KR20080106433A - Influenza Antigens, Vaccine Compositions and Related Methods - Google Patents
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Abstract
Description
Translated fromKorean본 출원은 USC 119(e) 35조하에 미국 출원 U.S.S.N. 60/773,378,(February 13, 2006 출원됨)(이하 '378 출원이라 칭함), 미국 출원 U.S.S.N. 60/813,955, June 15, 2006 출원됨)(이하 '955 출원이라 칭함)에 관계하며 이를 우선권으로 주장하고; '139 출원 및 '955 출원의 전문을 참고문헌으로 제출한다.This application is filed under U.S. Application U.S.S.N. 60 / 773,378 (filed February 13, 2006) (hereinafter referred to as the '378 application), U.S.S.N. 60 / 813,955, June 15, 2006) (hereinafter referred to as the '955 application) and claim this as a priority; The full text of the '139 application and the' 955 application is hereby incorporated by reference.
인플루엔자는 전세계적으로 유행처럼 번지며, 재발되며 급증하는 등의 특징을 가진 오랜 유래를 가진다. 인플루엔자 개발국가 및 선진국 모두에 동등하게 충격적일 수 있는 심각한 접촉성 질환이다. 인플루엔자 바이러스는 인간들에 위협을 주는 주요 요인중에 하나를 제공한다. 매년 백신 접종의 노력에도 불구하고, 인플루엔자 감염으로 인하여 실질적으로 질병 및 사망에 이르게 된다. 인플루엔자 전염은 거의 매년 발생되지만, 다행스러운 것은 광역적인 전염은 그렇게 흔히 일어나지는 않는다. 그러나, 최근에는 인플루엔자의 전염 가능성에 다시 직면하게 되는 인플루엔자 균주들이 출현하였다. 아시아 및 동유렵 일부 지역의 가금류에서 전염되는 H5NI3 타입의 조류 인플루엔자 바이러스는 전세계적으로 지속적으로 전파되고 있 다. 빠른 감염 및 조류에서 인간 개체로의 종을 교차한 감염은 인간군에서 발병 가능성 및 전염 위험을 증가시킨다. 바이러스는 매우 병원성이 크기 때문에 조류 및 일부 인간에서 확인된 경우 15%이상의 치사률을 가진다. 바이러스가 인간에서 인간으로 전염되는 경우에 신속하게, 광범위하게 질병이 전염되고 사망하게 될 가능성이 있다.Influenza has a long history of spreading, recurring, and surging around the world. It is a serious contact disease that can be equally shocking in both influenza developing and developed countries. Influenza viruses provide one of the major threats to humans. Despite the annual vaccination efforts, influenza infections lead to substantial illness and death. Influenza transmission occurs almost every year, but fortunately, widespread transmission is not so common. Recently, however, influenza strains have emerged which again face the possibility of influenza transmission. H5NI3 type avian influenza virus, which is transmitted from poultry in parts of Asia and Eastern Europe, continues to spread worldwide. Rapid infections and cross-species infections from birds to human subjects increase the likelihood of transmission and risk of transmission in human populations. The virus is so pathogenic that it has a mortality rate of more than 15% when identified in birds and some humans. When a virus spreads from human to human, there is a possibility that the disease can spread and die quickly.
인플루엔자에 대한 주요 방어 기작은 백신접종이다. 인플루엔자 바이러스들은 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)에 속하는 분절된 네가티드-가닥 RNA 바이러스이다. 바이러스성 항원은 매우 효과적인 이뮤노겐으로써 전신 및 점막 항체 반응을 유도시킬 수 있다. 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 당단백질 (HA)은 일반적으로 항체 중화 자극 및 백신 작제에 있어서 가장 중요한 바이러스성 항원이다. 바이러스성 뉴라미니다제(NA)의 존재가 바이러스에 대항하여 멀티-암(multi-arm) 보호성 면역 반응을 생성시키는데 중요한 것으로 확인되었다. 뉴라미니다제 활성을 저해시키는 항-바이러스가 개발되어 감염시에 추가적인 항-바이러스 치료가 될 수 있다. 인플루엔자 항바이러스 및 백신 개발에 유용한 것으로 간주되는 세 번째 성분은 이온 채널 단백질 M2이다.The main defense against influenza is vaccination. Influenza viruses are segmented negative-stranded RNA viruses belonging to Orthomyxoviridae. Viral antigens are highly effective immunogens that can induce systemic and mucosal antibody responses. Influenza virus hemagglutinin glycoprotein (HA) is generally the most important viral antigen in stimulating antibody neutralization and in vaccine construction. The presence of viral neuraminidase (NA) has been shown to be important for generating a multi-arm protective immune response against the virus. Anti-virals that inhibit neuraminidase activity have been developed and may be an additional anti-viral treatment upon infection. A third component that is considered useful for influenza antiviral and vaccine development is the ion channel protein M2.
인플루엔자 바이러스의 서브타입은 항원 쉬프트(shift)로 인한 상이한 HA 및 NA에 의해 지정된다. 또한 동일한 서브타입의 새로운 균주는 항원 드리프트(drift)로 인한 것이거나 또는 신규하고 상이한 에피토프를 생성시키는 HA 또는 NA 분자에 돌연변이로 인한 것이다. HA의 15가지 항원 서브타입이 설명되기는 하지만 이들 서브타입들중 세 가지 Hl, H2, H3만이 인간에서 광범위하게 순환된다. 선진국 및 개발도상국가에서 개선된 삶의 질을 추구함에 있어서 백신 접종이 최선의 방법이 되었다. 현재까지 이용가능한 백신의 주요성질은 관련 감염에 대해 보호할 수 있는 면역 반응을 유도하기 위해 감염 특징을 모방하는 기본 원리를 따르는 것이다. 그러나, 다양한 서브타입 및 복합물의 감소된 바이러스 생성은 시간이 많이 소요되고 비용도 상당히 든다. 신기술 개발 및 병원성의 분자 생물학의 심도있는 이해, 병원성 및 개인 면역계와 이들의 상호작용에 대한 이해로 백신 개발 및 운반에 새로운 접근 방법이 개발되었다. 따라서, 기술 발선으로 개선된 인플루엔자 항원 백신 조성물을 생산하는 능력이 개선되었으나, 최근의 새로운 서브타입 및 균주들을 해결하기 위한 백신 생산에 신규한 항원 및 백신의 추가 소스를 제공할 필요성은 여전히 존재한다. 비싸지 않은 그리고 접근성이 좋은 치료 조성물을 제공하기 위해 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 개선된 백신 고안 및 개발 및 이와 같은 조성물을 이용하고 만드는 방법이 필요하다.Subtypes of influenza viruses are designated by different HAs and NAs due to antigen shifts. Also new strains of the same subtype are due to antigen drift or due to mutations in HA or NA molecules that produce new and different epitopes. Although 15 antigen subtypes of HA are described, only three of these subtypes Hl, H2, H3 circulate extensively in humans. Vaccination has become the best way to pursue improved quality of life in both developed and developing countries. The main property of vaccines available to date is to follow the basic principle of mimicking infection characteristics to induce an immune response that can protect against the relevant infection. However, reduced virus production of various subtypes and complexes is time consuming and costly. The development of new technologies and an in-depth understanding of the molecular biology of pathogenicity, and understanding of the pathogenic and individual immune systems and their interactions have led to the development of new approaches to vaccine development and delivery. Thus, although the ability to produce improved influenza antigen vaccine compositions has improved with technology initiatives, there is still a need to provide additional sources of novel antigens and vaccines in vaccine production to address recent new subtypes and strains. There is a need for improved vaccine design and development for influenza virus subtypes and methods of using and making such compositions to provide inexpensive and accessible therapeutic compositions.
발명의 요약Summary of the Invention
본 발명은 식물에서 생산되는 인플루엔자 항원 및 백신 성분들을 제공하는 것이다. 본 발명은 열안정성(열안정성) 단백질과 융합된 형태로 생산되는 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 항원을 제공한다. 또한 본 발명은 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2가지 상이한 인플루엔자 항원을 포함하는 인플루엔자 백신을 제공한다. 일부 구체예에서 발명의 조성물에는 하나 또는 그이상의 식물 성분들이 포함된다. 또한, 본 발명의 항원 및 백신 조성물의 생산 및 이용하는 방법도 제시한다.The present invention is to provide influenza antigen and vaccine components produced in plants. The present invention provides one or more influenza antigens produced in fused form with thermostable (thermostable) proteins. The present invention also provides a vaccine composition comprising the influenza antigen. The present invention also provides an influenza vaccine comprising at least two different influenza antigens. In some embodiments the compositions of the invention include one or more plant components. Also provided are methods of producing and using the antigen and vaccine compositions of the present invention.
본 발명은 인플루엔자 감염에 대한 백신 조제에 유용한 인플루엔자 항원, 열안정성 단백질에 작용가능하도록 연결된 이와 같은 인플루엔자 항원을 포함하는 융합 단백질에 관계한다. 본 발명은 식물계에서 제공된 항원의 생산을 포함하나 이에 국한시키지 않은 생산 방법에 관계한다. 또한, 본 발명은 벡터, 융합 단백질, 식물 세포 및 본 발명의 항원 및 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관계한다. 또한, 본 발명의 백신 조성물을 개체로 투여하는 것으로 구성된 개체에서 인플루엔자 감염에 대항하는 면역 반응을 유도하는 방법에 관계한다.The present invention relates to fusion proteins comprising influenza antigens useful for vaccine preparation against influenza infection, such influenza antigens operably linked to thermostable proteins. The present invention relates to methods of production, including but not limited to the production of antigens provided in the plant kingdom. The invention also relates to vaccine compositions comprising vectors, fusion proteins, plant cells and antigens and fusion proteins of the invention. It also relates to a method of inducing an immune response against influenza infection in a subject consisting of administering the vaccine composition of the invention to the subject.
인플루엔자 항원Influenza antigen
본 발명의 인플루엔자 항원 단백질에는 인플루엔자 바이러스에 대항하는 면역 반응을 유도시킬 수 있는 임의 면역원성 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 일반적으로, 관심이 가는 면역원성 단백질에는 인플루엔자 항원(가령, 인플루엔자 단백질, 융합 단백질, 등), 이의 면역원 부분 또는 이의 면역원 변이체 및 이들의 일부 복합이 포함된다.Influenza antigen proteins of the invention include any immunogenic protein or peptide capable of inducing an immune response against influenza virus. In general, immunogenic proteins of interest include influenza antigens (eg, influenza proteins, fusion proteins, etc.), immunogen portions thereof, or immunogen variants thereof and some combinations thereof.
본 발명에 따라 이용할 수 있는 인플루엔자 항원에는 전장 인플루엔자 단백질 또는 인플루엔자 단백질의 단편들, 또는 전장 인플루엔자 단백질 또는 인플루엔자 단백질의 일부분을 포함하는 융합 단백질이 포함된다. 인플루엔자 단백질의 단편들을 이용하는 경우에, 단독 또는 융합 단백질로 이용하던 간에 이와 같은 단편들은 면역학적 활성(가령, 항-인플루엔자 항체들과 교차 반응성이 있는)을 보유한다. 바이러스 감염에 대항한 면역보호 반응을 유도하는 이들의 능력에 근거하여, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제는 백신을 생성시키는데 있어서 바람직한 1차 항원이다. 추가 항원 예를 들면 막 이온 채널 M2도 면역 보호 효과를 개선시키기 위한 백신 생산(가령, 복합 백신)에 유용할 수 있다.Influenza antigens usable in accordance with the present invention include full length influenza protein or fragments of influenza protein, or fusion proteins comprising part of full length influenza protein or influenza protein. In the case of using fragments of influenza protein, whether used alone or as a fusion protein, such fragments retain immunological activity (eg, cross reactive with anti-influenza antibodies). Based on their ability to induce an immunoprotective response against viral infections, hemagglutinin and neuraminidase are preferred primary antigens in producing vaccines. Additional antigens such as membrane ion channel M2 may also be useful for vaccine production (eg combination vaccines) to improve immune protective effects.
따라서, 본 발명은 식물 세포 및 이형성 단백질 인플루엔자 항원 (가령, 인플루엔자 단백질 또는 이의 단편, 인플루엔자 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질)을 발현시키는 식물을 제공한다. 본 발명의 이형성 단백질은 소요의 임의 인플루엔자 항원으로 구성되는데, 여기에는 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 막 이온 채널 M2 (M2), 헤마글루티닌 (HA)의 일부분, 뉴라미니다제 (NA)의 일부분 및 막 이온 채널(M2)의 일부분 또는 융합 단백질, 단편 또는 헤마글루티닌 (HA) 복합물, 뉴라미니다제 (NA), 막 이온 채널 M2 (M2), 헤마글루티닌 (HA)의 일부분, 뉴라미니다제 (NA)의 일부분 또는 막 이온 채널 M2의 일부분을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.Accordingly, the present invention provides plants that express plant cells and heterologous protein influenza antigens (eg, influenza proteins or fragments thereof, fusion proteins comprising influenza proteins or fragments thereof). The heterologous protein of the invention consists of any desired influenza antigens, including hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), membrane ion channel M2 (M2), a portion of hemagglutinin (HA) , A portion of neuraminidase (NA) and a portion or fusion protein, fragment or hemagglutinin (HA) complex of membrane ion channel (M2), neuraminidase (NA), membrane ion channel M2 (M2), A portion of hemagglutinin (HA), a portion of neuraminidase (NA), or a portion of membrane ion channel M2.
상이한 인플루엔자 HA, NA, M2 단백질(가령, 상이한 서브타입 또는 상이한 균주 또는 상이한 분리체)의 다양한 아미노산 서열이 당분야에 공지되어 있고, GenBank와 같은 데이터베이스에서 이용할 수 있다. 현재 특히 관심을 받은 두 가지 인플루엔자 서브타입의 HA 및 NA의 전장 단백질 서열 및 M2의 서열을 하기에 제공한다:Various amino acid sequences of different influenza HA, NA, M2 proteins (eg, different subtypes or different strains or different isolates) are known in the art and can be used in databases such as GenBank. The full-length protein sequence of HA and NA and the sequence of M2 of two influenza subtypes of particular interest at present are provided below:
V: Vietnam H5N1V: Vietnam H5N1
HA (HAV) SEQ ID NO.: 1HA (HAV) SEQ ID NO .: 1
AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHAKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTH
NGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFND
YEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIK
RSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQ
SGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGASGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA
INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQG
MVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLER
RIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELG
NGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSL
ALALMVAGLSL WMCSNGSLQCRICIALALMVAGLSL WMCSNGSLQCRICI
NA (NAV) SEQ ID NO.: 2:NA (NAV) SEQ ID NO .: 2:
MNPNQJGITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISJWYSUSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLMNPNQJGITIGSICMVTGIVS LMLQIGNMISJWYSUSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKL
AGNSSLCPINGWA VYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTAGNSSLCPINGWA VYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGT
VKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTS WLTIGISGPDNGA VA VLKYNVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTS WLTIGISGPDNGA VA VLKYN
GIITDTIKS WRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAGIITDTIKS WRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDA
PNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGT
GSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIGSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDI
VAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWS
WPDGAELPFTIDKWPDGAELPFTIDK
W: Wyoming H3N2W: Wyoming H3N2
HA (HAW) SEQ ID NO.: 3:HA (HAW) SEQ ID NO .: 3:
MKTIIALS YILCL VFSQKLPGNDNSTATLCLGHHA VPNGTIVKTITNDQIEVTNATEL VQSSSTMKTIIALS YILCL VFSQKLPGNDNSTATLCLGHHA VPNGTIVKTITNDQIEVTNATEL VQSSST
GG1CDSPHQ1LDGENCTLID ALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKA YSNCYPYDVPDYASLRSGG1CDSPHQ1LDGENCTLID ALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKA YSNCYPYDVPDY ASLRS
LVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSmSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSmSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPN
NEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRlSIYWNEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRlSIYW
TIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI
TYGACPRRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTTYGACPRRYVKQNTLKLAT GMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGT
GQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSY
NAELL VALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGNAELL VALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNG
TYDHD VYRDEALNNRFQTKGVELKSGYKDWIL WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRTYDHD VYRDEALNNRFQTKGVELKSGYKDWIL WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIR
CNICICNICI
NA (NAW) SEQ ID NO. : 4:NA (NAW) SEQ ID NO. : 4:
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYMNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVY
LTNTTIEKEICPKL AE YRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYLTNTTIEKEICPKL AE YRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCY
QFALGQGTTLNN VHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKA WLQFALGQGTTLNN VHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKA WL
HVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKAD
TKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSS
YVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGND VWMGRTISEKLRSGYEYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGND VWMGRTISEKLRSGYE
TFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLW
TSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPITSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
인플루엔자 Hong Kong M2 단백질 SEQ ID NO.: 5 :Influenza Hong Kong M2 Protein SEQ ID NO .: 5:
LTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
인플루엔자 단백질Influenza Protein
헤마글루티닌Hemagglutinin
특정 구체예에서, 전장 헤마글루티닌 (HA)을 본 발명의 백신 조성물에 이용한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그이상의 HA 도메인을 이용한다. 특정 구체예에서, 두 개 또는 그이상의 도메인을 이용하는데, 그 이유는 하나 또는 그이상의 융합 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 별개 폴리펩티드 또는 서로 연결되어 있기 때문이다. 특정 예시적인 구체예에서는 전장의 인플루엔자 항원, HA의 도메인 1-2 및 도메인 2-1 (HA1_2라고 칭함), 또는 HA의 도메인 3으로 구성된 인플루엔자 항원을 제공한다.In certain embodiments, full length hemagglutinin (HA) is used in the vaccine composition of the present invention. In some embodiments, one or more HA domains are used. In certain embodiments, two or more domains are used because they are linked to one or more separate polypeptides or to each other in one or more fusion polypeptides. Certain exemplary embodiments provide an influenza antigen consisting of the full length influenza antigen, domains 1-2 and HA 2-1 of HA (called HA1_2), or
HA Vietnam. [H5N I]: [0035] H5N 1 HA 시그날 펩티드 SEQ ID NO.: 6:HA Vietnam. [H5N I]:
AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKSAKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKS
H5N1 HA 도메인 1 -2 SEQ ID NO.: 7:H5N1 HA domain 1 -2 SEQ ID NO .: 7:
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL'DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL '
H5N1 HA 도메인 3 SEQ ID NO.: 33:
CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELK
HLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNN
TNQEDLLVL WGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMETNQEDLLVL WGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRME
FFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC
H5N1 HA 도메인 2-1 SEQ ID NO.: 8:H5N1 HA domain 2-1 SEQ ID NO .: 8:
NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAINTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAI
AGFIE GGWQGMVDG WYGYHHShJEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAAGFIE GGWQGMVDG WYGYHHShJEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEA
VGREFNNLERRJENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLVGREFNNLERRJENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRL
QLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYD YPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQIQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYD YPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
H5N1 HA 막통과 도메인 SEQ ID NO.: 9:H5N1 HA transmembrane domain SEQ ID NO .: 9:
LSIYSTVASSLALALMVAGLSLWMCSNGSLQCRICILSIYSTVASSLALALMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
HA A/Wyoming (H3N2)HA A / Wyoming (H3N2)
H3N2 HA 시그날 펩티드 SEQ ID NO.: 10: MKTIIALSYILCLVFSH3N2 HA signal peptide SEQ ID NO .: 10: MKTIIALSYILCLVFS
H3N2 HA 도메인 1-2 SEQ ID NO.: 11 :H3N2 HA domain 1-2 SEQ ID NO .: 11:
QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGIQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGI
H3N2 HA 도메인 3 SEQ ID NO.: 12:
CDSPHQILDGENCTLID ALLGDPQCDGFQNKK WDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVACDSPHQILDGENCTLID ALLGDPQCDGFQNKK WDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYA SLRSLVA
SSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKSSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEK
FDKL YIWGVHHP VTDSDQISLY AQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVFDKL YIWGVHHP VTDSDQISLY AQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIV
KPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKC
H3N2 HA 도메인 2-1 SEQ ID NO.: 13:H3N2 HA domain 2-1 SEQ ID NO .: 13:
NSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAlAGFIENNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLAT GMRNVPEKQTRGIFGAlAGFIEN
GWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSE
VEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYN AELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYN AELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDM
GNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHD VYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKD WILGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHD VYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKD WIL
H3N2 HA 막통과 도메인 SEQ ID NO.: 14:H3N2 HA transmembrane domain SEQ ID NO .: 14:
WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICIWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
특정 구체예에서, 전장(full length) 뉴라미니다제 (NA) 항원을 본 발명의 백신 항원으로 이용하였다. 일부 구체예에서 NA의 도메인을 이용한다. 특정 구체예에서 두 개 또는 드 이상의 도메인을 본 발명의 항원에 제공한다. 특정 예시적인 구체예에서는 엥커(anchor) 펩트드 서열이 결여된 전장 NA로 구성된 인플루엔자 항원을 제공한다.In certain embodiments, full length neuraminidase (NA) antigens were used as vaccine antigens of the invention. In some embodiments a domain of NA is used. In certain embodiments two or more domains are provided for an antigen of the invention. In certain exemplary embodiments, an influenza antigen consisting of full length NA lacking an anchor peptide sequence is provided.
뉴라미니다제Neuraminidase
NA VietnamNA Vietnam
H5N 1 NA 엥커 펩티드 SEQ ID NO.: 15:
MNPNQKIITIGSIC MVTGIVSMNPNQKIITIGSIC MVTGIVS
H5N1 NA SEQ ID NO.: 16:H5N1 NA SEQ ID NO .: 16:
LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKD
NSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEANSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEA
PSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES
ECACWGSCFTVMTDGPSNGQASHKJFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEITECACWGSCFTVMTDGPSNGQASHKJFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEIT
CVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGFCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGF
SFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHP
ELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDKELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
H3N2 NA 엥커 펩티드 SEQ ID NO.: 17 :H3N2 NA anchor peptide SEQ ID NO .: 17:
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFMNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHF
H3N2 NA SEQ ED NO.: 18:H3N2 NA SEQ ED NO .: 18:
KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFS
KDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELG
VPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKIVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKI
LRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPLRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYP
GVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGH
GVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYS
GIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPIGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
예시적인 인플루엔자 항원의 서열을 여기에서 제공하고, HA, NA, M2에 대한 각 도메인도 예시적인 균주들로 제공하나, HA, NA 또는 M2 도메인의 면역원성 특징을 보유하는 임의 서열을 대안으로 이용할 수도 있다. 당업자는 제공된 항원에 최소 75%, 80%, 85%, 또는 90% 또는 그이상의 상동성을 가지는 서열을 생성할 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, 인플루엔자 항원은 HA, NA 또는 M2 도메인 또는 이들 도메인의 일부에 최소 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 그 이상 상동성을 가지는 것을 포함하는 단백질로 구성되며, 이때 항원 단백질은 면역원성 활성을 보유한다. 예를 들면, 면역원성 특징으로 보유하는 인플루엔자 항원에 충분한 상동성을 가지는 서열은 여기에서 제공되는 도메인 (항원(들))과 반응하는 항체에 결합할 수 있다. 면역원성 특징에는 종종 관련 아미노산 또는 측쇄의 3차원 모양이 포함된다. 당업자는 서열에서 약간의 차이(가령, 경계에 차이 또는 일부 서열의 대체-그럼에도 불구하고 면역원성을 보존함)를 가지는 서열을 바로 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 지정된 아미노산 서열의 어느쪽이건 단부에 있는 도메인 경계에 있는 서열들(가령, 약 15개 아미노산, 약 14개 아미노산, 약 13개 아미노산, 약 12개 아미노산, 약 11개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 9개 아미노산, 약 8개 아미노산, 약 7개 아미노산, 약 6개 아미노산, 약 5개 아미노산, 약 4개 아미노산, 약 3개 아미노산, 약 2개 아미노산, 또는 약 1개 아미노산내에)에 있는 것은 본 발명에 따른 관련 도메인으로 구성되는 것으로 간주한다. 따라서, 본 발명은 도메인 지정에 근접한 잔기들로 구성되는 인플루엔자 항원 서열을 이용하는 것도 고려한다. 예를 들면, HA의 도메인(들)을 작제하여 본 발명의 항원으로써 인-프레임(in-frame) 융합 단백질로 발현시킨다(실시예 참고). 또한, 여기에서 제공하는 구조체 및 방법이 이용하여 면역원성인 인플루엔자 항원(가령 HA5NA, M2)의 아미노산 서열의 부분 도메인 또는 일부분을 만들 수 있다는 것도 인지할 것이다. 또한, 인플루엔자 항원을 생산하기 위해 도메인 또는 서브도메인을 별도로 또는 구성적으로 복합시킬 수도 있다.The sequences of exemplary influenza antigens are provided herein, and each domain for HA, NA, M2 is provided as exemplary strains, but any sequence retaining the immunogenic characteristics of the HA, NA, or M2 domain may alternatively be used. have. Those skilled in the art will be able to generate sequences having at least 75%, 80%, 85%, or 90% or more homology to a given antigen. In certain embodiments, the influenza antigen consists of a protein comprising at least 95%, 96%, 97%, 98%, or more homology to the HA, NA, or M2 domain or a portion of these domains, wherein the antigen Proteins retain immunogenic activity. For example, sequences having sufficient homology to influenza antigens possessing immunogenic characteristics can bind to antibodies that react with the domains (antigen (s)) provided herein. Immunogenic features often include three-dimensional shapes of related amino acids or side chains. Those skilled in the art will immediately be able to identify sequences that have some differences in the sequences (eg, differences in boundaries or replacement of some sequences—and conserves immunogenicity nonetheless). For example, sequences at domain boundaries at either end of a designated amino acid sequence (eg, about 15 amino acids, about 14 amino acids, about 13 amino acids, about 12 amino acids, about 11 amino acids, about 10 Dog amino acid, about 9 amino acids, about 8 amino acids, about 7 amino acids, about 6 amino acids, about 5 amino acids, about 4 amino acids, about 3 amino acids, about 2 amino acids, or about 1 amino acid) Is considered to consist of the relevant domain according to the invention. Thus, the present invention also contemplates using influenza antigen sequences consisting of residues close to domain designation. For example, the domain (s) of HA are constructed and expressed as an in-frame fusion protein as the antigen of the invention (see Examples). It will also be appreciated that the constructs and methods provided herein can be used to make partial domains or portions of amino acid sequences of influenza antigens (eg HA5 NA, M2) that are immunogenic. In addition, domains or subdomains may be combined separately or constitutively to produce influenza antigens.
예시적인 항원으로써, 여기에서 설명하는 것과 같이 헤마글루티닌, 뉴라미니다제의 서열 또는 특정 서브타입의 M2를 이용한다. 인플루엔자 바이러스의 다양한 서브타입이 존재하고, 새로운 서브타입 출연에 대해 지속적으로 확인하고 있다. 당업자는 여기에서 제공하는 방법 및 조성물을 적절히 이용하여 추가 서브타입의 서열을 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 변이도 여기에서 제공하는 방법 및 조성물내에 속한다.As exemplary antigens, hemagglutinin, the sequence of neuraminidase, or M2 of a particular subtype is used as described herein. Various subtypes of influenza virus exist and are constantly being identified for new subtype appearances. Those skilled in the art will appreciate that additional subtypes of sequences may be utilized, as appropriate, using the methods and compositions provided herein. Such variations also fall within the methods and compositions provided herein.
열안정성 단백질과 인플루엔자 폴리펩티드 융합체Thermostable Proteins and Influenza Polypeptide Fusions
본 발명의 특정 측면에서, 열안정한 단백질에 작용가능하도록 연결된 인플루엔자 단백질(또는 이의 단편 또는 이의 변이체)을 포함하는 융합 폴리펩티드로 구성된 인플루엔자 항원을 제공한다. 발명의 융합 폴리펩티드들은 당분야에 공지된 임의 이용 가능한 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 특정 구체예에서, 발명의 융합 단백질들은 식물 또는 이의 일부분 (가령, 식물, 식물 세포, 뿌리, 싹 등)에서 생산된다.In certain aspects of the invention, there is provided an influenza antigen consisting of a fusion polypeptide comprising an influenza protein (or fragment thereof or variant thereof) operably linked to a thermostable protein. Fusion polypeptides of the invention can be produced in any available expression system known in the art. In certain embodiments, the fusion proteins of the invention are produced in a plant or portion thereof (eg, plant, plant cell, root, shoot, etc.).
사람 또는 동물 세포에서 자연적으로는 발견되지 않는 효소 또는 다른 단백질이 본 발명의 융합 폴리펩티드에 이용에 있어서 특별히 적합하다. 융합되었을 때 융합 산물에 열안정성을 부여하는 열안정성 단백질이 유용하다. 열안정성은 생성된 단백질이 실온에서 모양을 유지하고 생성된 단백질을 유지할 수 있도록 한다. 이와 같은 특징은 융합 폴리펩티드의 용이하고, 효과적이고 비용에서 적절한 회수를 할 수 있도록 한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 유용한 열안정성 효소로는 글루카노하이드롤라제(glucanohydrolase) 패밀리이다. 이들 효소들은 특히 혼합 연결된 폴리사카라이드에 1,3-β 연결에 인접한 1,4-β 글루코시드 결합만을 특이적으로 절단시킨다. (Hahn et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 91:10417). 이와 같은 효소들은 귀리 및 보리와 같은 곡물에서 발견되며 C. thermocellum와 같은 다수의 곰팡이 및 세균 종에서도 발견된다. (Goldenkova et al., 2002, Mol. Biol. 36:698). 따라서, 본 발명의 융합 폴리펩티드에 이용할 수 있는 바람직한 열안정성 단백질에는 글리코시다제 효소가 포함된다. 예시적인 열안정성 글리코시다제 단백질에는 표 1에서 제시하는 것들에서 선택된 GenBank 수탁 번호로 알수 있는 것들이 포함되며, 이들 각각의 내용은 각 번호에 GenBank accession 정보를 결합시켜 여기에 첨부한다. 본 발명의 융합 단백질에 이용할 수 있는 예시적인 열안정성 효소에는 클로스트리디움 터모셀룸(Clostridium thermocellum) P29716, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) P37073, 및 로드테르무스 마리누스(Rhodthermus marinus) P45798가 포함되며 이들 각각에는 GenBank 수탁 번호가 포함된다. 실시예에서 설명하는 대표적인 융합 단백질들을 클로스트리디움 터모셀룸에서 분리된 변형된 열안정성 효소로 이용하나, 임의 열안정성 단백질을 본 발명에 따라 유사하게 이용할 수도 있다.Enzymes or other proteins not naturally found in human or animal cells are particularly suitable for use in the fusion polypeptides of the present invention. Thermostable proteins that give thermal stability to the fusion product when fused are useful. Thermal stability allows the resulting protein to retain shape at room temperature and retain the resulting protein. This feature allows for easy, effective and cost effective recovery of the fusion polypeptide. Useful thermostable enzymes that can be used in the present invention are the glucanohydrolase family. These enzymes specifically cleave only 1,4-β glucoside bonds adjacent to 1,3-β linkages to mixed linked polysaccharides. (Hahn et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 91: 10417). These enzymes are found in grains such as oats and barley and in many fungal and bacterial species such as C. thermocellum. (Goldenkova et al., 2002, Mol. Biol. 36: 698). Accordingly, preferred thermostable proteins that can be used in the fusion polypeptides of the invention include glycosidase enzymes. Exemplary thermostable glycosidase proteins include those identified by GenBank accession numbers selected from those shown in Table 1, each of which is attached to each number by combining GenBank accession information. Exemplary thermostable enzymes that can be used in the fusion proteins of the invention includeClostridium thermocellum P29716,Brevibacillus brevis P37073, andRhodthermus marinus P45798. Each of these includes a GenBank Accession Number. Representative fusion proteins described in the examples are used as modified thermostable enzymes isolated from Clostridium thermocelum, but any thermostable protein may be similarly used in accordance with the present invention.
본 발명에 따라 융합 단백질 및 폴리펩티드를 디자인할 때, 물론 항원의 면역원성을 보존시키는 것이 바람직하다. 또한, 융합 단백질의 열안정성을 제공하는 구조체를 만드는 것이 바람직하다. 이와 같은 특징은 표적 항원의 용이하고, 신속한 그리고 비용 효과적인 회수를 가능하게 한다. 특정 측면에서, 면역원성의 강화, 멀티플 백시 결정체에 결합 가능성이 있으나 백신 접종 개체에 면역원 노출전에는 부족한 것등을 포함하는 추가적인 장점을 제공하는 항원 융합 파트너를 선별할 수 있을 것이다. 소요의 융합 펩티드의 추가적인 요건에는 하나 또는 그이상의 항원의 결합을 용이하게 조절할 수 있으며 백신 조제를 위한 생산, 정제 및 조제에 용이성을 부여하는 단백질을 제공하는 것들이 포함된다. 당업자는 3차원 프리젠티에션이 이들 유익한 특징 각각에 영향을 줄 것이라는 것을 인지할 것이다. 따라서 면역원성의 보존 또는 선호적인 성질의 보존이 융합 위치 선택(가령, N-말단, C-말단, 내부, 이들의 복합) 및 융합 파트너의 선택에 영향을 줄 것이다. 대안으로 또는 추가적으로 선호도가 융합을 위해 선택되는 단편의 길이, 항원의 길이 또는 선택된 융합 파트너의 길이에도 영향을 줄 것이다.When designing fusion proteins and polypeptides according to the invention, it is of course desirable to preserve the immunogenicity of the antigen. It is also desirable to make constructs that provide thermal stability of the fusion protein. This feature allows for easy, rapid and cost effective recovery of the target antigen. In certain aspects, antigen fusion partners may be selected that provide additional advantages including enhanced immunogenicity, potential for binding to multiple vaccinia crystals but insufficient prior to immunogen exposure to vaccinated individuals. Additional requirements of the desired fusion peptides include those that provide a protein that can easily control the binding of one or more antigens and which provides ease in production, purification and preparation for vaccine preparation. Those skilled in the art will appreciate that three-dimensional presentation will affect each of these beneficial features. Thus, preservation of immunogenicity or preservation of preferred properties will affect the choice of fusion site (eg, N-terminus, C-terminus, internals, combinations thereof) and selection of fusion partners. Alternatively or additionally, preference will also affect the length of the fragment selected for fusion, the length of the antigen or the length of the selected fusion partner.
본 발명은 열 안정성 단백질과 다양한 항원의 성공적인 융합을 설명한다. 예를 들면, 우리는 리체나제로 언급한 열안정한 캐리어 분자 LicB를 융합 단백질 생산에 이용한다. LicB는 클로스트리디움 터모셀룸(Clostridiumthermocellum)에서 얻은 1,3-1,4-β 글루카나제(LicB)이다(GenBank accession: X63355 [gi:40697]). LicB 는 구형(globular) 단백질 패밀리에 속한다. LicB의 3차원 구조에 근거하여, 이의 N- 및 C-말단이 활성 도메인에 근접한 표면상에서 서로 인접하게 위치하고 있다. LicB 는 또한 활성 도메인으로부터 떨어져 있는 표면상에 노출된 루프 구조를 가진다. 단백질의 N- 및 C- 말단과 루프 구조가 인플루엔자 항원 폴리펩티드의 삽입 부위로 이용될 수 있도록 만들었다. 인플루엔자 항원 폴리펩티드는 N- 또는 C- 말단 융합으로 발현되거나 표면 루프로 삽입될 수도 있다. 중요한 것은 LicB는 낮은 pH 및 고온(최고 75℃)에서 효소 활성을 유지한다. 따라서, 캐리어 분자로써 LicB를 이용하는 것은 표적 특이적 면역원성의 강화, 다중 백신 결정부위에 결합될 가능성, 비강, 경구 또는 장관외로 운반될 수 있는 백신의 직접적인 조제 등을 포함하는 장점을 제공하는데 기여한다. 또한, 식물에서 LicB 융합물의 생산으로 동물 또는 사람의 병인균 오염 위험을 감소시켜야 한다. 실시예를 제공한다.The present invention describes the successful fusion of heat stable proteins with various antigens. For example, we use the thermostable carrier molecule LicB, referred to as lycase, to produce fusion proteins. LicB isClostridiumthermocellum ) 1,3-1,4-β glucanase (LicB) (GenBank accession: X63355 [gi: 40697]). LicB belongs to the globular protein family. Based on the three-dimensional structure of LicB, its N- and C-terminus are located adjacent to each other on the surface proximate the active domain. LicB also has a loop structure exposed on the surface away from the active domain. The N- and C-terminus and loop structures of the protein were made available as insertion sites for influenza antigen polypeptides. Influenza antigen polypeptides may be expressed in N- or C-terminal fusions or inserted into surface loops. Importantly, LicB maintains enzymatic activity at low pH and high temperatures (up to 75 ° C). Thus, using LicB as a carrier molecule contributes to the benefits of enhancing target specific immunogenicity, possibility of binding to multiple vaccine crystal sites, direct preparation of vaccines that can be delivered nasal, oral or extranasal, etc. . In addition, production of LicB fusions in plants should reduce the risk of pathogen contamination in animals or humans. An example is provided.
인플루엔자 항원으로 구성된 융합 단백질는invitro 및invivo를 포함하는 다양한 발현계를 이용하여 생산할 수 있다. 당업자는 특정 발현계를 위한 핵산 서열의 최적화가 바람직하다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 여기에서 제공하는 예시에서, 인플루엔자 항원-LicB 융합체의 발현을 위한 최적화된 서열을 제공한다. 실시예 1 참고. 따라서, 본 발명에 따른 인플루엔자 항원(s) 융합 단백질(s)을 인코드하는 임의 관련 핵산 및 이의 단편들은 본 발명의 핵산 구조체에 포함된다.Fusion proteins consisting of influenza antigens areinin vitro andinIt can be produced using a variety of expression systems, including invivo . Those skilled in the art will appreciate that optimization of nucleic acid sequences for specific expression systems is desirable. For example, in the examples provided herein, optimized sequences for expression of influenza antigen-LicB fusions are provided. See Example 1. Thus, any relevant nucleic acid and fragments thereof encoding the influenza antigen (s) fusion protein (s) according to the invention are included in the nucleic acid constructs of the invention.
식물계에서 생산하기 위해, 인플루엔자 항원(s) (가령, 인플루엔자 단백질(s) 또는 이의 단편 또는 이들의 융합체)를 발현시키는 유전자전이 식물을 이용할 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 유전자전이 식물은 안정산 생산 작물을 만드는 분야에 공지된 방법을 이용하여 생산할 수 있을 것이다. 추가적으로, 일과성 발현계를 이용하는 식물을 이용하여 인플루엔자 항원(s)을 생산할 수 있다. 식물에서 유전자전이 또는 일과성 발현에 상관없이 식물 발현계를 이용하는 경우에, 원하는 항원에 대해 발현계의 이용성에 따라 핵 발현, 클로로플라스트 발현, 미토콘드리아 발현 또는 바이러스 발현을 이용하여 잇점을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항원 및 융합 단백질 생산에 추가 발현 시스템을 이용할 수도 있다.For production in the plant kingdom, transgenic plants that express influenza antigen (s) (eg, influenza protein (s) or fragments thereof or fusions thereof) can be used. Alternatively or additionally, transgenic plants may be produced using methods known in the art of making stable acid producing crops. Additionally, plants using a transient expression system can be used to produce influenza antigen (s). In the case of using a plant expression system regardless of gene transfer or transient expression in a plant, benefits may be obtained by using nuclear expression, chloroplast expression, mitochondrial expression or viral expression depending on the availability of the expression system for the desired antigen. It is also possible to use additional expression systems for the production of antigens and fusion proteins according to the invention.
예를 들면, 포유류 발현 (가령, 포유류 세포주 (가령, CHO5 등)), 세균 발현 시스템s (가령,E. coil), 곤충 발현 시스템s (가령, 베큘로바이러스), 이스트 발현 시스템, in vitro 발현 시스템 (가령, 레티큘레이트 라이세이트(reticulate lysates)) 등을 본 발명의 항원 및 융합 단백질 발현이 이용할 수도 있다.For example, mammalian expression (eg, mammalian cell lines (eg, CHO5, etc.)), bacterial expression systems (eg,E. coil ), insect expression systems (eg, baculovirus), yeast expression system, in vitro expression Systems (eg, reticulate lysates) and the like can also be used for antigen and fusion protein expression of the invention.
인플루엔자 항원의 생산Production of Influenza Antigens
본 발명에 따르면, 인플루엔자 항원(인플루엔자 단백질(s), 이의 단편, 변이체 및/또는 융합체)을 임의 바람직한 시스템에서 생산할 수도 있다; 생산은 식물 시스템에 한정시키지 않는다. 벡터 구조체와 발현 시스템들은 당분야에 잘 공지되어 있으며, 적절히 이용하면 여기에서 제공하는 인플루엔자 항원의 이용에 결합시킬 수 있을 것이다. 예를 들면, 인플루엔자 항원 (이의 단편들, 변이체 및/또는 융합체)들은 공지의 발현 시스템을 통하여 생산할 수 있는데, 포유류 세포 시스템, 유전자 전이 동물, 미생물 발현 시스템, 곤충 세포 시스템, 유전자 전이 및 일과성 식물 시스템 포함 식물 시스템을 통하여 생산할 수 있다. 인플루엔자 항원이 융합 단백질로 생산되는 경우에, 비-식물 시스템에서 이와 같은 융합 단백질을 생산하는 것이 바람직할 수도 있다.According to the invention, influenza antigens (influenza protein (s), fragments, variants and / or fusions thereof) may be produced in any desired system; Production is not limited to plant systems. Vector constructs and expression systems are well known in the art and, if properly used, will be able to bind to the use of influenza antigens provided herein. For example, influenza antigens (fragments, variants and / or fusions thereof) can be produced via known expression systems, including mammalian cell systems, transgenic animals, microbial expression systems, insect cell systems, gene transfer and transient plant systems. It can be produced via an inclusive plant system. Where influenza antigens are produced as fusion proteins, it may be desirable to produce such fusion proteins in non-plant systems.
본 발명의 일부 구체예에서, 인플루엔자 항원이 식물 시스템에서 생산된다. 식물은 유전적인 조작이 상대적으로 용이하고, 사람 유체, 동물 세포주, 재조합 미생물 및 유전자전이 동물과 같은 다른 대체 재료에 비해 몇가지 장점들이 있다. 식물은 동물의 것과 유사한 단백질에 대해 전사후 수정 기전이 매우 정교하다(식물과 포유류 사이에 글리코실화 반응 패턴에 일부 차이가 있다는 것은 알아야 한다). 이것이 식물 조직에서 생활성 물질을 생산하게끔 한다. 또한, 식물들은 정교한 설비없이도 매우 많은 양의 바이오매스를 경제적으로 생산할 수 있다. 또한, 식물은 동물 병인균으로 오염될 대상이 아니다. 리포좀 및 마이크로캡슐과 같이, 식물 세포는 위장관으로 항원이 통과하는 것에 대해 보호해줄 수 있는 것으로 기대된다.In some embodiments of the invention, influenza antigens are produced in a plant system. Plants are relatively easy to manipulate genetically and have several advantages over other alternative materials such as human fluids, animal cell lines, recombinant microorganisms and transgenic animals. Plants have very sophisticated post-transcriptional modification mechanisms for proteins similar to those of animals (note that there are some differences in glycosylation reaction patterns between plants and mammals). This leads to the production of bioactive substances in plant tissues. In addition, plants can economically produce very large quantities of biomass without sophisticated equipment. In addition, plants are not subject to contamination with animal pathogens. Like liposomes and microcapsules, plant cells are expected to protect against the passage of antigen into the gastrointestinal tract.
