KR20110035134A

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Publication number: KR20110035134A
Application number: KR1020090092712A
Authority: KR
Inventors: 이재휘; 곽병국; 강명주; 박정민
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2029-09-29
Also published as: KR101125232B1

Abstract

본 발명은 초상자성 산화철 나노입자(Superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIOs)를 고효율로 탑재한 생체적합성 고분자 미세구 및 이의 제조방법을 제공하며, 더욱 구체적으로는 초상자성 산화철 나노입자에 대해 95% 이상의 탑재 효율을 가지고, 초상자성 산화철 나노입자의 오랜 미세구 내 머무름 시간을 가지며, 구형의, 우수한 균일성을 가진 생체적합 고분자를 포함하는 미세구를 제조하는 방법을 제공한다.

초상자성 산화철 나노입자, 미세구, 고분자

Description

초상자성 산화철 나노입자 탑재 고분자 미세구의 제조 방법 {Preparation method for superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs)-loaded polymeric microspheres}

본 발명은 초상자성 산화철 나노입자 탑재 생체적합성 고분자를 포함하는 미세구의 제조 방법에 관한 것으로서, 생체적합성 고분자 용액과 초상자성 산화철 나노입자를 혼합하는 단계; 및 상기 용액을 유기용매 층 및 코아세르베이션 매질층의 혼합용매에 적하하여 미세구를 형성시키는 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하며, 상기 방법을 채택함으로써 초상자성 산화철 나노입자를 고효율로 미세구 내 탑재하는 것이 가능하다.

초상자성 산화철 나노입자는 마그네타이트(magnetite, Fe₃O₄) 또는 마그네마이트(magnemite, γ-Fe₂O₃) 등의 철 산화물로 구성된 중심부(core)와 덱스트란 유도체나 전분 등의 천연고분자, 또는 생체적합성 합성 고분자 표면 코팅층(surface coating layer)으로 이루어진 나노 크기의 입자이다. 초상자성 산화철 나노입자는 대표적인 자기공명영상장치의 나노 조영제로서 상자성체 조영제(Gd, Fe, Mn 등의 전이금속 이온)에 비하여 민감도가 뛰어나고 독성이 없으며 생체 안에서 빠르게 배출되는 특징을 갖고 있어 현재 전 세계적으로 널리 연구, 활용되고 있다. 또한 교류자장에서 열을 발생하는 특성을 이용하여 종양과 같은 특정 부위를 괴사시키는 온열요법(hyperthermia), 에피독소루비신(epidoxorubicin) 또는 미토잔트론(mitoxantrone) 등의 항암제와 물리적 결합하여 자기장을 이용한 약물전달 시스템(magnetic drug targeting), 표적성 약물 전달(drug targeting) 등의 다양한 진단, 치료 영역에 사용되고 있다.

다수(수십-수만)의 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 고분자 미세구는 단독의 초상자성 산화철 나노입자와는 다른 새로운 차원의 치료와 진단 도구(tool)로 활용될 수 있다. 초상자성 산화철 나노입자의 고분자 미세구 내 탑재는, 1) 체내로 투여된 미세구의 위치 추적 및 분해양상 관찰 기능을 부여하여 특정 부위에 이식, 주입된 미세구의 자기 공명 장비를 이용한 비침습적 관찰을 가능케 하며, 2) 다수의 초상자성 산화철 나노입자를 제한된 공간에 위치시켜 자기 공명 감수성 (magnetic susceptibility)를 현저히 증대시킬 수 있으며, 3) 초상자성 산화철 입자가 탑재된 미세구는 자체를 강력한 온열요법의 도구로 사용될 수 있다. 또한 4) 교류자장을 통한 미세구 내 탑재된 초상자성 산화철 나노입자의 열발생은 미세구의 파괴, 고분자 미세구의 유동성(fluidity)변화 기능을 부여하여 마이크로 입자 내 동시에 탑재된 약물에 대한 방출 조절 기능을 부여할 수 있으며, 5) 초상자성 산화철 나노입자의 경구용 조영제 사용에 있어 위액 내 산화철의 용해를 방지할 수 있다.

현재 자기 공명 감수성 증대, 위액 내 산화철의 용해를 방지 등의 목적으로 실록산(siloxane), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리락트산 (polylactic acid, PLA) 등으로 구성된 고분자 미세구 개발이 이루어졌으나 기술적 한계로 인해 탑재 수율이 낮으며 코팅물질의 비율에 비해 초상자성 산화철 나노입자의 비율이 낮은 단점이 있다. 특히 소수성의 합성 고분자를 근간으로 한 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 미세구 제작을 위해서는 초상자성 산화철 나노입자의 표면을 올레인산(oleic acid)와 같은 소수성의 물질로 치환하여야 하며, 유기용매의 배출이 필연적이라는 문제점을 가지고 있다.

