 측정하기 위하여, 플레이트 판독기(Tecan Ultra)를 이용하여 450nm에서 흡수도를 측정하였다. 표 18에 항-DLL4 항체의 효과를 상세하게 나타낸다. 또한, 4B4, 21H3 및 21H3RK는 IgG1 항체로 구성되었을 때 DLL4-매개된 효과의 효과적인 저해제였다(도 1).

또한, 웨스턴 블랏을 통하여 Notch 신호생성을 저해하는 항-DLL4 항체(10 ㎍/㎖)의 능력도 평가하였다. 간단히 설명하면, DLL4-His (R&D systems, catalog #1506-D4-050/CF)를 0.1% BSA를 포함하는 PBS에 50 ㎍/㎖로 희석시켰다. 이 용액을 50 mM 중탄산 완충액, pH 9.6 (Sigma catalog #C-3041)에서 추가로 1 ㎍/㎖이 되도록 희석하였고, 웰당 1㎖을 12개 웰 플레이트에 첨가한 후, 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하였다. DLL4을 포함하지 않은 추가 웰은 동일한 과정을 이용하여 허위-피복(mock-coated)시켰다. PBS로 세척한 후, MCDB131 배지에서 제조된 HUVEC 세포를 웰당 12000개 세포로 접종시켰다. 접종 직후, 적절한 처치(가령 항-DLL4 항체, 10 ㎍/㎖ 첨가)가 있었고, 플레이트를 37℃/5% CO₂에서 24시간 동안 항온처리하였다. 항온처리가 완료된 후, RIPA 완충액에서 세포를 수확하였다. B-멀캅토에탄올 및 브로모페놀 블루를 포함하는 4×시료 완충액을 첨가하였고, 시료를 70℃에서 5분간 가열시키고, 4-12% NuPAGE 겔/MOPS 완충액(Invitrogen catalog # NP0001)에 로딩하였다. 니트로셀룰로오즈로 전기영동적 이동후에, 블랏은 5% 우유를 포함하는 PBST에서 1시간 동안 차단되었고, 절단된 항-Notch1 (Cell signaling technology, catalog #2421) 또는 GAPDH (Advanced Immunochemical, clone 6C5, catalog #2-RGM2) 항체를 5% 우유를 포함하는 PBS에서 차례로 1:1000 또는 1:10,000 희석하여 항온처리하였다. 4℃에서 하룻밤동안 오비탈 쉐이크상에서 항온처리한 후, PBST으로 블랏을 세척한 후, 5% 우유를 포함하는 PBST에서 1:2000으로 희석된 항-마우스-HRP 2차 항체 (Cell signaling Technology, catalog #7072)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBST로 세척한 후, Pierce Pico (catalog #34080; GAPDH) 또는 Femto (catalog #34075; 절단된 Notch1) 기질 시약을 이용하여 블랏을 발달(develop)시키고, 결과는 ChemiGenius 기구에서 분석하였다. 이들 연구로부터 수득된 결과에서, HUVEC 세포에서 DLL4-자극된 Notch 신호생성을 항-DLL4 항체가 차단시킬 수 있다는 것이 설명되었다(데이타를 제공하지 않음).

[표 18] N/A= 이용가능하지 않음. N.T.=테스트되지 않음.

실시예 9

시험관에서HUVEC 세관 형성에 대한DLL4 항체의 효과

시험관내 공동-배양 분석(가령, TCS Cell Works Cat no. ZHA-1000)으로 내피 세포 세관(tube) 형성을 감소시키는 능력에 대해 DLL4 저해성 항체를 테스트하였다. 인간 제정맥(Umbilical Vein) 내피세포(HUVECs)와 인간 배수염색체 섬유아세포를 24개 웰 플레이트 (TCS Cell works Cat no. ZHA-1000)에서 공동 배양으로 수득하거나 또는 다음과 같이 플레이트를 제조하였다: 37℃/5% CO₂에서 4시간 동안 24개 웰 조직 배양 플레이트에 콜라겐(증류수에서 1:10 희석; Sigma, catalog #C8919)을 피복하였다. PBS로 세척한 후, 섬유아세포(가령, Promocell #C-12300)를 FGM (Promocell #C-23010)에서 웰당 15000개 세포 농도로 첨가하였다. 37℃/5% CO₂에서 3일간 항온처리한 후, 플레이트로부터 배지를 제거하고, HUVEC 세포를 웰당 30,000개 세포 농도(EGM2 (Promocell #C-22111))로 첨가하였다. 37℃/5% CO₂에서 추가 4일간 항온처리한 후, 플레이트는 바로 사용할 수 있는 상태로 간주하며, 분석을 위하여 이 플레이트는 1일 시점으로 간주되었다. DLL4 차단 항체는 1일 시점에 배양물에 도입되었으며, 11일 기간동안 규칙적인 시격으로 20㎍/㎖ 내지 0.027 ㎍/㎖의 농도 범위에서 도입되었다. 4일, 7일, 그리고 9일 시점에 배지를 보충하였다. 공동-배양 모델은 TCS 최적화된 배지(공동-배양 분석과 함께 공급됨) 또는 2% 태아 송아지 혈청(FCS), 1% 글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 MCDB131 배지 (이하 “2% FS MCDB131 배지”로 통칭함)에 유지되었다. 공동-배양 모델은 가습된 5% CO₂/95% 대기, 37℃에서 유지되었다. 세관 착색 키트(TCS Cell Works catalog #ZHA-1225)를 제조업자의 지시에 따라 이용하여 CD31에 대한 세관의 고정 및 착색 후 11일 시점에서 세관(tubule) 형성을 검사하였다. 간략히 설명하면, 세포를 실온에서 30분 동안 얼음-냉각된 70% 에탄올로 고정시켰다. 세포를 차단한 후 실온에서 60분간 항-인간 CD31으로 처리하였다. 플레이트를 세척하였고, 알칼리 포스포타제(AP)로 콘쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG로 실온에서 60분간 처리하였다. AP-콘쥬게이트된 2차 항체로 항온처리한 후, 플레이트를 세척하고, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 포스페이트/니트로 블루 테트라졸리움(BCIP/NBT) 기질을 약 10분동안 첨가하였다. 10분이내에 짙은 자주색이 발생되어 세관 형성이 되었음을 반영하였다. 플레이트를 그 다음 세척하였고, 대기중에서 건조되도록 두었다. Zeiss KS400 3.0 Image Analyzer를 이용하여 전체 세포 이미지 분석법으로 세관 성장의 정량화를 실시하였다. 정량법에 측정되는 형태학적 매개변수는 전체 세관 길이였다. 일부 실험에서, 세관에서 분기수도 평가되었다. 가장자리 인위적 수축을 피하기 위하여 100㎛ 깊이의 가장자리를 제외하고 24개 각 웰내에서 모든 세관 형성을 측정하였다.

