KR20070055625A - Immunoglobulin Variants and Uses thereof - Google Patents
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Abstract
Translated fromKoreanDescription
Translated fromKorean도 1a는 각각의 뮤린 2H7 (서열 1), 인간화 2H7.v16 변이체 (서열 2) 및 인간 카파 경쇄 아군 I (서열 3)의 경쇄 가변 도메인 (VL)의 아미노산 서열을 비교하는 서열 정렬이다. 2H7 및 hu2H7.v16의 VL의 CDR은 CDR1 (서열 4), CDR2 (서열 5) 및 CDR3 (서열 6)과 같다.1A is a sequence alignment comparing the amino acid sequences of the light chain variable domains (VL ) of each murine 2H7 (SEQ ID NO: 1), humanized 2H7.v16 variant (SEQ ID NO: 2), and human kappa light chain subgroup I (SEQ ID NO: 3). CDRs of VL of 2H7 and hu2H7.v16 are identical to CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 5), and CDR3 (SEQ ID NO: 6).
도 1b는 각각의 뮤린 2H7 (서열 7), 인간화 2H7.v16 변이체 (서열 8) 및 중쇄 아군 III의 인간 컨센서스 서열 (서열 9)의 VH 서열을 비교하는 서열 정렬이다. 2H7 및 hu2H7.v16의 VH의 CDR은 CDR1 (서열 10), CDR2 (서열 11) 및 CDR3 (서열 12)과 같다.FIG. 1B is a sequence alignment comparing the VH sequences of each murine 2H7 (SEQ ID NO: 7), humanized 2H7.v16 variant (SEQ ID NO: 8), and the human consensus sequence (SEQ ID NO: 9) of heavy chain subgroup III. CDRs of VH of 2H7 and hu2H7.v16 are identical to CDR1 (SEQ ID NO: 10), CDR2 (SEQ ID NO: 11), and CDR3 (SEQ ID NO: 12).
도 1a 및 도 1b에서, 각각의 쇄에서 CDR1, CDR2 및 CDR3은 나타낸 바와 같이 FR1 내지 FR4인 프레임워크 영역으로 플랭킹된 브래킷 내에 포함된다. 2H7은 뮤린 2H7 항체를 언급한다. 두 줄의 서열 사이에 별표는 두 서열 사이에 상이한 위치를 나타낸다. a, b, c, d 및 e로 나타낸 삽입과 함께 잔기 번호매김은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 따른다.In FIGS. 1A and 1B, CDR1, CDR2 and CDR3 in each chain are included in a bracket flanked with framework regions that are FR1 through FR4 as shown. 2H7 refers to murine 2H7 antibody. An asterisk between two lines of sequence indicates a different position between the two sequences. Residue numbering with insertions represented by a, b, c, d and e is described by Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).
도 2는 2H7 Fab 플라스미드의 작제 (실시예 1 참고)를 위한 파지미드 pVX4 (서열 13)의 서열 및 CDR-이식된 항-IFN-α 인간화 항체에 대한 Fab의 L 쇄 (서열 14) 및 H 쇄 (서열 15)의 아미노산 서열을 나타낸다.FIG. 2 shows the sequence of phagemid pVX4 (SEQ ID NO: 13) and the L chain (SEQ ID NO: 14) and the H chain of the Fab for CDR-grafted anti-IFN-α humanized antibody for the construction of 2H7 Fab plasmid (see Example 1) The amino acid sequence of (SEQ ID NO: 15) is shown.
도 3은 키메라 2H7.v6.8 Fab (서열 16)를 코딩하는 발현 플라스미드의 서열을 나타낸다. L 쇄 (서열 17) 및 H 쇄 (서열 18)의 아미노산 서열을 나타낸다.3 shows the sequence of the expression plasmid encoding the chimeric 2H7.v6.8 Fab (SEQ ID NO: 16). The amino acid sequences of the L chain (SEQ ID NO: 17) and H chain (SEQ ID NO: 18) are shown.
도 4는 실시예 1에 기재하는 바와 같은 이뮤노글로불린 경쇄의 발현을 위한 플라스미드 pDR1 (서열 19 ; 5391 bp)의 서열을 나타낸다. pDR1은 무관한 항체, 인간화 항-CD3 항체 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992))의 경쇄를 코딩하는 서열, 볼드체로 밑줄그어 나타낸 개시 코돈 및 정지 코돈을 함유한다.4 shows the sequence of plasmid pDR1 (SEQ ID NO: 19; 5391 bp) for expression of an immunoglobulin light chain as described in Example 1. FIG. pDR1 is a sequence encoding the light chain of an irrelevant antibody, a humanized anti-CD3 antibody (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)), the bold initiation codon and the stop codon It contains.
도 5는 실시예 1에 기재하는 바와 같이 이뮤노글로불린 중쇄의 발현을 위한 플라스미드 pDR2 (서열 20; 6135 bp)의 서열을 나타낸다. pDR2는 무관한 항체, 인간화 항-CD3 항체 (Shalaby et al., 상기 문헌)의 중쇄를 코딩하는 서열, 볼드체로 밑줄그어 나타낸 개시 코돈 및 정지 코돈을 함유한다.5 shows the sequence of plasmid pDR2 (SEQ ID NO: 20; 6135 bp) for expression of immunoglobulin heavy chains as described in Example 1. FIG. pDR2 contains an unrelated antibody, a sequence encoding the heavy chain of a humanized anti-CD3 antibody (Shalaby et al., supra), a start codon and a stop codon, underlined in bold.
도 6은 2H7.v16 완전 L 쇄의 아미노산 서열 (서열 21)을 나타낸다. DIQ 전의 처음 19개의 아미노산은 성숙한 폴리펩티드 쇄에 존재하지 않는 분비 신호 서열이다.6 shows the amino acid sequence of the 2H7.v16 full L chain (SEQ ID NO: 21). The first 19 amino acids before DIQ are secretory signal sequences that do not exist in the mature polypeptide chain.
도 7은 2H7.v16 완전 H 쇄의 아미노산 서열 (서열 22)을 나타낸다. EVQ 전의 처음 19개의 아미노산은 성숙한 폴리펩티드 쇄에 존재하지 않는 분비 신호 서열이다. 도 1b에서의 VH 서열 (서열 8)과 완전 H 쇄 서열을 일직선에 맞추면 인간 γ 1 불변 영역이 서열 22 중 아미노산 위치 114-471로부터 유래한다.7 shows the amino acid sequence of the 2H7.v16 full H chain (SEQ ID NO: 22). The first 19 amino acids before EVQ are secretory signal sequences not present in the mature polypeptide chains. Aligning the VH sequence (SEQ ID NO: 8) with the complete H chain sequence in FIG. 1B, the
도 8은 2H7.v31 완전 H 쇄의 아미노산 서열 (서열 23)을 나타낸다. EVQ 전의 처음 19개의 아미노산은 성숙한 폴리펩티드 쇄에 존재하지 않는 분비 신호 서열이다. L 쇄는 2H7.v16 (도 6 참고)과 동일하다.8 shows the amino acid sequence of the 2H7.v31 full H chain (SEQ ID NO: 23). The first 19 amino acids before EVQ are secretory signal sequences not present in the mature polypeptide chains. L chain is identical to 2H7.v16 (see FIG. 6).
도 9는 실시예 6에 기재되는 바와 같이, 2H7.v16 및 2H7.v73 IgG 변이체의 상대적 안정성을 나타낸다. 검정 결과를 인큐베이션 전의 값으로 표준화시키고, 인큐베이션 후의 남은 백분율로서 보고하였다.9 shows the relative stability of 2H7.v16 and 2H7.v73 IgG variants, as described in Example 6. FIG. Assay results were normalized to the values before incubation and reported as percentage remaining after incubation.
도 10은 뮤린 2H7로부터 v75 이하의 인간화 버젼의 대상체로의 아미노산 변화를 요약한 흐름 도표이다.10 is a flow chart summarizing amino acid changes from murine 2H7 to humanized versions of v75 and below in subjects.
도 11은 실시예 10에 기재되는 바와 같이, 모든 군 (2H7 연구 및 리툭산® 연구를 합함) 중 평균 절대 B-세포수 [CD3-/CD40+]의 요약이다.FIG. 11 is a summary of mean absolute B-cell numbers [CD3- / CD40 +] in all groups (combining the 2H7 study and Rituxan® study), as described in Example 10. FIG.
도 12는 실시예 11에 기재되는 바와 같이 푸코스 결핍 2H7 변이체 상의 대표적인 ADCC 검정법의 결과를 나타낸다.12 shows the results of a representative ADCC assay on fucose deficient 2H7 variants as described in Example 11. FIG.
도 13은 항체 농도의 함수로서 플롯된 아넥신 (Annexin) V 염색법의 결과를 나타낸다. 라모스 (Ramos) 세포를 가교 2차 항체의 존재하에 무관한 IgG1 대조군 항체 (허셉틴 (Herceptin)®; 원형), 리툭시맵 (사각형), 또는 rhuMAb 2H7.v16 (삼각형)으로 처리하고, FACS로 분석하였다. 도 13 내지 15를 실시예 13에 기재한다.13 shows the results of Annexin V staining plotted as a function of antibody concentration. Ramos (Ramos) irrelevant IgG1 control antibody to cells in the presence of a crosslinking secondary antibody (Herceptin (Herceptin)®; round), processed, and analyzed by FACS as Rituximab (squares), or rhuMAb 2H7.v16 (triangles) It was. 13 to 15 are described in Example 13.
도 14는 항체 농도의 함수로서 플롯된 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 이중-염색법의 결과를 나타낸다. 라모스 세포를 가교 2차 항체의 존재하에 무관한 IgG1 대조군 항체 (허셉틴®; 원형), 리툭시맵 (사각형), 또는 rhuMAb 2H7.v16 (삼각형)으로 처리하고, FACS로 분석하였다.FIG. 14 shows the results of Annexin V and propidium iodide double-staining plotted as a function of antibody concentration. Irrelevant IgG1 control antibody to Ramos cells in the presence of a crosslinking secondary antibody; treated with (Herceptin® circle), Rituximab (squares), or rhuMAb 2H7.v16 (triangles) and analyzed by FACS.
도 15는 항체 농도의 함수로서 플롯된 살아있는 염색되지 않는 세포의 수 (10 s 당)를 나타낸다. 라모스 세포를 가교 2차 항체의 존재하에 무관한 IgG1 대조군 항체 (허셉틴®; 원형), 리툭시맵 (사각형), 또는 rhuMAb 2H7.v16 (삼각형)으로 처리하고, FACS로 분석하였다.15 shows the number of live unstained cells (per 10 s) plotted as a function of antibody concentration. Irrelevant IgG1 control antibody to Ramos cells in the presence of a crosslinking secondary antibody; treated with (Herceptin® circle), Rituximab (squares), or rhuMAb 2H7.v16 (triangles) and analyzed by FACS.
도 16, 17 및 18은 실시예 14에 기재하는 바와 같은 누드 마우스에서의 라지(Raji) 세포 종양 성장의 억제를 나타낸다. 동물을 PBS (대조군), 또는 리툭산® 또는 rhuMAb 2H7.v16을 5 mg/kg (도 16), 0.5 mg/kg (도 17) 또는 0.05 mg/kg (도 18)로 6 주 동안 매주 처리하였다 (수직 화살표로 나타낸 바와 같이 처리하였음; 군당 n=8인 마우스).16, 17 and 18 show inhibition of Raji cell tumor growth in nude mice as described in Example 14. Animals were treated with PBS (control), or Rituxan® or rhuMAb 2H7.v16 weekly at 5 mg / kg (FIG. 16), 0.5 mg / kg (FIG. 17) or 0.05 mg / kg (FIG. 18) for 6 weeks ( Treated as indicated by the vertical arrow; mice with n = 8 per group).
도 19는 실시예 15에 기재하는 바와 같이, 시노몰거스 원숭이 CD20의 뉴클레오티드 (서열 24) 및 아미노산 (서열 25) 서열을 나타낸다.FIG. 19 shows the nucleotide (SEQ ID NO: 24) and amino acid (SEQ ID NO: 25) sequences of cynomolgus monkey CD20, as described in Example 15.
도 20은 시노몰거스 원숭이 CD20의 아미노산 서열(서열 25)을 나타낸다. 인간 CD20과 상이한 잔기는 밑줄긋고, 인간 잔기(서열 26)를 원숭이 잔기의 아래에 직접 나타내었다. 원숭이 CD20의 추정되는 세포외 도메인은 볼체이다.20 shows the amino acid sequence of cynomolgus monkey CD20 (SEQ ID NO: 25). Residues different from human CD20 are underlined and human residues (SEQ ID NO: 26) are shown directly below the monkey residues. The putative extracellular domain of monkey CD20 is convex.
도 21은 실시예 15에 시재되는 바와 같은 hu2H7.v16, .v31 및 리툭산®에 결합하는 CD20을 발현하는 시노몰거스 원숭이 세포의 결과를 나타낸다. 항체를 시노 몰거스 CD20에 결합하는 FITC-접합된 뮤린 2H7과 결합하고 대체하는 능력에 대해 검정하였다.21 shows the results of cynomolgus monkey cells expressing CD20 binding to hu2H7.v16, .v31 and Rituxan® as described in Example 15. The antibody was assayed for its ability to bind and replace FITC-conjugated murine 2H7 that binds cynomolgus CD20.
도 22는 류마티스성 관절염 I/II기 임상 시험에 대한 투여량 증량 모형안을 나타낸다.22 shows a dose escalation model for rheumatoid arthritis stage I / II clinical trials.
도 23은 CHO 세포에서 2H7.v16의 발현을 위한 벡터를 나타낸다.Figure 23 shows a vector for expression of 2H7.v16 in CHO cells.
본 발명은 항-CD20 항체 및 B-세포 관련 질환의 치료에 있어서 이들의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to anti-CD20 antibodies and their use in the treatment of B-cell related diseases.
림프구는 백혈구의 여러 집단 중 하나이며; 이들은 구체적으로 외래 항원을 인지하고, 이에 반응한다. 림프구의 세가지 주요 부류는 B 림프구 (B 세포), T 림프구 (T 세포) 및 천연 킬러 (NK) 세포이다. B 림프구는 항체 생성에 원인이 되며, 체액 면역성을 제공한다. B 세포는 골수 내에서 성숙하고, 골수를 이탈하여 이들 세포 표면 상에 항원-결합 항체를 발현한다. 순전한 B 세포가 이의 막-결합된 항체에 특이적인 항원과 처음으로 마주쳤을 때, 상기 세포는 빠르게 분열하기 시작하고, 이의 자손을 기억 B 세포 및 "형질 세포"로 불리는 이펙터 세포로 분화시킨다. 기억 B 세포는 보다 긴 평균 수명을 가지고, 원래 모 세포와 동일한 특이성을 갖는 막-결합된 항체를 계속 발현한다. 형질 세포는 막 결합된 항체를 생성하지 못하는 대신 분비되는 형태의 항체를 생성한다. 분비된 항체는 체액 면역의 주요 이펙터 분자이다.Lymphocytes are one of several populations of white blood cells; They specifically recognize and respond to foreign antigens. The three main classes of lymphocytes are B lymphocytes (B cells), T lymphocytes (T cells), and natural killer (NK) cells. B lymphocytes contribute to antibody production and provide humoral immunity. B cells mature in the bone marrow and leave the bone marrow to express antigen-binding antibodies on these cell surfaces. When pure B cells first encounter antigens specific for their membrane-bound antibodies, the cells begin to divide rapidly and differentiate their progeny into memory B cells and effector cells called "trait cells". Memory B cells have a longer average life span and continue to express membrane-bound antibodies with the same specificities as the original parental cells. Plasma cells do not produce membrane bound antibodies but instead produce antibodies of the secreted form. Secreted antibodies are the major effector molecules of humoral immunity.
CD20 항원 (인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35로도 불림)은 분자량이 대략 35 kD인 프리-B 및 성숙한 B 림프구 상에 위치하는 소수성 횡막 단백질이다 (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989); 및 Einfeld et al. EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)). 상기 항원은 또한 B 세포 비-호지킨 림프종 (NHL)의 90% 초과에서 발현되나 (Anderson et al. Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)), 조혈 줄기 세포, 예비-B 세포, 정상 형질 세포 또는 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다 (Tedder et al. J. Immunol. 135 (2): 973-979 (1985)). CD20은 세포 주기 개시 및 분화를 위한 활성화 과정에서 초기 단계(들)을 조절하고 (Tedder et al., 상기 문헌), 가능하게는 칼슘 이온 채널로서 작용하는 것으로 생각된다 (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).CD20 antigen (human B-lymphocyte-limited differentiation antigen, also called Bp35) is a hydrophobic diaphragm protein located on pre-B and mature B lymphocytes with a molecular weight of approximately 35 kD (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989); and Einfeld et al. EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)). The antigen is also expressed in more than 90% of B cell non-Hodgkin's lymphoma (NHL) (Anderson et al. Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)), hematopoietic stem cells, pre-B cells, normal It is not found in plasma cells or other normal tissues (Tedder et al. J. Immunol. 135 (2): 973-979 (1985)). CD20 is thought to regulate the initial stage (s) in the activation process for cell cycle initiation and differentiation (Tedder et al., Supra) and possibly act as calcium ion channels (Tedder et al. J. Cell) Biochem. 14D: 195 (1990)).
B 세포 림프종에서 CD20이 발현되어, 이 항원은 상기 림프종을 치료하는데 유용한 치료적 표적이 되어 왔다. 미국에서 300,000명 이상이 B-세포 NHL을 앓고 있으며, 매년 56,000건 이상의 새로운 경우가 진단된다. 예를 들어, 인간 CD20 항원에 대한 유전자 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체인 리툭시맵 (리툭산 (RITUXAN)®) 항체 (제넨테크 인크. (Genentech, Inc.)로부터 구입가능함, South San Francisco, California, U.S.)는 재발성 또는 불응성 저등급 또는 난포성 CD20 양성, B 세포 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 사용된다. 리툭시맵은 1998년 4월 9일에 허여된 미국 특허 제5,736,137호 (Anderson et al.), 및 미국 특허 제5,776,456호에서는 "C2B8"로 언급된 항체이다. 작용의 시험관내 메카니즘 연구는 리툭산®이 인간 보체와 결합하여 림프구 B 세포주를 보체-의존성 세포독성 (CDC)을 통해 융해한다는 것을 입증하였다 (Reff at al, Blood 83 (2): 435-445 (1994)). 추가로, 이는 항체-의존성 세포매개 세포독성 (ADCC)에 대한 검정법에서 유의한 활성을 가진다. 생체 전임상 연구는 리툭산®이 아마도 보체 및 세포로 매개된 방법을 통해 시노몰거스 (Cynomolgus) 원숭이의 말초 혈액, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈한다는 것을 보여주었다 (Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)). NHL의 치료에 조치되는 다른 항-CD20 항체는 방사선 동위원소, 이트륨(Yttrium)-90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)에 연결된 뮤린 항체 제발린TM (ZevalinTM), I-131 (Corixa, WA)에 접합된 또다른 완전 뮤린 항체인 벡사 (Bexxar)TM를 포함한다.CD20 is expressed in B cell lymphomas, and this antigen has been a useful therapeutic target for treating such lymphomas. More than 300,000 people in the United States have B-cell NHL and over 56,000 new cases are diagnosed each year. For example, a Rituximab (RITUXAN® ) antibody (Genentech, Inc.), a genetically engineered chimeric murine / human monoclonal antibody to human CD20 antigen, available from South San Francisco , California, US) is used for the treatment of patients suffering from relapsed or refractory low grade or follicular CD20 positive, B cell non-Hodgkin's lymphoma. Rituximab is an antibody referred to as "C2B8" in US Pat. No. 5,736,137 to Anderson et al., Issued April 9, 1998, and US Pat. No. 5,776,456. In vitro mechanism studies of action have demonstrated that Rituxan® binds to human complement and fuses lymphocyte B cell lines through complement-dependent cytotoxicity (CDC) (Reff at al, Blood 83 (2): 435-445 (1994). )). In addition, it has significant activity in assays for antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC). In vivo preclinical studies have shown that Rituxan® depletes B cells from the peripheral blood, lymph nodes and bone marrow of Cynomolgus monkeys, perhaps via complement and cell mediated methods (Reff et al. Blood 83 (2) 435-445 (1994). Other anti -CD20 antibody action in the treatment of NHL is radioisotope, yttrium (Yttrium) -90 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA) murine antibody of claim valineTM (ZevalinTM) connected to, I-131 (Corixa, WA ) Is another fully murine antibody, Bexxar™ .
인간 치료법에서 뮤린 항체의 사용에 있어서 주요 제한점은 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응이다 (예를 들어 문헌 [Miller, R.A. et al. "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62: 988-995, 1983]; 및 [Schroff, R.W., et al. "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res., 45: 879-885, 1985). 설치동물 항체의 가변 (V) 도메인이 인간 불변 (C) 영역에 융합된 키메라 분자도 여전히 유의한 면역 반응을 야기할 수 있다 (HACA, 인간 항-키메라 항체) (Neuberger et al. Nature (Lond.), 314: 268-270, 1985). 모노클로날 항체의 임상적인 용도에서의 이러한 제한을 극복하기 위한 유력한 접근이 뮤린 항체 또는 비-인간 종으로부터의 항체의 "인간화"이다 (Jones et al. Nature (Lond), 321: 522-525, 1986; Riechman et al., Nature (Lond), 332: 323-327, 1988).A major limitation in the use of murine antibodies in human therapy is the human anti-mouse antibody (HAMA) response (see, eg, Miller, RA et al. "Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma" Blood, 62: 988-995, 1983; and Schroff, RW, et al. "Human anti-murine immunoglobulin response in patients receiving monoclonal antibody therapy" Cancer Res., 45: 879-885, 1985). Chimeric molecules in which the variable (V) domains of rodent antibodies have been fused to human constant (C) regions can still cause significant immune responses (HACA, human anti-chimeric antibodies) (Neuberger et al. Nature (Lond. ), 314: 268-270, 1985). A viable approach to overcome this limitation in the clinical use of monoclonal antibodies is the "humanization" of murine antibodies or antibodies from non-human species (Jones et al. Nature (Lond), 321: 522-525, 1986; Riechman et al., Nature (Lond), 332: 323-327, 1988).
따라서, 특히 만성 치료를 위해 환자에게 투여하는 경우, 항원성이 최소이거나 없는 CD20 항원에 대한 치료적인 항체를 생성하는 것이 유리하다. 본 발명은 이러한 요구 및 그밖의 요구를 만족시킨다. 본 발명은 현재의 치료 조성물의 제한점을 극복하고, 하기 발명의 상세한 설명으로부터 분명해지는 추가 이점을 제공하는 항-CD20 항체를 제공한다.Thus, it is advantageous to produce therapeutic antibodies against CD20 antigens with minimal or no antigenicity, especially when administered to patients for chronic treatment. The present invention satisfies these and other needs. The present invention provides anti-CD20 antibodies that overcome the limitations of current therapeutic compositions and provide additional advantages that will become apparent from the following detailed description.
발명의 요약Summary of the Invention
본 발명은 CD20 결합 항체 또는 이의 기능적 단편 및 B-세포 관련 질환의 치료에서 이들의 용도를 제공한다. 이들 항체는 모노클로날 항체이다. 구체적인 실시양태에서, CD20과 결합하는 항체는 인간화되거나 키메라이다. 인간화 2H7 변이체는 FR에 아미노산 치환을 갖는 변이체 및 이식된 CDR에 변화를 갖는 친화성 돌연변이 변이체를 포함한다. CDR 또는 FR 중에 치환된 아미노산은 공여자 또는 수여자 항체에 존재하는 아미노산에 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체는 향상된 CDC 및(또는) ADCC 기능 및 B-세포 사멸 (또한 본원에서 B- 세포 고갈로서 언급됨)을 비롯한 개선된 이펙터 기능을 가져오는 Fc 영역에서 아미노산 잔기에 변화를 추가로 포함한다. 그 밖의 본 발명의 항-CD20 항체는 안정성을 개선하는 특이적인 변화를 갖는 항체를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 안정성이 증가된 인간화 2H7 변이체는 하기 실시예 6에 기재되어 있다. 또한, 생체내에서 개선된 ADCC 기능을 갖는 푸코스 결핍 변이체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 키메라 항-CD20 항체는 뮤린 V 영역 및 인간 C 영역을 가진다. 이러한 구체적인 키메라 항-CD20 항체는 리툭산® (리툭시맵®, 제넨테크 인크.)이다.The present invention provides their use in the treatment of CD20 binding antibodies or functional fragments thereof and B-cell related diseases. These antibodies are monoclonal antibodies. In specific embodiments, the antibody that binds CD20 is humanized or chimeric. Humanized 2H7 variants include variants with amino acid substitutions in the FR and affinity mutant variants with changes in the implanted CDRs. The amino acids substituted in the CDRs or FRs are not limited to the amino acids present in the donor or recipient antibody. In other embodiments, the anti-CD20 antibodies of the invention are in an Fc region that results in improved effector function, including enhanced CDC and / or ADCC function and B-cell death (also referred to herein as B-cell depletion). It further comprises a change in the amino acid residue. Other anti-CD20 antibodies of the invention include antibodies with specific changes that improve stability. In specific embodiments, humanized 2H7 variants with increased stability are described in Example 6 below. Also provided are fucose deficient variants with improved ADCC function in vivo. In one embodiment, the chimeric anti-CD20 antibody has a murine V region and a human C region. Such specific chimeric anti-CD20 antibodies are Rituxan® (Rituximab® , Genentech Inc.).
본 발명의 항체 조성물 및 사용 방법 모두의 바람직한 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체는 각각 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같은 서열 21 및 22의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 2H7.v16이다. 도 6, 7 및 8에서 폴리펩티드 서열을 언급하는 경우, 이는 분비 신호 서열을 형성하는 처음 19 개 정도의 아미노산이 성숙한 폴리펩티드에는 존재하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 버젼 16을 기재로 하는 모든 다른 변이체의 V 영역은 공개문헌에서 지적된 아미노산 치환을 제외한 위치에서 v16의 아미노산 서열을 가질 것이다. 달리 지시하지 않는 한, 2H7 변이체는 v16과 동일한 L 쇄를 가질 것이다.In a preferred embodiment of both the antibody compositions and methods of use of the invention, the humanized CD20 binding antibody is 2H7.v16 having the light and heavy chain amino acid sequences of SEQ ID NOs: 21 and 22, respectively, as shown in FIGS. 6 and 7. When referring to the polypeptide sequences in FIGS. 6, 7 and 8, it should be understood that the first 19 or so amino acids that form the secretory signal sequence are not present in the mature polypeptide. The V region of all other variants based on
본 발명은 생체내 영장류 B 세포를 고갈시키는데 효과적이고, H 쇄 가변 영역 (VH)에서 항-인간 CD20 항체로부터의 적어도 서열 12의 CDR3 서열 및 실질적으로 인간 중쇄 아군 III (VHIII)의 인간 컨센서스 프레임워크 (FR) 잔기를 포함하는, 인간 CD20 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 영장류 B 세포는 인간 및 시노몰거스 원숭이로부터 유래한다. 하나의 실시양태에서, 상기 항체는 서열 10의 CDR1 서열 및 서열 11의 CDR2 서열인 H 쇄 CDR 서열을 추가로 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 항체는 서열 4의 CDR1 서열, 서열 5의 CDR2 서열, 서열 6의 CDR3 서열인 L 쇄 CDR 서열을 실질적으로 인간 경쇄 κ 아군 I (VκI)의 인간 컨센서스 프레임워크 (FR) 잔기와 함께 포함한다. 바람직한 실시양태에서, VL 중 FR 영역은 위치 46에서 공여자 항체 잔기를 가지며; 구체적인 실시양태에서, VL 중 FR 영역은 leuL46pro의 아미노산 치환을 갖는다 (인간 κI 컨센서스 서열 중 leu이 m2H7에서 상응하는 위치에 존재하는 pro로 변화되었음). VH 영역은 프레임워크에서 적어도 아미노산 위치 49, 71 및 73에서 공여자 항체 잔기를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, VH에서는 인간 중쇄 아군 III 중 하기 FR 위치가 치환된다: FR2에서는 AlaH49Gly; FR3에서는 ArgH71Val 및 AsnH73Lys. 또다른 실시양태에서, 인간화 항체에서 CDR 영역은 잔기가 공여자 및 수여자 항체 중 어떤 것에서도 유래하지 않은 아미노산 치환을 추가로 포함한다.The present invention is effective for depleting primate B cells in vivo, wherein the CDR3 sequence of at least SEQ ID NO: 12 from an anti-human CD20 antibody in the H chain variable region (VH ) and substantially human heavy chain subgroup III (VH III) human Provided are humanized antibodies that bind to human CD20 or antigen-binding fragments thereof comprising consensus framework (FR) residues. In one embodiment, primate B cells are from human and cynomolgus monkeys. In one embodiment, the antibody further comprises an H chain CDR sequence that is a CDR1 sequence of SEQ ID NO: 10 and a CDR2 sequence of SEQ ID NO: 11. In another embodiment, the antibody comprises a L chain CDR sequence that is a CDR1 sequence of SEQ ID NO: 4, a CDR2 sequence of SEQ ID NO: 5, a CDR3 sequence of SEQ ID NO: 6 substantially human consensus framework (FR) of human light chain κ subgroup I (VκI). Include with residues. In a preferred embodiment, the FR region in VL has a donor antibody residue at position 46; In a specific embodiment, the FR region in VL has an amino acid substitution of leuL46pro (wherein leu in the human κI consensus sequence has been changed to pro present at the corresponding position in m2H7). The VH region further comprises a donor antibody residue at at amino acid positions 49, 71 and 73 in the framework. In one embodiment, the following FR positions in human heavy chain subgroup III are substituted in VH : AlaH49Gly in FR2; In FR3, ArgH71Val and AsnH73Lys. In another embodiment, the CDR regions in the humanized antibody further comprise amino acid substitutions whose residues are not from any of the donor and recipient antibodies.
상기 실시양태의 항체는 도 1b에 나타낸 바와 같은 v16의 서열 8의 VH 서열을 추가로 포함한다. 상기 실시양태의 추가 실시양태에서, 상기 항체는 도 1a에 나타낸 바와 같은 v16의 서열 2의 VL 서열을 추가로 포함한다.The antibody of this embodiment further comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 8 of v16 as shown in FIG. 1B. In further embodiments of the above embodiments, the antibody further comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 2 of v16 as shown in FIG. 1A.
또다른 실시양태에서, 인간화 항체는 각각 도 6 및 도 8에 나타낸 바와 같은 서열 21 및 23의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 2H7.v31이며; 2H7.v31은 도 8에 나타낸 바와 같은 서열 23의 중쇄 아미노산 서열을 갖고; 2H7.v96은 v16의 H 쇄 중 D56A 및 N100A 및 L 쇄 중 S92A의 아미노산 치환을 가진다.In another embodiment, the humanized antibody is 2H7.v31 having light and heavy chain amino acid sequences of SEQ ID NOs: 21 and 23 as shown in FIGS. 6 and 8, respectively; 2H7.v31 has a heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 as shown in FIG. 8; 2H7.v96 has amino acid substitutions of D56A in the H chain of v16 and S92A in the N100A and L chains.
별개의 실시양태에서, 상기 실시양태 중 어느 하나의 항체는 대부분의 경우에서 비교되는 모 항체인 v16 및 다른 경우에서 리툭산인, 유도된 원래 또는 모 항체보다 ADCC 및(또는) CDC 활성을 개선시키는 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 개선된 활성을 갖는 하나의 상기 항체는 Fc 영역에 S298A/E333A/K334A의 삼중 알라닌 치환을 포함한다. S298A/E333A/K334A 치환을 갖는 하나의 항체는 서열 23의 중쇄 아미노산 서열을 갖는 2H7.v31이다. 항체 2H7.v114 및 2H7.v115는 리툭산®과 비교하여 적어도 10배 개선된 ADCC 활성을 나타낸다.In a separate embodiment, the antibody of any one of the above embodiments is an Fc that improves ADCC and / or CDC activity over the original or parent antibody derived, v16, which in most cases is the parent antibody compared to v16 and in other cases, Rituxan One or more amino acid substitutions in the region. One such antibody with improved activity comprises a triple alanine substitution of S298A / E333A / K334A in the Fc region. One antibody with the S298A / E333A / K334A substitution is 2H7.v31 with the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 23. Antibodies 2H7.v114 and 2H7.v115 show at least 10-fold improved ADCC activity compared to Rituxan® .
또다른 실시양태에서, 상기 항체는 대부분의 경우에서 v16인, 유도된 모 항체와 비교하여 CDC 활성을 감소시키는 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. v16과 비교하여 CDC 활성이 감소된 하나의 상기 항체는 H 쇄에 적어도 치환 K322A를 포함한다. ADCC 및 CDC 활성의 비교는 실시예에 기술한 바와 같이 검정할 수 있다.In another embodiment, the antibody further comprises one or more amino acid substitutions in the Fc region that reduce CDC activity as compared to the induced parental antibody, which in most cases is v16. One such antibody with reduced CDC activity as compared to v16 comprises at least the substitution K322A in the H chain. Comparison of ADCC and CDC activity can be assayed as described in the Examples.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 전장 항체이고, 여기서 VH 영역이 인간 IgG 중쇄 불변 영역과 연결된다. 바람직한 실시양태에서, IgG는 인간 IgG1 또는 IgG3이다.In a preferred embodiment, the antibody of the invention is a full length antibody, wherein the VH region is linked with a human IgG heavy chain constant region. In a preferred embodiment, the IgG is human IgG1 or IgG3.
하나의 실시양태에서, CD20 결합 항체는 세포독성제와 접합된다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 독소 또는 방사선 동위원소이다.In one embodiment, the CD20 binding antibody is conjugated with a cytotoxic agent. In a preferred embodiment, the cytotoxic agent is a toxin or radioisotope.
하나의 실시양태에서, 치료 또는 진단을 목적으로 사용하기 위한 본 발명의 항체는 CHO 세포에서 생성한다.In one embodiment, the antibodies of the invention for use for therapeutic or diagnostic purposes are produced in CHO cells.
또한, 상기 실시양태 중 어느 하나의 항체, 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 담체는 제약상 허용가능한 담체이다. 이들 조성물은 제품 또는 키트로 제공될 수 있다.Also provided are compositions comprising the antibody of any one of the above embodiments, and a carrier. In one embodiment, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier. These compositions may be provided as a product or a kit.
본 발명은 또한 20 mg/mL 항체의 인간화 2H7 항체, 10 mM 히스티딘 술페이트 pH 5.8, 60 mg/ml 수크로스 (6%), 0.2 mg/ml 폴리소르베이트 20 (0.02%)을 포함하는 액체 제제를 제공한다.The present invention also provides a liquid formulation comprising a humanized 2H7 antibody of 20 mg / mL antibody, 10 mM histidine sulfate pH 5.8, 60 mg / ml sucrose (6%), 0.2 mg / ml polysorbate 20 (0.02%) To provide.
본 발명은 또한 본원에 항체를 발현하기 위한 발현 벡터를 비롯한, 본원에 개시된 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.The invention also provides an isolated nucleic acid encoding any of the antibodies disclosed herein, including expression vectors for expressing the antibodies herein.
본 발명의 또다른 측면은 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포, 및 항체를 생산하는 숙주 세포이다. 후자의 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 항체를 생성하는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 이들 항체를 생성하는 방법을 제공한다.Another aspect of the invention is a host cell comprising the nucleic acid, and a host cell producing the antibody. In the latter preferred embodiment, the host cell is a CHO cell. A method of producing these antibodies is provided, comprising culturing the host cell producing the antibody and recovering the antibody from the cell culture.
또한, 본 발명의 또다른 측면은 용기 및 이에 함유되는 조성물을 포함하는 제품이며, 여기서 조성물은 상기 실시양태 중 어느 하나의 항체를 포함한다. NHL을 치료하는데 사용하기 위해, 제품은 상기 조성물이 비-호지킨 림프종을 치료하는데 사용하는 것임을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함한다.Still another aspect of the invention is a product comprising a container and a composition contained therein, wherein the composition comprises an antibody of any one of the above embodiments. For use in treating NHL, the product further comprises a package insert indicating that the composition is for use in treating non-Hodgkin's lymphoma.
본 발명의 추가 측면은 상기 항체 중 어느 하나를 B 세포와 접촉시켜 이에 따라 B 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는, 생체 내에서 B 세포 중 아폽토시스를 유도하는 방법이다.A further aspect of the invention is a method of inducing apoptosis in B cells in vivo, comprising contacting any one of the antibodies with the B cells and thus killing the B cells.
본 발명은 또한 본원에 개시되는 질환을 앓고 있는 인간 환자와 같은 포유동물에게 CD20 결합 항체 또는 이의 기능적 단편을 투여하여 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 자가면역 질환 또는 CD20 양성 암을 치료하기 위한 임의의 방법중 하나의 실시양태에서 항체는 각각 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같은 서열 21 및 22의 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 갖는 2H7.v16이다. 따라서, 하나의 실시양태는 치료 유효량의 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 암을 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, CD20 양성 암을 치료하는 방법이다. 바람직한 실시양태에서, CD20 양성 암은 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 림프구 우세형 호지킨 질환 (LPHD), 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 SLL을 비롯한 B 세포 림프종 또는 백혈병이다. B 세포 림프종 또는 백혈병의 치료 방법의 하나의 실시양태에서, 항체는 약 275 내지 375 mg/m2의 범위의 투여량으로 투여한다. 추가 실시양태에서, 치료 방법은 하나 이상의 화학요법제를 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 비-호지킨 림프종 (NHL)을 위해 화학요법제는 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론으로 이루어진 군으로부터 선택된다.The invention also provides a method of treating such a disease by administering a CD20 binding antibody or functional fragment thereof to a mammal, such as a human patient suffering from a disease disclosed herein. In one embodiment of any of the methods for treating an autoimmune disease or CD20 positive cancer, the antibody is 2H7.v16 having the light and heavy chain amino acid sequences of SEQ ID NOs: 21 and 22, respectively, as shown in FIGS. 6 and 7. Thus, one embodiment is a method of treating a CD20 positive cancer comprising administering a therapeutically effective amount of a humanized CD20 binding antibody of the invention to a patient suffering from cancer. In a preferred embodiment, the CD20 positive cancer is B cell lymphoma or leukemia, including non-Hodgkin's lymphoma (NHL) or lymphocyte predominant Hodgkin's disease (LPHD), chronic lymphocytic leukemia (CLL) or SLL. In one embodiment of the method of treating B cell lymphoma or leukemia, the antibody is administered at a dosage ranging from about 275 to 375 mg / m2 . In further embodiments, the method of treatment further comprises administering one or more chemotherapeutic agents to the patient, wherein the chemotherapeutic agent for non-Hodgkin's lymphoma (NHL) is doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine, and prednisolone It is selected from the group consisting of.
또한, 치료 유효량의 상기 중 어느 한 인간화 CD20 결합 항체를 자가면역 질환을 앓는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제 공한다. 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 유년형 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 베게너병, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증근육무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 자가면역 질환이 류마티스성 관절염인 경우, 항체는 바람직하게는 메토트렉세이트인 제2 치료제와 함께 투여할 수 있다.Also provided are methods of treating an autoimmune disease comprising administering a therapeutically effective amount of any one of the above humanized CD20 binding antibodies to a patient suffering from autoimmune disease. Autoimmune diseases include rheumatoid arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), Wegener's disease, inflammatory bowel disease, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), autoimmune Thrombocytopenia, multiple sclerosis, psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathy, myasthenia gravis, vasculitis, diabetes, Raynaud's syndrome, Sjogren's syndrome and glomerulonephritis. If the autoimmune disease is rheumatoid arthritis, the antibody may be administered with a second therapeutic agent, preferably methotrexate.