이러한 문제점을 해결하고 다수(수십-수천)의 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 고분자 미세구 제작에 있어 산화철 나노입자의 미세구 내 높은 봉입 효율성과 방출 조절을 가능케 하는 기술 개발이 선행되어야 한다. 또한 생체 투여 후 재현성과 예측성을 수반하기 위해서는 미세구의 모양과 크기에 있어서의 균일성이 보장되어야 한다. 한편, 생체적합성 고분자 중 키토산은 β-(1-4)-연결D-글루코사민(탈아세틸화 유닛) 및N-아세틸-D-글루코사민(아세틸화 유닛)으로 이루어진 선형 다당류이다. 이러한 키토산은 천연에 풍부하게 존재하며, 생체적합성이 우수하고, 생분해성이며, 독성이 적어 의료 및 약학 분야에서 광범위하게 사용되고 있다. 하지만 이러한 친수성 생체적합성 고분자 내 다수의 초상자성 산화철 나노입자를 탑 재한 미세구 시스템은 아직 개발되어 있지 않다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 초상자성 산화철 나노입자를 고효율로 탑재한 단분산의 생체적합성 고분자를 포함하는 미세구의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 초상자성 산화철 나노입자의 미세구 내 머무름 기간을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 생체적합성 고분자 용액과 초상자성 산화철 나노입자를 혼합하는 단계 및 상기 용액을 유기용매 층 및 코아세르베이션 매질층의 혼합용매에 적하하여 미세구를 형성하는 단계를 거쳐 제조함으로써 초상자성 산화철 나노입자가 고효율로 생체적합성 고분자 중에 탑재되고, 그 분포가 균일하며, 미세구 내 장기간 체류 가능한 미세구를 제조할 수 있다.

본 발명은 이온겔화법을 이용하여 초상자성 산화철 나노입자를 포함하는 단분산의 생체적합성 고분자 미세구를 제조하는 방법을 제공하며, 구체적으로는 초상자성 산화철 나노입자의 봉입효율이 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상으로 고효율로 탑재되고, 초상자성 산화철 나노입자의 미세구 내 분포가 균일하며, 초상자성 산화철 나노입자가 2주, 구체적으로는 4주, 보다 구체적으로는 8주 이상의 우수 한 미세구 내 체류능을 가지도록 설계된 미세구 입자 플랫폼을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 생체적합성 고분자 용액과 초상자성 산화철 나노입자를 혼합하는 단계; 및 상기 용액을 유기용매 층 및 코아세르베이션 매질층의 혼합용매에 적하하여 미세구를 형성하는 단계를 포함하는 초상자성 산화철 나노입자 탑재 친수성 고분자 미세구의 제조방법에 관한 것이다.

상기 제조된 미세구 중의 초상자성 산화철 나노입자의 탑재효율은 90% 이상, 구체적으로는 95% 이상으로 매우 고효율로 탑재될 수 있으며, 초상자성 산화철 나노입자가 미세구 중에 장기간, 구체적으로 2주 이상, 보다 구체적으로 4주 이상 체류할 수 있다.

본 발명에서, 생체적합성 고분자 용액으로는 키토산, 키틴(chitin), 콜라겐(collagen), 알부민(albumin), 아미노산(poly(amino acid)), 셀룰로오스(cellulose), 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 헤파린, 히아루론산(hyarulonic acid), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose), 셀룰로오스 설페이트(Cellulose sulphate), 카라지난(Carrageenan), 폴리(락트산)(Poly(lactic acid)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)), 폴리(히드록시 부 티레이트)(Poly(hydroxy butyrate)), 폴리(e-카프로락톤)(poly(e-caprolactone)), 폴리(알킬렌 석시네이트)(poly(alkylene succinates)), 폴리아마이드(Polyamides), 폴리(오르쏘 에스테르)(Poly(ortho esters)), 폴리(시아노 아크릴레이트)(Poly(cyano acrylates)), 폴리포스파진(Polyphosphazenes), 폴리에틸렌(Polyethylene), 폴리(비닐 알코올)(Poly(vinyl alcohol)), 폴리(에틸렌 옥사이드)(Poly(ethylene oxide)), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트(Poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(Poly(methyl methacrylate)), 폴리(테트라플루오로에틸렌(Poly(tetrafluoroethylene)), 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxanes), 폴리(에틸렌 옥사이드-b-프로필렌 옥사이드(Poly(ethylene oxide-b-propylene oxide)), 폴리(비닐 메틸 에테르)(Poly(vinyl methyl ether)) 또는 폴리(N-알킬아크릴아마이드)(Poly(N-alkylacrylamides))와 같은 고분자를 용매에 혼합한 용액이 사용될 수 있으며, 당업자는 생체적합성 고분자의 종류에 따라 적절한 용매를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, 생체적합성 고분자 용액으로는 구체적으로 키토산이 사용될 수 있으며, 이 때 사용되는 키토산의 탈아세틸화도는 60% 이상, 보다 구체적으로는 60% 이상 90% 이하일 수 있다.