도 2에서 설명된 것과 같이, 시험관내 내피 세포 세관 형성의 저해에서 이들 항체는 효과적인 것으로 관찰되었다. 더욱이, 이 분석에서 몇 가지 항체의 효능이 측정되었다. 이들 데이터는 표 19에 요약되어 있다. 이와 함께, 데이터에서 항체는 맥관 형성 과정을 모형화한 기능 분석에 활성이 있는 것으로 나타났다.

[표 19]

실시예 10

정제된 항체의 결합 친화력 측정

FACS 및 BIAcore 기술을 이용하여 DLL4에 대한 정제된 항체의 결합 친화력을 평가하였다. FACS 친화력 측정을 위하여, 인간 또는 필리핀 원숭이 DLL4를 과다발현시키는 HEK293 세포를 웰당 약 85,000-104,000개의 세포 농도로 접종하였고, 4℃에서 5시간 동안 정제된 항체의 적정(titrations)과 함께 항온처리하였다. 그 다음 세포를 세척하였고, 4℃에서 30분간 염소 항-인간 IgG-Fc-Cy5 + 5 ㎍/㎖ 7-아미노-악티노마이신(7AAD)과 함께 항온처리 하였다. FACS 분석을 이용하여 결합된 DLL4를 탐지하였고, 데이터는 다음의 식에 따라 피팅하였다(Drake &Klakamp, 2007, J.Immunol. Methods, 318, 157-162forderivation):

F = P'

이 식에서, F=평균 형광, L_T=전체 분자 mAb의 농도, P'=결합된 mAb에 임의의 형광 단위와 관련된 비례 상수, M=세포 몰 농도, n=세포당 수용체의 수, B=배경 신호, 그리고 K_D=평형 해리 상수. 각 mAb 적정 곡선의 경우, K_D에 대한 평가는 P'로 수득되며, n, B, 및 K_D는 비선형 분석에서 자유로이 변동되는 것이 허용된다. 표 20에서는 상기에서 설명된 방법을 이용하여 유도한 인간 및 필리핀 원숭이 DLL4에 대한 항-DLL4 항체의 친화력 평가를 요약하였다.

Biacore 분석에서, 각 정제된 항-DLL4 항체를 표준 아민 커플링을 이용하여 T100이내에 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 고정 수준은 200 RU 이하로 유지시켰다. UV-VIS 분광기에서 280 nm에서 110,440 M^-1㎝^-1의 몰 흡수도를 이용하여 DLL4의 농도를 측정하였으며, 이는Paceetal. (G. R. Grimsleyand C. N.Pace (2003) inCurrentProtocolsinProteinScience (JohnWiley &Sons,Inc.), 3.1.1-3.1.9)에 의해 개발된 방법을 이용하여 단백질의 서열로부터 계산되었다. 항원 DLL4 (R&D systems; 인간 catalog #1056-D4-050 또는 마우스, catalog #1389-D4-050)을 32-64 nM의 출발 농도로 희석하였고, 3중으로 3배 연속 희석하여 테스트하였다. 러닝 완충액은 HBS-P과 0.1 mg/㎖ BSA를 포함하고 있으며, 결합 반응은 23℃에서 수거하였다. 10 mM의 수산화나트륨의 15s 펄스로 결합된 복합체를 재생시켰다. 간단한 1:1 상호작용 모델로 반응 데이터를 전체적으로 피팅시켰으며, 표 20에는 인간 가용성 DLL4에 결합하는 것을 평가하였을 때, 항-DLL4 항체에서 수득된 k_a, k_d, K_D예상치가 요약되어 있다. 또한, BIAcore를 이용하여, 21H3, 21H3RK 및 4B4의 가용성 마우스 DLL4에 대한 친화력 평가치 또한 생성하였다: IgG 포맷의 모든 항체는 가용성 마우스 DLL4에 대해 360nM 또는 이 미만의 친화력을 보유하였다.