이들 치료 방법에서, CD20 결합 항체는 단독으로 또는 제2 치료제, 예컨대 2차 항체, 또는 화학요법제 또는 면역억제제와 함께 투여할 수 있다. 2차 항체는 CD20 또는 상이한 B 세포 항원, 또는 NK 세포 또는 T 세포 항원와 결합하는 항체일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 2차 항체는 방사선표지된 항-CD20 항체이다. 또다른 실시양태에서, CD20 결합 항체는 독소 또는 방사선 동위원소를 비롯한 세포독성제와 접합된다.In these methods of treatment, the CD20 binding antibody can be administered alone or in combination with a second therapeutic agent, such as a secondary antibody, or a chemotherapeutic or immunosuppressive agent. The secondary antibody may be an antibody that binds to CD20 or different B cell antigens, or NK cell or T cell antigens. In one embodiment, the secondary antibody is a radiolabeled anti-CD20 antibody. In another embodiment, the CD20 binding antibody is conjugated with a cytotoxic agent, including toxins or radioisotopes.
또다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 CD20 결합 항체를 피부근육염, 베게너 육아종증, ANCA, 재생불량 빈혈, 자가면역성 용혈 빈혈 (AIHA), 인자 VIII 결핍, 혈우병 A, 자가면역성 호중성백혈구감소증, 캐슬맨 증후군, 굿패스쳐 증후군, 고형 기관 장기이식 거부, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), IgM 매개성 질환, 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 하시모토 갑상샘염, 자가면역성 간염, 림프구 간질성 폐렴 (HIV), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식조직) vs. NSIP, 길랑-바레 증후군, 대혈관 혈관염, 거대 세포 동맥염 (다까야스 동맥염), 중혈관 혈관염, 가와사끼병, 다중결절동맥염으로부터 선택되는 자가면역 질환을 앓는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법의 하나의 실시양태에서, CD20 결합 항체는 리툭산®이다.In another aspect, the present invention provides therapeutically effective amounts of CD20 binding antibodies for dermatitis, Wegener's granulomatosis, ANCA, aplastic anemia, autoimmune hemolytic anemia (AIHA), factor VIII deficiency, hemophilia A, autoimmune neutropenia, Castleman syndrome, Goodpasture syndrome, solid organ transplant rejection, graft-versus-host disease (GVHD), IgM-mediated disease, thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), Hashimoto thyroiditis, autoimmune hepatitis, lymphocyte interstitial pneumonia ( HIV), obstructive bronchiolitis (non-graft tissue) vs. Treating the disease, comprising administering to a patient with an autoimmune disease selected from NSIP, Guillain-Barré syndrome, macrovascular vasculitis, giant cell arteritis (Dakayasu's arteritis), vascular vasculitis, Kawasaki disease, multiple nodule arteritis Provide a way to. In one embodiment of the method, the CD20 binding antibody is Rituxan® .
본 발명은 또한 시노몰거스 원숭이 CD20의 서열 24의 뉴클레오티드 서열 (도 19) 또는 이 서열의 다의성 변이체를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 하나의 실시양태는 서열 25 (도 20) 또는 보존적인 아미노산 치환을 갖는 서열 25 (도 20)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 또다른 실시양태는 숙주 세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 비롯한, 상기 핵산을 포함하는 벡터이다. 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 포함된다. 또한, 시노몰거스 원숭이 CD20의 아미노산 서열 [서열 25; 도 20]을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.The invention also provides an isolated nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 of FIG. Cynomolgus monkey CD20 (FIG. 19) or polymorphic variants of this sequence. One embodiment includes a sequence encoding a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 (FIG. 20) or SEQ ID NO: 25 having conservative amino acid substitutions. Another embodiment is a vector comprising said nucleic acid, including an expression vector for expression in a host cell. Also included are host cells comprising the vector. Furthermore, the amino acid sequence of cynomolgus monkey CD20 [SEQ ID NO: 25; 20 provides an isolated polypeptide comprising.
발명의 바람직한 실시태양의 상세한 설명Detailed Description of the Preferred Embodiments of the Invention
"CD20" 항원은 말초 혈액 또는 림프구 기관으로부터 90% 이상의 B 세포 표면상에서 발견되는 분자량이 대략 35 kD인 비-글리코실화 막횡단 인단백질이다. CD20은 초기 프리-B 세포 발달 동안 발현되고, 형질 세포 분화때까지 남아있으며; 이는 인간 줄기 세포, 림프구 전구 세포 또는 정상 형질 세포 상에는 발견되지 않는다. CD20은 정상 B 세포 뿐만 아니라 악성 B 세포 모두에 존재한다. 참고문헌에서 CD20에 대한 다른 명칭은 "B-림프구-제한된 분화 항원" 및 "Bp35"를 포함한 다. CD20 항원은 예를 들어, 문헌 [Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52: 81-149 (1989)] 및 [Valentine et al. J. Biol. Claem. 264 (19): 11282-11287 (1989)]에 기재되어 있다.The "CD20" antigen is a non-glycosylated transmembrane phosphoprotein with a molecular weight of approximately 35 kD found on at least 90% B cell surface from peripheral blood or lymphocyte organs. CD20 is expressed during early pre-B cell development and remains until plasma cell differentiation; It is not found on human stem cells, lymphocyte progenitor cells or normal plasma cells. CD20 is present in both normal B cells as well as malignant B cells. Other names for CD20 in the references include "B-lymphocyte-limited differentiation antigen" and "Bp35". CD20 antigens are described, for example, in Clark and Ledbetter, Adv. Can. Res. 52: 81-149 (1989) and Valentine et al. J. Biol. Claem. 264 (19): 11282-11287 (1989).
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는, 목적하는 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 한 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 다중특이성 항체 (예를 들어 이중특이성 항체) 및 항체 단편을 포함한다.The term “antibody” is used in its broadest sense and specifically includes monoclonal antibodies (including full-length monoclonal antibodies), multispecific antibodies (eg bispecific antibodies) and antibodies as long as they exhibit the desired biological activity or function. Contains fragments.
본 발명의 CD20 결합 항체 및 인간화 CD20 결합 항체의 생물학적 활성은 적어도 항체의 인간 CD20과의 결합, 보다 바람직하게는 인간 및 기타 영장류 (시노몰거스 원숭이, 레수스 원숭이, 침팬지 포함) CD20과의 결합을 포함할 것이다. 항체는 Kd 값이 1 × 10-8을 이하, 바람직하게는 약 1 × 10-9 이하로 CD20과 결합하여, 생체내에서 바람직하게는 상기 항체로 치료하지 않은 적절한 음성 대조군과 비교하였을 때, 20% 이상 B 세포를 사멸시키거나 고갈시킬 수 있다. B 세포 고갈은 하나 이상의 ADCC, CDC, 아폽토시스 또는 그 밖의 메카니즘의 결과일 수 있다. 본원에서 질환 치료의 일부 실시양태에서, 특이적인 이펙터 기능 또는 메카니즘은 인간화 2H7의 다른 변이체에 대해 바람직할 수 있으며, 인간화 2H7의 특정 변이체가 이들 생물학적 기능, 예컨대 ADCC를 달성하는데 바람직하다.The biological activity of the CD20 binding antibody and humanized CD20 binding antibody of the present invention is to at least bind the antibody to human CD20, more preferably to human and other primates (including cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees) CD20 Will include. The antibody has a Kd value of 1 × 10−8 or less, preferably about 1 × 10−9 or less, which binds to CD20 and is 20 in comparison with an appropriate negative control which is preferably not treated with the antibody in vivo. More than% B cells can be killed or depleted. B cell depletion may be the result of one or more ADCC, CDC, apoptosis or other mechanisms. In some embodiments of disease treatment herein, specific effector functions or mechanisms may be desirable for other variants of humanized 2H7, with certain variants of humanized 2H7 being preferred to achieve these biological functions, such as ADCC.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 전장 항체의 항원 결합 영역 또는 이의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형 성된 다중특이적 항체가 있다.An “antibody fragment” includes a portion of a full length antibody, generally the antigen binding region or variable region thereof. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab')2 and Fv fragments; Diabody; Linear antibodies; Single chain antibody molecules; And multispecific antibodies formed from antibody fragments.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 비-공유 결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 구성된다. 이들 두 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H쇄 및 L쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 CDR을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다."Fv" is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen-recognition site and an antigen-binding site. This fragment consists of a dimer in which one heavy chain variable region domain and one light chain variable region domain are tightly linked to each other by non-covalent bonds. These two domains are folded to form six hypervariable loops (three loops from the H and L chains), which provide amino acid residues for antigen binding and impart antigen binding specificity to the antibody. However, even one variable domain (or half of the Fv containing only three CDRs specific for the antigen), although less affinity than the entire binding site, has the ability to recognize and bind antigens.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 또한, 전형적으로 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 동종 집단의 항체로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 [예를 들 어, 미국 특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.As used herein, the term “monoclonal antibody” means an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, ie, the individual antibodies that make up this population, except for possible naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Is the same. Monoclonal antibodies are highly specific for a single antigenic site. Furthermore, in contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations that typically include several antibodies directed against several determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. The modifier “monoclonal” refers substantially to the properties of the antibody obtained from an antibody of a homogeneous population and should not be construed to mean that antibody production is required by any particular method. For example, the monoclonal antibodies used according to the invention can be prepared by the hybridoma method first described in Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), or by recombinant DNA methods (See, eg, US Pat. No. 4,816,567). In addition, “monoclonal antibodies” are described, for example, in Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and in Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), can also be isolated from phage antibody libraries.
본 발명의 CD20 결합 항체의 "기능적 단편"은 무손상 전장 분자로부터 유도되고, 상기 전장 분자와 실질적으로 동일한 친화성으로 CD20과 결합을 지속하며, 본원에 기재되는 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정법으로 측정되는 B 세포 고갈을 비롯한 생물학적 활성을 나타내는 이들의 단편이다.A "functional fragment" of a CD20 binding antibody of the invention is derived from an intact full-length molecule and continues to bind CD20 with substantially the same affinity as the full-length molecule, and in vitro or in vivo as described herein. Fragments thereof which exhibit biological activity including the measured B cell depletion.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 단편들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 한정한다. 그러나, 이러한 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신에, V 영역은 길이가 9 내지 12개 아미노산이며 가변성이 극도로 높아 "초가변 영역"으로 불리는 보다 짧은 영역에 의해 분리되어 있는, 15 내지 30개 아미노산으로 구성된 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 비교적 불변성인 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 β-쉬이트 구조를 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 상기 FR은 β-쉬이트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는 상기 β-쉬이트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 초가변 영역들은 FR에 의해 서로 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포매개 세포독성(ADCC)에 항체가 참여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.The term "variable" refers to the fact that certain fragments of the variable domains exhibit a wide range of sequence differences between antibodies. The V domain mediates antigen binding and defines the specificity of a particular antibody for a particular antigen. However, this variability is not evenly distributed throughout the 110 amino acids of the variable domain. Instead, the V region is called a framework region (FR) consisting of 15 to 30 amino acids, 9 to 12 amino acids in length and extremely highly variable, separated by shorter regions called "hypervariable regions". It consists of a relatively invariant stretch. The variable domains of each of the natural heavy and light chains predominantly comprise a β-sheet structure and comprise four FRs linked by three hypervariable regions, which FR connect the β-sheet structure, and in some cases the A loop forms to form part of the β-sheet structure. The hypervariable regions in each chain are located close to each other by the FRs, and the hypervariable regions from the other chain contribute to the formation of the antigen-binding site of the antibody (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest). , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). The constant domains are not directly involved in binding the antibody to the antigen, but exhibit various effector functions such as the antibody's involvement in antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC).
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는, 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 일반적으로, 이러한 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL 내의 잔기 약 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 부근 및 VH 내의 잔기 약 31 내지 35B (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3) 부근 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL 내의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3) 및 VH 내의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3) [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다.As used herein, the term "hypervariable region" refers to an amino acid residue of an antibody that is responsible for antigen-binding. Generally, such hypervariable regions are amino acid residues from the "complementarity determining regions" or "CDRs" (eg, residues in VL about 24 to 34 (L1), 50 to 56 (L2) and 89 to 97 (L3). ) And around 31 to 35B (H1), 50 to 65 (H2) and 95 to 102 (H3) residues in VH [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) and / or amino acid residues from "hypervariable loops" (eg, residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91 in VL ). To 96 (L3) and residues 26 to 32 (H1), 53 to 55 (H2) and 96 to 101 (H3) in VH (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)) It includes.
본원에서 언급되는 "컨센서스 서열" 또는 컨센서스 V 도메인 서열은 공지된 인간 이뮤노글로불린 가변 영역 서열의 아미노산 서열의 비교로부터 유도된 인공적인 서열이다. 이러한 비교에 기초하여, 인간 κ 및 인간 H 쇄 아군 III V 도메인으로부터 유래된 서열의 컨센서스인 V 도메인 아미노산을 코딩하는 재조합 핵산 서열을 제조하였다. 컨센서스 V 서열은 어떠한 공지된 항체 결합 특이성 또는 친화 성을 가지지 않는다.As used herein, a “consensus sequence” or consensus V domain sequence is an artificial sequence derived from a comparison of amino acid sequences of known human immunoglobulin variable region sequences. Based on this comparison, recombinant nucleic acid sequences encoding V domain amino acids, which are consensus of sequences derived from human κ and human H chain subgroup III V domains, were prepared. Consensus V sequences do not have any known antibody binding specificity or affinity.
"키메라" 항체 (이뮤노글로불린)은 특정 종으로부터 유래되었거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있으며, 상기 쇄의 나머지 부분은 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 다른 종으로부터 유래되었거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라, 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부를 가진다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서 사용되는 인간화 항체는 키메라의 하위부류이다.A “chimeric” antibody (immunoglobulin) is identical or homologous with the corresponding sequence of an antibody derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, and the rest of the chain exhibits the desired biological activity. As well as antibodies from other species or belonging to different antibody classes or subclasses, as well as portions of heavy and / or light chains identical or homologous to the corresponding sequences of said antibody fragments (US Pat. No. 4,816,567; and See Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984). Humanized antibodies as used herein are a subclass of chimeras.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수여자 또는 수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 Fc 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화도를 더 증진시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 전체 또는 실질적으로 전체 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 Fc 영역이 결합 친화도를 향상시키는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있으나, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. FR 중 이들 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에서 6 이하, L 쇄에서는 3 이하이다. 또한, 인간화 항체는 경우에 따라 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al.,Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.A “humanized” form of a non-human (eg murine) antibody is a chimeric antibody containing a minimal sequence derived from a non-human antibody. In most cases, humanized antibodies are hypervariable in non-human species (donor antibodies), such as mice, rats, rabbits or non-human primates, in which residues in the hypervariable region of the recipient possess the desired antibody specificity, affinity, and ability. Human immunoglobulin (recipient or recipient antibody) replaced with a residue in the region. In some cases, the Fc framework region (FR) residues of human immunoglobulins are replaced with corresponding non-human residues. Humanized antibodies may also include residues not found in the recipient antibody or the donor antibody. Such modifications further enhance antibody performance, such as binding affinity. In general, humanized antibodies will comprise substantially all of one or more, typically two, variable domains, wherein the whole or substantially whole hypervariable loops correspond to the hypervariable loops of non-human immunoglobulins and the Fc region All or substantially all FRs may comprise FRs of the human immunoglobulin sequence, although one or more amino acids may enhance this binding affinity. The number of these amino acid substitutions in the FR is typically 6 or less in the H chain and 3 or less in the L chain. In addition, the humanized antibody will optionally comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically at least a portion of a human immunoglobulin. For more details, see Jones et al.,Nature 321: 522-525 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
항체의 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 말하고, 항체 이소타입에 따라 달라진다. 항체 Fc 영역이 항체 이소타입을 또한 결정한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포매개 세포독성 (ADCC); 대식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절 및 B 세포 활성화가 포함된다.The "effector function" of an antibody refers to the biological activity attributable to the Fc region (natural sequence Fc region or amino acid sequence variant Fc region) of an antibody, and depends on the antibody isotype. The antibody Fc region also determines the antibody isotype. Examples of antibody effector functions include C1q binding and complement-dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC); Phagocytosis; Down regulation of cell surface receptors (eg, B cell receptor) and B cell activation.
"항체-의존성 세포매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포의 "아암 (arm)"이고 이러한 세포 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세 포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 추가로, 대상 분자의 ADCC 활성은 문헌 [Clynes et al., (USA) 95:652-656 (1998)] 등에 개시된 바와 같은 동물 모델 등에서 생체내 평가할 수 있다.“Antibody-dependent cytotoxic cytotoxicity” or “ADCC” refers to the secretion Ig bound to the Fc receptor (FcR) present on certain cytotoxic cells (eg, natural killer (NK) cells, neutrophils and macrophages). By a cytotoxic effector cell specifically bound to a target cell bearing an antigen, it refers to a cytotoxic form that allows the target cell to be killed by a cytotoxin. Antibodies are the "arms" of cytotoxic cells and are absolutely necessary for such cell death. NK cells, primary cells that mediate ADCC, express only FcγRIII, whereas monocytes express FcγRI, FcγRII and FcγRIII. FcR expression on hematopoietic cells is described by Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)], summarized in Table 3 on page 464. To assess ADCC activity of a subject molecule, in vitro ADCC assays can be performed as described in US Pat. No. 5,500,362 or 5,821,337. Effector cells useful for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells. Alternatively or in addition, ADCC activity of the subject molecule can be assessed in vivo in animal models and the like as disclosed in Clynes et al., (USA) 95: 652-656 (1998) and the like.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합되는 수용체를 의미한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 이것으로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체와 다르게 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체에는 주로 이의 세포질 도메인이 여러가지 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (개관을 위해서는 문헌 [M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)]을 참조). FcR에 대한 개관을 위해서는 문헌 ([Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)], [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]을 참조한다. 추후로 확 인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어에는 모체 IgG를 태아에게 전달시키는 신생아 수용체 FcRn도 포함된다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])."Fc receptor" or "FcR" refers to a receptor that binds to the Fc region of an antibody. Preferred FcRs are native sequence human FcRs. In addition, preferred FcRs are receptors (gamma receptors) that bind IgG antibodies, which include receptors of the FcγRI, FcγRII and FcγRIII subclasses, which include splice forms that differ from allelic variants of these receptors. . FcγRII receptors mainly include FcγRIIA (“activating receptor”) and FcγRIIB (“inhibiting receptor”), whose cytoplasmic domains have various similar amino acid sequences. The activating receptor FcγRIIA contains an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain. The inhibitory receptor FcγRIIB contains an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) in its cytoplasmic domain (see M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) for an overview). . For an overview of FcRs, see Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991), Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994) and de Haas et. al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995) Other FcRs, including those to be identified later, are included in the term “FcR” herein, which refers to the parent IgG. Neonatal receptor FcRn delivered to the fetus is also included (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
제WO 00/42072 (Presta)호는 FcR에 대한 개선된 결합 또는 감소된 결합을 갖는 항체 변이체를 기재하고 있다. 상기 특허 공개의 본문이 참고로 본원에 구체적으로 인용된다. 또한 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chena. 9 (2): 6591-6604 (2001)]을 참고할 수 있다.WO 00/42072 (Presta) describes antibody variants with improved or reduced binding to FcRs. The text of this patent publication is specifically incorporated herein by reference. See also Shields et al. J. Biol. Chena. 9 (2): 6591-6604 (2001).
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 RcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리할 수 있다."Human effector cells" are leukocytes that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably such cells express at least RcγRIII and perform ADCC effector functions. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMC), natural killer (NK) cells, monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils, but PBMCs and NK cells are preferred. Effector cells can be isolated from natural sources, such as blood.
"보체-의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적인 보체 활성화 경로는 보체의 동종 항원과 결합한 (적절한 서브클래스의) 항체에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 결합됨으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Method 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다."Complement-dependent cytotoxicity" or "CDC" means lysis of target cells in the presence of complement. The classical complement activation pathway is initiated by the binding of the first component (C1q) of the complement system to an antibody (of appropriate subclass) that binds to the homologous antigen of the complement. To assess complement activation, see, eg, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Method 202: 163 (1996) can be performed CDC analysis.
변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖고, Clq 결합력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 제6,194,551 B1호 및 제W0 99/51642호에 기재되어 있 다. 이들 특허 공보의 내용은 구체적으로 본원에 참고문헌으로 인용된다. 또한 문헌 [Idusogie et al.. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)] 참고.Polypeptide variants with altered Fc region amino acid sequences and increased or decreased Clq binding capacity are described in US Pat. Nos. 6,194,551 B1 and WO 99/51642. The contents of these patent publications are specifically incorporated herein by reference. See also Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
IgG에서 N-글리코실화 부위는 CH2 도메인 중 Asn297이다. 본 발명은 Fc 영역을 갖는 CD20과 결합하는 인간화 항체의 조성물을 제공하는데, 여기서 조성물 중 상기 항체의 약 80 내지 100% (바람직하게는 약 90 내지 99%)는 당단백질의 Fc 영역에 부착되는 푸코스가 없는 성숙한 코어 카르보히드레이트 구조를 포함한다. 본원에서 상기 조성물은 인간 IgG과의 상호작용에서 FcγRIIIA (V158)와 같이 효과적이지 않은 FcγRIIIA (F158)와 결합하는데 놀라운 개선을 나타낸다는 것을 입증하였다. 따라서, 본 조성물은 특히 FcγRIIIA (F158)를 발현하는 인간 환자의 치료법을 위해 상기 기재한 항-CD20 항체 조성물보터 우수할 것으로 예상된다. FcγRIIIA (F158)은 정상적인 건강한 미국인 및 카프카인에서 FcγRIIIA (V158) 및 FcγRIIIA (V158)보다 더욱 흔하다. 문헌 [Lehrnbecher et al. Blood 94: 4220 (1999)] 참고. 본 출원은 본원에서의 글리코실화 변이체와 당단백질의 Fc 영역에서의 아미노산 서열 개질(들)을 합한 결과로 인한 FcγRIII 결합 및(또는) ADCC 기능에서의 상승적인 증가를 추가로 입증한다.The N-glycosylation site in IgG is Asn297 in the CH2 domain. The present invention provides a composition of a humanized antibody that binds CD20 having an Fc region, wherein about 80-100% (preferably about 90-99%) of the antibody in the composition is attached to the Fc region of the glycoprotein. Mature core carbohydrate structure without course. The compositions herein demonstrate a surprising improvement in binding to ineffective FcγRIIIA (F158), such as FcγRIIIA (V158) in interaction with human IgG. Thus, the compositions are expected to be superior to the anti-CD20 antibody compositions described above, particularly for the treatment of human patients expressing FcγRIIIA (F158). FcγRIIIA (F158) is more common than FcγRIIIA (V158) and FcγRIIIA (V158) in normal healthy Americans and kafcaine. Lehrnbecher et al. Blood 94: 4220 (1999). The present application further demonstrates a synergistic increase in FcγRIII binding and / or ADCC function as a result of combining the glycosylation variants herein and amino acid sequence modification (s) in the Fc region of the glycoprotein.
"단리된" 항체는 천연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 것을 의미한다. 천연 환경의 오염 성분은 상기 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정된 항체의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과로 (2) 스피 닝 컵 시쿼네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 15개 이상 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시에 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제한다. 단리된 항체는 재조합 세포내에서 동일 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경 성분이 1종 이상 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.By "isolated" antibody is meant that it has been identified, isolated and / or recovered from the natural environmental component. Contaminant components of the natural environment are substances that prevent the antibody from being used for diagnosis or treatment, and may include enzymes, hormones, and other proteinaceous or nonproteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody comprises (1) greater than 95% by weight, most preferably greater than 99% by weight of the antibody as determined by the Lowry method, and (2) a spinning cup sequenator. Sufficient to obtain at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence by use, or (3) by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue or preferably silver staining. Purify so that only one band appears. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one antibody natural environmental component will not be present. Ordinarily, however, isolated polypeptide will be prepared via one or more purification steps.
"단리된" 핵산 분자는 상기 항체 핵산의 천연 공급원 내에서 통상적으로 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연계에서 발견되는 형태 또는 환경과는 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어 천연 세포의 경우와 상이한 염색체 위치에 존재하며 통상적으로 항체를 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule identified and separated from one or more contaminating nucleic acid molecules that are typically bound in the natural source of the antibody nucleic acid. Isolated nucleic acid molecules exist differently from the forms or environments found in nature. Thus, isolated nucleic acid molecules are distinguished from certain nucleic acid molecules present in natural cells. However, isolated nucleic acid molecules include, for example, nucleic acid molecules contained in cells that are at different chromosomal locations than in the case of natural cells and which normally express antibodies.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.The term "control sequence" refers to a DNA sequence necessary for the expression of a coding sequence operably linked in a particular host organism. Suitable control sequences for prokaryotes include, for example, promoters, optionally operator sequences, and ribosomal binding sites. Eukaryotic cells are known to utilize promoters, polyadenylation signals, and enhancers.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 프리서열 (presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 해당 폴리펩티드가 이의 분비에 관여하는 프리단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우 상기 폴리펩 티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 해당 폴리펩티드의 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보좀 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 촉진하도록 배치될 때 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 통상적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서의 라이게이션을 통해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.Nucleic acids are “operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences. For example, the DNA of a presequence or secretory leader is operably linked to the DNA of the polypeptide when the polypeptide is expressed as a preprotein involved in its secretion, and the promoter or enhancer When affecting the transcription of the coding sequence of a polypeptide, it is operably linked to said coding sequence, and a ribosomal binding site is operably linked to said coding sequence when positioned to facilitate translation of the coding sequence. Typically, “operably linked” means that the DNA sequences to be linked are located contiguously, and in the case of a secretory leader, not only are located contiguous but also within the same reading frame. However, enhancers do not have to be contiguous. Linking is accomplished through ligation at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, the synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with conventional practice.
"벡터"는 셔틀 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 전형적으로, 플라스미드 작제는 각각 박테리아 내의 플라스미드의 복제 및 선별을 위한 복제 기점 (예를 들어, ColE1 복제 기점) 및 선별 마커 (예를 들어, 암피실린 또는 테트라시클린 내성) 각각을 포함할 것이다. "발현 벡터"는 박테리아 또는 진핵 세포 중에서 본 발명의 항체 단편을 포함하는 항체의 발현을 위한 필수적인 제어 서열 또는 조절 요소를 함유하는 벡터를 말한다. 적합한 벡터는 하기 개시하였다."Vector" includes shuttle vectors and expression vectors. Typically, plasmid constructs will each comprise an origin of replication (eg, ColE1 origin of replication) and a selection marker (eg, ampicillin or tetracycline resistance) for replication and selection of plasmids in bacteria, respectively. An "expression vector" refers to a vector containing a control sequence or regulatory element necessary for expression of an antibody comprising an antibody fragment of the invention in a bacterial or eukaryotic cell. Suitable vectors are described below.
본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 생성하는 세포는 그 내에 항체를 코딩하는 핵산이 도입된 박테리아 및 진핵생물 숙주 세포를 포함할 것이다. 적합한 숙주 세포는 하기에 개시하였다.Cells producing humanized CD20 binding antibodies of the invention will include bacterial and eukaryotic host cells into which the nucleic acid encoding the antibody has been introduced. Suitable host cells are described below.
본원에 사용된 단어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되어 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것 (예를 들 어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)일 수 있거나 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.As used herein, the word "label" refers to a compound or composition that is detectable by direct or indirect conjugation to an antibody. The label may itself be detectable (eg, radioisotope labels or fluorescent labels) or, in the case of enzyme labels, may catalyze chemical changes in the detectable substrate compound or composition.
본원에서 "자가면역 질환"은 개체 자신 (자체) 항원 및(또는) 조직으로부터 발생하고 이에 관련되는 비-악성 질환 또는 장애이다.An “autoimmune disease” herein is a non-malignant disease or disorder arising from and associated with an individual's own (self) antigen and / or tissue.
본원에서 사용되는 "B 세포 고갈"은 실험 실시예에 기재하는 검정법과 같은 익히 공지된 검정법을 사용하여 측정가능한 치료전 B 세포 수준에 비한 약물 또는 항체 치료 후 동물 또는 인간에서의 B 세포 수준의 감소를 말한다. B 세포 수준은 실험 실시예에 기재된 검정법과 같은 익히 공지된 검정법을 사용하여 측정가능하다. B 세포 고갈은 완전하거나 부분적일 수 있다. 하나의 실시양태에서, CD20을 발현하는 B 세포의 고갈은 25% 초과이다. 임의의 한 메카니즘에 제한되지 않고, B-세포 고갈의 가능한 메카니즘은 ADCC, CDC, 아폽토시스, 칼슘 흐름의 조정 또는 이들의 2개 이상의 조합을 포함한다.As used herein, “B cell depletion” refers to a decrease in B cell levels in animals or humans following drug or antibody treatment relative to pre-treatment B cell levels measurable using well known assays, such as the assays described in the Experimental Examples. Say. B cell levels can be measured using well known assays, such as those described in Experimental Examples. B cell depletion can be complete or partial. In one embodiment, the depletion of B cells expressing CD20 is greater than 25%. Without being limited to any one mechanism, possible mechanisms of B-cell depletion include ADCC, CDC, apoptosis, modulation of calcium flow, or a combination of two or more thereof.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고(하거나) 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186); 화학요법제 및 독소, 예를 들어 박테리아, 진균, 식물 또는 동물에서 기원된 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편을 포함한다.As used herein, the term “cytotoxic agent” refers to a substance that inhibits or interferes with the function of a cell and / or causes cell destruction. Such terms include radioisotopes (eg, I131 , I125 , Y90 and Re186 ); Chemotherapeutic agents and toxins, such as enzymatically active toxins derived from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof.
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학 화합물이다. 화학 요법제의 예는 알칼리화제 또는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산 (등록상표)); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜아민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜아민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸로로멜아민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 미트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-아지도-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아마이신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로아미신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메캅토퓨린, 티아미피린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 프룩스우리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스탄올, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노굴루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리고시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔® (TAXOL®), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀 (탁소테르® (TAXOTERE®), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 빈블라스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레틴산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기의 임의의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 상기 정의에는 항-에스트로겐, 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 4(5)-이미다졸을 억제하는 아로마타제, 4-히드 록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤 (Fareston)) 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 종양에 대해 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제; 기타 화학요법제, 예컨대 프레드니솔론을 포함한다. 상기 중 어느 하나의 제약상 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.A "chemotherapeutic agent" is a chemical compound useful for treating cancer. Examples of chemotherapeutic agents include alkalizing or alkylating agents, such as thiotepa and cyclophosphamide (citosan®); Alkyl sulfonates such as busulfan, impprosulfan and pifosulfan; Aziridines such as benzodopa, carbocuone, meturedopa and uredopa; Ethyleneimines and methylamelamines such as altretamine, triethylenemelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide and trimethylromelamine; Nitrogen mustards such as chlorambucil, chlornaphazine, chlorophosphamide, esturamustine, ifosfamide, mechloretamine, mechloretamine oxide hydrochloride, melphalan, nozambisin, fensterrin, fred Nimustine, trophosphamide, uracil mustard; Mitrosureas such as carmustine, chlorozotocin, potemustine, lomustine, nimustine, rannimustine; Antibiotics such as alaccinomycin, actinomycin, oxtramycin, azaserine, bleomycin, cocktinomycin, calicheamicin, carabicin, carminomycin, carcinophylline, chromomycin, dactinomycin, dawoo Norubicin, detorrubicin, 6-azido-5-oxo-L-norleucine, doxorubicin (adriamycin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marceloamicin, mitomycin, mycophenolic acid, Nogalamycin, olibomycin, peplomycin, fort pyromycin, puromycin, quelamycin, rhorubicin, streptonigrin, streptozosin, tubercidine, ubenimex, ginostatin, zorubicin; Antimetabolic agents such as methotrexate and 5-fluorouracil (5-FU); Folic acid analogs such as denophtherine, methotrexate, putrophtherin, trimetrexate; Purine analogs such as fludarabine, 6-mecaptopurine, thiamiphyrin, thioguanine; Pyrimidine analogs such as ancitabine, azacytidine, 6-azauridine, carmofur, cytarabine, dideoxyuridine, doxyfluidine, enositabine, frucuridine, 5-FU; Androgens such as calussterone, dromostanolone propionate, epithiostanol, mepitiostane, testosterone; Anti-adrenal such as aminogulutetidemid, mitotan, trilostane; Folic acid supplements such as proline acid; Aceglaton; Aldophosphamide glycosides; Aminolevulinic acid; Amsacrine; Vestravusyl; Bisantrene; Edatraxate; Depopamine; Demecolsin; Diajikuon; Elponnitine; Elftinium acetate; Etogluside; Gallium nitrate; Hydroxyurea; Lentinane; Rodidamine; Mitoguazone; Mitoxantrone; Fur mall; Nitracrine; Pentostatin; Penamemet; Pyrarubicin; Grape filinic acid; 2-ethylhydrazide; Procarbazine; PSK® ; Lakamic acid; Sizopyran; Spirogermanium; Tenuazone acid; Triazcuone; 2,2 ', 2 "-trichlorotriethylamine;urethane;vindesine;dacarbazine;mannosemustine;mitobronitol;mitolactol;fibrobroman;psitotosine; arabinoxide (" Ara-C ");Thiotepa; taxoids such as paclitaxel (taxol® (TAXOL® ), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and docetaxel (taxotere® (TAXOTERE® ), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) Chlorambucil; gemcitabine; 6-thioguanine; mecaptopurine; methotrexate; platinum analogs such as cisplatin and carboplatin; platinum; etoposide (VP-16); phosphamide; mitomycin C; mitoxane Tron; vincristine; vinblastine; vinorelbine; nabelbin; novantron; teniposide; daunomycin; aminopterin; geloda; ibandronate; CPT-11; isomerase inhibitor RFS 2000; difluoro Romoxyornithine (DMFO); retinic acid; esperamicin; capecitabine; and any of the above pharmaceutical licenses Possible salts, acids or derivatives, the definition also includes anti-estrogens such as tamoxifen, raloxifene, aromatase that inhibits 4 (5) -imidazole, 4-hydroxytamoxifen, trioxyphene, keoxyphene , LY117018, onnapristone and toremifene (Fareston) and anti-androgens such as flutamide, nilutamide, bicalutamide, leuprolide and goserelin to modulate or inhibit hormonal action Anti-hormonal agents that act, and other chemotherapeutic agents such as prednisolone, including pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above.
"치료하는", "치료" 또는 "완화"는 치료 처치와 예방 조치 또는 예방적 조치 모두를 의미하는데, 이는 표적화된 병리학적 증상 또는 질환을 예방하거나 경감 (감소)시키는 것이 목적이다. 본 발명의 방법에 따라 치료 유효량의 CD20 결합 항체가 투여된 후, 특정 질환의 하나 이상의 증후 및 증상이 없으면서 관찰가능하고(하거나) 측정가능한 정도로 감소가 나타나는 경우, 대상은 CD20 양성 암 또는 자가면역 질환에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다. 예를 들어, 암에 대해서는 암세포 수의 감소 또는 암세포의 부재; 종양 크기의 감소; 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 경감기의 증가 및(또는) 특정 암과 관련된 1종 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감; 이환률 및 사망률 감소 및 삶의 질 개선이 있다. 질환의 이러한 징후 또는 증상의 감소는 환자도 느낄 수 있다. 치료는 암의 모든 징후의 소멸로서 정의되는 완전 반응 또는 종양의 크기가 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 75% 감소하는 부분적 반응을 달성할 수 있다. 환자는 또한 환자가 안정한 질환을 경험한다면 치료된 것으로 고려할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 암 환자는 여전히 1년 후에, 바람직하게는 15개월 후에 암에서의 진행이 없다. 질환에 있어서 성공적인 치 료 및 개선을 평가하는 이들 파라미터는 당업계에서 적절한 기술의 의사에게 친숙한 일반적인 절차로 용이하게 측정된다."Treating", "treatment" or "mitigation" means both therapeutic treatment and preventive or preventative measures, which aim to prevent or alleviate (reduce) targeted pathological symptoms or diseases. If, after administration of a therapeutically effective amount of a CD20 binding antibody in accordance with the methods of the invention, a decrease in observable and / or measurable extent without one or more symptoms and symptoms of the particular disease, the subject is a CD20 positive cancer or autoimmune disease For successfully "treated". For example, for cancer, a decrease in the number of cancer cells or the absence of cancer cells; Reduction in tumor size; Inhibit (ie, slow to some extent and preferably stop) tumor metastasis; Inhibition to some extent of tumor growth; Increased alleviation and / or alleviation to some extent of one or more symptoms associated with a particular cancer; There is a reduction in morbidity and mortality and improved quality of life. Reduction of these signs or symptoms of the disease may be felt by the patient. The treatment can achieve a complete response, defined as the disappearance of all signs of cancer, or a partial response in which the size of the tumor is preferably reduced by at least 50%, more preferably 75%. The patient may also be considered treated if the patient experiences a stable disease. In a preferred embodiment, the cancer patient still has no progress in cancer after one year, preferably after 15 months. These parameters for evaluating successful treatment and improvement in disease are readily measured by general procedures familiar to the physician of the appropriate skill in the art.
용어 "치료 유효량"은 대상 또는 포유동물에서 질병 또는 질환의 "치료"에 효과적인 항체 또는 약물의 양을 의미한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암세포 수의 감소; 종양 크기의 감소; 말초 기관으로의 암세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 느려지고 바람직하게는 멈추는 것); 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; 및(또는) 상기 암과 관련된 1종 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감을 가능하게 할 수 있다. 본원에서의 "치료"의 정의를 참조한다.The term "therapeutically effective amount" means an amount of an antibody or drug that is effective for "treatment" of a disease or condition in a subject or mammal. In the case of cancer, the therapeutically effective amount of the drug may be a decrease in the number of cancer cells; Reduction in tumor size; Inhibit (ie, slow to some extent and preferably stop) cancer cell infiltration into peripheral organs; Inhibit (ie, slow to some extent and preferably stop) tumor metastasis; Inhibition to some extent of tumor growth; And / or relieve to some extent one or more of the symptoms associated with the cancer. See the definition of "treatment" herein.
"만성" 투여란 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)를 투여하여, 초기 치료 효과 (활성)를 장기간 동안 유지하는 것을 말한다. "단속적" 투여는 중단없이 계속해서 행하는 것이 아니라 성질상 주기적으로 이루어지는 처치를 의미한다."Chronic" administration refers to administration of the agent (s) in a continuous manner as opposed to an acute mode, to maintain the initial therapeutic effect (activity) for a long time. "Intermittent" administration refers to treatments that are performed periodically by nature, rather than continuously without interruption.