생체적합성 고분자로 키토산과 같은 산성 고분자가 사용되는 경우 구체적으로 산성 용액에 혼합하여 사용할 수 있다. 산성 용액으로는 초산, 염산, 황산, 질산, 젖산, 개미산, 글루타민산, 아크릴산, 프로핀산, 석신산, 수산, 호박산, 아스 코르빈산, 글루콘산, 주석산, 말레인산, 구연산, 글루타글리콜산, 아민산, 술폰산, 인산, 탄산, 구연산, 염소산, 주석산, 말산, 스테아르산, 옥살산, 과염소산 또는 인산 등이 사용될 수 있으며, 이들 산성 용액은 0.5-10%(v/v)의 농도로 사용될 수 있다. 초상자성 산화철 나노입자와 생체적합성 고분자 용액을 혼합하여 교반기(stirrer), 혼합기(mixure), 호모게나이져(hogenizer) 등을 이용하여 수십-수만 rpm에서 산화철 나노입자를 균일하게 혼합할 수 있다.

본 발명에 따른 초상자성 산화철 나노입자를 함유하는 미세구 제조 시 분자량이 약 2만 미만인 경우에는 입자 형성이 원활치 않게 될 염려가 있다.

생체적합성 고분자의 점도는 2-100cps의 범위, 구체적으로는 5-90 cps 범위, 보다 구체적으로 5∼20 cps 범위이다.

생체적합성 고분자 용액의 농도는 0.5%-10.0%(w/v) 범위， 구체적으로 1.0-3.0%(w/v) 범위이다. 상기한 범위를 현저히 상위하는 경우, 구형체의 비드가 만들어지지 않을 우려가 있으며 현저히 하위하는 경우 입자의 세기가 약하여 보관, 색전 과정 동안 입자가 깨질 우려가 있다.

본 발명에 사용되는 초상자성 산화철 나노입자의 경우, 통상의 초상자성 산화철 나노입자의 크기는 10-300 nm 이하의 크기로 미세구(수 - 수천 μm)의 크기에 비해 매우 작기 때문에 초상자성 산화철 나노입자의 크기는 큰 제한이 되지 않는다.

본 발명의 미세구는 산화철 나노입자를 코팅제로 코팅하는 단계를 추가로 포함하여 제조될 수 있다.

초상자성 산화철 나노입자의 코팅제로는 친수성, 소수성 코팅 물질에 국한 되지 않으나 구체적으로는 시트르산, 덱스트란, 폴리카르복시메틸 덱스트란, 전분, 폴레이텔린 글리콜, 알부민, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 실리카, 실란, 키토산, 키틴(chitin), 콜라겐(collagen), 알부민(albumin), 폴리(아미노산)(poly(amino acid)), 셀룰로오스(cellulose), 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 헤파린, 히아루론산(hyarulonic acid), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose), 셀룰로오스 설페이트(Cellulose sulphate), 카라지난(Carrageenan), 폴리(락트산)(Poly(lactic acid)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)), 폴리(히드록시 부티레이트)(Poly(hydroxy butyrate)), 폴리(e-카프로락톤)(poly(e-caprolactone)), 폴리(알킬렌 석시네이트)(poly(alkylene succinates)), 폴리아마이드(Polyamides), 폴리(오르쏘 에스테르)(Poly(ortho esters)), 폴리(시아노 아크릴레이트)(Poly(cyano acrylates)), 폴리포스파진(Polyphosphazenes), 폴리에틸렌(Polyethylene), 폴리(비닐 알코올)(Poly(vinyl alcohol)), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트)(Poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(Poly(methyl methacrylate)), 폴리(테 트라플루오로에틸렌)(Poly(tetrafluoroethylene)), 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxanes), 폴리(에틸렌 옥사이드-b-프로필렌 옥사이드)(Poly(ethylene oxide-b-propylene oxide)), 폴리(비닐 메틸 에테르)(Poly(vinyl methyl ether)) 및 폴리(N-알킬아크릴아마이드)(Poly(N-alkylacrylamides))와 같은 친수성의 고분자 코팅제를 사용할 수 있다.