[표 20] N.T. 테스트되지 않음

[표 21]

실시예 11

FACS 분석을 통하여DLL4에 대한 교차-경쟁의 측정

FACS 분석을 이용하여 인간 DLL4에 다른 DLL4 항체가 결합하는 것을 정제된 DLL4 항체가 방해하는 능력을 평가하였다. 간단히 설명하면, 제조업자의 지시에 따라 시판되는 라벨링 키트(가령, Molecular Probes catalog #A30009, A-20186)를 이용하여 항체에 Alexa-647을 바로 라벨링시켰다. 교차-경쟁 수준을 측정하기 위하여, 2% FCS를 포함하는 PBS로 희석된 비-라벨링된 항-DLL4 항체(최종 농도:10-0.01 ㎍/㎖)를 DLL4-발현시키는 HEK 293 세포(실시예 6에서 설명됨, 2% FCS를 포함하는 PBS로 웰당 50000 세포로 희석됨)에 첨가하였고, 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, Alexa-647 라벨링된 항-DLL4 항체를 최종 농도가 0.1 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였고, 플레이트를 4℃에서 추가 1시간 동안 항온처리한 후, 세척하고, FACSCalibur 기구에서 판독하였다. 도 3에는 인간 DLL4에 결합하기 위하여 라벨링된 21H3RK와 경쟁하는 비-라벨링된 항체(10, 1, 0.1 ㎍/㎖)의 능력을 요약한 데이터가 포함된다. 표 22에는 인간 DLL4에 결합하기 위하여 라벨링된 21H3RK 및 4B4와 경쟁하는 비-라벨링된 항체들의 능력을 요약한 데이터가 포함된다.

또한, 표준 기술을 이용한 웨스턴 블랏을 통하여 재조합 DLL4 (R&D systems, catalog #1506-D4-050/CF) 및 HEK293 세포에서 발현된 고유 DLL4를 탐지하는 항체들의 능력 또한 측정하였다. 간략하게 설명하면, DLL4를 발현시키는 HEK293 세포를 프로테아제 억제제 칵테일 테블릿(Roche, catalog #11873580001) 1개와, 제조업자의 지시에 따라 BCA 단백질 분석(Pierce, catalog #23227)을 이용하여 정량화된 단백질을 포함하는 RIPA 완충액(Thermo, catalog #89900)에서 수확하였다. 웨스턴 블랏팅을 위하여, 단백질 시료를 얼음 위에서 해동시키고, 2분간 100℃에서 항온처리한 후, 10×Nupage 시료 환원제(Invitrogen, catalog #NP0004)와 4×시료 완충액을 첨가하고, 사전-주형된 4-12% NuPage BisTris 겔(Invitrogen, catalog #NP0321BOX)에 MES 완충액(Invitrogen, catalog #NP0002)을 이용하여 로딩시켰다. 니트로셀룰로오즈로 전기영동적 이동 후, Tris-완충염(100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5)-5% 우유를 포함하는 0.05% Tween 20 (TBST) 포함-에서 1시간 동안 블랏을 차단시키고, 그 다음 9G8, 2H10, 21H3, 4B4 또는 20G8 (모두 2 ㎍/㎖) 또는 시판되는 항-DLL4 항체 (R&D Systems, catalog #MAB1389; Abcam, catalog #ab7280, 모두 1 ㎍//ml)와 함께 5% 우유를 포함하는 TBST에서 항온처리하였다. DLL4에서 오비탈 쉐이크 상에서 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리한 후, TBST로 블랏을 세척한 후, 항-쥐, 항-토끼 또는 항-인간-HRP-콘쥬게이트된 2차 항체(Jackson Immunochemicals, catalog #112-035-003 및 111-035-003, 1:20,000 희석 또는 KPL, catalog #074-1006, 1:10,000 희석)와 5% 우유를 포함하는 TBST에서 실온, 1시간 동안 항온처리하였다. 상기에서 설명된 것과 같이 세척을 통하여 과량의 항체를 제거하였고, 면역복합체는 제조업자(Pierce, catalog #34076)의 지시에 따라 강화된 화학발광 탐지를 통하여 볼 수 있었으며, 그리고 Hyperfilm ECL (Amersham, catalog #28906839) 또는 Biomax MR (Kodak, catalog #8952855) 필름상에서 탐지되었다. 결과에서, 이와 같은 조건들하에서 재조합 및 고유 DLL4 모두다 시판되는 항체들과 9G8/2H10에 의해서 탐지될 수는 있지만, 21H3/20G8 또는 4B4에 의해서는 탐지될 수 없으며, 이는 이들 항체들이 DLL4상에 상이한 에피토프와 상호작용할 수 있다는 것을 말한다(데이터 제공되지 않음).

[표 22]

실시예 12

9G8 및 2H10에 서열 변형

면역글로블린 유전자들은 면역 반응이 성숙되는 동안 V, D 및 J 유전자 단편들의 재조합, 이소타입 전환(switching), 그리고 가변 부위에서 초돌연변이(hypermutation)를 포함하는 다양한 변형을 겪는다. 재조합 및 체세포 초돌연변이는 항체 다양성 및 친화력 성숙을 위한 기초가 되기도 하지만, 또한 이와 같은 면역글로블린을 치료제로 상업적으로 생산하는 것을 어렵게 만들거나 항체의 면역원성 위험을 증가시키게 만드는 서열 책임(liabilities)을 만들 수도 있다. 일반적으로, CDR 부위의 돌연변이는 개선된 친화력 및 기능에 기여하는 것으로 보이며, 프레임워크 부위들의 돌연변이는 면역원성 위험을 증가시킬 수 있을 것이다. 이와 같은 위험은 프레임워크 돌연변이를 생식계열로 되돌림으로써 감소될 수 있는데, 항체의 활성은 불리하게 영향을 받지 않는다. 일부 구조적 책임은 다양화(diversification) 프로세스에 의해 발생될 수도 있거나, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 기여하는 생식계역 서열내에 존재할 수도 있다. 소스에 무관하게, 산물의 불안정성, 응집, 이질성 또는 증가된 면역원성을 초래할 수도 있는 잠재적인 구조적 책임을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게 못한 책임의 예를 들면, 쌍을 이루지 않는 시스테인(이황화 결합 스크램블링 또는 가변 설퍼하이드릴 부가 생성물의 형성을 유도할 수 있음), N-링크된 글리코실화 부위(구조 및 활성의 이형성을 초래), 뿐만 아니라 아미드기능기 제거(가령 NG, NS), 이성체화(DG), 산화(노출된 메티오닌), 그리고 가수분해 (DP) 부위를 포함한다. 면역원성의 위험을 감소시키고, 리드(lead) 항체의 제약학적 특성을 개선시키기 위한 시도에서, 특정 변이체들을 만들었고, 결합 및 활성에 대해 테스트하였다. Stratagene Quick Change II 키트를 이용하여 제조업자가 설명하는 방식으로 부위 직접적인 돌연변이생성을 실시하였다. InVitrogen Freestyle 시스템에서 일과적인 형질변환(제조업자의 추천 과정에 준하여)에 의해 변이체 서열들을 발현시켰고, 단백질 A 친화력 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