본 발명의 조성물 및 방법Compositions and Methods of the Invention
본 발명은 하나 이상, 바람직하게는 2개 또는 모두가 비-인간 종 항-인간 CD20 항체 (공여자 항체)의 H 쇄 CDR을 갖는 H 쇄 및 실질적으로 수여자 항체로서 인간 컨센서스 항체의 모든 프레임워크 잔기를 포함하는 인간 CD20, 바람직하게는 기타 영장류 CD20에도 결합하는 인간화 항체를 제공한다. 공여자 항체는 마우스, 래트, 기니아 피그, 염소, 토끼, 말, 영장류를 포함하나, 대부분 빈번하게 뮤린 항체일 다양한 비-인간 종으로부터 유래일 것이다. 본 명세서에서 "실질적으로 모 든"은 인간화 항체 중 수여자 FR 영역이 인간 컨센서스 FR 서열 중에 원래 존재하지 않는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 이들 FR 변화는 수여자 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다.The present invention relates to all framework residues of the human consensus antibody as the H chain and substantially the recipient antibody having one or more, preferably two or all, H chain CDRs of non-human species anti-human CD20 antibodies (donor antibodies). It provides a humanized antibody that binds to human CD20, preferably other primate CD20. Donor antibodies include mice, rats, guinea pigs, goats, rabbits, horses, primates, but most likely will be from various non-human species that will be murine antibodies. “Substantially all” herein means that the recipient FR region in the humanized antibody may comprise one or more amino acid substitutions not originally present in the human consensus FR sequence. These FR changes may include residues that are not found in the recipient or donor antibody.
하나의 실시양태에서, 공여자 항체는 V 영역이 도 1a 및 1B에 나타낸 바와 같은 각각의 H 및 L 쇄의 CDR 및 FR 서열을 포함하는 뮤린 2H7 항체이다. 구체적인 실시양태에서, 인간 Fab 프레임워크에 대한 잔기는 인간 Vκ 아군 I 및 VH 아군 III의 컨센서스 서열에 상응하고, 이들 컨센서스 서열을 도 1a 및 도 1b에 각각 나타내었다. 본 발명의 인간화 2H7 항체는 뮤린 공여자 항체의 H 쇄 중에 하나 이상의 CDR을 가질 수 있다. 하나의 실시양태에서, 인간 CD20에 결합하는 인간화 2H7 항체는 공여자 항체의 H 및 L 쇄 모두의 CDR을 포함한다.In one embodiment, the donor antibody is a murine 2H7 antibody in which the V region comprises the CDR and FR sequences of the respective H and L chains as shown in FIGS. 1A and 1B. In specific embodiments, the residues for the human Fab framework correspond to the consensus sequences of human Vκ subgroup I and VH subgroup III, and these consensus sequences are shown in FIGS. 1A and 1B, respectively. The humanized 2H7 antibodies of the invention may have one or more CDRs in the H chain of the murine donor antibody. In one embodiment, the humanized 2H7 antibody that binds human CD20 comprises the CDRs of both the H and L chains of the donor antibody.
전장 항체에서, 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체는 인간 이뮤노글로불린의 C 도메인에 연결된 인간화 V 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, H 쇄 C 영역은 인간 IgG, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3으로부터 유래한다. L 쇄 C 도메인은 바람직하게는 인간 κ 쇄로부터 유래한다.In full length antibodies, the humanized CD20 binding antibodies of the invention may comprise a humanized V domain linked to the C domain of human immunoglobulins. In a preferred embodiment, the H chain C region is derived from human IgG, preferably IgG1 or IgG3. The L chain C domain is preferably derived from human κ chains.
달리 지시하지 않는 한, 본원에서 인간화 2H7 항체 버젼은 하기 실험 실시예에 제시된 아미노산 치환 또는 변화의 위치를 제외하고, 2H7.v16 L 쇄 (도 6, 서열 21) 및 2H7.v16 H 쇄 (도 7, 서열 22)의 V 및 C 도메인 서열을 가질 것이다.Unless otherwise indicated, humanized 2H7 antibody versions herein refer to the 2H7.v16 L chain (FIG. 6, SEQ ID NO: 21) and the 2H7.v16 H chain (FIG. 7) except for the positions of amino acid substitutions or changes shown in the experimental examples below. , V and C domain sequences of SEQ ID NO: 22).
인간화 CD20 결합 항체는 적어도 인간 CD20, 바람직하게는 기타 영장류 CD20, 예컨대 시노몰거스 및 레수스 원숭이 및 침팬지의 CD20과 결합할 것이다. 시노몰거스 원숭이 CD20의 서열은 실시예 15 및 도 19에 개시되어 있다.Humanized CD20 binding antibodies will bind to at least human CD20, preferably other primate CD20, such as CD20 of cynomolgus and rhesus monkeys and chimpanzees. The sequence of cynomolgus monkey CD20 is disclosed in Example 15 and FIG. 19.
본 발명의 CD20 결합 항체 및 인간화 CD20 결합 항체의 생물학적 활성은 Kd 값이 1 × 10-8 이하, 바람직하게는 약 1 × 10-9 이하, 또한 보다 바람직하게는 약 1 × 10-10 이하가 되도록, 적어도 인간 CD20과 항체의 결합, 보다 바람직하게는 인간 및 영장류 (시노몰거스 원숭이, 레수스 원숭이, 침팬지 포함) CD20과의 결합을 포함하며, 시험관내 또는 생체내에서, 바람직하게는 기준선 수준 또는 상기 항체로 처리하지 않은 적절한 음성 대조군과 비교하였을 때 20% 이하로 B 세포를 사멸시키거나 고갈시킬 수 있을 것이다.The biological activity of the CD20 binding antibody and humanized CD20 binding antibody of the present invention is such that the Kd value is 1 × 10−8 or less, preferably about 1 × 10−9 or less, and more preferably about 1 × 10−10 or less. Binding to antibodies with at least human CD20, more preferably with human and primates (including cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees) CD20, in vitro or in vivo, preferably at baseline level or B cells may be killed or depleted by up to 20% as compared to the appropriate negative control not treated with the antibody.
B 세포 고갈의 바람직한 수준은 질환에 따라 다를 것이다. CD20 양성 암을 치료하기 위해, 본 발명의 항-CD20 항체의 표적인 B 세포의 고갈을 최대화하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, CD20 양성 B 세포 신생물의 치료를 위해, B 세포 고갈은 적어도 당업계의 기술을 가진 의사에 의해, 예를 들어 종양 성장 (크기), 암 세포 유형의 증식, 전이, 특정 암의 기타 징후 및 증상을 모니터링함으로써 평가될 수 있는 질환의 진전을 방지하는데 충분한 것이 바람직하다. 바람직하게는, B 세포 고갈은 2개월 이상, 보다 바람직하게는 3개월, 또한 보다 바람직하게는 4개월, 보다 바람직하게는 5개월, 또한 보다 바람직하게는 6개월 이상 동안 질환의 진전을 방지하는데 충분하다. 또한, 보다 바람직한 실시양태에서, B 세포 고갈은 6개월 이상, 보다 바람직하게는 9개월, 보다 바람직하게는 1년, 보다 바람직하게는 2년, 보다 바람직하게는 3년, 보다 바람직하게는 5년 이상까지 경감되는 시간이 증가하 는데 충분하다. 가장 바람직한 실시양태에서, B 세포 고갈은 질환의 치료에 충분하다. 바람직한 실시양태에서, 암 환자에서 B 세포 고갈은 치료 전 기준선 수준의 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 및 또한 100%이다.Preferred levels of B cell depletion will vary depending on the disease. To treat CD20 positive cancers, it would be desirable to maximize the depletion of target B cells of the anti-CD20 antibodies of the invention. Thus, for the treatment of CD20 positive B cell neoplasia, B cell depletion may be at least by physicians of skill in the art, eg, tumor growth (size), proliferation, metastasis of cancer cell types, other signs of certain cancers. And sufficient to prevent the development of a disease that can be assessed by monitoring the symptoms. Preferably, B cell depletion is sufficient to prevent disease progression for at least 2 months, more preferably 3 months, more preferably 4 months, more preferably 5 months, and even more preferably 6 months or more. Do. In a more preferred embodiment, the B cell depletion is at least 6 months, more preferably 9 months, more preferably 1 year, more preferably 2 years, more preferably 3 years, more preferably 5 years. It is sufficient to increase the time to alleviate to the above. In the most preferred embodiment, B cell depletion is sufficient for the treatment of the disease. In a preferred embodiment, B cell depletion in cancer patients is at least about 75%, more preferably 80%, 85%, 90%, 95%, 99% and also 100% of baseline levels before treatment.
자가면역 질환의 치료에 대해, CD20 결합 항체의 투여량을 조정함으로써, 개별 환자에서 질환 및(또는) 상태의 중증도에 따라 B 세포 고갈의 정도를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, B 세포 고갈은 일어날 수 있으나 완전해서는 안된다. 또는, 전체 B 세포 고갈은 후속적인 치료가 아닌 초기 치료에서는 바람직할 수 있으며, 투여량은 단지 부분적인 고갈을 달성하도록 조정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, B 세포 고갈은 20% 이상이며, 즉 치료 전 기준선 수준과 비교하여 CD20 양성 B 세포의 80% 이하가 남는다. 또다른 실시양태에서, B 세포 고갈은 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상이다. 바람직하게는, B 세포 고갈은 질환의 진전을 중지시키는데, 바람직하게는 치료하의 특정 질환의 징후 및 증상을 완화시키는데, 또한 보다 바람직하게는 질환을 치료하는데 충분하다. 본 발명은 또한 항체의 한 암(arm)은 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체의 인간화 H 및 L 쇄를 갖고, 다른 한 암은 제2 항원에 대해 V 영역 결합 특이성을 갖는 이중특이적 CD20 결합 항체를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 제2 항원은 CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D 또는 기타 NK 활성화된 리간드로 이루어진 군으로 선택된다. 리툭산 (리툭시맵)과의 비료에서, v16은 리툭산보다 약 2 내지 5배의 ADCC 역가 증가, 약 3 내지 4배 CDC의 감소를 나타낸다.For the treatment of autoimmune diseases, it may be desirable to adjust the extent of B cell depletion according to the severity of the disease and / or condition in the individual patient by adjusting the dosage of the CD20 binding antibody. Thus, B cell depletion may occur but should not be complete. Alternatively, total B cell depletion may be desirable in initial treatment rather than subsequent treatment, and the dosage may be adjusted to achieve only partial depletion. In one embodiment, B cell depletion is at least 20%, ie, at most 80% of CD20 positive B cells remain compared to baseline levels prior to treatment. In another embodiment, B cell depletion is at least 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%. Preferably, B cell depletion is sufficient to stop the progression of the disease, preferably to alleviate the signs and symptoms of the particular disease under treatment, and more preferably to treat the disease. The present invention also provides that one arm of the antibody has a humanized H and L chain of the humanized CD20 binding antibody of the invention, and the other cancer has a bispecific CD20 binding antibody having a V region binding specificity for a second antigen. to provide. In specific embodiments, the second antigen is selected from the group consisting of CD3, CD64, CD32A, CD16, NKG2D or other NK activated ligands. In fertilizers with rituxan (rituximab), v16 shows an increase in ADCC titer of about 2 to 5 times and a decrease of about 3 to 4 times CDC than rituxan.
항체 제조Antibody manufacturing
모노클로날Monoclonal 항체 Antibodies
모노클로날 항체는 콜러 (Kohler) 등의 문헌 [Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마법으로 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA법 (미국 특허 제4,816,567호)으로 제조될 수 있다.Monoclonal antibodies can be prepared by the hybridoma method first described in Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), or by recombinant DNA method (US Pat. No. 4,816,567). have.
하이브리도마법에서 마우스 또는 햄스터와 같은 기타 적절한 숙주 동물은, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있는 림프구를 유발하기 위해, 상기 기술된 바와 같이 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구는 단리된 다음 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제로 골수종 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].In hybridomas, other suitable host animals, such as mice or hamsters, are immunized as described above to produce lymphocytes that can produce or produce antibodies that can specifically bind to proteins used for immunization. . Alternatively, lymphocytes can be immunized in vitro. After immunization, lymphocytes are isolated and then fused with myeloma cell lines with a suitable fusing agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 적절한 배지에 시딩되고 배양되는데, 상기 배지는 바람직하게는 비융합된 부모 골수종 세포 (융합 파트너라고도 지칭됨)의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 예를 들어, 만일 부모 골수종 세포에 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결여되면, 하이브리도마에 대한 선택적 배지는 통상적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 상기 물질들은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.The hybridoma cells thus prepared are seeded and cultured in a suitable medium, which medium preferably comprises one or more substances that inhibit the growth or survival of unfused parental myeloma cells (also referred to as fusion partners). For example, if parental myeloma cells lack hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT or HPRT) enzymes, selective media for hybridomas are typically hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT Medium), and the substances inhibit the growth of HGPRT-deficient cells.
융합 파트너 골수종 세포는, 효과적으로 융합하고 선택된 항체-생산 세포에 의한 안정적인 고농도의 항체 생성을 지속시키며, 비융합된 부모 세포를 선택하는 선택적 배지에 민감한 것이 바람직하다. 바람직한 골수종 세포주는 솔크 연구소 세포 분배 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주, 샌디에고 소재)로부터 입수 가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유도된 것, 및 SP-2와 유도체, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 미국 메릴랜드주, 록빌 소재)으로부터 입수 가능한 X63-Ag8-653 세포와 같은 마우스 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 기술되어 있다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].Fusion partner myeloma cells are preferably fused and effectively sustain stable high concentrations of antibody production by selected antibody-producing cells and are sensitive to selective medium to select unfused parental cells. Preferred myeloma cell lines are derived from MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors available from Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, CA, USA), and SP-2 and derivatives such as , Mouse myeloma cell line such as X63-Ag8-653 cells available from American Type Culture Collection, Rockville, MD. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been described for the production of human monoclonal antibodies [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); And Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
하이브리도마 세포가 성장하는 배지는, 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 검정된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 검정법, 예를 들어 방사 면역 검정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역 흡착 검정법 (ELISA)에 의해 측정된다.Medium in which hybridoma cells are grown is assayed for production of monoclonal antibodies directed against the antigen. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells is measured by immunoprecipitation or in vitro binding assays such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). do.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munsonetal.,Anal.Biochem., 107:220 (1980)]에 기술된 스캐차드 분석으로 측정될 수 있다.Binding affinity of monoclonal antibodies is described, for example, in Munsonet al.al.,Anal. Biochem., 107: 220 (1980)].
일단 소정의 특이성, 친화도 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 동정되면, 희석 과정을 제한하여 서브클로닝하고 표준 방법으로 배양할 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]. 상기 목적을 위한 적절한 배지는 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 예를 들어, 세포를 마우스에게 주사하여 동물의 복수 종양으로서 생체내에서 배양될 수 있다.Once hybridoma cells producing antibodies with the specified specificity, affinity, and / or activity are identified, the dilution process can be limited to subcloning and cultured in a standard manner. [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. Suitable media for this purpose include, for example, D-MEM or RPMI-1640 medium. In addition, the hybridoma cells can be cultured in vivo as ascites tumors in an animal, for example by injecting the cells into mice.
서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 통상적인 항체 정제 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G-세파로스 사용) 또는 이온-교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석 등에 의해 적절하게 분리된다.Monoclonal antibodies secreted by subclones may be prepared by conventional antibody purification methods, such as affinity chromatography (eg, using Protein A or Protein G-Sepharose) or ion-exchange from media, ascites fluid or serum. Chromatography, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and the like are suitably separated.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 원천으로서 기능한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 위치시킬 수 있고, 그 다음 이것을 이. 콜라이 (E.coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 (만일 그렇지 않으면 항체 단백질을 생산하지 않음)와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성한다. 박테리아에서 항체를 코딩하는 DNA의 재조합 발현에 대한 평가 논문은, 스케라 (Skerra) 등의 문헌 [Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 플뤽툰 (Plueckthun)의 문헌 [Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)]을 포함한다.DNA encoding a monoclonal antibody is easily isolated and sequenced using conventional methods (e.g., using oligonucleotide probes that can specifically bind to the heavy and light chains of the murine antibody). Is analyzed. Hybridoma cells function as a preferred source of the DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector and then this. Monoclonal antibodies in recombinant host cells by transfection into host cells, such asE.coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells (if not otherwise producing antibody proteins) Synthesize. Evaluation articles on recombinant expression of DNA encoding antibodies in bacteria are described in Skerra et al. Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) and Plueckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
추가의 실시태양에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCaffertyetal.,Nature, 348:552-554 (1990)]에 설명된 기술을 사용하여 제조된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클락손 (Clackson) 등의 문헌 [Nature, 352:624-628 (1991)] 및 마크스 (Marks) 등의 문헌 [J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)]은, 파지 라이브러리를 사용한 각각의 뮤린 및 인간 항체의 단리에 대해 기술하고 있다. 다음의 간행물들은 쇄 셔플링에 의한 고친화도 (nM 범위) 인간 항체의 생산 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)], 및 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 방법으로서의 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))을 기술한다. 따라서, 상기 기술들은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 통상적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.In further embodiments, monoclonal antibodies or antibody fragments can be isolated from antibody phage libraries prepared using the techniques described in McCaffertyetal.,Nature , 348: 552-554 (1990). Clarkson etal. ,Nature , 352: 624-628 (1991) and Marks et al.,J.Mol.Biol. , 222: 581-597 (1991) describe the isolation of each murine and human antibody using phage libraries. The following publications describe the production of high affinity (nM range) human antibodies by chain shuffling (Marks et al., Bio / Technology, 10: 779-783 (1992)), and as a method for constructing very large phage libraries. Combination infection and in vivo recombination (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Thus, these techniques are viable alternatives to conventional monoclonal antibody hybridoma techniques for isolating monoclonal antibodies.
항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열을 뮤린의 상동 서열로 치환하거나 (미국 특허 제4,816,567호; 및 [Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열을 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 코딩 서열의 전체 또는 일부와 융합시킴으로써 (이종 폴리펩티드), 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산하도록 개질될 수 있다. 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열은 항체의 불변 도메인을 치환할 수 있거나, 또는 항체의 한 항원-결합 위치의 가변 도메인으로 치환되어 항원에 대해 특이성을 갖는 한 항원-결합 위치 및 다른 항원에 대해 특이성을 갖는 다른 항원-결합 위치를 포함하는 키메라 이가 항체를 생성할 수 있다.The DNA encoding the antibody can, for example, replace human heavy and light chain constant domain (CH and CL ) sequences with homologous sequences of murine (US Pat. No. 4,816,567; and Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)), or by fusing an immunoglobulin coding sequence with all or a portion of a non-immunoglobulin polypeptide coding sequence (heterologous polypeptide) to produce a chimeric or fusion antibody polypeptide. Can be modified. Non-immunoglobulin polypeptide sequences may substitute for constant domains of an antibody, or may be substituted with variable domains of one antigen-binding site of an antibody to have specificity for one antigen-binding site and another antigen. Chimeric transcripts comprising other antigen-binding sites having can produce antibodies.
인간화 항체Humanized antibodies
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당 분야에 기술되어 있다. 바람직하게 는, 인간화 항체는 비-인간 근원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진 "임포트" 잔기로서 종종 지칭된다. 인간화는 실질적으로 다음과 같은 윈터 (Winter)와 그 동료들의 방법 [Jonesetal.,Nature, 321:522-525 (1986); Reichmannetal.,Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenetal.,Science, 239:1534-1536 (1988)]에 따라, 초가변 부위 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행된다. 따라서, 상기 "인간화" 항체는 실질적으로, 완전한 인간 가변 도메인보다 적은 부위가 비-인간 종의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제적으로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 초가변 부위 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기들이 설치류 항체의 유사 위치의 잔기로 치환된 인간 항체이다.Methods for humanizing non-human antibodies have been described in the art. Preferably, the humanized antibody has one or more amino acid residues introduced from a non-human source. Such non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, typically obtained from an "import" variable domain. Humanization is actually the method of Winter and his colleagues [Joneset al.al.,Nature , 321: 522-525 (1986); Reichmannetal.,Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyenetal.,Science , 239: 1534-1536 (1988), by substituting the hypervariable region sequences with the corresponding sequences of human antibodies. Thus, such “humanized” antibodies are substantially chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567) in which fewer sites than the complete human variable domain have been substituted with the corresponding sequences of non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some hypervariable site residues and possibly some FR residues are substituted by residues in analogous positions of rodent antibodies.
인간화 항체의 제조에 사용되는 경쇄 및 중쇄의 인간 가변 도메인의 선택은, 항체를 인간의 치료용으로 사용하고자 할 때 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 줄이기 위해 매우 중요하다. 소위 "최적합 (best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류 V 도메인과 가장 가까운 인간 V 도메인 서열 및 인간화 항체에 대해 허용된 그 내부의 인간 프레임워크 부위 (FR)를 동정했다 [Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]. 다른 방법은 모든 인간 항체의 특정 경쇄 또는 중쇄 서브그룹의 컨센서스 서열로부터 유도된 특정 프레임워크 부위를 사용한다. 다수의 각각 다른 인간 화 항체에 대해 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)].The selection of human variable domains of the light and heavy chains used in the production of humanized antibodies is very important to reduce antigenicity and HAMA responses (human anti-mouse antibodies) when the antibodies are intended for use in human treatment. According to the so-called "best-fit" method, the sequences of rodent antibody variable domains are screened against the entire library of known human variable domain sequences. Human V domain sequences closest to the rodent V domain and their internal human framework regions (FR) allowed for humanized antibodies were identified [Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. Another method uses a specific framework site derived from the consensus sequence of a particular light or heavy chain subgroup of all human antibodies. The same framework can be used for many different humanized antibodies [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993).
또한, 항원에 대한 높은 결합 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 항체를 인간화하는 것이 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 부모 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 부모 서열 및 여러 가지의 개념적 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 시판되며 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 형태 구조를 도시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램도 이용될 수 있다. 상기 디스플레이의 검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 이뮤노글로불린이 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능케 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 선택되고 수용자로부터의 임포트 서열과 조합되어, 표적 항원에 대한 친화도의 증가와 같은 소정의 항체 특성이 달성될 수 있다. 통상적으로, 초가변 부위 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 직접적으로, 및 가장 실질적으로 관련된다.It is also important to humanize antibodies while maintaining high binding affinity for antigens and other beneficial biological properties. To achieve this object, according to a preferred method, humanized antibodies are prepared by methods of analyzing parental sequences and various conceptual humanized products using three-dimensional models of parental and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are commercially available and are familiar to those skilled in the art. Computer programs can also be used to show and display possible three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Examination of the display enables analysis of the possible role of residues in the function of candidate immunoglobulin sequences, ie analysis of residues that affect the ability of a candidate immunoglobulin to bind its antigen. In this way, FR residues can be selected and combined with the import sequence from the recipient, so that certain antibody properties, such as an increase in affinity for the target antigen, can be achieved. Typically, hypervariable site residues are directly and most substantially involved in influencing antigen binding.
인간화 항체는 Fab와 같은 항체 단편일 수 있고, 이는 면역접합체를 생성하기 위해 임의로 하나 이상의 세포독성제와 접합된다. 다르게는, 인간화 항체는 완전한 IgG1 항체와 같은 완전한 항체일 수 있다.The humanized antibody may be an antibody fragment, such as a Fab, which is optionally conjugated with one or more cytotoxic agents to produce an immunoconjugate. Alternatively, the humanized antibody may be a complete antibody, such as a complete IgG1 antibody.
인간 항체 및 파지 디스플레이 방법Human antibody and phage display method
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 이제 면역화에 의해서 내인성 이뮤노글로불린의 생산없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들어, 마우스)이 제조될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 계열 돌연변이 마우스의 항체 중쇄 연결 부위 (JH) 유전자가 동형접합성 결실되면, 내인성 항체 생산이 완전히 억제되는 것으로 기술되어 있다. 인간 생식세포계 이뮤노글로불린 유전자의 어레이를 상기 생식세포계 돌연변이 마우스에게 전달하면, 마우스는 항원 투여에 대해 인간 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호 (모두 젠팜 (GenPharm)의 특허); 제5,545,807호; 및 WO 97/17852] 참조.As an alternative to humanization, human antibodies can be generated. For example, transgenic animals (eg mice) can now be produced by immunization capable of producing the entire repertoire of human antibodies without the production of endogenous immunoglobulins. For example, it has been described that endogenous antibody production is completely inhibited if the antibody heavy chain linkage region (JH ) gene of chimeric and germline mutant mice is homozygous deleted. When an array of human germline immunoglobulin genes is delivered to the germline mutant mice, the mice can produce human antibodies to antigen administration. See, eg, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); US Pat. Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (all of which are patents of GenPharm); 5,545,807; And WO 97/17852.
이와 달리, 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]은 비면역화된 공여자의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 사상 박테리오파지 (filamentous bacteriophage)의 주외피 또는 부외피 단백질 유전자 내에 인-프레임으로 클로닝되어, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이된다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 또한 항체의 기능적 특성에 기초한 선택으로 상기 특성을 갖는 항체를 코딩하는 유전자를 선택하게 된다. 따라서, 파지는 B-세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다 양한 형식으로 수행될 수 있으며, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J.,CurrentOpinioninStructuralBiology 3:564-571 (1993)]에 개관되어 있다. V-유전자 절편의 여러 가지 근원이 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 클락손 (Clackson) 등의 문헌 [Nature, 352:624-628 (1991)]에서, 면역화된 마우스의 비장에서 유래한 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체의 어레이를 단리했다. 실질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 설명된 기술에 따라, 비면역화 인간 공여자의 V 유전자 레퍼토리가 구성될 수 있고, 항원 (자가-항원을 포함)의 다양한 어레이에 항체가 단리될 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조.In contrast, phage display technology [McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990)] produces human antibodies and antibody fragments in vitro from the immunoglobulin variable (V) domain gene repertoire of non-immunized donors. Can be used. According to this technique, antibody V domain genes are cloned in-frame into the major or minor envelope protein genes of filamentous bacteriophages such as M13 or fd, and displayed as functional antibody fragments on the surface of phage particles. Since filamentous particles contain a single-stranded DNA copy of the phage genome, the selection based on the functional properties of the antibody also selects the genes encoding the antibodies with these properties. Thus, phage mimics some characteristics of B-cells. Phage display can be performed in a variety of formats, see, for example, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J.,CurrentOpinioninStructuralBiology 3: 564-571 (1993). Several sources of V-gene segments can be used for phage display. In Clarkson etal. ,Nature , 352: 624-628 (1991), arrays of various anti-oxazolone antibodies were isolated from a small random combination library of V genes derived from the spleen of immunized mice. Substantially in Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993), can construct a V gene repertoire of non-immunized human donors, Antibodies can be isolated in a variety of arrays, including self-antigens. See also US Pat. Nos. 5,565,332 and 5,573,905.
상기 논의한 바와 같이, 인간 항체는 또한 활성화 B 세포에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).As discussed above, human antibodies can also be produced in vitro by activating B cells (see US Pat. Nos. 5,567,610 and 5,229,275).
항체 단편Antibody fragments
특정 상황에서는, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 바람직하다. 단편의 크기가 작을수록 신속한 제거가 가능하고, 고형 종양에 대한 접근이 개선될 수 있다.In certain circumstances, it is preferable to use antibody fragments rather than whole antibodies. Smaller fragments allow for faster removal and improved access to solid tumors.
항체 단편의 생산을 위해 다양한 기술들이 개발되었다. 통상적으로, 상기 단편들은 완전한 항체의 단백분해성 소화에 의해 유도된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 하지만, 상기 단편 들은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 이. 콜라이에서 발현되고 분비될 수 있어, 다량의 상기 단편을 쉽게 생산할 수 있게 한다. 항체 단편은 상기와 같이, 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 [Carteretal., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 회수 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은, 미국 특허 제5,869,046호에 기술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 기타 기술들은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 실시태양에서, 선택된 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호 참조. Fv 및 sFv는 불변 부위가 결여된 완전한 조합 위치를 갖는 유일한 종류이므로, 생체내에서 사용하는 동안 비특이적인 결합을 줄이는데 적합할 수 있다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질을 융합시키기 위해 구성될 수 있다. 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조. 항체 단편은 또한, 미국 특허 제5,641,870호에 예를 들어 기술된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.Various techniques have been developed for the production of antibody fragments. Typically, these fragments are induced by proteolytic digestion of complete antibodies (eg, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); and Brennan et al., Science , 229: 81 (1985). However, these fragments can now be produced directly by recombinant host cells. Fab, Fv and ScFv antibody fragments are described in E. coli. It can be expressed and secreted in E. coli, making it easy to produce large amounts of such fragments. Antibody fragments can be isolated from antibody phage libraries, as described above. Or in the alternative, the Fab'-SH fragment is E. coli. Can be recovered directly from E. coli and chemically coupled to form F (ab ')2 fragments [Carteretal. , Bio / Technology 10: 163-167 (1992). According to another approach, F (ab ')2 fragments can be isolated directly from recombinant host cell culture. Fab and F (ab ')2 fragments with increased half-life in vivo, including recovery receptor binding epitope residues, are described in US Pat. No. 5,869,046. Other techniques for the production of antibody fragments will be apparent to those skilled in the art. In other embodiments, the antibody of choice is a single chain Fv fragment (scFv). WO 93/16185; US Patent No. 5,571,894; And US Pat. No. 5,587,458. Since Fv and sFv are the only species with complete combination sites lacking constant regions, they may be suitable for reducing nonspecific binding during use in vivo. sFv fusion proteins may be configured to fuse effector proteins at the amino or carboxy terminus of sFv. Antibody Engineering, ed. See Borrebaeck, supra. The antibody fragment may also be a "linear antibody" as described, for example, in US Pat. No. 5,641,870. The linear antibody fragment may be monospecific or bispecific.
이중특이적Bispecific 항체 Antibodies
이중특이적 항체는 둘 이상의 각각 다른 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖 는 항체이다. 이중특이적 항체는 예를 들어, CD20 단백질의 각각 다른 두 가지의 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 다른 항체는 CD20 결합 위치를 다른 단백질에 대한 결합 위치와 조합할 수 있다. 별법으로, 항-CD20 아암은 림프구 상에 유발되는 분자, 예컨대 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예컨대 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16), 또는 NKG2D 또는 NK 세포 활성화 리간드와 결합하는 아암과 결합하여 CD20-발현 세포에 세포 방어 메카니즘을 중점화 및 국부화시킬 수 있다. 이중특이적 항체는 또한, 세포독성제를 CD20을 발현하는 세포에 국부화시키는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 CD20-결합 아암 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 갖는다. 이중특이적 항체는 완전한 길이의 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.Bispecific antibodies are antibodies that have binding specificities for two or more different epitopes. Bispecific antibodies may bind, for example, two different epitopes of the CD20 protein. Such other antibodies may combine CD20 binding sites with binding sites for other proteins. Alternatively, the anti-CD20 arm may be a molecule induced on lymphocytes, such as a T cell receptor molecule (eg CD3), or an Fc receptor (FcγR) for IgG, such as FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16), or in combination with arms that bind to NKG2D or NK cell activating ligands, can centralize and localize cellular defense mechanisms to CD20-expressing cells. Bispecific antibodies can also be used to localize cytotoxic agents to cells expressing CD20. The antibody has a CD20-binding arm and a cancer that binds to a cytotoxic agent (eg, saporin, anti-interferon-α, vinca alkaloids, lysine A chain, methotrexate or radioisotope hapten). Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or antibody fragments (eg, F (ab ')2 bispecific antibodies).
WO 96/16673은 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체를 기재하고 있고, 미국 특허 제5,837,234호는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체를 개시하고 있다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα 항체는 WO 98/02463에 제시되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체를 교시하고 있다.WO 96/16673 describes bispecific anti-ErbB2 / anti-FcγRIII antibodies and US Pat. No. 5,837,234 discloses bispecific anti-ErbB2 / anti-FcγRI antibodies. Bispecific anti-ErbB2 / Fcα antibodies are shown in WO 98/02463. US Pat. No. 5,821,337 teaches bispecific anti-ErbB2 / anti-CD3 antibodies.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 완전한 길이의 이중특이적 항체의 통상적인 생산은, 두 가지의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기초되며, 여기서 두 개의 쇄는 각각 다른 특이성을 갖는다 [Millstein etal.,Nature, 305:537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적인 편성 때문에, 상기 하이브리도마 (쿼드로마)는 10개의 각각 다른 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중 단 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 이루어지는 정확한 분자의 정제는, 상당히 번거로우며 생성물 수율도 낮다. 유사한 방법이 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기술되어 있다.Methods of making bispecific antibodies are known in the art. Conventional production of full length bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs, where the two chains each have different specificities [Millsteinetal.,Nature , 305 : 537-539 (1983). Because of the random organization of immunoglobulin heavy and light chains, the hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of ten different antibody molecules, only one of which has an accurate bispecific structure. Purification of precise molecules, usually by affinity chromatography steps, is quite cumbersome and the product yield is low. Similar methods are described in WO 93/08829 and in Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
다른 접근법에 따르면, 소정의 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 위치)는 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열과 융합된다. 바람직하게는, 힌지 (hinge)의 적어도 일부분을 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인, CH2 및 CH3 부위와 융합된다. 하나 이상의 융합체에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 위치를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체, 및 필요에 따라 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는, 별도의 발현 벡터에 삽입되어 적절한 숙주 세포에 공형질감염된다. 이는 구성에 사용된 세 가지 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적 수율의 소정의 이중특이적 항체를 제공하는 경우, 실시태양에서 세 가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 보다 큰 유연성을 제공한다. 하지만, 동일한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 인해 높은 수율을 얻거나 또는 비율이 소정의 쇄 조합의 수율에 현저한 영향을 주지 않는 경우, 두 개 또는 세 개의 모든 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.According to another approach, antibody variable domains (antibody-antigen binding sites) with predetermined binding specificities are fused with immunoglobulin constant domain sequences. Preferably, it is fused with an Ig heavy chain constant domain,
상기 접근법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 하나의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하면 손쉬운 단리 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원하지 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합으로부터 소정의 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 보다 자세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.In a preferred embodiment of this approach, the bispecific antibody consists of a hybrid immunoglobulin heavy chain with a first binding specificity in one arm, and a hybrid immunoglobulin heavy chain-light chain pair (providing a second binding specificity) in the other arm. do. Since the presence of an immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule provides an easy way of isolation, this asymmetric structure has been found to facilitate the separation of certain bispecific compounds from unwanted immunoglobulin chain combinations. lost. This approach is disclosed in WO 94/04690. For further details on the production of bispecific antibodies, see, eg, Suresh et al., Methods in Enymology, 121: 210 (1986).
미국 특허 제5,731,168호에 기술된 또 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 간의 경계면이 조작되어 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은, CH3 도메인의 적어도 일부분을 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면에서 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티오신 또는 트립토판)로 치환된다. 큰 측쇄에 대한 동일하거나 유사한 크기의 대상성 "공동"은, 제2 항체 분자의 경계면 상에서 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 치환하여 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 기타 원하지 않는 최종 생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.According to another approach described in US Pat. No. 5,731,168, the interface between a pair of antibody molecules can be engineered to maximize the proportion of heterodimers recovered from recombinant cell culture. Preferred interfaces include at least a portion of the
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합에서 항체 중의 하나는 아비딘과, 다른 하나는 비오틴과 커플링될 수 있다. 상기 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화하기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 통상적인 가교법을 사용하여 제조될 수 있다. 적절한 가교제는, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.Bispecific antibodies include crosslinked or "heteroconjugate" antibodies. For example, in heterojunction, one of the antibodies may be coupled with avidin and the other with biotin. Such antibodies have been proposed, for example, for targeting immune system cells to unwanted cells (US Pat. No. 4,676,980), and for treating HIV infections (WO 91/00360, WO 92/200373 and EP 03089). Heteroconjugate antibodies can be prepared using any conventional crosslinking method. Suitable crosslinkers are disclosed in US Pat. No. 4,676,980 with a number of crosslinking techniques.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 또한, 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 결합으로 제조될 수 있다. 브레난 (Brennan) 등은 문헌 [Science, 229:81 (1985)]에서, 완전한 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')2 단편이 생성되는 과정을 기술하고 있다. 상기 단편들은 인접한 디티올을 안정화하고 분자간 디술파이드 형성을 예방하기 위한 디티올 복합체화제, 아비산나트륨의 존재하에 감소된다. 생성된 Fab' 단편은 그 다음, 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 그리고, Fab'-TNB 유도체 중의 하나는 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고, 동일한 몰 양의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는, 효소의 선택적인 고정을 위한 시약으로서 사용될 수 있다.Techniques for generating bispecific antibodies from antibody fragments are also described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared by chemical binding. Brennan et al., In Science, 229: 81 (1985), describe a process in which a complete antibody is proteolytically cleaved to produce F (ab ')2 fragments. The fragments are reduced in the presence of a dithiol complexing agent, sodium arsenite, to stabilize adjacent dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The Fab 'fragments generated are then converted to thionitrobenzoate (TNB) derivatives. One of the Fab'-TNB derivatives is then reconverted to Fab'-thiol by reduction to mercaptoethylamine and mixed with the same molar amount of other Fab'-TNB derivatives to form a bispecific antibody. The bispecific antibodies produced can be used as reagents for the selective immobilization of enzymes.
최근의 진전으로 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이하게 되었고, 이는 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. 샬라비 (Shalaby) 등은 문헌 [J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에서, 완전히 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산에 대해 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되고, 시험관내에서 화학적으로 커플링되어 이중특이적 항체를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는, ErbB2 수용체를 과다발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방암 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수 있다.With recent progress. Direct recovery of Fab'-SH fragments from E. coli was facilitated, which can be chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al. J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describe the production of a fully humanized bispecific antibody F (ab ')2 molecule. Each Fab 'fragment is E. coli. It is secreted individually from E. coli and chemically coupled in vitro to form bispecific antibodies. The bispecific antibody thus formed can bind to cells overexpressing the ErbB2 receptor and normal human T cells, as well as induce lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast cancer targets.
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하기 위한 다양한 기술들도 개시되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산되어 왔다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는, 유전자 융합에 의해 두 가지의 각각 다른 항체 Fab' 부분에 연결된다. 항체 동종이량체는 힌지 부분에서 감소되어 단량체를 형성한 다음, 재산화되어 항체 이종이량체를 형성한다. 상기 방법은 또한, 항체 동종이량체의 생산에 사용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기술된 "디아바디" 기술은, 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 별도의 기전을 제공한다. 단편은 동일한 쇄 상의 두 개의 도메인 간에 짝을 이루기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 짝을 이루게 되고, 이에 의해 두 개의 항원-결합 위치를 형성하게 된다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 방법도 보고되어 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조.Various techniques have also been disclosed for preparing and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. See Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Leucine zipper peptides from Fos and Jun proteins are linked to two different antibody Fab 'moieties by gene fusion. Antibody homodimers are reduced in the hinge portion to form monomers, which are then reoxidized to form antibody heterodimers. The method can also be used for the production of antibody homodimers. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), provides a separate mechanism for preparing bispecific antibody fragments. The fragment comprises VH linked to VL by a linker that is too short to pair between two domains on the same chain. Thus, the VH and VL domains of one fragment are paired with the complementary VL and VH domains of the other fragment, thereby forming two antigen-binding sites. Other methods of making bispecific antibody fragments using single-chain Fv (sFv) dimers have also been reported. See Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).