초상자성 산화철 나노입자의 키토산 미세구 내 농도는 혼합단계에서 조절할 수 있으며 초상자성 산화철 나노입자는 코팅물질이 친수성의 물질일수록 키토산 미세구 내 균일하게 혼합하기 용이하나 poly(lactide-co-glycolide)(PLGA), 실리카(silica), 실란(silane)과 같은 소수성 고분자로 코팅된 초상자성 산화철 나노입자의 경우도 혼합단계에서 10,000 rpm이상의 높은 교반속도를 통해 키토산 용액 내 균일하게 분포시킬 수 있다.

본 발명에 제시하는 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 생체적합성 고분자 미세구 제조에 있어 생체적합성 고분자의 구성비는 10 이상 100%(w/w) 미만, 보다 구체적으로는 40 이상 100%(w/w) 미만이며, 이를 현저히 벗어난 낮은 농도에서는 이온겔화 과정을 이용한 입자 형성 단계에서 입자가 형성되지 않거나 불규칙한 모양의 입자가 형성될 우려가 있다.

본 발명에 제시하는 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 생체적합성 고분자 로 구성된 고분자 미세구 제작에 있어 미세구의 직경은 5∼1000㎛의 범위, 5∼50㎛의 범위, 또는 50∼150㎛의 범위, 1 또는 150∼250㎛의 범위, 또는 250∼350㎛의 범위, 또는 350∼500㎛, 500∼600㎛, 600∼700㎛, 700∼800㎛, 800∼1000㎛의 범위로 목적에 따라 크기를 조절하여 제조될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 미세구는, 그 장축 : 단축의 비가 1:0.9 내지 1.1, 구체적으로 1:0.95 내지 1.05인 구형이다.

본 발명은 구체적으로,

(a) 생체적합성 고분자 용액과 초상자성 산화철 나노입자를 균일하게 혼합하는 단계;

(b) 생체적합성 고분자 용액과 초상자성 산화철 나노입자 혼합물을 물과 섞이지 않는 유기용매 상층, 코아세르베이션(coacervation) 매질 하층으로 이루어진 혼합액으로 적하하여 미세구를 형성하는 단계;

(c) 형성된 미세구를 가교(Cross-linking)하는 단계;

(d) 반응하지 않고 남은 가교제를 아세톤과 증류수와 같은 용매로 세척하고, 동결 건조 또는 드라이 오븐, 실온 등의 조건에서 건조하는 단계를 포함하는 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 고분자 미세구의 제조방법을 제공한다.

상기 (c) 단계에서, 초상자성 산화철 나노입자를 혼합한 미세구의 가교는 합 성 가교제(synthetic crosslinking reagent)로, 포름알데히드(formaldehyde), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 디알데히드 전분(dialdehyde starch), 및 에폭시 화합물(epoxy compound) 등과 천연 가교제(naturally crosslinking reagent)로, 게니핀(genipin) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로 포름알데히드, 글루타르알데히드, 디알데히드 전분, 에폭시 화합물, 게니핀, 글루타르알데히드 글리옥살, 덱스트린 알데히드 글리옥살, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보이미드, 디사이클로헥실카보이미드, 1-에틸-3-(2-몰포리닐-4-에틸)카보이미드, 디이소시아네이트, 트리폴리포스페이트 나트륨염, 디아세트알데히드 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 스클레르알데히드(scleraldehyde), 디에틸스쿠아레이트 또는 에피클로로히드린과 같은 가교제를 사용할 수 있다.

게니핀은 안전성, 생체적합성, 가교 입자의 생체 내에서의 보다 느린 분해 속도를 갖는다. 가교 반응시 가교액의 농도 및 반응시간을 조절하여 가교 정도를 조절할 수 있으며 가교제의 종류에 따라 가교시간에 따른 가교 정도는 다양하게 할 수 있다.