두 가지 방법으로 돌연변이된 항체들의 활성을 평가하였다: 첫째, 실시예 3에서 설명된 것과 같이, HEK293 세포에서 안정적으로 발현된 인간의 전장 DLL4에 가용성 Notch1/Fc가 결합하는 것을 차단시키는 항체들의 능력을 측정하였고, 둘째, 수용체-리간드 경쟁 연구에서 이용된 동일한 세포계에 항체들의 결합을 측정하였다. 결합 연구를 위하여, 인간 DLL4를 안정적으로 발현시키는 HEK293 세포를 2% FCS를 포함하는 PBS에서 웰당 50,000개의 세포 농도로 재현탁시키고, 항체 역가(최종 농도 0.01-10 ㎍/㎖)와 함께 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 세척하였고, 4℃에서 30분간 0.31 ㎍/㎖ 항-인간 IgG-Fc-FITC (BD Pharmingen, cat#555786)과 함께 항온처리하였다. FACS 분석을 이용하여 결합된 DLL4를 탐지하였다. 이 연구 결과는 표 23에 요약되어 있는데, 이 표는 인간 DLL4에 결합하는데 있어서 Notch1와 경쟁하는 항체의 능력 또는 돌연변이안된 항체와 비교하여 인간 DLL4에 결합하는 항체의 능력에 있어서, 9G8 및 2H10의 서열에 특정 돌연변이 효과를 보여준다.

[표 23]

실시예 13

회전타원체-기반을 둔생체내 맥관형성 분석에서 맥관형성억제 효과의 평가

KorffandAugustin: J.Cell.Biol. 143: 1341-52, 1998이 설명한 바와 같이, 하룻밤동안 회전타원체 형성을 허용하도록 플라스틱 접시에 100개 내피 세포(EFC)를 한방울씩 떨어지도록 피펫팅하여 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC) 회전타원체를 제조하였다. 그 다음 날, 이미 설명된 방법을 이용하여(Alajatietal., NatureMethods 5:439-445, 2008), EC 회전타원체를 수확하였고, Matrigel/피브린 용액에서, 단일 HUVECs와 혼합하여 회전타원체로써 최종 수가 100,000개의 ECs 그리고 주사된 플러그당 200,000개의 단일 ECs 가 되도록 하였다. VEGF-A 및 FGF-2를 최종 농도가 1000 ng/㎖ 되도록 첨가하였다. 수컷 SCID 마우스(5-8 주령)의 피하로 세포/매트릭스 현탁액 500 ㎕를 주사하였다. 다음 날 (1일 시점) 처리를 시작하였다. 21일 시점에 연구를 종료하였다. 매트릭스 플러그를 제거하고, 4% PFA에 고정시켰다. 모든 매트릭스 플러그를 파라핀에 고정시켰고, 조직 검사를 위해 8-10 ㎛의 두께로 절단하였다. 혈관은 인간 CD34에 대해 착색하여 볼 수 있었고, 평활근 악틴(SMA), 맥관 밀도 및 혈관주위세포(pericyte) 범위를 측정하였다. IgG1 및 IgG2 항체들은 생체내에서 맥관 형성을 조절하고, 혈관주위세포 회복을 억제하는데 효과적이다. 수득된 데이터에 따르면, 항-DLL4 항체 (21H3RK 또는 4B4)로 처치하면 1 mg/kg와 같은 낮은 항체 농도에서도 처리안된 대조와 비교하였을 때, 인간 맥관 형성의 증가를 적어도 100% 유도한다는 것으로 본다. 또한, 인간 맥관 형성에서 이와같은 증가는 5 mg/kg의 항체 약량에서 혈관주위세포 범위의 최소한 50% 감소와 연관이 있었다(αSMA 발현에 양성인 세포와 연합된 인간 CD34 양성 맥관의 비율로 평가됨). 표 24는 1mg/kg, 0.2mg/kg 및 0.04 mg/kg에서 주당 2회 i.p.로 투약된 21H3RK IgG1의 효과를 요약한 데이터를 보여준다. 이와 함께, 이 데이터는 맥관형성 분석에서 항체가 활성을 가진다는 것을 나타낸다.

[표 24]