2 이상의 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. 문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60(1991)] 참조.Antibodies having two or more valences are contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
다가 항체Polyvalent antibody
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 이가 항체보다 신속하게 내재화 (및(또는) 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다가 항체 (IgM 클래스와 다름)일 수 있고 (예를 들어, 4가 항체), 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 위치를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 부위 또는 힌지 부위를 포함한다 (또는 구성된다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fc 부위 및 Fc 부위에 대한 3개 이상의 항원 결합 부위 아미노-말단을 포함할 수 있다. 본원의 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8개, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 위치를 포함한다 (또는 구성된다). 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 쇄 (및 바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서 폴리펩티드 쇄는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있는데, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이며, Fc는 Fc 부위의 한 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드이며, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄는 VH-CH1-유연성 링커-VH-CH1-Fc 부위 쇄, 또는 VH-CH1-VH-CH1- Fc 부위 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 바람직하게는, 2개 이상 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원의 다가 항체는 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려된 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는, 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.Multivalent antibodies can be internalized (and / or catabolized) more quickly than divalent antibodies by cells expressing the antigen to which the antibody binds. Antibodies of the invention may be multivalent antibodies (different from the IgM class) having three or more antigen binding sites (eg, tetravalent antibodies), which are readily produced by recombinant expression of nucleic acids encoding polypeptide chains of the antibody. Can be. Multivalent antibodies may comprise a dimerization domain and three or more antigen binding sites. Preferred dimerization domains comprise (or consist of) an Fc moiety or a hinge moiety. In this scenario, the antibody may comprise an Fc region and three or more antigen binding site amino-terminus for the Fc region. Preferred multivalent antibodies herein comprise (or consist of) 3 to about 8, but preferably 4 antigen binding sites. Multivalent antibodies comprise one or more polypeptide chains (and preferably two polypeptide chains), wherein the polypeptide chains comprise two or more variable domains. For example, the polypeptide chain may comprise VD1- (X1)n -VD2- (X2)n -Fc, where VD1 is the first variable domain, VD2 is the second variable domain, and Fc is the region of the Fc region. One polypeptide chain, X1 and X2 are amino acids or polypeptides, and n is 0 or 1. For example, the polypeptide chain may comprise a VH -CH 1-flexible linker-VH -CH 1 -Fc site chain, or a VH -CH 1 -VH -CH 1 -Fc site chain. The multivalent antibody herein preferably further comprises two or more (preferably four) light chain variable domain polypeptides. The multivalent antibody herein may comprise, for example, about 2 to about 8 light chain variable domain polypeptides. Light chain variable domain polypeptides contemplated herein include light chain variable domains and optionally further comprise a CL domain.
기타 아미노산 서열 개질Other amino acid sequence modification
본원에 기술된 항-CD20 항체의 아미노산 서열 개질이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 개질은 예를 들어, 항-CD20 항체 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및(또는) 삽입 및(또는) 치환을 포함한다. 단, 최종 구성체가 소정의 특징을 갖는다면, 최종 구성체에 도달하기 위한 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 수행된다. 아미노산 변화는 또한 항-CD20 항체의 번역후 과정, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화를 변경시킬 수 있다.Amino acid sequence modifications of the anti-CD20 antibodies described herein are contemplated. For example, it may be desirable to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody. Amino acid sequence variants of the anti-CD20 antibody are prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the antibody nucleic acid, or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions and / or insertions and / or substitutions of residues in the anti-CD20 antibody amino acid sequence. Provided that the final construct has certain characteristics, any combination of deletion, insertion, and substitution to reach the final construct is performed. Amino acid changes may also alter the post-translational process of the anti-CD20 antibody, such as a change in the number or position of glycosylation sites.
돌연변이 유발을 위한 바람직한 위치인 항-CD20 항체의 특정 잔기 또는 부위를 동정하는 유용한 방법은, 문헌 [Cunningham and WellsinScience, 244:1081-1085 (1989)]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 군이 동정되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전 잔기), 아미노산의 CD20 항원과의 상호작용에 영향을 미치기 위해 중 성 또는 음전하 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환된다. 그 다음, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 상기 아미노산 위치는 치환 위치에, 또는 치환 위치에 대해 추가의 또는 기타의 변이체를 도입함으로써 정확해진다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하는 위치는 미리 결정되는 반면, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 소정 위치에서 돌연변이의 달성을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발이 표적 코돈 또는 부위에서 수행되고, 발현된 항-CD20 항체 변이체는 소정 활성에 대해서 스크리닝된다.Useful methods for identifying specific residues or sites of anti-CD20 antibodies that are preferred locations for mutagenesis are described in Cunningham and Wells. inScience , 244: 1081-1085 (1989), are referred to as "alanine scanning mutagenesis". Here, a group of residues or target residues are identified (eg, charged residues such as arg, asp, his, lys, and glu) and neutral or negatively charged amino acids (eg, to affect the interaction of amino acids with the CD20 antigen). Most preferably alanine or polyalanine). The amino acid position, which then exhibits functional sensitivity to substitution, is corrected by introducing additional or other variants at or relative to the substitution position. Thus, the position to introduce amino acid sequence variation is predetermined, while the nature of the mutation itself does not need to be predetermined. For example, to analyze the achievement of mutations at a given location, ala scanning or random mutagenesis is performed at the target codon or site and the expressed anti-CD20 antibody variants are screened for the desired activity.
아미노산 서열 삽입체는 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합체, 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입은 예를 들어, N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항-CD20 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 효소에 대한 (예를 들어, ADEPT에 대한), 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항-CD20 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합체를 포함한다.Amino acid sequence inserts include amino- and / or carboxyl-terminal fusions in the polypeptide length range comprising 1 to 100 or more residues, and intra-sequence insertion of single or multiple amino acid residues. Terminal insertions include, for example, an antibody having an N-terminal methionyl residue or an anti-CD20 antibody fused to a cytotoxic polypeptide. Other insertional variants of the antibody molecule include fusions to the N- or C-terminus of an anti-CD20 antibody to an enzyme (eg to ADEPT), or to a polypeptide that increases the serum half-life of the antibody.
또 다른 형태의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 상기 변이체는 항-CD20 항체 분자 내에 다른 잔기로 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 유발에 대해 가장 관심의 대상이 되는 위치는 초가변 부위를 포함하지만, FR 변화 또한 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 제목하에 표 A에 도시된다. 만일 상기 치환으로 생물학적 활성에 변화가 야기된다면, 표 A에 " 예시적 치환"으로 명명되었거나 또는 아미노산 군과 관련하여 하기 추가로 기술할 바와 같은, 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물이 스크리닝된다.Another form of variant is an amino acid substitution variant. The variant has one or more amino acid residues substituted with other residues in the anti-CD20 antibody molecule. Sites of greatest interest for substitution mutagenesis include hypervariable sites, but FR changes are also contemplated. Conservative substitutions are shown in Table A under the heading of "preferred substitutions." If such substitutions result in a change in biological activity, more substantial changes may be introduced and the products screened, as designated in Table A as “exemplary substitutions” or as described further below in connection with the amino acid group.
[표 A]TABLE A
아미노산 치환Amino acid substitutions
항체의 생물학적 성질에 있어서의 실질적인 변화는, (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어 판형 또는 나선형 입체 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄 부피의 유지에 대한 영향에 있어서 현저하게 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 천연 잔기는 공통적인 측쇄의 성질에 기초하여 여러 군으로 분류된다:Substantial changes in the biological properties of the antibody may include (a) the structure of the polypeptide backbone in the substitutional region, eg, a plate or helical conformation, (b) the charge or hydrophobicity of the molecule at the target site, or (c) the side chain volume. This is achieved by choosing significantly different substitutions in the effect on fats and oils. Natural residues are classified into several groups based on common side chain properties:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;(1) hydrophobic: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;(2) neutral hydrophilic: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;(3) acidic: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;(4) basic: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배열에 영향을 미치는 잔기: gly, pro 및(5) residues affecting chain configuration: gly, pro and
(6) 방향족: trp, tyr, phe.(6) aromatic: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 상기 군 중 한 구성원의 또 다른 군으로의 교체를 수반할 수 있다.Non-conservative substitutions may involve the replacement of one member of another of these groups with another group.
항-CD20 항체의 적절한 입체 구조를 유지하는데 관련되지 않는 임의의 시스테인 잔기 또한, 분자의 산화 안정성을 개선하고 이상 가교를 방지하기 위해 통상적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 시스테인 결합은 그 안정성을 개선하기 위해 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우) 항체에 첨가될 수 있다.Any cysteine residues not involved in maintaining the proper conformation of the anti-CD20 antibody may also be typically substituted with serine to improve the oxidative stability of the molecule and to prevent abnormal crosslinking. In contrast, cysteine binding may be added to the antibody (especially when the antibody is an antibody fragment such as an Fv fragment) to improve its stability.
치환 변이체의 특히 바람직한 형태는, 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 부위 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 통상적으로, 추가의 개선을 위해 선택된 결과적인 변이체는 그것이 생성된 부모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 수 있다. 상기 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은, 파지 디스플레이를 사용한 친화도 성숙을 포함한다. 간단히 말해서, 여러 가지의 초가변 부위 위치 (예를 들어, 6-7 위치)가 돌연변이되어 각 위치에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성한다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키지된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합체로서, 사상 파지 입자로부터 일가 방식으로 디스플레이된다. 그 다음, 파지-디스플레이된 변이체는 본원에 개시된 바와 같이 그 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 개질 을 위한 후보 초가변 부위 위치를 동정하기 위해 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이 수행되어, 항원 결합에 현저하게 기여하는 초가변 부위 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 항체와 CD20 간의 접촉점을 동정하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 인접 잔기는, 본원에서 설명된 기술에 따른 치환에 대한 후보이다. 일단 상기 변이체가 생성되면 변이체의 패널이 본원에 기술된 바와 같이 스크리닝되고, 하나 이상의 적절한 검정법에서 우수한 특성을 갖는 항체는 추가의 개선을 위해서 선택될 수 있다.Particularly preferred forms of substitutional variants include substituting one or more hypervariable site residues of a parent antibody (eg, a humanized or human antibody). Typically, the resulting variant selected for further improvement may have improved biological properties compared to the parent antibody in which it was produced. Convenient methods of generating such substitutional variants include affinity maturation using phage display. In short, various hypervariable site positions (eg, positions 6-7) are mutated to produce all possible amino substitutions at each position. The antibody variants thus produced are fusions to the gene III product of M13 packaged within each particle and are displayed in a monovalent fashion from filamentous phage particles. Phage-displayed variants are then screened for their biological activity (eg, binding affinity) as disclosed herein. Alanine scanning mutagenesis may be performed to identify candidate hypervariable site positions for modification to identify hypervariable site residues that significantly contribute to antigen binding. Alternatively, or in addition, it may be beneficial to analyze the crystal structure of the antigen-antibody complex to identify the point of contact between the antibody and CD20. Such contact residues and adjacent residues are candidates for substitution according to the techniques described herein. Once the variants are generated, a panel of variants is screened as described herein, and antibodies having good properties in one or more appropriate assays can be selected for further improvement.
항체의 또 다른 형태의 아미노산 변이체는, 항체의 원래의 글리코실화 패턴을 변화시킨다. 변화란, 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 위치의 첨가를 의미한다.Another form of amino acid variant of the antibody alters the original glycosylation pattern of the antibody. By change is meant the deletion of one or more carbohydrate residues found in the antibody and / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the antibody.
항체의 글리코실화는 통상적으로, N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 결합됨을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은, 탄수화물 잔기가 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 결합하기 위한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 중에 상기 트리펩티드 서열 중 하나가 존재하면 잠재적인 글리코실화 위치를 형성하게 된다. O-결합 글리코실화는 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있지만, N-아세일갈락토스아민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 당이 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 결합하는 것을 나타낸다.Glycosylation of antibodies is typically either N-linked or O-linked. N-linkage indicates that the carbohydrate moiety is bound to the side chain of the asparagine moiety. The tripeptide sequences asparagine-X-serine and asparagine-X-threonine, where X is any amino acid except proline, are recognition sequences for the carbohydrate moiety to enzymatically bind to the asparagine side chain. Thus, the presence of one of the tripeptide sequences in a polypeptide forms a potential glycosylation site. O-linked glycosylation may also be used with 5-hydroxyproline or 5-hydroxylysine, although sugars of either N-aceylgalactosamine, galactose or xylose are bound to hydroxyamino acids, most commonly serine or threonine. To bind.
항체에 대한 글리코실화 부위의 추가는 통상적으로, 하나 이상의 상기 기술된 트리펩티드 서열 (N-결합 글리코실화 부위에 대해)을 포함하도록 아미노산 서열을 변화시켜 달성된다. 변화는 또한, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 원래 항체의 서열에 첨가, 또는 치환시켜 (O-결합 글리코실화 부위에 대해) 이루어질 수 있다.The addition of glycosylation sites to the antibody is typically accomplished by changing the amino acid sequence to include one or more of the above described tripeptide sequences (for N-linked glycosylation sites). The change can also be made by adding or replacing one or more serine or threonine residues in the sequence of the original antibody (relative to the O-linked glycosylation site).
항-CD20 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는, 당 분야에 공지된 여러 가지 방법으로 제조된다. 상기 방법은 천연원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 위치-지정) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 과거에 제조된 항-CD20 항체의 변이체 또는 비-변이체 버젼의 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.Nucleic acid molecules encoding amino acid sequence variants of the anti-CD20 antibody are prepared by various methods known in the art. The method can be used to isolate (for natural amino acid sequence variants) or oligonucleotide-mediated (or location-directed) mutagenesis from natural sources, PCR mutagenesis, and variant or non-variant versions of anti-CD20 antibodies prepared in the past. Preparation by cassette mutagenesis, including but not limited to.
이펙터 기능과 관련하여 예를 들어, 항체의 항원-의존성 세포매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 증가시키거나 또는 억제하기 위해서 본 발명의 항체를 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역 중에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하여 달성될 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)가 Fc 영역 중에 도입될 수 있고, 이에 따라 이 영역 중에서 쇄간 디술파이드 결합 형성을 허용할 수 있다. 따라서, 생성된 동종이량체 항체는 향상되거나 또는 감소된 내재화 능력 및(또는) 증가되거나 또는 감소된 보체-의존적 세포 사멸 및 항체-의존성 세포독성 (ADCC)을 나타낼 수 있다. 문헌 [Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 문헌 [Shopes, B. J. Immunol.148:2918-2922 (1992)] 참조. 또한, 증가된 항-종양 활성을 가진 동종이량체 항체가 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 것과 같이 제조될 수 있다. 별법으로, 두개의 Fc 영역을 가지며, 이에 따라 증가된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가진 항체가 제조될 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)] 참조.With respect to effector function, it may be desirable to modify the antibodies of the invention, for example, to increase or inhibit the antigen-dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) and / or complement dependent cytotoxicity (CDC) of the antibody. Can be. This can be accomplished by introducing one or more amino acid substitutions in the Fc region of the antibody. Alternatively or additionally, cysteine residue (s) may be introduced in the Fc region, thereby allowing interchain disulfide bond formation in this region. Thus, the resulting homodimeric antibodies may exhibit enhanced or reduced internalization capacity and / or increased or decreased complement-dependent cell death and antibody-dependent cytotoxicity (ADCC). Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). In addition, homodimeric antibodies with increased anti-tumor activity can be prepared as described in Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Alternatively, antibodies can be prepared that have two Fc regions, thus having increased complement lysis and ADCC ability. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해서, 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기술된 것과 같이 항체 (특히, 항체 단편) 중으로 회수 수용체 결합 에피토프를 도입할 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같이, "회수 수용체 결합 에피토프"란 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 관여하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.To increase the serum half-life of the antibody, recovery receptor binding epitopes can be introduced into the antibody (especially antibody fragments), as described, for example, in US Pat. No. 5,739,277. As used herein, “recovery receptor binding epitopes” are epitopes of the Fc region of IgG molecules (eg, IgG1 , IgG2 , IgG3 or IgG4 ) that are involved in increasing serum half-life in vivo of IgG molecules. Refers to.
기타 항체 개질Other Antibody Modifications
항체의 기타 개질이 본원에 고려된다. 예를 들어 항체는 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼 중의 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에 의해 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.Other modifications of the antibodies are contemplated herein. For example, the antibody can be linked to one of a variety of nonproteinaceous polymers, such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polyoxyalkylene or polyethylene glycol, or copolymers of polypropylene glycol. Antibodies may also be used, for example, in a colloidal drug delivery system (e.g., liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or coacervation techniques or interfacial polymerization (e.g., in macroemulsions). Or microcapsules prepared by hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methylmethacrylate) microcapsules, respectively. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980).
목적하는 특성을 갖는 항체의 스크리닝Screening for Antibodies with Desired Properties
특정 생물학적 특성을 갖는 항체를 실험 실시예에 기재된 바와 같이 선별할 수 있다.Antibodies with specific biological properties can be selected as described in the experimental examples.
본 발명의 항-CD20 항체의 성장 억제 효과는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, CD20를 내재적으로 발현하거나 CD20 유전자로의 형질감염 후 CD20를 발현하는 세포를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주 및 CD20-형질감염 세포를 다양한 농도의 본 발명의 항-CD20 모노클로날 항체로 수 일 (예컨대, 2-7일) 동안 처리하고 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나 다른 몇몇 비색 측정 분석법으로 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또 다른 방법은 본 발명의 항-CD20 항체가 존재하거나 부재하는 조건 하에서 처리된 세포에 의한3H-티미딘 흡수를 비교하는 것이다. 처리 후, 세포를 모으고 DNA로 혼입된 방사활성량을 섬광계수기로 정량한다. 적당한 양성 대조군에는 선택된 세포주의 성장을 억제하는 것으로 알려진 성장 억제 항체로 처리된 세포주가 포함된다.The growth inhibitory effect of the anti-CD20 antibodies of the present invention can be measured using methods known to those skilled in the art, for example, cells that express CD20 either endogenously or after transfection with the CD20 gene. For example, tumor cell lines and CD20-transfected cells are treated with various concentrations of the anti-CD20 monoclonal antibodies of the invention for several days (eg 2-7 days) and stained with crystal violet or MTT or some other colorimetric. Can be analyzed by measurement analysis. Another method of measuring proliferation is to compare3 H-thymidine uptake by cells treated under the presence or absence of anti-CD20 antibodies of the invention. After treatment, the cells are collected and the amount of radioactive activity incorporated into DNA is quantified by scintillation counter. Suitable positive controls include cell lines treated with growth inhibitory antibodies known to inhibit the growth of selected cell lines.
세포 사멸을 유도하는 항체를 선별하기 위해서, 예를 들어 프로피듐 요오다이드 (PI), 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 나타나는 바와 같이, 막의 일체성이 손상된 정도를 대조군과 비교하여 평가할 수 있다. PI 흡수 분석은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. CD20-발현 종양 세포는 배지 단독과 인큐베이션하거나, 예를 들어 약 10 ㎍/㎖의 적당한 모노클로날 항체를 함유하는 배지와 인큐베이션한다. 상기 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 각 처리를 수행한 후, 세포를 수세하고 35 ㎜ 스트레이너-캡핑된 12 × 75 튜브내로 분취하여 (튜브 당 1 ㎖, 처리 그룹 당 3 튜브) 세포 덩어리를 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/㎖)를 넣는다. FACSCAN (등록상표) 유동세포계수기와 FACSCONVERT (등록상표) CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정된 바와 같이 통계학적 유의적 수준의 세포 사멸을 유도하는 이들 항체를 세포 사멸 유도 항체로서 선별할 수 있다.To screen for antibodies that induce cell death, the extent to which the integrity of the membrane is impaired can be assessed compared to the control, as indicated by, for example, propidium iodide (PI), trypan blue or 7AAD uptake. PI uptake assays can be performed in the absence of complement and immune effector cells. CD20-expressing tumor cells are incubated with the medium alone or incubated with a medium containing, for example, about 10 μg / ml of the appropriate monoclonal antibody. The cells are incubated for 3 days. After each treatment, cells are washed and aliquoted into 35 mm strainer-capped 12 × 75 tubes (1 ml per tube, 3 tubes per treatment group) to remove cell mass. Subsequently, PI (10 μg / ml) is added to the tube. Samples can be analyzed using a FACSCAN® flow cytometer and FACSCONVERT® CellQuest software (Becton Dickinson). These antibodies that induce statistically significant levels of cell death as measured by PI uptake can be selected as cell death inducing antibodies.
원하는 항체에 의해 결합된 CD20 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단 분석을 수행할 수 있다. 이 분석은 시험 항체가 공지된 항-CD20 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는 지를 알아보는 데 사용할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 에피토프 맵핑은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 서열은 알라닌 스캐닝과 같은 방법으로 돌연변이화시켜 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이 항체는 먼저 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 시험하여 적절하게 폴딩되는지를 확인한다. 다른 방법에서, CD20 폴리펩티드의 여러 영역에 상응하는 펩티드는 시험 항체와 함께, 또는 특성이 규명된 에피토프 또는 공지된 에피토프가 있는 항체 및 시험 항체와 함께 경쟁 분석에 사용할 수 있다.For screening antibodies that bind epitopes on CD20 polypeptide bound by the desired antibody, conventional cross-blocking as described in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988) Analysis can be performed. This assay can be used to determine if the test antibody binds to the same site or epitope as known anti-CD20 antibodies. Alternatively, or in addition, epitope mapping can be performed by methods known in the art. For example, antibody sequences can be mutated in a manner such as alanine scanning to identify contact residues. Mutant antibodies are first tested for binding to polyclonal antibodies to ensure that they are properly folded. Alternatively, peptides corresponding to various regions of the CD20 polypeptide can be used in competition assays with the test antibody, or with characterized epitopes or antibodies with known epitopes and test antibodies.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법Vectors, Host Cells and Recombinant Methods
본 발명은 인간화 CD20 결합 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 벡터 및 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포 및 항체를 생성하기 위한 제조합 기술을 제공한다.The present invention provides isolated nucleic acids, vectors encoding humanized CD20 binding antibodies, and synthetic techniques for generating host cells and antibodies comprising the nucleic acids.
항체의 재조합 생성을 위해, 이를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내에 삽입한다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용히여) 용이하게 단리하고 서열분석한다. 다수의 벡터가 사용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나 이로써 제한되지 않는다.For recombinant production of an antibody, the nucleic acid encoding it is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of DNA) or expression. DNA encoding monoclonal antibodies is readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., using oligonucleotide probes that can specifically bind to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody). do. Many vectors are available. Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, origins of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters, and transcription termination sequences.
(i) 신호 서열 성분(i) signal sequence components
본 발명의 CD20 결합 항체는 재조합적으로 뿐만 아니라, 바람직하게는 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 기타 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드를 갖는 융합 폴리펩티드로서 제조할 수 있다. 바람직하게 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인지되고, 가공 (즉, 신호 펩티다제에 의한 절단)되는 서열이다. 천연 CD20 결합 항체 신호 서열을 인지 및 가공하지 않는 원핵생물 숙주 세포에 대하여, 신호 서열은 예를 들어 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 효모에서의 분비를 위해, 천연 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C.albicans) 글루코아밀라제 리더 또는 제WO 90/13646호에 기재된 신호 서열로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 헤르페스 gD 신호를 사용할 수 있다.The CD20 binding antibodies of the invention can be prepared not only recombinantly, but also as fusion polypeptides with heterologous polypeptides, preferably signal sequences or other polypeptides having specific cleavage sites at the N-terminus of the mature protein or polypeptide. Preferably the heterologous signal sequence selected is a sequence that is recognized by the host cell and processed (ie, cleaved by signal peptidase). For prokaryotic host cells that do not recognize and process native CD20 binding antibody signal sequences, the signal sequences are substituted, for example, with prokaryotic signal sequences selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or thermostable enterotoxin II leader. do. For secretion in yeast, the natural signal sequence may be, for example, a yeast invertase leader, an α factor leader (includingSaccharomyces andKluyveromyces α-factor leader) or an acid phosphatase leader , Seed.C.albicans glucoamylase leader or signal sequence described in WO 90/13646. In mammalian cell expression, mammalian signal sequences and viral secretion leaders can be used, such as simple herpes gD signals.
이러한 전구체 영역에 대한 DNA를 CD20 결합 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션한다.DNA for this precursor region is ligated in reading frame to the DNA encoding the CD20 binding antibody.
(ii) 복제 기점(ii) origin of replication
발현 벡터 및 클로닝 벡터는 모두 하나 이상의 숙주 세포에서 벡터를 복제할 수 있는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 벡터를 복제할 수 있고, 복제 기점을 포함하거나 자율적으로 서열을 복제하는 서열이다. 상기 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 익히 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 복제 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 복제 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다. 일반적으로, 상기 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다 (단지, SV40 기점은 어얼리 프로모터를 함유하기 때문에 통상적으로 사용될 수 있음).Both expression vectors and cloning vectors contain nucleic acid sequences capable of replicating the vector in one or more host cells. In general, in cloning vectors, this sequence is a sequence capable of replicating the vector independently of the host chromosomal DNA, including the origin of replication or autonomously replicating the sequence. Such sequences are well known for various bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most Gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin of replication is suitable for yeast, and various viral origins of replication (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) can be used to detect vectors in mammalian cells. Useful for cloning. In general, the origin of replication component is not necessary for mammalian expression vectors (the SV40 origin may be commonly used because it contains the early promoter).
(iii) 선별 유전자 성분(iii) selection gene components
발현 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커로도 불리우는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자, 예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩한다.Expression and cloning vectors may contain a selection gene, also called a selectable marker. Typical selection genes, eg, genes encoding D-alanine racemase for Bacillus, are (a) proteins that confer resistance to antibiotics or other toxins such as ampicillin, neomycin, methotrexate or tetracycline, (b A) Encode proteins that compensate for nutrient deficiencies or (c) provide important nutrients that are not available from the complex medium.
선별 전략의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 정체시키는 약물을 사용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 이들 세포는 약물 내성을 수여하는 단백질을 생성하고, 이에 따라 선별 요법에서 생존한다. 이러한 우세한 선별의 예로 약물 네오마이신, 미코페놀산 및 히그로마이신을 사용한다.One example of a selection strategy uses drugs to stagnate the growth of host cells. These cells successfully transformed with the heterologous gene produce a protein that confers drug resistance and thus survives the selection therapy. Examples of such dominant selection use the drugs neomycin, mycophenolic acid and hygromycin.
포유동물 세포에 대한 적합한 선별 마커의 또다른 예로 CD20 결합 항체 핵산을 획득하는데 적격인 세포를 확인할 수 있는 마커, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이다.Another example of a suitable selection marker for mammalian cells is a marker capable of identifying cells eligible for obtaining a CD20 binding antibody nucleic acid, such as DHFR, thymidine kinase, metallothionein-I and -II, preferably primate metal Rotionine gene, adenosine deaminase, ornithine decarboxylase and the like.
예를 들어, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포는 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 함유하는 배양 배지 중에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 1차로 확인한다. 야생형 DHFR이 이용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 세포주 (예를 들어, ATCC CRL-9096)이다.For example, cells transformed with the DHFR selection gene are identified primarily by culturing all transformants in a culture medium containing methotrexate (Mtx), a competitive antagonist of DHFR. When wild type DHFR is used, a suitable host cell is a Chinese hamster ovary cell (CHO) cell line (eg ATCC CRL-9096) lacking DHFR activity.
별법으로, CD20 결합 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또다른 선별 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)을 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)를 선별 마커, 예컨대 아미노글리코시드성 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마 이신, 또는 G418에 대한 선별 제제를 함유하는 매질에서 세포 성장에 의해 선별할 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호 참고.Alternatively, host cells transformed or co-transformed with a DNA sequence encoding a CD20 binding antibody, a wild type DHFR protein, and another selection marker such as
효모에 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979)].trp1 유전자는 트립토판을 이용해 성장하는 능력이 결여된 효모의 변이주, 예를 들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. 그 다음, 효모 숙주 세포 게놈에서trp1 손상부의 존재는 트립토판의 부재하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게Leu2-결핍 효모주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는Leu2 유전자를 지닌 공지된 플라스미드에 의해 상호보완된다.A selection gene suitable for use in yeast is the
추가로, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD 1로부터 유도된 벡터를 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 효모의 형질전환을 위해 사용할 수 있다. 별법으로, 재조합 송아지 키모신의 대량 생산을 위한 발현 시스템이 문헌 [K lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]에 보고되었다. 또한, 클루이베로마이세스의 산업주에 의한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정한 다중-복제수 발현이 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)]에 개시되어 있다.In addition, vectors derived from 1.6 μm
(iv) 프로모터 성분(iv) promoter components
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인지되고, CD20 결합 항체를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로 모터 시스템, 알칼리 포스파타제 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 또한, 다른 공지된 박테리아 프로모터가 적합하다. 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 CD20 결합 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.Expression and cloning vectors are generally recognized by the host organism and contain a promoter operably linked to the nucleic acid encoding the CD20 binding antibody. Promoters suitable for use in prokaryotic hosts includephoA promoters, β-lactamase and lactose promoter systems, alkaline phosphatase promoters, tryptophan (trp) promoter systems and hybrid promoters such as the tac promoter. In addition, other known bacterial promoters are suitable. Promoters for use in bacterial systems will also contain a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to the DNA encoding the CD20 binding antibody.
프로모터 서열은 진핵생물에 대해 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵 유전자는 전사가 시작되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 가진다. 다수의 유전자의 전사 시작점으로부터 70 내지 80 염기 상류에 발견되는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단에는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 추가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이러한 모든 서열은 진핵 발현 벡터 내에 적합하게 삽입된다.Promoter sequences are known for eukaryotes. Virtually all eukaryotic genes have an AT-rich region located approximately 25-30 bases upstream from the site where transcription begins. Another sequence found 70 to 80 bases upstream from the start of transcription of many genes is the CNCAAT region where N can be any nucleotide. At the 3 'end of most eukaryotic genes is the AATAAA sequence, which may be a signal for adding a poly A tail to the 3' end of the coding sequence. All such sequences are suitably inserted into eukaryotic expression vectors.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터가 포함된다.Examples of promoter sequences suitable for use in yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase or other glycolysis enzymes such as enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxyl Promoter for Lase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphate Isomerase, 3-Phosphoglycerate Mutase, Pyruvate Kinase, Triocellate Isomerase, Phosphoglucose Isomerase and Glucokinase Included.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타 제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 추가로 유럽 특허 제73,657호에 기재되어 있다. 효모 인핸서가 또한 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.Other yeast promoters that are inducible promoters with the added advantage of transcription controlled by growth conditions include
포유동물 숙주 세포내의 벡터로부터의 CD20 결합 항체 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 포울폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진, 숙주 세포 시스템에 적합한 프로모터에 의해 조절된다.CD20 binding antibody transcription from a vector in a mammalian host cell may be a virus such as polyoma virus, polopox virus, adenovirus (eg adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus , Host cell system, obtained from a promoter, a heterologous mammalian promoter, such as an actin promoter or an immunoglobulin promoter and a heat-shock promoter, obtained from the genome of retroviruses, hepatitis B virus and preferably monkey virus 40 (SV40) Is controlled by a promoter suitable for.
SV40 바이러스의 어얼리 및 레이트 프로모터는 또한 SV40 바이러스의 복제 기점를 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 이미디어트 어얼리 포로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 파필로마 바이러스를 사용한 포유동물 숙주에서 발현된 DNA에 대한 시스템이 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형이 미국 특허 제 4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 티미딘 키나제 프로모터의 조절하에 마우스 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 대해 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)] 참고. 별법으로, 라우스 사르코마 (RousSarcoma) 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로 사용될 수 있다.Early and late promoters of the SV40 virus are also conveniently obtained as SV40 restriction fragments containing the origin of replication of the SV40 virus. The Eateit Early Poromotor of human cytomegalovirus is conveniently obtained as a HindIII E restriction fragment. A system for DNA expressed in mammalian hosts using bovine papilloma virus as a vector is disclosed in US Pat. No. 4,419,446. A modification of this system is described in US Pat. No. 4,601,978. See also Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982) for expression of human β-interferon cDNA in mouse cells under the control of the thymidine kinase promoter from the herpes simplex virus. Alternatively, RausSarkoma (RousSarcoma ) Virus long terminal repeats can be used as promoters.
(v) 인핸서 요소 성분(v) enhancer element components
고등 진핵세포에 의한 본 발명의 CD20 결합 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 현재 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 어얼리 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해서는 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]를 참고. 인핸서는 CD20 결합 항체 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.Transcription of the DNA encoding the CD20 binding antibodies of the invention by higher eukaryotic cells can often be increased by inserting an enhancer sequence into the vector. Many enhancer sequences are now known to be derived from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, one will use an enhancer derived from a eukaryotic virus. Examples include the SV40 enhancer on the back of the origin of replication (bp 100-270), the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the back of the origin of replication, and adenovirus enhancers. For enhancement elements for the activation of eukaryotic promoters, see Yanib, Nature 297: 17-18 (1982). The enhancer can be spliced into the vector at the 5 'or 3' position of the CD20 binding antibody coding sequence, but is preferably located at the 5 'site from the promoter.
(vi) 전사 종결 성분(vi) transcription termination components
또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 그러한 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 입수한다. 이들 영역은 CD20 결합 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 의 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 제WO 94/11026호 및 본원에 개시하는 발현 벡터를 참고.In addition, expression vectors for use in eukaryotic host cells (multinuclear cells derived from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans or other multicellular organisms) will include sequences necessary for transcription termination and mRNA stabilization. Such sequences are typically obtained from the 5 'and sometimes 3' untranslated regions of eukaryotic or viral DNAs or cDNAs. These regions contain nucleotide segments that are transcribed as polyadenylation fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the CD20 binding antibody. One useful transcription termination component is bovine growth hormone polyadenylation region. See WO 94/11026 and the expression vectors disclosed herein.
(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환(vii) Selection and transformation of host cells
본원에서 벡터내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 상기 기재한 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리키아 (Eshcerichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonellatyphimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratiamarcescans) 및 시겔라 (Shigella) 등 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 비. 서브틸리스 (B.subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 (B.licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 아에루기노사 (P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이나, 다른 균주, 예컨대 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325)이 적합하다. 이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다.Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors herein include the prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cells described above. Suitable prokaryotic cells are eubacteria, such as Gram-negative or Gram-positive organisms, for, for example, Enterobacter bacteria, new(Enterobacteriaceae), for this example, the Escherichia(Eshcerichia) such. E. coli, Enterobacter(Enterobacter), El Winiah(Erwinia), keulrep when Ella(Klebsiella), Proteus(Proteus), Salmonella(Salmonella), for example, Salmonella typhimurium(Salmonellatyphimurium ),Serratia , for exampleSerratia Marsescansmarcescans) and the like, and Shigella(Shigella), Bacillus(Bacillus), for example, rain.B.subtilis and b. Needle piece formate miss(B. licheniformis) (e.g., as set forth in the DD 266,710, published April 12, 1989 Date of rain piece you miss formate(B.licheniformis) 41P), for Pseudomonas(Pseudomonas), for example, blood. Rugi ah include labor(P.aeruginosa), and Streptomyces(Streptomyces). One desirable tooth. E. coli cloning host. E. coli 294 (ATCC 31,446), but other strains, such as E. coli. E. coli B. Lee. E. coli X1776 (ATCC 31,537) and E. coli. E. coli strain W3110 (ATCC 27,325) is suitable. This example is illustrative only and is not limited thereto.
전장 항체, 항체 단편, 및 항체 융합 단백질은 특히, 글리코실화 및 Fc 이펙 터 기능이 필요하지 않은 경우, 예를 들어 치료 항체가 세포독성제 (예를 들어, 독소)에 결합되어 있고 면역접합체 자체가 종양 세포의 파괴에 효과적인 경우 박테리아에서 제조할 수 있다. 순환하는 전장 항체의 반감기는 더 길다. 이. 콜라이에서 제조하는 것은 보다 빠르고 보다 저렴한 효율적인 방법이다. 항체 단편 및 폴리펩티드를 박테리아에서 발현하는 것은 예를 들어, 최적의 발현 및 분비를 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 개시하고 있는 미국 특허 제5,648,237호 (Carter et. al.), 동 제5,789,199호 (Joly et al.) 및 동 제5,840,523호 (Simmons et al.)를 참조한다 (이들 특허는 본원에 참고문헌으로 인용됨). 발현 후, 항체는 가용성 분획으로 이. 콜라이 세포 페이스트로부터 단리하고, 예를 들어, 이소타입에 따라 단백질 A 또는 G 컬럼을 통해 정제할 수 있다. 최종 정제는 예를 들어, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하기 위한 방법과 유사하게 수행할 수 있다.Full length antibodies, antibody fragments, and antibody fusion proteins are particularly useful when, for example, glycosylation and Fc effector functions are not required, for example, therapeutic antibodies are bound to cytotoxic agents (eg toxins) and the immunoconjugate itself If effective in destroying tumor cells, they may be prepared from bacteria. The half-life of circulating full-length antibodies is longer. this. Manufacturing in E. coli is a faster and cheaper efficient method. Expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria is described, for example, in US Pat. No. 5,648,237 (Carter et. Al., US Pat. No. 5,789,199, which discloses a translational initiation region (TIR) and signal sequence for optimal expression and secretion). See Joly et al. And US Pat. No. 5,840,523 to Simmons et al. (These patents are incorporated herein by reference). After expression, the antibody was transformed into a soluble fraction. It can be isolated from E. coli cell paste and purified via, for example, a Protein A or G column, depending on the isotype. Final purification can be performed similarly to methods for purifying antibodies expressed, for example, in CHO cells.
원핵세포 외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물이 CD20 결합 항체 코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomycescerevisiae), 또는 베이커 효모는 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다수의 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomycespombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K.lactis), 케이. 프라길리스 (K.fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K.bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K.waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K.drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K.marxianus); 야로위아 (yarrowia)[유럽 특허 제402,226호]; 피치아 파스토리스 (Pichiapastoris)[유럽 특허 제183,070호]; 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichodermareesia)[유럽 특허 제244,234호]; 뉴로스포라 크라사; 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomycesoccidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A.nidulans) 및 에이. 니게르 (A.niger)가 본원에 일반적으로 이용가능하고 유용하다.In addition to prokaryotic cells, eukaryotic microorganisms such as fibrous fungi or yeast are suitable as cloning or expression hosts for CD20 binding antibody coding vectors.Saccharomycescerevisiae , or Baker's Yeast, is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. Many other genera, species and strains such asSchizosaccharomycespombe ;Kluyveromyces hosts, for example K.K.lactis , K.K.fragilis (ATCC 12,424), K.B.bulgaricus (ATCC 16,045), K.K. wickeramii (ATCC 24,178), K.K.waltii (ATCC 56,500), K.K.drosophilarum (ATCC 36,906), K.Thermotolerans and K.Maxianus (K.marxianus ); Yarrow subtotal(yarrowia) [European Patent No. 402 226;Pichia Pastorispastoris ) (European Patent 183,070); Candida(Candida);Trichodermareesia ) (European Patent No. 244,234); Neurospora krasa;Schwanniomyces , for exampleSchwanniomycesoccidentalis ); And fibrous fungi such asNeurospora ,Penicillium ,Tolypocladium andAspergillus hosts, for example A.A.nidulans andA.nidulansA.niger is generally available and useful herein.
글리코실화 CD20 결합 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수많은 배큘로바이러스 종 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 애기프티 (Aedesaegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedesalbopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (과실파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyxmori)와 같은 숙주로부터 유래된 상응하는 허용가능한 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 각종 바이러스 균주, 예를 들면 오토그라파 칼리포니카 (Autographacalifornica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 입수가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따른 바이러스로서 사용될 수 있다.Suitable host cells for the expression of glycosylated CD20 binding antibodies are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. Numerous baculovirus species and variants, andSpodopterafrugiperda (caterpillars),Aedes agitisaegypti ) (mosquito),Aedes albopictusalbopictus ) (mosquito),Drosophilamelanogaster (fruit flies) andBombyx mori (Bombyx) Corresponding acceptable insect host cells derived from a host such asmori ) have been identified. Various virus strains for transfection, for exampleAutographa Californicacalifornica ) L-1 variants of NPV and Bm-5 strains of Bombyx mori NPV are available, and such viruses can be used as viruses according to the invention, in particular for transfection of Spodoptera prugiferda cells.