상기 (b) 단계에서, 유기용매로는 C₄_-9 탄화수소, C₁₀_-30 지방족 알코올, C₁₀_-30 방향족 알코올, C₁₀_-30 지방족 에스테르, C₁₀_-30 방향족 에스테르, C₁₀_-30 지방족 에테르, C₁₀_-30 방향족 에테르, 아세톤, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 및 그 혼합용매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용매가 사용될 수 있으나, 이로 한정되지 않는다. 즉, 상기 초상자성 산화철 나노입자 분산 생체적합성 고분자 용액을 석유 에테르를 포함하는 물과 섞이지 않는 C₄_-9 탄화수소 및 그 이성질체, C₁₀_-30 지방족 및 방향족 알코올, C₁₀_-30 지방족 및 방향족 에스테르, C₁₀_-30 지방족 및 방향족 에테르, 케톤 류, 알데하이드 류, 에틸 에테르 류, 할로탄화수소 (halohydrocarbons) 류, 글라이콜 에테르 에스테르 류, 프탈레이트 (phthalate) 류, 에틸에테르 (ethyl acetate), 이소프로필 아세테이트 (isopropyl acetate), n-프로필 아세테이트 (n-propyl acetate), 이소부틸 아세테이트 (isobutyl acetate), n-부틸 아세테이트 (n-butyl acetate), 이소 부틸 이소부티레이트 (isobutyl isobutyrate), 2-에틸헥실 아세테이트 (2-ethylhexyl acetate), 에틸렌 글리콜 디아세테이트 (ethylene glycol diacetate), C9 아세테이트 (C9 acetate), C10 아세테이트 (C10 acetate), 메틸 에틸 케톤 (methyl ethyl ketone), 메틸 이소부틸 케톤 (methyl isobutyl ketone), 메틸 이소아밀 케톤 (methyl isoamyl ketone),메틸 n-아밀 키톤 (methyl n-amyl ketone), 디부틸 케톤 (diisobutyl ketone), 사이클로헥사논 (cyclohexanone), 이소포론 (isophorone), 알데하이드(acetaldehyde), n-부틸알데하이드 (n-butyraldehyde), 크로톤알데하이드 (crotonaldehyde), 2-에틸헥사알데하이드 (2-ethylhexaldehyde), 이소부틸알데하이드 (isobutylaldehyde), 프로피온알데하이드 (propionaldehyde), 에틸 3-에톡시프로피오네이트 (ethyl 3-ethoxypropionate), 토루엔 (toluene), 자일렌 (xylene), 1,1,1, 트리클로로에탄 (1,1,1 trichloroethane), 프로필렌 글리콜 모노메틸 에틸 아세테이트 (propylene glycol monomethyl ether acetate), 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 아세테이트 (ethylene glycol monoethyl ether acetate), 에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르 (ethylene glycol monobutyl ether acetate), 디에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르 아세테이트 (diethylene glycol monobutyl ether acetate), 디부틸 프탈레이트 (dibutyl phthalate), 이데틸 프탈레이트 (diethyl phthalate), 디메틸 프탈레이트 (dimethyl phthalate), 디옥틸 프탈레이트 (dioctyl phthalate), 디옥틸 테레프탈레이트 (dioctyl terephthalate), 부틸 옥틸 프탈레이트 (butyl octyl phthalate), 부틸 벤젠 프탈레이트 (butyl benzyl phthalate), 디옥틸 아디페이트 (dioctyl adipate), 트리에틸렌 글리콜 디-2-에틸헥사노에이트 (triethylene glycol di-2-ethylhexanoate), 트리옥틸 트리메틸리테이트 (trioctyl trimellitate), 글리세릴 트리아세테이트 (glyceryl triacetate), 글리세릴/트리프로피오닌 (glyceryl/tripropionin)과 2,2,4-트리메틸-1,3-펜타네디올 디이소부틸레이트 (2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrate) 및 그 혼합물 등의 물과 섞이지 않는 유기용매층이 사용될 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어, 코아세르베이션 매질의 하층을 형성하는 매질은 순수한 알칼리 수용액보다 C₁_-₅유기용매와 알칼리 수용액의 혼합물일 수 있으며, C_1-5유기용매는 비중이 0.9 이하일 수 있다. 구체적으로 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 아세톤과 알칼리 수용액의 혼합물일 수 있다.

C₁_-₅유기용매는 코아세르베이션 매질 상층과 하층 사이의 비중 차이를 줄여 유기 용액과 수용액 사이에서 액적이 통과되지 못하는 현상을 방지하는데 효과적이며, 결과적으로 구형의 미세구의 형성에 도움이 된다.

또는 그 낮은 분자량의 반대이온과의 피로인산염, 트리폴리인산염, 테트라폴리인산염, 옥타폴리인산염, 헥사메타인산염 및 높은 분자량의 반대이온과의 옥틸설페이트염, 라우릴설페이트염, 헥사데실설페이트염, 세틸스테아릴설페이트염과 지용성의 알지네이트, 카라지난 등이 단독으로 또는 혼합하여 사용될 수 있으며, 기타 FeCN, 폴리알데히드카르본산염, 염소염, 불소염, 탄산염, 질산염, 황산염, 인산염 또는 시안염 등 다양한 염이 사용될 수 있다.