실시예 14

21H3RK의에피토프메핑

단클론 21H3RK 는 인간 DLL4에 특이적으로 결합하지만, 인간 DLL1은 인지하지 못한다. 이와 같은 특이성은 인간 DLL4에 대한 Mab 21H3RK의 결합 에피토프를 유추하는데 이용된다. DLL4의 세포외 도메인의 일부분이 DLL1의 대응 단편으로 대체되도록 키메라 변이체들을 조작하였다. 인간 DLL4 (Yoneya et al., 2001, J. Biochem., 129, 27-34, cloned in-house) 및 인간 DLL1 (accession # NMDll4005618, Origene, Md.)을 오버래핑 연장 PCR에 주형으로 이용하여 재조합 단백질들의 표면 발현을 위한 DLL4 막통과 도메인을 포함하는 일련의 변이체들을 작제하였다. 생성된 변이체들을 인간 사이토메갈로바이러스 주요 즉각 초기 (hCMVie) 인헨서, 프로모터 및 일시적 포유류 발현을 위한 5'-미해독 부위를 인코드하는 포유류 발현 벡터내로 클론시켰다. HEK293F 세포에서 Mab 21H3RK와 유세포분석(flow cytometric) 특징화를 위하여 막-결합된 단백질로써 키메라 변이체들은 일시적으로 발현되었다. 형질감염 48시간 후, HEK293F 형질감염체를 얼음위 PBS에서 1 ㎍/㎖의 Mab 21H3RK 와 함께 1시간 동안 항온처리하였고, 세척하였고, 그 다음 염소 항-인간 IgG-FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA)과 함께 항온처리하였고, LSRII 유세포분석기(BD Biosciences, CA)로 분석하였다. 모든 키메라 변이체의 발현 수준은 염소 항-마우스 DLL4 (인간 DLL4를 인지함) 및 염소 항-인간 DLL1 다클론항체의 혼합물(둘다 R&D Systems., MN의 제품)과 함께 항온처리하여 모니터하였고, 그 다음 돼지 항-염소 IgG-PE (Invitrogen, CA)로 탐지하였다.

인간 Dll1 및 Dll4은 아미노산 수준에서 53% 상동성을 공유하지만, Mab 21H3RK는 Dll4에 특이적으로 결합하지만, Dll1은 인지하지 못하였다. 이와 같은 특이성을 담당하는 부위를 확인하기 위하여 인간 Dll1의 작은 부위를 인코드하는 인간 Dll4의 키메라 변이체를 작제하였다. 인간 Dll4의 서브도메인을 인간 Dll1의 대응 잔기로 치환시켜 12개 키메라 녹아웃 변이체를 만들었다. 도 4에서는 DLL4의 세포외 부위가 구조적으로 한정된 서브 도메인으로 어떻게 나뉘어졌는가를 설명한다. 성숙한 DLL4 단백질의 큰 아미노 말단(N-ter)은 두 개의 더 작은 단편으로 나뉘었다. KO 변이체 N-ter 1은 성숙한 DLL4 단백질의 처음 86개 아미노산(AA)을 인간 DLL1으로 치환하였고, KO 변이체 N-ter 2는 아미노산 87-146을 인간 DLL1으로 치환하였다. 도면에 표시된 다른 녹아웃 변이체들은 다음의 DLL1 치환을 포함한다: 전체 N-말단 도메인 (AA 1-146), DSL 도메인 (AA 147-191), EGF1 도메인 (AA 192-224), EGF1 및 2 도메인들(AA 192-255), EGF3 및 4 도메인들 (AA 256-333), 그리고 4개의 EGF5-8 도메인들 (AA 334-503). 추가적으로 복합된 도메인 치환 변이체도 만들었다: N-말단 및 DSL 도메인들 (AA 1-191), N-말단 + DSL 및 EGF1-2 도메인들 (AA1-255), DSL 및 EGF1-2 도메인들 (AA 147-255), 그리고 DSL 및 EGF1 도메인들 (AA 147-224). 항-Dll4 및 Dll1 다클론 항체로 모니터하였을 때 세포 표면상에 모든 재조합 단백질들이 잘 발현되었으나(도 5, 두 줄의 상부 패널), Mab 21H3RK는 DSL 및 EGF1 인간 Dll1 도메인들 (도 5, 하부 패널)로 구성된 구조체들 중 어느 것도 인지하지 못하였다. 추가적으로, DLL4 DSL 및 EGF1 도메인들 (녹-인 돌연변이체)로 인코드된 Dll1 구조체는 Dll1에 Mab 21H3RK 결합을 부여하였다(도 6). 따라서, 21H3RK의 결합 에피토프는 DSL 및 EGF1 도메인들내에 위치한다.

단백질의 이 단편내에 결합 에피토프를 더 한정하고, Mab 21H3RK 결합 특이성을 맡고 있는 주요 잔기를 확인하기 위하여, 세 가지 추가적인 변이체를 만들었다. Dll4의 DSL 및/또는 EGF1 도메인들내에 15개 아미노산의 3개 단편 3은 대응하는 Dll1 잔기로 대체시켰다: 단편 A (AA 187-201), 단편 B (AA 200-214), 그리고 단편 C (AA 210-224)는 몇 가지 아미노산 치환체만을 인코드하고, 여기서 Dll1 및 Dll4 서열은 보존되지 않는다. 단편 A는 DSL 도메인의 마지막 5개 아미노산, DSL 및 EGF1 도메인 사이의 4개 아미노산 링커, 그리고 EGF1 도메인의 6개 아미노산의 범위를 가진다. 이들 15개의 아미노산을 Dll1 잔기로 치환시키면 Mab 21H3RK 결합을 상실하게 된다. 단편 B 와 C에서 Dll4 잔기를 Dll1으로 대체하였을 때 효과는 관찰되지 않았다. 이들 데이터로부터 DSL의 C-말단과 EGF1의 N-말단을 포함하는 15개 아미노산 (AA 187-201)이 결합에 중요하다는 것을 확인하였고, 21H3RK에 에피토프는 DSL의 C-말단 및 EGF1의 N-말단에 위치한 주요 부위(AA187-201)과 함께 DSL 및 EGF1 도메인(AA 147-224)로 메핑되었다.