또한, 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물이 숙주로서 사용되 수 있다.In addition, plant cell cultures of cotton, corn, potatoes, soybeans, petunias, tomatoes, and tobacco can be used as hosts.
그러나, 가장 큰 흥미는 척추동물 세포에 있으며, 척추동물 세포를 배양물 (조직 배양물)에서 증식시키는 것은 통상적인 과정이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 [293 세포, 또는 현탁 배양물에서 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]; 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 세포 [TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2)이다.However, the greatest interest is in vertebrate cells, and propagation of vertebrate cells in culture (tissue culture) has become a common process. Examples of useful mammalian host cell lines include monkey kidney CV1 cell line transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); Human embryonic kidney cell line [293 cells, or 293 cells subcloned for growth in suspension culture; Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977); Baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10); Chinese hamster ovary cells / -DHFR [CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980); Mouse sertoli cells [TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980); Monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70); African green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL-1587); Human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2); Dog kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34); Buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442); Human lung cells (W138, ATCC CCL 75); Human liver cells (Hep G2, HB 8065); Mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI cells [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982); MRC 5 cells; FS4 cells; And human liver carcinoma cell line (Hep G2).
숙주 세포를 CD20 결합 항체 생산을 위한 상기 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시킨 다음, 경우에 따라 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 변형된 통상의 영양 배지내에서 배양한다.Conventional nutrition modified to transform a host cell with said expression or cloning vector for CD20 binding antibody production and optionally to induce a promoter, select a transformant, or amplify a gene encoding the desired sequence. Incubate in the medium.
(viii) 숙주 세포의 배양(viii) culture of host cells
본 발명의 CD20 결합 항체를 제조하기 위해 사용되는 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 함스 (Ham's) F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글즈 배지 ((DMEM), Sigma)와 같은 시판되는 배지가 상기 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 동 제4,560,655호; 또는 동 제5,122,469호; 제WO 90/03430호; 제WO 87/00195호; 또는 미국 특허 등록 제30,985호]에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 배지는 필요에 따라, 호르몬 및(또는) 기타 성장인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들면, 젠타마이신 (등록상표) 약물), 미량 원소 (통상, 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 이와 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물도, 당업계에 공지되어 있는 적당한 농도로 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 이용되고 있는 조건이며, 이는 당업자에게는 자명할 것이다.Host cells used to prepare the CD20 binding antibodies of the invention can be cultured in a variety of media. Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma), minimal essential medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) and Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) were used to Suitable for cultivation See also, Ham et al., Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem., 102: 255 (1980), US Pat. No. 4,767,704; 4,657,866; US Pat. 4,927,762; 4,927,762; 4,560,655; 4,560,655; Or 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; Or any of the mediums described in US Patent No. 30,985 can be used as the culture medium for the host cells. Any of these media can be used as needed, including hormones and / or other growth factors (eg, insulin, transferrin or epidermal growth factor), salts (eg, sodium chloride, calcium, magnesium and phosphate), buffers ( For example, HEPES), nucleotides (eg, adenosine and thymidine), antibiotics (eg, gentamicin® drug), trace elements (typically inorganic compounds present in final concentrations in the micromolar range) And glucose or equivalent energy sources. Any other necessary supplements may also be included at appropriate concentrations known in the art. Culture conditions such as temperature, pH, etc. are conditions already in use with the host cell selected for expression, which will be apparent to those skilled in the art.
(ix) 항체의 정제(ix) Purification of Antibodies
재조합 기술을 이용할 경우, 항체는 세포내의 주변세포질에서 생성되거나 또 는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생성되는 경우, 첫번째 단계로서 원심분리 또는 한외여과 등을 수행하여 숙주 세포 또는 이의 용해된 단편인 미립자 잔해 (debris)를 제거한다. 이. 콜라이의 주변세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 방법은 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에 기재되어 있다. 간단하게 설명하면, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해는 원심분리하여 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터 얻은 상층액은 우선 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치와 같은 시판되는 단백질 농축 여과기를 사용하여 농축시킨다. PMSF 등과 같은 프로테아제 억제제를 임의의 상기 단계에 포함시켜 단백질분해를 억제할 수 있고, 항생제을 포함시켜 외래 오염물의 성장을 방지할 수 있다.Using recombinant technology, antibodies can be produced in the periplasm of cells or secreted directly into the medium. When the antibody is produced intracellularly, centrifugation or ultrafiltration is performed as a first step to remove particulate debris, which is a host cell or a soluble fragment thereof. this. Methods for isolating antibodies secreted into the periplasmic space of E. coli are described in Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992). In brief, the cell paste is thawed over about 30 minutes in the presence of sodium acetate (pH 3.5), EDTA and phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Cell debris can be removed by centrifugation. When the antibody is secreted into the medium, the supernatant obtained from this expression system is first concentrated using a commercial protein concentration filter such as Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration apparatus. Protease inhibitors such as PMSF and the like can be included in any of the above steps to inhibit proteolysis and antibiotics can be included to prevent the growth of foreign contaminants.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A가 적합한지는 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄-기재의 항체를 정제할 수 있다 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)]. 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 [Guss et al., EMBO J 5:1567-1575 (1986)]. 친화성 리간드가 부착될 매트릭스는 대개의 경우에 아가로 스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 세공 조절된 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같이 기계적으로 안정한 매트릭스로 인해, 아가로스의 경우보다 유속이 더 빠르고 프로세싱 시간이 더 단축될 수 있다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX (등록상표) 수지 (미국 뉴저지주 필립스버그에 소재하는 제이.티. 베이커 (J.T. Baker) 제품)가 정제에 유용하다. 회수될 항체에 따라, 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (등록상표) 상 크로마토그래피 또는 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼) 상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 다른 단백질 정제 기술도 이용할 수 있다.Antibody compositions prepared from cells can be purified using, for example, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and affinity chromatography, with affinity chromatography being the preferred purification technique. Whether protein A is suitable as an affinity ligand depends on the species and isotype of any immunoglobulin Fc domain present in the antibody. Protein A can be used to purify human γ1, γ2 or γ4 heavy chain-based antibodies [Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983). Protein G is recommended for all mouse isotypes and human γ3 (Guss et al., EMBO J 5: 1567-1575 (1986)). The matrix to which the affinity ligand will be attached is usually agarose, but other matrices are available. Due to the mechanically stable matrix, such as pore controlled glass or poly (styrenedivinyl) benzene, the flow rate is faster and the processing time can be shorter than in the case of agarose. If the antibody comprises a
임의의 예비 정제 단계 이후에, 대상 항체 및 오염물질을 함유하는 혼합물에 대해 약 2.5 내지 4.5의 pH 및 바람직하게는 낮은 염농도 (예를 들어 약 0 내지 0.25 M 염)의 용출 완충액을 사용하는, 낮은 pH의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행할 수 있다. After any preliminary purification step, a low, using elution buffer with a pH of about 2.5 to 4.5 and preferably a low salt concentration (eg about 0 to 0.25 M salt) for the mixture containing the antibody and contaminants of interest Hydrophobic interaction chromatography of pH can be performed.
항체 접합체Antibody conjugates
항체는 세포독성제, 예컨대 독소 또는 방사선 동위원소와 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 독소는 칼리케아미신, 메토트렉세이트탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴 E 및 이들의 유사체 또는 유도체가 바람직하다.Antibodies may be conjugated with cytotoxic agents such as toxins or radioisotopes. In certain embodiments, the toxin is preferred for calicheamicin, methotrexatetansinoid, dolastatin, auristatin E and analogs or derivatives thereof.
바람직한 약물/독소는 DNA 손상제, 미세소관 중합 또는 탈중합 억제제 및 항 대사제를 포함한다. 세포독성제의 바람직한 부류는 예를 들어 효소 억제제, 예컨대 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제 및 티미딜레이트 합성효소 억제제, DNA 개재제, DNA 절단제, 국소이성화효소 억제제, 약물의 안트라시클린 족, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독성 뉴클레오시드, 약물의 프테리딘 족, 디이넨, 포도필로톡신 및 분화 유도체를 포함한다. 이들 부류의 특히 유용한 구성원은 예를 들어, 메토트렉세이트, 메토프테린, 디클로로메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 6-메캅토퓨린, 시토신 아라비노시드, 멜팔란, 류로신, 류로시데인, 악티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, N-(5,5-디아세톡시펜틸)독소루비신, 모르폴린-독소루비신, 1-(2-클로로에틸)-1,2-디메탄술포닐 히드라지드, N8-아세틸 스페르미딘, 아미노프테린, 메토프테린, 에스페라미신, 미토마이신 C, 미토마이신 A, 악티노마이신, 블레오마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 탈리조마이신, 포도필로독소 및 포도필로독소 유도체, 예컨대 에토포시드 또는 에토포시드 포스페이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 탁솔, 탁소테르, 레틴산, 부티르산, N8-아세틸 스페르미딘, 캄프토테신, 칼리케아미신, 브리오스타틴, 세팔로스타틴, 안사미토신, 악토신, 메토트렉세이트탄시노이드, 예컨대, DM-1, 메이탄신, 메이탄시놀, N-데스메틸-4,5-데스폭시메이탄시놀, C-19-데클로로메이탄시놀, C-20-히드록시메이탄시놀, C-20-데메톡시메이탄시놀, C-9-SH 메이탄시놀, C-14-알콕시메틸메이탄시놀, C-14-히드록시 또는 아세틸옥시메틸메이탄시놀, C-15-히드록시/아세틸옥시메이탄시놀, C-15-메톡시메이탄시놀, C-18-N-데메틸메이탄시놀 및 4,5- 데옥시메이탄시놀, 아우리스타틴, 예컨대 아우리스타틴 E, M, PHE 및 PE; 돌로스타틴, 예컨대 돌로스타틴 A, 돌로스타틴 B, 돌로스타틴 C, 돌로스타틴 D, 돌로스타틴 E (20-에피 및 11-에피), 돌로스타틴 G, 돌로스타틴 H, 돌로스타틴 I, 돌로스타틴 1, 돌로스타틴 2, 돌로스타틴 3, 돌로스타틴 4, 돌로스타틴 5, 돌로스타틴 6, 돌로스타틴 7, 돌로스타틴 8, 돌로스타틴 9, 돌로스타틴 10, 데오-돌로스타틴 10, 돌로스타틴 11, 돌로스타틴 12, 돌로스타틴 13, 돌로스타틴 14, 돌로스타틴 15, 돌로스타틴 16, 돌로스타틴 17, 및 돌로스타틴 18; 세팔로스타틴, 예컨대 세팔로스타틴 1, 세팔로스타틴 2, 세팔로스타틴 3, 세팔로스타틴 4, 세팔로스타틴 5, 세팔로스타틴 6, 세팔로스타틴 7, 25'-에피-세팔로스타틴 7, 20-에피-세팔로스타틴 7, 세팔로스타틴 8, 세팔로스타틴 9, 세팔로스타틴 10, 세팔로스타틴 11, 세팔로스타틴 12, 세팔로스타틴 13, 세팔로스타틴 14, 세팔로스타틴 15, 세팔로스타틴 16, 세팔로스타틴 17, 세팔로스타틴 18 및 세팔로스타틴 19 등이다.Preferred drugs / toxins include DNA damaging agents, microtubule polymerization or depolymerization inhibitors and anti-metabolic agents. Preferred classes of cytotoxic agents are, for example, enzyme inhibitors such as dihydrofolate reductase inhibitors and thymidylate synthetase inhibitors, DNA intercalators, DNA cleavage agents, isomerase inhibitors, anthracycline family of drugs, vinca Drugs, mitomycin, bleomycin, cytotoxic nucleosides, pteridines of the drug, diynene, grapephytotoxin and differentiation derivatives. Particularly useful members of these classes are, for example, methotrexate, methotterin, dichloromethoprexate, 5-fluorouracil, 6-mecaptopurine, cytosine arabinosides, melphalan, leucine, leuurosidein, actinomycin , Daunorubicin, doxorubicin, N- (5,5-diacetoxypentyl) doxorubicin, morpholine-doxorubicin, 1- (2-chloroethyl) -1,2-dimethanesulfonyl hydrazide, N8 -acetyl Spermidine, aminopterin, methotterin, esperamicin, mitomycin C, mitomycin A, actinomycin, bleomycin, carminomycin, aminopterin, thalizomycin, grapephytotoxin and grapephytotoxin Derivatives such as etoposide or etoposide phosphate, vinblastine, vincristine, bindesin, taxol, taxotere, retinic acid, butyric acid, N8 -acetylspermidine, camptothecin, calicheamicin, bryostatin Cephalostatin, inner Mitosine, actosine, methotrexatetansinoids such as DM-1, maytansine, maytansinol, N-desmethyl-4,5-despoxymaytansinol, C-19-dechloromaytansi Knoll, C-20-hydroxymaytansinol, C-20-demethoxymethoxytanol, C-9-SH maytansinol, C-14-alkoxymethylmaytansinol, C-14-hydride Oxy or acetyloxymethylmaytansinol, C-15-hydroxy / acetyloxymaytansinol, C-15-methoxymethansinol, C-18-N-demethylmaytansinol and 4, 5- deoxymaytansinol, auristatins such as auristatin E, M, PHE and PE; Dolostatin, such as Dolostatin A, Dolostatin B, Dolostatin C, Dolostatin D, Dolostatin E (20-epi and 11-epi), Dolostatin G, Dolostatin H, Dolostatin I, Dolostatin 1, Dolo Statin 2, Dolostatin 3, Dolostatin 4, Dolostatin 5, Dolostatin 6, Dolostatin 7, Dolostatin 8, Dolostatin 9, Dolostatin 10, Deo-Dolostatin 10, Dolostatin 11, Dolostatin 12, Dolo Statins 13, dolostatin 14, dolostatin 15, dolostatin 16, dolostatin 17, and dolostatin 18; Cephalostatin, such as Cephalostatin 1, Cephalostatin 2, Cephalostatin 3, Cephalostatin 4, Cephalostatin 5, Cephalostatin 6, Cephalostatin 7, 25'-Epi-Sephalostatin 7, 20-epi-cephalostatin 7, cephalostatin 8, cephalostatin 9, cephalostatin 10, cephalostatin 11, cephalostatin 12, cephalostatin 13, cephalostatin 14, cephalostatin 15, ce Palostatin 16, Cefalostatin 17, Cefalostatin 18 and Cefalostatin 19 and the like.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제하는 작용을 하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카산 관목 메이테누스 세라타 (Maytenusserrata)로부터 처음 단리되었다 [미국 특허 제3,896,111호]. 그 후, 특정 미생물도 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생산하는 것으로 밝혀졌다 [미국 특허 제4,151,042호]. 합성 메이탄시놀, 이의 유도체 및 유사체는 예를 들면, 미국 특허 제4,137,230호; 동 제4,248,870호; 동 제4,256,746호; 동 제4,260,608호; 동 제4,265,814호; 동 제4,294,757호; 동 제4,307,016호; 동 제4,308,268호; 동 제4,308,269호; 동 제4,309,428호; 동 제4,313,946호; 동 제 4,315,929호; 동 제4,317,821호; 동 제4,322,348호; 동 제4,331,598호; 동 제4,361,650호; 동 제4,364,866호; 동 제4,424,219호; 동 제4,450,254호; 동 제4,362,663호; 및 동 제4,371,533호 (이들 공개문헌은 본원에 참고문헌으로 명확하게 인용됨)에 기재되어 있다.Maytansinoids are mitotic inhibitors that act to inhibit tubulin polymerization. Maytansine is an East African shrubMaytenus serrata.serrata ) was first isolated from US Pat. No. 3,896,111. Thereafter, certain microorganisms have also been found to produce maytansinoids such as maytansinol and C-3 maytansinol esters (US Pat. No. 4,151,042). Synthetic maytansinol, derivatives and analogs thereof are described, for example, in US Pat. No. 4,137,230; 4,248,870; 4,248,870; 4,256,746; 4,256,746; 4,260,608; 4,260,608; 4,265,814; US Pat. 4,294,757; 4,294,757; 4,307,016; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,268; 4,308,269; US Pat. 4,309,428; US Pat. 4,313,946; 4,313,946; 4,315,929; 4,315,929; 4,317,821; 4,317,821; 4,322,348; US Pat. 4,331,598; 4,331,598; 4,361,650; US Pat. 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,450,254; 4,362,663; US Pat. And 4,371,533, which publications are expressly incorporated herein by reference.
메이탄신 및 메이탄시노이드를 종양 세포 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 접합시켰다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체 및 이의 치료 용도는, 예를 들면 미국 특허 제5,208,020호; 동 제5,416,064호; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 기재되어 있고, 이들 공개문헌은 본원에 참고문헌으로 명확하게 인용된다. 문헌 [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대한 모노클로날 항체 C242에 연결된 메이탄시노이드 (DM1로 명명됨)를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 이러한 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 나타내었다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 메이탄시노이드가 디술피드 링커를 통하여, 인간 결장암 세포주 상의 항원과 결합하는 뮤린 항체 A7과 접합되어 있거나, 또는 HER-2/neu 종양유전자와 결합하는 또 다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1과 접합되어 있는 면역접합체가 기재되어 있다.Maytansine and maytansinoids were conjugated to antibodies that specifically bind tumor cell antigens. Immunconjugates containing maytansinoids and their therapeutic use are described, for example, in US Pat. No. 5,208,020; 5,416,064; And
항체-메이탄시노이드 접합체를 제조하는 것으로 당업계에 공지된 많은 연결 기가 있으며, 이 연결기에는, 예를 들면 미국 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 제0 425 235 B1호 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에 기 재된 것이 포함된다. 이러한 연결 기에는 상기 언급된 특허에 기재된 바와 같은, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다제 불안정 기 또는 에스테라제 불안정 기가 포함되는데, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.There are many linking groups known in the art to make antibody-maytansinoid conjugates, which are described, for example, in US Pat. No. 5,208,020 or EP Pat. Cancer Research 52: 127-131 (1992). Such linking groups include disulfide groups, thioether groups, acid labile groups, photolabile groups, peptidase labile groups or esterase labile groups, as described in the aforementioned patents, with disulfide and thioether groups being preferred. Do.
상기 항체와 메이탄시노이드의 접합체는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들면 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 특히 바람직한 커플링제에는 디술피드 연결을 제공해주는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) [Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 (1978)] 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP)가 포함된다.The conjugate of the antibody and maytansinoid may be prepared by various bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP), succinimidyl-4- ( N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, iminothiolane (IT), difunctional derivatives of imidoesters (e.g. dimethyl adipimidate HCL), active esters (e.g. disuccinimidyl suverate) Aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine ), Diisocyanates (eg
링커는 연결 유형에 따라서, 각종 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들면, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여, 히드록실기와 반응시켜 형성할 수 있다. 이 반응은 히드록실기가 있는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기가 있는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 이러한 연결은 메이 탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.The linker may be attached to the maytansinoid molecule at various positions, depending on the type of link. For example, ester linkages can be formed by reaction with hydroxyl groups using conventional coupling techniques. This reaction can occur at the C-3 position with hydroxyl group, the C-14 position modified with hydroxymethyl, the C-15 position modified with hydroxyl group, and the C-20 position with hydroxyl group. In a preferred embodiment, this linkage is formed at the C-3 position of maytansinol or a maytansinol analogue.
칼리케아미신Calicheamicin
또 다른 대상 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합되어 있는 항-TAT 항체를 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 군은 서브-피코몰 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 군의 접합체를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 제5,712,374호, 동 제5,714,586호, 동 제5,739,116호, 동 제5,767,285호, 동 제5,770,701호, 동 제5,770,710호, 동 제5,773,001호, 동 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드사의 특허임)을 참조한다. 사용될 수 있는, 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θI1이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998); 상기 미국 특허는 모두 아메리칸 시아나미드사의 특허임). 항체와 접합시킬 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 안티폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 다에 세포내 작용 부위가 있고, 이들은 원형질막을 쉽게 통과하지 못한다. 그러므로, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 약물을 세포내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 상승된다.Another subject immunoconjugate comprises an anti-TAT antibody conjugated to one or more calicheamicin molecules. The calicheamicin group of antibiotics can cleave double stranded DNA at sub-picomol concentrations. For the preparation of conjugates of the calicheamicin group, U.S. Patents 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 No. (all are patents of American Cyanamide). Structural analogs of calicheamicin that may be used include, but are not limited to, γ1I , α2I , α3I , N-acetyl-γ1I , PSAG and θI1 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998); all of these US patents are patents of American Cyanamide. Another anti-tumor drug that can be conjugated with the antibody is QFA, which is an antifolate. There are sites of intracellular action at both calicheamicin and QFA, and they do not readily cross the plasma membrane. Therefore, uptake of these drugs intracellularly through antibody mediated internalization greatly enhances their cytotoxic effects.
방사선 동위원소Radioisotope
종양의 선별적 파괴를 위해, 항체는 방사성이 높은 원자를 포함할 수 있다. 각종 방사성 동위원소를 사용하여 방사성 동위원소와 결합된 항-CD20 항체를 제조할 수 있다. 방사성 동위원소의 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 접합체를 진단에 사용하는 경우, 접합체는 신티그램 촬영 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화 (MRI)로도 알려져 있음)용 스핀 표지, 예컨대, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.For selective destruction of the tumor, the antibody may contain highly radioactive atoms. Various radioisotopes can be used to prepare anti-CD20 antibodies bound to radioisotopes. Examples of radioisotopes include radioisotopes of At211 , I131 , I125 , Y90 , Re186 , Re188 , Sm153 , Bi212 , P32 , Pb212 and Lu. When the conjugate is used for diagnosis, the conjugate may be a radioactive atom for scintogram imaging studies, for example tc99m or I123 , or spin labels for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (also known as magnetic resonance imaging (MRI)), such as , Iodine-123, iodine-131, indium-111, fluorine-19, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-17, gadolinium, manganese or iron.
방사성 표지 또는 기타 표지는 공지된 방법으로 접합체에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성하거나, 예컨대 수소 대신에 불소-19를 수반하는 적당한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성으로 합성할 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 시스테인 잔기를 통해 펩티드에 부착할 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착할 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)을 이용하여 요오드-123을 도입시킬 수 있다. 다른 방법은 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에 자세히 기재되어 있다.Radiolabels or other labels can be introduced into the conjugates by known methods. For example, peptides can be biosynthesized or synthesized, for example, by chemical amino acid synthesis using suitable amino acid precursors with fluorine-19 instead of hydrogen. Labels such as tc99m or I123 , Re186 , Re188 and In111 can be attached to the peptide via cysteine residues. Yttrium-90 may be attached via lysine residues. Iodine-123 can be introduced using the IODOGEN method (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57). Another method is described in detail in "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989).
항체와 세포독성제로 구성된 접합체는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들면 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테 르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al. Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체와 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조). 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커가 사용될 수 있다 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호].Conjugates composed of antibodies and cytotoxic agents include various bifunctional protein coupling agents, such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), succinimidyl-4- (N- Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, iminothiolane (IT), difunctional derivatives of imidoesters (such as dimethyl adimidate HCL), active esters (such as dissuccinimidyl suverate), Aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azido compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine) , Diisocyanates (eg
CD20CD20 결합 항체의 Of binding antibody치료적Therapeutic 용도 Usage
본 발명의 CD20 결합 항체는 자가면역 질환 및 관련 증상 및 B 세포 림프종 및 백혈병을 비롯한 CD20 양성 암을 비롯한 다수의 악성 및 비악성 질환을 치료하는데 유용하다. CD20 항원이 없는 골수에서 줄기 세포 (B-세포 전구세포)는 몇 달 내에 치료 후에 건강한 B-세포를 재생시키고, 정상 수준으로 되돌린다.The CD20 binding antibodies of the invention are useful for treating a number of malignant and nonmalignant diseases, including CD20 positive cancers, including autoimmune diseases and related symptoms and B cell lymphomas and leukemias. Stem cells (B-cell progenitors) in bone marrow without the CD20 antigen regenerate healthy B-cells after treatment within a few months and return to normal levels.
자가면역 질환 또는 자가면역 관련 증상은 관절염 (류마티스성 관절염, 유년형 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선 관절염), 건선, 피부염, 예컨대 아토피성 피부염; 만성 자가면역성 두드러기, 다발근육염/피부근육염, 독성 표피 괴사, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 장 질환 (IBD) (크론병, 궤양성 결장염) 관련 반응, 호흡 곤란 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 알레르기성 비염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알레르기성 증상, 습진, 천식, T 세포 침윤 및 만성 염증성 반응을 포함하는 증상, 죽종경화증, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 루푸스 (신장염, 비-신장, 원반, 탈모증 포함), 유년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 시토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 베게너 육아종증를 비롯한 육아종증, 무과립구증, 혈관염 (ANCA 포함), 재생불량 빈혈, 쿰브스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 자가면역성 용혈 빈혈 (AIHA)을 비롯한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 진정 적혈구계 빈혈 (PRCA), 인자 VIII 결핍, 혈우병 A, 자가면역성 호중성백혈구감소증, 면역범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 포함하는 질환, CNS 염증성 장애, 다기관 손상 증후군, 중증근육무력증, 항원-항체 복합체 매개된 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베쳇 질환, 캐슬맨 증후군, 굿패스쳐 증후군, 람버트-이튼 근무력증 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 고형 기관 장기이식 거부 (고패널 항체 적정, 조직에 IgA 침착 등을 위한 예비 치료 등), 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 수포성 유천포창, 천포창 (복통, 박탈을 비롯한 모든 천포창), 자가면역성 다중 내분비계 질환, 라이터 질환, 근육강직 증후군, 거대 세포 동맥염, 면역 복합성 신장염, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증 또 는 IgM 매개된 신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 자가면역성 고환염 및 난소염을 비롯한 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상샘저하증; 자가면역성 내분비계 질환, 예컨대 자가면역성 갑상샘염, 만성 갑상샘염 (하시모토 갑상샘염), 아급성 갑상샘염, 특발 갑상샘저하증, 애디슨병, 그레이브병, 자가면역성 다분비선 증후군 (또는 다분비선 내분비병증 증후군), 제I형 당뇨병 (또한 인슐린-의존 당뇨병 (IDDM)으로도 불림) 및 쉬이한 증후군; 자가면역성 간염, 림프구 간질성 폐렴 (HIV), 폐쇄성 세기관지염 (비-이식조직) vs NSIP, 길랑-바레 증후군, 대혈관 혈관염 (예컨대, 다발근육통성 류마티스 및 거대 세포 동맥염 (다까야스 동맥염)), 중혈관 혈관염 (예컨대, 가와사끼병 및 다중결절동맥염), 강직 척추염, 베르거병 (IgA 신장병증), 급속 진행성 사구체신염, 원발성 담즙성 간경변증, 비열대성 스프루우 (글루텐 장병증), 한랭글로불린혈증, ALS, 관상 동맥 질환을 포함한다.Autoimmune diseases or symptoms related to autoimmunity include arthritis (rheumatic arthritis, juvenile rheumatoid arthritis, osteoarthritis, psoriatic arthritis), psoriasis, dermatitis, such as atopic dermatitis; Chronic autoimmune urticaria, polymyositis / skin myositis, toxic epidermal necrosis, systemic sclerosis and sclerosis, inflammatory bowel disease (IBD) (Crohn's disease, ulcerative colitis) related reactions, dyspnea syndrome, adult respiratory distress syndrome (ARDS), Meningitis, allergic rhinitis, encephalitis, uveitis, colitis, glomerulonephritis, allergic symptoms, eczema, asthma, symptoms including T cell infiltration and chronic inflammatory response, atherosclerosis, autoimmune myocarditis, leukocytosis, systemic lupus erythematosus (SLE), lupus (including nephritis, non-kidney, disc, alopecia), childhood-onset diabetes, multiple sclerosis, allergic encephalomyelitis, immune response associated with acute and delayed hypersensitivity mediated by cytokines and T-lymphocytes, tuberculosis , Sarcoidosis, Wegener's granulomatosis, including granulomatosis, agranulocytosis, vasculitis (including ANCA), aplastic anemia, Cumbus positive anemia, diamond Rackfan anemia, autoimmune hemolytic anemia (AIHA), including hemolytic anemia, pernicious anemia, true erythrocytic anemia (PRCA), factor VIII deficiency, hemophilia A, autoimmune neutropenia, leukopenia, leukocytes Diseases including leakage, CNS inflammatory disorders, multi-organ damage syndrome, myasthenia gravis, antigen-antibody complex mediated disease, anti-glomerular basement membrane disease, anti-phospholipid antibody syndrome, allergic neuritis, Benin disease, Castleman syndrome, Goodyear Tsui syndrome, Lambert-Eton's work syndrome, Raynaud's syndrome, Sjogren's syndrome, Stevens-Johnson syndrome, solid organ transplant rejection (such as high-panel antibody titration, preliminary treatment for IgA deposition in tissues), graft-versus-host disease (GVHD ), Bullous febrile swelling, swelling spear (all swellings including abdominal pain, deprivation), autoimmune multiple endocrine disorders, lighter disease, muscle stiffness symptoms Group, giant cell arteritis, immune complex nephritis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathy or IgM mediated neuropathy, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), autoimmune thrombocytopenia, Autoimmune diseases of the testes and ovaries, including autoimmune testicular and ovarian inflammation, primary hypothyroidism; Autoimmune endocrine diseases such as autoimmune thyroiditis, chronic thyroiditis (Hashimoto thyroiditis), subacute thyroiditis, idiopathic hypothyroidism, Addison disease, Grave's disease, autoimmune polysecretory syndrome (or polysecretory endocrine syndrome), Type I diabetes (also called insulin-dependent diabetes (IDDM)) and Suey's syndrome; Autoimmune hepatitis, lymphocyte interstitial pneumonia (HIV), obstructive bronchiolitis (non-graft tissue) vs NSIP, Guillain-Barré syndrome, macrovascular vasculitis (eg, polymyalgia rheumatoid and giant cell arteritis (Dakaya's arteritis)), moderate Vascular vasculitis (e.g., Kawasaki disease and polynodal arthritis), ankylosing spondylitis, Berger's disease (IgA nephropathy), rapid progressive glomerulonephritis, primary biliary cirrhosis, nontropical sprue (gluten enteropathy), cold globulinemia, ALS, Coronary artery disease.
CD20 양성 암은 세포 표면에 CD20을 발현하는 세포의 비정상적 증식을 포함하는 암이다. CD20 양성 B 세포 신생물은 CD20-양성 호지킨 질환, 예컨대 림프구 우세형 호지킨 질환 (LPHD); 비-호지킨 림프종 (NHL); 난포 중심 세포 (FCC) 림프종; 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 모발상 세포 백혈병을 포함한다. 비-호지킨 림프종은 저등급/난포 비-호지킨 림프종 (NHL), 소림프구 림프종 (SLL), 중등급/난포 NHL, 중등급 확산 NHL, 고등급 면역모세포 NHL, 고등급 림프모세포 NHL, 고등급 소 비-절단 세포 NHL, 거대 질환 NHL, 혈장구양 림프구림프종, 뇌개 세포 림프종, AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 을 포함한다. 이들 암의 재발 치료가 또한 고려된다. LPHD는 방사선 치료 및 화학치료법 치료에도 불구하고 빈번히 재발하는 경향이 있으며, CD20-양성 악성 세포를 특징으로 하는 호지킨 질환 유형이다. CLL은 4가지의 주요한 백혈병 유형 중 하나이다. 림프구로 불리는 성숙한 B-세포의 암인 CLL은 혈액, 골수 및 림프 조직에서 세포의 진행성 축적에 의해 명백해진다.CD20 positive cancers are cancers that include abnormal proliferation of cells expressing CD20 on the cell surface. CD20 positive B cell neoplasms include CD20-positive Hodgkin's disease, such as lymphocyte predominant Hodgkin's disease (LPHD); Non-Hodgkin's lymphoma (NHL); Follicular central cell (FCC) lymphoma; Acute lymphocytic leukemia (ALL); Chronic lymphocytic leukemia (CLL); Hairy cell leukemia. Non-Hodgkin's lymphomas are low grade / follicular non-Hodgkin's lymphoma (NHL), small lymphocytic lymphoma (SLL), medium grade / follicular NHL, medium grade diffuse NHL, high grade immunoblast NHL, high grade lymphoblast NHL, high Grades non-cleaved cell NHL, giant disease NHL, plasma-sized lymphoma, lymphocytic cell lymphoma, AIDS-associated lymphoma and Waldenstrom's macroglobulinemia. Relapse treatment of these cancers is also contemplated. LPHD tends to recur frequently despite radiotherapy and chemotherapy treatment and is a type of Hodgkin's disease characterized by CD20-positive malignant cells. CLL is one of four major types of leukemia. CLL, a cancer of mature B-cells called lymphocytes, is evident by the progressive accumulation of cells in the blood, bone marrow, and lymphoid tissue.
구체적인 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체 및 이의 기능적 단편을 사용하여 비-호지킨 림프종 (NHL), 림프구 우세형 호지킨 질환 (LPHD), 소림프구 림프종 (SLL), 만성 림프구백혈병, 류마티스성 관절염 및 유년형 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 예컨대 루푸스 신장염, 베게너 질환, 염증성 장 질환, 특발성 혈소판감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반병 (TTP), 자가면역성 혈소판감소증, 다발성 경화증, 건선, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 중증근육무력증, 혈관염, 당뇨병, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군 및 사구체신염을 치료한다.In specific embodiments, non-Hodgkin's lymphoma (NHL), lymphocyte predominant Hodgkin's disease (LPHD), small lymphocytic lymphoma (SLL), chronic lymphocytic leukemia, rheumatoid arthritis using humanized CD20 binding antibodies and functional fragments thereof, and Juvenile rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), such as lupus nephritis, Wegener's disease, inflammatory bowel disease, idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), autoimmune thrombocytopenia, multiple Cure, psoriasis, IgA nephropathy, IgM polyneuropathy, myasthenia gravis, vasculitis, diabetes, Raynaud's syndrome, Sjogren's syndrome and glomerulonephritis.
인간화 CD20 결합 항체 또는 이의 기능적 단편은 예를 들어 재발성 또는 불응성 저등급 또는 난포, CD20-양성, B-세포 NHL을 위한 단일 제제 치료로서 유용하거나, 또는 다중 약물 요법에서 다른 약물과 병용하여 환자에게 투여할 수 있다.Humanized CD20 binding antibodies or functional fragments thereof are useful as single agent treatments, for example for recurrent or refractory low grade or follicles, CD20-positive, B-cell NHL, or in combination with other drugs in multiple drug therapies. It can be administered to.
무통성 림프종은 보통의 환자가 다수의 경감 및 재발의 기간 후 6 내지 10 년 동안 생존하는, 느리게 성장하는 불치 질환이다. 하나의 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체 또는 이의 기능적 단편을 사용하여 무통성 NHL을 치료한다.Painless lymphoma is a slow growing incurable disease in which the average patient survives for 6 to 10 years after a number of periods of relief and relapse. In one embodiment, humanized CD20 binding antibodies or functional fragments thereof are used to treat indolent NHL.
신생물의 치료의 효능 또는 성공률을 평가하기 위한 파라미터는 적절한 질환 에서의 기술을 가진 의사에게 공지된 것이다. 일반적으로 상기 의사는 특정 질환의 징후 및 증상에서의 감소를 예기할 것이다. 파라미터는 질환 진행으로의 정중 시간, 경감된 시간, 질환 안정성을 포함한다.Parameters for assessing the efficacy or success rate of treatment of neoplasms are known to the physician with the appropriate disease. In general, the physician will anticipate a decrease in the signs and symptoms of the particular disease. Parameters include median time to disease progression, time alleviated, disease stability.
하기 참고문헌은 림프종 및 CLL, 이들의 진단, 치료 및 치료 효능을 측정하기 위한 표준 의약 절차를 기재하고 있다. 문헌 [Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1998]; [van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000]; 및 [Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Huffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000].The following references describe standard medical procedures for measuring lymphoma and CLL, their diagnostic, therapeutic and therapeutic efficacy. Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W. B. Saunders Company, Philadelphia, 1998; van Besien K and Cabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Chap. 70, pp 1293-1338, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Hoffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000; And Rai, K and Patel, D: Chronic Lymphocytic Leukemia, Chap. 72, pp 1350-1362, in: Hematology, Basic Principles and Practice, 3rd ed. Huffman et al. (editors). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000].
자가면역 또는 자가면역 관련 질환의 치료의 효능 또는 성공률을 평가하기 위한 파라미터는 적절한 질환에서의 기술을 가진 의사에게 공지된 것이다. 일반적으로 상기 의사는 특정 질환의 징후 및 증상에서의 감소를 예기할 것이다. 하기는 실시예의 방법에 의한다.Parameters for assessing the efficacy or success rate of treatment of an autoimmune or autoimmune related disease are known to the physician having the skill in the appropriate disease. In general, the physician will anticipate a decrease in the signs and symptoms of the particular disease. The following is by the method of Example.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 항체는 류마티스성 관절염의 치료에 유용하다. RA는 다관절 염증, 관절 파괴를 일으키고, 궁극적으로는 관절 기능을 감소시키는 연골 소실 및 골미란을 특징으로 한다. 추가로, RA는 전신 질환이기 때문에, 이는 다른 조직, 예컨대 폐, 안구 및 골수에 영향을 미칠 수 있다, 10 년 이상 RA 를 앓고 있는 환자의 50% 미만은 날에 따라서는 정상적으로 계속 작동하고 기능할 수 있다.In one embodiment, the antibodies of the invention are useful for the treatment of rheumatoid arthritis. RA is characterized by cartilage loss and bone erosion, which causes polyarticular inflammation, joint destruction, and ultimately reduces joint function. In addition, since RA is a systemic disease, it can affect other tissues such as lungs, eyes, and bone marrow. Less than 50% of patients suffering from RA for more than 10 years will continue to function and function normally on a day-to-day basis. Can be.