상기 단계 (b)에서 적하가 100 내지 1000 ㎕/h의 속도, 구체적으로 200 내지 800 ㎕/h의 속도, 보다 구체적으로 300 내지 700㎕/h의 속도로 수행될 수 있다. 또한, 상기 단계 (b)에서 적하시 가스를 이용할 수 있으며, 가스로는 질소, 헬륨, 아르곤, 이산화탄소, 네온과 같은 비활성 기체 또는 산소, 수소, 공기가 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구 제작

키토산(약 85%가 디아세틸화 됨)을 1% (v/v) 아세트산 수용액에 용해시켜 1.5% (w/v) 농도의 키토산 용액을 제조하였다. 점성이 있는 상기 키토산 용액에 다양한 비율로 산화철 나노입자를 가하고 호모믹서를 이용하여 2000 rpm에서 혼합하였다. 산화철 나노입자의 퍼센트 비율(%, w/w)은 각각 0.01, 0.1, 1.0. 5.0, 10.0 mM이었다. 상기 키토산 용액 또는 키토산/초상자성 산화철 나노입자 용액은 1 ml 주사기에 충진되었고, 600 ul/h의 속도로 주사기로부터 방출됨과 동시에 질소 가스(0.2-1.5 kgf/cm²)로 코아세르베이션 매질(에탄올:20% (w/v) NaOH 수용액:석유 에테르=50:5:5 v/v)로 떨어졌다(도 1 참조). 석유 에테르 층을 거치며 입자는 계면 장력에 의해 고형의 형태로 변형되었으며 아래 수산화나트륨 수용액에서 코아세르베이트(coaceravated)되어 입자를 형성하였다. 미세구(45 mg)는 그 후 0.05% 게니핀(genipin) 에탄올 용액 10 ml에 분산되어 가교(cross-linking)되었다. 가교된 키토산 미세구는 그 후 남은 게니핀을 제거하기 위하여 에탄올로 세척되었고, 다시 아세톤으로 세 번 세척되었다. 세척된 미세구는 60℃로 건조되었다.

<실시예 2> 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구의 성상

제조된 키토산 미세구의 형태는 광학 현미경으로 평가되었다. 건조된 미세구는 매질에 가하고 완전히 팽윤된 미세구를 슬라이드 글래스 위에 놓고, 형태적 특징을 관찰하였다. 키토산 미세구의 크기 및 크기 분포는 이미지 분석 소프트웨어(Optimas 6.1, VSG, U.K.)에 의해 측정, 평가되었다.

(1) 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구의 크기 조절

SPIOs가 분산된 키토산 용액에 NaOH-기반 코아세르베이션 매질에 떨어뜨리는 과정에 있어 질소가스의 세기와 SPIOs가 분산된 키토산 용액를 주입하는 시린지의 내경을 조절하여 입자 크기를 조절하였다. 질소가스 세기 0.2-1.5 kgf/cm² 범위, 주사 바늘의 두께를 21-31G 사이로 조절함으로써 150 - 1200 μm 사이의 SPIOs 탑재 키토산 입자를 용이하게 제조하였다. 수득되는 입자의 크기분포는 평균입자경의 10% 내로 매우 균일함을 확인하였다.

(2) 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구의 모양

0.01-10.0 mM의 농도로 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구를 현미경으로 관찰하였다. 마이크로입자는 초상자성 산화철 나노입자 탑재 유무, 탑재량에 의해 영향을 받지 않았으며 공(blank)미세구와 더불어 매우 구형임을 확인하였다. 석유 에테르 층의 존재가 키토산의 입자를 구형으로 제조하는데 매우 긍정적인 역할을 담당하여 이는 유기 용매와 키토산 수용액 사이의 계면 장력이 매우 커서 구형 액적 형태를 변형시키려는 에너지를 극복하여 중력에 의해 입자의 모양이 타원형으로 도는 요인을 상쇄할 수 있었기 때문이다. 입자의 장축과 단축의 비는 1.03 이내의 진구형이었다.

<실시예 3> 초상자성 산화철 나노입자의 키토산 미세구 내 분포 양상 관찰

초상자성 산화철 나노입자 탑재 색전 미립구를 프루시안 블루(pruccian blue)로 염색하고 마이크로톰(microtome)을 이용하여 5 μm 두께로 절단한 후 절단면을 광학 현미경으로 관찰하였다. 프루시안 블루 염색을 통해 푸른색으로 염색된 산화철 입자들이 미립구 전반에 걸쳐 나타났으며 이를 통해 나노 입자가 미립구 내 고르게 분산되어 있음을 확인하였다.

<실시예 4> 초상자성 산화철 나노입자의 탑재효율 측정

유도결합플라즈마 발광법 (Inductively coupled plasma spectrometer, ICP)을 이용하여 SPIO를 정량적으로 분석하였다. 1-100 μg/ml의 철농도에 대해 259.940 nm 검출 파장에서 우수한 직선성 (R²=1) 검량선을 작성하고 샘플의 세기 (intensity)를 대입, 농도를 도출하였다.