식물을 이용하여 다양한 생산 시스템을 통하여 이형성(heterologous) 단백질을 생산할 수 있다. 이와 같은 시스템중 하나는 유전자전이/유전적으로 변형된 식물을 이용하는 것인데, 표적 산물을 인코드하는 유전자를 식물의 게놈으로 영구히 결합시킨 것이다. 유전자전이 시스템은 식물 생산 시스템을 생성시킬 수도 있다. 포유류 기원 및 많은 백신 후보물질 항원을 포함하는 다양한 외부 단백질이 유전자전이 식물에서 발현되었고, 기능적으로 활성을 가진다는 것을 보여주었다.(Tacket et al., 2000, J. Infect. Dis., 182:302; and Thanavala et al., 2005, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 102:3378). 추가적으로 간염 B 주요 표면 항원을 발현시키는 프로세스안된 유전자전이 식물을 면역 주사를 받지 않은 사람 지원자에 투여하면 면역 반응이 생성된다(Kapusta et al., 1999, FASEB J., 13:1796).Plants can be used to produce heterologous proteins through a variety of production systems. One such system is the use of transgenic / genetically modified plants, in which the gene encoding the target product is permanently bound into the genome of the plant. Gene transfer systems can also produce plant production systems. It has been shown that various foreign proteins, including mammalian origin and many vaccine candidate antigens, have been expressed in transgenic plants and are functionally active (Tacket et al., 2000, J. Infect. Dis., 182: 302). and Thanavala et al., 2005, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 102: 3378). In addition, administration of an unprocessed transgenic plant expressing hepatitis B major surface antigen to an unimmunized human volunteer produces an immune response (Kapusta et al., 1999, FASEB J., 13: 1796).
식물에서 폴리펩티드를 발현시키는 또 다른 시스템은 외부 서열(가령, 일과성 발현)을 발현하도록 조작된 식물 바이러스 벡터를 이용하는 것이다. 이와 같은 방법으로 신속한 생산 시스템으로 건강한 비-유전자 전이 식물을 이용하게 한다. 따라서, 유전적으로 조작된 식물 및 재조합 식물 바이러스에 감염된 식물들을 원하는 특정 단백질을 신속하게 발생시키고 생산시키는 "그린 팩토리"로써 사용할 수 있을 것이다. 식물 바이러스들은 외부 단백질 생산을 위한 발현 벡터로써 매력을 가질 만한 특정 장점들이 있다. 식물 RNA 바이러스의 몇 가지 멤버들은 잘 특징화되어 있고, 감염성 cDNA를 유전자 조작을 위해 이용할 수 있다. 일단 감염성 바이러스 유전자 물질이 민감성 숙주 세포에 유입되면, 상당 수준으로 복제되어 전체 식물을 통하여 급속히 확산된다. 식물성 바이러스 발현 벡터를 이용한 표적 폴리펩티드를 생산하는 몇 가지 접근법이 있는데 표적 폴리펩티드를 바이러스 게놈에 결합시키는 방법이 포함된다. 한 가지 방법은 항원 펩티드에 대해 캐리어 분자로 기능을 하는 세균, 동물 또는 식물에 감염되는 바이러스의 피복 단백질을 조작하는 것이다. 이와 같은 캐리어 단백질은 이들 표면상에 원하는 항원 에피토프를 도시하는 재조합 바이러스 유사 입자를 어셈블리하고 형성시키는 능력을 가진다. 이와 같은 방법으로 백신 후보물질의 시간대비 효과적인 생산이 가능한데, 그 이유는 백신 후보물질의 특정 성질이 식물 조직으로부터 용이하고 비용 측면에서 효과적인 회수가 가능하기 때문이다. 추가 장점으로는 표적-특이적 면역원성의 강화, 다중 백신 결정부위에 결합 가능성 및 구강, 비강 또는 장관외로 운반되는 백신으로의 조제 용이성 등이 포함된다. 예를 들면, 피복 단백질에 융합되는 바이러스의 에피토프를 운반하는 재조합 식물 바이러스 입자를 포함하는 시금치 잎은 투여시에 면역 반응을 일으킨다. (Modelska et al, 1998, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 95:2481 ; and Yusibov et al, 2002, 백신, 19/20:3155).Another system for expressing polypeptides in plants is to use plant viral vectors engineered to express foreign sequences (eg, transient expression). In this way, a rapid production system allows for the use of healthy non-genic transgenic plants. Thus, genetically engineered plants and plants infected with recombinant plant viruses may be used as "green factories" to rapidly generate and produce the specific proteins of interest. Plant viruses have certain advantages that make them attractive as expression vectors for foreign protein production. Several members of plant RNA viruses are well characterized and infectious cDNAs can be used for genetic engineering. Once infectious viral genetic material enters a sensitive host cell, it replicates to a significant level and rapidly spreads throughout the entire plant. Several approaches for producing target polypeptides using plant viral expression vectors include methods of binding the target polypeptide to the viral genome. One method is to engineer coat proteins of viruses that infect bacteria, animals or plants that function as carrier molecules for antigenic peptides. Such carrier proteins have the ability to assemble and form recombinant virus like particles showing the desired antigenic epitopes on these surfaces. In this way, effective production of vaccine candidates over time is possible because the specific properties of the vaccine candidates can be easily and cost-effectively recovered from plant tissues. Additional advantages include the enhancement of target-specific immunogenicity, the possibility of binding to multiple vaccine crystal sites, and the ease of preparation into vaccines delivered orally, nasal or extranasally. For example, spinach leaves containing recombinant plant virus particles that carry epitopes of the virus fused to the coat protein elicit an immune response upon administration. (Modelska et al, 1998, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 95: 2481; and Yusibov et al, 2002, vaccines, 19/20: 3155).
식물 발현 시스템Plant expression system
본 발명에 따라 이형성 핵산에 결합 및 유지에 민감한 그리고 이형성 단백질을 생산할 수 있는 임의 식물을 이용할 수 있다. 일반적으로, 비닐하우스 및 수경 시스템과 같은 특정 조건하에 생장을 잘 하는 식물을 이용하는 것이 종종 바람직할 수도 있다. 인류 또는 가축이 일반적으로 소비하지 않은 식물을 선택하거나 인간의 먹이 사슬에 전형적인 일부가 되지 않은 식물을 선택하여 발현된 폴리뉴클레오티드가 원치 않게 섭취되더라도 큰 걱정을 유발하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 그러나, 식용 식물을 이용하는 것이 바람직하다고 하기도 한다. 특정 구체예에서, 식물의 식용 부분에 발현된 폴리펩티드를 축적시키는 식물을 이용하는 것이 바람직할 것이라는 것이다.According to the present invention, any plant that is sensitive to binding and maintenance to heterologous nucleic acid and capable of producing a heterologous protein can be used. In general, it may often be desirable to use plants that grow well under certain conditions, such as green houses and hydroponic systems. It may be desirable to select plants that are not normally consumed by humans or livestock or to select plants that are not typical parts of the human food chain so that expressed polynucleotides do not cause much concern if they are inadvertently ingested. In some embodiments, however, it may be desirable to use edible plants. In certain embodiments, it will be desirable to use plants that accumulate polypeptides expressed in the edible portion of the plant.
흔히, 특정 바람직한 식물 특징은 발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 결정될 것이다. 몇 가지 실시예를 제공하기 위해 다량으로 생산될 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드(항원 단백질이 발현되는 경우와 같이), 상대적으로 높은 바이오매스를 가지는 식물(가령, 담배, 바이러스 감염에 상당히 민감하여 추가 장점을 가지는 담배는 생장 기간이 짧고, 사람의 먹이쇄에 포함되지 않은)이 바람직할 수 있다. 온전한 활성을 가지는 항원 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 특정 전사후 변형을 요구하는 경우에, 관련 변형(예를 들면 특징 글리코실화반응)을 이루지기 위해 특정 식물 종의 능력(또는 무능력)이 선별 기준이 될 수도 있다. 예를 들면, 식물이 특정 전사후 변형(가령, 글리코실화반응)을 수행할 수 있는 능력이 있을 때 식물은 포유류 전사후 변형에서 볼 수 있는 시알화 패턴(sialation patterns)을 생성시키지 않을 것이다. 따라서, 항원의 식물 생산은 대안 시스템에서 생산되는 동일한 단백질 서열과는 다른 존재(entity)의 생산으로 이어질 수 있다.Frequently, certain preferred plant characteristics will be determined by the polynucleotide expressed. To provide some examples, polynucleotides encoding proteins to be produced in large quantities (such as when antigen proteins are expressed), plants with relatively high biomass (eg, tobacco, viral infections are very sensitive and added Cigarettes that have advantages have short growth periods and are not included in the human food chain). When polynucleotides encoding antigenic proteins with intact activity require a particular post-transcriptional modification, the ability (or inability) of the particular plant species to make relevant modifications (e.g., characteristic glycosylation) is the criteria for selection. It could be For example, when a plant is capable of performing certain post-transcriptional modifications (eg, glycosylation), the plant will not produce sialation patterns seen in mammalian post-transcriptional modifications. Thus, plant production of antigens can lead to the production of entities different from the same protein sequences produced in alternative systems.
본 발명의 특정 구체예에서, 농작물 식물 또는 농작물 관련 식물을 이용한다. 특정 구체예에서 식용 식물을 이용한다.In certain embodiments of the invention, crop plants or crop related plants are used. In certain embodiments edible plants are used.
본 발명에 따라 이용할 수 있는 식물에는 피자식물(Angiosperms), 선태류식물(Bryophytes (가령, 설앵초[Hepaticae], Musci, 등), 양치류[Pteridophytes] (가령, ferns, horsetails, 석송속[lycopods]), 겉씨식물[Gymnosperms] (가령, 침엽수[conifers], cycase, 은행[Ginko], Gnetales), 녹조 (가령, Chlorophyceae, Phaeophyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Euglenophyceae)등이 포함된다. 예시적인 식물은 Leguminosae(콩과[Fabaceae]; 가령, 완두, 알파파, 소이빈); 벼과[Gramineae] (Poaceae; 가령, 옥수수, 밀, 쌀); 가지과[Solanaceae], 특히,Lycopersicon 종(가령, 토마토),Solarium(가령, 감자, 가지),Capsium (가령, 고추), 또는Nicotiana (가령, 담배); 미나리과[Umbelliferae] 특히 , Daucus 종 (가령, 당근), 솔잎미나리속[Apium](가령, 셀러리), 또는 운향과[Rutaceae](가령, 오렌지); 국화과[Compositae], 특히Lactuca 종 (가령, 양상추); 십자화과[Brassicaceae] (Cruciferae), 특히,Brassica 또는Sinapis종을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 식물들은Brassica 또는Arabidopsis 종의 식물이 된다. 일부 예시적인Brassicaceae 과에는Brassica campestris, B. carinata, B. juncea, B. napus, B. nigra, B. oleraceae.B. tournifortii, Sinapis alba, Raphanussativus을 포함한다. 변형이 용이하고, 발아 묘목으로써 식용으로 적절한 식물에는 알파파, 녹구, 무, 밀, 머스타드, 시금치, 당근, 비트, 양파, 마늘, 셀러리, 대황, 양배추 또는 양상추, 물냉이 또는 냉이와 같은 초목(잎이 무성한), 파아슬리, 민트와 같은 허브, 클로버, 콜리플라워, 브로콜리, 소이빈, 렌즈콩, 및 해바라기와 같은 식용 꽃을 포함한다.Plants that can be used according to the present invention include pizza plants (Angiosperms), sauropods (such as Bryophytes (Hepaticae, Musci, etc.), Pteridophytes (eg, ferns, horsetails, lycopods), Glynosperms (eg, conifers, cycase, ginkgo (Ginko), Gnetales), green algae (eg, Chlorophyceae, Phaeophyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Euglenophyceae), etc. Exemplary plants include Leguminos. Fabaceae; for example, peas, alfalfa, soybeans; Gramineae (Poaceae; corn, wheat, rice); Solanaceae, in particular,Lycopersicon species (eg, tomatoes),Solarium (Eg, potatoes, eggplant),Capsium (eg, red pepper), orNicotiana (eg, tobacco); Umbelliferae, in particular, Daucus species (eg, carrots), Pine needles [Apium ] (eg, celery), or Rutaceae (eg, orange); Compositae, in particularLactuca species (eg lettuce); Brassicaceae (Cruciferae), in particularBrassica orSinapis Includes species. In certain aspects, the plants of the invention areBrassica orArabBecomes a plant ofidopsis species. Some illustrative andBrassicaceae includeBrassica campestris, B. carinata, B. juncea , B. napus, B. nigra, B. oleraceae.B.tournifortii, Sinapis alba, Raphanussativus . Plants that are easily transformed and suitable for edible as germination seedlings include: green onions such as alfalfa, green bulb, radish, wheat, mustard, spinach, carrot, beet, onion, garlic, celery, rhubarb, cabbage or lettuce, watercress or wasabi Leafy), herbs such as parsley, mint, edible flowers such as clover, cauliflower, broccoli, soybeans, lentils, and sunflowers.
식물내로Into the plant 벡터의 도입 Introduction of Vector
일반적으로 공지의 기술을 이용하여 벡터를 식물내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 벡터 자체를 바로 식물에 도입시킬 수 있다(가령, 연마성 접종[abrasive inoculations], 기계적 분무 접종[mechanized spray inoculations], 진공 침윤[vacuum infiltration], 입자 투하[particle bombardment], 또는 전기천공[ electroporation]). 대안으로 또는 추가적으로, 비리온을 준비할 수 있고(예를 들면 이미 감염된 식물로부터), 그리고 공지의 기술을 이용하여 다른 식물에 응용할 수도 있다.In general, known techniques can be used to introduce vectors into plants. For example, the vector itself can be introduced directly into the plant (eg, abrasive inoculations, mechanized spray inoculations, vacuum infiltration, particle bombardment, or electricity). Electroporation). Alternatively or additionally, virions can be prepared (eg from already infected plants) and applied to other plants using known techniques.
다양한 식물종에 감염되는 것으로 알려진 다양한 종류의 식물들이 있으며, 본 발명에 따라 폴리뉴클레오티드 발현이 이용할 수 있다.(see, for example, in The Classification and Nomenclature of viruses, "Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of viruses" (Ed. Murphy et al), Springer Verlag: New York, 1995, the entire contents of which are incorporated herein by reference; Grierson et al., plant Molecular Biology, Blackie, London, pp. 126-146, 1984; Gluzman et al., Communications in Molecular Biology: viral vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 172-189, 1988; and Mathew, plant viruses Online (http://image.fs.uidaho.edu/vide/). 식물 세포로 단일 바이러스 벡터를 운반하는 것보다는 본 발명의 특정 구체예에서 다중 상이한 벡터들을 바이러스 벡터의 복제를 위해 함께 운반될 수 있도록 한다(그리고 추가적으로 세포에서 세포로 또는 장거리 이동을 위해). 일부 또는 모든 단백질이 유전자 전이 식물의 게놈에 인코드될 수 있다. 특정 측면에서, 하기에서 더욱 상세하게 설명하겠지만, 이들 시스템에는 하나 또는 그 이상의 바이러스 벡터 성분들이 포함된다.There are various kinds of plants known to be infected with various plant species, and polynucleotide expression can be used according to the present invention. (See, for example, in The Classification and Nomenclature of viruses, "Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of viruses "(Ed. Murphy et al), Springer Verlag: New York, 1995, the entire contents of which are incorporated herein by reference; Grierson et al., plant Molecular Biology, Blackie, London, pp. 126-146, 1984 Gluzman et al., Communications in Molecular Biology: viral vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 172-189, 1988; and Mathew, plant viruses Online (http: //image.fs.uidaho. edu / vide /) In certain embodiments of the invention, rather than delivering a single viral vector to a plant cell, multiple different vectors can be delivered together for replication of the viral vector (and additionally from cell to cell or For the distance traveled), and can have any or all of a protein can be encoded in the genome of transgenic plant. In a particular aspect, as will be described in more detail below, these systems include to one or more of the virus vector component.
광범위한 식물에 바로 감염시키고, 감염 전염의 위험이 거의 또는 전혀 없는 시스템을 얻기 위해 두 가지 이형성 식물 바이러스 성분들을 포함하는 벡터 시스템을 이용한다. 예시적인 시스템은 이미 설명된 바 있다(가령, PCT Publication WO 00/25574 및 U.S. Patent Publication 2005/0026291, 여기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 특정 측면에서, 바이러스성 벡터를 주입, 기계적인 접종, 분무 등을 통하여 식물에 응용한다(가령, 식물, 식물의 일부, 싹 등). 감염이 바이러스 게놈을 식물에 바로 제공하여 얻어지는 경우에 임의 기술을 이용하여 게놈을 준비할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 유용하게 이용할 수 있는 많은 바이러스는 ssRNA 게놈을 가진다. ssRNA는 in vivo 또는 in vitro에서 게놈의 DNA 카피의 전사를 통하여 만들거나 RNA 카피를 복제하여 만들 수 있다. 용이하게 이용할 수 있는 in vitro 전사 시스템이 제공된다면 (가령, SP6, T7, 레티큘로사이트 라이세이트, 등.), 그리고 RNA 벡터의 DNA 카피를 용이하게 유지한다면 발명의 ssRNA 벡터는 in vitro 전자 특히 T7 또는 SP6 폴리메라제를 통하여 만들 수 있다.A vector system comprising two heterologous plant viral components is used to immediately infect a wide range of plants and obtain a system with little or no risk of infection transmission. Exemplary systems have already been described (e.g., PCT Publication WO 00/25574 and US Patent Publication 2005/0026291, as mentioned herein, in certain aspects of the invention, injecting viral vectors, mechanical inoculation, Application to plants via spraying, etc. (eg, plants, parts of plants, shoots, etc.) If the infection is obtained by directly providing the viral genome to the plant, any technique may be used to prepare the genome. Many viruses that can be usefully employed in accordance with the present invention have an ssRNA genome, which can be made in vivo or in vitro through transcription of a DNA copy of the genome or by replicating an RNA copy. If an in vitro transcription system is provided (eg, SP6, T7, reticulosite lysate, etc.), and the DNA copy of the RNA vector is easily maintained, the ssRNA vector of the invention is i n vitro, in particular via T7 or SP6 polymerase.
단일 바이러스 벡터 타입을 식물로 도입시키는 것보다는 본 발명의 특정 구체예에서, 다중 상이한 바이러스 벡터를 도입시킨다. 이와 같은 벡터들은 복제, 세포간 이동 또는 장거리 이동과 같은 기능에 대해 교차-보완적이다(trans- complement). 벡터들에는 본원 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원들을 인코드하는 다중 폴리펩티드를 발현시크는 식물 또는 식물의 일부를 선별하는 것은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 실행한 것과 동일한 방식으로 실행할 수 있다.In certain embodiments of the invention, rather than introducing a single viral vector type into a plant, multiple different viral vectors are introduced. Such vectors are trans-complementary for functions such as replication, intercellular migration or long distance migration. Vectors can include different polynucleotides that encode influenza antigens of the invention. Selecting a plant or part of a plant that seeks to express multiple polypeptides encoding one or more influenza antigens can be performed in the same manner as performed for the polynucleotide or polypeptide.
식물 조직 발현 시스템Plant tissue expression system
상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명에 따라 인플루엔자 항원을 임의 원하는 시스템에서 만들 수 있다. 벡터 구조체 및 발현 시스템들은 당분야에 잘 공지되어 있고, 이를 채용하여 여기에서 제공하는 인플루엔자 항원의 이용에 결합시킨다. 예를 들면, 유전자 전이 식물 생산은 공지된 것이고, 구조체 생성 및 식물 생산을 당분야에 공지된 기술을 이용하여 조작할 수 있다. 일부 구체예에서, 식물에서 일과성 발현 시스템이 바람직할 수 있다. 이들 시스템들중 두 가지에는 클론성 뿌리 및 클론성 식물 시스템 및 이의 유도체 뿐만 아니아 발아된 묘목 시스템의 생산이 포함된다.As discussed above, influenza antigens can be made in any desired system in accordance with the present invention. Vector constructs and expression systems are well known in the art and employ them to bind to the use of influenza antigens provided herein. For example, gene transfer plant production is known and structure generation and plant production can be manipulated using techniques known in the art. In some embodiments, transient expression systems may be desirable in plants. Two of these systems include the production of cloned root and clonal plant systems and their derivatives as well as germinated seedling systems.
클론성Clonality 식물 plant
클론 뿌리는 RNA 바이러스성 발현 벡터들을 유지시키고 상당 시간동안 그리고 다중 서브컬쳐 동안에 전체 뿌리에서 균질하고 안정적으로 표적 단백질을 생산한다. 세포간 또는 장거리 이동시에 재조합에 의해 표적 유전자가 제거된 식물과는 대조적으로, 뿌리 배양물에서는 바이러스 벡터의 일체성이 유지되며, 시간에 걸쳐 생산되는 표적 단백질의 수준이 초기 스크리닝 동안 관찰된 것과 유사하다. 클론 뿌리는 항원 및 백신 조성물의 경구 조성물용 이형성 단백질 물질의 생산을 용이하게 한다. 항원 생산에 유용한 식물에서 유도된 다양한 클론 대상을 생성하는 방법 및 시약은 이미 설명된 바 있으며 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, PCT Publication WO 05/81905, 참고문헌으로 첨부됨). 클론 대상에는 항원(본 발명의 항원 단백질)을 생산할 수 있는 클론 뿌리 라인, 클론 식물 라인 및 클론 식물이 포함된다. 본 발명에서는 다양한 식물 조직(가령, 뿌리, 잎) 및 단일 세포(클론 식물)에서 유도된 온전한 식물에서 유도된 클론 세포 라인에서 항원 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 생성물의 발현을 위한 시약 및 방법을 제공한다. 이와 같은 방법은 일반적으로 다양한 타입의 식물 바이러스 벡터 사용을 근거한다.Clonal roots retain RNA viral expression vectors and produce target proteins homogeneously and stably in whole roots for a significant time and during multiple subcultures. In contrast to plants in which target genes have been removed by recombination during intercellular or long-distance migration, integrity of the viral vector is maintained in root cultures, and the level of target protein produced over time is similar to that observed during initial screening. Do. Clonal roots facilitate the production of heterologous protein materials for oral compositions of antigen and vaccine compositions. Methods and reagents for generating various clone targets derived from plants useful for antigen production have already been described and are known in the art (eg, PCT Publication WO 05/81905, incorporated by reference). Clonal subjects include clone root lines, clone plant lines and clone plants capable of producing antigens (antigenic proteins of the invention). The present invention provides reagents and methods for expression of antigen polynucleotides and polypeptide products in clonal cell lines derived from intact plants derived from various plant tissues (eg, roots, leaves) and single cells (clone plants). Such methods are generally based on the use of various types of plant viral vectors.
예를 들면, 한 측면에서 본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리 라인을 수득하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (i) 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 벡터를 식물 또는 식물이 일부에 도입시키고; (ii) 식물로부터 하나 또는 그 이상의 클론 뿌리를 생성하는 단계로 구성된다. 예를 들면, 클론 뿌리 라인은 우둘투둘한 뿌리가 형성되는 원인이 되는 아그로박테리움(가령,A. rhizogenes)으로 식물 또는 식물의 일부분(가령, 수확된 잎 조각)에 감염시켜 만들 수 있다. 바이러스를 유지시키는 라인, 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현시키는 라인 등을 동정하기 위해 다양한 방법으로 클론 뿌리 라인을 스크린할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 클론 뿌리 라인을 제공하고, 또한 이와 같은 클론 뿌리 라인을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 발현시키고, 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리펩티드를 생산하는 방법도 포함한다.For example, in one aspect the present invention provides a method for obtaining a clone root line expressing a polynucleotide encoding an influenza antigen of the invention, which method comprises: (i) encoding the influenza antigen of the invention Viral vectors consisting of polynucleotides are introduced into a plant or plant by a part; (ii) generating one or more clone roots from the plant. For example, a clone root line can be made by infecting a plant or part of a plant (eg, harvested leaf flakes) with Agrobacterium (eg,A. rhizogenes ) that causes the formation of clumpy roots. Clonal root lines can be screened in a variety of ways to identify lines that maintain viruses, lines that express high levels of polynucleotides encoding influenza antigens of the invention, and the like. The present invention also provides a clone root line produced by the method of the present invention, and also includes a method of expressing a polynucleotide using such clone root line and producing a polypeptide encoding the influenza antigen of the present invention. do.
본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리 세포주를 생성시키는 방법을 제공하는데; 그 방법은The present invention provides a method for generating a clonal root cell line expressing a polynucleotide encoding an influenza antigen according to the present invention; That way
(i) 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈을 가지고, 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 세포주를 만들고;(i) having a genome consisting of polynucleotides encoding influenza antigens of the invention, creating a clone root cell line comprising a viral vector;
(ii) 클론 뿌리 세포주로부터 개별 세포를 방출시키고;(ii) releasing individual cells from the clone root cell line;
(iii) 뿌리 세포 증식에 적절한 조건하에 세포를 유지시키는 단계로 구성된다. 본 발명은 클론 뿌리 세포주 및 클론 뿌리 세포주를 이용하여 폴리뉴클레오티드를 발현시키고, 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.(iii) maintaining the cells under conditions suitable for root cell proliferation. The present invention provides a method for expressing polynucleotides and producing polypeptides using a clone root cell line and a clone root cell line.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물 세포주를 생성하는 방법을 제공하는데; 그 방법은In one aspect, the invention provides a method of generating a clonal plant cell line expressing a polynucleotide encoding an influenza antigen of the invention; That way
(i) 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈을 가지고, 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 세포주를 만들고;(i) having a genome consisting of polynucleotides encoding influenza antigens of the invention, creating a clone root cell line comprising a viral vector;
(ii) 클론 뿌리 세포주로부터 개별 세포를 방출시키고;(ii) releasing individual cells from the clone root cell line;
(iii) 뿌리 세포 증식에 적절한 조건하에 세포를 유지시키는 단계로 구성된다. 본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물 세포주를 생성하는 방법을 제공하는데; 그 방법은(iii) maintaining the cells under conditions suitable for root cell proliferation. The present invention provides a method for generating a clonal plant cell line expressing a polynucleotide encoding an influenza antigen of the invention; That way
(i) 배양물에서 유지된 식물 세포주의 세포내로 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 벡터를 도입시키고;(i) introducing a viral vector consisting of a polynucleotide encoding the influenza antigen of the invention into cells of a plant cell line maintained in culture;
(ii) 바이러스 벡터를 함유하는 세포를 인리치(enrich)시키는 단계로 구성된다. 인리치(enrichment)는 i)배양물로부터 세포의 일부를 제거하고; ii) 세포 농도를 감소시키기 위해 제거된 세포를 희석시키고 (iii) 희석된 세포가 증식되도록 하고; iv) 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 스크리닝하는 것으로 실행된다. 클론 식물 세포주를 본 발명에 따른 인플루엔자 항원 생산에 이용할 수 있다.(ii) enriching the cells containing the viral vector. Enrichment removes a portion of cells from i) culture; ii) diluting the removed cells to reduce cell concentration and (iii) allowing the diluted cells to proliferate; iv) screening for cells comprising the viral vector. Clonal plant cell lines can be used for influenza antigen production according to the invention.
본 발명에는 클론 식물을 생성시키는 방법이 포함되는데, 이 식물의 세포에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 방법에는 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물을 생성시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은The present invention includes a method for producing a clone plant, the cell of which comprises a viral vector consisting of a polynucleotide encoding the influenza antigen of the present invention. For example, the method of the present invention provides a method for producing a clone plant expressing a polynucleotide encoding an influenza antigen of the invention, the method comprising:
(i) 클론 뿌리 라인을 만들고, 이 뿌리 라인의 세포에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈이 포함되며;(i) make a clone root line, the cells of which comprise a genome consisting of polynucleotides encoding the influenza antigen of the invention;
(ii) 클론 뿌리 라인으로부터 개별 세포를 방출시키고; 그리고(ii) releasing individual cells from the clone root line; And
(iii) 식물 형성에 최적의 조건하에 방출된 세포를 유지시키는 단계로 구성된다. 본 발명은 또한 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물을 생성시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은(iii) maintaining the released cells under conditions optimal for plant formation. The invention also provides a method of producing a clone plant expressing a polynucleotide encoding an influenza antigen of the invention, the method comprising
(i) 클론 식물 세포주를 생성시키고, 이 식물의 세포에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈을 가지는 바이러스 벡터를 포함하며; 그리고(i) generate a clone plant cell line, the cells of the plant comprising a viral vector having a genome consisting of a polynucleotide encoding the influenza antigen of the invention; And
(ii) 식물이 형성되는데 최적의 조건하에 세포를 유지하는 단계로 구성된다. 일반적으로 본 발명의 클론 식물은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 임의 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 이와 같은 클론 식물을 항원성 폴리펩티드 생산에 이용할 수 있다.(ii) the plant is formed, which consists in maintaining the cells under optimal conditions. In general, clone plants of the invention can express any polynucleotide encoding the influenza antigen of the invention. Such clone plants can be used for the production of antigenic polypeptides.
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명은 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인(가령, 잎, 줄기 등으로부터 유도된 세포 라인), 클론 식물에서 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 시스템을 제공한다. 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작용가능하도록 연결된 바이러스 벡터를 이용하여 조상전래(ancestral)의 식물 세포로 도입되는데, 이때 벡터의 게놈에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 클론 뿌리 라인 또는 클론 식물 세포 라인은 하기에서 논의하는 몇 가지 기술 중 하나에 따라 바이러스를 포함하는 세포에서 확립한다. 식물 바이러스 벡터 또는 이의 일부분을 감염, 바이러스 전사체의 접종 또는 감염성 cDNA 클론에 의한 감염, 전기 천공 또는 T-DNA 매개 유전자 전달에 의한 감염으로 식물 세포로 도입시킬 수 있다.As described above, the present invention relates to clone root lines, clone root cell lines, clone plant cell lines (eg, cell lines derived from leaves, stems, etc.), polynucleotides encoding the influenza antigen of the present invention in clone plants. It provides a system for expressing. The polynucleotide encoding the influenza antigen of the present invention is introduced into an ancestral plant cell using a viral vector operably linked to a promoter, wherein the polynucleotide encoding the influenza antigen of the present invention is introduced into the genome of the vector. Nucleotides are included. Clonal root lines or clone plant cell lines are established in cells containing viruses according to one of several techniques discussed below. Plant viral vectors or portions thereof can be introduced into plant cells by infection, inoculation of viral transcripts or infection by infectious cDNA clones, infection by electroporation or T-DNA mediated gene transfer.
다음에서는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인, 클론 식물을 생성시키는 방법을 설명한다. "뿌리 라인("root line")은 뿌리 세포 라인( "root cell line")과 구별되어야 하는데, 뿌리 라인은 실질적인 뿌리형태의 구조 또는 뿌리를 생산하지만, 뿌리 세포 라인은 뿌리형 구조를 형성하지 않은 뿌리 세포로 구성된다. 라인("line")은 세포주(또는 세포 라인)이 증식하고 유전자 정보를 후손 세포에 전달하는 것을 말하는 의도로 이용된다. 세포주의 세포는 일반적으로 고유(intact) 식물에서 볼 수 있는 것과 같은 조직화된 구조의 일부가 없는 배양물에서 증식한다. 뿌리 라인("root line")은 완전한 식물의 일부분 없이 뿌리 구조에 세포가 증식할 수 있다는 것을 말한다. "식물 세포"에는 뿌리 세포가 포함된다는 것을 알아야 한다. 그러나, 비-뿌리 조직으로부터 직접적으로 식물 세포 라인을 생성하기 위해 이용된 것으로부터 뿌리 라인 및 뿌리 세포 라인을 생성시키기 위한 발명의 방법을 구별하기 위해(클론 뿌리 라인 또는 클론 뿌리 라인에서 유도된 클른 식물로부터 클론 식물 세포 라인을 생성하는 것에 반대되는 것으로), 여기에서 사용된 "식물 세포" 및 "식물 세포 라인"은 일반적으로 비-뿌리 식물 조직으로 구성된 세포 및 세포 라인을 말하는 것이다. 예를 들면, 식물 세포는 잎, 줄기, 묘조(shoot), 꽃 부분이 될 수 있다. 여기에서 유도된 것과 같이 생성된 클론 식물로부터 씨를 유도할 수도 있다. 이와 같은 씨에는 바이러스 벡터 및 이들 씨들에서 수득한 식물을 포함할 수 있다. 씨 스톡(stocks)을 수득하는 방법은 공지되어 있다(예를 들면, U.S Patent Publication 2004/093643).The following describes a method for producing a clone root line, clone root cell line, clone plant cell line, clone plant expressing a polynucleotide encoding an influenza antigen of the present invention. The "root line" should be distinguished from the "root cell line" where the root line produces a substantially rooted structure or root, while the root cell line does not form a rooted structure. "Line" is used to refer to the propagation of a cell line (or cell line) and transfer of genetic information to descendant cells, where cells of the cell line are generally found in intact plants Proliferate in cultures where there is no part of an organized structure, such as can, etc. A "root line" means that a cell can proliferate in the root structure without a part of the complete plant. However, it should be noted that root lines and root cell lines are generated from those used to generate plant cell lines directly from non-rooted tissue. In order to distinguish the inventive method for producing (as opposed to producing a clone plant cell line from a clone root line or a cloned plant derived from the clone root line), the "plant cells" and "plant cell lines" used herein Refers generally to cells and cell lines consisting of non-rooted plant tissue, for example, plant cells can be leaves, stems, shoots, flower parts, etc. Clones generated as derived from Seeds may also be derived from plants, such seeds may include viral vectors and plants obtained from these seeds .. Methods for obtaining seed stocks are known (for example, see US Patent Publication 2004). / 093643).
클론 뿌리 라인Clone root line
본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 직접 발현에 이용되는 식물 바이러스 벡터가 있는 클론 뿌리 라인을 생성하는 시스템을 제공한다. 프로모터에 작용가능하도록 연결된 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 또는 그이상의 바이러스 발현 벡터를 다양한 공지의 방법 중 하나에 따라 식물 또는 식물의 일부로 도입한다. 예를 들면, 식물 잎에 바이러스 전사체를 접종시킬 수 있다. 벡터 자체를 식물에 직접 제공할 수도 있다(가령, 마찰성 접종, 기계적 분무 접종, 진공 침윤, 입자 투하 또는 전기 천공을 통하여). 대안으로 또는 추가로, 비리온(가령, 이미 감염된 식물로부터)을 만들거나 공지 기술에 따라 다른 식물에 사용할 수 있다.The present invention provides a system for generating clone root lines with plant viral vectors used for direct expression of polynucleotides encoding influenza antigens of the present invention. One or more viral expression vectors comprising polynucleotides encoding influenza antigens of the invention linked to a promoter are introduced into a plant or plant part according to one of a variety of known methods. For example, plant leaves may be inoculated with viral transcripts. The vector itself may also be provided directly to the plant (eg, via frictional inoculation, mechanical spray inoculation, vacuum infiltration, particle release or electroporation). Alternatively or in addition, virions (eg, from already infected plants) can be made or used in other plants according to known techniques.
바이러스 게놈을 식물에 직접 사용하여 감염을 시킬 수 있는데, 임의 이용가능한 기술을 이용하여 바이러스 게놈을 준비한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 유용하게 이용되는 많은 바이러스들은 ssRNA 게놈을 가진다. ssRNA는invivo 또는in vitro에서 게놈의 DNA 복사체의 전사, RNA 복사체의 복제에 의해 만들 수 있다. 바로 이용할 수 있는 경우에 사용이 용이한invitro전사 시스템(가령, SP6, T7, 레티큘로사이트 라이세이트, 등) 및 RNA 벡터의 DNA 복사체 유지의 편의성이 있다면, 본 발명의 ssRNA 벡터들은invitro 전사, 특히 T7 또는 SP6 폴리메라제를 이용한 전사에 의해 만들 수 있다. 감염성 cDNA 클론을 이용할 수도 있다. 아그로박테리아 중개된 유전자 전이를 이용하여 바이러스 벡터와 같은 바이러스 핵산을 당분야에 공지된 방법에 따라 진공침윤(agroinfiltration)을 이용하여 식물 세포로 전달시킨다.Viral genomes can be used directly in plants to infect, and the viral genome is prepared using any available technique. For example, many viruses usefully employed in accordance with the present invention have an ssRNA genome. ssRNA isinIt can be made by transcription of DNA copies of the genome,invivo orinvitro , by replication of RNA copies. Easy to use when ready to useinin vitro If the convenience of a transfer system (e.g., SP6, T7, site licenses glyphosate, such as the retina particulates) RNA and DNA copies of the vector maintenance, ssRNA vectors of the inventioninby in vitro transcription, in particular by transcription using T7 or SP6 polymerase. Infectious cDNA clones can also be used. Agrobacterial mediated gene transfer is used to transfer viral nucleic acids, such as viral vectors, to plant cells using agroinfiltration according to methods known in the art.
그 다음 식물 또는 식물 일부를 바이러스 전사체의 복제에 최적의 조건하에 유지시킨다(배양 또는 생장). 본 발명의 특정 구체예에서, 바이러스는 세포간에 국소적으로 또는 처음 접종된 잎에서 추가 잎으로의 시스템적으로 초기 접종된 세포를 벗어나 전파된다. 그러나, 본 발명의 일부 구체예에서 바이러스는 전파되지 않는다. 따라서, 바이러스 벡터에는 기능을 하는 MP 및/또는 CP를 인코드하는 유전자를 포함하거나 또는 이들 유전자 중 하나 또는 둘다 부족한 것도 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터를 식물 또는 식물의 일부분에 있는 (곤충) 다중 세포로 도입한다.The plant or plant part is then maintained (cultured or grown) under conditions optimal for the replication of the viral transcript. In certain embodiments of the invention, the virus is propagated locally between cells or systemically initially inoculated cells from the first inoculated leaves to additional leaves. However, in some embodiments of the invention the virus is not spread. Thus, viral vectors may contain genes encoding functional MPs and / or CPs, or may lack one or both of these genes. In general, viral vectors are introduced into (insect) multiple cells in a plant or part of a plant.
식물로 바이러스 벡터를 도입시킨 후에, 잎을 수확한다. 일반적으로 잎은 바이러스 벡터를 도입시킨 후 임의 시간에 수확할 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터를 식물로 도입시킨 후 일정 시간 동안 식물을 유지시키는 것이 바람직한데, 예를 들면 바이러스 복제를 할 충분한 시간 동안 그리고 선택적으로 바이러스가 초기 접종된 세포로부터 전파될 수 있는 시간 동안 유지시키는 것이 바람직하다. 하기에서 설명하는 공지의 방법을 이용하여 클론 뿌리 배양물(또는 다중 배양물)을 준비한다.After introducing the viral vector into the plant, the leaves are harvested. In general, leaves can be harvested at any time after introduction of the viral vector. However, it is desirable to maintain the plant for a period of time after introduction of the viral vector into the plant, for example for a sufficient time for viral replication and optionally for a period of time during which the virus can be propagated from the initially seeded cells. desirable. Clonal root cultures (or multicultures) are prepared using known methods described below.
일반적으로, 임의 이용가능한 방법을 이용하여 바이러스 벡터가 도입된 식물 또는 식물 조직으로부터 클론 뿌리 배양물을 준비할 수 있다. 이와 같은 방법중에 하나는 특정 세균 플라스미드에 존재하는 유전자를 이용하는 것이다. 이들 플라스미드들은 DNA를 감염시키고 다양한 많은 유기체로 전달시키는 다양한 종류의 아그로박테리움에서 발견된다. 속(genus)으로써, 아그로박테리움은 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물, 피자 식물 및 속씨 식물종을 포함하는 크고 다양한 식물 타입으로 DNA을 전달 할 수 있다(예를 들면, Gelvin, 2003, Microbiol. MoI. Biol. Rev., 67:16, 참고문헌으로 첨부함). 식물 세포의 유전적 변경의 분자 근간은 다양한 아그로박테리아(Agrobacterial) 종에 내재하는 거대 종양 유도성(Ti) 또는 뿌리를 내는(rhizogenic)(Ri) 플라스미드의 식물 핵 게놈으로 세균의 전달 및 융합이다. 이 부분은 플라스미드에 존재하는 경우에 T- 부분이라고 하고, 플라스미드로부터 잘라낸 경우에 T-DNA라고 한다. 일반적으로 단일 가닥 T-DNA 분자를 자연 발생적 아그로박테리아(Agrobacterial) 감염으로 식물 세포로 전달되며 최종적으로 게놈으로 융합(이중 가닥 형으로)된다. Ti 플라스미드에 기초한 시스템은 식물로 외부 유전자 물질을 도입시키고 유전자 전이 식물을 생산하는데 널리 이용된다.In general, clonal root cultures can be prepared from plants or plant tissues into which viral vectors have been introduced using any available method. One such method uses genes present in certain bacterial plasmids. These plasmids are found in various types of Agrobacterium that infect DNA and deliver it to many different organisms. As a genus, Agrobacterium can deliver DNA to a wide variety of plant types, including dicotyledonous and monocotyledonous plants, pizza plants and genus seed species (eg, Gelvin, 2003, Microbiol. MoI. Biol). Rev., 67:16, attached as a reference). Molecular basis of genetic changes in plant cells is a wide range of Agrobacterium bacteria(Agrobacterial) species massive tumor-induced (Ti), or that a root (rhizogenic) (Ri) transfer of bacteria to the plant of the plasmid nuclear genome inherent in and fused. This part is called T-part when it exists in a plasmid, and it is called T-DNA when it cut out from a plasmid. Typically deliver a single-stranded T-DNA molecule into a naturally-occurring bacterium Agrobacterium(Agrobacterial) a plant cell by infection and is ultimately fused (in the form double-stranded) in the genome. Systems based on Ti plasmids are widely used to introduce foreign genetic material into plants and to produce transgenic plants.