실시예 15

FACS 분석에 의해DLL4내화시키는DLL4 항체의 측정

FACS 분석을 통하여 DLL4의 내화를 유도하는 정제된 항체들의 능력을 조사하였다. DLL4를 안정적으로 발현시키는 HEK293 세포를 해리시키고, FACS 완충액(PBS+2% FCS)에서 세척한 후, V-자 바닥의 플레이트에 웰당 50,000-100,000개의 세포로 도말하였다. 1차 항체(항-DLL4 또는 적절한 이소타입 기준)를 37℃의 따뜻한 FACS에서 최종 농도가 10 ㎍/㎖이 되도록 희석시키고, 조직배양기(37℃/5% CO₂)에서 30분, 60분, 120분 또는 240분동안 세포에 첨가하였다. 적절한 시점에서, 세포를 4℃로 미리 냉각시킨 원심분리기에서 500g에서 회전시키고, 냉각 FACS 완충액으로 세척시키고, FITC 라벨링된 항-인간 IgG 2차 항체 (1 ㎍/㎖, Jackson Labs, cat #109-096-098)와 함께 얼음위에서 10분간 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 4℃로 미리 냉각시킨 원심분리기에서 500g에서 다시 회전시키고, 냉각 FACS 완충액으로 세척시키고, 2% 파라포름알데히드로 20분간 고정시켰다. FACSCalibur 상에서 판독하여 내화를 평가하였다. 이와 같은 분석 조건하에서, 상기 시점에서 21H3RK의 10%>의 내화가 발생하였다. 또한 2차 항-인간 IgG 항체 대신, DLL4에 대한 비-교차 경쟁 항체로 항온처리하여 내화를 측정할 수 있다. 일부 실험에서, FACS 완충액으로 희석된 1차 항체 (10 ㎍/㎖)를 위에서 설명된 것과 같이 DLL4를 과다발현시키는 세포와 함께 얼음위에서 30분간 사전-항온처리하고, 37℃의 따뜻한 FACS로 세척하고, 조직배양기(37℃/5% CO₂)에서 30분, 60분, 120분 또는 240분 동안 세포를 항온처리하였다. 이와 같이 항온처리후, 세포를 세척하고, 제2항체와 함께 항온처리하였으며, 상기와 같이 고정한 후, FACSCalibur에서 판독하였다. 이와 같은 조건하에서, t=0 대조와 비교하여, 21H3RK 및 4B4에 대한 내화는 각각 t=60분 및 240분에서 <15% 및 <35% 으로 관찰되었다. 2차 항-인간 IgG 항체 대신 DLL4에 대한 비-교차 경쟁 항체와 항온처리하여, 상기 검사 조건하에 내화를 측정할 수도 있을 것이다.

실시예 16

맥관 형성에 대한 마우스MatrigelPlug 모델에서 항-DLL4 항체의 활성

맥관형성을 조절하는 항-DLL4 항체의 능력은 Matrigel 플러그 분석(plug assay)을 이용하여 평가할 수 있다. 이와 같은 분석에서, 맥관형성-유도 화합물들, 가령 bFGF, VEGF 또는 종양 세포를 액상 Matrigel로 도입시킬 수 있으며, 피하 주사 후, 고형화시켜, 내피 및 맥관 평활근 세포에 의한 침윤을 허용하고, 새로운 맥관 형성을 허용한다. 간단히 설명하면, 4℃에서 액상형의 Matrigel은 비이클 (가령, PBS) 또는 성장 인자/종양 세포(가령, LL2, MCF7, A431, Colo205, KNRK, Calu-6, SW620, Panc1)와 혼합할 수 있고, 암컷 마우스 129s1/Sv1mJ(6-8 주령, 그룹당 n=5 )의 하복부로 0.5㎖을 피하 주사하였다. 복막 주사를 통하여 1주일에 두 차례 항-DLL4 항체를 투여할 수 있다. 5-10일후, 인도적으로 동물들을 안락사시킬 수 있고, 맥관형성 평가를 위하여 플러그를 회수할 수 있으며, 이는 맥관 밀도의 조직학적 수치와 벽세포 범위(mural cell coverage)에 의해 결정될 수 있는데, 예를 들면, CD31 및 알파 평활근 악틴(αSMA) 면역착색 평가, 헤모글로빈 함량 측정 그리고 예를 들면, FITC-Dextran를 이용한 맥관 관류 측정이다. 항-DLL4 항체의 맥관형성을 조절하는 능력이 측정된다.

실시예 17

환자의 원발성 종양 시료로부터 인간 종양이종이식편 모델에서 항-DLL4 항체의 활성

본 실시예는 마우스에서 이형이식편으로 자랐을 때 원발성 환자 시료로부터 유도된 종양의 성장을 억제 또는 저지시키기 위하여 항-DLL4 항체의 사용을 설명한다. 간략하게 설명하면, 수용자 마우스는 이소플루란으로 의학적 마취 수준에 이를 때까지 흡입을 통하여 마취시킬 수 있다. 원발성 종양은 항생체 및 10% FCSi가 보충된 RPMI로 헹구어 내고, 그 다음 “슬러시 혼합물”을 만들기 위하여 외과용 메스를 이용하여 잘게 저미고, 이식에 적절한 용적으로 나눈다(가령, 300 mg의 종양은 4마리 마우스에 이식할 수 있을 것이다). 종양 혼합물은 13-가우지 암 이식편 투관침에 적재할 수 있다. 투관침의 샤프트에 종양 혼합물을 완전하게 채줘서 우측 옆구리를 통하여 피하로 삽입시키고, 복부 지방 패드 아래 내용물을 내려놓는다. 그 다음 마우스를 우리로 돌려보낸 후, 회복되는 것을 모니터할 수 있다.

제1계대에서, 통상 3-5마리 마우스에 원발성 종양 혼합물을 이식하였다. 종양이 800-1000㎣에 도달하면, 이를 잘라내어, 대략 3×3×3 mm 단편으로 절단하여, 5마리 마우스에게 마우스당 1개 단편씩 하위-계대시켰다. 나머지 종양 물질은 H&E 착색 및 DNA/RNA 추출에 추가하여 Recovery™ Cell Culture Freezing medium (Gibco, catalog 30 # 12648-010)에 보관한다. 계대 2를 넘긴 종양은 효과 연구용 이식물로 이용될 수 있다. 효과 실험에서, 1개 종량 단편을 각 동물에 이식한다.