초상자성 산화철 나노입자가 탑재된 키토산 미립구에 ICP용 염산을 가하여 60℃에서 2시간 동안 진탕하여 초상자성 산화철 나노입자를 철로 이온화하여 ICP-AES를 이용하여 측정하였다. 평가 결과 하기 <표 1>과 같이 0.1-10.0의 SPIOs 농도 범위에 대해 95% 이상의 매우 높은 탑재 효율을 가짐을 확인하였다. 이온겔화 기술을 통해 키토산을 신속히 고형화하였으며 이를 통해 키토산 용액 내 분산되었던 초상자성 산화철 나노입자가 이온겔화를 통해 형성된 네트워크 내 효율적으로 탑재할 수 있었다. 특히 친수성의 고분자로 코팅된 초상자성 산화철 나노입자의 경우 키토산 용액 내 분산성이 우수하고 키토산과 반발력이 적어 초기에 가해준 초상자성 산화철 나노입자의 95%이상이 탑재될 수 있었던 것으로 사료된다.

<표 1> 탑재 효율 측정 결과

샘플	탑재 효율 (%)
0.1mM SPIO-CS	97.3
1mM SPIO-CS	96.6
5mM SPIO-CS	95.5
10mM SPIO-CS	95.5

<실시예 5> 초상자성 산화철 나노입자의 키토산 미세구에서의 방출 평가

인공 체액 (simulated body fluid, pH 7.4)에서의 한달 동안 방출 양상을 관찰한 결과, 탑재된 초상자성 산화철 나노입자의 90% 이상이 키토산 미세구 내에 머 무르는 것으로 확인하였다. 오랜 기간 초상자성 산화철 나노입자가 키토산 미세구 내에 머무르게 함으로써 MR 추적을 비롯한 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 미세구의 활용에 있어 활용의 장기(long-term) 유용성을 제공한다.

도 1은 본 발명에 따른 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구의 제조 과정을 보여주는 도면이다.

도 2는 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구의 크기 조절 방법과 제조된 마이크로 입자를 광학 현미경으로 관찰한 사진이다. (a) 질소 가스의 세기와 시린지 바늘의 내경에 따른 입도 분포, (b) 다양한 농도의 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구 사진이다.

도 3은 초상자성 산화철 나노입자를 탑재한 키토산 미세구의 푸루시안 블루 염색 후 절단면의 사진이다. 푸른색으로 염색된 초상자성 산화철 나노입자가 키토산 입자 내 고르게 분산되어 있음을 알 수 있다.

도 4는 인공 체액에서 초상자성 산화철 나노입자의 키토산 미세구 내 방출 양상을 관찰한 것이다.

도 5는 탑재된 산화철 나노입자의 방출 실험 결과를 도시한 것이다.