다양한 아그로박테리아(Agrobacterial) 종으로 식물을 감염시키고 T-DNA 전달하는 것은 많은 효과를 가진다. 예를 들면,A.tumefaciens는 근두암종병(crown gall disease )의 원인이 되며,A.rhizogenes는 감염 부위에 모근병(hairy root disease)으로 알려진 가는 뿌리가 자라도록 하는 원인이 된다. 각 뿌리는 하나의 유전학적으로 변형된 세포에서 생성된다. 따라서 뿌리에 있는 뿌리 세포는 클론이며, 각 뿌리는 세포의 클론 집단이 된다.A.rhizogenes 감염에 의해 생성된 뿌리는 높은 생장률과 유전적 안정성을 특징으로 한다(Giri et al, 2000, Biotech. Adv., 18:1, 참고문헌을 첨부한다). 또한, 이와 같은 뿌리는 유전적으로 안정한 식물을 재생할 수 있다. (Giri 2000, supra).The infection of various bacteria, plants with Agrobacterium(Agrobacterial) species and T-DNA transfer has a number of effects. For example,A.tumefaciens causes root gall disease andA.rhizogenes causes thin roots, known as hairy root disease, to grow at the site of infection. Each root is produced in one genetically modified cell. Thus, the root cells in the roots are clones, and each root is a clone of cells. Roots produced by infection withA.rhizogenes are characterized by high growth rates and genetic stability (Giri et al, 2000, Biotech. Adv., 18: 1, with references). In addition, such roots can reproduce genetically stable plants. (
일반적으로, 본 발명은 아그로박테리아(Agrobacteria)의 임의 균주 특히 식물 세포로부터 뿌리 형성을 유도할 수 있는A.rhizogenes 균주를 이용하는 것이 포함된다. 상기에서 언급한 것과 같이, Ri 플라스미드 (Ri T-DNA)의 일부는 모근병을 유발하는데 책임이 있다. Ri 플라스미드의 일부를 식물 세포로 전달하는 것은 Ri 플라스미드를 가지는 아그로박테리움으로 감염시켜 편리하게 실시할 수 있는데, 발명에는 식물 세포로 관련 부분을 도입시키는 대안 방법을 이용하는 것도 포함된다. 이와 같은 방법에는 식물 세포로 유전자 물질을 도입시키는 임의 방법이 포함되는데, 유전자총(biolistics), 전기천공(electroporation), PEG-매개된 DNA 취입, Ti-계 벡터등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. Ri T-DNA의 관련 부분을 바이러스 벡터를 이용하여 식물 세포로 도입시킬 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 벡터에 Ri 유전자가 포함되거나 상이한 바이러스 벡터에 포함될 수 있는데, 이때 이 벡터는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 동일한 또는 상이한 타입이 될 수 있다. 모근을 만드는데 전체 Ri T-DNA가 필요하지 않을 수 있으며, Ri-T-DNA의 일부에 당분야에 공지된 것과 같이 뿌리 형성을 유도하는 충분한 유전 물질이 포함되는 경우에 본 발명은 Ri-T-DNA의 이용을 포함한다. 추가 유전 물질, 가령, Ri 플라스미드내에 있으나, T-DNA에는 존재하지 않는 유전자가 본 발명에 따른 식물 세포로 전달될 수 있으며, 특히 유전자의 발현 산물로 T-DNA가 식물 세포 DNA로 통합되도록 한다.In general, the present invention includes the use of any strain ofAgrobacteria , in particularA.rhizogenes strains capable of inducing root formation from plant cells. As mentioned above, part of the Ri plasmid (Ri T-DNA) is responsible for causing hairy root disease. Delivery of a portion of the Ri plasmid to plant cells can be conveniently carried out by infection with Agrobacterium bearing the Ri plasmid, which includes the use of alternative methods of introducing the relevant portions into the plant cells. Such methods include any method of introducing genetic material into plant cells, including but not limited to biolistics, electroporation, PEG-mediated DNA injection, Ti-based vectors, and the like. Relevant portions of Ri T-DNA can be introduced into plant cells using viral vectors. The Ri vector may be included in the same vector containing a polynucleotide encoding an influenza antigen of the invention or may be included in a different viral vector, wherein the vector comprises a vector comprising a polynucleotide encoding the influenza antigen of the invention. It can be the same or different types. The entire Ri T-DNA may not be needed to create the hair root, and the present invention is directed to Ri-T- when a portion of the Ri-T-DNA contains sufficient genetic material to induce root formation as is known in the art. The use of DNA. Genes in additional genetic material, such as Ri plasmids but not present in the T-DNA, can be delivered to the plant cells according to the invention, in particular allowing the expression of the gene to integrate the T-DNA into plant cell DNA.
본 발명의 특정 구체예에 따라 클론 뿌리 라인을 준비하기 위해, 수확한 잎 부분을 감염 및 형질변환에 적절한 조건하에A.rhizogenes와 접촉시킨다. 잎 부분은 배양물에 유지시켜 모근 발생을 유도한가. 각 뿌리는 클론, 가령 뿌리에 있는 세포는 Ri T-DNA가 전달된 단일 조상 세포에서 유도된 것이다. 본 발명에 따르면, 이와 같은 조상 세포의 일부에는 바이러스 벡터를 포함할 것이다. 따라서, 이와 같은 조상 세포로부터 유도된 뿌리에 세포에는 복제하여 세포 분할 동안에 전이되기 때문에 바이러스 벡터를 포함할 것이다. 따라서, 세포의 높은 비율(가령 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%)의 세포 또는 모든 세포(100%), 또는 실질적으로 모든(최소 98%) 세포에는 바이러스 벡터가 포함될 것이다. 바이러스성 벡터는 클론 뿌리내에 자녀 세포에 의해 유전되어, 뿌리내 바이러스 벡터의 이동이 뿌리를 통하여 바이러스 벡터를 유지시키는데 필수적인 것은 아니다. 개별 클론 모근을 잎 부분으로부터 떼어내어 추가 배양할 수 있다. 이와 같은 뿌리를 뿌리 라인이라고 한다. 분리된 클론 뿌리는 분리 후에 생장을 계속한다.To prepare a clone root line according to certain embodiments of the invention, the harvested leaf portions are contacted withA.rhizogenes under conditions suitable for infection and transformation. Are leaf parts maintained in culture to induce hair follicle development? Each root is a clone, such as cells in the root, derived from a single progenitor cell to which Ri T-DNA has been delivered. According to the present invention, some of these progenitor cells will include viral vectors. Thus, cells that are derived from such progenitor cells will contain viral vectors because they replicate to cells and spread during cell division. Thus, a high percentage of cells (e.g., at least 50%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%) or all cells (100%), or substantially all (at least 98%) cells, have a virus. The vector will be included. Viral vectors are inherited by the child cells in the clone roots, so that migration of the viral vectors in the roots is not necessary to maintain the viral vectors through the roots. Individual cloned roots can be removed from the leaf portion and further cultured. Such roots are called root lines. Isolated clone roots continue to grow after separation.
다양한 상이한 클론 뿌리 라인을 본 발명의 방법을 이용하여 만들었다. 이들 뿌리 라인은 본 발명의 인플루엔자 항원(가령, 인플루엔자 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 인코드하는)을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 이용하여 만들었다. 뿌리 라인을 웨스턴 블랏으로 테스트하였다. 뿌리 라인은 다양한 폴리펩티드의 상이한 발현 수준을 나타낸다. 높은 발현을 보여주는 뿌리 라인을 선택하여 추가 배양한다. 이들 뿌리 라인을 다시 연속 테스트하여, 상당 시간동안 높은 발현 수준을 유지한다는 것을 보여주었다. 발현 수준은 클론 뿌리 라인을 만드는데 이용된 동일한 바이러스 벡터로 감염된 고유 식물에서의 발현과 필적하거나 그 이상이었다. 또한, 뿌리 라인의 발현 안정성은 동일한 바이러스 벡터로 감염된 식물에서 수득한 것 이상이었다. 이와 같은 바이러스 감염된 식물의 최고 80%는 2-3 계대후에 야생형으로 복귀된다. (이와 같은 계대는 전사체를 식물에 접종하여, 감염(국소 또는 전신)이 일어나게 하고, 잎 샘플을 취하고, 발현에 대해 연속적으로 테스트하기 위해 새로운 식물에 접종하는 것과 연관된다).Various different clone root lines were made using the method of the present invention. These root lines were made using viral vectors comprising polynucleotides encoding influenza antigens of the invention (eg, encoding influenza polypeptides or fragments thereof or fusion proteins thereof). Root lines were tested by Western blot. Root lines represent different expression levels of various polypeptides. Further incubate by selecting root lines showing high expression. These root lines were again tested in series, showing that they maintained high expression levels for a significant time. Expression levels were comparable or higher than those in native plants infected with the same viral vector used to make the clone root line. In addition, the expression stability of the root line was higher than that obtained in plants infected with the same viral vector. Up to 80% of these virally infected plants return to wild type after 2-3 passages. (This passage is associated with inoculating a plant with a transcript, causing infection (local or systemic) to occur, taking leaf samples, and inoculating new plants to continuously test for expression).
하기에서 설명하는 것과 같이 본 발명의 펩티드의 항원을 생산하기 위해 대규모로 뿌리 라인을 배양할 수 있다. 클론 뿌리 라인( 및 클론 뿌리 라인에서 유도된 세포 라인)은 뿌리 및 식물 세포의 배양에 일반적으로 이용되는 다양한 화합물, 가령 옥신, 사이코키닌과 같은 식물 생장 호르몬을 포함하지 않은 배지에 유지시킨다. 이와 같은 특징은 조직 배양과 연관된 비용을 상당히 줄여주고, 발명자는 이것이 식물을 이용하는 단백질 생산의 경제적 실익에 상당히 기여할 것으로 기대한다.Root lines can be cultured on a large scale to produce antigens of the peptides of the invention, as described below. Clone root lines (and cell lines derived from clone root lines) are maintained in a medium that does not contain plant growth hormones such as various compounds commonly used for the cultivation of roots and plant cells, such as auxin, psychokinin. This feature significantly reduces the costs associated with tissue culture, and the inventors expect it to contribute significantly to the economic benefits of protein production using plants.
다양한 임의 방법을 이용하여 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리를 선별할 수 있을 것이다. 웨스턴 블랏, ELISA 검사 등을 이용하여 인코드된 폴리펩티드를 감지할 수 있다.Various arbitrary methods may be used to select clone roots that express polynucleotides encoding influenza antigens of the invention. Western blots, ELISA assays and the like can be used to detect encoded polypeptides.
GFP와 같은 감지가능한 마커의 경우에, 비쥬얼 스크린과 같은 대안법을 실시할 수 있을 것이다. 선택가능한 마커를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 이용한다면, 적절한 선택을 부여해야한다(가령, 잎 물질 또는 이로부터 유도된 뿌리를 적절한 항생제 또는 영양 조건하에서 배양하여 생존하는 뿌리를 확인하고 분리하는). 특정 바이러스 벡터에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 두 개 또는 그이상의 폴리뉴클레오티드, 가령 상이한 폴리펩티드를 인코드하는 두 개 또는 그이상의 폴리뉴클레오티드, 포함한다. 이들중 하나가 선택성 또는 감지가능한 마커인 경우에, 마커의 발현을 선택 또는 감지에 의해 선택된 또는 감지된 클론 뿌리는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 가능성이 높다. 특정 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뿌리 라인의 스크리닝도 PCR 및 다른 핵산 감지 방법을 이용하여 실행할 수 있을 것이다.In the case of detectable markers such as GFP, alternative methods such as visual screens may be implemented. If viral vectors containing polynucleotides encoding selectable markers are used, appropriate selection should be given (e.g., leaf material or roots derived therefrom are cultured under appropriate antibiotic or nutrient conditions to identify surviving roots and Separated). Certain viral vectors include two or more polynucleotides encoding influenza antigens of the invention, such as two or more polynucleotides encoding different polypeptides. If one of these is a selectable or detectable marker, the clone roots selected or sensed by selecting or sensing the expression of the marker are likely to express the second polynucleotide. Screening of root lines comprising specific polynucleotides may also be performed using PCR and other nucleic acid detection methods.
대안으로 또는 추가적으로, 클론 뿌리 라인은 바이러스 감염 결과로 국소 병소를 형성하게 되는 숙주 식물(가령, 과민성 숙주 식물)의 접종에 의해 바이러스 존재에 대해 스크리닝할 수 있을 것이다. 예를 들면, 뿌리 조직 5mg을 50㎕ 인산염 완충액에서 균질화시키고, 이를 이용하여 담배 식물의 단일 잎에 접종한다. 바이러스가 뿌리 배양물에 존재하는 경우에, 2 내지 3일 이내에 특징적인 병소가 감염된 잎에 나타날 것이다. 이는 뿌리 라인에 본 발명의 인플루엔자 항원(표적 유전자)을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 재조합 바이러스를 포함한다는 것을 의미한다. 국소 병소들이 형성되지 않으면, 바이러스는 없는 것이고, 뿌리 라인은 네가티브로 거절된다. 이 방법은 시간 및 비용 측면에서 효과적이다. 바이러스 존재에 대해 초기 스크리닝 후에, 바이러스를 포함하는 뿌리는 2차 스크리닝 가령, 웨스턴 블랏 또는 ELISA을 받게되어 높은 발현체를 선별한다. 추가 스크리닝, 예를 들면 신속한 생장, 특정 매체에서 생장 또는 특정 환경 조건하에서의 생장에 대한 스크리닝을 할 수 있을 것이다. 이와 같은 스크리닝 방법은 일반적으로 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인 및/또는 클론 식물 임의 발생에 이용할 수 있을 것이다.Alternatively or additionally, the clone root line may be screened for virus presence by inoculation of host plants (eg, hypersensitive host plants) that will form local lesions as a result of viral infection. For example, 5 mg of root tissue is homogenized in 50 μl phosphate buffer and used to inoculate single leaves of tobacco plants. If the virus is present in root culture, characteristic lesions will appear on the infected leaves within two to three days. This means that the root line includes a recombinant virus that carries a polynucleotide encoding the influenza antigen (target gene) of the invention. If no local lesions are formed, the virus is free and the root line is negatively rejected. This method is effective in terms of time and cost. After initial screening for the presence of the virus, roots containing the virus are subjected to a second screening such as Western blot or ELISA to select high expression. Further screening may be possible, for example for rapid growth, growth in certain media or growth under certain environmental conditions. Such screening methods will generally be available for clonal root lines, clone root cell lines, clone plant cell lines and / or clone plant random development.
당업자에게 명백한 것과 같이, 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 라인을 만드는 발명의 설명에 다양한 변형이 가능할 수 있다. 이와 같은 변형도 본 발명의 범주내에 있다. 예를 들면, Ri T-DNA 유전자의 도입전에 고유 식물 또는 이의 일부분으로 바이러스 벡터를 도입시키는 것이 일반적으로 바람직할 수 있으나, 일부 특정 구체예에서, Ri-DNA를 바이러스 벡터 도입전에 도입시킨다. 또한, 잎 부분을 수확하여 세균에 노출시키기 전에 고유 식물을A. rhizogenes에 접촉시키는 것도 가능하다.As will be apparent to those skilled in the art, various modifications may be made to the description of the invention for making clone root lines comprising viral vectors. Such modifications are also within the scope of the present invention. For example, it may generally be desirable to introduce viral vectors into native plants or portions thereof prior to the introduction of the Ri T-DNA gene, but in some specific embodiments, the Ri-DNA is introduced prior to viral vector introduction. It is also possible to contact native plants withA. rhizogenes before harvesting the leaves and exposing them to bacteria.
바이러스 벡터를 보유하는 식물 또는 식물의 일부분의 단일 세포로부터 클론 뿌리 라인을 만드는 다른 방법을 이용할 수 있다(가령, Ri 플라스미드로부터 유전 물질 또는A. rhizogenes을 이용하지 않는 방법). 예를 들면, 식물 호르몬 또는 특정 식물 호르몬 복합물로 처리하여 식물 조직으로부터 뿌리를 생성시키는 것은 공지의 것이다.Other methods of making clone root lines from a single cell of a plant or part of a plant containing the viral vector can be used (eg, without using genetic material orA. rhizogenes from the Ri plasmid). For example, it is known to generate roots from plant tissues by treating with plant hormones or certain plant hormone complexes.
클론 뿌리 라인으로부터 유도된 클론 세포 라인Clone cell line derived from clone root line
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 클론 뿌리 라인을 생성하는 방법을 제공하는데, 이때 뿌리 라인의 세포에는 바이러스 벡터가 포함되어 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 다양한 상이한 세포가 뿌리로부터 생성된다. 예를 들면, 뿌리 세포 라인은 다양한 공지의 방법을 이용하여 뿌리로부터 수득된 개별 뿌리 세포로부터 생성된다. 이와 같은 뿌리 세포 라인은 뿌리내에 다양한 상이한 뿌리 세포 타입으로부터 수득될 수도 있다. 일반적으로 뿌리 물질을 수확하여 분해시켜(예를 들면, 물리적으로 또는 효소적으로 분해), 개별 뿌리 세포를 방출시키고 추가 배양한다. 완전한 프로토플라스트(protoplast)을 형성할 필요는 없다. 원하는 경우, 단일 뿌리 세포로부터 뿌리 세포 라인을 얻기 위해, 뿌리 세포를 매우 희석된 세포 농도에서 플레이트할 수 있다. 이와 같은 방식으로 유도된 뿌리 세포 라인은 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 세포 라인이다. 이와 같은 뿌리 세포 라인은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 나타낸다. 적절한 식물 호르몬 존재하에 분해된 뿌리 세포를 배양함으로써 클론 뿌리로부터 유사한 방식으로 클론 식물 세포 라인을 수득할 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현시키는 세포 라인을 확인하기 위해 인리치의 스크리닝 및 연속적인 라운드(successive rounds)를 이용할 수 있다. 그러나, 세포 라인이 유도된 클론 뿌리 라인이 높은 수준으로 발현시키면 추가 스크리닝은 불필요하다.As discussed above, the present invention provides a method for generating a clone root line, wherein the cells of the root line contain a viral vector. As is known in the art, a variety of different cells are produced from the roots. For example, root cell lines are generated from individual root cells obtained from the roots using various known methods. Such root cell lines may be obtained from a variety of different root cell types in the roots. Generally, root material is harvested and degraded (eg, physically or enzymatically) to release individual root cells and further culture. It is not necessary to form a complete protoplast. If desired, root cells can be plated at highly diluted cell concentrations to obtain root cell lines from single root cells. The root cell line derived in this manner is a clone root cell line comprising a viral vector. Such root cell lines show expression of polynucleotides encoding influenza antigens of the invention. Clonal plant cell lines can be obtained in a similar manner from clone roots by culturing the degraded root cells in the presence of appropriate plant hormones. Screening and successive rounds of inrich can be used to identify cell lines that express high levels of polynucleotides encoding influenza antigens of the invention. However, if the cloned root line from which the cell line was induced is expressed at high levels, further screening is unnecessary.
클론 뿌리 라인의 경우에서와 같이 클론 뿌리 세포 라인의 세포는 바이러스 벡터를 포함하는 단일 조상 세포로부터 유도되고, 따라서 바이러스 벡터를 포함하는데, 이는 복제되어 세포 분할 동안에 전이된다. 따라서, 높은 비율(가령, 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%), 세포의 전부(100%), 또는 실질적으로 전체(최소 98%) 세포에는 바이러스 벡터를 포함할 것이다. 바이러스 벡터는 클론 뿌리 세포 라인내에 자녀 세포에 의해 유전되기 때문에, 세포중에서 바이러스 벡터의 이동이 바이러스 벡터를 유지하는데 필수사항이 아니라는 것이다. 하기에서 설명하는 것과 같이 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 클론 뿌리 세포 라인을 이용할 수 있다.As in the case of the clone root line, the cells of the clone root cell line are derived from a single progenitor cell comprising the viral vector and thus comprise the viral vector, which is replicated and transferred during cell division. Thus, a high percentage (e.g., at least 50%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%), all (100%), or substantially whole (at least 98%) cells of a cell are assigned a viral vector. Will include. Since viral vectors are inherited by child cells in clone root cell lines, the migration of viral vectors in the cells is not essential to maintaining the viral vectors. Clonal root cell lines can be used to produce polynucleotides encoding the influenza antigens of the invention as described below.
클론 식물 세포 라인Clone plant cell line
본 발명은 클론 식물 세포 라인을 생성하는 방법을 제공하는데, 이때 식물 바이러스 벡터를 이용하여 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 직접 발현시킨다. 본 발명의 방법에 다르면 프로모터에 작용가능하도록 연결된 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 또는 그이상의 바이러스 발현 벡터를 세포 배양물내에 유지된 식물 세포 라인의 세포내로 도입한다. 다양한 타입의 식물로부터 다수의 식물 세포 라인이 공지되어 있는데, 이들중 임의의 것을 이용할 수 있을 것이다. 새로이 유도된 세포 라인은 본 발명을 실행하는데 이용되는 공지 방법에 따라 만들 수 있을 것이다. 다수의 방법중 임의 방법에 따라 식물 세포 라인의 세포내로 바이러스 벡터를 도입시킨다. 예를 들면, 프로토플라스트를 준비하고 바이러스 전사체를 세포내로 전기천공시킨다. 식물 세포 라인의 세포로 식물 바이러스 벡터를 도입시키는 다른 방법들도 이용할 수 있다.The present invention provides a method for generating a clone plant cell line, wherein a plant viral vector is used to directly express a polynucleotide encoding the influenza antigen of the present invention. According to the method of the present invention, one or more viral expression vectors comprising polynucleotides encoding the influenza antigens of the present invention operably linked to a promoter are introduced into cells of plant cell lines maintained in cell culture. Numerous plant cell lines are known from various types of plants, any of which may be used. Newly derived cell lines may be made according to known methods used to practice the present invention. Viral vectors are introduced into cells of plant cell lines according to any of a number of methods. For example, protoplasts are prepared and virus transcripts are electroporated into cells. Other methods of introducing plant viral vectors into cells of the plant cell line can also be used.
본 발명에 따른 클론 식물 세포 라인을 생성시키는 방법 및 식물 세포(가령 프로토플라스트)내로 도입에 적절한 바이러스 벡터를 생성시키는 방법은 다음과 같이 이용할 수 있다: 바이러스 벡터를 도입시킨 후에, 식물 세포 라인을 조직 배양물에 유지시킨다. 이 기간 동안 바이러스 벡터가 복제되고, 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 발현될 것이다. 클론 식물 세포 라인은 연속 인리치먼트 과정에 의해 배양물로부터 유도된다. 예를 들면 샘플을 배양물에서 빼내고 선택적으로 세포의 농도를 낮추기 위해 희석할 수 있으며, 개별 드롭(droplet)으로 배양접시상에 도말한다. 드롭을 유지시켜 세포 분할을 허용한다.Methods for generating cloned plant cell lines according to the invention and for generating viral vectors suitable for introduction into plant cells (eg protoplasm) can be used as follows: After introduction of the viral vectors, the plant cell lines are applied. Maintain in tissue culture. During this period the viral vector will be replicated and the polynucleotides encoding the influenza antigens of the invention will be expressed. Clonal plant cell lines are derived from the culture by a continuous enrichment process. For example, samples may be withdrawn from the culture and optionally diluted to lower the concentration of cells and plated on the petri dish in separate droplets. Maintain the drop to allow cell division.
드롭에는 배양물의 초기 밀도, 희석 양에 따라 다양한 세포 수를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 1회의 인리치먼트후에 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 세포 라인을 수득하고자 한다면, 세포를 희석하여 대부분의 드롭에 0 또는 1 세포가 포함될 수 있도록 한다. 그러나, 멀티 세포가 각 드롭에 존재하도록 농도를 선별하고, 발현 세포를 포함하는 지를 확인하기 위해 드롭을 스크리닝하는 것이 좀더 효과적일 것이다. 일반적으로, 임의 적절한 스크리닝 과정을 이용할 수도 있을 것이다. 예를 들면, GFP와 같은 감지가능한 마커를 이용할 수 있을 것이다. 웨스턴 블랏 또는 ELISA 검사를 이용할 수도 있다. 각 드롭(100㎕)에는 이들 검사를 실행하는데 충분한 양이상의 세포를 포함한다. 다수의 인리치먼트 라운드를 실행하여 연속덕으로 더 높은 발현 세포 주를 분리한다. 단일 클론 식물 세포 라인(예를 들면, 단일 조상 세포로부터 유도된 집단)은 단일 세포 클로닝을 위한 표준 방법을 이용하여 추가 희석을 제한시켜 생성시킬 수 있다. 그러나, 개별 클론 라인을 반드시 분리시킬 필요는 없다. 다중 클론 세포 라인을 포함하는 집단을 이용하여 본 발명의 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다.It will be appreciated that the drop may include various cell numbers depending on the initial density of the culture, the amount of dilution. If one would like to obtain a clone cell line expressing a polynucleotide encoding the influenza antigen of the present invention after one enrichment, the cells are diluted so that most drops contain 0 or 1 cells. However, it would be more effective to screen the concentrations so that multiple cells are present in each drop and screen the drop to ensure that it contains expressing cells. In general, any suitable screening procedure may be used. For example, a detectable marker such as GFP may be used. Western blot or ELISA tests may also be used. Each drop (100 μl) contains more than enough cells to run these tests. Multiple enrichment rounds are run to isolate higher expressing cell lines in series. Monoclonal plant cell lines (eg, populations derived from single progenitor cells) can be generated by limiting further dilution using standard methods for single cell cloning. However, it is not necessary to separate the individual clone lines. Populations comprising multiple clonal cell lines can be used to express polynucleotides encoding one or more influenza antigens of the invention.
일반적으로, 클론 뿌리 라인을 생성시키기 위해 상기에서 설명한 특정 방식을 클론 식물 세포 라인 생성에 응용한다. 예를 들면, 다중 상이한 벡터 조합을 이용할 수 있는 것과 같이 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 하나 또는 그이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 다양성을 이용할 수 있다. 유사한 스크리닝 방법을 이용할 수도 있다. 클론 뿌리 라인 및 클론 뿌리 세포 라인의 경우와 같이, 클론 식물 세포 라인의 세포들은 바이러스 벡터를 포함하는 단일 조상 세포로부터 유도되어, 따라서 이들이 복제될 것이고, 세포 분할 동안 전달되기 때문에 바이러스 벡터를 포함하게 될 것이다. 따라서, 세포의 많은 부분(가령 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%), 모든 세포(100%), 똔느 실질적으로 모든 세포(최소 98%)에 바이러스 벡터가 포함될 것이다. 클론 식물 세포 라인내에 자녀 세포에 의해 바이러스 벡터가 유전될 것이므로, 세포간에 바이러스 벡터의 이동이 바이러스 벡터를 유지시키는데 반드시 필요한 것은 아니다. 하기에서 설명하는 것과 같이 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리펩티드를 생산하는데 클론 식물 세포 라인을 이용할 수도 있다.In general, the specific manner described above for generating clone root lines is applied to clone plant cell line generation. For example, the diversity of viral vectors comprising one or more polynucleotides encoding the influenza antigens of the invention can be used, such as multiple different vector combinations can be used. Similar screening methods may be used. As with the clone root line and clone root cell line, the cells of the clone plant cell line are derived from a single ancestral cell comprising the viral vector, thus containing the viral vector as they will replicate and be delivered during cell division. will be. Thus, a large number of cells (e.g., at least 50%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%), all cells (100%), and substantially all cells (at least 98%) have viral vectors Will be included. Since viral vectors will be inherited by child cells in clone plant cell lines, the migration of viral vectors between cells is not necessary to maintain the viral vector. Clonal plant cell lines can also be used to produce polypeptides encoding the influenza antigens of the present invention as described below.
클론 식물Clone plant
클론 식물은 상기에서 설명하는 다양한 방법에 따라 만들어진 클론 뿌리, 클론 뿌리 세포 라인 및/또는 클론 식물 세포 라인으로부터 생성될 수 있다. 여기에서 설명하는 것과 같이, 뿌리, 뿌리 세포 라인, 클론 뿌리 라인과 같은 식물 세포 라인 및 클론 뿌리 세포 라인 및 클론 식물 세포 라인으로부터 식물을 생성시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다(가령, Peres et ai, 2001, Plant Cell, Tissue, Organ Culture, 65:37; and standard reference works on Plant molecular biology and biotechnology cited elsewhere herein). 따라서, 본 발명은 다음의 단계로 구성된 클론 식물을 생성시키는 방법을 제공한다; (i) 상기에서 설명하는 방법중 임의 방법에 따라 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인 또는 클론 식물 세포를 생성시키고; 그리고 (ii) 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인 또는 클론 식물로부터 온전한 식물을 생성한다. 클론 식물이 증식되고, 표준 방법에 따라 생장한다.Clone plants can be generated from clone roots, clone root cell lines and / or clone plant cell lines made according to the various methods described above. As described herein, methods for producing plants from roots, root cell lines, plant cell lines such as clone root lines and clone root cell lines and clone plant cell lines are known in the art (eg, Peres et ai). , 2001, Plant Cell, Tissue, Organ Culture, 65:37; and standard reference works on Plant molecular biology and biotechnology cited elsewhere herein). Accordingly, the present invention provides a method for producing a clone plant consisting of the following steps; (i) producing a clone root line, clone root cell line or clone plant cell according to any of the methods described above; And (ii) create intact plants from clone root lines, clone root cell lines or clone plants. Clone plants are multiplied and grown according to standard methods.
클론 뿌리 라인의 경우에서와 같이, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인, 클론 식물의 세포들은 바이러스 벡터를 포함하는 단일 조상 세포로부터 유도되어, 이것들이 복제하고 분할 동안에 전이되기 때문에 바이러스 벡터를 포함하게 될 것이다. 따라서, 세포의 많은 부분(가령 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%), 모든 세포(100%), 똔느 실질적으로 모든 세포(최소 98%)에 바이러스 벡터가 포함될 것이다. 클론 식물내에 자녀 세포에 의해 바이러스 벡터가 유전될 것이므로, 세포간에 바이러스 벡터의 이동이 바이러스 벡터를 유지시키는데 반드시 필요한 것은 아니다.As in the case of the clone root line, the cells of the clone root cell line, clone plant cell line, clone plant are derived from a single progenitor cell containing the viral vector, so that they contain the viral vector because they replicate and metastasize during division. Will be. Thus, a large number of cells (e.g., at least 50%, at least 75%, at least 80%, at least 90%, at least 95%), all cells (100%), and substantially all cells (at least 98%) have viral vectors Will be included. Since the viral vector will be inherited by child cells in clone plants, the migration of the viral vector between cells is not necessary to maintain the viral vector.
발아(Sprouts) 및 출아묘(Sprouted Seedling) 식물 발현 시스템Sprouts and Sprouted Seedling Plant Expression System
본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 생산하는데 유용한 다양한 발아 및 출아묘를 생성하기 위한 시스템 및 시약들은 이미 설명된 바 있으며 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, PCT Publication WO 04/43886, 참고문헌으로 첨부한다). 본 발명은 또한 출아묘를 제공하는데, 이는 인플루엔자 항원을 포함하는 바이오매스로 식용가능하다. 특정 측면에서, 바이오매스는 조성물을 포함하는 항원 소비를 위해 직접적으로 제공된다. 일부 측면에서 바이오매스를 소비전에 프로세싱 예를 들면 균질화(homogenizing), 크러슁(crushing), 건조 또는 추출할 수 있다. 특정 측면에서 바이오매스로부터 인플루엔자 항원을 정제하여, 약학 조성물로 조제할 수 있다. 생(live)으로 소비되거나 수확될 수 있는 출아묘(가령,Brassica속의 발아, 출아묘) 내에서 인플루엔자 항원을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 일정한 내부 조절가능한 환경(방, 용기 등)에서 씨앗을 식용 출아묘로 생장시키는 것과 관련된다. 씨앗은 발현이 외인성 유도가능한 프로모터에 의해 구동될 수 있고, 인플루엔자 항원을 인코드하는 발현 카세트를 포함하는 유전공학적으로 조작된 씨앗이 될 수 있다. 빛, 열, 식물성 호르몬에 의해 유도될 수 있는 다양한 외인성 유도성 프로모터를 이용할 수 있을 것이다.Systems and reagents for producing various germinated and sprouted seedlings useful for producing influenza antigens according to the invention have already been described and are known in the art (for example, PCT Publication WO 04/43886, appended by reference). do). The present invention also provides sprouted seedlings, which are edible as biomass comprising influenza antigens. In certain aspects, biomass is provided directly for antigen consumption comprising the composition. In some aspects the biomass may be processed, for example homogenizing, crushing, drying or extracting before consumption. In certain aspects, influenza antigens can be purified from biomass and formulated into pharmaceutical compositions. Sprouted seedlings that can be consumed or harvested live (egBrassica Germination of the genus, sprouted seedlings) is provided further methods for producing influenza antigen. In certain aspects, the present invention relates to growing seeds into edible sprouted seedlings in a constant internally controlled environment (room, container, etc.). The seed can be driven by an exogenous inducible expression and can be a genetically engineered seed comprising an expression cassette encoding an influenza antigen. Various exogenous inducible promoters may be used that can be induced by light, heat, and plant hormones.
관련 구체예에서, 본 발명은 아그로박테리움 형질전환 시스템을 이용하여 인플루엔자 항원을 인코드하는 박현 카세트로 식물을 형질변환시켜 출아묘용 씨앗 스톡을 우선 만들어 출아묘에서 인플루엔자 항원을 생산하는 방법을 제공하는데, 이때 인플루엔자 항원의 발현은 유도성 프로모터에 의해 구동된다. 유전자 전이 씨앗은 한정된, 조절가능한 환경에서 생장된 형질변환된 식물에서 수득하여 인플루엔자 항원을 발현하도록 유도할 수 있다.In a related embodiment, the present invention provides a method of producing an influenza antigen in sprouted seedlings by first transforming a plant with a Park Hyun cassette that encodes an influenza antigen using an Agrobacterium transformation system to produce seed stock for sprouting seedlings. In this case, expression of the influenza antigen is driven by an inducible promoter. Gene transfer seeds can be obtained from transformed plants grown in a defined, controlled environment to induce influenza antigen expression.
일부 구체예에서, 인플루엔자 항원을 인코드하는 바이러스 발현 카세트로 발아묘를 감염시키는 방법을 제공하는데 이때 발현은 바이러스 프로모터 또는 유도성 프로모터중 임의의 것에 의해 구동된다. 출아묘는 한정된, 조절가능한 환경에서 2 내지 14일간 생장시키거나 또는 소비 또는 수확을 위해 충분한 양의 인플루엔자 항원이 수득될 때까지 생장시킨다.In some embodiments, a method of infecting a germ seedling with a virus expression cassette encoding an influenza antigen is provided wherein the expression is driven by any of a viral promoter or an inducible promoter. Sprouted seedlings are grown for 2 to 14 days in a defined, controlled environment or until sufficient influenza antigens are obtained for consumption or harvest.
본 발명은 출아묘에서 인플루엔자 항원을 생산하기 위한 시스템을 추가로 제공하는데, 시스템에는 온도 조절이 가능한 하우징 유닛과 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원을 인코드하는 발현 카세트를 포함하는 출아묘가 포함되는데, 이때 발현은 구성 또는 유도성 프로모터에 의해 구동된다. 시스템은 조절이 불가능한 외부 환경에 대해 또는 온실에 대해 독특한 장점을 제공한다. 따라서, 본 발명은 재배업자가 인플루엔자 항원의 발현을 유도하기 위해 정확하게 시간을 조절할 수 있게 한다. 이는 인플루엔자 항원을 생산하기 위한 시간 및 비용을 상당히 감소시켜 줄 수 있다.The present invention further provides a system for producing influenza antigen in sprouted seedlings, the system comprising a sprouting seedling comprising a temperature controllable housing unit and an expression cassette encoding one or more influenza antigens, wherein Expression is driven by constitutive or inducible promoters. The system offers unique advantages for the uncontrolled external environment or for the greenhouse. Thus, the present invention allows growers to precisely control time to induce expression of influenza antigens. This can significantly reduce the time and cost for producing influenza antigens.
특정 측면에서, 일과성 형질감염된 발아에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 바이러스 벡터를 포함한다. 묘목은 일정시간 생장되어 발아에서 바이러스 핵산을 생산할 수 있도록 하고, 생장 후에 다중 복사체 바이러스가 생산되어 인플루엔자 항원이 생산된다.In certain aspects, transient transfected germination includes viral vectors encoding the influenza antigens of the invention. Seedlings grow for a period of time to allow the production of viral nucleic acids in germination, after which multiple copy viruses are produced to produce influenza antigens.
특정 측면에서, 인플루엔자 항원을 인코드하는 핵산을 포함하는 유전공학적으로 조작된 씨앗 또는 배를 한정된, 제어가능한 환경에서 출아묘로 생장하게 한다. 한정된 제어가능한 환경은 씨앗이 실내에서 생장할 수 있도록 하우징 유닛 또는 룸이 될 수 있다. 한정된, 조절가능한 환경의 모든 환경 요인은 조절가능하다. 싹은 생장을 위해 빛을 요구하지 않기 때문에, 조명은 고가이며, 유전공학적으로 조작된 씨앗 또는 배아를 빛이 없는 실내에서 출아묘 단계로 생장시킬 수 있을 것이다.In certain aspects, genetically engineered seeds or embryos comprising nucleic acids encoding influenza antigens are allowed to grow into sprouted seedlings in a defined, controllable environment. The limited controllable environment can be a housing unit or room so that the seeds can grow indoors. All environmental factors of the limited, adjustable environment are adjustable. Since shoots do not require light to grow, lighting can be expensive and genetically engineered seeds or embryos can be grown to the germination seed stage in a light-free room.
본 발명의 한정된 조절가능한 환경에서 조절될 수 있는 다른 외부 환경 요인에는 온도, 습도, 수분, 영양소, 가스(가령, O2 또는 CO2 함량 또는 대기 순환), 화학물질(당 및 당 유도체와 같은 소분자 또는 식물성 호르몬 지베릴렌산 또는 아브시식산과 같은 호르몬) 및 이와 유사한 것들이 포함된다.Other external environmental factors that can be controlled in the limited adjustable environment of the present invention include temperature, humidity, moisture, nutrients, gases (eg, O2 or CO2 content or atmospheric circulation), chemicals (small molecules such as sugars and sugar derivatives). Or hormones such as the vegetable hormone gibberylene acid or abcic acid) and the like.
본 발명의 특정 방법에 따르면, 인플루엔자 항원을 인코드하는 핵산의 발현은 외인성 유도성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 외인성 유도성 프로모터는 내부 자극보다는 외부 자극에 반응하여 핵산의 발현을 증가 또는 감소시키게 된다. 다수의 환경 인자들이 유전공학적으로 조작된 싹의 발현 카세트에 의해 운반되는 핵산의 발현 유도물질로 기능할 수 있다. 프로모터는 열-쇼크 프로모터와 같은 역-유도성 프로모터가 될 수 있다. 예를 들면, 열-쇼크 프로모터를 이용하여 한정된 공간의 환경의 온도를 핵산 발현을 유도하기 위해 상승시킬 수도 있다. 다른 프로모터에는 빛 유도성 프로모터가 포함된다. 한정된 조절가능한 환경에 항상 빛이 제공되는 경우에, 빛 유도성 프로모터들은 구성 프로모터로 유지시킬 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로 빛을 단순하게 밝혀서 발생 동안 특정 시기에 핵산 발현을 개시시킬 수도 있다. 프로모터는 핵산 발현을 유도할 때 사용되는 화학물질에 의한 유도성 프로모터가 될 수도 있다. 이와 같은 구체예에 따르면 화학물질을 씨, 배아 또는 출아묘에 단순히 안개처럼 뿌리거나 분무하여 핵산 발현을 유도할 수 있다. 살포나 분무를 정확하게 조절가능하며, 표적 씨, 배아 또는 묘목에 의도하는 바에 따라 직접 가할 수 있다. 한정된 환경은 바람 또는 기류가 없기 때문에 원하는 표적으로부터 화학물질을 소산시킬 수 있어 원하는 바에 따라 표적에 화학물질을 유지시킬 수 있다.According to certain methods of the invention, the expression of nucleic acids encoding influenza antigens can be regulated by exogenous inducible promoters. Exogenous inducible promoters increase or decrease the expression of nucleic acids in response to external stimuli rather than internal stimuli. Many environmental factors can function as expression inducers of nucleic acids carried by genetically engineered shoot expression cassettes. The promoter may be a reverse-induced promoter such as a heat-shock promoter. For example, a heat-shock promoter may be used to raise the temperature of the confined space's environment to induce nucleic acid expression. Other promoters include light inducible promoters. In the case where light is always provided in a limited adjustable environment, light inducible promoters can be maintained as constitutive promoters. Alternatively or additionally, light may simply be revealed to initiate nucleic acid expression at specific times during development. The promoter may be an inducible promoter by a chemical used to induce nucleic acid expression. According to this embodiment, the nucleic acid expression can be induced by simply misting or spraying the chemical onto seeds, embryos or sprouted seedlings. Spraying or spraying is precisely controllable and can be applied directly to the target seed, embryo or seedling as intended. The confined environment is free of wind or airflow, allowing the chemical to dissipate from the desired target, keeping the chemical on the target as desired.
본 발명에 따르면, 수확시기에 출아묘에 인플루엔자 항원의 발현을 최대화시키기 위해 발현 유도 시간을 선택할 수 있다. 특정 생장 단계에서 배아에서 발현 유도 예를 들면, 발아(germination) 후 특정 일정에 배아에서 발현 유도로 인하여 수확시기에 인플루엔자 항원의 최대 합성을 이끈다. 예를 들면 발아후 4일째에 프로모터로부터 발현을 유도하여 3일 또는 5일째에 프로모터 발현을 유도한 것보다 더 많은 단백질을 합성하게 된다. 당업자는 일상적인 실험을 통하여 최대 발현을 얻을 수 있을 것이다. 특정 방법에서 출아묘는 발아후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 12일에 수확할 수 있다.According to the present invention, the expression induction time can be selected to maximize the expression of influenza antigen in the sprouted seedlings at harvest time. Induction of expression in embryos at certain stages of growth, for example, leading to maximum synthesis of influenza antigens at harvest time due to induction of expression in embryos at certain schedules after germination. For example, at 4 days after germination, expression is induced from the promoter to synthesize more proteins than at 3 or 5 days of inducing promoter expression. Those skilled in the art will be able to obtain maximal expression through routine experimentation. In certain methods, sprouted seedlings may be harvested about 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days or 12 days after germination.
발현 벡터가 유도성 프로모터 대신에 구성(constitutive) 프로모터를 보유하는 경우, 출아묘는 출아묘의 형질변환후에 특정 시간에 수확할 수 있을 것이다. 예를 들면, 출아묘는 발생 초기 단계에서 바이러스에 의해 형질변환되면 출아묘는 발현이 형질변환후 최대시점에 되는 시기에 수확할 수 있다. 에를 들면 형질변환후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일이 될 수 있다. 씨앗의 발아에 따라 싹은 형질변환후 1개월, 2개월, 3개월 또는 더 긴 시간에 발생될 수 있을 것이다.If the expression vector has a constitutive promoter instead of an inducible promoter, the sprouted seedlings may be harvested at a certain time after transformation of the sprouted seedlings. For example, sprouted seedlings are transformed by the virus at an early stage of development, and sprouted seedlings can be harvested at a time when expression is at the maximum point after transformation. For example, it can be about 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days or 14 days after transformation. have. Depending on the germination of the seed, the shoots may occur one month, two months, three months or longer after transformation.