본 항체는 조기 RA를 앓는 환자에서 제1선 치료법 (즉, 순전한 메토트렉세이트 (MTX))으로서, 단일치료법으로 또는 예를 들어 MTX 또는 시클로포스파미드와 함께 사용할 수 있다. 또는, 본 항체를 DMARD 및(또는) MTX 불응성인 환자를 위한 제2선 치료법으로서, 단일치료법으로 또는 예를 들어 MTX와 함께 사용할 수 있다. 인간화 CD20 결합 항체는 관절 손상을 예방하고 조절하며, 구조적 손상을 지연시키고, RA에서 염증과 관련된 통증을 감소시키고, 일반적으로 중증 RA를 완화시키는데 징후 및 증상을 감소시키는데 유용하다. RA 환자는 RA를 치료하는데 사용되는 다른 약물의 치료 전 또는 후에, 또는 상기 치료와 함께 인간화 CD20 항체로 치료할 수 있다 (하기 병용 치료 참고). 하나의 실시양태에서, 이전에 질환을 변경하는 항류마티스 약물에 실패하였고(거나) 메토트렉세이트 단독에 부적절한 반응을 갖는 환자를 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체로 치료한다. 본 치료의 하나의 실시양태에서, 환자를 인간화 CD20 결합 항체 단독을 투여하고 (제1일 및 제15일 째 1g 정맥내 주입), CD20 결합 항체 및 시클로포스파미드 (제3일 및 제17일 째 750 mg 정맥내 주입)를 투여하거나; 또는 CD20 결합 항체 및 메토트렉세이트를 투여하는 17일 치료 요법을 행한다.The antibody can be used as first line therapy (ie pure methotrexate (MTX)) in monotherapy or in combination with, for example, MTX or cyclophosphamide in patients with early RA. Alternatively, the present antibodies can be used as monotherapy or in combination with, for example, MTX, as a second line therapy for patients with DMARD and / or MTX refractory. Humanized CD20 binding antibodies are useful for preventing and controlling joint damage, delaying structural damage, reducing pain associated with inflammation in RA, and generally reducing signs and symptoms in alleviating severe RA. RA patients may be treated with humanized CD20 antibodies before or after the treatment of other drugs used to treat RA, or in combination with the treatment (see combination treatment below). In one embodiment, patients who previously failed a disease modifying antirheumatic drug and / or have an inappropriate response to methotrexate alone are treated with the humanized CD20 binding antibody of the invention. In one embodiment of this treatment, the patient is administered with a humanized CD20 binding antibody alone (1 g intravenous infusion on
RA에서 치료 효능을 평가하는 하나의 방법은 연화 관절 및 종대 관절 등에서의 개선 백분율을 측정하는 미국 류마티스학 협회 (American College of Rheumatology, ACR) 기준을 기초로 한다. RA 환자는 예를 들어 항체 치료를 받지 않은 것 (예를 들어 치료 전 기준선) 또는 위약으로의 치료와 비교하여 ACR 20 (20% 개선)으로 점수화할 수 있다. 항체 치료의 효능을 평가하는 다른 방법은 X-선 점수화, 예컨대 샤프 (Sharp) X-선 점수를 사용하여 구조적 손상, 예컨대 골미란 및 관절 공간 협소화를 점수화한다. 또한, 환자를 치료 중 또는 치료 후의 시간에서 건강 평가 질의서 (Health Assessment Questionnaire [HAQ]) 점수, AIMS 점수, SF-36에 기초한 무력의 예방 또는 개선에 대해 평가할 수 있다. ACR 20 기준은 연화 (통증) 관절수 및 종대 관절 모두에서의 20% 개선 및 5가지 추가 측정에서 적어도 3가지에서의 20% 개선을 포함할 수 있다:One method of evaluating treatment efficacy in RA is based on the American College of Rheumatology (ACR) criteria, which measure percent improvement in softened joints and longitudinal joints. RA patients may be scored with ACR 20 (20% improvement) compared to, for example, not receiving antibody treatment (eg, baseline prior to treatment) or treatment with placebo. Another method of evaluating the efficacy of antibody treatment is to score structural damage such as bone erosion and joint spatial narrowing using X-ray scoring, such as Sharp X-ray scoring. Patients may also be assessed for prevention or improvement of armed forces based on Health Assessment Questionnaire [HAQ] scores, AIMS scores, SF-36, during or after treatment. The
1. 시각적 유사 척도에 의한 환자의 통증 평가 (VAS),1. Pain assessment of patients by visual similarity scale (VAS),
2. 질환 활성의 환자의 전체적인 평가 (VAS),2. overall assessment of patients with disease activity (VAS),
3. 질환 활성의 의사의 전체적인 평가 (VAS)3. Doctor's Overall Assessment of Disease Activity (VAS)
4. 건강 평가 질의서에 의해 평가된 환자 스스로 평가된 무력 및4. The patient's self-assessed force as assessed by the health assessment questionnaire and
5. 급성기 반응물인 CRP 또는 ESR.5. Acute phase reactants, CRP or ESR.
ACR 50 및 70은 유사하게 정의된다. 바람직하게는 환자는 ACR 20 이상, 바람직하게는 ACR 30, 보다 바람직하게는 ACR 50, 보다 더 바람직하게는 ACR 70, 가장 바람직하게는 ACR 75 이상의 점수를 달성하는데 효과적인 본 발명의 CD20 결합 항체의 양으로 투여된다.
건선 관절염은 유일하고 분별되는 방사선적 양상을 갖는다. 건선 관절염에 대해서는, 관절 미란 및 관절 공간 협소화를 샤프 점수로도 평가할 수 있다. 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 사용하여 관절 손상을 예방할 뿐만 아니라 상기 장애의 질환 징후 및 증상을 감소시킬 수 있다.Psoriatic arthritis has a unique and distinguishing radiological pattern. For psoriatic arthritis, joint erosion and joint spatial narrowing can also be assessed by the Sharp score. The humanized CD20 binding antibodies of the invention can be used to prevent joint damage as well as reduce disease signs and symptoms of the disorder.
또한, 본 발명의 또다른 측면은 치료 유효량의 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체를 SLE을 앓고 있는 환자에게 투여함으로써 루푸스 또는 SLE를 치료하는 방법이다. SLEDAI 점수는 질환 활성의 수적 정량이다. SLEDAI는 질환 활성과 관련된 것으로 공지된 24개의 임상적이고 실험적인 파라미터의 칭량된 0 내지 103의 숫자 범위의 지수이다. 문헌 [Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14 : 515-521] 참고. 이중-가닥 DNA에 대한 항체는 신장 발적 및 기타 루푸스의 조짐을 일으키는 것으로 여겨진다. 항체 치료를 받는 환자는 소변에서 혈청 크레아티닌, 소변 단백질 또는 혈액에 유의하고 재생가능한 증가로서 정의되는 신장 발적의 시간 동안 모니터링될 수 있다. 다르게 또는 추가로, 환자는 항핵 항체 및 이중 가닥 DNA에 대한 항체의 수준에 대해 모니터링될 수 있다. SLE를 위한 치료는 고-투여량 코르티코스테로이드 및(또는) 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다.Yet another aspect of the invention is a method of treating lupus or SLE by administering a therapeutically effective amount of a humanized CD20 binding antibody of the invention to a patient suffering from SLE. SLEDAI score is a numerical quantification of disease activity. SLEDAI is an index in the numerical range of 0 to 103 of the 24 clinical and experimental parameters known to be associated with disease activity. See Bryan Gescuk & John Davis, "Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus" in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14: 515-521. Antibodies to double-stranded DNA are believed to cause kidney redness and other signs of lupus. Patients receiving antibody treatment may be monitored for the time of kidney redness, defined as a significant and reproducible increase in serum creatinine, urine protein or blood in the urine. Alternatively or in addition, patients may be monitored for levels of antinuclear antibodies and antibodies against double stranded DNA. Treatments for SLE include high-dose corticosteroids and / or cyclophosphamide (HDCC).
척추관절병증은 강직 척추염, 건선 관절염 및 크론병을 비롯한 관절의 장애의 군이다. 치료 성공은 허가된 환자 및 의사의 전체적인 평가 측정 도구에 의해 결정될 수 있다.Spondyloarthropathies are a group of disorders of the joints including ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis and Crohn's disease. Treatment success can be determined by the overall assessment measurement tool of authorized patients and physicians.
다양한 의약을 사용하여 건선을 치료하고; 치료는 질환의 중증도에 따라 직접적으로 달라진다. 건성의 보다 온건한 형태를 앓는 환자는 전형적으로 국소 치료, 예컨대 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타졸로 및 타자로텐을 사용하여 질환을 치료하는 반면, 중간 및 심한 건선을 알는 환자는 전신 (메토 트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 LTVB) 치료법을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 타르를 또한 사용한다. 이들 치료법은 안전상의 문제, 시간 소비성 요법 또는 치료의 불편한 과정의 조합을 가진다. 추가로, 일부는 사무실 환경에 고가의 장비 및 전용 공간이 필요하다. 전신 의약은 심각한 부작용, 예컨대 고혈압, 고지혈증, 골수 억제, 간 질환, 신장 질환 및 위장관 항진을 발생시킬 수 있다. 또한, 광치료법의 사용은 피부암의 발병률을 증가시킬 수 있다. 국소 치료법의 사용과 관련된 불만족 및 불편 외에, 광치료법 및 전신 치료법은 환자에게 치료법을 시행하고 중단하는 것을 반복하고, 이들의 부작용으로 인한 평생 노출을 모니터링해야한다.Various medicines are used to treat psoriasis; Treatment depends directly on the severity of the disease. Patients with more moderate forms of dryness typically use topical therapies such as topical steroids, anthraline, calcipotriene, clobetazolo and tazarotene, while patients with moderate and severe psoriasis are known. It is more preferred to use systemic (methototrexate, retinoid, cyclosporin, PUVA and LTVB) therapy. Tar is also used. These therapies have a combination of safety concerns, time consuming therapies or inconvenient processes of treatment. In addition, some require expensive equipment and dedicated space in the office environment. Systemic medications can cause serious side effects such as hypertension, hyperlipidemia, bone marrow suppression, liver disease, kidney disease and gastrointestinal hyperactivity. In addition, the use of phototherapy may increase the incidence of skin cancer. In addition to dissatisfaction and discomfort associated with the use of topical therapies, phototherapy and systemic therapies should be repeated on and off the treatment for the patient and monitor lifetime exposure due to their side effects.
건선을 위한 치료 효능을 기준 상태와 비교하여 의사의 전체적인 평가 (PGA) 변화, 및 건선 영역 및 중증도 지수 (PASI) 점수, 건선 증상 평가 (PSA)를 비롯한 질환의 임상적인 징후 및 증상에서의 변화를 모니터링함으로써 평가한다. 환자는 구체적인 시간점에서 경험되는 가려움의 정도를 나타내는 시각적 유사 척도 상에서 치료를 통해 주기적으로 특정될 수 있다.Changes in the physician's overall assessment (PGA) and clinical signs and symptoms of the disease, including psoriasis area and severity index (PASI) scores, psoriasis symptom assessment (PSA), by comparing treatment efficacy for psoriasis with baseline conditions. Evaluate by monitoring. Patients may be routinely identified through treatment on visual similar measures that indicate the extent of itching experienced at specific time points.
환자는 치료적 항체의 첫번째 주입과 함께 주입 반응 또는 주입-관련 증상을 경험할 수 있다. 이들 증상은 심각성이 다양하고, 일반적으로 의약적인 개입으로 가역된다. 이들 증상은 감기 유사 열, 오한/경직, 오심, 두드러기, 두통, 기관지연축, 혈관부종을 포함하나 이로써 제한되지 않는다. 본 발명의 질환 치료 방법이 주입 반응을 최소화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 측면 은 인간화 CD20 결합 항체가 리툭산®으로의 치료와 비교하였을 때 보체 의존 세포독성이 감소하거나 또는 없고, 그 결과 주입 관련 증상을 감소시키는 상기 항체를 투여함으로써 개시된 질환을 치료하는 방법이다. 하나의 실시양태에서, 인간화 CD20 결합 항체는 2H7.v116이다.The patient may experience an infusion response or infusion-related symptoms with the first infusion of the therapeutic antibody. These symptoms vary in severity and are generally reversible with medical intervention. These symptoms include, but are not limited to, cold-like fever, chills / stiffness, nausea, urticaria, headache, bronchospasm, angioedema. It may be desirable for the disease treatment methods of the invention to minimize infusion reactions. Thus, another aspect of the present invention provides a method for treating a disease disclosed by administering the antibody wherein the humanized CD20 binding antibody reduces or does not have complement dependent cytotoxicity as a result of treatment with Rituxan® , and thus reduces infusion-related symptoms. That's how. In one embodiment, the humanized CD20 binding antibody is 2H7.v116.
투여량Dosage
치료되는 적응증 및 당업계의 의사에게 친숙할 수 있는 투여량과 관련된 인자에 따라, 본 발명의 항체를 독성 및 부작용을 최소화하면서 상기 적응증의 치료를 위해 효과적인 투여량으로 투여할 수 있다. CD20 양성 암 또는 자가면역 질환의 치료를 위해, 치료 유효 투여량은 약 250 mg/m2 내지 약 400 mg/m2 또는 500 mg/m2, 바람직하게는 약 250 내지 375 mg/m2의 범위일 것이다. CD20 양성 B 세포 신생물의 치료의 하나의 실시양태에서, 항체를 300 내지 375 mg/m2의 범위로 투여한다. B-세포 림프종, 예컨대 비-호지킨 림프종을 앓고 있는 환자의 치료를 위해, 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항-CD20 항체 및 인간화 항-CD20 항체를 10 mg/kg 또는 375 mg/m2의 범위로 인간 환자에게 투여할 것이다. NHL를 치료하기 위해, 하나의 투여량 요법은 제1주 치료에서 10 mg/kg의 투여량인 항체 조성물 1 회분을 투여하고, 2주의 간격 후 동일한 양의 항체 제2의 1회분을 투여하는 것일 수 있다. 일반적으로 NHL 환자는 일반 1년 동안 상기 치료를 받고, 림프종이 재발하는 경우 상기 치료를 반복할 수 있다. 또다른 투여 요법에는, 저급 NHL로 치료받 는 환자는 4주의 인간화 2H7 버젼, 바람직하게는 v16 (매주 375 mg/m2)을 제공받고, 5주 후에 3주마다 3회 동안 표준 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 또는 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손) 화학요법에 추가로 추가 단계의 항체를 제공받는다.Depending on the indication being treated and factors related to dosages that are familiar to those skilled in the art, the antibodies of the present invention may be administered in effective dosages for the treatment of the indications with minimal toxicity and side effects. For the treatment of CD20 positive cancer or autoimmune disease, the therapeutically effective dosage ranges from about 250 mg / m2 to about 400 mg / m2 or 500 mg / m2 , preferably about 250 to 375 mg / m2 would. In one embodiment of the treatment of CD20 positive B cell neoplasia, the antibody is administered in the range of 300-375 mg / m2 . For the treatment of patients suffering from B-cell lymphoma, such as non-Hodgkin's lymphoma, in specific embodiments, the anti-CD20 antibody and the humanized anti-CD20 antibody of the present invention are administered at 10 mg / kg or 375 mg / m2 . To human patients in the range. To treat NHL, one dosage regimen is to administer one batch of antibody composition at a dose of 10 mg / kg in
류마티스성 관절염을 치료하기 위해, 하나의 실시양태에서, 인간화 항체에 대한 투여량 범위는 2회분으로 125 mg/m2 (약 200 mg/회분과 동량) 내지 600 mg/m2, 예를 들어 제1회 1회 분량인 200 mg을 제1일에 투여한 다음, 제2회 1회 분량인 200 mg을 제15일에 투여한다. 상이한 실시양태에서, 투여량은 250 mg/회분, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 425 mg, 450 mg, 475 mg, 500 mg, 525 mg, 550 mg, 575 mg 및 600 mg이다.To treat rheumatoid arthritis, in one embodiment, the dosage range for a humanized antibody ranges from 125 mg / m2 (equivalent to about 200 mg / batch) to 600 mg / m2 in two doses, eg, One dose of 200 mg is administered on
질환의 치료에서, 본 발명의 CD20 결합 항체는 상기 질환 분야의 의사에 의해 결정되어 만성적으로 또는 간헐적으로 환자에게 투여할 수 있다.In the treatment of a disease, the CD20 binding antibody of the invention can be administered to a patient chronically or intermittently as determined by the physician in the field of the disease.
정맥내 주입에 의해 또는 피하적으로 약물 투여된 환자는 발열, 오한, 작열감, 무력증 및 두통과 같은 부작용을 경험할 수 있다. 이러한 부작용을 완화시키기거나 최소화시키기 위해서는 환자는 황체의 초기 조건화 투여량을 받은 후 치료 투여량을 받을 수 있다. 조건화 투여량은 환자이 더 높은 투여량에 내성을 갖도록 조건화시키기 위해 치료 투여량 보다 낮을 것이다.Patients administered drug intravenously or subcutaneously may experience side effects such as fever, chills, burning sensation, lethargy and headache. To alleviate or minimize these side effects, the patient may receive a therapeutic dose after receiving an initial conditioned dose of corpus luteum. The conditioned dose will be lower than the therapeutic dose to condition the patient to be resistant to the higher dose.
투여 경로Route of administration
CD20 결합 항체는 인간 환자에게 공지된 방법에 따라, 예컨대 정맥내 투여, 예를 들어 볼루스로서 또는 장기간에 걸친 연속 주입에 의해, 피하, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 관절내, 활액내, 경막내 또는 흡입 경로, 일반적으로는 정맥내 또는 피하 투여에 의해 투여한다.CD20 binding antibodies are subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal, intrathecal, intraarticular, synovial, according to methods known to human patients, such as intravenous administration, for example as bolus or by prolonged continuous infusion, It is administered by the intradural or inhalation route, generally by intravenous or subcutaneous administration.
하나의 실시양태에서, 인간화 2H7 항체를 주입 비히클로서 0.9% 염화나트륨 용액과 함께 정맥내 주입으로 투여한다.In one embodiment, the humanized 2H7 antibody is administered by intravenous infusion with 0.9% sodium chloride solution as the infusion vehicle.
병용 치료법Combination Therapy
상기 기재한 B 세포 신생물의 치료에 있어서, 환자를 다중약물 요법으로 본 발명의 CD20 결합 항체와 함께 하나 이상의 치료제, 예컨대 화학요법제와 병용하여 치료할 수 있다. CD20 결합 항체는 동시적으로, 순차적으로 또는 교대로 화학요법제를 투여하거나 다른 치료로 반응이 없어진 후에 투여할 수 있다. 림프종 치료를 위한 표준 화학요법은 시클로포스파미드, 시타라빈, 멜팔란 및 미톡산트론에 멜판란 추가를 포함할 수 있다. CHOP은 비-호지킨 림프종을 치료하기 위한 가장 흔한 화학치료법 요법 중 하나이다. 다음의 약물은 CHOP 요법에 사용되는 약물이다: 시클로포스파미드 (상표명 시톡산, 네오사르); 아드리아마이신 (독소루비신/히드록시독소루비신) ; 빈크리스틴 (온코빈) ; 및 프레드니솔론 (종종 델타손 또는 오라손으로 불림). 특별한 실시양태에서, CD20 결합 항체를 하나 이상의 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 화학요법제와 함께 이를 필요로 하는 환자에게 투여한다. 구체적인 실시양태에서, 림프종 (예컨대, 비-호지킨 림프종)을 앓는 환자를 본 발명의 항-CD20 항체와 함께 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 치료법을 병용하여 치료한다. 또다른 실시양 태에서, 암 환자를 본 발명의 인간화 CD20 결합 항체와 함께 CVP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손) 화학치료법을 병용하여 치료할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, CD20-양성 NHL을 앓는 환자를 인간화 2H7.v16과 함께 CVP를 병용하여 치료한다. CLL 치료의 구체적인 실시양태에서, CD20 결합 항체를 플루다라빈 및 시톡산 중 하나 또는 모두로의 화학치료법과 함께 투여한다.In the treatment of B cell neoplasias described above, patients may be treated in multidrug therapy in combination with one or more therapeutic agents, such as chemotherapeutic agents, in combination with the CD20 binding antibody of the invention. CD20 binding antibodies may be administered concurrently, sequentially or alternately after the chemotherapeutic agent or after other treatments have stopped responding. Standard chemotherapy for the treatment of lymphoma may include the addition of melpanlan to cyclophosphamide, cytarabine, melphalan and mitoxantrone. CHOP is one of the most common chemotherapy regimens for treating non-Hodgkin's lymphoma. The following drugs are drugs used for CHOP therapy: cyclophosphamide (tradename Cytosan, Neosar); Adriamycin (doxorubicin / hydroxydoxorubicin); Vincristine (oncorbin); And prednisolone (often called deltason or orason). In a particular embodiment, a CD20 binding antibody is administered to a patient in need thereof with one or more of the chemotherapeutic agents of doxorubicin, cyclophosphamide, vincristine and prednisolone. In specific embodiments, patients suffering from lymphoma (eg, non-Hodgkin's lymphoma) are treated with a combination of CHOP (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone) therapy with an anti-CD20 antibody of the invention. In another embodiment, cancer patients can be treated in combination with CVP (cyclophosphamide, vincristine and prednisone) chemotherapy with humanized CD20 binding antibodies of the invention. In specific embodiments, patients suffering from CD20-positive NHL are treated with CVP in combination with humanized 2H7.v16. In specific embodiments of CLL treatment, the CD20 binding antibody is administered in combination with chemotherapeutic treatment with either or both fludarabine and citosan.
상기 기재한 자가면역 질환 또는 자가면역 관련 증상을 치료하는데 있어서, 환자를 예를 들어 다중 약물 요법으로 본 발명의 CD20 결합 항체와 함께 제2 치료제, 예컨대 면역억제제를 병용하여 치료할 수 있다. CD20 결합 항체를 동시적으로, 순차적으로 또는 교대로 면역억제제를 투여하거나 다른 치료법으로 반응이 없어진 후에 투여할 수 있다. 면역억제제는 당업계에 기술된 바와 동일하거나 그 미만의 투여량으로 투여할 수 있다. 바람직한 보조 면역억제제는 치료할 장애의 유형 및 환자의 병력을 비롯한 다수 인자에 따라 달라질 것이다.In treating the autoimmune disease or autoimmune related symptoms described above, the patient can be treated in combination with a second therapeutic agent, such as an immunosuppressant, in combination with a CD20 binding antibody of the invention, for example, in multiple drug therapy. CD20 binding antibodies may be administered concurrently, sequentially or alternately after the immunosuppressive agent or after the response has been lost by other therapies. Immunosuppressants can be administered at doses equal to or less than those described in the art. Preferred adjuvant immunosuppressants will depend on a number of factors, including the type of disorder to be treated and the history of the patient.
본원에 사용되는 보조 치료법을 위한 "면역억제제"는 환자의 면역계를 저해하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 말한다. 이러한 제제는 키모킨 생성을 저하시키거나, 자가-항원 발현을 하향 조절하거나 저해하거나, 또는 MHC 항원을 차폐하는 물질을 포함할 수 있다. 이러한 제제의 예로 스테로이드, 예컨대 글루코코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 덱사메타손; 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘 (미국 특허 제4,665,077호 참고), 아자티오프린 (또는 아자티오프린에 부작용 반응이 있는 경우, 시클로포스파미드); 브로모크립틴; 글루타르알데히드 (미국 특허 제4,120,649호에 기재되어 있는 바와 같이 MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린 A; 항-인터페론-γ, -β 또는 -α 항체를 비롯한 시토킨 또는 시토킨 수용체 길항체; 항-종양 괴사 인자-α 항체; 항-종양 괴사 인자-β 항체; 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 팬-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 용해성 펩티드 (1990년 7월 26일에 공개된 제WO 90/08187호); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스퍼구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (미국 특허 제5,114,721호); T-세포 수용체 단편 (문헌 [Offner et al., Science 251: 430-432 (1991)]; 제WO 90/11294호; 및 제WO 91/01133)호; 및 T 세포 수용체 항체 (제EP 340,109호), 예컨대 T10B9를 포함한다.As used herein, an "immunosuppressant" for adjuvant therapy refers to a substance that acts to inhibit or mask the immune system of a patient. Such agents may include substances that lower chemokine production, downregulate or inhibit self-antigen expression, or mask MHC antigens. Examples of such agents include steroids such as glucocorticosteroids such as prednisone, methylprednisolone and dexamethasone; Dexamethasone; 2-amino-6-aryl-5-substituted pyrimidines (see US Pat. No. 4,665,077), azathioprine (or cyclophosphamide, if there is a side effect of azathioprine); Bromocriptine; Glutaraldehyde (masks MHC antigens as described in US Pat. No. 4,120,649); Anti-idiotype antibodies against MHC antigens and MHC fragments; Cyclosporin A; Cytokine or cytokine receptor antagonists, including anti-interferon-γ, -β or -α antibodies; Anti-tumor necrosis factor-α antibodies; Anti-tumor necrosis factor-β antibody; Anti-interleukin-2 antibodies and anti-IL-2 receptor antibodies; Anti-L3T4 antibodies; Heterologous anti-lymphocyte globulin; Pan-T antibodies, preferably anti-CD3 or anti-CD4 / CD4a antibodies; Soluble peptides containing LFA-3 binding domains (WO 90/08187 published July 26, 1990); Streptokinase; TGF-β; Streptodonase; RNA or DNA from the host; FK506; RS-61443; Deoxyspergualin; Rapamycin; T-cell receptor (US Pat. No. 5,114,721); T-cell receptor fragments (Offner et al., Science 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; and WO 91/01133); And T cell receptor antibodies (EP 340,109) such as T10B9.
류마티스성 관절염을 치료하기 위해, 환자를 본 발명의 CD20 항체와 함께 하나 이상의 DMARDS (질환-개질 항-류마티스 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트), NSAI 또는 NSAID (비-스테로이드성 항-염증성 약물), HUMIRATM (아달리무마브; Abbott Laboratories), ARAVA® (레플루노미드), REMICADE (인플릭시마브; Centocor Inc., Malvern, Pa), ENBREL (에타네르셉트; Immunex, WA), COX-2 억제제의 약물을 병용하여 치료할 수 있다. RA에 통상적으로 사용되는 DMARD는 히드록시클로로퀸, 술파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 에타네르셉트, 인플릭시마브, 아자티오프린, D-페니실라민, 금 (경구), 금 (근육내), 미노시클린, 시클로스포린, 포도 알균 단백질 A 면역흡착이다. 아달리무마브는 TNFα에 결합하는 인간 모노클로날 항체이다. 인플릭시맵은 TNFα에 결합하는 키메라 모노클로날 항체이다. 에타네르셉트는 인간 IgG1의 Fc 일부와 연결된 인간 75 kD (p75) 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)의 세포외 리간드 결합 일부로 이루어진 "면역부착" 융합 단백질이다. RA의 통상적인 치료를 위해, 예를 들어 "류마티스 관절혐의 관리를 위한 가이드라인"인 문헌 [Arthritis & Rheumatism 46 (2): 328-346 (February, 2002)]을 참고한다. 구체적인 실시양태에서, RA 환자는 본 발명의 CD20 항체와 함께 메토트렉세이트 (MTX)를 병용하여 치료한다. MTX의 예시적인 투여량은 약 7.5 내지 25 mg/kg/주이다. MTX는 경구 또는 피하 투여할 수 있다.To treat rheumatoid arthritis, a patient is treated with one or more DMARDS (disease-modifying anti-rheumatic drugs (eg methotrexate), NSAI or NSAID (non-steroidal anti-inflammatory drugs), in combination with a CD20 antibody of the invention, HUMIRATM (Adalimumab; Abbott Laboratories), ARAVA® (Reflunomide), REMICADE (Infliximab; Centocor Inc., Malvern, Pa), ENBREL (Etanercept; Immunex, WA), COX-2 Drugs of inhibitors can be combined to treat DMARDs commonly used in RA include hydroxychloroquine, sulfasalazine, methotrexate, leflunomide, etanercept, infliximab, azathioprine, D-penicila Min, gold (oral), gold (intramuscular), minocycline, cyclosporin, staphylococcal protein A immunoadsorption Adalimumab is a human monoclonal antibody that binds to TNFα Infliximab binds to TNFα Chimeric monoclonal antibody. Tannercept is an “immunoadhesive” fusion protein consisting of an extracellular ligand binding portion of the human 75 kD (p75) tumor necrosis factor receptor (TNFR) linked to the Fc portion of human IgG1 For conventional treatment of RA, for example See Arthritis & Rheumatism 46 (2): 328-346 (February, 2002), “Guidelines for the Management of Rheumatoid Arthritis.” In specific embodiments, RA patients are methotrexate with the CD20 antibody of the present invention. (MTX) in combination An exemplary dosage of MTX is about 7.5 to 25 mg / kg / week MTX may be administered orally or subcutaneously.
강직 척추염, 건선 관절염 및 크론병을 치료하기 위해, 환자를 본 발명의 CD20 항체와 함께 예를 들어 레미케이드 (인플릭시마브; Centocor Inc., Malvern, Pa), ENBREL (에타네르셉트; Immunex, WA)을 병용하여 치료할 수 있다.To treat ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis and Crohn's disease, patients are treated with the CD20 antibody of the present invention, for example, with remicade (Infliximab; Centocor Inc., Malvern, Pa), ENBREL (Etanercept; Immunex, WA). ) Can be used in combination.
SLE의 치료는 고-투여량의 코르티코스테로이드 및(또는) 시클로포스파미드 (HDCC)를 포함한다.Treatment of SLE includes high-dose corticosteroids and / or cyclophosphamide (HDCC).
건선을 치료하기 위해, 환자를 CD20 결합 항체를 국소 치료, 예컨대 국소 스테로이드, 안트랄린, 칼시포트리엔, 클로베타졸 및 타자로텐, 또는 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린, PUVA 및 UVB 치료법과 함께 투여할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 건선 환자를 시클로스포린가 함께 순차적으로 또는 동시적으로 CD20 결합 항체로 치료한다.To treat psoriasis, patients are administered CD20 binding antibodies in combination with topical therapy, such as topical steroids, anthraline, calcipotriene, clobetasol and tazarotene, or methotrexate, retinoid, cyclosporine, PUVA and UVB therapy. can do. In one embodiment, psoriasis patients are treated with CD20 binding antibodies sequentially or simultaneously with cyclosporines.
제약 제제Pharmaceutical formulation
본 발명에 따라 사용되는 CD20-결합 항체의 치료 제제를 임의의 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 함께 동결건조된 제제 또는 수용성 용액 형태로 혼합하여 저장용으로 제조된다. 적합한 담체, 부형체 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 인산, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충용액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 (글루코스, 만노스 또는 덱스트린 포함); 킬레이팅제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 자당, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 포함한다.The therapeutic preparation of the CD20-binding antibody used according to the invention is lyophilized with any pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)). Prepared for storage by mixing in the form of a formulation or an aqueous solution. Suitable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers such as phosphoric acid, citric acid and other organic acids; Antioxidants including ascorbic acid and methionine; Preservatives (eg, octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride, benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propyl paraben; catechol; Resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); Low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; Proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins; Hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; Monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates (including glucose, mannose, or dextrins); Chelating agents such as EDTA; Sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; Salt-forming counter ions such as sodium; Metal complexes (eg, Zn-protein complexes); And / or nonionic surfactants such as TWEEN ™, PLURONICS ™ or polyethylene glycol (PEG).
예시적인 항-CD20 항체 제제가 본원에 참고문헌으로 명백히 인용된 WO 98/56418에 기재되어 있다. 또다른 제제는 2 내지 8 ℃에서 2년 저장의 최소 유효 수명을 갖는 pH 5.0인 40 mg/mL인 항-CD20 항체, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할 로스, 0.9% 벤질 알콜, 0.02% 폴리소르베이트 20을 포함하는 액체 다중투여 제제이다. 목적하는 또다른 항-CD20 제제는 pH 6.5인 9.0 mg/mL 염화나트륨, 7.35 mg/mL 나트륨 시트레이트 디히드레이트, 0.7 mg/mL 폴리소르베이트 80 및 주사용 멸균수 중 10 mg/mL 항체를 포함한다. 또한, 또다른 수성 제약 제제는 약 pH 4.8 내지 약 pH 5.5, 바람직하게는 pH 5.5인 10 내지 30 mM 나트륨 아세테이트, 약 0.01-0.1% v/v의 양으로 계면활성제로서 폴리소르베이트, 약 2-10% w/v의 양으로 트레할로스 및 보존제로서 벤질 알콜 (미국 특허 제6,171,586호)을 포함한다. 피하 투여를 위해 적합화된 동결건조된 제제는 제W097/04801호에 개시되어 있다. 이러한 동결건조 제제는 적합한 희석액으로 고농도의 단백질로 재구성될 수 있으며, 상기 재구성 제제는 본원에서 치료하는 동물에게 피하 투여할 수 있다.Exemplary anti-CD20 antibody formulations are described in WO 98/56418, which is expressly incorporated herein by reference. Another formulation is 40 mg / mL anti-CD20 antibody, 25 mM acetate, 150 mM trehalose, 0.9% benzyl alcohol, 0.02% polysorbate, pH 5.0 with a minimum useful life of 2 years storage at 2-8 ° C. Liquid multidose
인간화 2H7 변이체에 대한 하나의 제제는 pH 5.8인 10 mM 히스티딘, 6% 수크로스, 0.02% 폴리소르베이트 20 중 12 내지 14 mg/ml인 항체이다.One formulation for the humanized 2H7 variant is an antibody that is 12-14 mg / ml in 10 mM histidine, 6% sucrose, 0.02
구체적인 실시양태에서, 2H7 변이체, 특히 2H7.v16은 pH 5.8인 10 mM 히스티딘 술페이트, 60 mg/ml 수크로스, 0.2 mg/ml 폴리소르베이트 20 및 주사용 멸균수 중 20 mg/mL 항체로 제제화한다.In a specific embodiment, the 2H7 variant, particularly 2H7.v16, is formulated with 10 mM histidine sulfate, 60 mg / ml sucrose, 0.2 mg /
또한, 본원의 제제는 바람직하게는 보충 활성을 가지나 서로 부정적으로 작용하지 않는, 치료되는 특정 적응증에 필요한 하나 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 시토킨 또는 면역억제제 (예를 들어 T 세포에 대해 작용하는 면역억제제, 예컨대 시클로스포린 또는 T 세포와 결합하는 항체, 예를 들어 LFA-1에 결합하는 항체)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 다른 제제의 효과량은 상기 제제에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 장애의 유형 또는 치료의 유형, 및 상기 논의한 기타 인자에 따라 다르다. 이들은 일반적으로 본원에 기재한 바와 같은 투여 경로로 동일한 투여량을 사용되거나, 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.In addition, the formulations herein may contain one or more active compounds necessary for the particular indication to be treated, which preferably have complementary activities but do not act negatively with each other. For example, cytotoxic agents, chemotherapeutic agents, cytokines or immunosuppressive agents (e.g., immunosuppressive agents acting on T cells such as cyclosporin or antibodies that bind T cells, such as LFA-1 It may be desirable to further provide). The effective amount of the other agent depends on the amount of antibody present in the agent, the type of disease or disorder or the type of treatment, and other factors discussed above. They are generally used at the same dosage as the route of administration as described herein, or at about 1-99% of the dosage used so far.
또한, 활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼 중에서 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐 각각에 포획될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.The active ingredient can also be used in a colloidal drug delivery system (e.g. liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or in macroemulsions, for example coacervation techniques or interfacial polymerization, for example hydroxymethyl It may also be entrapped in microcapsules prepared by cellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methylmethacrylate) microcapsules, respectively. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
서방형 제제를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예로는 상기 항체를 함유하는 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 등이 있는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT (등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 등이 있다.Sustained release formulations can be prepared. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, and the matrices are in the form of shaped articles, eg, films, or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactide (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid And injections of copolymers of ethyl-L-glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, degradable lactic acid-glycolic acid copolymers, for example LUPRON DEPOT® (lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate Possible microspheres) and poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야만 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 수행된다.The formulation to be used for in vivo administration must be sterile. This is readily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.
제품 및Products and키트Kit
본 발명의 또다른 실시양태는 자가면역 질환 및 관련 증상 및 CD20 양성 암, 예컨대 비-호지킨 림프종의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이다. 이러한 제품은 용기 및 이러한 용기 상에 부착되어 있거나 용기에 들어 있는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기의 예로는 병, 바이알, 주사기 등이 있다. 이러한 용기는 유리 또는 플라스틱 등과 같은 다양한 재료로부터 제조될 수 있다. 상기 용기에는 암 증상의 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균성 입구를 가질 수 있다 (예를 들어 이러한 용기는 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액제 백 또는 바이알일 수 있음). 이러한 조성물 중의 1종 이상의 활성 작용제는 본 발명의 CD20 결합 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물에는 조성물이 암의 치료에 사용된다는 것이 표시되어 있다. 상기 라벨 또는 포장 삽입물은 암 환자에게 상기 항체 조성물을 투여하기 위한 지침서를 추가로 포함할 것이다. 패키지 삽입물은 상기 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용도, 용량, 투여, 금기 사항 및(또는) 주의 사항에 대한 정보를 포함하는 상업용 치료 제품 패키지에 통상적으로 포함된 지시를 말한다. 하나의 실시양태에서, 패키지 삽입물은 본 조성물이 비-호지킨 림프종을 치료하는데 사용되는 것임을 지시한다.Another embodiment of the invention is a product containing substances useful for the treatment of autoimmune diseases and related symptoms and CD20 positive cancers such as non-Hodgkin's lymphoma. Such products include a container and a label or package insert attached to or contained in the container. Examples of suitable containers include bottles, vials, syringes and the like. Such containers can be made from various materials, such as glass or plastic. The container contains a composition effective for the treatment of cancer symptoms and may have a sterile inlet (for example, this container may be an intravenous solution bag or vial with a stopper that can be penetrated with a hypodermic needle) . At least one active agent in such a composition is a CD20 binding antibody of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used to treat cancer. The label or package insert will further comprise instructions for administering the antibody composition to a cancer patient. A package insert refers to instructions normally included in a commercial therapeutic product package that includes information about indications, uses, dosages, administration, contraindications, and / or precautions regarding the use of the therapeutic product. In one embodiment, the package insert indicates that the composition is used to treat non-Hodgkin's lymphoma.
또한, 상기 제품은 제약상 허용가능한 완충액, 예를 들어 박테리아 증식 억제성 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 상업적인 관점 및 사용자 관점에서 바 람직한 기타 물질, 예컨대 기타 완충액, 희석제, 여과제, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the product may further comprise a second container comprising a pharmaceutically acceptable buffer, such as bacterial growth inhibitory water for injection (BWFI), phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. The product may further comprise other materials that are desirable from a commercial and user standpoint, such as other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.
다양한 목적, 예를 들어 아폽토시스 분석을 위한 양성 대조군으로서 B-세포 사멸의 분석, 세포로부터 CD20의 정제 또는 면역침전에 유용한 키트도 제공한다. CD20의 단리 및 정제를 위해, 상기 키트는 비드 (예를 들어 세파로스 비드)에 커플링된 항-CD20 항체를 함유할 수 있다. 예를 들어 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 CD20을 시험관내 검출 및 정량하기 위한 항체를 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 제품의 경우와 마찬가지로, 키트는 용기 및 상기 용기 상에 부착되어 있거나 용기에 들어 있는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 상기 용기에는 1종 이상의 본 발명의 항-CD20 항체를 포함하는 조성물이 들어 있다. 예를 들어 희석제 및 완충액, 대조군 항체를 함유하는 용기를 추가로 포함시킬 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물에 대한 설명서 뿐만 아니라 의도된 시험관내 또는 진단 용도로 사용하기 위한 지침서를 제공할 수 있다.Kits useful for assaying B-cell killing, purification of CD20 from cells or immunoprecipitation as a positive control for various purposes, eg, apoptosis assays, are also provided. For isolation and purification of CD20, the kit may contain an anti-CD20 antibody coupled to beads (eg, Sepharose beads). Kits containing antibodies for detecting and quantifying CD20 in vitro, for example by ELISA or Western blot, can be provided. As with the product, the kit includes a container and a label or package insert attached to or contained in the container. The container contains a composition comprising at least one anti-CD20 antibody of the invention. For example, a container containing a diluent, a buffer, and a control antibody may be further included. The label or package insert may provide instructions for the composition as well as instructions for use for intended in vitro or diagnostic purposes.