Claims

(a) 생체적합성 고분자 용액과 초상자성 산화철 나노입자를 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 용액을 유기용매층 및 코아세르베이션 매질층의 혼합용매에 적하하여 미세구를 형성하는 단계를 포함하는 초상자성 산화철 나노입자 탑재 친수성 고분자 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
초상자성 산화철 나노입자의 탑재효율이 90% 이상인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
초상자성 산화철 나노입자가 미세구 중에 4주 이상 체류하는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
생체적합성 고분자 용액이 키토산, 키틴(chitin), 콜라겐(collagen), 알부민(albumin), 아미노산(poly(amino acid)), 셀룰로오스(cellulose), 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 헤파린, 히아루론산(hyarulonic acid), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose), 셀룰로오스 설페이트(Cellulose sulphate), 카라지난(Carrageenan), 폴리(락트산)(Poly(lactic acid)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)), 폴리(히드록시 부티레이트)(Poly(hydroxy butyrate)), 폴리(e-카프로락톤)(poly(e-caprolactone)), 폴리(알킬렌 석시네이트)(poly(alkylene succinates)), 폴리아마이드(Polyamides), 폴리(오르쏘 에스테르)(Poly(ortho esters)), 폴리(시아노 아크릴레이트)(Poly(cyano acrylates)), 폴리포스파진(Polyphosphazenes), 폴리에틸렌(Polyethylene), 폴리(비닐 알코올)(Poly(vinyl alcohol)), 폴리(에틸렌 옥사이드)(Poly(ethylene oxide)), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트(Poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(Poly(methyl methacrylate)), 폴리(테트라플루오로에틸렌(Poly(tetrafluoroethylene)), 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxanes), 폴리(에틸렌 옥사이드-b-프로필렌 옥사이드(Poly(ethylene oxide-b-propylene oxide)), 폴리(비닐 메틸 에테르)(Poly(vinyl methyl ether)) 및 폴리(N-알킬아크릴아마이드)(Poly(N-alkylacrylamides))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 생체적합성 고분자를 용매와 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
생체적합성 고분자 용액의 점도가 2 내지 100 cps인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
생체적합성 고분자 용액의 농도가 0.5 내지 10 w/v%인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
산화철 나노입자를 코팅제로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제7항에 있어서
코팅제가 시트르산, 덱스트란, 폴리카르복시메틸 덱스트란, 전분, 폴레이텔린 글리콜, 알부민, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 실리카, 실란, 키토산, 키틴(chitin), 콜라겐(collagen), 알부민(albumin), 폴리(아미노산)(poly(amino acid)), 셀룰로오스(cellulose), 아가로스(agarose), 알지네이트(alginate), 헤파 린, 히아루론산(hyarulonic acid), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose), 셀룰로오스 설페이트(Cellulose sulphate), 카라지난(Carrageenan), 폴리(락트산)(Poly(lactic acid)), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)), 폴리(히드록시 부티레이트)(Poly(hydroxy butyrate)), 폴리(e-카프로락톤)(poly(e-caprolactone)), 폴리(알킬렌 석시네이트)(poly(alkylene succinates)), 폴리아마이드(Polyamides), 폴리(오르쏘 에스테르)(Poly(ortho esters)), 폴리(시아노 아크릴레이트)(Poly(cyano acrylates)), 폴리포스파진(Polyphosphazenes), 폴리에틸렌(Polyethylene), 폴리(비닐 알코올)(Poly(vinyl alcohol)), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트)(Poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(Poly(methyl methacrylate)), 폴리(테트라플루오로에틸렌)(Poly(tetrafluoroethylene)), 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxanes), 폴리(에틸렌 옥사이드-b-프로필렌 옥사이드)(Poly(ethylene oxide-b-propylene oxide)), 폴리(비닐 메틸 에테르)(Poly(vinyl methyl ether)) 및 폴리(N-알킬아크릴아마이드)(Poly(N-alkylacrylamides))로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
제조된 미세구 직경이 5 내지 1000㎛인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
단계 (b) 이후,
(c) 형성된 미세구를 가교제로 가교하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제10항에 있어서
가교제가 포름알데히드, 글루타르알데히드, 디알데히드 전분, 에폭시 화합물, 게니핀, 글루타르알데히드 글리옥살, 덱스트린 알데히드 글리옥살, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보이미드, 디사이클로헥실카보이미드, 1-에틸-3-(2-몰포리닐-4-에틸)카보이미드, 디이소시아네이트, 트리폴리포스페이트 나트륨염, 디아세트알데히드 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 스클레르알데히드(scleraldehyde), 디에틸스쿠아레이트 및 에피클로로히드린으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
생체적합성 고분자 용액이 키토산 용액인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조 방법.
제12항에 있어서
키토산의 탈아세틸화도가 60% 이상인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제12항에 있어서
키토산 용액이 키토산을 산성 용매와 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
재14항에 있어서
산성 용매가 초산, 염산, 황산, 질산, 젖산, 개미산, 글루타민산, 아크릴산, 프로핀산, 석신산, 수산, 호박산, 아스코르빈산, 글루콘산, 주석산, 말레인산, 구연산, 글루타글리콜산, 아민산, 술폰산, 인산, 탄산, 구연산, 염소산, 주석산, 말산, 스테아르산, 옥살산, 과염소산 및 인산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
유기용매층이 C₄_-9 탄화수소, C₁₀_-30 지방족 알코올, C₁₀_-30 방향족 알코올, C₁₀_-30 지방족 에스테르, C₁₀_-30 방향족 에스테르, C₁₀_-30 지방족 에테르, C₁₀_-30 방향족 에테르, 아세톤, 아세토니트릴, 디에틸에테르, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 및 그 혼합용매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 층인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
코아세르베이션 매질층이 알칼리 수용액 또는 알칼리 수용액 및 C₁_-5 유기용매의 혼합 용매층인 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제17항에 있어서
알칼리 수용액이 수산화 이온(OH-)이 들어있는 용액이거나;
그 반대이온과의 염, 또는 이들의 혼합물이며,
여기에서 염은 피로인산염, 트리폴리인산염, 테트라폴리인산염, 옥타폴리인산염, 헥사메타인산염, FeCN, 지용성 알지네이트, 카라지난, 옥틸설페이트염, 라우 릴설페이트염, 헥사데실설페이트염, 세틸스테아릴설페이트염, 폴리알데히드로카르본산염, 염소염, 불소염, 탄산염, 질산염, 황산염, 인산염 및 시안염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제 1항에 있어서
단계 (b)에서 적하가 100 내지 1000 ㎕/h의 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제1항에 있어서
단계 (b)에서 적하시 가스를 이용하는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.
제20항에 있어서
가스가 질소, 헬륨, 아르곤, 이산화탄소, 네온, 산소, 수소 및 공기로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미세구의 제조방법.