일반적으로 인플루엔자 항원의 발현이 시작되면, 씨, 배아 또는 출아묘는 인플루엔자 항원 수준이 충분히 발현될 때까지 생장하도록 한다. 특정 측면에서, 충분한 수준은 수확된 바이오매스를 날 것으로 복용했을 때 환자에 치료요법적으로 잇점을 제공할 수 있는 수준이 된다. 대안으로 또는 추가로, 충분한 수준은 인플루엔자 항원이 바이로매스로부터 농축되거나 정제되어 투여시 환자에 치료요법적으로 유익한 점을 제공하는 약학 조성물로 조제될 수 있는 수준이 된다. 일반적으로, 인플루엔자 항원은 자연상태에서 출아묘에 발현되는 단백질이 아니다. 어쨌든, 인플루엔자 항원은 자연상태에서 출아묘에 존재하는 농도이상의 농도에서 발현된다.In general, when expression of influenza antigens begins, seeds, embryos or sprouted seedlings are allowed to grow until sufficient influenza antigen levels are expressed. In certain aspects, sufficient levels are those that provide therapeutic benefit to the patient when the harvested biomass is taken raw. Alternatively, or in addition, sufficient levels are such that influenza antigens can be formulated into pharmaceutical compositions in which the influenza antigen is concentrated or purified from viromass to provide therapeutic benefit to the patient upon administration. In general, influenza antigens are not proteins expressed in sprouted seedlings in nature. In any case, influenza antigens are expressed at concentrations above those present in sprouted seedlings in nature.
인플루엔자 항원의 발현이 일단 유도되면, 출아묘를 수확하게 되는 출아묘 단계까지 생장을 계속하도록 한다. 출아묘는 생으로 수확할 수 있다. 생 출아묘 수확은 최소한의 노력과 파손 등을 포함하는 몇 가지 장점을 가진다. 본 발명의 출아묘는 수경재배에 의해 생장되어, 수확은 수경재배 액으로부터 출아묘를 단순히 집어 올리는 것이 된다. 본 발명의 출아묘 생장에 토양이 필요하지 않지만 당업자에 의해 필요하다고 생각되거나 바람직하다고 생각되는 경우에 제공될 수 있다. 싹이 토양없이 생장할 수 있기 때문에 수확 시기에 출아묘 물질을 세척할 필요는 없다. 세척없이 또는 문지름없이(수확된 물질의 파손을 최소화시키게 되는) 수경재배 환경으로부터 출아묘를 직접적으로 수확하게 된다. 식물의 파손 또는 시듬은 아포프톱시스를 유도한다. 아포프톱시스 동안에 특정 단백질 분해성 효소가 활성화되어 출아묘에서 발현된 약학 단백질을 분해시키고, 이는 단백질의 치료 활성이 감소 결과를 초래한다. 아포프톱시스 유도성 단백질 분해는 성숙한 식물로부터 단백질의 수득률을 상당히 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 식물로부터 단백질을 추출하는 순간까지 수확이 일어나지 않아 아포프톱시스를 피할 수 있을 것이다.Once expression of the influenza antigen is induced, growth continues until the sprouting seedling stage at which sprouting seedlings are harvested. Sprouted seedlings can be harvested raw. Harvesting raw sprouted seedlings has several advantages, including minimal effort and breakage. The sprouted seedlings of the present invention are grown by hydroponic cultivation, and the harvest simply picks up the sprouted seedlings from the hydroponic cultivation liquid. It may be provided when the sprouting seedling growth of the present invention does not require soil, but is deemed necessary or desirable by the skilled person. It is not necessary to wash sprouted seedling material at harvest time, as the shoots can grow without soil. Germinating seedlings are harvested directly from the hydroponic environment without washing or rubbing (which minimizes the breakage of harvested material). Plant breakage or stalking leads to apoptosis. During apoptosis, certain proteolytic enzymes are activated to degrade pharmaceutical proteins expressed in sprouted seedlings, which results in a decrease in the therapeutic activity of the proteins. Apoptosis-induced proteolysis can significantly reduce the yield of protein from mature plants. Apoptosis may be avoided because no harvest occurs until the moment the protein is extracted from the plant using the method of the present invention.
예를 들면, 살아있는 싹을 연마, 분쇄 또는 혼합하여 프로테아제 저해물질을 포함하는 완충액에 출아묘 바이오매스 슬러리를 만든다. 완충액은 약 4℃로 유지한다. 일부 측면에서, 출아묘 바이오매스는 대기 건조, 분무 건조, 냉동 또는 동결 건조된다. 성술한 식물에서 이들 방법 중 일부 예를 들면 대기-건조에 의해 약학 단백질의 활성이 상실될 수 있다. 그러나, 출아묘는 매우 작고, 용적 비율에 대해 큰 표면적을 가지기 때문이 이와 같은 것은 발생하지 않을 수도 있다. 당업자는 발현된 단백질의 단백질 분해를 최소화시키는 바이오매스 수확 기술이 상당히 많으며, 본 발명에 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.For example, live shoots are ground, crushed, or mixed to form sprouted seedling biomass slurries in a buffer containing protease inhibitors. The buffer is maintained at about 4 ° C. In some aspects, sprouted seedling biomass is air dried, spray dried, frozen or freeze dried. The activity of pharmaceutical proteins may be lost in some of these methods in airborne plants, for example by air-drying. However, this may not occur because the sprouted seedlings are very small and have a large surface area for the volume ratio. Those skilled in the art will appreciate that there are a number of biomass harvesting techniques that minimize the proteolysis of expressed proteins and that they can be used in the present invention.
일부 구체예에서, 출아묘는 식용이 가능하다. 특정 구체예에서, 수확시(가령, 수확 직후, 수확후 최소한의 시간내에)에 인플루엔자 항원을 충분한 수준으로 발현시키는 출아묘를 소비한다. 이와 같은 방식으로, 치료를 요하는 환자에 인플루엔자 항원을 투여하기 전에 인플루엔자 항원의 수확에 의해 유도되는 단백질 분해에 의한 분해를 최소화시킨다. 예를 들면, 바로 소비할 수 있는 출아묘를 환자에 직접 제공할 수 있을 것이다. 대안으로 또는 추가로 유전공학적으로 조작된 씨 또는 배아를 치료를 요하는 환자에 제공하고, 환자가 출아묘 키울 수 있다. 한 측면에서, 유전공학적으로 조작된 출아묘를 환자에 공급하거나 또는 환자를 치료하는 의사에 공급하여 특정 바람직한 인플루엔자 항원을 발현시키는 출아묘 스톡을 배양할 수도 있다. 이는 고가의 약품을 구입할 여력이 안되거나 운반할 여력이 안되는개발도상국가에서 특히 가치가 있다. 본 발명의 출아묘는 이와 같은 개발도상국 집단에 특히 바람직한 출아묘를 만드는데 용이하다.In some embodiments, sprouted seedlings are edible. In certain embodiments, sprouted seedlings are consumed that express sufficient levels of influenza antigen at harvest (eg, immediately after harvest, within a minimum time after harvest). In this way, degradation by proteolysis induced by harvesting of influenza antigens is minimized before administration of influenza antigens to patients in need of treatment. For example, a sprouted seedling that can be consumed immediately can be provided directly to the patient. Alternatively or additionally, genetically engineered seeds or embryos may be provided to a patient in need of treatment, and the patient may grow sprouted seedlings. In one aspect, genetically engineered sprouted seedlings may be supplied to a patient or to a physician treating the patient to culture sprouted seedling stocks that express certain desired influenza antigens. This is especially valuable in developing countries where they cannot afford or cannot afford expensive drugs. The sprouted seedlings of the present invention are easy to make sprouted seedlings which are particularly desirable for such a developing population.
한정된 환경에서의 조절가능한 성질은 외부 환경에서 자라는 식물에 비교하여 본 발명에 잇점을 부여한다. 일반적으로, 식물에서 약학 단백질을 발현시키는 유전공학적으로 조작된 출아묘를 생장시키면, 유전공학적으로 조작된 식물을 생장시키는 것보다 더 신속하게(식물을 더 어릴 때 수확하기 때문에) 그리고 힘을 덜 들이고, 위험이 감소된 약학 산물을 제공한다. 본 발명에 이용되는 한정된 조절가능한 환경은 자연계에서 식물의 교차 오염을 감소 또는 제거시킨다.Adjustable properties in confined environments benefit the present invention compared to plants growing in an external environment. In general, growing genetically engineered sprouted seedlings that express pharmaceutical proteins in plants is faster and less laborious than growing genetically engineered plants (because they are harvested when they are younger). It provides pharmaceutical products with reduced risk. The limited adjustable environment used in the present invention reduces or eliminates cross contamination of plants in nature.
예를 들면, 열 유도성 프로모터는 외부 온도를 조절할 수 없기 때문에 실외에서는 이용되지 않을 것이다. 프로모터는 특정 수준이상으로 실외 온도가 상승되면 언제든지 개시될 수 있다. 유사하게, 프로모터는 실외 온도가 떨어질 때마다 작동을 멈추게 될 것이다. 이와 같은 온도 변이는 하루에, 예를 들면 낮에는 개시되고 밤에는 중단될 수 있다.For example, heat inducible promoters will not be used outdoors because they cannot control the outside temperature. The promoter can be started at any time if the outdoor temperature rises above a certain level. Similarly, the promoter will stop working whenever the outdoor temperature drops. Such temperature variations can be initiated in one day, for example during the day and stopped at night.
여기에서 설명하는 것과 같이 열 유도성 프로모터는 실외와 같이 거의 동일한 정도로 기온 변화에 민감한 온실에 실질적으로 이용할 수 없을 것이다. 온실에서 유전공학적으로 조작된 식물의 생장은 상당히 비용이 든다. 대조적으로, 본 시스템에서, 모든 변수를 조절하여 매번 수확시마다 최대의 발현을 얻을 수 있도록 한다.As described here, thermally inducible promoters will not be practically available in greenhouses sensitive to temperature changes, such as outdoors. The growth of genetically engineered plants in greenhouses is quite expensive. In contrast, in the present system, all variables are adjusted to ensure maximum expression at each harvest.
특정 구체예에서, 본 발명의 출아묘를 트레이에 생장시켜, 출아묘 발생동안에 물을 주고, 분무하거나 연무시킬 수 있다. 예를 들면, 트레이에 하나 또는 그 이상의 수분 제공, 분무, 연무 및 배수 장비를 고정시켜 물, 영양소 및 화학물질 등을 출아묘 발생 동안에 특정 시기에 정확한 양으로 공급 및 배수를 시킬 수 있다. 예를 들면, 씨는 축축하게 젖도록 충분한 양의 수분을 요한다. 트레이에 있는 구멍을 통하여 과량의 수분은 바닥으로 배수된다. 일반적으로 배수된 물은 환경으로 방출하기 전에 유해한 화학물질을 제거하기 위해 적절히 조치한다.In certain embodiments, sprouted seedlings of the present invention can be grown in trays to water, spray or mist during sprouted seedling development. For example, one or more moisturizing, spraying, misting, and drainage equipment can be secured to a tray so that water, nutrients, and chemicals can be supplied and drained in the correct amount at specific times during sprouting seedlings. For example, seeds need a sufficient amount of moisture to get wet. Excess moisture is drained to the floor through holes in the tray. In general, drained water is properly disposed of to remove harmful chemicals before release to the environment.
트레이의 또 다른 장점은 매우 작은 공간내에 유지될 수 있다는 것이다. 출아묘의 생장을 위해 빛이 필요하지 않기 때문에 씨, 배아를 함유하는 트레이 또는 출아묘는 하우징 설비의 단위 바닥 공간당 많은 양의 바이오매스를 제공하기 위해 이와 같은 목적으로 제작된 설비에서 상단에 단단하게 수직으로 적재할 수 있다. 또한, 트레이 적재는 하우징 단위내에 수평으로 열을 맞추어 배열할 수도 있다. 싹이 생장하여 수확할 수 있는 시기가 되면(약 2일 내지 14일), 개별 묘목 트레이를 프로세싱 설비로 수작업으로 또는 콘베이어 벨트와 같은 자동화 장비를 이용하여 이동시킬 수 있다.Another advantage of the tray is that it can be kept in a very small space. Since no light is needed to grow the sprouted seedlings, the tray containing the seeds, embryos or sprouted seedlings should be firmly on the top of the plant designed for this purpose to provide a large amount of biomass per unit floor space of the housing plant. Can be loaded vertically. In addition, the tray stacking may be arranged in a row horizontally in the housing unit. When it is time for the shoots to grow and harvest (about 2 to 14 days), individual seedling trays can be moved manually to processing facilities or using automated equipment such as conveyor belts.
본 발명의 시스템은 인플루엔자 항원의 재료가 되는 출아묘 바이오매스를 제공하는 독특한 성질이 있다. 직접적으로 소비되건 또는 약학 조성물 형태로 처리되건, 출아묘는 한정된 조절가능한 환경에서 생장하기 때문에 출아묘 바이오매스 및/또는 이로부터 유도된 약학 조성물을 소비자에게 저렴한 가격으로 제공될 수 있다. 또한, 출아묘의 생장 조건을 조절할 수 있다는 사실은 생성물의 품질 및 순도를 일정하게 유지시킬 수 있다. 본 발명의 한정된 조절가능한 환경은 과학자들에 의해 실외에서 유전공학적으로 조작된 농산물의 재배를 금지하는 EPA의 많은 안전 규제를 피할 수 있다.The system of the present invention has the unique property of providing sprouted seedling biomass as a material for influenza antigens. Whether directly consumed or processed in the form of a pharmaceutical composition, sprouted seedlings can be provided to consumers at low cost because sprouted seedling biomass and / or derived pharmaceutical compositions are grown in a limited, controlled environment. In addition, the fact that the growth conditions of sprouted seedlings can be controlled can keep the quality and purity of the product constant. The limited adjustable environment of the present invention may circumvent many safety regulations of EPA, which prohibit scientists from growing genetically engineered produce outdoors.
형질변환된 싹Transformed shoot
다양한 방법을 이용하여 식물을 형질변환시키고, 유전공학적으로 조작된 출아묘를 만든다. 유전자 전이 식물 세포 라인을 in vitro에서 생성시키고, 세포 라인이 온전한 식물로 재생되는데 요구되는 식물의 형질변환에 이용가능한 두 가지 방법에는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이와 마이크로프로젝타일 투하(microprojectile bombardment) 또는 전기천공이 포함된다. 바이러스 형질변환이 원하는 산물을 수득하기 전에 실험적인 또는 제너레이션 래그(generational lag) 없이 수확될 수 있는 배아와 출아묘를 좀더 신속하게 그리고 비용을 적게 들이는 방법이다. 임의 기술의 경우에, 당업자는 식물, 씨앗, 배아 또는 출아묘에 통상적으로 이용될 수 있는 형질변환 프로토콜을 어떻게 조절하여 최적화시킬 수 있는지를 인지할 수 있을 것이다.Plants are transformed using a variety of methods to produce genetically engineered sprouted seedlings. Genetically Transforming Plant Cell lines are available in vitro, and two methods available for the transformation of plants required for cell lines to be regenerated into intact plants includeAgrobacterium tumefaciens mediated gene transfer and microprojection. Microprojectile bombardment or electroporation. Viral transformation is a faster and less expensive method for embryos and sprouted seedlings that can be harvested without experimental or generational lag before obtaining the desired product. In the case of any technique, one of ordinary skill in the art will be able to appreciate how to adjust and optimize the transformation protocols commonly available for plants, seeds, embryos or sprouted seedlings.
아그로박테리움 형질변환 발현 카세트Agrobacterium Transformation Expression Cassette
아그로박테리움은 그램 음성 족 리조바아세(Rhizobiaceae)의 대표속이다. 이 종은 크라운 골(crown gall) 및 모근병과 같은 식물 종양의 원인이 된다. 종양의 특징인, (dedifferentiated) 식물 조직에서 오파인(opines)으로 알려진 아미노산 유도체가 아그로박테리움에 의해 생산되고, 식물에 의해 동화(catabolize)된다. 오파인 발현을 맡고 있는 세균 유전자는 키메라 발현 카세트의 조절 요소의 통상의 자원이 된다. 본 발명에 따르면, 아그로박테리움 형질변환 시스템을 이용하여 식용 출아묘를 생성시키고, 이는 성숙한 식물보다 다소 조기에 수확된다. 아그로박테리움 형질변환 방법을 인플루엔자 항원을 발현시키는 출아묘를 생성시키는데 응용할 수 있다.Agrobacterium is a representative of the Gram-negative Rizobiaceae. This species causes plant tumors such as crown gall and hair root disease. Amino acid derivatives known as opines in dedifferentiated plant tissues, which are characteristic of tumors, are produced by Agrobacterium and are assimilated by plants. The bacterial genes responsible for the expression of opines become a common source of regulatory elements of the chimeric expression cassettes. According to the present invention, edible sprouted seedlings are produced using an Agrobacterium transformation system, which is harvested somewhat earlier than mature plants. Agrobacterium transformation methods can be applied to generate sprouted seedlings expressing influenza antigens.
일반적으로, 식물의 형질변환은 식물/세균 벡터를 운반하는 아그로박테리움 튜머페션스와 공동 배양하여 조직 배양물에서 생장한 식물의 형질변환시키는 것에 관계한다. 벡터에는 인플루엔자 항원을 인코드하는 유전자를 포함한다. 아그로박테리움은 식물 숙주 세포로 벡터를 전달하고, 항생제 처리에 의해 아그로박테리움은 제거된다. 인플루엔자 항원을 발현시키는 형질변환된 식물 세포들을 선별하고, 분화시켜 최종적으로 온전한 식물로 재생시킨다(Hellens et al, 2000, 식물 MoI. Biol, 42:819; Pilon-Smits et al., 1999, Plant Physiolog., 119:123; Barfield et al, 199], Plant Cell Reports, 10:308; and Riva et al, 1998, J. Biotech, 1(3); 각 참고문헌으로 첨부한다).Generally, transformation of plants involves co-culturing with Agrobacterium tumerfeces carrying the plant / bacterial vector to transform plants grown in tissue culture. Vectors include genes encoding influenza antigens. Agrobacterium delivers the vector to plant host cells and Agrobacterium is removed by antibiotic treatment. Transformed plant cells expressing influenza antigens are selected, differentiated and finally regenerated into intact plants (Hellens et al, 2000, Plant Mo I. Biol, 42: 819; Pilon-Smits et al., 1999, Plant Physiolog , 119: 123; Barfield et al, 199; Plant Cell Reports, 10: 308; and Riva et al, 1998, J. Biotech, 1 (3); appended by each reference).
본 발명에서 이용할 수 있는 발현 벡터에는 식물에서 작용하도록 고안된 인플루엔자 항원과 발현 카세트의 하류 및 상류 컴패니언 서열(companion sequences)을 가진 유전자(또는 발현 카세트)가 포함된다. 컴패니언 서열은 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 오리진이며, 세균으로부터 원하는 식물 숙주로 DNA을 전달하기 위해 벡터에 존재하는 필수 특징들을 제공한다.Expression vectors that may be used in the present invention include influenza antigens designed to act in plants and genes (or expression cassettes) having companion sequences downstream and upstream of the expression cassette. Companion sequences are generally plasmids or viral origins and provide the essential features present in the vector to transfer DNA from bacteria to the desired plant host.
기본적인 세균/식물 벡터 구조체는 바람직하게는 광역의 숙주 범주의 원핵 복제 오리진, 원핵세포 선택성 표식을 제공할 수 있다. 적절한 원핵세포 선택성 표식에는 암피실린 또는 테트라사이클린과 같은 항생제에 대한 저항성이 포함된다. 당분야에 공지된 추가 기능을 인코드하는 다른 DNA서열이 벡터에 존재할 수도 있다.The basic bacterial / plant vector construct may preferably provide a prokaryotic origin of replication, a prokaryotic selectivity marker of a broad host range. Suitable prokaryotic selectivity markers include resistance to antibiotics such as ampicillin or tetracycline. Other DNA sequences may be present in the vector that encode additional functions known in the art.
아그로박테리움 T-DNA 서열은 식물 염색체로 DNA의 아그로박테리움 매개된 전달에 필요하다. T-DNA의 종양-유도성 유전자를 일반적으로 제거하고 인플루엔자 항원을 인코드하는하는 서열로 대체한다. T-DNA 보더(border) 서열은 식물 게놈으로 T-DNA 부분으로 통합개시하기 때문에 보유된다. 인플루엔자 항원의 발현이 바로 감지되지 않는 경우에, 세균/식물 벡터 구조체에 식물 세포의 형질변환이 있는지를 결정하는데 적절한 선택성 표식 유전자, 예를 들면, nptll 카나마이신 저항성 유전자가 포함될 수 있다. 동일한 또는 상이한 세균/식물 벡터 (Ti 플라스미드)가 Ti 서열이다. Ti 서열에는 비루런스(virulence) 유전자, 이 유전자는 T-DNA의 절단, 식물 게놈으로 전달 및 통합을 인코드한다(Schell, 1987, Science, 237:1176). 식물 게놈으로 이형성 서열의 통합을 허용하는데 적절한 다른 서열들에는 트랜스포존(transposon) 서열 및 상동성 재조합을 위한 유사한 것들이 포함된다.Agrobacterium T-DNA sequences are required for Agrobacterium mediated delivery of DNA to plant chromosomes. Tumor-inducing genes of T-DNA are generally removed and replaced with sequences encoding the influenza antigen. The T-DNA border sequence is retained because it initiates integration into the T-DNA portion of the plant genome. If the expression of the influenza antigen is not detected immediately, a selectable marker gene, such as nptll kanamycin resistance gene, may be included that is suitable for determining whether the bacterial / plant vector construct has a transformation of plant cells. The same or different bacterial / plant vectors (Ti plasmids) are Ti sequences. The Ti sequence contains a viral gene, which encodes the cleavage of T-DNA, transfer and integration into the plant genome (Schell, 1987, Science, 237: 1176). Other sequences suitable for allowing integration of heterologous sequences into the plant genome include transposon sequences and similar ones for homologous recombination.
특정 구조체에는 항원 단백질을 인코드하는 발현 카세트를 포함한다. 주어진 형질변환에 하나, 두 개 또는 그 이상의 발현 카세트가 이용될 수도 있다. 재조합 발현 카세트에는 인플루엔자 항원 인코드 서열에 추가하여 다음의 요소들이 포함될 수 있다: 프로모터 부분, 식물 5' 비해독(untranslated) 서열, 개시 코돈 (발현된 유전자가 이를 보유하느냐에 따라), 전사 및 해독 종료 서열. 추가적으로, 전사 및 해독 종료물질이 본 발명의 발현 카세트 도는 키메라 유전자에 포함될 수 있다. 단백질이 적절하게 프로세싱되고 전좌(translocation)를 허용하는 시그날 방출 서열이 발현 카세트에 포함될 수 있다. 다양한 프로모터, 시그날 서열 및 전사 및 해독 종료물질에 대해서는 예를 들면 Lawton et al. (1987, Plant Mol. Biol, 9:315) 및 U.S. Patent 5,888,789 (이둘 다 참고문헌으로 첨부한다)에서 설명하고 있다. 또한, 항생제 저항성에 대한 구조적 유전자를 선택성 인자로 통상적으로 이용한다 (Fraley et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 80:4803, 참고문헌으로 첨부한다). 카세트의 5'와 3' 에 유일한 제한 효소 부위가 기존의 벡터로 용이하게 삽입되도록 한다. 적어도 한 가지 T-DNA 보더 서열을 운반하며, 아그로박테리움 매게된 형질변환(binary) 벡터 시스템에 대해 설명되어 있다(PCT/EP99/07414, 참고문헌으로 첨부됨).Certain constructs include expression cassettes that encode antigenic proteins. One, two or more expression cassettes may be used for a given transformation. The recombinant expression cassette may include the following elements in addition to the influenza antigen encoding sequence: promoter portion, plant 5 'untranslated sequence, start codon (depending on whether the expressed gene has it), transcription and translation termination order. Additionally, transcriptional and translation terminators may be included in the expression cassette or chimeric genes of the invention. Signal release sequences may be included in the expression cassette to allow the protein to be properly processed and to allow translocation. For various promoters, signal sequences and transcriptional and translation terminators, see, eg, Lawton et al. (1987, Plant Mol. Biol, 9: 315) and U.S. Patent 5,888,789, both of which are incorporated by reference. In addition, structural genes for antibiotic resistance are commonly used as selectivity factors (Fraley et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 80: 4803, incorporated by reference). The only restriction enzyme sites at 5 'and 3' of the cassette allow for easy insertion into existing vectors. Agrobacterium-embedded transgenic vector systems that carry at least one T-DNA border sequence are described (PCT / EP99 / 07414, incorporated by reference).
재생play
형질변환된 식물의 씨앗을 수확하고, 건조하고, 세척하여 원하는 유전자 산물의 생존, 존재 및 발현을 테스트할 수 있다. 이것이 일단 결정되면 씨앗 스톡은 필요할 경우 사용하기에 적절한 일반적으로 온도, 습도, 위생 및 안전성에 적절한 조건하에 보관한다. 그 다음, 배양된 프로토플라스트로부터 전체 식물을 재생할 수 있는데 이는 Evans et al. (Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMillan Publishing Co., New York, NY, 1983, incorporated herein by reference); 및 Vasil (ed., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, FL, Vol. I, 1984, and Vol. Ill, 1986, incorporated herein by reference)에서 설명하고 있다. 특정 측면에서, 출아묘 단계에서만 식물들이 재생된다. 일부 측면에서는 전체 식물들을 재생하여 씨앗 산물 스톡을 만들고, 출아묘는 씨앗 스톡의 씨로부터 생성된다.The seeds of the transformed plant can be harvested, dried and washed to test for survival, presence and expression of the desired gene product. Once this has been determined, seed stocks are stored under conditions appropriate for temperature, humidity, hygiene and safety in general, which are suitable for use when necessary. The whole plant can then be regenerated from the cultured protoplasm, which is described by Evans et al. Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMillan Publishing Co., New York, NY, 1983, incorporated herein by reference; And Vasil (ed., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, FL, Vol. I, 1984, and Vol. Ill, 1986, incorporated herein by reference). In certain aspects, plants are regenerated only during the sprouting seedling stage. In some aspects, whole plants are regenerated to produce seed product stocks, and sprouted seedlings are produced from seeds of seed stocks.
프로토플라스트를 분리하고, 온전한 재생된 식물을 제공하는 모든 식물은 본 발명에 의해 형질변환되어, 전이된 유전자를 포함하는 전체 식물을 회수한다. 실제 모든 식물은 배양된 세포 또는 조직으로부터 재생되는데, 식용 싹을 생산하는 모든 주요 종의 식물을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 일부 적절한 식물에는 알파파, 녹두, 무, 밀, 머스타드, 시금치, 당근, 비트, 양파, 마늘, 셀러리, 대황, 양배추 또는 양상추와 같은 잎 식물, 물냉이 또는 큰 바닥 냉이, 파슬리, 민트 또는 클로버와 같은 허브, 콜리플라워, 브로콜리, 소이빈, 렌즈콩, 해바라기와 같은 식용 꽃이 포함된다.All plants that isolate the protoplasts and provide intact regenerated plants are transformed by the present invention to recover the entire plant including the transferred genes. In fact, all plants are regenerated from cultured cells or tissues, including but not limited to plants of all major species that produce edible shoots. Some suitable plants include leaf plants such as alfalfa, green beans, radishes, wheat, mustard, spinach, carrots, beets, onions, garlic, celery, rhubarb, cabbage or lettuce, watercress or large horseradish, parsley, mint or clover and Edible flowers such as herbs, cauliflower, broccoli, soybeans, lentils, and sunflowers are included.
재생 수단은 식물의 한 종으로부터 다른 종으로 다양하다. 그러나, 당업자는 이형 유전자 복사체를 포함하는 형질변환된 프로토플라스트 현탁액을 먼저 제공해야한다는 것을 인지할 것이다. 유합(Callus) 조직이 형성되고, 유합조직으로부터 어린가지(shoot)가 유도되고 연속하여 뿌리를 내린다. 대안으로 또는 추가적으로 배아 형성은 프로토플라스트 현탁액으로부터 유도될 수 있다. 이들 배아가 자연 배아로 발아하여 식물을 형성한다. 씨를 물에 담구거나 또는 씨앗에 물을 분무하여 씨의 수분 함량을 35-45%로 증가시켜 발아가 시작된다. 발아의 진행을 위해, 일반적으로 씨앗은 조절된 온도 및 대기 조건하에 물로 포화된 대기에서 유지한다. 배양 배지에는 일반적으로 옥신 및 사이토키닌과 같은 다양한 아미노산 및 호르몬을 포함한다. 알파파와 같은 종에는 배지에는 글루타민산 및 프롤린을 첨가하는 것이 유리하다. 어린 가지와 뿌리는 일반적으로 동시에 발생한다. 효과적인 재생은 배지, 유전자 타입, 배양물의 역학에 따라 달라진다. 이들 세가지 변수가 조절된다면 재생은 반복적으로 재생할 수 있다.Regeneration means vary from one species of plant to another. However, one skilled in the art will recognize that a transformed protoplast suspension comprising heterologous gene copies must first be provided. Callus tissue is formed, shoots are induced from the callus and take root in succession. Alternatively or additionally embryonic formation may be derived from a protoplast suspension. These embryos germinate into natural embryos to form plants. Germination begins by soaking the seeds in water or spraying them with water to increase the moisture content of the seeds to 35-45%. For the progress of germination, seeds are generally kept in an atmosphere saturated with water under controlled temperature and atmospheric conditions. The culture medium generally contains various amino acids and hormones such as auxin and cytokinin. For species such as alpha waves, it is advantageous to add glutamic acid and proline to the medium. Young branches and roots usually occur simultaneously. Effective regeneration depends on the media, gene type, and culture dynamics. If these three parameters are adjusted, playback can be repeated.
형질변환된 식물 세포에서 생장된 성숙한 식물은 같은 종류이며, 비-분리형동종접합체 유전자 전이 식물이 확인된다. 동종의 식물은 항원-인코드 서열을 포함하는 씨앗을 만든다. 이와 같은 씨앗이 발아되어 출아묘 단계로 생장하고 본 발명의 인플루엔자 항원을 만든다.Mature plants grown in transformed plant cells are of the same kind, and non-isolated homozygous gene transfer plants are identified. Homogeneous plants produce seeds that contain the antigen-encoding sequence. Such seeds germinate to grow in the germinating seedling stage to make the influenza antigen of the present invention.
관련 구체예에서, 본 발명의 씨앗이 씨앗 산물로 형성되어 어떻게 묘목을 약학 조성물로 투여 또는 수확하기 위한 출아묘 단계로 생장시키는지에 대한 지시사항과 함께 판매된다. 관련 구체예에서, 원하는 형질을 포함하는 하이브리드 도는 변이체를 본 발명의 동종 번식 식물로부터 발생시킬 수도 있다.In related embodiments, the seeds of the present invention are formed with seed products and sold with instructions on how to grow seedlings into sprouted seedling stages for administration or harvesting into pharmaceutical compositions. In related embodiments, hybrid or variants comprising the desired traits may be generated from the homologous plants of the invention.
직접적인 통합Direct integration
본 발명에서 미세입자투사(microprojectile bombardment) 또는 전기천공에 의해 식물 세포의 게놈으로 DNA 단편의 직접 통합을 이용할 수도 있다(가령, Kikkert, et al, 1999, Plant: J. Tiss. Cult. Assoc, 35:43; Bates, 1994, MoI. Biotech., 2:135). 좀더 구체적으로, 본 발명의 인플루엔자 항원을 발현시키는 벡터를 다양한 기술을 이용하여 식물 세포에 도입시킬 수 있다. 상기에서 설명한 것과 같이, 벡터에는 식물 세포에서 이용할 수 있는 선택성 마커를 포함할 수도 있다. 벡터에는 제2 숙주에서 선별 및 증식을 허용하는 서열 예를 들면, 복제 기원 및 선택성 마커를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 제2숙주에는 세균 및 이스트를 포함한다. 한 구체예에서, 제2 숙주는 세균(가령, 대장균, 복제 원점은 복제의 colEl-타입 오리진이다)이 되며, 선택성 마커는 암피실린 저항성을 인코드하는 유전자가 된다. 이와 같은 서열은 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용할 수 있다(가령, Clontech, Palo Alto, CA 또는 Stratagene, La Jolla, CA).In the present invention, direct integration of DNA fragments into the genome of plant cells by microprojectile bombardment or electroporation can also be used (eg Kikkert, et al, 1999, Plant: J. Tiss. Cult. Assoc, 35 : 43; Bates, 1994, Mo I. Biotech., 2: 135). More specifically, vectors expressing the influenza antigens of the present invention can be introduced into plant cells using a variety of techniques. As described above, the vector may include a selectable marker that can be used in plant cells. Vectors can include sequences that allow for selection and propagation in a second host, such as sequences comprising replication origins and selectable markers. Generally, the second host includes bacteria and yeast. In one embodiment, the second host is a bacterium (eg, E. coli, origin of replication is the colEl-type origin of replication) and the selectivity marker is a gene encoding ampicillin resistance. Such sequences are known in the art and are commercially available (eg, Clontech, Palo Alto, CA or Stratagene, La Jolla, CA).
본 발명의 벡터를 변형하여, 아그로박테리움 튜머페션스 벡터, 아그로박테리움 튜머페션스의 T-DNA 보더 부분, 핵산 또는 발현 카세트를 인코드하는 항원에 상동성 부분을 포함하는 식물 형질변환 플라스미드를 조절할 수 있다. 추가로, 벡터에는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)의 플라스미드를 유도하는 무해한 식물 종양을 포함할 수도 있다.By modifying the vector of the present invention, a plant transformed plasmid comprising a homologous moiety to an Agrobacterium tumerfesions vector, a T-DNA border portion of Agrobacterium tumerfesions, an antigen encoding a nucleic acid or an expression cassette is prepared. I can regulate it. In addition, the vector may include a harmless plant tumor that induces a plasmid ofAgrobacterium tumefaciens .
이와 같은 구체예에 따르면, 벡터 발명의 직접적인 형질변환은 기계적인 재조합 DNA 전달에 마이크로피펫을 이용하여 식물 세포에 직접적으로 벡터를 미세주입하는 것과 관련있을 수 있다(가령, Crossway, 1985, MoI. Gen. Genet., 2Q2-Λ19, 참고문헌을 첨부한다). 유전 물질을 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 식물 세포로 전달할 수도 있다(가령, Krens et al., 1982, Nature 296:72). 식물로 핵산을 도입시키는 또 다른 방법은 작은 비드 또는 압자의 매트릭스내에 또는 표면상에 핵산의 소립자에 의해 고속 탄도 침투시키는 것이다(가령, Klein et al., 1987, Nature 321:10; Knudsen et al., Planta, 185:330). 또 다른 도입 방법은 미니셀, 세포, 라이소좀 또는 다른 융합성 지질 표면의 바디와 같은 다른 대상과 프로토플라스트를 융합시키는 것이다(가령, Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 79:1859). 본 발명의 벡터를 전기천공에 의해 식물로 도입시킬 수 있다(가령, Fromm et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Set, USA, 82:5824). 이와 같은 기술에 따라 식물 프로토플라스트는 유전자 구조체를 포함하는 플라스미드 존재하에 전기천공된다. 고장력(high field strength)의 전기 펄스는 가역적으로 바이오막을 침투하게 하여 플라스미드의 도입이 허용된다. 전기천공된 식물 프로토플라스트는 세포 벽 분할을 재형성하고, 식물 유합조직을 형성하고, 이는 재생되어 본 발명의 출아묘를 형성한다. 당업자는 식용 출아묘를 만들기 위해, 어떻게 이와 같은 식물 세포의 형질변환 방법을 이용하는지를 인지할 것이다.According to this embodiment, the direct transformation of the vector invention may involve microinjecting the vector directly into plant cells using micropipettes for mechanical recombinant DNA delivery (eg, Crossway, 1985, MoI. Gen). Genet., 2Q2-Λ19, with references). Genetic material may also be delivered to plant cells using polyethylene glycol (eg, Krens et al., 1982, Nature 296: 72). Another method of introducing nucleic acids into plants is by high speed ballistic penetration by small particles of nucleic acid in or on the surface of small beads or indenters (eg, Klein et al., 1987, Nature 321: 10; Knudsen et al. , Planta, 185: 330). Another method of introduction is to fuse the protoplasts with other objects such as minicells, cells, lysosomes or other bodies of confluent lipid surfaces (eg, Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. ScL, USA). , 79: 1859). Vectors of the invention can be introduced into plants by electroporation (eg, Fromm et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Set, USA, 82: 5824). According to this technique, plant protoplasts are electroporated in the presence of plasmids containing gene constructs. High field strength electric pulses reversibly penetrate the biofilm to allow introduction of the plasmid. Electroporated plant protoplasts reshape cell wall divisions and form plant callus, which is regenerated to form the sprouting seedlings of the present invention. Those skilled in the art will recognize how to use such plant cell transformation methods to produce edible sprouted seedlings.
바이러스 형질변환Virus transformation
통상의 발현 시스템과 유사하게, 식물 바이러스 벡터를 이용하여 전장의 항원을 포함하는 전장 단백질을 만들 수 있다. 본 발명에 따라, 식물 바이러스 벡터를 이용하여 씨, 배아, 출아묘에서 항원을 감염 생산할 수 있다. 바이러스성 시스템을 이용하여 짧은 펩티드로부터 큰 복합 단백질을 발현시킨다. 특히, 토마토 바이러스 벡터를 이용하는 방법이 McCormick et al(1999, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 96:703; Kumagai et al. 2000, Gene, 245:169; and Verch et al, 1998, J. Immunol. Methods, 220:69; 참고문헌으로 첨부한다). 따라서, 식물 바이러스성 벡터는 짧은 펩티드 뿐만 아니라 큰 복합 단백질을 모두 발현시키는 능력을 가진다.Similar to conventional expression systems, plant viral vectors can be used to make full length proteins comprising full length antigens. In accordance with the present invention, plant viral vectors can be used to infect and produce antigens in seeds, embryos, sprouted seedlings. Viral systems are used to express large complex proteins from short peptides. In particular, methods using tomato viral vectors are described by McCormick et al (1999, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 96: 703; Kumagai et al. 2000, Gene, 245: 169; and Verch et al, 1998, J. Immunol.Methods, 220: 69; appended by reference). Thus, plant viral vectors have the ability to express both large peptides as well as short peptides.
특정 구체예에서, 인플루엔자 항원을 발현하는 유전자 전이 싹은 숙주/바이러스 시스템을 이용하여 만들어진다. 바이러스 감염에 의해 생성된 유전자 전이 싹은 안전한 것으로 이미 설명된 유전자 전이 단백질의 재료를 제공한다. 예를 들면, 싹은 동물 병인균의 오염이 없다. 있음직 하지는 않지만, 예를 들면 담배의 식용 싹에서 단백질은 이론상으로는 정제없이 경구 투여할 수 있어 상당한 비용을 줄일 수 있다. 또한, 바이러스/발아 시스템은 스케일-업 및 제조에 훨씬 간단한 비용 절감적인 경로를 제공하는데, 그 이유는 트란스진(trangenes)이 바이러스내로 도입되어 수일내에 상업규모로 생장할 수 있기 때문이다. 대조적으로, 대규모 시도 또는 상업화에는 충분한 양의 씨 또는 식물 재료가 이용되기 때문에 유전자 전이 식물은 5-7년을 필요로 할 수 있다.In certain embodiments, transgenic shoots expressing influenza antigens are made using a host / viral system. Gene transfer shoots produced by viral infection provide the material of the gene transfer protein that has already been described as safe. For example, shoots are free of animal pathogen contamination. Although unlikely, for example, protein in edible shoots of tobacco can theoretically be administered orally without tablets, which can significantly reduce costs. In addition, the virus / germination system provides a much simpler cost-saving route to scale-up and manufacturing because trangenes can be introduced into the virus and grow to commercial scale within a few days. In contrast, transgenic plants may require 5-7 years because a sufficient amount of seed or plant material is used for large scale trials or commercialization.
본 발명에 따르면, 식물 RNA 바이러스는 특정 장점을 가지는데, 이는 외부 단백질 발현을 위한 벡터로써의 매력을 가지도록 한다. 다수의 식물 RNA 바이러스의 분자생물학 및 병리학이 파악되어 있고, 바이러스 생물학, 유전학 및 조절 서열에 대해서도 상당히 공지되어 있다. 대부분 식물 RNA 바이러스는 작은 게놈을 가지며 감염성 cDNA 클론을 이용하여 유전자 조작을 실행할 수 있다. 감염성 바이러스 물질이 일단 민감성 숙주 세포로 유입되면 높은 수준으로 복제하여 전체적인 출아묘를 통하여 신속하게 퍼진다(접종후 1일 내지 10일 후). 바이러스 입자들은 감염된 출아묘 조직으로부터 용이하고 경제적으로 회수된다. 바이러스는 광역의 숙주 범위를 가지고 있어 몇 가지 민감 종의 감염에 단일 구조체를 이용할 수게 된다. 이와 같은 특징들은 싹으로 바로 전달될 수 있다.According to the present invention, plant RNA viruses have certain advantages, which make them attractive as vectors for foreign protein expression. Molecular biology and pathology of many plant RNA viruses have been identified and quite well known for viral biology, genetics and regulatory sequences. Most plant RNA viruses have a small genome and can be genetically engineered using infectious cDNA clones. Once infectious viral material enters a sensitive host cell, it replicates at high levels and spreads quickly throughout the entire sprouted seedling (1-10 days after inoculation). Virus particles are easily and economically recovered from infected sprouted seedling tissue. Viruses have a broad host range, allowing the use of a single construct for the infection of several sensitive species. Such features can be transferred directly to the shoots.
외부 서열은 식물 RNA 바이러스로부터 발현되는데, 이는 일반적으로, 원하는 서열로 바이러스 유전자들중 하나를 대체하고, 적절한 위치의 바이러스 게놈으로 외부 서열을 삽입하거나 또는 바이러스의 구조 단백질에 외부 펩티드를 융합시켜 실행될 수 있다. 또한 이들 방법중 임의 방법을 복합하여 바이러스의 치명적 기능을 교차 실행(trans-complementation)하여 외부 서열을 발현시킬 수 있다. 담배 모자이크 바이러스(TMV), 알파파 모자이크 바이러스(AIMV), 이의 키메라를 이용하여 바이러스-감염된 식물에서 외부 서열을 발현시키는 도구로 사용할 수 있는 다양한 전략들이 존재한다.The external sequence is expressed from a plant RNA virus, which can generally be done by replacing one of the viral genes with the desired sequence, inserting the external sequence into the viral genome at the appropriate location, or fusing the external peptide to the structural protein of the virus. have. Any of these methods can also be combined to trans-complement the lethal function of the virus to express foreign sequences. There are various strategies that can be used as a tool for expressing foreign sequences in virus-infected plants using tobacco mosaic virus (TMV), alpha wave mosaic virus (AIMV), and chimeras thereof.