시노몰거스Sinomolgus 원숭이 monkeyCD20CD20
본 발명은 또한 도 19에 나타낸 바와 같은 시노몰거스 원숭이 CD20의 서열 24의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 핵산은 cDNA이다. 하나의 실시양태에서, 원숭이 CD20을 코딩하는 핵산은 숙주 세포에서 발현하기 위한 발현 벡터이다. 발현 벡터 중 서열 24의 뉴클레오티드 서열은 발현 제어 서열, 예컨대 프로모터 또는 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된다. 발현 제어 서열은 시노몰거스 CD20 유전자와 정상적으로 관련된 천연 서열 또는 상기 유전자에 이종인 서열일 수 있다. 또한, 시노몰거스 원숭이 CD20의 아미노산 서열 [서열 25; 도 19 및 20]을 포함하는 단리된 폴리펩티드 및 시노몰거스 CD20 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 일면에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 CHO 세포이다. 시노몰거스 CD20 아미노산 서열 또는 상기 서열의 단편을 포함하는 융합 단백질을 또한 고려한다.The invention also provides an isolated nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 of cynomolgus monkey CD20 as shown in FIG. 19. In one embodiment, the nucleic acid is cDNA. In one embodiment, the nucleic acid encoding monkey CD20 is an expression vector for expression in a host cell. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 in the expression vector is operably linked with an expression control sequence, such as a promoter or promoter and enhancer. The expression control sequence may be a native sequence normally associated with the cynomolgus CD20 gene or a sequence heterologous to said gene. Furthermore, the amino acid sequence of cynomolgus monkey CD20 [SEQ ID NO: 25; 19 and 20 provide host cells containing the isolated polypeptide and cynomolgus CD20 nucleic acid. In one embodiment, the host cell is a eukaryotic cell, eg, a CHO cell. Also contemplated are fusion proteins comprising cynomolgus CD20 amino acid sequences or fragments of these sequences.
실험Experiment실시예Example
실시예Example 1 One
22H7H7 항- term-CD20CD20뮤린Murine모노클로날Monoclonal 항체의 인간화 Humanization of Antibodies
뮤린 항-인간 CD20 항체, 2H7 (본원에서 m2H7로서도 언급함, m은 뮤린)의 인간화는 일련의 위치-지정 돌연변이 유발 단계로 수행하였다. 뮤린 2H7 항체 가변 영역 서열 및 마우스 V 및 인간 C를 갖는 키메라 2H7이 예를 들어, 미국 특허 제5,846,818호 및 제6,204,023호에 기재되어 있다. 2H7의 CDR 잔기를 공지된 항체의 서열을 갖는 뮤린 2H7 가변 도메인의 아미노산 서열 (미국 특허 제5,846,818호에 개시됨)과 비교하여 확인하였다 (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). 경쇄 및 중쇄의 CDR 영역을 서열 초가변성을 기초로 한정하고 (Kabat et al., 상기 문헌), 각각 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. 합성 올리고뉴클레오티드 (표 1)를 사용하여 위치-지정 돌연변이 유발로 모든 6개의 뮤린 2H7 CDR 영역을 플라스미드 pVX4 (도 2) 상에 함유된 컨센서스 서열 VκI, VHIII (VL 카파 아군 I, VH 아군 III)에 상응하는 완전 인간 Fab 프레임워크 내에 도입하였다.Humanization of the murine anti-human CD20 antibody, 2H7 (also referred to herein as m2H7, m is murine) was performed in a series of site-directed mutagenesis steps. Chimeric 2H7 with murine 2H7 antibody variable region sequences and mouse V and human C are described, for example, in US Pat. Nos. 5,846,818 and 6,204,023. The CDR residues of 2H7 were identified by comparison with the amino acid sequence of the murine 2H7 variable domain with the sequence of known antibodies (disclosed in US Pat. No. 5,846,818) (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). CDR regions of the light and heavy chains were defined based on sequence hypervariability (Kabat et al., Supra) and shown in FIGS. 1A and 1B, respectively. Synthetic oligonucleotides (Table 1), the position with - all six murine The consensus sequence contains a 2H7 CDR regions on plasmid pVX4 (Fig. 2), Vκ I, VH III (VL by directed mutagenesis kappa ally I, It was introduced into the fully human Fab framework corresponding to VH subgroup III).
돌연변이 유발 및 이. 콜라이에서 F(ab)의 발현을 위해 파지미드 pVX4 (도 2)를 사용하였다. 파지미드 pb0720, pB0475의 유도체 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989))를 기초로 하여, pVX4는 인간화 컨센서스 κ-아군 I 경쇄 (VLκI-CL) 및 인간화 컨센서스 아군 III 중쇄 (VHIII-CH1) 항-IFN-α (인터페론α) 항체를 코딩하는 DNA 단편을 함유한다. pVX4는 또한 모두가 또다른 상기 기재된 pUC119-기재의 플라스미드인 pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992))로부터 유도된 알칼리 포스파타제 프로모터 및 샤인-달가노 서열을 가진다. 유일한 Spel 제한 부위를 F(ab) 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 사이에 도입하였다. 항-IFN-α 중쇄 및 경쇄 모두에서 처음 23개 아미노산은 StII 분비 신호 서열이다 (Chang et al., Gene 55 : 189-196 (1987)).Mutagenesis and teeth. Phagemid pVX4 (FIG. 2) was used for expression of F (ab) in E. coli. Based on phagemid pb0720, derivatives of pB0475 (Cunningham et al., Science 243: 1330-1336 (1989)), pVX4 is a humanized consensus κ-subgroup I light chain (VL κI-CL ) and humanized consensus subgroup III Heavy chain (VH III-CH 1) contains a DNA fragment encoding an anti-IFN-α (interferonα) antibody. pVX4 is also an alkaline phosphatase promoter and shine-dalgano sequence derived from pAK2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)), all of which are also another described pUC119-based plasmid Has The only Spel restriction site was introduced between the DNA encoding the F (ab) light and heavy chains. The first 23 amino acids in both the anti-IFN-α heavy and light chains are the St II secretion signal sequence (Chang et al., Gene 55: 189-196 (1987)).
2H7 (2H7.v2)의 CDR-교환 버젼을 작제하기 위해, 위치-지정 돌연변이 유발 을 데옥시우리딘을 함유하는 pVX4의 주형 상에서 수행하였으며; 항-IFN-α의 6개의 모든 CDR이 뮤린 2H7 CDR로 변화하였다. 생성된 분자를 인간화 2H7 버젼 2 (2H7.v2) 또는 2H7의 "CDR-교환 버젼"으로 언급하며; 이는 도 1a 및 1B에 나타낸 컨센서스 인간 FR 잔기와 함께 m2H7 CDR 잔기를 가진다. 인간화 2H7.v2는 추가 인간화를 위해 사용하였다.To construct a CDR-exchange version of 2H7 (2H7.v2), site-directed mutagenesis was performed on a template of pVX4 containing deoxyuridine; All six CDRs of anti-IFN-α were changed to murine 2H7 CDRs. The resulting molecule is referred to as humanized 2H7 version 2 (2H7.v2) or the “CDR-exchange version” of 2H7; It has an m2H7 CDR residue along with the consensus human FR residue shown in FIGS. 1A and 1B. Humanized 2H7.v2 was used for further humanization.
표 1은 H 및 L 쇄에서 각각의 뮤린 2H7 (m2H7) CDR를 생성하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열을 보여준다. 예를 들어, CDR-H1 올리고뉴클레오티드를 사용하여 m2H7 H 쇄 CDR1을 재생성한다. CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3를 각각 H 쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 언급하며, 유사하게 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3은 각각 L 쇄 CDR로 언급한다. CDR-H2에서의 치환은 2개의 올리고뉴클레오티드, CDR-H2A 및 CDR-H2B로 두 단계에서 수행되었다.Table 1 shows the oligonucleotide sequences used to generate the respective murine 2H7 (m2H7) CDRs in the H and L chains. For example, CDR-H1 oligonucleotides are used to regenerate m2H7 H chain CDR1. CDR-H1, CDR-H2 and CDR-H3 are referred to as H chain CDR1, CDR2 and CDR3, respectively, and similarly CDR-L1, CDR-L2 and CDR-L3 are referred to as L chain CDRs, respectively. Substitution in CDR-H2 was performed in two steps with two oligonucleotides, CDR-H2A and CDR-H2B.
[표 1]TABLE 1
pVX4에서 인간 프레임워크 뮤린 2H7 CDR의 CDR-교환의 작제를 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 서열. 각각의 올리고뉴클레오티드에 의해 변경된 잔기는 밑줄그었다.Oligonucleotide sequence used for construction of CDR-exchange of human framework murine 2H7 CDRs at pVX4. Residues modified by each oligonucleotide are underlined.
인간화 작제와 비교하기 위해, 키메라 2H7 Fab (뮤린 VL 및 VH 도메인, 및 인간 CL 및 CHI 도메인을 함유함)를 발현하는 플라스미드를 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 위치-지정 돌연변이 유발 (Kunkel, 상기 문헌)로 2H7.v2 내에 뮤린 프레임워크 잔기를 도입함으로써 작제하였다. 2H7.v6.8로 공지된 키메라 Fab의 발현을 위한 생성된 플라스미드 작제의 서열을 도 3에 나타내었다. Fab의 각각의 코 딩된 쇄는 pVX4 (도 2)에 대해 상기 기재한 바와 같은 23개 아미노산 StII 분비 신호 서열을 가진다.For comparison with humanization constructs, plasmids expressing chimeric 2H7 Fabs (containing murine VL and VH domains, and human CL and CHI domains) were subjected to site-directed mutagenesis using synthetic oligonucleotides (Kunkel, Supra), by introducing murine framework residues in 2H7.v2. The sequence of the resulting plasmid construct for expression of the chimeric Fab known as 2H7.v6.8 is shown in FIG. 3. Each encoded chain of Fab has a 23 amino acid St II secretion signal sequence as described above for pVX4 (FIG. 2).
인간 VκI, VHIII 컨센서스 프레임워크 (도 1a 및 1B) 및 상기 인간화 항체 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992))와 뮤린 2H7 프레임워크 잔기의 서열 비교를 기초로 하여, 여러 프레임워크 돌연변이를 위치-지정 돌연변이 유발로 2H7.v2 Fab 작제 내에 도입하였다. 이러한 돌연변이는 특정 인간 컨센서스 프레임워크 잔기를 뮤린 2H7 프레임워크에 발견되는 잔기로 변화시키고, 이 부위에서 CDR 입체형태 또는 항원 접촉에 영향을 미칠 수 있다. 버젼 3은 VH(R71V, N73K)를 함유하고, 버젼 4는 VH(R71V)를 함유하고, 버젼 5는 VH(R71V, N73K) 및 VL(L46P)를 함유하고, 버젼 6은 VH(R71V, N73K) 및 VL(L46P, L47W)를 함유하였다.Of human VκI, VH III consensus framework (FIGS. 1A and 1B) and the humanized antibody (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289 (1992)) and murine 2H7 framework residues Based on sequence comparisons, several framework mutations were introduced into the 2H7.v2 Fab construct by site-directed mutagenesis. Such mutations may change certain human consensus framework residues to residues found in the murine 2H7 framework and may affect CDR conformation or antigenic contact at this site.
m2H7 항체의 인간화 Fab 버젼 및 키메라 Fab 버젼을 이. 콜라이에서 발현시키고, 하기와 같이 정제하였다. 이중- 및 단일-가닥 DNA의 제조를 위해 이. 콜라이 균주 XL-1 Blue (Stratagene, San Diego, CA)를 플라스미드들로 형질전환시켰다. 각각의 변이체에 대해, 경쇄 및 중쇄 모두를 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sequenase, U.S. Biochemical Corp.)을 사용하여 완전히 서열분석하였다. 5 ㎍/ml 카르베니실린을 함유하는 LB 플레이트 상에 단백질 발현을 위해 선택된 단일 콜로니인 MM294의 유도체, 이. 콜라이 균주 16C9를 플라스미드로 형질전환시켰다. 상기 단일 콜로니를 5 ml LB-100 ㎍/ml 카르베니실린 중에 5 내지 8 시간 동안 37 ℃에서 성장시켰다. 5 ml 배양액을 500 ml AP5-100 ㎍/ml 카르베니실린에 첨가하고, 4 L 배플 장착 진탕 플라스크 중에 16 시간 동안 37 ℃에서 성장시켰다. AP5 배지 (pH 7.4)를 1 L 물에 1.5 g 글루코스, 11.0 히케이스 (Hycase) SF, 0.6 g 효모 추출액 (보증됨), 0.19 g 무수 MgS04, 1.07 g NH4Cl, 3.73 g KCl, 1.2 g NaCl, 120 ml 1M 트리에탄올아민로 구성한 다음, 0.1 ㎛ 실킨 (Sealkeen) 여과기를 통해 멸균 여과하였다.Humanized Fab and chimeric Fab versions of the m2H7 antibody were determined by E. coli. Expressed in E. coli and purified as follows. For the preparation of double- and single-stranded DNA. E. coli strain XL-1 Blue (Stratagene, San Diego, Calif.) Was transformed with plasmids. For each variant, both light and heavy chains were fully sequenced using the dideoxynucleotide method (Sequenase, US Biochemical Corp.). Derivatives of MM294, a single colony selected for protein expression on LB plates containing 5 μg / ml carbenicillin, E. E. coli strain 16C9 was transformed with a plasmid. The single colonies were grown at 37 ° C. for 5-8 hours in 5 ml LB-100 μg / ml carbenicillin. 5 ml culture was added to 500 ml AP5-100 μg / ml carbenicillin and grown in a 4 L baffle equipped shake flask at 37 ° C. for 16 hours. AP5 medium (pH 7.4) in 1 L water, 1.5 g glucose, 11.0 Hycase SF, 0.6 g yeast extract (guaranteed), 0.19 g anhydrous MgS04 , 1.07 g NH4 Cl, 3.73 g KCl, 1.2 g NaCl, 120 ml 1M triethanolamine, and then sterile filtered through a 0.1 μm Silkeen filter.
세포를 1 L 원심분리 병 (Nalgene)에서 3000 × g로 원심분리하여 수확하고, 상층액을 제거하였다. 1 시간 동안 냉동시킨 후, 펠렛을 냉각된 10 mM MES-10 mM EDTA, pH 5.0 (완충액 A) 25 ml 중에 재현탁하였다. 0.1 M PMSF (Sigma) 250 ㎕를 첨가하여 단백질가수분해를 억제하고, 계란 백색 이소자임 10 mg/ml 스톡 3.5 ml를 첨가하여 박테리아 세포벽의 용혈을 보조하였다. 얼음 상에서 1 시간 동안 온건히 진탕한 후, 샘플을 40,000 × g로 15 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 완충액 A와 함께 50 ml로 만들고, 완충액 A로 평형된 2 ml DEAE 컬럼상에 로딩하였다. 그 다음, 관통-흐름을 완충액 A로 평형된 단백질 G-세파로스 (Sepharose) CL-4B (Pharmacia) 컬럼 (층 부피 0.5 ml)에 수행하였다. 컬럼을 완충액 A 10 ml로 세척하고, 0.3 M 글리신 (pH 3.0) 3 ml로 1M 트리스 (Tris) (pH 8.0) 1.25 ml 중으로 용출시켰다. 그 다음, F(ab)를 센트리콘 (Centricon)-30 (Amicon)을 사용하여 PBS 중으로 교환하고, 최종 부피 0.5 ml로 농축시켰다. 모든 F(ab)의 SDS-PAGE 겔을 순도 확인을 위해 전개시키고, 각각의 변이체의 분자량을 전자분무 질량 분광법으 로 입증하였다.Cells were harvested by centrifugation at 3000 × g in a 1 L centrifuge bottle (Nalgene) and the supernatant was removed. After frozen for 1 hour, the pellet was resuspended in 25 ml of chilled 10 mM MES-10 mM EDTA, pH 5.0 (buffer A). Proteolysis was inhibited by adding 250 μl of 0.1 M PMSF (Sigma) and 3.5 ml of
세포-기재 ELISA 결합 분석 (하기 기재됨)에서, 키메라 2H7 Fab를 비롯한 Fab의 CD20과의 결합을 검출하기가 어려웠다. 따라서, 2H7 Fab 버젼을 분석 및 추가 돌연변이 유발을 위해 전장 IgG1 항체로서 재형시켰다.In cell-based ELISA binding assays (described below), it was difficult to detect binding of Fabs to CD20, including chimeric 2H7 Fabs. Thus, 2H7 Fab versions were reshaped as full length IgG1 antibodies for analysis and further mutagenesis.
전장 IgG'의 발현을 위한 플라스미드를 포유동물 세포 발현 (Gorman et al.; DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990))을 위한 상기 기재된 pRK 벡터 내에 키메라 2H7 (v6.8) Fab의 VL 및 VH 도메인 및 인간화 Fab 버젼 2 내지 6을 서브클로닝하여 작제하였다. 간단하게 설명하면, 각각의 Fab 작제물을EcoRV 및BlpI으로 소화시켜 VL 단편을 자르고, 이를 완전 경쇄 (VL-CL 도메인)의 발현을 위한 플라스미드 pDR1 (도 4)의EcoRV/BlpI 부위 내로 클로닝하였다. 추가로, 각각의 Fab 작제를PvuII 및ApaI로 소화시켜 VH 단편을 자르고, 이를 완전 중쇄 (VH-CH1-힌지-CH2-CH3 도메인)의 발현을 위한 플라스미드 pDR2 (도 5)의PvuII/ApaI 부위 내로 클로닝하였다. 각각의 IgG 변이체에 대해, 경쇄 발현 플라스미드 및 중쇄 발현 플라스미드를 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주, 293 (Graham et al., J. Gen. Tirol., 36: 59-74, (1977)) 내에 공동-형질감염시킴으로써 일시적 형질감염을 수행하였다. 간단하게 설명하면, 293 세포를 형질감염 전 1일에 분할시키고, 혈청을 함유한 배지 중에 플레이팅하였다. 그 다음 날, 칼슘 포스페이트 침전물로서 제조된 이중-가닥 DNA를 첨가한 후, pAdVAntageTM DNA (Promega, Madison, WI) 및 세포를 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세포를 혈청이 없는 배지 중에 배양 하고, 4일 후에 수확하였다. 항체를 단백질 A-세파로스 CL-4B를 사용하여 배양 상층액으로부터 정제한 다음, 완충액을 10 mM 나트륨 숙시네이트, 140 mM NaCl (pH 6.0)로 교환하고, 센트리콘-10 (Amicon)을 사용하여 농축하였다. 단백질 농축액을 정량적 아미노산 분석으로 측정하였다.Plasmids for the expression of full-length IgG 'were transformed into chimeric 2H7 (v6.8) Fab in the pRK vectors described above for mammalian cell expression (Gorman et al .; DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3-10 (1990)). VL and VH domains and humanized
CD20 항원에 대한 상대적 결합 친화도를 측정하기 위해, 세포-기재 ELISA 분석을 사용하였다. 인간 B-림프구모세포 WIL2-S 세포 (ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 습윤된 5% CO2 인큐베이터 내에서 2 mM L-글루타민, 20 mM HEPES (pH 7.2) 및 10% 열-불활성화 소태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 중에 성장시켰다. 세포를 PBS를 함유하는 1% FBS (분석 완충액)로 세척하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 (Nunc, Roskilde, Denmark)에서 웰 당 250 내지 300,000 세포로 시딩하였다. 분석 완충액 중 2-배 계열 희석 표준 (2H7 v6.8 키메라 IgG 15.6 내지 1000 ng/ml) 및 3-배 계열 희석 샘플 (2.7 내지 2000 ng/ml)을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 얼음에 묻고 45 분 동안 인큐베이션시켰다. 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해, 0.1 mL 분석 완충액을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포를 0.2 mL 분석 완충액으로 2회 이상 세척하였다. 플레이트에 결합된 항체는 염소 항-인간 항체 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에 접합된 퍼옥시다제를 플레이트에 첨가하여 검출하였다. 45분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 상기 기재한 바와 같이 세척하였다. TMB 기질 (3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 플레이트에 첨가하였다. 반응을 1M 인산을 첨가하여 중지하였다. 적정 곡선을 4개 파라미터 비선형 회귀 곡선-피팅 프로그램 (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA)으로 피팅하였다. 적정 곡선의 중점 (mid-OD) 및 이의 상응하는 표준 농도에서 흡수도를 측정하였다. 그 다음, 이 mid-OD에서 각각의 변이체 농도를 측정하고, 표준 농도를 각각의 변이체의 농도로 나누었다. 이에 따른 값은 표준에 비한 각각의 변이체 결합의 비율이다. 상대적 친화성의 표준 편차 (등가 농도)는 실험 간에 일반적으로 ±10%이었다.To determine the relative binding affinity for the CD20 antigen, cell-based ELISA assays were used. Human B-lymphocytes WIL2-S cells (ATCC CRL 8885, American Type Culture Collection, Rockville, MD) were treated with 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES (pH 7.2) and 10% heat in a wet 5% CO2 incubator. -Grows in RPMI 1640 supplemented with inactivated fetal bovine serum. Cells were washed with 1% FBS (assay buffer) containing PBS and seeded at 250-300,000 cells per well in 96-well round bottom plates (Nunc, Roskilde, Denmark). Two-fold series dilution standards (2H7 v6.8 chimeric IgG 15.6-1000 ng / ml) and three-fold series dilution samples (2.7-2000 ng / ml) in assay buffer were added to the plates. The plate was buried in ice and incubated for 45 minutes. To remove unbound antibody, 0.1 mL assay buffer was added to the wells. The plate was centrifuged and the supernatant removed. Cells were washed two more times with 0.2 mL assay buffer. Antibodies bound to the plate were detected by addition of peroxidase conjugated to goat anti-human antibodies (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) to the plate. After incubation for 45 minutes, the cells were washed as described above. TMB substrate (3,3 ', 5,5'-tetramethyl benzidine; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) was added to the plate. The reaction was stopped by adding 1 M phosphoric acid. Titration curves were fitted with a four parameter nonlinear regression curve-fitting program (KaleidaGraph, Synergy software, Reading, PA). Absorbance was measured at the midpoint of the titration curve (mid-OD) and its corresponding standard concentration. Each variant concentration was then measured in this mid-OD and the standard concentration was divided by the concentration of each variant. The resulting value is the ratio of each variant binding to the standard. The standard deviation (equivalent concentration) of relative affinity was generally ± 10% between experiments.
표 2에 나타낸 바와 같이 CDR-교환 변이체 (v.2)의 결합도는 키메라 2H7 (v. 6.8)에 비해 극적으로 감소하였다. 그러나, 버젼 3 내지 6은 개선된 결합도를 보였다. 키메라 2H7의 수에 대한 결합 친화도를 회복하는데 필요할 수 있는 돌연변이의 최소수를 결정하기 위해, 추가 돌연변이 및 돌연변이의 조합을 위치-지정 돌연변이 유발로 작제하여 표 2에 나타낸 바와 같은 변이체 7 내지 17을 생성하였다. 특히, 이들은 VH 돌연변이 A49G, F67A, I69L, N73K 및 L78A; 및 VL 돌연변이 M4L, M33I 및 F71Y를 포함하였다. 버젼 16 및 17은 둘 사이에 유의한 차이점 없이 (표준 편차 = ±10%), 키메라 버젼의 결합 친화도의 2 배 내의 최고 상대적 결합 친화도를 나타내었다. 돌연변이의 수를 최소화하기 위해, 단지 4개의 인간 프레임워크 잔기의 뮤린 프레임워크 잔기 (표 2)로의 돌연변이를 포함하는 버젼 16을 추가 특성화를 위해 인간화 형태로서 선택하였다.As shown in Table 2, the degree of binding of CDR-exchange variants (v.2) was dramatically reduced compared to chimeric 2H7 (v. 6.8). However,
[표 2]TABLE 2
세포-기재 ELISA를 사용한 키메라 2H7에 비교되는 CD20으로의 인간화 2H7 IgG 변이체의 상대적 결합 친화도. 상대적 결합도는 등가량 결합에 필요한 변이체의 농도에 대한 키메라 2H7의 농도로서 나타내며; 따라서 1 미만의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 약하다는 것을 나타낸다. 상대적 친화성 측정에서 표준 편차는 평균 ±10%이다. 가변 도메인에서 프레임워크 치환은 캐뱃 (Kabat)의 번호매김 체계 (Kabat et al., 상기문헌)에 따라 CDR-교환 버젼에 상대적이다.Relative binding affinity of humanized 2H7 IgG variants with CD20 compared to chimeric 2H7 using cell-based ELISA. Relative binding is expressed as the concentration of chimeric 2H7 relative to the concentration of variant required for equivalent binding; Thus, a ratio of less than 1 indicates a weaker affinity for the variant. In relative affinity measurements, the standard deviation is on average ± 10%. Framework substitutions in the variable domains are relative to the CDR-exchange version according to Kabat's numbering system (Kabat et al., Supra).
[표 3]TABLE 3
인간화 2H7 버젼 16 (2H7.v16)에서 돌연변이 VH(A49G, R71V, N73K) 및 VL(L46P)의 작제를 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 서열. 밑줄친 코돈은 지시된 아미노산 치환을 코딩한다. VH(R71V, N73K) 및 VL (L46P)에 대해서, 올리고는 이들이 Fab 주형에서의 돌연변이 유발을 위해 사용되기 때문에 센스 가닥으로 나타내고, 반면에 VH(A49G)에 대해서 올리고는 이들이 pRK (IgG 중쇄) 주형으로 사용되기 때문에 안티-센스 가닥을 나타낸다. 버젼 16의 단백질 서열을 도 6 및 도 7에 나 타내었다.Oligonucleotide sequence used for the construction of mutant VH (A49G, R71V, N73K) and VL (L46P) in humanized 2H7 version 16 (2H7.v16). Underlined codons encode the indicated amino acid substitutions. For VH (R71V, N73K) and VL (L46P), oligos are represented as sense strands because they are used for mutagenesis in Fab templates, whereas for VH (A49G) they are raised as pRK (IgG heavy chain) templates It is used as an anti-sense strand. The protein sequence of
실시예Example 2 2
22H7H7의 항원-결합 결정인자 (Antigen-binding determinants of파라토프Paratope))
CD20에 대한 결합에서 항체의 개별 측쇄의 공헌성을 시험해 보기 위해 2H7.v16 또는 2H7.v17에 알라닌 치환 (Cunningham & Wells, Science 244: 1081-1085 (1989))을 수행하였다. IgG 변이체를 293 세포에서 pDR1 및 pDR2 벡터로부터 발현시키고, 이를 정제하고, 상기 기재한 바와 같은 상대적 결합 친화도에 대해 분석하였다. 여러 알라닌 치환이 WIL-2S 세포 상의 CD20에 대한 상대적 결합도에 유의한 감소를 일으켰다 (표 4).Alanine substitutions (Cunningham & Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)) in 2H7.v16 or 2H7.v17 were performed to test the contribution of the individual side chains of the antibody in binding to CD20. IgG variants were expressed from pDR1 and pDR2 vectors in 293 cells, purified, and analyzed for relative binding affinity as described above. Several alanine substitutions resulted in a significant decrease in the relative binding to CD20 on WIL-2S cells (Table 4).
[표 4]TABLE 4
세포-기재 ELISA (WIL2-S 세포)를 사용하여 측정된 인간화 2H7.v16의 CDR 영역에 있어서의 알라닌 치환의 영향. 상대적 결합도를 동등 결합을 위해 필요한 변이체의 농도에 비한 2H7.v16 모체의 농도로서 표현하였으며; 따라서 1 미만의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 약하다는 것을 나타내고, 1 초과의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 높은 것을 나타낸다. 상대적 친화성 측정에서 표준 편차는 평균 ±10%이다. 가변 도메인에서 프레임워크 치환은 캐뱃의 번호매김 체계 (Kabat et al., 상기문헌)에 따라 2H7.v16에 상대적이다. NBD는 측정불가능한 결합을 의미한다. 버젼 45에 대한 두 수는 별개의 실험으로부터 유래하였다.Effect of Alanine Substitution in the CDR Region of Humanized 2H7.v16, Measured Using Cell-Based ELISA (WIL2-S Cells). Relative binding is expressed as the concentration of 2H7.v16 parent as compared to the concentration of variant required for equivalent binding; Thus, a ratio below 1 indicates a weaker affinity for the variant and a ratio above 1 indicates a higher affinity for the variant. In relative affinity measurements, the standard deviation is on average ± 10%. Framework substitutions in the variable domains are relative to 2H7.v16 according to Kabat's numbering system (Kabat et al., Supra). NBD means unmeasurable binding. The two numbers for
실시예Example 3 3
22H7H7CDRCDR 영역 내의 추가 돌연변이 Additional mutations within the region
또한, Ala-스캐닝에 의해 중요한 것으로 확인된 CDR 위치에서 추가 잔기 치환 및 치환들의 조합을 시험하였다. 여러 조합 변이체, 특히 v.96은 v.16에 비해 보다 단단히 결합하는 것으로 나타났다.In addition, additional residue substitutions and combinations of substitutions at the CDR positions identified as important by Ala-scanning were tested. Several combination variants, especially v.96, have been shown to bind more tightly than v.16.
[표 5]TABLE 5
세포-기재 ELISA (WIL2-S 세포)를 사용하여 측정된 인간화 2H7.v16의 CDR 영역에 있어서의 돌연변이 및 비-알라닌 치환의 조합의 영향. CD20에 대한 상대적 결합도를 동등 결합을 위해 필요한 변이체의 농도에 비한 2H7.v16 모체의 농도로서 표현하였으며; 따라서 1 미만의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 약하다는 것을 나타내고, 1 초과의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 높은 것을 나타낸다. 상대적 친화성 측정에서 표준 편차는 평균 ±10%이다. 가변 도메인에서 프레임워크 치환은 캐뱃의 번호매김 체계 (Kabat et al., 상기문헌)에 따라 2H7.v16에 상대적이다.Influence of a combination of mutations and non-alanine substitutions in the CDR regions of humanized 2H7.v16 measured using cell-based ELISA (WIL2-S cells). Relative binding to CD20 was expressed as the concentration of 2H7.v16 parent as compared to the concentration of variant required for equivalent binding; Thus, a ratio below 1 indicates a weaker affinity for the variant and a ratio above 1 indicates a higher affinity for the variant. In relative affinity measurements, the standard deviation is on average ± 10%. Framework substitutions in the variable domains are relative to 2H7.v16 according to Kabat's numbering system (Kabat et al., Supra).
실시예Example 4 4
프레임워크Framework 인간화 치환 부위에서의 돌연변이 Mutations at Humanized Substitution Sites
또한, 인간화 동안 변화되는 프레임워크 위치에서의 추가 잔기 치환을 2H7.v16 배경에서 시험하였다. 특히, 뮤린 2H7 모체 및 인간 컨센서스 프레임워크 어디에서도 발견되지 않는 대체 프레임워크 치환을 VL(P46) 및 VH(G49, V71 및 K73)에서 수행하였다.In addition, additional residue substitutions at framework positions that change during humanization were tested in the 2H7.v16 background. In particular, alternative framework substitutions not found anywhere in the murine 2H7 parent and human consensus framework were performed in VL (P46) and VH (G49, V71 and K73).
일반적으로 이들 치환은 상대적 결합도에는 거의 변화를 가져오지 않았으며 (표 6), 이는 이들 위치에서는 프레임워크 잔기에 어느 정도의 융통성이 있음을 나타낸다.In general, these substitutions resulted in little change in relative binding (Table 6), indicating some flexibility in framework residues at these positions.
[표 6]TABLE 6
프레임워크 치환의 세포-기재 ELISA (WIL2-S 세포) 분석에서의 상대적 결합도. IgG 변이체를 2H7.v16 배경에 대한 돌연변이로 나타내었다. 상대적 결합도를 동등 결합을 위해 필요한 변이체의 농도에 비한 2H7.v6.8 키메라의 농도로서 표현하였으며; 따라서 1 미만의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 약하다는 것을 나타내고, 1 초과의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 높은 것을 나타낸다. 상대 적 친화성 측정에서 표준 편차는 평균 ±10%이다. 가변 도메인에서 프레임워크 치환은 캐뱃의 번호매김 체계 (Kabat et al., 상기문헌)에 따라 2H7.v16에 상대적이다. (*) 변이체는 2H7.v16과 함께 표준 비교체로서 분석되었음; 상대적 값은 키메라의 값으로 표준화하였음.Relative binding in cell-based ELISA (WIL2-S cells) analysis of framework substitutions. IgG variants are shown as mutations against the 2H7.v16 background. Relative binding is expressed as the concentration of 2H7.v6.8 chimera relative to the concentration of variant required for equivalent binding; Thus, a ratio below 1 indicates a weaker affinity for the variant and a ratio above 1 indicates a higher affinity for the variant. In relative affinity measurements, the standard deviation is on average ± 10%. Framework substitutions in the variable domains are relative to 2H7.v16 according to Kabat's numbering system (Kabat et al., Supra). (*) Variants were analyzed as standard comparative with 2H7.v16; Relative values are normalized to the values of chimeras.
(*) 변이체는 2H7.v16과 함께 표준 비교체로서 분석되었음; 상대적 값은 키메라의 값으로 표준화하였음.(*) Variants were analyzed as standard comparative with 2H7.v16; Relative values are normalized to the values of chimeras.
실시예Example 5 5
향상된Enhanced이펙터Effector 기능을 갖는 인간화 2 Humanization with
2H7이 보체-의존 세포독성 (CDC) 및 항체-의존 세포매개 세포 독성 (ADCC) 모두를 통해 B-세포의 용혈을 매개할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 개선된 CDC 및 ADCC 활성을 갖는 인간화 2H7.v16의 변이체의 생성을 시도하였다. 다른 항체의 Fc 영역 내의 특정 잔기의 돌연변이가 보체 성분 C1q에 대한 향상된 결합을 통해 CDC를 향상시킨다는 것이 기재되어 있다 (Idusogie et al., J. Immunol. 166: 2571-2575 (2001)). 또한, 활성화된 Fcγ 수용체에 대한 IgG 결합 향상 및 억제성 Fcγ 수용체에의 IgG 결합 감소를 통해 ADCC를 향상시키는 돌연변이가 기재되어 있다 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001); Presta et al., Biochem. Soc. Trans. 30: 487-490 (2002)). 특히, S298A/E333A/K334A 돌연변이가 CDC 및 ADCC 활성을 향상시키는 것으로 확인되었으며 (또한 본원에서 3중 Ala 돌연변이 또는 변이체로서 언급함; Fc 영역에서의 번호매김은 EU 번호매김 체계에 따른 것임; Kabat et al., 상기 문헌)), 이는 문헌 [Idusogie et al., 상기 문헌 (2001); Shields et al., 상기 문헌]에 기재되어 있다.Since 2H7 can mediate hemolysis of B-cells through both complement-dependent cytotoxicity (CDC) and antibody-dependent cytotoxic cytotoxicity (ADCC), we have humanized 2H7 with improved CDC and ADCC activity. An attempt was made to generate variants of v16. Mutations of certain residues in the Fc region of other antibodies have been described to enhance CDC through enhanced binding to complement component C1q (Idusogie et al., J. Immunol. 166: 2571-2575 (2001)). Also described are mutations that enhance ADCC through enhanced IgG binding to activated Fcγ receptors and reduced IgG binding to inhibitory Fcγ receptors (Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 ( Presta et al., Biochem. Soc. Trans. 30: 487-490 (2002)). In particular, S298A / E333A / K334A mutations have been shown to enhance CDC and ADCC activity (also referred to herein as triple Ala mutations or variants; numbering in the Fc region is according to the EU numbering system; Kabat et. al., supra), which is described in Idusogie et al., supra (2001); Shields et al., Supra.
2H7의 CDC 및 ADCC 활성을 개선하기 위해, 2H7 Fc의 3중 Ala 돌연변이를 작제하였다. 항-HER2 항체 4d5의 인간화 변이체를 돌연변이 S298A/E333A/K334A로 생성하였으며, 이는 4D5Fc110 (즉, 항-p185HER2 IgG1 (S298A/E333A/K334A); Shields et al., 상기 문헌)으로 공지되어 있다. 항체 4D5Fc110 (Shields et al., 상기 문헌)을 코딩하는 플라스미드, p4D5Fc110를Apal 및HindIII로 소화하고, Fc-단편 (돌연변이 S298A/E333A/K334A를 함유함)을 2H7 중쇄 벡터 pDR2-v16의ApaI/HindIII 부위 내로 라이게이션시켜 pDR2-v31을 생성하였다. 버젼 31 완전 H 쇄의 아미노산 서열을 도 8에 나타내었다. L 쇄는 v16의 L 쇄와 동일하였다.To improve CDC and ADCC activity of 2H7, a triple Ala mutation of 2H7 Fc was constructed. Humanized variants of anti-HER2 antibody 4d5 were generated with mutations S298A / E333A / K334A, which are known as 4D5Fc110 (ie, anti-p185 HER2 IgG1 (S298A / E333A / K334A); Shields et al., Supra). . The plasmid encoding antibody 4D5Fc110 (Shields et al., Supra), p4D5Fc110 was digested withApa l andHind III, and the Fc-fragment (containing mutations S298A / E333A / K334A) wasApa of the 2H7 heavy chain vector pDR2-v16. PDR2-v31 was generated by ligation into the I /Hind III site. The amino acid sequence of the version 31 full H chain is shown in FIG. 8. The L chain was identical to the L chain of v16.
IgG1 항체의 Fc 영역의 불변 도메인이 비교적 주어진 종 간에 비교적 보존되었으나, 대립유전자 변이체가 존재한다 (문헌 [Lefranc and Lefranc, in Tlae Human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43-78, F. Shakib (ed.), Pergamon Press, Oxford (1990)]를 개관).Although the constant domains of the Fc region of IgG1 antibodies have been relatively conserved among a given species, allelic variants exist (Lefranc and Lefranc, in Tlae Human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function, and regulation, pp. 43- 78, F. Shakib (ed.), Pergamon Press, Oxford (1990).
[표 7]TABLE 7
CD20 결합에 대한 Fc 영역에서의 치환의 영향. CD20에 대한 상대적 결합을 프레임워크 치환의 세포-기재 (WIL2-S) 분석에서 측정하였다. Fc 돌연변이 (*)를 EU 번호매김 (Kabat, 상기문헌)에 의해 나타내고, 2H7.v16 모체에 상대적이다. v.31의 Fc 영역에서의 3중 Ala 변화의 조합을 "Fc110"으로 기재하였다. IgG 변이체를 2H7.v16 배경에 대한 돌연변이로 나타내었다. 상대적 결합도를 동등 결합을 위해 필요한 변이체의 농도에 비한 2H7.v6.8 키메라의 농도로서 표현하였으며; 따라서 1 미만의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 약하다는 것을 나타낸다. 상대적 친화성 측정에서 표준 편차는 평균 ±10%이다.Effect of Substitution in the Fc Region on CD20 Binding. Relative binding to CD20 was measured in cell-based (WIL2-S) analysis of framework substitutions. Fc mutation (*) is indicated by EU numbering (Kabat, supra) and is relative to the 2H7.v16 parent. The combination of triple Ala changes in the Fc region of v.31 was described as "Fc110". IgG variants are shown as mutations against the 2H7.v16 background. Relative binding is expressed as the concentration of 2H7.v6.8 chimera relative to the concentration of variant required for equivalent binding; Thus, a ratio of less than 1 indicates a weaker affinity for the variant. In relative affinity measurements, the standard deviation is on average ± 10%.
실시예Example 6 6
향상된 안정성을 갖는 인간화 2Humanization with
치료 단백질로 개발하기 위해서는, 선택된 변이체가 적합한 제제 완충액 중에 생성물의 질에 영향을 미칠 수 있는 산화, 디아민화 또는 기타 반응에 대해 안정하게 남아있는 것이 바람직하다.2H7.v16에서 여러 잔기가 불안정성의 가능한 원인으로서 확인되었다: VL(M32) 및 VH(M34, N100). 따라서, v16과의 비교를 위해 이들 부위에 돌연변이를 도입하였다.In order to develop into a therapeutic protein, it is desirable that the selected variant remain stable against oxidation, deamination or other reactions that may affect the quality of the product in a suitable formulation buffer. Several residues in 2H7.v16 have been identified as possible causes of instability: VL (M32) and VH (M34, N100). Therefore, mutations were introduced at these sites for comparison with v16.