종양 성장은 2개의 수직 직경을 측정하여 실행한다. 종양 측정 및 체중은 처치 개시후 2주간 매주 2차례 기록할 수 있다. 종양 용적 계산 식은 다음과 같다: (L×W²)/2.

DLL4 길항 항체는 용액으로 투약될 수 있다. 평균 종양 용적이 100-200㎣에 이르거나 종양 이식과 동일한 시점에서 치료를 시작할 수 있다. 치료 기간은 총 28일로 구성될 수 있다. DLL4 길항 항체는 예를 들면, 단일 물질로 또는 다른 물질과 복합하여, 5mg/kg/day, 10mg/kg/day 또는 20 mg/kg/day (ip, qd, 2×/wk)으로 투여될 수 있다. 종양 측정 및 체중은 처치 개시후 4주간 매주 2차례 기록할 수 있다. 환자의 시료로부터 단독으로 또는 복합하여 유도된 종양 이종이식편의 성장을 저해시키는 DLL4 항체의 능력을 측정하였다.

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SEQUENCE LISTING<110> AstraZeneca <120> TARGETED BINDING AGENTS DIRECTED TO DLL4 AND USES THEREOF 524<130> 103524<150> 61/098,673<151> 2008-09-19<160> 91 <170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 351<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 1caggtgctgc tgatccagtc tggcgccgag gtgaagaagc ctggcgcctc cgtccaggtg 60tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc aactacggcg tgatctgggt gcggcaggcc 120cccggccagg gcctggagta catgggctgg atctccgcct acaacggcaa caccaattac 180gcccagaagc tgcaggacag agtcaccatg acctccgaca cctccaccac caccgcctac 240atggaactgc ggtccctgcg gagcgacgac accgccgtgt actactgcgc cagagagctg 300ggctcctcct tcgactactg gggccagggc accctggtca ccgtctcctc a 351<210> 2<211> 117<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2Gln Val Leu Leu Ile Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Gln Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3<211> 327<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 3tcctacgagc tgacccagcc tccttccgtg tccgtgtccc ctggccagac cgcccggatc 60acctgctccg gcgacgccct gcctaagaag tacgcctact ggtatcagca gaagtccggc 120caggcccctg tgctggtgat ctacgaggac atcaagcggc cttccggcat ccctgagcgg 180ttctccggct cctcctccgg caccatggcc accctgacca tctctggcgc ccaggtggag 240gacgaggccg actactactg cttctccacc gacaactccg gcgaccactc cgtgtttggc 300ggcggaacaa agctgaccgt gctgggc 327<210> 4<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Ile Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser 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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72<211> 107<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 72Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 73<211> 117<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 73Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Ala Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74<211> 107<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 74Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 75<211> 124<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 75Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Pro Arg Ile Pro Val Thr Thr Glu Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76<211> 111<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 76Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Phe Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 77<211> 118<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 77Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Val Trp Phe Asp Gly Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Arg Ile Ala Ala Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 78<211> 106<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 78Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Glu Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Ser Ser Leu Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 79<211> 106<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 79Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Glu Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Ser Ser Leu Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 80<211> 122<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 80Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Arg Gln Gly Tyr Gly Gly His Pro Asp Val Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81<211> 122<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 81Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Ser Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gln Gly Tyr Gly Gly His Pro Asp Val Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82<211> 107<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 82Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Val Tyr Val 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Ala Val 85 90 95 Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 83<211> 108<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 83Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Val Tyr Val 20 25 30 Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile 35 40 45 Tyr Glu Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala 65 70 75 80 Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Ala 85 90 95 Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 84<211> 124<212> PRT<213> Mus musculus<400> 84Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Thr Pro Arg Ile Pro Trp Thr Thr Ala Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85<211> 111<212> PRT<213> Mus musculus<400> 85Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Phe Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Glu Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 86<211> 124<212> PRT<213> Mus musculus<400> 86Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Met Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Pro Arg Ile Pro Trp Thr Thr Ala Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87<211> 111<212> PRT<213> Mus musculus<400> 87Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Phe Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Glu Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 88<211> 124<212> PRT<213> Mus musculus<400> 88Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile His Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Val Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Pro Arg Ile Pro Trp Thr Thr Ala Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89<211> 111<212> PRT<213> Mus musculus<400> 89Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Tyr 20 25 30 Phe Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Glu Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 90<211> 78<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 90Val Ile Cys Ser Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Asn Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly 20 25 30 Asn Leu Ser Cys Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro 35 40 45 Ile Cys Leu Ser Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro 50 55 60 Ala Glu Cys Leu Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys 65 70 75 <210> 91<211> 15<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 91Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser Gly Cys His 1 5 10 15