AlMV 게놈은 브로모비리데(Bromoviridae)족 바이러스의 대표이며, 세가지 게놈 RNAs (RNAsl-3)와 서브게놈 RNA (RNA4)로 구성된다. 게놈 RNAs1 및 2는 바이러스 복제효소(replicase) 단백질 Pl 및 2를 각각 인코드한다. 게놈 RNA3는 세포간 이동 단백질 P3 및 피복 단백질(CP)을 인코드한다. CP는 서브게놈 RNA4로부터 해독되는데, 게놈 RNA3으로부터 합성되고, 감염 시작에 요구된다. 연구에 따르면, 게놈 활성화, 복제, RNA 안정성, 증후 형성 및 RNA 캡슐화를 포함하는 다중 기능에 CP가 관련된다는 것이다(가령, BoI et al, 1971, Virology, 46:73; Van Der Vossen et al, 1994, Virology 202:891; Yusibov et al, Virology, 208:405; Yusibov et al, 1998, Virology, 242:1 ; BoI et al, (Review, 100 refs.), 1999, J. Gen. Virol, 80:1089; De Graaff, 1995, Virology, 208:583; Jaspars et al, 1974,Adv. 바이러스 Res., 19:37; Loesch-Fries, 1985, Virology, 146:177; Neeleman et al, 1991, Virology, 181 :687; Neeleman et al, 1993, Virology, 196: 883; Van Der Kuyl et α/., 1991, Virology, 183:731; and Van Der Kuyl et al, 1991, Virology, 185:496).The AlMV genome is representative of the Bromoviridae virus and consists of three genomic RNAs (RNAsl-3) and subgenomic RNA (RNA4).
바이러스 입자들의 겹합포개기(Encapsidation)는 씨, 배아 또는 출아묘의 접종된 부분으로부터 접종안된 부분으로 바이러스의 장거리 이동 및 시스템적 감염에 일반적으로 요구된다. 본 발명에 따르면, 접종은 식물 발생의 임의 단계에서 일어날 수 있다. 배아 및 싹에서 접종된 바이러스 전파는 매우 신속하다. AlMV 비리온은 독특한 CP (24kD)에 의해 결합포개기되어 한 가지 이상의 입자 타입을 형성한다. 입자들의 크기(30- 내지 60-nm의 길이, 18nm 직경) 및 모양(구형, 타원형 또는 간상[bacilliform])은 결합포개기된 RNA의 크기에 따라 달라진다. 어셈블리시에, AlMV CP의 N-말단은 바이러스 입자의 표면상에 위치하고 바이러스 어셈블리를 간섭하지 않은 것으로 보인다 (BoI et al., 1971 , Virology, 6:73). 또한, 38개 아미노산 펩티드와 ALMV CP는 N-말단에서 in vitro상에서 입자들을 형성하고 생물학적 활성은 유지한다 (Yusibov et al, 1995, J. Gen. Virol., 77:567).Encapsidation of virus particles is generally required for long-distance migration and systemic infection of the virus from the inoculated portion of the seed, embryo or sprouted seedling. According to the invention, inoculation can occur at any stage of plant development. Virus propagation in embryos and shoots is very rapid. AlMV virions are superlaid by unique CPs (24 kD) to form one or more particle types. The size of the particles (30-60-nm long, 18 nm diameter) and shape (spherical, elliptical or bacilliform) depend on the size of the superimposed RNA. At assembly, the N-terminus of the AlMV CP appears to be on the surface of the viral particles and does not interfere with the virus assembly (BoI et al., 1971, Virology, 6:73). In addition, the 38 amino acid peptide and ALMV CP form particles in vitro and retain biological activity at the N-terminus (Yusibov et al, 1995, J. Gen. Virol., 77: 567).
AlMV는 식물 씨앗, 배아 및 싹을 포함하는 다수의 농업적으로 가치가 있는 곡물 식물을 포함하는 광범위한 숙주 범위를 가진다. 이와 함께, 이들 특징으로 ALMV CP를 캐리어 분자로써 우수한 후보물질을 만들고, AlMV는 발생의 발아 단계에 있는 식물에 외부 서열의 발현을 위한 매력적인 후보 벡터가 되다. 또한, TMV와 같은 이형성 벡터로부터 발현시에 바이러스 활성의 간섭없이 TMV 게놈을 결합포개기시킨다(Yusibov et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5784, incorporated herein by reference). 이로써 외부 서열에 융합된 AlMV CP용 캐리어 바이러스로 TMV를 이용하게 된다.AlMV has a broad host range that includes a number of agriculturally valuable grain plants, including plant seeds, embryos and shoots. Together, these features make ALMV CP an excellent candidate as a carrier molecule, and AlMV becomes an attractive candidate vector for the expression of foreign sequences in plants in the germination stage of development. In addition, when expressed from heterologous vectors such as TMV, the TMV genome is superimposed without interference of viral activity (Yusibov et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 5784, incorporated herein by reference). . This makes use of TMV as a carrier virus for AlMV CP fused to an external sequence.
토바모바이러스(tobamviruses)의 프로토타입인 TMV는 17.0kD CP로 결합포개기된 단일 펄스-센스 RNA로 구성된 게놈을 보유하는데, 이는 막대형 입자로 된다(300nm 길이). CP는 TMV의 유일한 구조 단백질이며, 결합포개기에 요구되며, 감염된 숙주에서 바이러스의 장거리 이동에도 필요하다(Saito et al, 1990, Virology 176:329). 게놈 RNA로부터 183 및 126 kD 단백질이 해독되고, 이들은 바이러스 복제에 요구된다 (Ishikawa et al, 1986, Nucleic Acids Res., 14:8291). 30 kD 단백질은 바이러스의 세포간 이동 단백질이다(Meshi et al, 1987, EMBO J., 6:2557). 이동 및 피복 단백질은 서브게놈 mRNA로부터 해독된다(Hunter et al., 1976, Nature, 260:759; Bruening ef or/., 1976, Virology, 71:498; and Beachy et al, 1976, Virology, 73:498, 각각은 참고문헌으로 첨부된다).TMV, a prototype of tobamviruses, contains a genome consisting of a single pulse-sense RNA bound to 17.0 kD CP, which is a rod-shaped particle (300 nm long). CP is the only structural protein of TMV and is required for binding scaffolds, and is also required for long-distance migration of viruses in infected hosts (Saito et al, 1990, Virology 176: 329). 183 and 126 kD proteins are translated from genomic RNA and they are required for viral replication (Ishikawa et al, 1986, Nucleic Acids Res., 14: 8291). The 30 kD protein is the intercellular transfer protein of the virus (Meshi et al, 1987, EMBO J., 6: 2557). Transfer and coat proteins are translated from subgenomic mRNA (Hunter et al., 1976, Nature, 260: 759; Bruening ef or /., 1976, Virology, 71: 498; and Beachy et al, 1976, Virology, 73: 498, each of which is incorporated by reference).
식물 조직을 형질변환시키는 다른 방법에는 식물의 꽃을 형질변환시키는 것이 포함된다. 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 형질변환은 식물의 꽃을 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 용액에 담구어 실행한다(Curtis et al, 2001, 유전자 전이 Res., 10:363; and Qing et al, 2000, Molecular Breeding: New Strategies in Plant Improvement 1 :67). "담궈진(dipped)" 식물에 의해 생성된 씨앗집단에서 형질변환된 식물은 형성된다. 꽃 발생 동안 특정 시기에 알에는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)가 알의 내부에 근접하는 알의 벽에 구멍이 있다. 알의 내부에 들어가면 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)는 개별 난세포(ovules)를 침투하여 형질변환시킨다(Desfeux et al, 2000, Plant Physiology, 123:895). 형질변환된 난세포는 난내에 씨앗 형성의 전형적인 과정을 따른다.Other methods of transforming plant tissue include transforming the flowers of the plant. Transformation ofArabidopsis thaliana is carried out by dipping plants in a solution ofAgrobacterium tumefaciens (Curtis et al, 2001, Gene Transfer Res., 10: 363; and Qing et al, 2000, Molecular Breeding: New Strategies in Plant Improvement 1:67). Transformed plants are formed from a population of seeds produced by "dipped" plants. At certain times during flowering, eggs have holes in the walls of the eggs whereAgrobacterium tumefaciens is located close to the inside of the eggs. Once inside the eggs,Agrobacterium tumefaciens penetrate and transform individual ovules (Desfeux et al, 2000, Plant Physiology, 123: 895). Transformed egg cells follow the typical process of seed formation in eggs.
항원의 생산 및 분리Production and Isolation of Antigens
일반적으로 당분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 항원 생산을 위한 본 발명의 식물, 식물 세포 및/또는 식물 조직(예를 들면, 클론 식물, 클론 식물 세포, 클론 뿌리, 클론 뿌리 라인, 싹, 출아묘, 식물 등)을 배양하고 생장시킨다. 광범위하게 다양한 배양 배지 및 바이오리엑터를 이용하여 모근 세포, 뿌리 세포 라인 및 식물 세포를 배양한다(Giri et al, 2000, Biotechnol Adv., 18:1 ; Rao et al, 2002, Biotechnol. Adv., 20:101 ;참고문헌으로 첨부한다). 클론 식물은 임의 적절한 방법으로 생장시킬 수 있다.Plants, plant cells and / or plant tissues of the invention (eg, clone plants, clone plant cells, clone roots, clone root lines, shoots, buds) for antigen production generally using standard methods known in the art Seedlings, plants, etc.) are cultured and grown. A wide variety of culture media and bioreactors are used to culture hair root cells, root cell lines and plant cells (Giri et al, 2000, Biotechnol Adv., 18: 1; Rao et al, 2002, Biotechnol. Adv., 20 : 101; appended as a reference). Clone plants can be grown by any suitable method.
특정 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 항원은 임의 공지의 방법에 의해 생산할 수 있다. 일부 구체예에서, 식물 또는 식물의 일부에서 인플루엔자 항원이 발현된다. 당분야에 공지된 통상의 조건 및 기술에 따라 단백질을 분리하고 정제한다. 여기에는 추출, 침전, 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 전기영동 및 이와 유사한 방법이 포함된다. 본 발명은 당분야에 공지된 임의 다양한 식물 발현 시스템 및 여기에서 제공하는 바이러스 발현 시스템을 이용하여 인플루엔자 항원 생산의 적절한 스케일 업 및 정제와 관계한다.In certain embodiments, influenza antigens of the invention can be produced by any known method. In some embodiments, the influenza antigen is expressed in a plant or part of a plant. Proteins are isolated and purified according to conventional conditions and techniques known in the art. This includes extraction, precipitation, chromatography, affinity chromatography, electrophoresis and similar methods. The present invention relates to appropriate scale up and purification of influenza antigen production using any of a variety of plant expression systems known in the art and the virus expression systems provided herein.
본 발명의 많은 구체예에서, 백신 산물을 위한 인플루엔자 항원을 분리하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명의 단백질은 이를 발현시키는 식물 조직 또는 이의 일부, 예를 들면, 뿌리, 뿌리 세포, 식물, 식물 세포로부터 생산되고, 식물 재료의 부분적 또는 온전한 분리를 위해 여기에서 설명하는 방법 또는 당분야에 공지된 이용가능한 방법을 이용한다. 식물 세포 또는 조직의 일부 또는 전부로부터 발현 산물을 분리하는 것이 바람직한 경우에 임의 이용가능한 기술을 이용할 수도 있다. 당업자는 광범위한 분별 및 분리 과정에 대해 잘 숙지하고 있을 것이다(예를 들면, Scopes et al, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Janson et al, 1993; Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Wiley- VCH, 1998; Springer- Verlag, NY, 1993; and Rot, protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001; 각각을 참고문헌으로 첨부한다). 흔히, 산물은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도를 가지는 것이 바람직하다. 식물 조직 또는 유체로부터 물질을 정제하는데 유용한 방법에 대해서는 U.S. Pat. Nos. 6,740,740 ; 6,841,659을 참고한다.In many embodiments of the present invention, it will be desirable to isolate influenza antigens for vaccine products. Proteins of the invention are produced from plant tissues or parts thereof expressing them, such as roots, root cells, plants, plant cells, and are known in the art or methods described herein for partial or intact separation of plant material. Use available methods. Any available technique may be used where it is desired to separate the expression product from some or all of the plant cells or tissues. Those skilled in the art will be familiar with a wide range of fractionation and separation processes (e.g., Scopes et al, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Janson et al, 1993; Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 1998; Springer- Verlag, NY, 1993; and Rot, protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001; each incorporated by reference). Often, the product is about 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% It is desirable to have the above purity. Useful methods for purifying substances from plant tissues or fluids are described in U.S. Pat. Pat. Nos. 6,740,740; See 6,841,659.
당업자는 원하는 인플루엔자 항원 산물을 수득하는 방법이 추출에 의한 것이라는 것을 인지할 것이다. 식물 재료(가령, 뿌리, 잎 등)를 추출하여 잔류 바이오매스로부터 원하는 산물을 제거하여 산물의 농도 및 순도를 증가시킨다. 식물을 완충액에서 추출한다. 예를 들면, 식물 재료는 완충액 예를 들면 인산염 완충액과 1대1 중량비의 물로 이동한다. 필요한 경우에 단백질분해효소 저해물질을 첨가할 수도 있다. 식물 재료는 활발한 블렌딩 또는 그라인딩을 이용하여 파쇄시키고, 여과 또는 원심분리에 의해 제거된 바이오매스는 완충액에 현탁되고 추출된다. 용액에 포함된 산물을 추가 단계를 이용하여 추가 정제하거나 동결 건조 또는 침전을 통하여 건조 분말로 전환시킬 수 있다. 프레싱으로 추출을 할 수도 있다. 식물 또는 뿌리는 프레스에서 가압하거나 또는 서로 접해있는 롤러를 통과시켜 뭉개어 추출할 수 있다. 으깨진 식물 또는 뿌리로부터 나타나는 유체를 수거하고, 당분야에 공지된 방법에 따라 처리한다. 프레스를 통한 추출은 좀더 농축된 형태의 산물 방출을가능하게 한다. 그러나, 산물의 전반적인 수률은 산물이 용액에서 추출되는 경우에 낮아질 수도 있다.Those skilled in the art will appreciate that the method of obtaining the desired influenza antigen product is by extraction. Plant materials (eg roots, leaves, etc.) are extracted to remove the desired product from the residual biomass to increase the concentration and purity of the product. The plant is extracted from the buffer. For example, the plant material is transferred to a buffer such as phosphate buffer and water in a 1 to 1 weight ratio. Protease inhibitors may be added if necessary. The plant material is crushed using vigorous blending or grinding, and the biomass removed by filtration or centrifugation is suspended and extracted in buffer. The product contained in the solution can be further purified using additional steps or converted to dry powder through freeze drying or precipitation. You can also extract by pressing. Plants or roots can be crushed and extracted by pressing in presses or through rollers facing each other. The fluid emerging from the crushed plant or root is collected and treated according to methods known in the art. Extraction through the press allows product release in a more concentrated form. However, the overall yield of the product may be lower if the product is extracted from solution.
백신vaccine
본 발명은 인플루엔자 감염의 치료 및 예방을 위한 백신으로 활성이 있는 인플루엔자 항원(가령 인플루엔자 단백질 또는 이의 면역원 부분 또는 인플루엔자 단백질 또는 이의 면역원 부분을 포함하는 융합 단백질과 같이 치료요법적 용도의 약리학적 항원 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 수의학 분야에 활성이 있는 인플루엔자 항원으로 수의학 분야에 용도를 제공한다. 특정 구체예에서, 인플루엔자 항원은 식물 또는 이의 일부분(가령, 뿌리, 세포, 싹, 세포 라인, 식물 등)으로부터 만들 수 있다. 특정 구체예에서, 제공된 인플루엔자 항원이 식물, 식물 세포 또는 식물 조직(가령, 싹, 출아묘, 뿌리, 뿌리 배양물, 클론 세포, 클론 세포 라인, 클론 식물 등)에서 발현된다면 식물을 직접 사용하거나 또는 부분적으로 정제된 또는 정제된 형태의 개체에 약리학적 투여를 위해 조제물로 이용할 수 있다.The present invention provides a pharmacological antigenic protein for therapeutic use, such as an influenza antigen that is active as a vaccine for the treatment and prevention of influenza infection, such as an influenza protein or an immunogen portion thereof or a fusion protein comprising an influenza protein or an immunogen portion thereof. In addition, the present invention provides a use in the veterinary field as an influenza antigen active in the veterinary field In certain embodiments, the influenza antigen is a plant or part thereof (eg, root, cell, shoot, cell line, plant). Etc. In certain embodiments, provided influenza antigens are expressed in plants, plant cells or plant tissues (eg, shoots, sprouted seedlings, roots, root cultures, clone cells, clone cell lines, clone plants, etc.). If used directly or partially in purified or purified form. It can be used as a preparation for pharmacological administration.
본 발명은 투여가 필요한 개체에 투여하였을 때 약리학적 활성을 유지하는 인플루엔자 항원을 발현시키는 식물, 식물 세포, 식물 조직을 제공한다. 예시적인 개체에는 척추동물(사람과 같은 포유류)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 개체에는 소, 양, 개, 고양이 등과 같은 수의학적 개체가 포함된다. 특정 구체예에서 식용 식물 또는 이의 일부분(가령, 싹, 뿌리)를 치료요법적 효과량으로 개체의 구강으로 투여한다. 일부 측면에서, 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원은 여기에서 설명하는 약리학적 조제물로 제공된다. 본 발명의 백신 조성물에는 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 최소 두 가지 인플루엔자 항원이 투여되는 백신 조성물에 포함될 수 있다.The present invention provides plants, plant cells, plant tissues that express influenza antigens that retain pharmacological activity when administered to a subject in need thereof. Exemplary subjects include vertebrates (mammals, such as humans). According to the invention, the subject includes veterinary subjects such as cattle, sheep, dogs, cats and the like. In certain embodiments the edible plant or portion thereof (eg, shoots, roots) is administered to the oral cavity of the individual in a therapeutically effective amount. In some aspects, one or more influenza antigens are provided in the pharmacological preparations described herein. The vaccine composition of the present invention comprises one or more influenza antigens. In certain embodiments, at least two influenza antigens of the invention may be included in a vaccine composition administered.
본 발명에 따르면, 인플루엔자 항원 백신으로 개체를 치료하면 생리학적 효과를 유도할 수 있다. 백신 단백질은 질환 또는 질병에 대해 치료 또는 경감 성질을 가질 수 있어, 이를 투여하여 질환 또는 질병의 증상 또는 심각성을 완화, 경감 또는 개시의 지역 또는 역전시킬 수 있다. 인플루엔자 항원을 포함하는 백신은 예방학적 성질을 가질 수 있기 때문에 이를 이용하여 이와 같은 질병 또는 질환 또는 발병할 것 같은 병리학적 상태에서 심각성을 감소시키거나 질병의 개시를 방지 또는 지연시킬 수 있다. 본 발명에 따른 항원으로 개체를 치료하여 유도할 수 있는 생리학적 효과에는 유기체에 의한 감염을 방해하기 위해 효과적인 면역 반응을 유도하는 것이 포함된다.According to the present invention, treating an individual with an influenza antigen vaccine can induce a physiological effect. Vaccine proteins may have therapeutic or alleviating properties for a disease or condition and may be administered to localize or reverse the symptoms or severity of the disease or condition. Because vaccines comprising influenza antigens can have prophylactic properties, they can be used to reduce the severity or prevent or delay the onset of such diseases or diseases or pathological conditions that are likely to develop. Physiological effects that can be induced by treating an individual with an antigen according to the present invention include inducing an effective immune response to prevent infection by an organism.
일부 구체예에서, 발명의 백신은 경구 또는 점막 경로를 통하여 운반될 수 있다. 경구 및/또는 점막 운반은 많은 병인균의 주요 감염 경로가 되는 점막 조직 감염을 예방할 가능성이 있다. 경구 및/점막 운반은 전신 면역 반응을 준비시킬 수 있다. 점막 면역 시스템을 자극하고 전신 면역원성을 준비시킬 수 있는 항원의 경구 투여용 이형 발현 시스템 개발에 상당한 진전이 있어왔다. 그러나, 경구 백신의 운반에 기존 효과는 효과를 달성하기 위해 상당량의 항원이 요구된다는 것을 설명한다. 따라서, 표적 항원의 다량을 경제적으로 생산하는 것이 효과적인 경구 백신을 만드는 선행 조건이다. 열안정성 항원을 포함한 항원을 발현시키는 식물 개발이 이와 같은 난제를 해결하는 좀 더 실질적인 방법이 된다.In some embodiments, the vaccines of the invention can be delivered via the oral or mucosal route. Oral and / or mucosal transport has the potential to prevent mucosal tissue infection, which is a major path of infection for many pathogens. Oral and / or mucosal delivery can prepare for a systemic immune response. Significant progress has been made in developing heterologous expression systems for oral administration of antigens that can stimulate the mucosal immune system and prepare systemic immunogenicity. However, the existing effect on the delivery of oral vaccines demonstrates that a significant amount of antigen is required to achieve the effect. Therefore, economic production of large amounts of target antigens is a prerequisite for making an effective oral vaccine. Developing plants that express antigens, including thermostable antigens, is a more practical way to address these challenges.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있는데 예를 들면, 경구, 비강, 장관(enterally), 장관외(parenterally), 근육 또는 정맥, 직장, 질, 국소, 안구, 폐를 통하여 또는 접촉에 의해 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 식물 또는 이의 일부에서 발현되는 인플루엔자 항원은 식물을 개체로 직접 경구로 직접 투여할 수 있다. 일부 측면에서 식물 또는 식물의 일부에서 발현되는 백신 단백질을 추출하고 정제하여 약학 조성물 조제에 이용할 수 있다. 이들의 사용처에 따라 분리된 산물을 적절히 조제하는 것이 바람직하다(약리학적 물질, 백신 조성물 등). 일부 구체예에서, 이를 발현시키는 일부 또는 전부의 식물 조직과 함께 산물을 조제하는 것이 바람직할 것이다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a subject through various routes, for example, orally, nasal, enterally, parenterally, muscle or vein, rectal, vaginal, topical, ocular, lung Or by contact. In certain embodiments, influenza antigens expressed in a plant or part thereof can be directly orally administered directly to the subject. In some aspects vaccine proteins expressed in plants or parts of plants can be extracted and purified to prepare pharmaceutical compositions. It is preferable to prepare the separated product appropriately according to their use (pharmacological substance, vaccine composition, etc.). In some embodiments, it will be desirable to formulate the product with some or all plant tissues that express it.
식물 재료와 함께 산물을 조제하는 것이 바람직할 경우에, 관련 수용체(예를 들면, 사람 또는 다른 동물)에 독성이 없는 식물을 이용하는 것이 바람직할 것이다. 관련t 식물 조직 (가령, 세포, 뿌리, 잎)을 단순하게 수확하여 공지의 기술을 이용하여 처리할 수 있는데 발현된 산물의 활성을 유지하는 것이 고려되어야 한다. 특정 구체예에서, 식용 식물( 및 식물의 식용 부분)에 발현된 인플루엔자 항원을 보유하여 물질을 바로 섭취하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 경구 투여(적절히 조제된)후에 백신 항원이 활성화되면 식용 식물 부분에서 항원 단백질을 생산하여 단백질이 발현된 식물의 일부 또는 전부와 함께 경구 투여용으로 발현된 인플루엔자 항원을 조제하는 것이 바람직할 것이다.If it is desired to prepare the product with plant material, it would be desirable to use plants that are not toxic to the relevant receptors (eg, humans or other animals). Relevant plant tissues (eg, cells, roots, leaves) can be simply harvested and processed using known techniques, which should be considered to maintain the activity of the expressed product. In certain embodiments, it is desirable to have the influenza antigen expressed on an edible plant (and the edible portion of the plant) and consume the material directly. For example, if the vaccine antigen is activated after oral administration (appropriately formulated), it is desirable to produce an antigenic protein in the edible plant part to prepare an influenza antigen expressed for oral administration with some or all of the plant where the protein is expressed. something to do.
제공되는 백신 항원 (가령, 본 발명의 인플루엔자 항원)은 공지 기술에 따라 조제될 수 있다. 예를 들면, 백신 산물의 효과량을 하나 또는 그이상의 유기 또는 무기, 액상 또는 고체의 약리학적으로 적절한 캐리어 물질과 함께 조제할 수 있을 것이다. 본 발명에 따라 생산된 백신 항원은 정제, 캡슐, 트로치, 분산액, 현탁액, 용액, 겔캡, 알약, 캐플릿, 크림, 연고, 에어로졸, 분말 패킷형태가 되며, 약형에서 단백질의 활성을 파괴하지 않는한 액체, 용매, 희석액, 표면활성물질, 등장액, 농후제, 또는 에멸젼화제, 보존제 및 고체 결합제등이 포함될 수 있다.Provided vaccine antigens (eg, influenza antigens of the invention) can be prepared according to known techniques. For example, an effective amount of the vaccine product may be formulated with one or more organic or inorganic, liquid or solid pharmacologically appropriate carrier materials. Vaccine antigens produced according to the invention are in the form of tablets, capsules, troches, dispersions, suspensions, solutions, gelcaps, pills, caplets, creams, ointments, aerosols, powdered packets, which do not destroy the activity of the protein in the dosage form. Liquids, solvents, diluents, surface active substances, isotonic solutions, thickeners, or emulsifiers, preservatives and solid binders may be included.
일반적으로, 조성물은 상이한 약리학적 수용가능한 캐리어, 어쥬번트, 비이클 또는 이들중 하나 또는 그 이상의 복합체를 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이 "약리학적으로 수용가능한 캐리어, 어쥬번트 또는 비이클"에는 투여에 사용할 수 있는 용매, 분산 매체, 코팅, 항균 및 항곰팡이제, 등장액, 흡수 지연 물질이 포함된다. 약리학적으로 수용가능한 캐리어로 사용될 수 있는 물질에는 락토즈, 글루코즈, 슈크로즈와 같은 당; 옥수수 전분, 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오즈 및 카르복시메틸 셀룰로오즈, 에틸 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트와 같은 유도물질; 분말형 트라가탄; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일, 소이빈 오일과 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올레이트, 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화 마그네슘, 수산화 알루미늄과 같은 완충액; 알긴산; 발열물질없는 물; 등장 염; 링거액; 에틸 알코올 및 인산염 완충 용액 및 라우릴 설페이트 나트륨 및 스테아레이트 마그네슘과 같은 비-독성 윤활제, 발색제, 방출제, 피복제, 감미제, 향료, 방향, 보존제, 항산화제 등이 제조업자의 판단에 따라 조성물에 포함될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1975). 예를 들면, 백신 항원 산물은 통상의 당의정을 만드는 혼합 과립화, 용해, 동결건조 또는 유사한 과정을 통하여 약학 조성물로 제공될 수 있다.In general, the composition may comprise different pharmacologically acceptable carriers, adjuvants, vehicles or complexes of one or more thereof. As used herein, "pharmacologically acceptable carrier, adjuvant or vehicle" includes solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic solutions, delayed absorption materials, which may be used for administration. Materials that can be used as pharmacologically acceptable carriers include sugars such as lactose, glucose, sucrose; Starches such as corn starch, potato starch; Inducers such as cellulose and carboxymethyl cellulose, ethyl cellulose, cellulose acetate; Powdered tragatan; malt; gelatin; talc; Excipients such as cocoa butter and suppository waxes; Oils such as peanut oil, cottonseed oil, sesame oil, olive oil, corn oil, soybean oil; Glycols such as propylene glycol; Esters such as ethyl oleate, ethyl laurate; Agar; Buffers such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; Alginic acid; Pyrogen-free water; Isotonic salts; Ringer's solution; Non-toxic lubricants, colorants, release agents, coatings, sweeteners, flavorings, fragrances, preservatives, antioxidants, such as ethyl alcohol and phosphate buffer solutions and lauryl sulfate sodium and magnesium stearate, are included in the composition at the manufacturer's discretion. (Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, EW Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1975). For example, the vaccine antigen product may be provided to the pharmaceutical composition through mixed granulation, dissolution, lyophilization or similar procedures to make conventional dragees.
추가 백신 성분Additional Vaccine Ingredients
발명의 백신에는 개체에 투여하였을 때 백신의 면역원성을 강화시키기 위해 임의 적절한 어쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 어쥬번트에는 Quillaja saponaria (QS) 추출물, 식품 등급의 QS, 예를 들면, Quil A 및 QS-21의 정제된 서브분류물, 명반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, MF59, Malp2, 인컴플리트 Freund's 어쥬번트; 컴플리트 freund's 어쥬번트; 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL)등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 추가 어쥬번트에는 면역 조절 올리고뉴클레오티드 예를 들면, WO 96/02555에서 설명하는 메틸화안된 CpG 서열을 포함한다. 여기에서 언급한 것과 같이, TH1 세포 반응의 선호 자극물질인 어쥬번트를 제공하는 경우에 상이한 어쥬번트의 복합도 고려할 수 있다. 예를 들면, QS21는 3D-MPL와 함께 조제할 수 있다. QS21:3D-MPL 비율은 일반적으로 1: 10 내지 10:1; 1:5 내지 5:1이 되며; 실질적으로는 1:1이다. 적절한 시너지 효과를 내는 범위는 3D-MPL:QS21이 2.5:1 내지 1:1이 된다. 사람 백신 조제물에 이용하기에 적절한 정제된 QS 추출물의 양은 체중 kg당 0.01 mg 내지 10 mg이다.The vaccine of the invention may further comprise any suitable adjuvant to enhance the immunogenicity of the vaccine when administered to a subject. For example, such adjuvant includes Quillaja saponaria (QS) extract, purified subclasses of food grade QS such as Quil A and QS-21, alum, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, MF59, Malp2, Incomplete Freund's adjuvant; Complete freund's adjuvant; 3 De-O-acylated monophosphoryl lipid A (3D-MPL), and the like. Additional adjuvants include immunomodulatory oligonucleotides such as the unmethylated CpG sequences described in WO 96/02555. As mentioned herein, a combination of different adjuvants may also be considered when providing an adjuvant which is the preferred stimulator of the TH1 cell response. For example, QS21 can be prepared together with 3D-MPL. The QS21: 3D-MPL ratio generally ranges from 1: 10 to 10: 1; 1: 5 to 5: 1; Practically 1: 1. The range that produces a suitable synergy is 3D-MPL: QS21 ranging from 2.5: 1 to 1: 1. The amount of purified QS extract suitable for use in human vaccine formulations is from 0.01 mg to 10 mg per kg body weight.
특정 열안정성 단백질(가령, 리체나제)은 자체적으로 면역 반응 강화 활성을 설명하는데, 이와 같은 단백질은 인플루엔자 항원과 융합되거나 별도로 사용되건 간에 어쥬번트 이용으로 간주한다. 따라서, 발명의 백신 조성물에는 하나 또는 그이상의 어쥬번트를 포함한다. 특정 백신 조성물에는 두 개 또는 그이상의 어쥬번트를 포함한다. 또한, 조성물 및 투여 경로에 따라, 특정 어쥬번트가 특정 조성물 또는 복합물에 바람직하다.Certain thermostable proteins (eg, reginase) themselves describe immune response enhancing activities, which are considered to be adjuvant use, whether fused with influenza antigens or used separately. Thus, the vaccine composition of the invention comprises one or more adjuvants. Certain vaccine compositions include two or more adjuvants. In addition, depending on the composition and route of administration, certain adjuvants are preferred for certain compositions or complexes.
특정 상황에서, 피하로 또는 근육으로 투여되는 백신 산물(가령, 단백질)의 하나 또는 그 이상의 성분의 흡수를 느리게 함으로써 발명의 백신 효과를 연장시키는 것도 바람직할 수도 있다. 이는 물에 용해도가 나쁜 결정 또는 무정형 물질의 액채 현탁액을 이용하면 된다. 산물의 흡수 속도는 분해율에 따라 달라지고, 분해율은 크기 및 형태에 따라 달라진다. 대안으로 또는 추가로, 장관외로 투여된 산물의 흡수 지연은 오일 비이클에 산물을 용해 또는 현탁시켜 얻을 수 있다. 주사용 데포는 단백질의 마이크로 캡슐 매트릭스를 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해가능한 폴리머에 형성시켜 만들 수 있다. 산물과 폴리머의 비율 및 이용되는 특정 폴리머의 성질에 따라 방출 속도를 조절할 수 있다. 생분해가능한 폴리머에는 포릴(오르소에스테르) 및 폴리(안하이드리드)등이 포함된다. 주사용 데포우 조성물은 신체 조직에 적응할 수 있는 리포좀 또는 마이크로에멸전에 산물을 포집시켜 만들 수 있다. 대안적인 폴리머 운반 비이클을 경구 조제물에 이용할 수 있다. 예를 들면, 생분해가능한, 인체에 사용가능한 폴리머 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르 및 폴리락트산 등이 이용될 수 있다. 항원 또는 이의 면역원성 부분을 미소 입자 가령 폴리머 운반 비이클과 복합시켜 미소입자로 조제할 수도 있다.In certain circumstances, it may be desirable to extend the vaccine effect of the invention by slowing the absorption of one or more components of the vaccine product (eg, protein) administered subcutaneously or intramuscularly. This can be achieved by using a liquid suspension of crystalline or amorphous material, which is poorly soluble in water. The rate of absorption of the product depends on its rate of degradation, which depends on its size and shape. Alternatively or additionally, delayed absorption of the product administered extra-gut can be obtained by dissolving or suspending the product in an oil vehicle. Injectable depots can be made by forming microencapsule matrices of protein into biodegradable polymers such as polylactide-polyglycolide. The rate of release can be controlled by the ratio of product to polymer and the nature of the particular polymer employed. Biodegradable polymers include poly (orthoester), poly (anhydride) and the like. Depot injectable compositions can be made by entrapping the product prior to liposomes or microemergence that can adapt to body tissue. Alternative polymer delivery vehicles can be used in oral formulations. For example, biodegradable, human-useable polymers such as ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, polylactic acid, and the like can be used. The antigen or immunogenic portion thereof may be formulated into microparticles by combining with microparticles such as polymer transport vehicles.
백신 항원의 장관 투여용 조제물을 고체, 반고체, 현탁액 또는 에멸젼 형태로 조입시킬 수 있도 물, 현탁액, 에멸젼 물질과 같은 임의 약리학적으로 수용가능한 캐리어와 함께 합성될 수 있다. 항원은 특히 예방 수잔으로 투여되는 경우에 펌프 또는 지연 방출형으로 투여될 수 있다. 보조 활성 화합물 예를 들면, 치료될 질병 또는 임상 상태에 대해 독립적으로 활성을 가지는 화합물 또는 본 발명 화합물의 활성을 강화시키는 화합물을 조성물에 또는 조성물과 함께 투여할 수 있다. 향료 및 발색제를 이용할 수도 있다.Preparations for enteral administration of vaccine antigens can be synthesized with any pharmacologically acceptable carrier such as water, suspensions, or emulsion materials, which may be incorporated in solid, semisolid, suspension or emulsion form. The antigen may be administered in a pump or delayed release form, particularly when administered as a prophylactic Susan. Supplementary Active Compounds For example, a compound having activity independently of a disease or clinical condition to be treated or a compound that enhances the activity of a compound of the invention can be administered to or in combination with the composition. Fragrances and colorants can also be used.
본 발명의 백신 산물, 선택적으로 식물 조직과 함께 백신 산물은 약학 조성물로 경구 투여하는데 특히 적합하다. 경구 액체 조성물을 이용하고, 소아 집단에 특히 용도가 있을 것이다. 수확된 식물 재료는 원하는 치료요법적 산물, 원하는 형태에 따라 다양한 방법(가령, 대기 건조, 동결 건조, 추출 등)에 의해 프로세스된다. 상기에서 설명하는 이와 같은 조성물은 경구로만 복용하거나 음식 또는 사료 또는 음료와 함께 복용할 수 있다. 경구 투여용 조성물에는 식물, 식물의 추출물, 감염된 식물에서 정제된 단백질이 건조 분말, 음식, 수용성 또는 비-수용성 용매, 현탁액 또는 에멸젼 형으로 제공된다. 비-수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 생선 오일, 주사용 유기 에스테르가 된다. 수용성 캐리어에는 물, 물-알코올 용액, 에멸젼 또는 현탁액을 포함하는데, 염화나트륨 염, 링거 덱스트로즈 용액, 덱스트로즈+염화나트륨 용액, 락토즈 또는 고정 오일을 포함하는 링거액을 포함한 염 및 완충 의료용 비경구 비이클이 포함된다. 건조 분말에는 동결 건조, 대기 건조 또는 분무 건조된 임의 식물 바이오매스를 포함한다. 예를 들면, 식물은 이들을 시판되는 대기 건조기에 약 120℉에서 바이오매스내 수분 함량이 중량대비 5% 미만이 될 때까지 대기 건조시킬 수도 있다. 건조된 식물은 벌크 고체로 프로세싱하기 위해 보관하거나 그라인딩하여 원하는 메쉬 크기의 분말로 만들기 위해 프로세스한다. 대안으로 또는 추가로, 동결-건조는 대기 건조에 민감한 산물에 이용할 수 있다. 산물은 바이오매스내 수분 함량이 중량대비 5% 미만이 될 때까지 진공 건조기에서 동결 건조시킬 수도 있다. 건조된 물질은 여기에서 설명하는 것과 같이 추가 처리할 수 있다.Vaccine products of the invention, optionally together with plant tissue, are particularly suitable for oral administration in pharmaceutical compositions. Oral liquid compositions are used and will be of particular use in the pediatric population. Harvested plant material is processed by various methods (eg, air drying, freeze drying, extraction, etc.) depending on the desired therapeutic product, the desired form. Such compositions described above may be taken orally or in combination with food or feed or beverage. Compositions for oral administration include plants, plant extracts, and proteins purified from infected plants in the form of dry powders, foods, water soluble or non-aqueous solvents, suspensions or emulsions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils, fish oils, injectable organic esters. Aqueous carriers include water, water-alcohol solutions, emulsions or suspensions, salts and buffered medical parenterals including sodium chloride salt, Ringer's dextrose solution, dextrose + sodium chloride solution, Ringer's solution including lactose or fixed oils. Old vehicles are included. Dry powders include any plant biomass that is freeze dried, air dried or spray dried. For example, the plants may be air dried in a commercial air dryer at about 120 ° F. until the moisture content in the biomass is less than 5% by weight. The dried plants are stored or ground for processing into bulk solids and processed to produce a powder of the desired mesh size. Alternatively or in addition, freeze-drying may be used for products that are sensitive to atmospheric drying. The product may be lyophilized in a vacuum dryer until the moisture content in the biomass is less than 5% by weight. The dried material may be further processed as described herein.
식물에서 유도된 물질을 하나 또는 그이상의 허브 조제물과 함께 또는 이와 같은 형태로 투여할 수도 있다. 유용한 허브 조제물에는 액체 및 고체 허브 조제물이 포함된다. 허브 조제물의 일부 실시예에는 팅크제, 추출물(예를 들면, 수용성 추출물, 알코올 추출물), 달임(decoctions), 건조 조제물(예를 들면 대기-건조, 분무 건조, 냉동 또는 냉동-건조), 분말(동결건조된 분말) 및 액체가 포함된다. 허브 조제물은 임의 표준 운반 비이클 예를 들면, 캡슐, 정제, 좌약, 액상 약형 등의 형태로 제공될 수 있다. 당업자는 본 발명에 이용할 수 있는 허브 조제물의 운반 양식 및 다양한 조제물의 형태를 인지할 수 있을 것이다.The plant derived material may be administered together with or in the form of one or more herbal preparations. Useful herbal preparations include liquid and solid herbal preparations. Some examples of herbal preparations include tinctures, extracts (eg, water soluble extracts, alcohol extracts), decoctions, dry preparations (eg air-dry, spray dry, freeze or freeze-dry), powders (Freeze-dried powder) and liquids. Herbal preparations may be provided in the form of any standard delivery vehicle such as capsules, tablets, suppositories, liquid dosage forms, and the like. Those skilled in the art will recognize the modes of delivery of the herbal formulations and the forms of the various formulations that may be employed in the present invention.
발명의 뿌리 라인, 세포 라인, 식물, 추출물, 분말, 건조된 조제물, 정제된 단백질 또는 핵산 산물 등은 상기에서 설명하는 하나 또는 그이상의 부형제 유무하게 포집된 형(encapsulated form)가 될 수 있을 것이다. 고형 약형은 정제, 당의, 캡슐, 알약, 과립 등과 같은 형태는 피복이나 장용피, 방출 제어 피복 및 당분야에 공지된 다른 코팅으로 준비될 수도 있다. 고형 약형에서 활성 물질은 슈크로즈, 락토즈 또는 전분과 같은 하나이상의 비활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이와 같은 약령은 정상적인 경우에, 비활성 희석제이외에 비활성 윤활제 및 스테아레이트 마그네슘 및 미소결정 셀룰로오즈와 같은 다른 태블릿 보조제를 추가 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 약형에는 완충물질이 포함될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명제를 포함하거나 활성 성분만을 방출하거나 또는 지연된 방식으로 장관의 특정 부분에 선호적으로 방출하는 조성물이 될 수 있다. 이용되는 삽입조성물에는 폴리머 물질 및 왁스를 포함할 수 있다.Root lines, cell lines, plants, extracts, powders, dried preparations, purified proteins or nucleic acid products of the invention may be in encapsulated form with one or more excipients described above. . Solid dosage forms may be prepared in the form of tablets, dragees, capsules, pills, granules and the like, with a coating or enteric coating, a release controlling coating and other coatings known in the art. In solid dosage forms the active substance may be mixed with one or more inert diluents such as sucrose, lactose or starch. Such a condition may, in normal cases, further comprise an inert lubricant and other tablet aids such as magnesium stearate and microcrystalline cellulose in addition to the inert diluent. In the case of capsules, tablets and pills, the dosage form may comprise a buffer. These may optionally be compositions comprising an opaque agent, releasing only the active ingredient or preferentially releasing to certain parts of the intestine in a delayed manner. Insert compositions used may include polymeric substances and waxes.
일부 방법에서 본 발명에 따른 인플루엔자 항원 또는 이의 바이오매스 을 발현시키는 식물 또는 이의 일부를 의료용 식품으로 경구 투여할 수 있다. 이와 같은 식용 조성물은 일반적으로 고형일 경우에는 날로 먹고, 액상형일 경우에는 마신다. 식물 재료를 사전 프로세싱 단계없이 또는 최소한의 조리후에 바로 섭취할 수 있다. 예를 들면, 직접적으로 먹을 수 있는 싹에 백신 단백질이 발현될 수 있다. 예를 들면, 알파파 싹, 녹두 싹 또는 시금치 또는 양상추 잎에 백신 항원이 발현된다. 한 구체예에서, 식물 바이오매스를 프로세스하여 프로세싱 단계후에 회수된 물질을 섭취한다.In some methods, a plant or part thereof expressing an influenza antigen or biomass thereof according to the invention can be administered orally as a medical food. Such edible compositions are generally eaten raw when solid and drank when liquid. The plant material can be taken directly without pre-processing steps or after minimal cooking. For example, vaccine proteins may be expressed in directly edible shoots. For example, vaccine antigens are expressed in alpha wave sprouts, mung bean sprouts, or spinach or lettuce leaves. In one embodiment, the plant biomass is processed to consume recovered material after the processing step.
본 발명에 따른 유용한 프로세싱 방법은 식품 또는 사료 산업에 흔히 이용되는 방법이다. 이와 같은 방법에 의한 최종 산물에는 일반적으로 발현된 항원의 실질적인 양이 포함되고, 먹거나 또는 마시기에 편리하다. 최종 산물은 다른 음식 또는 사료형 예를 들면, 염, 캐리어, 향 보강제, 항생제 등과 함께 혼합될 수 있으며, 고형, 반-고형, 현탁액, 에멸젼 또는 액상형으로 소비될 수 있다. 이와 같은 방법에는 보존 단계 예를 들면, 파스퇴르화 반응, 조리 또는 보전 및 방부 물질 첨가등이 포함된다. 임의 식물을 이용할 수 있고, 본 발명에 따라 프로세싱되어 식용 또는 마실 수 있는 식물성 물질을 만든다. 식물에서 유도된 조제물에 있는 인플루엔자 항원의 양은 당분야에 표준 방법에 의해 테스트될 수 있는데, 예를 들면, 겔 전기영동, 산물에 특이적인 프로브 또는 항체를 이용하는 ELISA 또는 웨스턴 블랏 분석이 있다. 이와 같은 측정 방법을 이용하여 소비되는 백신 항원 단백질 양을 표준화시킨다. 예를 들면 백신 항원의 양을 측정 및 조절하여, 산물의 상이한 수준을 가지는 산물 배취(batches)를 혼합하여 단일 약량으로 소비되는 또는 마시게 되는 물질의 양을 표준화시킬 수 있다. 본 발명의 한정된 조절가능한 환경은 이와 같은 표준화 과정을 실행할 필요를 최소화시킬 수 있다.Useful processing methods according to the invention are those commonly used in the food or feed industry. Final products by this method generally include a substantial amount of the expressed antigen and are convenient to eat or drink. The final product can be mixed with other food or feed forms such as salts, carriers, flavor enhancers, antibiotics, and the like, and can be consumed in solid, semi-solid, suspension, emulsion or liquid form. Such methods include preservation steps such as pasteurization, cooking or preservation and addition of preservatives. Any plant can be used and processed in accordance with the present invention to produce an edible or drinkable vegetable material. The amount of influenza antigen in plant-derived preparations can be tested by standard methods in the art, such as, for example, gel electrophoresis, ELISA or Western blot analysis using product-specific probes or antibodies. This measurement method is used to standardize the amount of vaccine antigen protein consumed. For example, by measuring and controlling the amount of vaccine antigen, product batches with different levels of product can be mixed to normalize the amount of material consumed or consumed in a single dose. The limited adjustable environment of the present invention can minimize the need to implement this standardization process.
개체가 복용하는 식물 세포 도는 조직에서 생산된 백신 단백질은 소화계에 적절하게 흡수될 수 있다. 최소화로 프로세스된 식물 조직를 섭취할 경우 한 가지 장점은 식물의 세포에 단백질을 포집 또는 격리(sequestration)시킬 수 있다는 것이다. 따라서, 산물은 장에 도달하기 전에 상부 소화기관으로부터 어느 정도 보호를 받게되며, 활성 산물의 더 많은 비율이 흡수되는데 이용될 수 있을 것이다.Vaccine proteins produced by plant cells or tissues taken by the individual can be absorbed into the digestive system as appropriate. One advantage of ingesting plant tissue that has been processed with minimization is the ability to capture or sequester proteins in the cells of the plant. Thus, the product is somewhat protected from the upper digestive system before reaching the intestine, and a greater proportion of the active product may be used to absorb it.
본 발명의 약학 조성물은 치료목적으로 또는 예방목적으로 투여될 수 있다. 조성물을 질병의 치료 또는 예방에 이용될 수 있을 것이다. 예를 들면, 질병의 발생 위험이 있는 또는 질병으로 고통을 받고 있는 임의 개체를 치료할 수 있을 것이다. 개인은 질병의 임의 증상을 가진다고 진단을 받지 않고도 질병의 발생 위험이 있다고 판단될 수도 있을 것이다. 예를 들면 개인이 인플루엔자 감염에 대해 상대적으로 높은 위험 환경에 있거나 있었던 것으로 보이면 개인은 질병 발생 위험이 높은 것으로 간주한다. 유사하게, 개인의 가족 또는 친구 구성원이 인플루엔자 감염으로 진단을 받은 경우에 개인은 질병 발생 위험이 높은 것으로 간주한다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered for therapeutic or prophylactic purposes. The composition may be used to treat or prevent a disease. For example, any individual who is at risk of developing or suffering from a disease may be treated. An individual may be considered at risk of developing the disease without being diagnosed with any symptoms of the disease. For example, if an individual appears to or was at a relatively high risk for influenza infection, the individual is considered to be at high risk. Similarly, when an individual's family or friend member is diagnosed with an influenza infection, the individual is considered at high risk of developing the disease.
액상 약형은 경우 투여형을 형성하는데, 예를 들면, 약학적으로 수용가능한 에멸젼, 마이크로에멸젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘륵시르등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 활성 성분에 추가하여, 액체 약형에는 당분야에 통상으로 이용되는 비활성 희석제를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 물 또는 다른 용매, 용해물질, 유화제 예를 들면, 에틸 알오콜, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 목화시, 땅콩, 옥수수, 배, 올리브, 캐스터, 참깨 오일), 글리세롤, 테트라하이드로퓨르퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 및 이의 혼합물이 된다. 비활성 희석제 이외에도, 경구 조성물에는 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 방향제 및 풍미제와 같은 어쥬번트가 포함될 수 있다.Liquid dosage forms form a dosage form, for example, but include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable emulsions, microemulsions, solutions, suspensions, syrups and eloxir. In addition to the active ingredient, liquid dosage forms may include inert diluents conventionally used in the art, for example, water or other solvents, solubilizing agents, emulsifiers such as ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl Carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oils (especially in cotton, peanuts, corn, pears, olives, casters, sesame oils), Glycerol, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethylene glycol, sorbitan fatty acid esters and mixtures thereof. In addition to inert diluents, oral compositions may include adjuvant such as wetting agents, emulsifiers, suspending agents, sweetening agents, fragrances and flavoring agents.
직장 또는 질 투여용 조성물에는 좌약 또는 체류 관장제가 될 수 있는데, 이는 적절한 비-자극 부형제 또는 캐리어 예를 들면, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 실온에서는 고체이나 체온에서는 액체가 되어 직장 또는 질에서 용해되어 활성 단백질을 방출하는 좌약 왁스 등의 부형제 또는 캐리어를 본 발명의 조성물과 혼합하여 만들 수 있다.Compositions for rectal or vaginal administration may be suppositories or retention enemas, which are suitable non-irritating excipients or carriers, for example, cocoa butter, polyethylene glycol or solids at room temperature or liquid at body temperature to dissolve in the rectum or vagina Excipients or carriers, such as suppository waxes, that release proteins can be made by mixing with the compositions of the present invention.
본 발명의 백신 조성물의 국소, 점막 또는 경피 투여용 약형에는 연고, 고약, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치 등이 포함된다. 활성 물질 또는 이의 조제물을 멸균 조건하에서 약학적으로 수용가능한 캐리어와 혼합하고, 임의 필요한 보존제 또는 완충액도 필요에 따라 혼합할 수 있다. 점막 또는 경피 투여의 경우에 장벽을 침투하기에 적절한 침투제를 조성물에 이용한다. 이와 같은 침투제는Pharmaceutical formulations for topical, mucosal or transdermal administration of the vaccine composition of the present invention include ointments, plasters, creams, lotions, gels, powders, solutions, sprays, inhalants or patches. The active substance or its preparation may be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier under sterile conditions and any necessary preservatives or buffers may be mixed as needed. In the case of mucosal or transdermal administration, a penetrant suitable for penetrating the barrier is used in the composition. Such penetrants
당분야에 공지되어 있고, 경점막 투여의 경우에, 계면활성제, 담즙염, 푸시딘산 유도체 등이 포함된다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 이용하여 실시할 수 있다. 경피 투여의 경우에, 항원 또는 이의 면역원 부분을 연고, 살브스(salves), 겔 또는 크림이 된다. 안구 조성물, 귀점안제 및 안약등으로 조제하는 것도 본 발명의 범주에 속한다. 추라고 본 발명은 경피 패취를 이용하는 것도 고려하는데, 이는 신체로 백신 단백질의 조절된 운반을 제공하는데 추가적인 장점을 가진다. 이와 같은 약형은 적절한 매체에 백신 산물을 현탁 또는 분산시켜 만들 수 있다. 흡수 강화물질을 이용하여 피부를 통과하는 백신 단백질의 흐름을 증가시킬 수 있다. 속도 조절 막을 제공하거나 폴리머 매트릭스 또는 겔에 백신 단백질을 분산시켜 속도를 조절할 수 있다.Known in the art and for transmucosal administration, surfactants, bile salts, fusidic acid derivatives and the like are included. Transmucosal administration can be carried out using nasal sprays or suppositories. In the case of transdermal administration, the antigen or immunogen portion thereof is an ointment, salves, gel or cream. Formulation with ocular compositions, ear drops, eye drops and the like is also within the scope of the present invention. The present invention also contemplates the use of transdermal patches, which have the added advantage of providing controlled delivery of vaccine proteins to the body. Such dosage forms can be made by suspending or dispersing the vaccine product in the proper medium. Absorption enhancers can be used to increase the flow of vaccine protein through the skin. The rate can be controlled by providing a rate controlling membrane or by dispersing the vaccine protein in a polymer matrix or gel.
본 발명의 조성물은 원하는 결과를 얻는데 필수적인 양 및 시간으로 투여할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 약학 조성물의 "치료요법적 효과량"은 개체에서 질병을 치료, 경감 또는 예방하는데 효과적인 양을 말한다. 따라서, 여기에서 언급하는 "질병의 치료, 경감 또는 예방에 효과적인 양"은 임의 개체에서 질병을 치료, 경감 또는 예방하기 위해 약학 조성물의 독성을 일으키지 않는 범위의 충분한 양이 된다. 예를 들면, "치료요법적 효과량"은 감염 치료(예를 들면 바이러스 감염, 인플루엔자 감염) 등의 치료, 경감 또는 예방을 하기 위한 양이 된다.The compositions of the present invention may be administered in amounts and times necessary to achieve the desired result. In certain embodiments of the invention, a "therapeutically effective amount" of a pharmaceutical composition refers to an amount effective to treat, alleviate or prevent a disease in a subject. Thus, the "amount effective for treating, alleviating or preventing a disease" as referred to herein is a sufficient amount within a range that does not cause toxicity of the pharmaceutical composition to treat, alleviate or prevent the disease in any individual. For example, a "therapeutically effective amount" is an amount for treating, alleviating or preventing an infection treatment (for example, viral infection, influenza infection) and the like.
요구되는 정확한 양은 개체의 종, 나이, 일반적인 상태, 질병의 단계, 특정 약학 혼합물, 투여 방식 등에 따라 개체마다 다양하다. 항원을 발현시키는 식물 및 이의 준비물을 포함하는 본 발명의 인플루엔자 항원은 투여의 용이성 및 약형의 단일성을 위해 단위 투약형으로 조제될 수 있다. 여기에서 언급하는 발현 "투약 단위형"은 치료될 환자에 적절한 백신 조성물 단위를 말한다. 그러나, 본 발명의 조성물의 전체 매일 용도는 일반적으로 의학적 판단 범위내에서 의사가 결정한다. 임의 특정 환자 또는 유기체에 특별히 치료요법적으로 효과적인 약량 수준은 감염의 심각성 또는 위험도; 이용되는 특정 화합물의 활성; 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강, 성별, 환자의 식이요법, 약리역학적 상태, 투여 시간, 투여 경로 및 이용되는 특정 항원 방출 속도; 치료 기간; 이용되는 백신 조성물에 복합되는 또는 동시 투여되는 약물 및 의학 분야에 공지된 요인을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.The exact amount required varies from individual to individual, depending on the species, age, general condition, stage of disease, particular pharmaceutical mixture, mode of administration, etc. of the individual. Influenza antigens of the invention, including plants expressing the antigen and preparations thereof, can be formulated in unit dosage form for ease of administration and unity of the drug form. The expression “dosage unit form” as referred to herein refers to a unit of vaccine composition suitable for the patient to be treated. However, the overall daily use of the compositions of the present invention is generally determined by the physician within the scope of medical judgment. Dosage levels that are particularly therapeutically effective for any particular patient or organism may include the severity or risk of infection; The activity of the specific compound employed; The age, body weight, general health, sex, patient's diet, pharmacodynamic status, time of administration, route of administration, and specific antigen release rate employed; Duration of treatment; It may vary depending on a variety of factors, including those that are complex or co-administered to the vaccine composition employed and factors known in the medical arts.
본 발명의 백신 조성물은 복합 요법에 이용될 수 있는데(예를 들면 복합 백신 요법), 즉 약학 조성물을 하나 또는 그이상의 다른 원하는 약학 및 백신 과정과 동시에, 이전에, 또는 연차적으로 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 복합 섭생에 이용되는 특정 복합 치료(가령, 인플루엔자 감염의 백신 치료법)는 일반적으로 얻고자 하는 치료효과 및 원하는 치료요법 또는 과정의 공존성을 고려한다. 이용되는 치료법 및/또는 백신은 동일한 질환에 대해 원하는 효과를 얻거나(예를 들면 항원을 다른 인플루엔자 백신과 동시에 투여할 수 있고) 이들은 상이한 효과를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.Vaccine compositions of the invention can be used in combination therapy (e.g. combination vaccine therapy), i.e., the pharmaceutical composition can be used simultaneously, prior to, or annually with one or more other desired pharmaceutical and vaccine procedures. Will recognize. Certain combination therapies used in a combination regimen (eg, vaccine therapy for influenza infection) generally take into account the therapeutic effect desired and the coexistence of the desired therapy or process. It will be appreciated that the treatments and / or vaccines employed will achieve the desired effect on the same disease (eg, antigens may be administered simultaneously with other influenza vaccines) or they may have different effects.
특정 구체예에서, 백신 조성물은 최소 두 가지 인플루엔자 항원을 포함한다. 예를 들면, 특정 백신 조성물은 본 발명의 최소 두 가지 인플루엔자 항원으로 구성된다(본 발명의 항원을 포함하는 HA 도메인 및 NA 도메인). 일부 측면에서, 이와 같은 복합 백신에는 인플루엔자 항원을 포함하는 한 가지 열안정성 융합 단백질을 포함할 수 있고, 일부 다른 측면에서 인플루엔자 항원을 포함하는 두 가지 또는 그이상의 열안정성 융합 단백질이 제공될 수 있다.In certain embodiments, the vaccine composition comprises at least two influenza antigens. For example, a particular vaccine composition consists of at least two influenza antigens of the invention (HA domain and NA domain comprising the antigen of the invention). In some aspects, such combination vaccines may include one thermostable fusion protein comprising an influenza antigen, and in some other aspects, two or more thermostable fusion proteins comprising an influenza antigen may be provided.
복합 백신을 이용하는 경우에, 인플루엔자 항원의 임의 복합을 이용할 수 있다. 조성물에는 여기에서 제공되는 다중 항원을 포함하는 다중 인플루엔자 항원을 포함할 수도 있다. 또한 조성물에는 여기에서 제공하는 한가지 또는 그이상의 항원과 한가지 또는 그 이상의 추가 항원을 포함할 수도 있다. 인플루엔자 항원 복합물에는 한가지 이상의 감염 타입에 대항하여 면역 반응을 부여하기 위해 한가지 또는 그이상의 다양한 서브 타입 또는 균주에서 유도된 인플루엔자 항원을 포함한다. 인플루엔자 항원 복합물에는 상이한 서브타입 또는 균주에서 유도된 최소 한 개, 최소 두 개, 최소 세 개, 최소 네 개 또는 그이상의 항원을 포함할 수 있다. 일부 복합의 경우에, 상이한 서브타입으로부터 최소 두 개 또는 최소 세 개 항원이 하나의 백신 조성물에 복합된다. 또한, 복합 백신은 인플루엔자 항원 및 하나 또는 그이상의 독특한 감염성 물질을 이용할 수 있다.When using a combination vaccine, any combination of influenza antigens can be used. The composition may include multiple influenza antigens, including multiple antigens provided herein. The composition may also include one or more antigens and one or more additional antigens provided herein. Influenza antigen complexes include influenza antigens derived from one or more of various subtypes or strains to confer an immune response against one or more types of infection. Influenza antigen complexes may include at least one, at least two, at least three, at least four or more antigens derived from different subtypes or strains. In some combinations, at least two or at least three antigens from different subtypes are combined in one vaccine composition. Combination vaccines can also utilize influenza antigens and one or more unique infectious agents.
키트Kit
한 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 약학 팩 또는 키트에는 본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 생산하는 생 출아묘, 클론 물질 또는 조제물, 추출물 또는 본 발명의 약학 조성물의 하나 또는 그 이상의 추가 성분들을 선택적으로 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기에 백신을 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학 팩 또는 키트에는 약학 조성물의 하나 또는 그 이상의 추가 성분들을 선택적으로 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기에 본 발명에 따른 정제된 인플루엔자 항원을 포함한다. 특정 구체예에서, 약학 팩 또는 키트에는 복합 요법으로 사용하기 위한 추가의 승인된 치료제(가령, 인플루엔자 항원, 인플루엔자 백신)을 포함한다.In one aspect the invention provides a pharmaceutical pack or kit comprising the influenza antigen according to the invention. In certain embodiments, the pharmaceutical pack or kit comprises one or more optionally comprising one or more additional ingredients of a live germinating seedling, clonal material or preparation, extract or pharmaceutical composition of the invention producing an influenza antigen according to the invention The further container includes a pharmaceutical composition comprising the vaccine. In some embodiments, the pharmaceutical pack or kit comprises a purified influenza antigen according to the invention in one or more containers, optionally containing one or more additional ingredients of the pharmaceutical composition. In certain embodiments, the pharmaceutical pack or kit comprises additional approved therapeutic agents (eg, influenza antigens, influenza vaccines) for use in combination therapy.
이와 같은 용기에는 약학 산물의 조제, 이용 또는 판매에 관한 정부 기관의 주의 경고형태의 안내문이 부착될 수 있으며, 이는 인체 투여를 위한 조제, 이용 및 시판을 기관이 승인한다는 의미도 반영된다.Such containers may be accompanied by a notice in the form of a warning notice from a governmental agency regarding the preparation, use or sale of pharmaceutical products, which also reflects the approval of the Agency for the preparation, use and marketing of human administration.
키트에는 치료시약을 포함한다. 비-제한적인 예로, 인플루엔자 백신은 경구 투여형으로 치료를 위해 제공될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로 인플루엔자 백신은 투여용 주사용 조제물로 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 인플루엔자 백신은 투여용 흡입가능한 조제물로 제공될 수 있다. 따라서 약학적인 투여량 또는 지시는 인플루엔자 감염으로 고통을 받는 또는 감염 위험에 처한 개체에 투여하기 위해 키트에 제공될 수 있다.Kits include therapeutic reagents. As a non-limiting example, influenza vaccines can be provided for treatment in oral dosage forms. Alternatively or additionally, the influenza vaccine may be provided as an injectable formulation for administration. In some embodiments, the influenza vaccine can be provided as an inhalable preparation for administration. Thus, pharmaceutical dosages or instructions may be provided in the kit for administration to a subject suffering from or at risk of an influenza infection.
다음의 대표적인 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이며, 본 발명의 범주를 이에 국한시키고자 함은 아니다. 또한, 본 발명의 다양한 변형 및 여기에 제공된 것에 추가하여 다양한 실시예들은 내용으로부터 발생될 수 있다는 것을 당업자가 충분히 인지할 수 있을 것이다. 다음의 실시예는 다양한 구체예 및 이의 등가의 형태로 본 발명을 실행할 수 있도록 정보, 예시, 가이드 등이 포함된다.The following representative examples are intended to illustrate the invention and are not intended to limit the scope thereof. In addition, those skilled in the art will fully appreciate that various modifications to the present invention and various embodiments in addition to those provided herein may occur from the disclosure. The following examples include information, examples, guides, and the like, for practicing the present invention in various embodiments and equivalent forms thereof.
도 1 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 단백질 도메인의 도시도. 상부 좌측에 있는 I52 및 3은 여기에서 설명하는 도메인 1, 2, 3에 상응한다. 도메인 1, 2, 및 2, 1은 함께 폴드되어 스템 도메인(SD)을 만든다. 도메인 3은 구체(globular) 도메인(GD)이다. 아이템 1-6에 제시된 범위는 HA의 아미노산 위치에 상응한다.1 shows diagrams of hemagglutinin (HA) protein and protein domains. I5 2 and 3 on the upper left side correspond to
도 2. pET32 플라스미드의 지도. 상부 좌측은 표적 항원을 클로닝하는데 이용되는 변형 플라스미드에 부족한 T7 프로모터 및 T7 터미네이트 사이의 부분을 나타낸다.2. Map of pET32 plasmid. The upper left shows the portion between the T7 promoter and the T7 terminator lacking in the modified plasmid used to clone the target antigen.
도 3. 변형된 pET32a 벡터내로 삽입된 pET-PR-LicKM-KDEL 및 pET-PR-LicKM-VAC 구조체의 도시.Figure 3. PET-PR-LicKM-KDEL and pET-PR-LicKM-VAC constructs inserted into modified pET32a vectors.
도 4. pBI121 벡터 조직의 도시.4. Illustration of pBI121 vector organization.
도 5. GUS 유전자 절단 및 TMV-유도된 플라스미드 추가후에 pBI 벡터로부터 pBID4 플라스미드 유도를 위한 도시.Figure 5 shows for pBID4 plasmid induction from pBI vectors after GUS gene cleavage and TMV-induced plasmid addition.
도 6. 벡터내로 삽입된 표적 서열 유무하에 리체나제(richenase) 서열에서 HA, HA의 도메인 및 NA의 융합 도시.Figure 6 Fusion diagram of HA, domain of HA and NA in the richenase sequence with and without the target sequence inserted into the vector.
도 7A, B. LicKM 및 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 리체나제 검사.7A, B. Reginase test of plant extracts expressing LicKM and fusion proteins.
(7A)는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 리체나제의 일과성 발현.(7A) is a transient expression of lychase inNicotiana benthamiana .
(7B)는 식물에서 리체나제 HA 융합 단백질의 자이모그램(Zymogram)(화살표).(7B) Zymogram (arrow) of lycase HA fusion protein in plants.
도 8. 항-HA 및 항-LiB 항체를 이용하여 Lic-HA 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 웨스턴 분석.8. Western analysis of plant extracts expressing Lic-HA fusion protein using anti-HA and anti-LiB antibodies.
도 9. Lic-NA 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 리체나제 검사.Reginase test of plant extracts expressing Lic-NA fusion protein.
도 10. Lic-HA 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 웨스턴 분석.10. Western analysis of plant extracts expressing Lic-HA fusion protein.
도 11. HA 리체나제 융합 단백질을 발현시킨 식물에서 적혈구 세포 헤마토글 루티닌 검사.Figure 11. Erythrocyte cell hematoglutinin assay in plants expressing HA reginase fusion protein.
도 12. 어쥬번트 유무하에 테스트용 H5N1 인플루엔자 백신으로 면역화시킨 생쥐에서 항체 반응.12. Antibody response in mice immunized with test H5N1 influenza vaccine with or without adjuvant.
도 13. 어쥬번트 유무하에 테스트용 H5N1 인플루엔자 백신으로 면역화시킨 생쥐로부터 수득한 혈청 희석물에 의한 헤마토글루티닌 활성 저해.Inhibition of hematoglutinin activity by serum dilutions obtained from mice immunized with test H5N1 influenza vaccine with or without adjuvant.
도 14A-D. H3N2 인플루엔자 테스트 백신 및 대조군 처리 집단에서 H3N2 바이러스 도전에 대한 증후. (14A)는 임상적인 증후 전반에 대한 평균 최대 결과. (14B) 바이러스 도전후에 비강 세척물에서 세포 카운트의 평균 최대 결과. (14C) 동물에서 체중 감소의 평균 최대 결과. (14D) 동물의 체온 변화의 평균 최대 결과.Figures 14A-D. Symptoms for H3N2 virus challenge in H3N2 influenza test vaccine and control treatment population. (14A) The mean maximum results for the overall clinical symptoms. (14B) Mean maximum results of cell counts in nasal lavage following virus challenge. (14C) Average maximum result of weight loss in animals. (14D) Average maximum result of body temperature changes in animals.
도 15. H3N2 인플루엔자 테스트 백신 및 대조군 처리군에서 H3N2 바이러스 도전후에 바이러스 쉐딩(shedding); Group 1은 네가티브 대조군의 결과를 나타낸다; Group 2는 테스트 물질 1 (CMB Fl)으로 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다; Group 3 은 테스트 물질 2 (CMB F2)로 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다; Group 4는 테스트 물질 3 (CMB F3)로 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다; 그리고 Group D는 포지티브 대조군 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다. N은 각 Group에서의 평가된 동물의 수를 말한다(그룹당 8마리).15. Virus shedding after H3N2 virus challenge in H3N2 influenza test vaccine and control treatment groups;
도 16. 식물에서 생산된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 항원의 특징. (16A) 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스의 정제된 HA에 대해 생성된 양 혈청을 이용한 LicKM-(SD) 및 LicKM-(GD)의 ELISA 분석. 상동성 바이러스 (AJ W/3/03) 및 식물에서 생산된 NA를 각각 포지티브 및 네가티브 대조군으로 이용한다. (16B) LicKM (anti-LicKM)에 대해 생성된 토끼 혈청 및 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 (anti- HA)의 정제된 HA에 대해 생성된 양 혈청을 이용하여 LicKM-HA(SD)의 이뮤노블랏 분석(lane 4) 및 LicKM-HA(GD)의 이뮤노블랏 분석 (lane 3). LicKM (lane 2) 및 상동성 바이러스 (lane 1)를 대조군으로 이용한다. (16C) NIBRG-18 재조합 바이러스에 대해 생성된 양 혈청(anti-H7N2) 및 NIBRG-17 재조합 바이러스에 대해 생성된 양 혈청 (anti-H7Nl)을 이용한 NA의 ELISA 분석. NIBRG-18 (anti-H7N2)에 대한 양 혈청을 이용하여 평가된 상동성 바이러스 (A/W/3/03)를 포지티브 대조군으로 이용한다. (16D) NIBRG-18 (anti- H7N2) 또는 NIBRG- 17 (anti-H7Nl)에 대하여 생성된 양 혈청으로 선 배양후에 뉴라미니다제 활성의 균주 특이적인 저해. 세가지 반복체로부터 평균 효소 활성을 표준 편차로 나타내었다.16. Characterization of influenza A / Wyoming / 3/03 virus antigens produced in plants. (16A) ELISA analysis of LicKM- (SD) and LicKM- (GD) using sheep serum generated against purified HA of influenza A / Wyoming / 3/03 virus. Homologous virus (AJ W / 3/03) and NA produced in plants are used as positive and negative controls, respectively. (16B) of LicKM-HA (SD) using rabbit serum generated against LicKM (anti-LicKM) and sheep serum generated against purified HA of influenza A / Wyoming / 3/03 virus (anti-HA) Immunoblot analysis (lane 4) and immunoblot analysis of LicKM-HA (GD) (lane 3). LicKM (lane 2) and homologous virus (lane 1) are used as controls. (16C) ELISA analysis of NA using sheep serum generated for NIBRG-18 recombinant virus (anti-H7N2) and sheep serum generated for NIBRG-17 recombinant virus (anti-H7N1). Homologous virus (A / W / 3/03) evaluated using sheep serum for NIBRG-18 (anti-H7N2) is used as a positive control. (16D) Strain specific inhibition of neuraminidase activity after preculture with sheep serum generated against NIBRG-18 (anti-H7N2) or NIBRG-17 (anti-H7Nl). Mean enzyme activity from the three repeats is shown as standard deviation.
도 17. VCl+ 어쥬번트, VC2 (어쥬번트 없이) 또는 VC2 + 어쥬번트로 면역화시킨 흰 족제비로부터 헤마토글루티닌 저해 역가. 혈청 샘플은 제1투여전에(Pre-imm), 제1투여후 14일에(Dl), 제2투여후 14일에(D2), 제3투여후 10일에(D3), 그리고 도전후 4일(Post-Ch)에 수득하였다. 표준 편차와 기하학적 평균 역가를 나타내었다.17. Hematoglutinin inhibition titers from ferrets immunized with VCl + adjuvant, VC2 (without adjuvant) or VC2 + adjuvant. Serum samples were pre-imm, 14 days post first dose (Dl), 14 days post second dose (D2), 10 days post third dose (D3), and 4 post challenge Obtained at Post-Ch. Standard deviations and geometric mean titers are shown.
도 18. VCl+ 어쥬번트, VC2 (어쥬번트 없이) 또는 VC2 + 어쥬번트로 면역화시킨 흰 족제비의 도전후 모니터링이다. 표준 편차와 평균치를 나타내었고, 멀티플 테스트용으로 Bonferroni 보정한 ANOVA를 이용하여 데이터의 통계학적 분석을 실시하였다. 통계학적 유의성은 p < 0.05으로 정의함. (18A) 감염후 바이러스 발산(shed) 피크. (18B) 감염후 체중 최대 체중 감소. (18C) 감염후 체온 상승 피크. (18D) 감염후 증후 수치 피크 (18E) 감염후 비강 세척 샘플의 ml당 전체 백혈구세포 카운트 피크.18. Post challenge challenge of ferrets immunized with VCl + adjuvant, VC2 (without adjuvant) or VC2 + adjuvant. Standard deviations and mean values were shown, and statistical analysis of the data was performed using Bonferroni-corrected ANOVA for multiple testing. Statistical significance is defined as p <0.05. (18A) Virus shed peak after infection. (18B) Maximum weight loss after infection. (18C) Peak in body temperature after infection. (18D) Post-infection symptom value peak (18E) Total leukocyte count peak per ml of nasal wash sample after infection.
실시예 1. 백신 후보물질 구조체 생성Example 1 Generation of Vaccine Candidate Constructs
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌으로부터 항원 서열 생성Antigen Sequence Generation from Influenza Virus Hemagglutinin
인플루엔자 바이러스 타입 Vietnam H5N1 및 Wyoming H3N2의 HA 스템(stem) 도메인 (SD) 1-2 및 HA 구형(globular) 도메인 (GD)3을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 합성하고, 이것이 정확하다는 것을 확인하였다. 생산된 핵산을 도메인을 인코드하는 서열의 양단부상에 조작하기 위한 부위인 제한효소 BglII/HindIII로 절단한다.Nucleotide sequences encoding the HA stem domains (SD) 1-2 and HA globular domain (GD) 3 of influenza virus types Vietnam H5N1 and Wyoming H3N2 were synthesized and confirmed to be correct. The produced nucleic acid is cleaved with restriction enzyme BglII / HindIII, which is a site for manipulation on both ends of the sequence encoding the domain.
생성된 DNA 단편은 조작된 열안정성 캐리어 분자를 인코드하는 서열에 in frame으로 융합시킨다.The resulting DNA fragment is fused in frame to the sequence encoding the engineered thermostable carrier molecule.
HA Vietnam TH5N 11HA Vietnam TH5N 11
(SD 도메인 1-2): HA1_2V: (SEQ TD NO.: 19):(SD domain 1-2): HA1_2V: (SEQ TD NO .: 19):
AGATCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAGATCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATAC
AATTATGGAGAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAAATTATGGAGAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACA
ACGGAAAGTTGGGAGGAGGAAACACTAAGTGCCAGACTCCAATGGGAGCTATTAACTCACGGAAAGTTGGGAGGAGGAAACACTAAGTGCCAGACTCCAATGGGAGCTATTAACTC
TTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGATTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGA
AGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCACAAAGAGAGAGGAGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCACAAAGAGAGAGGAGA
AGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAAGAGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAAG
GAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCTGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCT
GCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCTATGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCTAT
TATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGTTCAACAATCTTGAGATATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGTTCAACAATCTTGAGA
GGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTAGGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTA
CAACGCTGAGCTTCTTGTGCTTATGGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTACAACGCTGAGCTTCTTGTGCTTATGGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTA
ACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAGGAGCTACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAGGAGCT
TGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAGTCTGTTATGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAGTCTGTTA
GGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGACTTAAGAGGGAGGAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGACTTAAGAGGGAGGA
GATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTAAGCTTGATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTAAGCTT
(SD 도메인 1-2): HA1_2V: (SEQ ID NO.: 20):(SD domain 1-2): HA1_2V: (SEQ ID NO .: 20):
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLNTKCQTPMGAINSSMPFHNIH
PLTIGECPKYVKSINRLVLATGLRNSPQRERRRKKJLGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHPLTIGECPKYVKSINRLVLATGLRNSPQRERRRKKJLGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYH
HSNEQGSGYAADKESTQKA1DGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDHSNEQGSGYAADKESTQKA1DGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMED
GFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCD
NECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQINECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
(GD 도메인 3): HA3V: (SEQ ID NO.: 21):(GD domain 3): HA3V: (SEQ ID NO .: 21):
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GGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAGGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAA
AGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGAGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGG
GAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAGAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCA
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TCACCATCCAAATGATGCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATCACCATCCAAATGATGCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACA
TTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTA
AGGTGAACGGACAATCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATAGGTGAACGGACAATCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGAT
GCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGT
GAAGAAGGGAGATTCTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAAGCTTGAAGAAGGGAGATTCTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAAGCTT
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GATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAGAAGAACGTGACGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAGAAGAACGTGAC
TGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTGCGATCTTGTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTGCGATCTTG
ATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAACCATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAACC
CAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAACCAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAAC
CCAGTTAATGATCTTTGCTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGAGGAGCTTAAGCACCTCCAGTTAATGATCTTTGCTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGAGGAGCTTAAGCACCT
TCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCATCTTGGTCATCTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCATCTTGGTCATC
TCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTTTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTT
CAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTT
ACAACAACACTAACCAGGAGGATCTTCTTGTGCTTTGGGGAATTCACCATCCAAATGATACAACAACACTAACCAGGAGGATCTTCTTGTGCTTTGGGGAATTCACCATCCAAATGAT
GCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCGCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTC
TACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAAT
CTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAG
TCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGAGATTCTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGAGATTC
TACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAACTCCAATACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAACTCCAA
TGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTTGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGT
GCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCAGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCA
CAAAGAGAGAGGAGAAGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGCAAAGAGAGAGGAGAAGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTG
AGGGAGGATGGCAAGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCAAGGGAGGATGGCAAGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCA
GGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTAGGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTA
ACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAG
TTCAACAATCTTGAGAGGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTCAACAATCTTGAGAGGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCC
TTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGCTTCTTGTGTTGATGGAGAACGAGAGGACTCTTTTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGCTTCTTGTGTTGATGGAGAACGAGAGGACTCTT
GATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGAGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGA
TAACGCTAAGGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGTTAACGCTAAGGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGT
GCATGGAGTCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGAGCATGGAGTCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGA
CTTAAGAGGGAGGAGATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTCACTTAAGAGGGAGGAGATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTCA
CCATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTCCCATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC
HA A/Wvoming (Η3N2)HA A / Wvoming (Η3N2)
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CGCTGTTCCAAACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAACGCTGTTCCAAACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAA
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TGCATTACACCTAATGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGATTGCATTACACCTAATGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGAT
TACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAA
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GAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCATCAGAATTCTGGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCATCAGAATTCTG
AGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACAGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAAC
GGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGGGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGG
AGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAA
GATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATGATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTAT
TGATCTTACTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGTGATCTTACTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGG
AGAACGCTGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCAGAACGCTGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGC
TTGCATTGAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTGCATTGAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTC
TTAACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATTTTAACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATT
CTTAAGCTTCTTAAGCTT
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QKLPGNDNSTATLCLGHHA VPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGINSECITPNGSIPNQKLPGNDNSTATLCLGHHA VPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGINSECITPNGSIPN
DKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLAT GMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWY
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EDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKC
DNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
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CTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGACTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGA
AAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAGAAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAG
GAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAACTGGGCTGGGAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAACTGGGCTGG
AGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACAAGTCTTTCTTCTCAGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACAAGTCTTTCTTCTC
TAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTATGCCTAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTATGCC
AAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATTAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATT
CTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACTAAGAGGTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACTAAGAGGT
CTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGAGGGATATTTCTTCTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGAGGGATATTTCTTCT
AGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTCTTATTAACTCTACTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTCTTATTAACTCTACT
GGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGAAAGTCATCTATTATGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGAAAGTCATCTATTAT
GAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAAGCTTGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAAGCTT
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TCTTCTACTGGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCACTCTTCTACTGGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCAC
TCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGTCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGG
ATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATT
ACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTT
TCAACTGGGCTGGAGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACTCAACTGGGCTGGAGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAAC
AAGTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAAGTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTT
AACGTGACTATGCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCAAACGTGACTATGCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCA
CCCAGTTACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTCCCAGTTACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGT
GTCTACTAAGAGGTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGAGTCTACTAAGAGGTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGA
GGGATATTTCTTCTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTCGGGATATTTCTTCTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTC
TTATTAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGATTATTAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGA
AAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCATTACAAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCATTAC
TCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGATTACTTATGTCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGATTACTTATG
GAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATGAGGAAGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATGAGGAA
TGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATGTGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATG
GATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGGAACGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGGAAC
TGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGTTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGT
TGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCT
GAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATCGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATC
TTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGATTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGA
CTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCCTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGC
TGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGTGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTG
AGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTAACAACAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTAACAAC
AGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATTCTTCATCAAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATTCTTCATCA
TCACCACCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTCTCACCACCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC
인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제로부터 항원 서열의 생성Generation of Antigen Sequences from Influenza Virus Neuraminidase
인플루엔자 바이러스 type Vietnam H5N1 (NAV) 및 Wyoming H3N2(NAW)의 각 인플루엔자 바이러스 타입의 뉴라미니다제를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 합성하고 이것들이 정확하다는 것을 확인하였다. 생산된 핵산은 도메인을 인코드하는 서열의 양단 상에 조직된 부위가 되는 제한효소SalI으로 절단하였다. 생성된 DNA 단편들은 조작된 열안정성 캐리어 분자를 인코드하는 서열에 C 말단에 in frame 융합되었다.Nucleotide sequences encoding the neuraminidase of each influenza virus type of influenza virus type Vietnam H5N1 (NAV) and Wyoming H3N2 (NAW) were synthesized and confirmed to be correct. The produced nucleic acid wasdigested with restriction enzymeSalI , which is a site organized on both ends of the sequence encoding the domain. The resulting DNA fragments were fused in frame at the C terminus to sequences encoding engineered thermostable carrier molecules.