Claims

200pM 미만의 K_D로 인간 DLL4에 결합;
필리핀 원숭이 DLL4와 교차 반응;
마우스 DLL4와 약하게 교차 반응;
필리핀 원숭이 DLL4에 거의 동등한 친화력으로 결합;
DLL1 또는 Jagged 1에 유의적으로 결합하지 않음;
대조(control)와 비교하였을 때, 2D 배양에서 HUVEC 세포 증식의 DLL4-매개 억제를 85% 이상 역전시킴;
대조와 비교하여 2D 배양에서 0.08 ㎍/㎖ 농도에서 HUVEC 세포 세관(tube) 형성을 50% 이상 억제시킴; 및
t=0 대조와 비교하여, 4시간 시점에서 50% 미만의 내화(internalization)를 나타냄의 특성들 중에서 하나 이상의 특성을 나타내며,
DLL4에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체가 포유류에서 종양 성장 및/또는 전이를 억제하는, 분리된 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 100pM 미만의 K_d로 DLL4에 결합하는, 분리된 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 서열 번호: 90의 연속 아미노산의 전체 특정 부위와, 적어도 3개의 아미노산 잔기로 된 적어도 하나의 아미노산 서열의 임의의 복합물을 포함하는 에피토프에 결합하는, 분리된 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 또는 21H3RK 중에서 어느 하나인, 분리된 항체.
(a) 표 2 또는 13에 나타낸 CDR3 서열;
(b) 표 2 또는 13에 나타낸 CDR1, CDR2 또는 CDR3 서열 중 어느 하나;
(c) 표 2 에 나타낸 가변 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열; 또는
(d) 표 2 에 나타낸 가변 중쇄 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 항체.
(a) 서열 번호 :6의 VH CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 6의 VH CDR1;
(b) 서열 번호 :6의 VH CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 6의 VH CDR2;
(c) 서열 번호 :6의 VH CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 6의 VH CDR3;
(d) 서열 번호 :8의 VL CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 8의 VL CDR1;
(e) 서열 번호 :8의 VL CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 8의 VL CDR2; 및
(f) 서열 번호 :8의 VL CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 8의 VL CDR3을 포함하고,
DLL4에 면역특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
제7항에 있어서, 상기 항체가,
(a) 서열 번호: 6의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
(b) 서열 번호: 8의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 분리된 항체.
항체 또는 이의 결합 단편이,
DLL4에 면역특이적으로 결합하고;
서열 번호: 6의 아미노산과 적어도 90%의 상동성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 90%의 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하며;
DLL4에 결합 활성을 갖는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
(a) 서열 번호 :30의 VH CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 30의 VH CDR1;
(b) 서열 번호 :30의 VH CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 30의 VH CDR2;
(c) 서열 번호 :30의 VH CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 30의 VH CDR3;
(d) 서열 번호 :32의 VL CDR1과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 32의 VL CDR1;
(e) 서열 번호 :32의 VL CDR2와 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 32의 VL CDR2; 및
(f) 서열 번호 :32의 VL CDR3과 동일한 아미노산 서열을 갖거나 이에 대해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기 치환을 포함하는 서열 번호: 32의 VL CDR3을 포함하고,
DDL4에 면역특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
제10항에 있어서, 상기 항체가,
(a) 서열 번호: 30의 VH CDR1, CDR2 및 CDR3; 및
(b) 서열 번호: 32의 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 분리된 항체.
항체 또는 이의 결합 단편이,
DLL4에 면역특이적으로 결합하고;
서열 번호: 30의 아미노산과 적어도 90%의 상동성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 번호: 32의 아미노산 서열과 적어도 90%의 상동성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하며;
DLL4에 결합 활성을 갖는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
항체가 서열 번호: 6을 포함하는 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호: 6은 표 9의 각 열(row)에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
항체가 서열 번호: 8을 포함하는 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호: 8은 표 10의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
항체가 서열 번호: 30을 포함하는 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호: 30은 표 5의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
항체가 서열 번호: 32를 포함하는 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호: 32은 표 6의 각 열에 표시된 생식계열 및 비-생식계열 잔기의 독특한 조합들 중 어느 하나를 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 단클론 항체인, 분리된 항체.
제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체가 완전한 인간 단클론 항체의 결합 단편인, 분리된 항체.
제18항에 있어서, 상기 항체가 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 dAb 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된, 분리된 항체.
DLL4에 결합하는 것에 대해 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 또는 21H3RK 중 어느 하나와 경합하는 단클론 항체.
항체 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 또는 21H3RK 중 어느 하나와, DLL4 상 동일한 에피토프에 결합하는 단클론 항체.
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181로 기탁된 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 경쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열;
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 중쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열; 또는
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9502로 기탁된 Mab2H10VHOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 중쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열 및 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-10181로 기탁된 Mab2H10VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 경쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상 또는 3개 이상을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 중쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열;
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516으로 기탁된 Mab9G8VLOPT1로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 경쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열; 또는
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9517로 기탁된 Mab9G8VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 중쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열 및 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9516으로 기탁된 Mab9G8VLOPT1로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 경쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 중쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열;
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9500으로 기탁된 Mab21H3VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 경쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열; 또는
ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9501로 기탁된 Mab21H3VH로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 중쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 중쇄 아미노산 서열 및 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-9500으로 기탁된 Mab21H3VLOP로 지정된 플라스미드에서 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 경쇄 CDR 중 하나 이상, 2개 이상, 또는 3개 이상을 포함하는 가변 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 항체 또는 이의 결합 단편.
제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 따른 항체를 인코드하는 핵산 분자.
악성 종양의 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계; 및
상기 동물에게 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 따른 항체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 악성 종양의 치료 방법.
제28항에 있어서, 상기 동물이 인간인, 방법.
제28항에 있어서, 상기 항체가 완전한 인간 단클론 항체인 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 및 21H3RK로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제22항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 악성 종양이 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위(복부)암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
비-종양성 질환의 치료가 필요한 동물을 선별하는 단계; 및
상기 동물에 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 따른 항체의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 비-종양성 질환의 치료 방법.
제32항에 있어서, 상기 동물이 인간인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 항체가 항체인 4B4, 2H10, 21F7, 12A1, 17F3, 9G8, 20G8, 21H3, 1E4, 3A7, 4B3, 1D4 및 21H3RK로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
제32항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 비-종양성 질환이 안구 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환 및 폐혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
악성 종양의 치료를 위한 제25항의 조성물의 용도.
제36항에 있어서, 상기 악성 종양이 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간세포(간) 암종, 갑상선 종양, 위(복부)암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 교아종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담즙(담관암), 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물의 용도.
비-종양성 질환의 치료를 위한 제25항의 조성물의 용도.
제38항에 있어서, 상기 비-종양성 질환이 안구 질환, 염증성 질환, 심혈관 질환 및 폐혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물의 용도.