NAV(Nl): (SEQ ID NO.: 27):NAV (Nl): (SEQ ID NO .: 27):
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGTGGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGT
CTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACCTTATCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACCTTAT
GCTTCAGATTGGAAACATGATTTCTATTTGGGTGTCACACTCTATTCACACTGGAAACCAGCTTCAGATTGGAAACATGATTTCTATTTGGGTGTCACACTCTATTCACACTGGAAACCA
GCATCAGTCTGAGCCAATTTCTAACACTAACCTTTTGACTGAGAAGGCTGTGGCTTCTGTGCATCAGTCTGAGCCAATTTCTAACACTAACCTTTTGACTGAGAAGGCTGTGGCTTCTGT
TAAGTTGGCTGGAAACTCTTCTCTTTGCCCTATTAACGGATGGGCTGTGTACTCTAAGGATAAGTTGGCTGGAAACTCTTCTCTTTGCCCTATTAACGGATGGGCTGTGTACTCTAAGGA
TAACTCTATTAGGATTGGATCTAAGGGAGATGTGTTCGTGATTAGGGAGCCATTCATTTTAACTCTATTAGGATTGGATCTAAGGGAGATGTGTTCGTGATTAGGGAGCCATTCATTT
CTTGCTCTCACCTTGAGTGCCGTACTTTCTTCCTTACTCAGGGTGCTCTTCTTAACGATAACTTGCTCTCACCTTGAGTGCCGTACTTTCTTCCTTACTCAGGGTGCTCTTCTTAACGATAA
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TTGGAGAAGCTCCATCTCCATACAACTCTAGATTCGAGTCTGTTGCTTGGAGTGCTTCTGTTGGAGAAGCTCCATCTCCATACAACTCTAGATTCGAGTCTGTTGCTTGGAGTGCTTCTG
CTTGCCATGATGGAACTTCATGGCTTACTATTGGAATTTCTGGACCAGATAACGGAGCTCTTGCCATGATGGAACTTCATGGCTTACTATTGGAATTTCTGGACCAGATAACGGAGCT
GTTGCTGTGCTTAAGTACAACGGAATTATTACTGATACCATCAAGTCTTGGAGGAACAAGTTGCTGTGCTTAAGTACAACGGAATTATTACTGATACCATCAAGTCTTGGAGGAACAA
CATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGCTTGCGTTAACGGATCTTGCTTCACTGTGATCATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGCTTGCGTTAACGGATCTTGCTTCACTGTGAT
GACTGATGGACCATCTAATGGACAGGCTTCTCACAAGATTTTCAAGATGGAGAAGGGAGACTGATGGACCATCTAATGGACAGGCTTCTCACAAGATTTTCAAGATGGAGAAGGGA
AAGGTTGTGAAGTCTGTGGAACTTGATGCTCCAAACTACCATTACGAGGAGTGTTCTTGAAGGTTGTGAAGTCTGTGGAACTTGATGCTCCAAACTACCATTACGAGGAGTGTTCTTG
CTATCCAGATGCTGGAGAGATTACTTGTGTGTGCCGTGATAATTGGCATGGATCTAACACTATCCAGATGCTGGAGAGATTACTTGTGTGTGCCGTGATAATTGGCATGGATCTAACA
GGCCATGGGTGTCATTCAATCAGAACCTTGAGTACCAGATTGGTTACATTTGCTCTGGAGGCCATGGGTGTCATTCAATCAGAACCTTGAGTACCAGATTGGTTACATTTGCTCTGGA
GTGTTCGGAGATAATCCAAGGCCAAACGATGGAACTGGATCTTGTGGACCAGTGTCATCGTGTTCGGAGATAATCCAAGGCCAAACGATGGAACTGGATCTTGTGGACCAGTGTCATC
TAATGGAGCTGGAGGAGTGAAGGGATTCTCTTTCAAGTACGGAAACGGAGTTTGGATTGTAATGGAGCTGGAGGAGTGAAGGGATTCTCTTTCAAGTACGGAAACGGAGTTTGGATTG
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CTGGATCTTCTATTTCTTTCTGCGGAGTGAATTCTGATACTGTGGGATGGTCTTGGCCAGCTGGATCTTCTATTTCTTTCTGCGGAGTGAATTCTGATACTGTGGGATGGTCTTGGCCAG
ATGGAGCTGAGCTTCCATTCACTATTGATAAGGTCGACCATCATCATCATCACCACAAGATGGAGCTGAGCTTCCATTCACTATTGATAAGGTCGACCATCATCATCATCACCACAAG
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LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKD
NSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEANSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEA
PSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES
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NAW(N2): (SEQ ID NO.: 28):NAW (N2): (SEQ ID NO .: 28):
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGTGGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGT
CTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACAAGCACTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACAAGCA
GTACGAGTTCAACTCTCCACCAAACAACCAGGTTATGCTTTGCGAGCCAACTATTATTGGTACGAGTTCAACTCTCCACCAAACAACCAGGTTATGCTTTGCGAGCCAACTATTATTG
AGAGGAACATTACTGAGATTGTGTACCTTACTAACACTACTATTGAGAAGGAGATTTGCAGAGGAACATTACTGAGATTGTGTACCTTACTAACACTACTATTGAGAAGGAGATTTGC
CCAAAGTTGGCTGAGTACCGTAATTGGTCTAAGCCACAGTGCAACATTACTGGATTCGCCCAAAGTTGGCTGAGTACCGTAATTGGTCTAAGCCACAGTGCAACATTACTGGATTCGC
TCCATTCTCTAAGGATAACTCAATTAGGCTTTCTGCTGGAGGAGATATTTGGGTTACAATCCATTCTCTAAGGATAACTCAATTAGGCTTTCTGCTGGAGGAGATATTTGGGTTACAA
GGGAGCCATACGTTTCTTGCGATCCAGATAAGTGCTACCAGTTCGCTCTTGGACAAGGAGGGAGCCATACGTTTCTTGCGATCCAGATAAGTGCTACCAGTTCGCTCTTGGACAAGGA
ACTACTCTTAACAACGTGCACTCTAACGATACTGTGCACGATAGGACTCCATACCGTACACTACTCTTAACAACGTGCACTCTAACGATACTGTGCACGATAGGACTCCATACCGTAC
TCTTTTGATGAACGAGCTTGGAGTTCCATTCCACCTTGGAACTAAGCAAGTGTGCATTGCTCTTTTGATGAACGAGCTTGGAGTTCCATTCCACCTTGGAACTAAGCAAGTGTGCATTGC
TTGGTCATCTTCATCTTGCCACGATGGAAAGGCTTGGCTTCATGTTTGCGTGACTGGAGATTGGTCATCTTCATCTTGCCACGATGGAAAGGCTTGGCTTCATGTTTGCGTGACTGGAGA
TGATGAGAACGCTACTGCTTCTTTCATCTACAACGGAAGGCTTGTGGATTCTATTGTTTCTGATGAGAACGCTACTGCTTCTTTCATCTACAACGGAAGGCTTGTGGATTCTATTGTTTC
TTGGTCTAAGAAGATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGTGTGCATTAACGGAACTTTTGGTCTAAGAAGATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGTGTGCATTAACGGAACTT
GCACTGTGGTTATGACTGATGGATCTGCTTCTGGAAAGGCTGATACAAAGATTCTTTTCGCACTGTGGTTATGACTGATGGATCTGCTTCTGGAAAGGCTGATACAAAGATTCTTTTC
ATTGAGGAGGGAAAGATTGTGCACACTTCTACTCTTTCTGGATCTGCTCAGCATGTTGAATTGAGGAGGGAAAGATTGTGCACACTTCTACTCTTTCTGGATCTGCTCAGCATGTTGA
GGAGTGTTCTTGCTACCCAAGGTATCCAGGAGTTAGATGTGTGTGCCGTGATAACTGGAGGAGTGTTCTTGCTACCCAAGGTATCCAGGAGTTAGATGTGTGTGCCGTGATAACTGGA
AGGGATCTAACAGGCCAATTGTGGATATTAACATTAAGGATTACTCTATTGTGTCATCTTAGGGATCTAACAGGCCAATTGTGGATATTAACATTAAGGATTACTCTATTGTGTCATCTT
ATGTGTGCTCTGGACTTGTTGGAGATACTCCAAGGAAGAACGATTCTTCTTCATCTTCACATGTGTGCTCTGGACTTGTTGGAGATACTCCAAGGAAGAACGATTCTTCTTCATCTTCAC
ACTGCCTTGATCCAAATAACGAGGAGGGAGGACATGGAGTTAAGGGATGGGCTTTCGAACTGCCTTGATCCAAATAACGAGGAGGGAGGACATGGAGTTAAGGGATGGGCTTTCGA
TGATGGAAACGATGTTTGGATGGGAAGGACTATTTCTGAGAAGTTGAGGAGCGGATACTGATGGAAACGATGTTTGGATGGGAAGGACTATTTCTGAGAAGTTGAGGAGCGGATAC
GAGACTTTCAAAGTGATTGAGGGATGGTCTAACCCAAATTCTAAGCTGCAGATTAACAGGAGACTTTCAAAGTGATTGAGGGATGGTCTAACCCAAATTCTAAGCTGCAGATTAACAG
GCAAGTGATTGTGGATAGGGGAAACAGGAGTGGATACTCTGGAATTTTCTCTGTGGAGGGCAAGTGATTGTGGATAGGGGAAACAGGAGTGGATACTCTGGAATTTTCTCTGTGGAGG
GAAAGTCTTGCATTAACAGATGCTTCTACGTGGAGCTTATTAGGGGAAGGAAGCAGGAGAAAGTCTTGCATTAACAGATGCTTCTACGTGGAGCTTATTAGGGGAAGGAAGCAGGA
GACTGAGGTTTTGTGGACTTCTAACTCTATTGTGGTGTTCTGCGGAACTTCTGGAACTTAGACTGAGGTTTTGTGGACTTCTAACTCTATTGTGGTGTTCTGCGGAACTTCTGGAACTTA
CGGAACTGGATCTTGGCCAGATGGAGCTGATATTAACCTTATGCCAATTGTCGACCATCCGGAACTGGATCTTGGCCAGATGGAGCTGATATTAACCTTATGCCAATTGTCGACCATC
ATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGACTCGAGATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGACTCGAG
NAW: (SEQ ID NO.: 18):NAW: (SEQ ID NO .: 18):
KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFS
KDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMN
ELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKIELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKI
LRTQESECVCINGTCTWMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPLRTQESECVCINGTCTWMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYP
GVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGH
GVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYS
GIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPlGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPl
열안정성 캐리어 구조체 생성Thermally stable carrier structure creation
전장의 고유 C.thermocellum 리체나제, LicB는 리더 펩티드 펩티드 (Lp)5 N-말단 부분(A), 표면 루프(l), C-말단 부분(C), Pro-Thr 박스 및 셀룰로좀-결합 도메인 (C-BD)으로 구성된다. 우리는 LicB 인코딩 유전자로부터 Lp, Pro-Thr 박스 및 C-BD을 제거하고 분자를 고리모양으로 순서를 교환하여, N- 과 C- 말단을 바꾸고(Musiychuk et ai, 2007, influenza and Other Respiratory viruses, 1 :1), N- 및 C-말단에 뿐만 아니라 표면 루프(l)내에 표적 서열을 클로닝하기 위한 독특한 제한효소 부위를 삽입하였다. 생성된 조작된 캐리어 분자 서열을 확인하고, 이를 LicKM으로 명명하였다.Full-length native C.thermocellum reginase, LicB, is a leader peptide peptide (Lp) 5 N-terminal part (A), surface loop (l), C-terminal part (C), Pro-Thr box and cellulosome-binding It consists of a domain (C-BD). We remove Lp, Pro-Thr boxes and C-BD from LicB encoding genes and reverse the order of the molecules in a ring, altering the N- and C-terminus (Musiychuk et ai, 2007, influenza and Other Respiratory viruses, 1: 1), a unique restriction site was inserted at the N- and C-terminus as well as for cloning the target sequence in the surface loop (l). The resulting engineered carrier molecule sequence was identified and named LicKM.
SEQ ID NO.: 29:SEQ ID NO .: 29:
GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAGGATCCTTAATTAAAATG GGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTA
AGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGA
ATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATT
GATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGG
TGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATAC
TTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTA
TAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGTAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAG
GAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAG
TATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTT GTTGTTAATAC
TCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGC
TAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAATAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAA
GATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATTGACTCGAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATTGACTCGA
GCTCGCTC
SEQ ID NO.:30:SEQ ID NO.:30:
MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKMGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGK
DTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNI
PVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFS
NFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHHNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHH
특정 구조체의 경우, LicKM의 N- 및 C- 말단에 PRla 시그날 펩티드 및 KDEL 서열을 만들었다. 이들 구조체의 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO.: 31 및 SEQ ID NO.: 32에 나타내었다.For certain constructs, PRla signal peptide and KDEL sequences were made at the N- and C-terminus of LicKM. Nucleic acid and amino acid sequences of these constructs are shown in SEQ ID NO .: 31 and SEQ ID NO .: 32.
SEQ ID NO.: 31 :SEQ ID NO .: 31:
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCTGGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCT
CTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAAAATGGAGGTTCTTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAAAATGGAGGTTCTT
ATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAG
TTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGAC
CATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACT
AAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCT
TGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATAT
TGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTC
CTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGACTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGA
TATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGG
TAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGAT
TCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAG
CCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTC
GACCATCATCATCATCATCATAAGGATGAACTTTGACTCGAGCTCGACCATCATCATCATCATCATAAGGATGAACTTTGACTCGAGCTC
SEQ ID NO.: 32:SEQ ID NO .: 32:
MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAMGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAA
KNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQD
FHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQ
AEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSN
GKMILTLDREYVDHHHHHHKDELGKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL
재조합 항원 구조체의 생성Generation of Recombinant Antigen Constructs
pBR322 플라스미드로부터 유도된 pET 발현 벡터를 이용하는데 이는 높은 수준의 전사 및 해독을 촉진시키는 T7 박테리오파아지 유전자 10의 특징을 가지도록 조작한 것이다. RNA 폴리메라제를 인코드하는 박테리오파아지는 T7 프로모터 서열에 매우 특이성을 가지며 이는 T7 파아지 게놈이외의 게놈에서는 거의 볼 수 없다(도 2). pET-32를 이용하여 이 벡터에 클론된 변형된 리체나제 서열의 루프 부분으로 HA 및 NA 구조체를 융합시킨다. 리체나제 유전자의 촉매 도메인, 상류 서열 PR-IA ("병인균-관련 단백질 1 A"), 엔도플라스믹 레티큘럼(KDEL) 또는 액포 보유 서열(vacuolar retaining sequence)(VAC), 하류 His6 태그를 변형된 pET-32 벡터의PacI 및XhoI 부위(T7 프로모터 및 T7 종료물질이 잘려나간 위치)로 클론하였다. 이와 같은 방식으로, pET-PR-LicKM-KDEL 및 pET-PR-LicKM-VAC을 수득하였다(도 3).A pET expression vector derived from the pBR322 plasmid is used, which has been engineered to have the characteristics of the
HA 도메인 또는 NA의 DNA 단편을 LicKM의 루프(l) 부분에 서브클론시켜 해동을 위한 정확한 리딩 프레임내에 융합한다. LicKM-NA 융합체가 작제된다. NAW 또는 NAV의 DNA 단편은 해독을 위한 정확한 frame에 융합체를 제공하기 위해SalI 부위를 이용하여 LicKM의 C-말단으로 서브클론시킨다.DNA fragments of the HA domain or NA are subcloned into the loop (l) portion of LicKM and fused in the correct reading frame for thawing. LicKM-NA fusions are constructed. DNA fragments of NAW or NAV are subcloned to the C-terminus of LicKM using theSal I site to provide a fusion to the correct frame for translation.
실시예 2. 백신 후보물질 항원 벡터의 생성Example 2 Generation of Vaccine Candidate Antigen Vectors
표적 항원 구조체 LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), 또는 LicKM-NA는 개별적으로 선택된 바이러스성 벡터 (pBI-D4)에 서브클론시켰다. pBl-D4는pBl121-유도된 이 중(binary) 벡터인데 이 벡터는 대장균(Escherichia coli) β-D-글루쿠로니다제(GUS)를 코딩하는 리포터 유전자가 폴리링커("polylinker")로 대체되었는데, 여기에XbaI과SacI 부위사이에 TMV-유도된 벡터가 클론되었다(도 4). pBI-D4는 TMV -기초한 구조체로, 발현되는 외부 유전자(가령, LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), LicKM-NA와 같은 표적 항원)를 TMV의 피복 단백질 (CP) 유전자로 대체한다. 바이러스는 TMV 126/183kDa 유전자, 이동 단백질 (MP) 유전자, CP 오픈 리딩 프레임(ORF)로 뻗어있는 CP 서브게놈 mRNA 프로모터(sgp)를 보유한다. CP의 개시 코돈을 변형켰다. 바이러스는 CP가 결핍되어 체관부(phloem)를 통하여 숙주 식물로 이동할 수 없다. 그러나, 바이러스 감염의 세포가 이동은 기능을 유지하며, 바이러스는 이와 같은 방법으로 상측 잎으로 서서히 이동할 수 있다. 다중 클로닝 부위(Pacl-Pmel-Agel-Xhol)를 외부 유전자 발현을 위해 sgp의 말단에 만들고, 그 다음에 이어서 TMV 3' 비-해독 부위(NTR)가 이어진다. 35S 프로모터를 바이러스 서열의 5'말단에서 융합한다. 벡터 서열은 pBI121의BamHI과SacI 부위에 위치한다. 바이러스 서열의 3'에는 망치머리 리보자임이 위치한다(Chen et al, 2003, MoI. Breed., 11 :287). 이와 같은 구조체에는 LicKM-HA-SD, LicKM-HA(GD), 또는 NA를 인코드하는 서열과 시그날 펩티드 from 담배 PR-la 단백질, a 6x His tag, ER-체류 고정 서열 KDEL의 시그날 펩티드를 인코드하는 서열 또는 공포(vacuolar) 서열 융합된 서열을 포함한다(도 5). PR-LicKM-HA(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KDEL, PR-LicKM-NA-KDEL를 인코드하는 구조체를 위해, 코딩 DNA를PacI-XhoI 단편으로 pBI-D4안으로 도입시킨다. 또한, HAW (HA Wyoming), HAV (HA Vietnam), NAW (NA Wyoming), NAV (NA Vietnam)를PacI-XhoI 단편으로써 pBI-D4안으로 도입시킨다. 뉴클레오티드 서열이 최종 발현 구조체의 서브클로닝 졍션으로 연결되어 있다는 것을 확인하였다(도 6).Target antigen constructs LicKM-HA (SD), LicKM-HA (GD), or LicKM-NA were subcloned into individually selected viral vectors (pBI-D4). pBl-D4 is apBl 121-derived binary vector, a reporter gene encodingEscherichia coli β-D-glucuronidase (GUS) that is a polylinker (“polylinker”). Replaced, where a TMV-derived vector was cloned between theXba I andSac I sites (FIG. 4). pBI-D4 is a TMV-based construct that replaces expressed external genes (eg, target antigens such as LicKM-HA (SD), LicKM-HA (GD), LicKM-NA) with the coat protein (CP) gene of TMV do. The virus has a CP subgenomic mRNA promoter (sgp) that extends into the TMV 126 / 183kDa gene, transfer protein (MP) gene, CP open reading frame (ORF). The start codon of CP was modified. The virus is deficient in CP and cannot migrate through the phloem to the host plant. However, the migration of the cells of the virus infection remains functional, and the virus can migrate slowly to the upper leaves in this way. Multiple cloning sites (Pacl-Pmel-Agel-Xhol) are made at the ends of sgp for external gene expression, followed by the
실시예 3: 식물 생성 및 항원 생산Example 3: Plant Production and Antigen Production
식물에 아그로박테리움의 침투Penetration of Agrobacterium on Plants
아그로박테리움 침투에 의해 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 일과성 발현 시스템을 얻었다(Turpen et aL, 1993, J. Virol. Methods, 42:227).N. benthamiana의 건강한 잎에 LicKM-HA 또는 LicKM-NA를 발현시키도록 조작된 바이러스 벡터를 포함하는A. rhizogenes 또는A. tumefaciens(GV3101)를 침투시켰다.Agrobacterium infiltration resulted in anAgrobacterium -mediated transient expression system (Turpen et aL, 1993, J. Virol. Methods, 42: 227). Healthy leaves ofN. benthamiana were infiltrated withA. rhizogenes orA. tumefaciens (GV3101) containing viral vectors engineered to express LicKM-HA or LicKM-NA.
A. rhizogenes 균주 A4 (ATCC 43057)를 구조체 pBI-D4- PR-LicKM-HA(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KJDEL, pBI-D4-PR-LicKM-NA-KDEL를 이용하여 형질변환시켰다. 아그로박테리움 배양물을 Kapila et al.(1997, Plant Sci., 122:101)에서 설명하는 것에 따라 생장시키고 유도시켰다. 2㎖ 스타터-배양물(새로운 콜로니로부터 취함)을 YEB (5g/ℓ 소고기 추출물, 1g/ℓ 이스트 추출물, 5g/ℓ 펩톤, 5g/ℓ 슈크로즈, 2mM MgSO4, 25㎍/㎖ 카나마이신)에서 280℃ 하룻밤동안 생장시켰다. 스타터 배양물은 1:500으로 500㎖ YEB+ 25㎍/㎖ 카나마이신, 10mM 2-4(-몰포리노)에탄설폰산(MES) pH 5.6, 2mM 추가 MgSO4, 20μM 아세토시리곤에 희석하여 넣는다. 희석된 배양물을 280℃에서 O.D.600 값이 ~1.7이 되도록 하룻밤동안 생장시켰다. 세포는 15 분간 3,000 x g에서 원심분리시키고, (MS염, 10 mM MES pH 5.6, 20 g/ℓ 슈크로즈, 200μM 아세토시리곤)에 재현탁시켜, O.D.600 값이 ~2.4가 되도록 한 후에 실혼에서 1-3시간 동안 유지시키고, 이를 아그로박테리움 침투에 이용하였다.N. benthamiana 잎들에 바늘없는 일회용 주사기를 이용하여 아그로박테리움 현탁액을 주사하였다. 침투된 잎들은 침투후 4-7일(예를 들면 6일)에 수확한다.A. rhizogenes strain A4 (ATCC 43057) using constructs pBI-D4-PR-LicKM-HA (SD) -KDEL, PR-LicKM-HA (GD) -KJDEL, pBI-D4-PR-LicKM-NA-KDEL By transformation. Agrobacterium cultures were grown and induced as described in Kapila et al. (1997, Plant Sci., 122: 101). 2 ml starter-culture (taken from fresh colony) was 280 in YEB (5 g / l beef extract, 1 g / l yeast extract, 5 g / l peptone, 5 g / l sucrose, 2 mM MgSO4 , 25 μg / ml kanamycin) C overnight was grown. Starter cultures are diluted 1: 500 in 500 ml YEB + 25 μg / ml kanamycin, 10 mM 2-4 (-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) pH 5.6, 2 mM additional MgSO4 , 20 μM acetosirigon. Diluted cultures were grown overnight at 280 ° C. to an OD600 value of ˜1.7. Cells were centrifuged at 3,000 × g for 15 minutes and resuspended in (MS salt, 10 mM MES pH 5.6, 20 g / L sucrose, 200 μM acetosyringone) to bring the OD600 value to ˜2.4 and then at room temperature. It was maintained for 1-3 hours and used for Agrobacterium infiltration.N. benthamiana leaves were injected with an Agrobacterium suspension using a needleless disposable syringe. Infiltrated leaves are harvested 4-7 days (
식물은 리체나제 활성 검사 및 면역블랏 분석 평가를 통하여 표적 항원 발현이 되었는지를 스크리닝하였다(도 7, 8, 9, 10). 효소도(Zymogram) 분석에서 테스트된 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 침투 잎에 HA 및 NA 키메라 단백질이 모두 발현된 것으로 나타났다. 발현은 리체나제 활성과 연관된다(도 7 및 9). 융합 단백질과 연관된 활성 밴드에서 리체나제 대조군보다 조금 더 무거운 밴드와 아그로박테리움 감염 후에 식물에서 발현되는 산물과 동일한 무게를 가지는 밴드가 나타났는데, 이는 전체 융합 산물의 존재를 확인시켜주는 것이다.Plants were screened for target antigen expression through reginase activity assay and immunoblot assay evaluation (FIGS. 7, 8, 9, 10). Zymogram analysis showed that both the HA and NA chimeric proteins were expressed inNicotiana benthamiana infiltrated leaves. Expression is associated with lysinase activity (FIGS. 7 and 9). In the active band associated with the fusion protein, a band heavier than the lysinase control and a band having the same weight as the product expressed in the plant after Agrobacterium infection appeared, confirming the presence of the entire fusion product.
클론 뿌리 및 클론 뿌리 라인 생성Generate clone roots and clone root lines
니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 외식편 1㎝X1㎝를 0.1% NH4Cl에 살균 및 dH2O에 6회 세척후에 얻었다. 외식편에 abacsial 측면에 나이프를 이용하여 약간의 상처를 낸 후, 아그로박테리움 리조겐(Agrobacterium rhizogenes), 균주 A4,-pBlD4-Lic-HA-KDEL 또는 pBID4-Lic-NA-KDEL을 포함하고 있음-와 공동 배양시켰다.외식편을 2'동안 아그로박테리움 하룻밤 배양물(O.D.600nm?? 0.8-1)으로 배양하고, 3000 rpm, 4℃에서 원심분리시키고, MMA 배지로 재현탁시켜, 20mM 아세토시리곤 존재하에 최종 O.D.600nm이 ~0.5가 되도록 한다. 배양 종료시에, 외식물은 멸균 종이 상에서 건조시키고, 1% 글루코즈 및 20mM 아세토시리곤 존재하에 0.8% 한천 MS 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 파라필름으로 마감하고, 실온에서 2일간 유지시켰다. 외식편을 500㎎/ℓ 세포탁심(Cif), 100mg/ℓ 티멘틴(Timentin)(Tim), 25mg/ℓ 카나마이신 존재하에 MS 플레이트로 옮겼다. 약 5주후에, 유전자 전이 뿌리가 pBID4-Lic-HA-KDEL 및 pBID4-Lic-NA-KDEL 구조체를 포함하는 아그로박테리움 리조겐(Agrobacterium rhizogenes)으로 형질변환된 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎 외식편으로부터 생성된다.
형질변환후에, 모근을 잘라내고, 고형의 호르몬없는 K3 배지에 일렬로 둔다. 4 내지 6일 후에, 가장 활발하게 생장된 뿌리를 분리해내고, 액상 K3 배지로 옮긴다. 선택된 뿌리는 24℃ 암상태에서 회전 쉐이크 상에서 배양시키고, 클론 라인은 분리하여 주단위로 서브배양시킨다. 뿌리 및/클론 라인을 리체나제 활성 검사 및 면역 블랏 분석을 통하여 표적 항원 발현이 있었는지에 대해 스크리닝할 수 있다.After transformation, the hair roots are cut and lined in solid hormone free K3 medium. After 4-6 days, the most actively growing roots are separated and transferred to liquid K3 medium. Selected roots are incubated on a rotary shake in 24 ° C. dark, and clone lines are separated and subcultured weekly. Roots and / clone lines can be screened for target antigen expression via reginase activity tests and immunoblot analysis.
실시예 4: 백신 후보물질의 생산Example 4: Production of Vaccine Candidates
100mg 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 침투된 잎 샘플을 감염후 4, 5, 6, 7일에 회수하였다. 단백질 발현에 대해 수확 후 바로 새로운 조직을 분석하였고, 연속하여 정제되지 않은 식물 추출물 준비 또는 융합 단백질 정제를 위해 -80℃에서 수집하였다.100 mgNicotiana benthamiana infiltrated leaf samples were recovered 4, 5, 6 and 7 days after infection. New tissues were analyzed immediately after harvest for protein expression and collected at −80 ° C. for preparation of unpurified plant extracts or purification of fusion proteins.
새로운 샘플을 냉각 PBS 1x + 프로테아제 저해물질(Roche) 1/3 w/v 용적비(1㎖/ 0.3 g 조직)에 재현탁시키고, 페스텔(pestel)로 빻는다. 균질물은 SDS 겔 로딩 완충액으로 5분간 가열하고, 12,000rpm, 4℃에서 5분간 웜심분리하여 맑게 한다. 상청액을 새로운 튜브에 옮기고, 20㎕, 1㎕ 또는 이들의 희석액을 12% SDS-PAGE상에서 분리하고, 항-His6-HA 생쥐 또는 토끼 항-리체나제 다클론 항체를 이용하여 웨스턴 분석을 통하여 분석하거나 또는 효소도 분석에 의해 기능을 가진 리체나제 활성을 나타내는 효소 활성을 평가한다. 효소도는 효소 활성을 측정하여 전기영동(electrophoretic) 방법이다. 이 방법은 배양 기간 동안에 용해된 효소에 의해 분해되는 기질로 충만된 도데실 설페이트 나트륨 겔에 기초한다. 겔의 착색으로 어두운 적색 배경에 효소 활성은 흰색 밴드로 나타난다. 특정 범위 내에, 밴드 강도는 적하된 효소 양과 1차원적인 관계에 있을 것이다.Fresh samples are resuspended in
플라스미드 pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL 또는 pBID4-LicKM-HA(GD)-KDELHA를 포함하는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacteriumtumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조겐(rhizogenes)으로 침투된 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물에서 발현은 융합 단백질에서 HA 단백질의 전기영동성 이동이 이론상 MW에 상응하는 경우에 키메라 단백질 LicKM-HA(SD)-KDEL 또는 LicKM-HA(GD)-KDEL의 분자량에 특정 결합이 상응하게 된다. (리체나제 효소 MW는 약 28kD이다).Agrobacterium tumerfeces (Agrobacterium ) comprising plasmid pBID4-LicKM-HA (SD) -KDEL or pBID4-LicKM-HA (GD) -KDELHA expression inNicotiana benthamiana plants infiltrated withtumefaciens or with Agrobacteriumrhizogenes indicates that the chimeric protein LicKM-HA ( The specific binding corresponds to the molecular weight of SD) -KDEL or LicKM-HA (GD) -KDEL. (Richase enzyme MW is about 28 kD).
정제안된 추출물에서 발현되는 키메라 단백질 Lic-HA-KDEL 및 Lic-NA-KDEL의 정량화는 수작업으로 침투된 조직 및 진공-침투된 조직상에 면역 블랏팅으로 할 수 있다.Quantification of the chimeric proteins Lic-HA-KDEL and Lic-NA-KDEL expressed in unpurified extracts can be by immunoblotting on manually infiltrated and vacuum-infiltrated tissues.
항원의 정제Purification of Antigens
pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL, pBID4-LicKM-HA(GD)-KDEL, pBID4-full-length-NA-KDEL 구조체를 포함하는 재조합 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)로 침투된 식물의 잎은 균질화과정을 통하여 빻는다. "EDTA-없는" 프로테아제 저해물질(Roche)을 포함하는 추출 완충액과 X-100 1%를 3용적비 w/v로 이용하여 30분간 4℃에서 흔든다. 추출물은 10분간 4℃에서 9000 x g에서 원심분리시켰다. 상청액을 연속하여 miracloth로 여과시키고, 20.000 x g에서 30분간 원심분리시키고, 0.45-μm 필터를 통하여 여과시킨 후에 크로마토그래피를 이용하여 정제시킨다.pBID4-LicKM-HA (SD) -KDEL, pBID4-LicKM-HA (GD) -KDEL, pBID4-full-length-NA-KDEL recombinant Agrobacterium comprising a structure Solarium tube meope syeonseu(Agrobacterium tumefaciens) the penetration of the plant Leaves are ground through a homogenization process. Extraction buffer containing "EDTA-free" protease inhibitor (Roche) and X-100 1% were shaken at 4 ° C. for 30 min using 3 volume ratio w / v. The extract was centrifuged at 9000 × g at 4 ° C. for 10 minutes. The supernatant is successively filtered with miracloth, centrifuged at 20.000 xg for 30 minutes, filtered through a 0.45-μm filter and purified by chromatography.
생성된 추출물은 암모니움 설페이트 침전을 이용하여 절단한다. 간단하게 설명하면, (NH4)2SO4를 추출물에 첨가하여 20% 포화되도록 하고, 얼음위에서 1시간 동안 두고, 15분간 18,000 x g에서 회전시킨다. 펠렛은 버리고, (NH4)2SO4를 첨가하여 60% 포화되도록 하고, 얼음위에서 1시간 동안 두고, 15분간 18,000 x g에서 회전시킨다. 상청액을 버리고, 생성된 펠렛은 완충액에 재현탁시키고, 얼음위에서 20분간 유지시키고, 30분간 18,000 x g에서 원심분리시키고, 상청액은 10000 용적의 세척 완충액에 대해 하룻밤동안 투석시켰다:The resulting extract is cleaved using ammonium sulfate precipitation. In brief, (NH4 )2 SO4 is added to the extract to allow 20% saturation, left on ice for 1 hour, and spun at 18,000 xg for 15 minutes. Discard the pellet, add (NH4 )2 SO4 to 60% saturation, leave on ice for 1 hour and spin at 18,000 xg for 15 minutes. The supernatant was discarded and the resulting pellet was resuspended in buffer, held for 20 minutes on ice, centrifuged at 18,000 xg for 30 minutes, and the supernatant was dialyzed overnight against 10000 volumes of wash buffer:
중력하에 실온에서 IMAC ("Immobilized Metal Affinity Chromatography," GE Healthcare)를 이용하여, His-tagged LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL, 전장 -NA-KDEL 키메라 단백질을 정제하였다. 정제는 변성 조건하에서 실시하였다. 단백질을 0.5㎖ 분획물로 회수하고, 단일화시키고, PBS 1X에 대해 하룻밤동안 4℃에서 투석된 20mM EDTA5를 첨가하고, SDS-PAGE로 분석하였다.Purification of His-tagged LicKM-HA (SD) -KDEL, LicKM-HA (GD) -KDEL, full-length-NA-KDEL chimeric protein using IMAC (“Immobilized Metal Affinity Chromatography,” GE Healthcare) at room temperature under gravity It was. Purification was carried out under denaturing conditions. Proteins were recovered in 0.5 mL fractions, singulated and 20 mM EDTA5 dialyzed overnight at 4 ° C. against
대안으로, 분획물을 첨가된 20mM EDTA와 함께 수거하고, 하룻밤동안 4℃에서 NaH2PO4 10 mM에 대해 투석시키고, 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여 정제시킨다. LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL, 전장-NA-KDEL 정제의 경우, 음이온 교환 컬럼 Q Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biosciences)를 이용한다. LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL, 전장-NA-KDEL 친화력 또는 이온-교환 정제된 키메라 단백질은 12% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하고, 코마시 블루 착색시켰다. 분리된 단백질은 다클론 항-리체나제 항체와 연속하여 항-토끼 IgG 양고추냉이 과산화효소-컨쥬게이트된 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 위해, PDVF 막으로 전기영동에 의해 이동시킨다.Alternatively, fractions are collected with added 20 mM EDTA, dialyzed overnight at 4 ° C. against NaH2 PO4 10 mM and purified via anion exchange chromatography. For LicKM-HA (SD) -KDEL, LicKM-HA (GD) -KDEL, full length-NA-KDEL purification, an anion exchange column Q Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biosciences) is used. LicKM-HA (SD) -KDEL, LicKM-HA (GD) -KDEL, full-length-NA-KDEL affinity or ion-exchange purified chimeric protein was isolated on 12% polyacrylamide gel and stained blue with Coomassie. The isolated protein is transferred by electrophoresis to the PDVF membrane for Western blot using anti-rabbit IgG horseradish peroxidase-conjugated antibody in series with polyclonal anti-richase antibody.
투석후에 수집된 분획물은 pAb α-리체나제 및 pAb α-His6.을 이용한 이뮤노블랏을 이용하여 분석하였다. His-tag는 발현된 키메라 단백질에 의해 유지되었고, 정제된 단백질의 최종 농도는 소프트웨어를 이용하여 평가하였다.Fractions collected after dialysis were analyzed using immunoblots using pAb α-lysinase and pAb α-His6 . His-tag was maintained by the expressed chimeric protein and the final concentration of purified protein was assessed using software.
헤마토글루티닌화 반응 검사Hematoglutinination Test
두 가지 상이한 원료로부터 적혈구세포(RBC)의 세종을 이용하여 식물에서 만들어진 인플루엔자 벡산에 헤마토글루티닌 활성을 설명한다. 검사된 백신 재료를 인플루엔자 A/Wyoming/03/03 (H3N2 바이러스) 또는 인플루엔자 A/Vietnam/ 1194/2004(H5N1 바이러스)의 "도메인 3" (구형 도메인)으로 명명한다.Hematoglutinin activity is described for influenza bexic acid produced in plants using three kinds of red blood cells (RBCs) from two different sources. The vaccine material tested is named "
닭, 칠면조 및 말에서 얻은 RBC는 개별적으로 인산염 완충염(PBS)로 3회 세척하고, PBS로 0.5% v/v로 조정한다. 밑둥근 96 웰 미량적정 플레이트에 Falcon 플레이트가 포지티브와 네가티브 결과사이에 분명한 설명을 제공한다는 것을 보장하는 품질 보증용으로 PBS만으로 테스트하였다. 백신 재료는 중복으로 0.5mg/㎖로 시작하여, 재료 25㎕를 25㎕ PBS에 단계적으로 피펫팅하여 플레이트를 최고 2배까지 희석하였다. RBC/플레이트 한 종의 0.5% 현탁액 25㎕를 플레이트의 모든 웰에 분배하였다. 플레이트를 흔들어서 RBC를 분포시키고 4℃에서 4시간 동안 배양한 후 네가티브 결과로부터 포지티브를 결정한다.RBCs from chickens, turkeys and horses are individually washed three times with phosphate buffer (PBS) and adjusted to 0.5% v / v with PBS. The Palcon plate was tested with PBS only for quality assurance to ensure that the Falcon plate provided a clear explanation between the positive and negative results. Vaccine material started at 0.5 mg / ml in duplicate, and 25 μl of the material was pipetted stepwise into 25 μl PBS to dilute the plates up to 2 times. 25 μl of a 0.5% suspension of one species of RBC / plate was dispensed into all wells of the plate. The plate is shaken to distribute the RBC and incubated for 4 hours at 4 ° C. and then the positive is determined from the negative result.
인플루엔자 A/Vietnam/I 194/2004 (H5N 1 바이러스)의 도메인 3은 일관되고 반복적으로 조류 RBC에는 포지티브한 결과를 제공하지만 말 RBC에서는 아니다. 희석종말점(endpoint dilution)은 중복재료(replicates)에서 모두 8로 일치하며, 반복 실험으로 H5 도메인 3은 62.5㎍ 농도에서 조류 RBCs를 헤마토글루티네이트 시킬 수 있다(도 11).
실시예 5: 면역원성 연구Example 5: Immunogenicity Studies
초기 면역원성 연구Early immunogenicity study
초기 면역원 연구를 실시하여 식물에서 생산된 LicKM-항원 융합체가 복막을 통하여 면역주사를 맞은 생쥐에서 특정 혈청 IgG를 유도할 수 있는지, 그리고 유도된 항체가 in vitro에서 인플루엔자 바이러스를 중화시킬 수 있는지를 확ㅇ니한다. 이 견구는 LicKM, LicKM-HA(SD), LicKM-HA(SD)를 이용하고 아그로박테리움으로부터 인리치한 재조합 NA를 상기에서 설명하는 것과 같이 75% 순도로 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 잎에 침투시켰다.Initial immunogen studies have been conducted to determine whether plant-produced LicKM-antigen fusions can induce specific serum IgG in immunized mice through the peritoneum and whether the induced antibodies can neutralize influenza viruses in vitro. Yes. These dogs were prepared using LicKM, LicKM-HA (SD), LicKM-HA (SD) and recombinant NA enriched from Agrobacterium as described above inNicotiana benthamiana with 75% purity. Penetrated the leaves.
8주령의 암컷 BALB/c 생쥐를 재조합 LicKM-HA(SD), LicKMHA(GD) 100㎍/투여량 및 재조합 NA 50㎍/투여량으로 면역주사하였다. 이뮤노겐의 면역주사는 1일에 복막으로 주사후, 제1 부스터는 14일 후에, 제2 부스터는 10일 후에 실시한다. 첫 투여량에는 1:1 용적 비율의 컴플리트 Freund's 어쥬번트가 포함되고, 제2투여량에는 임의 어쥬번트가 포함되지 않는다. 네가티브 대조군은 재조합 LicKM 투여량 250㎍을 제공받는다. 각 군에는 세 마리 생쥐가 있다. 제1 투여전 1일에 프레-이뮨 혈청을 수집하고, 혈청은 제2부스터 후 28일에 연속하여 수거한다. 인플루엔자 특이적 IgG 항체 역가는 ELISA 검사를 이용하여 결정한다(도 12).Eight week old female BALB / c mice were immunized with 100 μg / dose of recombinant LicKM-HA (SD), LicKMHA (GD) and 50 μg / dose of recombinant NA. Immunogen immunizations are given per day intraperitoneally, 14 days after the first booster and 10 days after the second booster. The first dose contains complete Freund's adjuvant in a 1: 1 volume ratio and the second dose does not include any adjuvant. Negative controls receive a 250 μg recombinant LicKM dose. There are three mice in each group. Pre-Syag serum is collected 1 day prior to the first dose, and serum is collected continuously 28 days after the second booster. Influenza specific IgG antibody titers are determined using an ELISA assay (FIG. 12).
인플루엔자 백신에 대해 발생된 면역 혈청에 의한 바이러스의 헤마토글루티닌 활성 저해.Inhibition of hematoglutinin activity of the virus by immune sera generated against influenza vaccines.
상기에서 설명한 것과 같이 생쥐로부터 프레이뮨(Preimmune) 혈청 및 제2부스트 후 혈청을 비활성화된 인플루엔자 바이러스의 헤마토글루티닌 활성 저해에 대한 항체 역가 능력을 평가하였다. 비활성화된 인플루엔자 A/Vietnam/I 194/2004 바이러스(H5N1 바이러스)의 4 HA 단위를 프레이뮨 혈청과 백신의 제2부스터후에 수득한 혈청 25㎕ 희석액과 복합하였다. 실시예 4에서 설명하는 것과 같이 조류 RBC에서 헤마토글루티닌 활성 저해를 평가하였다. 생성된 항체 역가는 바이러스의 헤마토글루티닌 저해에 효과가 있었다. 예시적인 결과는 도 13에 나타내었고 표 1에 정리하였는데, 생성된 항체는 바이러스의 헤마토글루티닌 활성에 대해 보호할 수 있다는 것을 설명한다.As described above, preimmune serum and serum after second boost from mice were evaluated for the ability of antibody titers to inhibit hematoglutinin activity of inactivated influenza viruses. Four HA units of inactivated influenza A / Vietnam / I 194/2004 virus (H5N1 virus) were combined with a 25 μl dilution of serum obtained after the second booster of preyze serum and vaccine. Inhibition of hematoglutinin activity in algal RBC was assessed as described in Example 4. The resulting antibody titers were effective at inhibiting hematoglutinin of the virus. Exemplary results are shown in FIG. 13 and summarized in Table 1, demonstrating that the resulting antibodies can protect against hematoglutinin activity of the virus.
실시예 6: 인플루엔자 백신화반응의 모델 시스템Example 6: Model System of Influenza Vaccination
A. 근육내 백신주사A. Intramuscular Vaccine Injection
인플루엔자 감염 연구를 위해 확립된 동물 모델인 흰 족제비를 이용하여 인플루엔자 백신의 효과를 측정하였다(가령 Boyd et al, 1975; Chen et al., 1995; Scheiblauer et al., 1995; Sweet et al, 1980, Microbiol. Rev., 44:303; Maassab et al, 1982, J. Infect. Dis., 146:780; Toms et al, 1977; Webster et al, 1994; Fenton et.al, 1981 ; and Webster et al, 1994). 흰족제비 동물 모델을 이용한 유전(Transmission) 연구에서 인플루엔자 바이러스의 수용체 전파 뿐만 아니라 바이러스의 비루런스에 돌연변이의 효과를 설명한다(Herlocher et al., 2001 ; and Herlocher et al., 2002). 여기에서 설명하는 연구에 사용된 이형성 프라임-백신-도전으로 비활성화된 어쥬번트연결된 인플루엔자 백신으로 성공적으로 테스트하였다.Ferrets, an animal model established for influenza infection studies, were used to measure the effectiveness of influenza vaccines (eg Boyd et al, 1975; Chen et al., 1995; Scheiblauer et al., 1995; Sweet et al, 1980, Microbiol. Rev., 44: 303; Maassab et al, 1982, J. Infect. Dis., 146: 780; Toms et al, 1977; Webster et al, 1994; Fenton et.al, 1981; and Webster et al, 1994). Transmission studies using ferret animal models account for the effects of mutations on viral virulence as well as receptor propagation of influenza viruses (Herlocher et al., 2001; and Herlocher et al., 2002). It was successfully tested with the heterozygous linked influenza vaccine inactivated with the heterologous prime-vaccine-challenge used in the studies described herein.
테스트 물질 생산Test material production
우리는 흰족재비에서 식물에서 생산된 항원의 면역원성 및 보호 효과를 평가하였다. 테스트 물질은 식물에서 생산된 정제된 표적 항원으로 구성된다. 인플루엔자 type A (A/Wyoming/3/03 [H3N2])의 균주의 HA 도메인은 열안정성 캐리어 분자와 융합되도록 만들어 상기에서 설명하는 식물계 발현 시스템에서 만들어진다. 동일한 균주에서 구한 NA는 상기에서 설명하는 식물계 발현 시스템에서 만들어진다. 테스트 물질에는 임의 핵산, 독성 물질 또는 감염성 물질을 포함하지 않는다.We evaluated the immunogenic and protective effects of plant-produced antigens in ferrets. The test substance consists of the purified target antigen produced in the plant. The HA domain of a strain of influenza type A (A / Wyoming / 3/03 [H3N2]) was made to fuse with a thermostable carrier molecule and made in the plant-based expression system described above. NA obtained from the same strain is made in the plant-based expression system described above. The test substance does not include any nucleic acid, toxic substance or infectious substance.
특히, HA의 아미노산 17 내지 67 + 아미노산 294 내지 532(스템 도메인을 함께 구성)를 인코드하는 뉴클레오티드 서열(Wilson et al, 1981, Nature 289:366)을 LicKM (GenBank accession number DQ776900)에 삽입하여 LicKM-HA(SD)을 얻는다. HA의 아미노산 68 내지 293(구형 도메인을 구성)을 인코드하는 뉴클레오티드도 유사하여 삽입하여 LicKM-HA(GD)을 얻는다. 니코티나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 병인성 관련 단백질 PR1a의 시그날 펩티드를 인코드하는 서열(Pfitzner et al., 1987, Nucleic Acids Res. , 15 :4449)을 융합체가 N-말단에 포함되어 있다. 폴리-히스티딘 친화력 정제 tag(6XHis) 및 엔도플라스믹 레티큘럼 유지 시그날(KDEL)을 인코드하는 서열은 C-말단에 포함된다. LicKM 융합체를 하이브리드 벡터 pBID4 (Wilson et al, supra)에 도입시켜, 바이러스 게놈이 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터로부터 전사되고, 바이러스 복제 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 피복 단백질 서브 게놈 mRNA로부터 표적 서열이 발현되도록 하는데(Shivprasad et al, 1999, Virology, 255:312), 이 하이브리드 벡터는 잎에서 표적의 일과성 발현을 위해 아그로박테리움 바이너리 플라스미드 pBI121(Chen et al, 2003, MoI, Breed., 11 :287)로부터 유도된다. 또한, 동일한 인플루엔자 균주의 NA의 아미노산 38 내지 469를 인코드하는 서열을 LicKM에 사전 융합없이 pBID4로 도입시킨다. 상기에서와 같이, PRIa의 시그날 펩티드는 N-말단에 포함되며, 6xHis + KDEL는 C-말단에 포함된다.In particular, a nucleotide sequence (Wilson et al, 1981, Nature 289: 366) encoding
인플루엔자 항원을 포함하는 조작된 벡터는 전기천공에 의해 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101로 도입된다. 재조합 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 현탁액을 씨를 뿌린 후 약 6주되는 잎에 접종하여 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물에 도입시켜 표적 서열을 잎 조직으로 도입시킨다. 식물은 약 21℃에서 12시간 낮밤 주기 조건하에 화분에서 생장시켰다. 잎들을 발현 구조체에 따라 접종후 4일 내지 7일에 수확한다. 단백질 추출물은 완충액(50mM 인산나트륨염, pH 7.0; 100mM 염화나트륨; 10mM 디에틸디티오카르바메이트; 10mM β-멀캅토에탄올)에서 잎을 빻아서 준비한다 재조합 항원은 황화암모니움 침전 및 고정된 금속 친화력 크로마토그래피(6xHis tag이용) 및 음이온 교환 크로마토그래피, 각 단계후에는 투석하여 최소 순도를 80%로 하는 과정에 의해 준비한다.Engineered vectors containing influenza antigens are introduced intoAgrobacterium tumefaciens strain GV3101 by electroporation. RecombinantAgrobacterium tumefaciens suspensions are seeded in leaves about 6 weeks after seeding and introduced intoNicotiana benthamiana plants to introduce target sequences into the leaf tissue. The plants were grown in pots at 12 ° C day and night conditions at about 21 ° C. The leaves are harvested 4-7 days after inoculation depending on the expression construct. Protein extracts are prepared by grinding leaves in buffer (50 mM sodium phosphate salt, pH 7.0; 100 mM sodium chloride; 10 mM diethyldithiocarbamate; 10 mM β-mercaptoethanol). Recombinant antigen is precipitated with ammonium sulfide and immobilized metal. Affinity chromatography (using 6xHis tag) and anion exchange chromatography, after each step, are prepared by dialysis to obtain a minimum purity of 80%.
기준 항혈청으로 식물에서 생산된 항원의 반응을 ELISA 분석으로 평가하고(도 16A), 면역 블랏팅에 의해 변성 조건하에서 평가하였다(도 16B). ELISA의 경우에, 96 웰 플레이트를 LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), 또는 식물에서 정제된 NA로 또는 비활서오하된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스로 피복한다. 피복된 플레이트를 정제된 A/Wyoming/3/03 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청, NEBRG-18 (H7N2) 재조합된 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청 또는 NIBRG-17 (H7N1) 재조합된 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청과 배양시켰다. 면역블랏 분석을 위해, 100ng LicKM-HA(SD), 100ng LicKM-HA(GD), 100ng HA에 상응하는 양의 비활성화된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03를 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, 폴리비닐리덴 플로라이드 막으로 옮기고, LicKM 또는 A/Wyoming/3/03 바이러스의 정제된 HA에 대해 생성된 양 항혈청으로 배양시켰다. NA 활성은 표준 WHO 프로토콜 WHO/CDS/CSR/NCS 2002.5.Rev.l에 따라 검사하였다. NA 활성 저해는 뉴라미니다제 검사 실행전에 상동성 (NIBRG-18 [H7N2J) 또는 이형성(NIBRG-17 [H7N1]) 재조합 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청과 식물에서 생산된 NA를 사전-배양하여 평가하였다.Responses of antigens produced in plants with reference antiserum were assessed by ELISA assay (FIG. 16A) and evaluated under denaturing conditions by immunoblotting (FIG. 16B). For ELISA, 96 well plates are coated with LicKM-HA (SD), LicKM-HA (GD), or purified NA in plants or with influenza A / Wyoming / 3/03 virus deactivated. The coated plates were generated for sheep antiserum generated for purified A / Wyoming / 3/03 virus, sheep antiserum generated for NEBRG-18 (H7N2) recombined virus or for NIBRG-17 (H7N1) recombined virus. Incubated with both antiserum. For immunoblot analysis, 100 ng LicKM-HA (SD), 100 ng LicKM-HA (GD), and 100 ng HA equivalent amounts of inactivated influenza A / Wyoming / 3/03 were isolated using SDS-PAGE and poly Transferred to vinylidene fluoride membrane and incubated with both antiserum produced against purified HA of LicKM or A / Wyoming / 3/03 virus. NA activity was examined according to the standard WHO protocol WHO / CDS / CSR / NCS 2002.5.Rev.l. Inhibition of NA activity is assessed by pre-culture of sheep antisera and plant produced NA against homologous (NIBRG-18 [H7N2J) or heterozygous (NIBRG-17 [H7N1]) recombinant viruses prior to performing the neuraminidase assay. It was.
ELISA 및 면역블랏 검사에서, LicKM에 대해 생성된 다클론 토끼 혈청이 비슷하게 각 융합체를 인지하기는 하지만, LicKM-HA(SD)는 LicKM-HA(GD) 보다 기준 혈청에 의해 더 강하게 인지되었다(도 16B). 또한, 식물에서 생산된 NA는 재조합 H7N2 바이러스에 대해 생성된 다클론 양 혈청에 의해 인지되었고(도 16C), 이는 균주 특이적인 방법으로 기준 혈청에 의해 저해되는 효소 활성을 보여준다. (도 16C).In ELISA and immunoblot tests, LicKM-HA (SD) was more strongly recognized by reference serum than LicKM-HA (GD), although polyclonal rabbit serum generated for LicKM similarly recognized each fusion. 16B). In addition, NA produced in plants was recognized by polyclonal sheep serum generated against recombinant H7N2 virus (FIG. 16C), which shows enzymatic activity inhibited by reference serum in a strain specific method. (Figure 16C).
백신 접종vaccination
흰족제비 연구는 UK동물법, 1986에서 요구되는 UK Home Office 라이센스하에 실행되었다(Scientific Procedures). 고밀도 흰족제비 LabDiet 5Ll 5 (IPS Product Supplies, London, UK)에서 유지된 수컷 긴털족제비 또는 알비노 흰족제비(High gate Farm, Highgate, England), 4.5월령, 441 내지 629 g의 체중(연구개시일 당시)를 표 2에서 나타낸 것과 같이 처리군으로 나누었다.Ferret studies were conducted under the UK Home Office license required by the UK Animal Code, 1986 (Scientific Procedures). Male longhair weasel or albino ferret (High gate Farm, Highgate, England), 4.5 months old, weighing 441 to 629 g (at the time of study) maintained in High Density Ferret LabDiet 5Ll 5 (IPS Product Supplies, London, UK). Divided into treatment groups as shown in Table 2.
* TCID50 ("조직 배양 감염 약량") = 실험 웰의 절단에 활성, 생장하는 바이러스를 포함하는 바이러스 희석 수준* TCID50 (“Tissue Culture Infection Dose”) = viral dilution level containing the active, growing virus for cleavage of experimental wells
8마리 흰족제비 세그룹에 후보 백신 조제물(식물에서 생산되는 인플루엔자 항원 복합물을 포함; VC1+어쥬번트, VC2, VC2+어쥬번트)로 프라이밍 및 부스트 2회(0, 14, 28일)에 피하 면역주사하였다(표 1). VCl 동물은 100㎍ LicKM-HA(SD) 및 100㎍ LicKM-GD + 1.3mg alum을 투여받았다. VC2 동물은 100㎍ LicKM-(SD), 100㎍ LicKM-(GD), 50㎍ NA, 1.3mg alum ("+어쥬번트") 또는 alum 없음 ("어쥬번트 없음")을 투여받았다. 100㎍ LicKM-(SD) 및 100㎍ LicKM-(GD)은 HA 100㎍에 상응하도록 함께 제공된다. 네가티브 대조군 동물은 alum 어쥬번트 만을 제공받고, 포지티브 대조군 동물은 단일 비강 투여량의 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 (0일에 ㎖당 105.5 TCID50 농도에서 0.5㎖)를 제공받았다. 면역주사후에, 병소, 자극, 운동성, 홍반, 일반적 활성에 대해 동물을 매일 주시한다.Priming and boosting subcutaneous immunization in two groups (0, 14, 28) with eight candidate ferrets in three vaccine candidates (including influenza antigen complexes produced in plants; VC1 + adjuvant, VC2, VC2 + adjuvant) (Table 1). VCl animals received 100 μg LicKM-HA (SD) and 100 μg LicKM-GD + 1.3 mg alum. VC2 animals received 100 μg LicKM- (SD), 100 μg LicKM- (GD), 50 μg NA, 1.3 mg alum (“+ adjuvant”) or no alum (“no adjuvant”). 100 μg LicKM- (SD) and 100 μg LicKM- (GD) are given together to correspond to 100 μg HA. Negative control animals received only alum adjuvant and positive control animals received a single nasal dose of influenza A / Wyoming / 3/03 virus (0.5 ml at a concentration of 105.5 TCID50 per ml on day 0). After vaccination, animals are monitored daily for lesions, irritation, motility, erythema, and general activity.
동물의 비강으로 바이러스 도전을 받게 되는데, 최종 투여후 10일 ㎖당 105.5 TCID50 농도에서 마취하에 0.5㎖ 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스로 도전을 받게된다. 혈액 샘플은 백신주사일, 도전(challenge)일, 도전후 4일째에 수거하였고, 비강 세척액은 도전후 4일째 수거하였다. 혈청 HI 역가를 상동성 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 및 이형성 인플루엔자 A/Sydney/5/97 (H3N2), A/California/7/04 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (HlNl) 바이러스에 대해 결정하였다.The animal is challenged with the nasal cavity, which is challenged with 0.5 ml influenza A / Wyoming / 3/03 virus under anesthesia at a concentration of 105.5 TCID50 per
표 3에 나타낸 과정에 따라 인플루엔자 백신접종, 과정, 바이러스 도전을 실행하였다. 식물에서 만들어진 백신 후보물질을 제공받은 동물에서 부작용이 나타나지는 않았다. 동물에 개별 확인 및 체온 감시를 위해 트랜스폰더를 삽입하였다. 투약은 연구 과정에 나타낸 시간대에 세 번의 별도 과정으로 실시하였다(표 3). 미리 준비된 테스트 물질을 각 투약에 분배하였다. 테스트 물질은 투여직전에 어쥬번트와 혼합하였다.Influenza vaccination, procedures, and viral challenge were performed according to the procedures shown in Table 3. No adverse effects were seen in animals receiving vaccine candidates made from plants. Animals were inserted with transponders for individual identification and temperature monitoring. Dosing was administered in three separate courses at the time indicated in the study process (Table 3). Test materials prepared in advance were dispensed into each dose. The test substance was mixed with the adjuvant immediately before administration.
분석analysis
임상적 징후(건강 수치), 체중 및 체온 변화를 기록하였다. 매일, 감염후에 각 동물에서 병소, 자극, 운동성, 홍반 및 일반적인 활동에 대해 검사를 하고, 건강 지수를 결정하기 위해 기록하였다. 각 동물은 다음과 같이 기록한다: 재채기 또는 코가 꾸륵거름(1점); 외부 콧코구멍으로부터 화농 방출(1점); 자발적인 활성 또는 움직임 감소(1점); 자발적인 활동 없음 또는 민첩함 감소(2점). "자발적 활동 또는 움직임 감소" 및 "자발적 활동 없음 또는 민첩함 감소"는 상호 배타적인 수치이다. 감염후 체중의 최대 감소를 각 동물마다 기록한다. 감염후 최대 최온 증가도 각 동물마다 기록한다. 임의 날에 각 동물에서 최대 건강 지수, 체중 감소 및 체온 변화의 평균 및 표준 편차를 처리군으로 계산하고, ANOVA으로 비교한다. 각 동물에서 매일 종합 건강, 체중 감소, 체온 변화로 구성된 AUC-유사 측정을 계산한다: 처리군 평균, 중간 및 표준 편차를 계산하고, ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 테스트와 비교한다. 살아있는 바이러스로 도전후, 각 처리군은 임상 징후, 체온 및 체중 변화로 나타나는 도전으로부터 회복을 설명한다. 테스트 백신을 제공받은 동물 집단은 보호되며, 상동성 인플루엔자 바이러스로 도전을 받은 후에 질병의 징후는 없거나 거의 없는 것으로 나타났다. 테스트 백신 후보물질 모두 동물에 완전한 보호를 제공한다(도 14).Clinical signs (health figures), weight and body temperature changes were recorded. Daily, post infection, animals were examined for lesions, irritation, motility, erythema and general activity and recorded to determine health index. Each animal is recorded as follows: sneezing or nasal congestion (1 point); Purulent discharge from the external nostrils (1 point); Spontaneous activity or movement reduction (1 point); No voluntary activity or reduced agility (2 points). "Voluntary activity or movement reduction" and "No voluntary activity or agility reduction" are mutually exclusive figures. The maximum loss in weight after infection is recorded for each animal. The maximum warming increase after infection is also recorded for each animal. The mean and standard deviation of maximal health index, weight loss and body temperature change in each animal on any day are calculated by treatment group and compared by ANOVA. AUC-like measurements consisting of daily comprehensive health, weight loss, and temperature changes in each animal are calculated: treatment group mean, median and standard deviation are calculated and compared with ANOVA or Kruskal-Wallis test. After challenge with live virus, each treatment group demonstrates recovery from the challenge represented by clinical signs, body temperature and weight changes. The animal population receiving the test vaccine was protected and showed no or little signs of disease after being challenged with homologous influenza virus. All test vaccine candidates provide complete protection to the animals (FIG. 14).
바이러스 도전후에 비강 세척액을 수거하였다. 각 비강 세척액 용적으로 측정하고, 비강 세척액 중량을 모니터하였다. 도전후 비강 세척액에서 트립판 블루(총 세포 카운트를 결정하는데 이용됨)을 이용하여 백혈구 세포를 카운트하여 염증 세포 반응을 측정하였다. 비강 세척액에 감염후 세포 카운터를 각 샘플링 날에 log 변환된 데이터의 평균, 중간 및 표준 편차를 통하여 종합한다; 처리군은 ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 테스트로 비교하였다. 상기에서 설명된 임상 징후에 유사하게, 테스트 처리 백신을 제공받은 처리 군에서 비강 세척액의 모니터링으로 감염에 대해 포지티브 대조군에 동등한 또는 그 이상의 보호를 받는다는 것을 설명한다(도 14).Nasal washes were harvested after virus challenge. Each nasal wash volume was measured and the nasal wash weight was monitored. Inflammatory cell responses were measured by counting white blood cells using trypan blue (used to determine total cell count) in nasal lavage after challenge. After infection with nasal washes, the cell counters are aggregated through the mean, median and standard deviation of the log transformed data on each sampling day; Treatment groups were compared by ANOVA or Kruskal-Wallis test. Similar to the clinical signs described above, it is demonstrated that monitoring of nasal lavage in treatment groups receiving test treatment vaccines provides equal or greater protection to the positive control against infection (FIG. 14).
비강 세척 샘플상에 Madin-Darby canine kidney (MDCK) 세포 적정을 이용하여 바이러스 발산(shedding)을 결정하였다. MDCK 세포 적정 검사의 종결점은 칠면조 적혈구세포를 이용한 헤마토글루티닌 검사로 결정한다. Karber 계산을 이용하여 각 샘플에서 log10 TCID50/㎖을 결정하였다. 비강 세척 샘플에서의 바이러스 발산은 감염후 비강 세척 샘플 상에서 결정하였다. 각 동물에서 발산되는 최대 역가는 로그 변환되었다; 처리군, 평균, 표준 편차를 계산하고, Kruskal-Wallis 테스트로 비교하였다. 임의 시간에서 임의 바이러스 발산을 가는 처리군에 동물 비율을 표로 만들고, 각 군은 독립적으로 χ2 테스트를 이용하여 대조하였다. 바이러스 발산으로부터 결과를 도 15에 나타내었다. 네가티브 대조군 처리 군만 유의성있는 바이러스 발산이 있었다(도 15).Virus shedding was determined using Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell titration on nasal wash samples. The end point of the MDCK cell titration assay is determined by a hematoglutinin test using turkey erythrocytes. Karber calculations were used to determine log10 TCID50 / ml in each sample. Virus shedding in nasal wash samples was determined on nasal wash samples after infection. The maximum titer emitted in each animal was log transformed; Treatment groups, mean and standard deviation were calculated and compared by Kruskal-Wallis test. Animal ratios were tabulated to treatment groups with random virus divergence at any time, and each group was independently controlled using the χ2 test. The results from virus divergence are shown in FIG. 15. Only negative control treatment groups had significant virus shedding (FIG. 15).
헤마글루티닌 저해 검사(HAI)는 상동성 바이러스(인플루엔자 A/Wyoming/3/2003 (H3N2) 바이러스)에 대해 백신주사전 및 주사후 혈청 샘플을 이용하여 실시예 5에서 설명하는 것과 같이 실행하여, 기저수준에서 혈청-네가티브와 면역주사 및 감염후에 동물의 혈청 변환이 있는지에 대해 확인하였다. HAI 역가를 표로 만들고, 기준일(0일째)와 종료일에 4배이상 상승된 동물들을 확인하였다.The hemagglutinin inhibition test (HAI) was performed as described in Example 5 using serum samples before and after vaccination against homologous virus (Influenza A / Wyoming / 3/2003 (H3N2) virus). At baseline, serum-negative and vaccination and post-infection animals were checked for serum conversion. HAI titers were tabulated and animals raised more than four-fold at baseline (day 0) and end date were identified.
면역주사를 맞은 동물의 혈청의 헤마토글루티닌-저해(HI) 활성은 보호와 관련있는 것으로 간주된다(Brown et al. , 2004, Dev. Biol. (Basel), 115:1; and Hobson et al. , 1972, J. Hyg., 70:767). 각 실험 결과를 표 4에 나타내었다. H3N2 또는 포지티브 대조군에 대해 테스트 백신으로 면역주하를 받은 군의 모든 동물은 고혈청 헤마토글루티닌 저해 활성을 가지는 강력한 표적-특이적인 면역 반응을 가졌다. 백신의 제1투여후에, VC2+어쥬번트는 높은 HAI 역가를 생성하였다. 어쥬번트 없이 VC2는 보호 반응을 생성하였으나 제1투여후에 어쥬번트를 포함하는 것만큼 역가가 높지는 않았다. 그러나 제2투여후에, 역가는 어쥬번트를 가지는 CMB1 수준과 유사한 수준에 도달하였다. VCl +어쥬번트는 항체의 보호 수준을 생성하였는데, 이는 백신의 제2투여후에 상당히 더 높았다(표 4).Hematoglutinin-inhibiting (HI) activity in the serum of animals vaccinated is considered to be related to protection (Brown et al., 2004, Dev. Biol. (Basel), 115: 1; and Hobson et al., 1972, J. Hyg., 70: 767). The results of each experiment are shown in Table 4. All animals in the group immunized with test vaccine against H3N2 or positive control had a strong target-specific immune response with high serum hematoglutinin inhibitory activity. After the first dose of vaccine, the VC2 + adjuvant produced high HAI titers. Without the adjuvant VC2 produced a protective reaction but not as high as the adjuvant containing after the first administration. However, after the second dose, the titer reached a level similar to the CMB1 level with the adjuvant. VCl + adjuvant produced a protective level of antibody, which was significantly higher after the second dose of vaccine (Table 4).
도 17에서는 제2 HA 검사 실엄 결과를 나타내었다. 임의 동물의 프레-이뮨 혈청에서 또는 NC 동물의 혈청에서 HI 활성이 관찰되지 않았다(도 17). 그러나, VC2+어쥬번트로 백신주사를 맞은 모든 흰족제비의 혈청은 1:320 내지 1:2560(평균 역가 1273)의 높은 HI 역가를 나타내었다. VC1+어쥬번트를 제공받은 동물 가운데 제1투여후에 HI 역가가 낮거나 반응이 없는 것(Fewer responders)들이 관찰되었고(도 17), 이는 NA가 면역 반응을 조절할 것이라는 것을 말한다. VC2를 제공받은 8마리 동물중 다섯 마리는 1:160 내지 1:1280 범위의 HI 역가를 가지며, 어쥬번트 없이 상업적인 비활성화된 인플루엔자 백신은 일반적으로 HI 역가가 매우 낮았다(Potter et al, 1972, Br. J. Exp. Pathol, 53: 168; Potter et al, 1973, J. Hyg. (Lond.), 71 :97; and Potter et al, 1973, Arch. Gesamte virusforsch., 42:285). FVC1+어쥬번트, VC2 또는 VC2+어쥬번트의 제2투여후에, 모든 흰족제비의 혈청은 1:640 내지 1:2560 범위의 HI 역가를 가지고, 이들은 제3투여후에도 유사한 높은 역가를 유지한다(도 17). 이들 동물 모두의 혈청에는 1:40의 과량의 역가를 가지는데, 이는 최저 HI 역가가 사람에서 보호와 일치하는 것으로 간주된다(Brown et al, 2004, Dev. Biol. (Basel), 115:1; and Hobson et al, 1972, J. Hyg., 70:767).17 shows the results of the second HA test failure. HI activity was not observed in the pre-serum serum of any animal or in the serum of NC animals (FIG. 17). However, the serum of all ferrets vaccinated with VC2 + adjuvant showed high HI titers of 1: 320 to 1: 2560 (average titer 1273). Among the animals given VC1 + adjuvant, low HI titers or Fewer responders were observed after the first dose (FIG. 17), indicating that NA will modulate the immune response. Five of the eight animals receiving VC2 had HI titers ranging from 1: 160 to 1: 1280, and commercially inactivated influenza vaccines without adjuvant generally had very low HI titers (Potter et al, 1972, Br. J. Exp. Pathol, 53: 168; Potter et al, 1973, J. Hyg. (Lond.), 71:97; and Potter et al, 1973, Arch. Gesamte virus forsch., 42: 285). After the second dose of FVC1 + adjuvant, VC2 or VC2 + adjuvant, all ferret serum had HI titers ranging from 1: 640 to 1: 2560, and they maintained similar high titers even after the third dose (FIG. 17). . The serum of all these animals has an excess titer of 1:40, which indicates that the lowest HI titer is consistent with protection in humans (Brown et al, 2004, Dev. Biol. (Basel), 115: 1; and Hobson et al, 1972, J. Hyg., 70: 767).
식물에서 생산된 백신 후보물질의 2 내지 3회 투여후 흰족제비의 혈청에 HI 역가는 비강으로 감염된 포지티브 대조군 동물에서의 것과 상응하거나 이보다 컸고(도 17), 다른 흰족제비 연구에서 관찰된 것보다는 초과되었다. 예를 들면, 시판되는 비활성화된 H3N2 인플루엔자 백신을 근육으로 면역주사를 맞은 흰족제비는 2회 투여후에 1:20의 HI 역가가 발생되는 것으로 보고되었다(Lambkin et al, 2004, 백신, 22:4390). VC1+어쥬번트, VC2 또는 VC2+어쥬번트로 면역주사를 맞은 흰족제비의 혈청에는 A/Wyoming/3/03에 대항하는 것보다 이형성 H3N2 바이러스 균주A/Sydney/5/97 및 A/California/7/04 Sera에 대해 약 4 내지 12배 더 낮은 역가를 가졌으나, 이들 역가는 보호에 상응하는 1 :40 분계점을 모두 초과하여, 이는 이들 백신 후보물질이 이형성 H3N2 균주에 대한 보호 능역이 있다는 것을 설명한다. HI titers below 1 :10 were observed against 인플루엔자 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)에 대해 1:10이하의 HI 역가가 관찰되었는데 이는 HI 항체 반응의 H3 서브타입 특이성을 나타내는 것이다.HI titers in ferret serum after 2-3 administrations of vaccine candidates produced in plants corresponded to or greater than those in positive control animals infected with nasal passages (FIG. 17) and exceeded those observed in other ferret studies. It became. For example, ferrets immunized with a commercially inactivated H3N2 influenza vaccine into muscle have been reported to develop a HI titer of 1:20 after two doses of administration (Lambkin et al, 2004, vaccine, 22: 4390). . Sera of ferrets vaccinated with VC1 + adjuvant, VC2 or VC2 + adjuvant contained heterologous H3N2 virus strains A / Sydney / 5/97 and A / California / 7/04 than against A / Wyoming / 3/03. Although they had about 4-12 fold lower titers for Sera, these titers exceeded all of the 1:40 threshold corresponding to protection, demonstrating that these vaccine candidates have a protective capacity against heterologous H3N2 strains. HI titers below 1: 10 were observed against influenza A / New Caledonia / 20/99 (HlNl) HI titers below 1:10 were observed, indicating the H3 subtype specificity of the HI antibody response.
면역원성 및 보호 효과 연구가 실행되어 살아있는 난에서 생장된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스로 비강 도전을 받은 흰족제비의 식물에서 생산되는 HA 및 NA 항원으로 면역주사 후 보호 효과를 평가하였다.Immunogenicity and protective effects studies were conducted to evaluate the post-vaccination protective effects with HA and NA antigens produced in the ferret plants nasal challenged with influenza A / Wyoming / 3/03 virus grown in living eggs.
도전후에 바이러스 감염은 도전후 4일에 비강 세척물에서 바이러스 발산을 모니터하여 각 동물에서 결정한다. 세 가지 후보물질 백신 조성물중 임의의 것을 제공받은 한 마리 동물에서만 감지가능한 정도의 바이러스 발산이 나타났고, 이는 102 TCID50보다 적었으며, NC 군의 동물에서는 106 TCID50내지 107 TCID50 범위의 발산을 보여주었다(도 18A). PC 군에서 바이러스 발산 수준은 102 TCID50내지 103 TCID50 범위에 있고 이는 후보 백신군에 임의 동물에서보다 높았다(도 18A).Post-challenge viral infections are determined in each animal by monitoring virus divergence in
후보 백신 조제물을 제공받은 동물에서 보호 증가가 관찰되었다. 감염후 체중 감소는 NC 군에 있는 것들과 비교하였을 때 VC1+어쥬번트, VC2+어쥬번트 또는 상동성 바이러스를 제공받은 흰족제비에서 상당히 감소되었다.(도 18B). VC2를 제공받은 동물에서 체중 감소가 줄어든 것은 그다지 놀라운 것은 아니다(도 18B). 또한, 임의 백신 후보 물질 조성물로 면역주사를 맞은 흰족제비에서 체온 상승은 NC 또는 PC 군의 동물과 비교하였을 때 감소되었다(도 18C). 또한, 증후 수치 평균 피크, 도전후에 몇 가지 인플루엔자 관련된 증후 빈도는 NC군의 동물과 비교하였을 때 후보 백신 조성물을 제공받은 동물에서 감소되었다(도 18D). 유사하게, 상부 호흡기관 감염의 지시물질로써 취한 흰족제비의 비강 세척액에 백혈구세포 카운터는 NC 군에 있는 동물과 비교하였을 때 후보물질 백신 수용체에서 감소되었다(도 18E).An increase in protection was observed in animals receiving candidate vaccine preparations. Post-infection weight loss was significantly reduced in ferrets receiving VC1 + adjuvant, VC2 + adjuvant or homologous virus as compared to those in the NC group (FIG. 18B). Reduced weight loss in animals receiving VC2 is not surprising (FIG. 18B). In addition, the increase in body temperature in ferrets immunized with any vaccine candidate composition was reduced as compared to animals in the NC or PC group (FIG. 18C). In addition, the mean value of the symptom value peak, the frequency of several influenza related symptoms after challenge, was reduced in animals receiving the candidate vaccine composition as compared to animals in the NC group (FIG. 18D). Similarly, leukocyte counters in ferret nasal lavage taken as an indicator of upper respiratory tract infection were reduced in candidate vaccine receptors as compared to animals in the NC group (FIG. 18E).
도전 연구에서 식물에서 생산된 HA 및 NA 항원은 흰족제비에서 고도의 높은 보호 면역성을 부여하고, 이는 백신 개발에 전망을 보여주는 것이다. 앞으로 연구에서 LicKM-SD 및 LicKM-GD를 개별적으로 투여하였을 때 보호 역할 및 면역 반응을 실행함에 있어서 NA의 역할을 밝혀야 할 것이다.In the challenge study, the plant-produced HA and NA antigens confer a high degree of protective immunity in ferrets, showing promise for vaccine development. Future studies should reveal the role of NA in implementing protective and immune responses when LicKM-SD and LicKM-GD are administered separately.
B. 비강 백신 주사B. Nasal Vaccination
Balb/c 생쥐 또는 흰족제비 동물 모델에서 비강 면역주사후에 후보 백신의 면역원성을 평가하였다. 연구안은 상기 실시예에서 논의된 근육내 면역주사의 경우와 유사하다. 간략하게 설명하면 어쥬번트(가령, 수산화알루미늄, MALP-2, 등) 존재 하에 또는 부재 하에 0, 14, 28일에 표적 항원 세 가지 약량(100㎍/투여)으로 생쥐 또는 흰족제비 집단(집단에 약 8-10마리)의 비강으로 면역주사한다. 혈청 샘플과 비강 세척액을 항원 투여전 각 백신투여일 및 제3투여후 10일에 수거하였다. 면역주사를 맞은 동물에 최종 투여일후에, 동물을 감염시키고, 열을 수반하는 호흡기 감염 증후를 만들기 위해 비강 경로를 통하여 공지된 인플루엔자 바이러스 상동성 균주로 도전시켰다. 면역 반응의 성질은 바이러스 도전후에 바이러스 발산, 감염후 체중 감소, 체온 상승, 증후 수치의 평균 피크, 비강 세척액에 백혈구세포 카운트 수준을 결정하여 검사한다. NA 및/또는 HA에 대한 항체 존재 및 HI 및 바이러스 중화 활성도 검사하였다.Immunogenicity of candidate vaccines was evaluated after nasal vaccination in Balb / c mice or ferret animal models. The proposal is similar to the case of intramuscular vaccines discussed in the above examples. Briefly, the mouse or ferret population (groups) with three doses (100 μg / dose) of the target antigen at 0, 14, 28 days with or without an adjuvant (eg, aluminum hydroxide, MALP-2, etc.) About 8-10 animals). Serum samples and nasal lavage were collected on each vaccination day prior to antigen administration and 10 days after the third dose. Vaccines were infected with animals and challenged with known influenza virus homologous strains through the nasal route to create fever-associated respiratory infection symptoms after the last dose. The nature of the immune response is examined by determining virus shedding after viral challenge, weight loss after infection, elevated body temperature, mean peak of symptom levels, and leukocyte count levels in nasal lavage fluid. Antibody presence and HI and virus neutralizing activity against NA and / or HA were also examined.
C. 투여량 상승 연구C. Dose Escalation Study
항원 및 어쥬번트의 최적 조성 및 투여량, 투여경로 및 면역주사 섭생은 약량 상응 연구(dose escalation studies)를 통하여 추가 평가할 수 있다. 이 연구는 근육 경로(표 3) 및 비강 경로를 모두 이용하여 실시한다. 실시예에서 논의된 근육 및 비강 면역주사와 유사하게, 동물군(집단에 약 8-10마리)를 다양한 약량의 테스트 백신(어쥬번트 유무하에-가령, 수산화알루미늄, MALP-2, 등) 비강으로 면역주사한다. 예시적인 약량은 하기 표 5에 나타내었다.Optimal composition and dosage of antigen and adjuvant, route of administration and vaccination regimen can be further assessed through dose escalation studies. This study is conducted using both the muscular pathway (Table 3) and the nasal route. Similar to the muscle and nasal vaccines discussed in the Examples, animals (about 8-10 in a population) were injected into the nasal cavity with various doses of test vaccine (with or without an adjuvant—eg, aluminum hydroxide, MALP-2, etc.). Vaccines Exemplary dosages are shown in Table 5 below.
다른 연구에서, 혈청 샘플 및 비강 세척액은 항원 투여전 각 백신주사일 및 제3 투약후 10일에 계산하엿다. 면역주사를 맞은 동물은 동물을 감염시키고, 열을 수반하는 호흡기 감염 증후를 만드는 것으로 공지된 인플루엔자 바이러스의 상동성 균주로 비강 경로를 통하여 최종 투여후에 도전을 받게 한다. 면역 반응의 성질은 바이러스 도전후에 바이러스 발산, 감염후 체중 감소, 체온 상승, 증후 수치의 평균 피크, 비강 세척액에 백혈구세포 카운트; NA, HA 및/또는 M2에 대한 항체 존재; 헤마토글루티닌 저해 및 바이러스 중화 활성도 검사하여 결정하였다.In another study, serum samples and nasal lavage fluid were calculated on each vaccination day before antigen administration and 10 days after the third dose. Immunized animals are challenged after final administration via the nasal route with homologous strains of influenza virus known to infect animals and create symptoms of respiratory infections involving fever. The nature of the immune response may include: virus shedding after viral challenge, weight loss after infection, elevated body temperature, mean peak of symptom levels, white blood cell counts in nasal lavage fluid; Presence of antibodies to NA, HA and / or M2; Hematoglutinin inhibition and virus neutralization activity were also determined by testing.
*i.m.은 근육투여를 말한다.* i.m. means muscle administration.
SEQUENCE LISTING<110> Yusibov, et al. <120> Influenza Antigens, Vaccine Compositions, and Related Methods<130> 2002645-0113<140> 11/706573<141> 2007-02-13<160> 35 <170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 577<212> PRT<213> HA (HAV) Protein<400> 1Ala Lys Ala Gly Val Gln Ser Val Lys Met Glu Lys Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr 20 25 30 His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn 35 40 45 Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly 50 55 60 Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile 85 90 95 Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn 100 105 110 Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His 115 120 125 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys 130 135 140 Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys 145 150 155 160 Pro Tyr 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cactaagtgc cagactccaa tgggagctat taactcttct 180atgccattcc acaacattca cccacttact attggagagt gcccaaagta cgtgaagtct 240aacaggcttg tgcttgctac tggacttagg aattctccac aaagagagag gagaaggaag 300aagaggggac ttttcggagc tattgctgga ttcattgagg gaggatggca aggaatggtt 360gatggatggt acggatacca tcactctaat gagcagggat ctggatatgc tgctgataag 420gagtctactc agaaggctat tgatggagtg actaacaagg tgaactctat tattgataag 480atgaacactc agttcgaagc tgttggaagg gagttcaaca atcttgagag gaggattgag 540aaccttaaca agaaaatgga ggatggattc cttgatgtgt ggacttacaa cgctgagctt 600cttgtgctta tggagaacga gaggactctt gatttccacg attctaacgt gaagaacctt 660tacgacaaag tgaggcttca gcttagggat aacgctaagg agcttggaaa cggttgcttc 720gagttctacc acaagtgcga taatgagtgc atggagtctg ttaggaacgg aacttacgat 780tacccacagt actctgagga agctagactt aagagggagg agatttctgg agtgaagttg 840gagtctattg gtatctacca gattaagctt 870<210> 20<211> 283<212> PRT<213> (SD domain 1-2) HA1-2V<400> 20Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu 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tctgtgggaa cttctactct 720taaccagagg cttgtgccaa gaattgctac taggtctaag gtgaacggac aatctggaag 780gatggagttc ttctggacta ttcttaagcc aaacgatgct attaacttcg agtctaacgg 840aaacttcatt gctccagagt acgcttacaa gattgtgaag aagggagatt ctactattat 900gaagtctgag cttgagtacg gaaactgcaa cactaagtgc caaactccaa tgggagctat 960taactcttct atgccattcc acaacattca cccacttact attggagagt gcccaaagta 1020cgtgaagtct aacaggcttg tgcttgctac tggacttagg aattctccac aaagagagag 1080gagaaggaag aagaggggac ttttcggagc tattgctgga ttcattgagg gaggatggca 1140aggaatggtt gatggatggt acggatacca tcactctaat gagcagggat ctggatatgc 1200tgctgataag gagtctactc agaaggctat tgatggagtg actaacaagg tgaactctat 1260tattgataag atgaacactc agttcgaagc tgttggaagg gagttcaaca atcttgagag 1320gaggattgag aaccttaaca agaaaatgga ggatggattc cttgatgtgt ggacttacaa 1380cgctgagctt cttgtgttga tggagaacga gaggactctt gatttccacg attctaacgt 1440gaagaacctt tacgacaaag tgaggcttca gcttagggat aacgctaagg agcttggaaa 1500cggttgcttc gagttctacc acaagtgcga taatgagtgc atggagtctg ttaggaacgg 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acaagttgtt cgagaggact aagaagcagc ttagggagaa cgctgaggat 720atgggaaatg gatgcttcaa aatctaccac aagtgcgata acgcttgcat tgagtctatt 780aggaacggaa cttacgatca cgatgtgtac cgtgatgagg ctcttaacaa caggttccag 840attaagggag tggagcttaa gtctggatac aaggattgga ttcttaagct t 891<210> 24<211> 290<212> PRT<213> (SD domain 1-2) HA1-2<400> 24Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 20 25 30 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn 50 55 60 Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro 65 70 75 80 Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn 85 90 95 Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 100 105 110 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg 115 120 125 His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr 130 135 140 Gln Ala Ala 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agtctttcaa ctgggctgga 240gttactcaga acggaacttc ttctgcttgt aagaggaggt ctaacaagtc tttcttctct 300aggcttaact ggcttactca ccttaagtac aagtacccag ctcttaacgt gactatgcca 360aacaacgaga agttcgataa gttgtacatt tggggagttc accacccagt tactgattct 420gatcagattt ctctttacgc tcaggcttct ggaaggatta ctgtgtctac taagaggtct 480cagcagactg tgattccaaa cattggatac cgtccaagag tgagggatat ttcttctagg 540atttctatct actggactat tgtgaagcca ggagatattc ttcttattaa ctctactgga 600aaccttattg ctccaagggg atacttcaag attaggagtg gaaagtcatc tattatgagg 660agtgatgctc caattggaaa gtgcaagctt 690<210> 26<211> 1699<212> DNA<213> (full length) HASW<400> 26ggatccatta attaaaatgg gattcgtgct tttctctcag cttccttctt tccttcttgt 60gtctactctt cttcttttcc ttgtgatttc tcactcttgc cgtgctcaaa agttgccagg 120aaacgataac tctactgcta ctctttgcct tggacatcac gctgttccaa acggaactat 180tgtgaaaact attactaacg atcagattga ggtgacaaac gctactgagc ttgttcagtc 240atcttctact ggaggaattt gcgattctcc acaccagatt cttgatggag agaactgcac 300tcttattgat gctcttcttg gagatccaca gtgcgatgga ttccagaaca agaagtggga 360tcttttcgtg gaaaggtcta aggcttactc taactgctac ccatacgatg ttccagatta 420cgcttctctt aggagtcttg tggcttcttc tggaactctt gagttcaaca acgagtcttt 480caactgggct ggagttactc agaacggaac ttcttctgct tgtaagagga ggtctaacaa 540gtctttcttc tctaggctta actggcttac tcaccttaag tacaagtacc cagctcttaa 600cgtgactatg ccaaacaacg agaagttcga taagttgtac atttggggag ttcaccaccc 660agttactgat tctgatcaga tttctcttta cgctcaggct tctggaagga ttactgtgtc 720tactaagagg tctcagcaga ctgtgattcc aaacattgga taccgtccaa gagtgaggga 780tatttcttct aggatttcta tctactggac tattgtgaag ccaggagata ttcttcttat 840taactctact ggaaacctta ttgctccaag gggatacttc aagattagga gtggaaagtc 900atctattatg aggagtgatg ctccaattgg aaagtgcaac tctgagtgca ttactccaaa 960cggatctatt ccaaacgata agccattcca gaacgtgaac aggattactt atggagcttg 1020cccaagatac gtgaagcaga acactcttaa gttggctact ggaatgagga atgtgccaga 1080gaagcagact aggggaattt tcggagctat tgctggattc attgagaatg gatgggaggg 1140aatggttgat ggatggtacg gattcaggca ccagaattca gagggaactg gacaagctgc 1200tgatcttaag tctactcagg ctgctattaa ccagattaac ggaaagttga acaggcttat 1260tggaaagact aacgagaagt tccaccagat tgagaaggag ttctctgagg ttgagggaag 1320gattcaggat cttgagaagt acgtggagga tacaaagatt gatctttggt cttacaacgc 1380tgagcttctt gttgctcttg agaaccagca cactattgat ttgactgatt ctgagatgaa 1440caagttgttc gagaggacta agaagcagct tagggagaac gctgaggata tgggaaatgg 1500atgcttcaaa atctaccaca agtgcgataa cgcttgcatt gagtctatta ggaacggaac 1560ttacgatcac gatgtgtacc gtgatgaggc tcttaacaac aggttccaga ttaagggagt 1620ggagcttaag tctggataca aggattggat tcttcatcat caccaccacc acaaggatga 1680gctttgatga ctcgagctc 1699<210> 27<211> 1446<212> DNA<213> NAV (N1)<400> 27ggatccttaa ttaaaatggg attcgtgctt ttctctcagc ttccttcttt ccttcttgtg 60tctactcttc ttcttttcct tgtgatttct cactcttgcc gtgctcaaaa tgtcgacctt 120atgcttcaga ttggaaacat gatttctatt tgggtgtcac actctattca cactggaaac 180cagcatcagt ctgagccaat ttctaacact aaccttttga ctgagaaggc tgtggcttct 240gttaagttgg ctggaaactc ttctctttgc cctattaacg gatgggctgt gtactctaag 300gataactcta 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ggagtttctt ctgcttgccc ataccaggga 300aagtcatctt tcttcaggaa cgttgtgtgg cttattaaga agaactctac ttacccaact 360attaagaggt cttacaacaa cactaaccag gaggatcttc ttgtgctttg gggaattcac 420catccaaatg atgctgctga gcagactaag ttgtaccaga acccaactac ttacatttct 480gtgggaactt ctactcttaa ccagaggctt gtgccaagaa ttgctactag gtctaaggtg 540aacggacaat ctggaaggat ggagttcttc tggactattc ttaagccaaa cgatgctatt 600aacttcgagt ctaacggaaa cttcattgct ccagagtacg cttacaagat tgtgaagaag 660ggagattcta ctattatgaa gtctgagctt gagtacggaa actgcaagct t 711<210> 22<211> 1699<212> DNA<213> (full-length) HAS-V<400> 22ggatccatta attaaaatgg gattcgtgct tttctctcag cttccttctt tccttcttgt 60gtctactctt cttcttttcc ttgtgatttc tcactcttgc cgtgctgatc aaatctgcat 120tggataccac gctaacaact ctactgagca agtggataca attatggaga agaacgtgac 180tgttactcac gctcaggata ttcttgaaaa gactcacaac ggaaagttgt gcgatcttga 240tggagtgaag ccacttattc ttagggattg ctctgttgct ggatggcttc ttggaaaccc 300aatgtgcgat gagttcatta acgtgccaga gtggtcttat attgtggaga aggctaaccc 360agttaatgat 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