[표 8]TABLE 8
세포-기재 (WIL2-S) 분석에서 CD20에 대한 향상된 안정성 및(또는) 이펙터 기능을 위해 디자인된 2H7 변이체의 상대적 결합도. IgG 변이체를 2H7.v16 배경에 대한 돌연변이로 나타내었다. 상대적 결합도를 동등 결합을 위해 필요한 변이체의 농도에 비한 2H7.v6.8 키메라의 농도로서 표현하였으며; 따라서 1 미만의 비율은 변이체에 대한 친화성이 보다 약하다는 것을 나타낸다. 상대적 친화성 측정에서 표준 편차는 평균 ±10%이다. 가변 도메인에서 프레임워크 치환은 캐뱃의 번호매김 체계에 따라 2H7.v16에 상대적이며, Fc 돌연변이(*)는 EU 번호매김 (Kabat et al., 상기문헌)에 의해 나타내었다. (**) 변이체를 2H7.v16과 함께 표준 비교체로서 분석하고; 상대적 값은 키메라의 값으로 표준화하였다.Relative binding of 2H7 variants designed for improved stability and / or effector function on CD20 in cell-based (WIL2-S) assays. IgG variants are shown as mutations against the 2H7.v16 background. Relative binding is expressed as the concentration of 2H7.v6.8 chimera relative to the concentration of variant required for equivalent binding; Thus, a ratio of less than 1 indicates a weaker affinity for the variant. In relative affinity measurements, the standard deviation is on average ± 10%. Framework substitutions in the variable domains are relative to 2H7.v16 according to Kabat's numbering system, and Fc mutations (*) are indicated by EU numbering (Kabat et al., Supra). (**) variants were analyzed as standard comparative with 2H7.v16; Relative values were normalized to the values of chimeras.
추가 Fc 돌연변이를 안정성 또는 친화성-향성된 돌연변이와 합하여 이전에 보고된 돌연변이 (Idusogie et al. (2000); Idusogie et al. (2001); Shields et al. (2001))를 기초로 이펙터 기능을 변경하고 향상하였다. 이들 변화는 실시예 5에 기재된 S298, E333A, K334A를 포함하며; K322A는 CDC 활성이 감소하였고; D265A는 ADCC 활성이 감소하였고; K326A 또는 K326W는 CDC 활성이 향상되었고; E356D/M358L는 Fc 영역에서의 알로타입 변화에의 영향을 시험하였다. 이들 돌연변이 중 어느 것도 CD20 결합 친화도에 유의한 차이를 일으키지 않았다.Additional Fc mutations were combined with stability or affinity-directed mutations to effector function based on previously reported mutations (Idusogie et al. (2000); Idusogie et al. (2001); Shields et al. (2001)). Changed and improved. These changes include S298, E333A, K334A described in Example 5; K322A decreased CDC activity; D265A decreased ADCC activity; K326A or K326W improved CDC activity; E356D / M358L tested the effect on allotype changes in the Fc region. None of these mutations produced a significant difference in CD20 binding affinity.
(**) 변이체는 2H7.v16과 함께 표준 비교체로서 측정되었으며; 상대적 값은 키메라의 값으로 표준화하였다.(**) The variant was measured as a standard comparative with 2H7.v16; Relative values were normalized to the values of chimeras.
단백질 분해의 속도에 대한 안정 돌연변이의 영향을 시험하기 위해, 2H7.v16 및 2H7.v73을 10 mM 히스티딘, 6% 수크로스, 0.02% 폴리소르베이트 20 (pH 5.8) 중에 12 내지 14 mg/mL로 제제화하고, 16일 동안 40 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 인큐베이션된 샘플을 이온 교환 크로마토그래피로 전하 변이체에서의 변화에 대해, 크기 배제 크로마토그래피로 응집 및 단편화에 대해, 그리고 세포-기재 (WIL2-S) 분석에서 시험에 의한 상대적 결합도를 분석하였다.To test the effect of stable mutations on the rate of proteolysis, 2H7.v16 and 2H7.v73 were added at 12-14 mg / mL in 10 mM histidine, 6% sucrose, 0.02% polysorbate 20 (pH 5.8). Formulated and incubated at 40 ° C. for 16 days. The incubated samples were then analyzed for changes in charge variants with ion exchange chromatography, for aggregation and fragmentation with size exclusion chromatography, and for relative binding by test in cell-based (WIL2-S) analysis. It was.
결과 (도 9)는 가속되는 안정성 조건 하에서 이온 교환 크로마토그래피에 의 한 주요 피크의 분획 중 손실에 대하여 2H7 v.16과 비교하였을 때 안정성이 보다 크다는 것을 나타낸다. 응집, 단편화 또는 결합 친화도에 대해 어떠한 유의한 차이도 나타나지 않았다.The results (FIG. 9) show that the stability is greater as compared to 2H7 v.16 for the loss in fraction of the main peak by ion exchange chromatography under accelerated stability conditions. No significant difference was seen for aggregation, fragmentation or binding affinity.
실시예Example 7 7
WIL2WIL2-S 세포 상의On -S cellsCD20CD20과의 항체 결합의Of antibody binding to스캐차드Skachard 분석 analysis
WIL2-S 세포와의 2H7 IgG 변이체 결합도에 대한 평형 해리 상수 (Kd)를 방사선표지된 2H7 IgG를 사용하여 결정하였다. IgG 변이체를 CHO 세포에서 생성하였다. 리툭산® (모든 실험의 원료는 제넨테크 에스. (Genentech, S., San Francisco, CA)로부터 입수됨) 및 뮤린 2H7 (BD PharMingen, San Diego, CA)을 인간화 변이체와의 비교를 위해 사용하였다. 또한, 뮤린 2H7 항체는 예를 들어 이바이오사이언스 (eBioscience, San Diego, CA) 및 칼바이오켐 (Calbiochem, San Diego, CA), 아큐레이트 케미칼 앤 사이언티픽 코퍼레이션 (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY), 안셀 (Ancell, Bayport, MN) 및 빈시-바이오켐 (Vinci-Biochem, Vinci, Italy)으로부터 구입가능하다. 모든 희석은 결합 분석 완충액 (1% 소 혈청 알부민, 25 mM HEPES pH 7.2, 및 0.01% 나트륨 아지드를 함유하는 DMEM 배지) 중에 수행하였다. 0.8 nM의 농도의125I-2H7.v16 (락토퍼옥시다제로 요오드표식됨)의 분취액 (0.025 mL)을 V-바닥 96-웰 미세분석 플레이트의 웰에 시여하고, 냉각된 항체의 계열 희석액 (0.05 mL)을 첨가하고 혼합하였다. 그 다음, WIL2-S 세포 (0.025 mL 중 60,000 세포)를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 실 온에서 24 시간 동안 인큐베이션한 다음, 3,500 RPM으로 15 분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상층액을 흡인하고, 세포 펠렛을 세척하고, 원심분리하였다. 상층액을 다시 흡인하고, 펠렛을 1N NaOH 중에 용해시키고, 감마 계수를 위해 튜브레 옮겼다. 데이타를 프로그램 리간드 (Ligand, McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983))를 사용하는 스캐차드 분석 (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220-239 (1980))을 위해 사용하였다. 표 9에 나타낸 결과는 인간화 2H7 변이체가 뮤린 2H7과 비교하여 유사한 CD20 결합성을 가지고, 리툭산®과 유사한 결합 친화도를 가지는 것을 나타낸다. 2H7.v31이 상기 표 7에 나타낸 결합도를 기초하였을 때 v.16과 매우 유사한 Kd를 가질 것으로 예기된다.The equilibrium dissociation constant (Kd) for 2H7 IgG variant binding to WIL2-S cells was determined using radiolabeled 2H7 IgG. IgG variants were generated in CHO cells. Rituxan® (raw material for all experiments was obtained from Genentech, S., San Francisco, Calif.) And murine 2H7 (BD PharMingen, San Diego, Calif.) Were used for comparison with humanized variants. In addition, murine 2H7 antibodies are described, for example, in eBioscience, San Diego, Calif. And Calbiochem, San Diego, Calif., Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY), Ancell, Bayport, MN and Vinci-Biochem, Vinci, Italy. All dilutions were performed in binding assay buffer (DMEM medium containing 1% bovine serum albumin, 25 mM HEPES pH 7.2, and 0.01% sodium azide). Aliquots (0.025 mL) of125 I-2H7.v16 (iodine-labeled lactoperoxidase) at a concentration of 0.8 nM were seeded into the wells of a V-bottom 96-well microanalysis plate and serial dilutions of the cooled antibody. (0.05 mL) was added and mixed. Then, WIL2-S cells (60,000 cells in 0.025 mL) were added. The plate was sealed and incubated for 24 hours at room temperature and then centrifuged for 15 minutes at 3,500 RPM. The supernatant was then aspirated, the cell pellet washed and centrifuged. The supernatant was aspirated again, the pellet was dissolved in 1N NaOH, and the tube was transferred for gamma counting. Data is used for the Scatchar analysis (Munson and Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220-239 (1980)) using the program ligand (Ligand, McPherson, Comput. Programs Biomed. 17: 107-114 (1983)). It was. The results shown in Table 9 show that the humanized 2H7 variants have similar CD20 binding as compared to murine 2H7 and have similar binding affinity as Rituxan® . It is expected that 2H7.v31 will have a Kd very similar to v.16 based on the degree of binding shown in Table 7 above.
[표 9]TABLE 9
실시예Example 8 8
보체Complement 의존 세포독성 ( Dependent cytotoxicity (CDCCDC) 분석) analysis
2H7 IgG 변이체를 본질적으로 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000); Idusogie et al., J. Immunol 166: 2571-2575 (2001)]에 기재된 바와 같은 CD20를 발현하는 림프구모세포 B-세포주인 WIL2-S 세포의 보체-의존 용 혈을 매개하는 이들의 능력에 대해 분석하였다. 항체를 0.1 mg/mL 스톡 용액으로부터 1:3 계열 희석하였다. 각각의 희석액 0.05 mL 분취액을 정상 인간 보체 (Quidel, San Diego, CA)의 용액 0.05 mL를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. 이 혼합물에 50,000개 WIL2-S 세포를 0.05 mL 부피로 첨가하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션한 후, 알라머 블루 (Alamar blue (Accumed International, Westlake, OH))의 용액 0.05 mL를 첨가하고, 추가 18 시간 동안 37 ℃에서 계속 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트로부터 커버를 제거하고, 이들을 실온에서 궤도 진탕기 상에서 15 분 동안 진탕하였다. 상대적 형광 단위체 (RFU)를 530 nm 여기 여과기 및 590 nm 방출 여과기를 사용하여 판독하였다. EC50을 칼라이다그래프 (KaleidaGraph) 소프트웨어를 사용하여 각각의 항체에 대한 농도의 함수로서 RFU를 피팅하여 계산하였다.2H7 IgG variants are essentially described in Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000); Assays for their ability to mediate complement-dependent hemolysis of WIL2-S cells, lymphocytes B-cell line expressing CD20 as described in Idusogie et al., J. Immunol 166: 2571-2575 (2001). It was. Antibodies were serially diluted 1: 3 from 0.1 mg / mL stock solution. A 0.05 mL aliquot of each dilution was added to a 96-well tissue culture plate containing 0.05 mL of a solution of normal human complement (Quidel, San Diego, Calif.). To this mixture 50,000 WIL2-S cells were added in a volume of 0.05 mL. After incubation at 37 ° C. for 2 hours, 0.05 mL of a solution of Alamar blue (Accumed International, Westlake, OH) was added and incubation continued at 37 ° C. for an additional 18 hours. The covers were then removed from the plates and they were shaken for 15 minutes on an orbital shaker at room temperature. Relative fluorescent unit (RFU) was read using a 530 nm excitation filter and a 590 nm emission filter. EC50 was calculated by fitting RFU as a function of concentration for each antibody using KaleidaGraph software.
결과 (표 10)는 v.73에 대해서는 리툭산®과 유사한 상대적 효능, v.75에 대해서는 리툭산®보다 3배 높은 효능, v.16에 대해서는 리툭산®보다 3배 낮은 효능을 갖도록 인간화 2H7 항체에 의해 CDC에 있어서 놀라운 개선을 나타낸다.The results (Table 10) show the relative efficacy similar to Rituxan® for v.73, three times higher potency than Rituxan® for v.75, and three times lower potency than Rituxan® for v.16. It shows a surprising improvement in CDC.
[표 10]TABLE 10
리툭산에 비교되는 2H7 항체의 CDC 활성. 1 초과의 수는 리툭산®보다 낮은 효능을 나타내고, 1 미만의 수는 리툭산보다 높은 효능 활성을 나타낸다. (*)에 의해 지적된 일시적으로 생성된 항체를 제외하고, 항체들은 안정한 CHO 세포주로부 터 생성되었다.CDC activity of 2H7 antibody compared to Rituxan. Numbers greater than 1 show lower potency than Rituxan® and numbers less than 1 show higher potency activity than Rituxan. Except for the transiently produced antibodies indicated by (*), antibodies were generated from stable CHO cell lines.
실시예Example 9 9
항체 의존 세포 독성 (Antibody dependent cytotoxicity (ADCCADCC) 분석) analysis
2H7 IgG 변이체를 락테이트 디히드로게나제 (LDH) 판독기를 사용하여 본질적으로 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001)]에 기재된 바와 같은 CD20을 발현하는 림프구모세포 B-세포주인 WIL2-S 세포의 천연 킬러 세포 (NK 세포) 용혈을 매개하는 이들의 능력에 대해 분석하였다. CD16으로도 공지된 (Koene et al., Blood 90: 1109-1114 (1997)), FcγRIII에 대해 동형화된 정상 인간 공여자로부터 수득되고, PBS (인산염 완충 염수) 100 mL로 희석된 NK 세포를 헤파린처리된 혈액 100 mL로부터 준비하였다. 이 실험에서, NK 세포는 CD16 (F158/V158)에 대한 인간 공여자 이종접합체로부터 유래된다. 희석된 혈액을 림프구 분리 배지 (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) 15 mL 상에 층으로 만들고, 2000 RPM으로 20 분 동안 원심분리하였다. 층 사이 경계면에서의 백색 세포를 4개의 투명한 50-mL 튜브에 시여하고, 이를 15% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI로 충전하였 다. 튜브를 1400 RPM으로 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 펠렛을 MACS 완충액 (0.5% BSA, 2mM EDTA) 중에 재현탁시키고, NK 세포를 제조사 (Miltenyi Biotech)의 프로토콜에 따라 비드 (NK Cell Isolation Kit, 130-046-502)를 사용하여 정제하였다. NK 세포를 2 × 106 세포/mL가 되도록 MACS 완충액 중에 희석하였다.2H7 IgG variants were essentially prepared using a lactate dehydrogenase (LDH) reader, Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001) were analyzed for their ability to mediate natural killer cell (NK cell) hemolysis of WIL2-S cells, a lymphoblastic B-cell line expressing CD20. Heparinized NK cells obtained from normal human donors homozygous for FcγRIII, also known as CD16 (Koene et al., Blood 90: 1109-1114 (1997)), diluted with 100 mL of PBS (phosphate buffered saline). From 100 mL of the prepared blood. In this experiment, NK cells are derived from human donor heterozygotes for CD16 (F158 / V158). Diluted blood was layered on 15 mL of lymphocyte separation medium (ICN Biochemical, Aurora, Ohio) and centrifuged at 2000 RPM for 20 minutes. White cells at the interlayer interface were seeded in four clear 50-mL tubes and filled with RPMI containing 15% fetal bovine serum. The tube was centrifuged at 1400 RPM for 5 minutes and the supernatant was discarded. The pellet was resuspended in MACS buffer (0.5% BSA, 2 mM EDTA) and NK cells were purified using beads (NK Cell Isolation Kit, 130-046-502) according to the manufacturer's protocol (Miltenyi Biotech). NK cells were diluted in MACS buffer to 2 × 106 cells / mL.
분석 배지 (글리신이 없는 F12/DMEM 50:50, 1 mM HEPES 완충액 pH 7.2, 페니실린/스트렙토마이신 (100 유닛/mL; Gibco), 글루타민 및 1% 열-불활성화 소태아 혈청)에서의 항체의 계열 희석액 (0.05 mL)을 둥근-바닥 조직 배양 플레이트에 첨가하였다. WIL2-S 세포를 4 × 105/mL의 농도가 되도록 분석 완충액 중에 희석하였다. WIL2-S 세포 (웰 당 0.05 mL)를 96-웰 플레이트 상에서 희석된 항체와 혼합하고, 실온으로 30 분 동안 인큐베이션하여 항체를 CD20과 결합시켰다 (옵소닌화).Family of antibodies in assay medium (F12 / DMEM 50:50 without glycine, 1 mM HEPES buffer pH 7.2, penicillin / streptomycin (100 units / mL; Gibco), glutamine and 1% heat-inactivated fetal bovine serum) Dilutions (0.05 mL) were added to round-bottom tissue culture plates. WIL2-S cells were diluted in assay buffer to a concentration of 4 × 105 / mL. WIL2-S cells (0.05 mL per well) were mixed with the antibody diluted on 96-well plates and incubated for 30 minutes at room temperature to bind the antibody with CD20 (opsonized).
ADCC 반응을 각각의 웰에 NK 세포 0.1 mL를 첨가함으로써 개시하였다. 대조군 웰에는 2% 트리톤 (Triton) X-100을 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 방출된 LDH의 수준을 제조자의 지침서를 수반하는 세포독성 (LDH) 검출 키트 (Kit#1644793, Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana.)를 사용하여 측정하였다. LDH 현상액 0.1 mL를 각각의 웰에 첨가한 후, 10 초 동안 혼합하였다. 그 다음, 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고, 어둡게 실온에서 15 분 인큐베이션하였다. 그 다음, 490 nm에서의 흡광도를 판독하고, 대조군 웰에서 측정된 총 LDH로 나누어 용혈도 (%)를 계산하는데 사용하였다. 용혈도는 항체 농도의 함수로서 플롯되고, 4개 파라미터 곡선 피트 (칼라이다그래프)를 사용하여 EC50 농도를 측정하였다.ADCC reactions were initiated by adding 0.1 mL of NK cells to each well. To the
결과는 v.31 및 v.75에 대해서는 리툭산®보다 20배 높은 상대적 효능을 갖고, v.16에 대해서는 리툭산®보다 5배 높은 효능을 가지며, v.73에 대해서는 대부분 4배 이상의 효능을 갖도록 인간화 2H7 항체가 ADCC에 있어서 활성이라는 것을 나타낸다.The results are humanized to have a 20-fold higher potency than Rituxan® for v.31 and v.75, a 5-fold potency over Rituxan® for v.16, and almost four-fold potency for v.73. 2H7 antibody is active in ADCC.
[표 11]TABLE 11
추가 ADCC 분석을 리툭산®과 2H7의 조합-변이체를 비교하기 위해 수행하였다. 이들 분석의 결과는 2H7.v114 및 2H7.v115가 리툭산®과 비교하여 10배 초과의 개선된 ADCC 효능을 가진다는 것을 나타낸다 (표 12).Further ADCC analysis was performed to compare the combination-variants of Rituxan® with 2H7. The results of these assays show that 2H7.v114 and 2H7.v115 have more than 10-fold improved ADCC efficacy compared to Rituxan® (Table 12).
[표 12]TABLE 12
실시예Example 10 10
시노몰거스Sinomolgus원숭이에서의
CHO 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성된 2H7 변이체를 이들의 생체내 활성을 평가하기 위해 정상 수컷 시노몰거스 (Macaca fascicularis) 원숭이에서 시험하였다. 다른 항-CD20 항체, 예컨대 C2B8 (리툭산®)의 정상적인 영장류에서 B-세포를 고갈시키는 능력이 입증되었다 (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)).2H7 variants generated by transient transfection of CHO cells were tested in normal male Macaca fascicularis monkeys to assess their in vivo activity. The ability to deplete B-cells in normal primates of other anti-CD20 antibodies, such as C2B8 (Rituxan® ), has been demonstrated (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)).
하나의 연구에서, 인간화 2H7 변이체를 비교하였다. 병행 연구에서, 리툭산®을 또한 시노몰거스 원숭이에서 시험하였다. 5개의 투여량 군 각각에 4마리의 원숭이를 사용하였다: (1) 비히클, (2) 0.05 mg/kg hu2H7.v16, (3) 10 mg/kg hu2H7.v16, (4) 0.05 mg/kg hu2H7.v31 및 (5) 10 mg/kg hu2H7.v31. 항체를 연구 제1일째 한번, 제8일째 또 한번의 총 2회의 투여에 대해 0, 0.2, 또는 20 mg/mL의 농도로 정맥내 투여하였다. 투여한 첫날을 제1일로 나타내고, 그 전날을 제-1일로 나타내고, 회복한 첫날을 (각 군에서 2마리 동물에 대해) 제11일로 나타내었다. 혈액 샘플을 제-19일, 제-12일, 제1일 (투여전) 및 투여 후 6시간, 24 시간 및 72시간에 수집하였다. 추가 샘플을 제8일 (투여전), 제10일 (군 당 2마리의 동물 희생 전) 및 제36일 및 제67일 (회복한 동물에 대해)에 취했다.In one study, humanized 2H7 variants were compared. In a parallel study, Rituxan® was also tested in cynomolgus monkeys. Four monkeys were used in each of the five dose groups: (1) vehicle, (2) 0.05 mg / kg hu2H7.v16, (3) 10 mg / kg hu2H7.v16, (4) 0.05 mg / kg hu2H7 v31 and (5) 10 mg / kg hu2H7.v31. Antibodies were administered intravenously at concentrations of 0, 0.2, or 20 mg / mL for a total of two administrations, once on
말초 B-세포 농도를 CD3-/CD40+ 세포를 계수하는 FACS 방법으로 측정하였다. 원숭이 샘플에서 전체 림프구의 CD3-/CD40+ B 세포의 백분율을 하기의 게이팅법 (gating strategy)에 의해 수득하였다. 림프구 집단을 한정된 영역 1 (R1)에 정면 산란/측면 산란의 산란도 상에 표시하였다. R1 중의 사건을 사용하여, 형광 강도 점 플롯을 CD40 및 CD3 마커에 대해 나타내었다. 형광성 표지된 동형 대조군을 사용하여 CD40 및 CD3 양성률에 대한 개별 컷오프 포인트를 측정하였다.Peripheral B-cell concentrations were measured by the FACS method of counting CD3- / CD40 + cells. The percentage of CD3- / CD40 + B cells of total lymphocytes in monkey samples was obtained by the following gating strategy. Lymphocyte populations are displayed on scatter plots of frontal / lateral scattering in defined region 1 (R1). Using events in R1, fluorescence intensity dot plots are shown for CD40 and CD3 markers. Individual cutoff points for CD40 and CD3 positive rates were measured using fluorescent labeled homologous controls.
결과는 2H7.v16 및 2H7.v31 모두가 10 mg/kg 투여량에서 완전 말초 B-세포 고갈을 일으킬 수 있고, 0.05 mg/kg 투여량에서 부분 말초 B-세포 고갈을 일으킬 수 있다는 것을 나타낸다 (도 11). 투여한 후 처음 72 시간 동안 측정된 B-세포 고갈의 시간 과정 및 한도는 두 항체에 대해 유사하였다. 회복된 동물의 후속적인 분석은 2H7.v31로 치료된 동물이 2H7.v16을 투여한 동물과 비교하여 연장된 B-세포 고갈을 보인다는 것을 나타내었다. 특히, 2H7.v16 10 mg/kg으로 치료한 후 회복된 동물은 샘플링한 제10일 내지 제36일 사이의 어느 시점에 순차적인 B-세포 회복을 보였다. 그러나, 2H7.v31 10 mg/kg으로 치료한 후 회복된 동물은 제36일 내지 제67일 사이의 시점까지 어떠한 회복도 나타나지 않았다. 이는 2H7.v16과 비교하여 2H7.v31이 약 1달의 보다 긴 완전 고갈 기간을 가진다는 것을 제시한다.The results show that both 2H7.v16 and 2H7.v31 can cause complete peripheral B-cell depletion at the 10 mg / kg dose and partial peripheral B-cell depletion at the 0.05 mg / kg dose (FIG. 11). The time course and limits of B-cell depletion measured during the first 72 hours after dosing were similar for the two antibodies. Subsequent analysis of recovered animals showed that animals treated with 2H7.v31 showed prolonged B-cell depletion compared to animals administered 2H7.v16. In particular, animals recovered after treatment with
원숭이 연구 중 낮은 투여량 또는 높은 투여량에서 어떠한 독성도 관찰되지 않았으며, 육안적인 병리도 정상이었다. 다른 연구에서, v16은 이들 원숭이에서 2 주 간격으로 2회 투여로 주어지는 정맥내 투여 후 (100 mg/kg × 2 = 1200 mg/m2 × 2)로 평가된 가장 높은 투여량까지 우수하게 내성이었다.No toxicity was observed at low or high doses in monkey studies, and gross pathology was normal. In another study, v16 was well tolerated in these monkeys up to the highest dose evaluated after intravenous administration given at two weekly intervals (100 mg / kg × 2 = 1200 mg / m2 × 2). .
2H7.v16 및 리툭산®으로의 시노몰거스 원숭이에서의 데이타는 CDC 활성의 5배 감소가 효능에 반대적인 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다. 강력한 ADCC 활성을 가지나, CDC 활성이 감소된 항체는 보다 높은 CDC 활성을 갖는 항체보다 제1 주입 반응의 관점에서 보다 바람직한 안전성 프로파일을 가질 수 있다.Data in cynomolgus monkeys with 2H7.v16 and Rituxan® show that a 5-fold reduction in CDC activity does not adversely affect efficacy. Antibodies with potent ADCC activity but reduced CDC activity may have a more favorable safety profile in terms of the first infusion reaction than antibodies with higher CDC activity.
실시예Example 11 11
향상된Enhanced이펙터Effector 기능을 갖는 Having
정상 CHO 및 HEK293 세포는 푸코스를 높은 정도 (97 내지 98%)로 IgG 올리고당에 첨가한다. 또한, 혈청으로부터의 IgG은 고도로 푸코실화되어 있다.Normal CHO and HEK293 cells add fucose to IgG oligosaccharides at high levels (97-98%). In addition, IgG from serum is highly fucosylated.
푸코실화 적격인 디히드로폴레이트 리덕타제- (DHFR-) CHO 세포주인 DP12 및 단백질 푸코실화 결핍인 세포주인 Lec13을 사용하여 이 연구를 위한 항체를 생성하였다. CHO 세포주 Pro-Lec13.6a (Lec13)는 예시바 약대 알버트 아인슈타인 단과대 (Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University)의 파멜라 스탠리 (Pamela Stanley) 교수로부터 수득하였다. 부모 세포주는 Pro-(프롤린 영양요구균주) 및 Gat-(글리신, 아데노신, 티미딘 영양요구균주)이다. CHO-DP12 세포주는 디히드로폴레이트 리덕타제 결핍인 CHO-K1 세포주 (ATCC #CCL-61)의 유도체이며, 인슐린에 대한 요구성이 감소되었다. 세포주를 슈퍼펙트법 (Superfect Method, Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 cDNA로 형질감염시켰다. 항체를 발현하는 형질감염된 Lec13 세포의 선별을 L-글루타민, 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드 (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)를 함유하고, 10% 불활성화 FBS (GIBCO), 10 mM HEPES 및 1 × 페니실린/스트렙토마이신 (GIBCO)으로 보충된 MEM 알파 배지를 함유하는 성장 배지 10 ㎍/ml에서 푸로마이신 디히드로클로라이드 (Calbiochem, San Diego, CA)를 사용하여 수행하였다. CHO 세포를 GHT이 없는 햄스 (Ham's) F12: 글리신이 없으며, NaHCO3을 함유한 낮은 글루코스 DMEM을 함유하고, 5% FBS (GIBCO), 10 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 1X GHT (글리신, 히폭산틴, 티미딘) 및 1X 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 성장 배지 중에 유사하게 선별하였다.Foucault misfire eligible dihydro folate reductase- (DHFR-) CHO cell line, using the DP12 and protein deficiency Foucault misfire of the Lec13 cell line was producing antibodies for this study. The CHO cell line Pro-Lec13.6a (Lec13) was obtained from Professor Pamela Stanley of Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University. Parent cell lines are Pro- (proline nutrient strains) and Gat- (glycine, adenosine, thymidine nutrient strains). The CHO-DP12 cell line is a derivative of the CHO-K1 cell line (ATCC # CCL-61) which is dehydrofolate reductase deficient and has a reduced requirement for insulin. Cell lines were transfected with cDNA using the Superfect Method (Qiagen, Valencia, Calif.). Selection of transfected Lec13 cells expressing the antibody consisted of L-glutamine, ribonucleoside and deoxyribonucleoside (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), 10% inactivated FBS (GIBCO), 10 mM It was performed using puromycin dihydrochloride (Calbiochem, San Diego, Calif.) In 10 μg / ml of growth medium containing MEM alpha medium supplemented with HEPES and 1 × penicillin / streptomycin (GIBCO). CHO cells were Ham's F12 without GHT: Glycine free, low glucose DMEM containing NaHCO3 , 5% FBS (GIBCO), 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1X GHT (glycine, Similar selection was made in growth medium supplemented with hydroxyxanthin, thymidine) and IX penicillin / streptomycin.
콜로니가 2 내지 3 주 내에 형성되었고, 증대 및 단백질 발현을 위해 풀링하였다. 세포 풀을 소량의 배치식 단백질 발현을 위해 플레이트 10 cm 당 3 × 106 세포로 최초 시딩하였다. 세포가 90-95% 전면생장하면 혈청 없는 배지로 옮기고, 3 내지 5일 후 세포 상층액을 수집하고, Fc IgG-ELISA 및 무손상 IgG-ELISA 중에 시험하여 단백질 발현 수준을 평가하였다. Lec13 및 CHO 세포를 15 cm 플레이트 당 대략 8 × 106 세포로 시딩하고, 다음 날 10 mg/L 재조합 인간 인슐린 및 1 mg/L 미량 성분으로 보충된 PS24 생산 배지로 옮겼다.Colonies formed within 2-3 weeks and pooled for augmentation and protein expression. Cell pools were initially seeded at 3 × 106 cells per 10 cm of plate for small batch protein expression. Cells were transferred to medium without serum when 90-95% congenital growth, cell supernatants were collected after 3-5 days and tested in Fc IgG-ELISA and intact IgG-ELISA to assess protein expression levels. Lec13 and CHO cells were seeded at approximately 8 × 106 cells per 15 cm plate and transferred to PS24 production medium supplemented with 10 mg / L recombinant human insulin and 1 mg / L trace components the next day.
Lec13 세포 및 DP12 세포를 혈청 없는 생산 배지에 3 내지 5일 동안 유지하였다. 상층액을 수집하고, 150 ml 코니칼 튜브에서 원심분리하여 청정화시켜 세포 및 잔해를 제거하였다. 프로테아제 억제제 PMSF 및 아프로티닌 (Sigma, St. Louis, MO)을 첨가하고, 상층액을 MWC030 여과기 (Amicon, Beverly, MA)를 사용하여 교반된 세포 상에서 5 배 농축하고, 즉시 단백질 G 크로마토그래피 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ))를 사용하여 정제하였다. 모든 단백질을 센트리프리엡 (Centripriep)-30 농축기 (Amicon)를 사용하여 인산염 완충 염수 (PBS)로 완충액을 교환하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 단백질 농도를 A280을 사용하여 측정하고, 아미노산 조성물 분석을 통해 입증하였다.Lec13 cells and DP12 cells were maintained in serum-free production medium for 3-5 days. Supernatants were collected and clarified by centrifugation in 150 ml conical tubes to remove cells and debris. Protease inhibitors PMSF and aprotinin (Sigma, St. Louis, Mo.) were added, and the supernatants were concentrated 5 times on stirred cells using a MWC030 filter (Amicon, Beverly, Mass.) And immediately protein G chromatography (Amersham) Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)). All proteins were exchanged in phosphate buffered saline (PBS) using Centriprip-30 concentrator (Amicon) and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Protein concentration was measured using A280 and verified through amino acid composition analysis.
CHO 세포를 인간화 2H7v.16, 2H7v.31을 발현하는 벡터로 형질감염시키고, 상기 기재한 바와 같이 선별하였다. 2H7v.16 항체는 야생형 Fc 영역를 유지하는 반면, v.31 (상기 실시예 5의 표 7 참고)은 FcγRIIIA 수용체 (Shields et al. J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001))에 대한 보다 높은 친화성을 유도하는 3개의 아미노산 변화 (S298A, E333A, K334A)를 수행한 Fc 영역을 가진다. 형질감염 및 선별 후, 세포의 개별 콜로니를 단리하고, 단백질 발현 수준을 평가하고, 가장 우수한 생산자를 메토트렉세이트 선별로 플라스미드 복제수를 증폭시키고, 이에 따라 항체를 보다 높은 수준으로 생성하는 세포를 선별하였다. 세포를 성장시키고, 7일의 기간 동안 혈청 없는 배지로 옮기고, 단백질 A 컬럼 상에 로딩하고, 항체를 표준 기술을 사용하여 용출하였다. 항체의 최종 농도를 무손상 항체를 측정하는 Elisa를 사용하여 특정하였다. 모든 단백질을 센트리프리엡-30 농축기 (Amicon)를 사용하여 인산염 완충 염수 (PBS)로 완충액을 교환하고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다.CHO cells were transfected with vectors expressing humanized 2H7v.16, 2H7v.31 and selected as described above. The 2H7v.16 antibody retains the wild-type Fc region, whereas v.31 (see Table 7 in Example 5 above) shows the FcγRIIIA receptor (Shields et al. J. Biol. Chem. 276 (9): 6591-6604 (2001) ) Has an Fc region that has undergone three amino acid changes (S298A, E333A, K334A) leading to higher affinity for). After transfection and screening, individual colonies of cells were isolated, protein expression levels were assessed, and the best producers were amplified by methodrexate selection to amplify the plasmid copy number, thus selecting cells that produced higher levels of antibody. Cells were grown, transferred to serum free medium for a period of 7 days, loaded onto a Protein A column, and antibodies were eluted using standard techniques. Final concentrations of the antibodies were specified using Elisa to measure intact antibodies. All proteins were buffer exchanged with phosphate buffered saline (PBS) using a Centripriep-30 concentrator (Amicon) and analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
아스파라긴-연결된 올리고당의 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화비행시간 법 (MALDI-TOF) 질량 스펙트럼 분석: N-결합 올리고당은 문헌 [Papac et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998)]의 절차를 사용하여 재조합 당단백질로부터 유리된다. 간단하게 설명하면, 96 웰 PVDF-라이닝 미세적정 플레이트 (Millipore, Bedford, MA)의 웰을 밀리포어 멀티스크린 (Millipore Multiscreen) 진공 다기관으로 진공을 적용시켜 100 ㎕ 메탄올로 PDVF 막을 통과시켜 조건화시켰다. 조건화된 PVDF 막을 3 × 250 ㎕ 물로 세척하였다. 모든 세척 단계 사이에, 웰을 다기관으로 온건한 진공을 적용하여 완전히 배출시켰다. 막을 6 M 구아니딘 히드로클로라이드, 360 mM 트리스, 2 mM EDTA (pH 8.6)로 이루어진 환원 및 카르복시메틸화 완충액 (RCM)으로 세척하였다. 당단백질 샘플 (50 ㎍)을 개별 웰에 적용하고, 다시 온건한 진공으로 PVDF 막을 통해 배수시키고, 웰을 RCM 완충액 2 × 50 ㎕로 세척하였다. 부동 샘플을 각각의 웰에 0.1 M 디티로트레이톨 (DTT) 용액 50 ㎕를 첨가하여 환원시키고, 미세적정 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. DTT를 진공으로 제거하고, 웰을 물 4 × 250 ㎕로 세척하였다. 시스테인 잔기를 1 M NaOH 중에 신선하게 제조되고, RCM 완충액을 사용하여 0.1 M으로 희석된 0.1 M 요오도아세트산 (IAA) 용액 50 ㎕를 첨가하여 카르복실메틸화시켰다. 카르복실메틸화를 실온에서 30 분 동안 어둡게 인큐베이션하여 수행하였다. 진공을 플레이트에 적용하여 IAA 용액을 제거하고, 웰을 정제수 4 × 250 ㎕로 세척하였다. PVDF 막을 1% PVP360 (폴리비닐피롤리딘 360,000 MW) (Sigma) 용액 100 ㎕를 첨가하여 차단하고, 주위 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. PVP-360 용액을 온건한 진공으로 제거하고, 웰을 물 4 × 250 ㎕로 세척하였다. PNGase F (New England Biolabs, Beverly, MA) 소화 용액인 10 mM 트리스 아세테이트 (pH 8.4) 중 25 유닛/ml 용액 25 ㎕을 각각의 웰에 첨가하고, 소화를 37 ℃에서 3 시간 동안 진행하였다. 소화시킨 후, 샘플을 500 ㎕ 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브로 옮기고, 1.5 M 아세트산 용액 2.5 ㎕를 각각의 샘플에 첨가하였다. 산성화된 샘플을 3 시간 동안 상온에서 인큐베이션시켜 올리고당을 글리코실아민에서 히드록실 형으로 전환하였다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석 전에, 유리된 올리고당을 콤팩트 반응 튜브 (US Biochemical, Cleveland, OH) 중으로 충전된 슬러리인 양이온 교환 수지 (수소형 AGSOW-X8 수지) (Bio-Rad, Hercules, CA)의 0.7-ml 층을 사용하여 탈염시켰다.Matrix-assisted laser desorption / ionizationtime -of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometryof asparagine-linked oligosaccharides : N-linked oligosaccharides are prepared using the procedure of Papac et al.,
양성 모드로 샘플의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석을 위해, 상기 탈염된 올리고당 (0.5 ㎕ 분취액)을 에탄올/10 mM 염화나트륨 1:1 (v/v) 1 ml 중에 2,5-디히드록시벤조산 2 mg을 5-메톡시실리시클릭산 0.1 mg과 함께 용해시켜 제조한 2,5-디히드록시벤조산 매트릭스 (sDHB) 0.5 ㎕와 함께 스테인레스 표적에 적용하였다. 샘플/매트릭스 혼합물을 진공으로 건조하였다. 음성 형식으로 분석하기 위해, 탈염된 N-결합 올리고당 (0.5 ㎕ 분취액)을 1:3 (v/v) 아세토니트릴/13.3 mM 암모늄 시트레이트 완충액 중에 제조된 2',4',6'-트리히드록시아세토페논 매트릭스 (THAP) 0.5 ㎕와 함께 스테인레스 표적에 수행하였다. 샘플/매트릭스 혼합물을 진공 건조하고, 이어서 대기 수분을 흡수한 후 분석하였다. 유리된 올리고당을 퍼셉티브 바이오시스템즈 보이저 (PerSeptive Biosystems Voyager)-DE 질량 분광기 상에서 MALDI-TOF에 의해 분석하였다. 질량 분광기를 선형 배치의 양성 또는 음성 형식으로 모두 20 kV에서 작동시키고, 지체 추출을 사용하였다. 데이타를 레이저 파워 1300을 사용하여, 신호를 노이즈로 개선하는 데이타 누적 모드 (240 스캔) 중에서 수득하였다. 장비를 표준 올리고당의 혼합물로 눈금을 정하고, 데이타를 19 포인트 사빗스키-골레이 (Savitsky-Golay) 알고리즘을 사용하여 스무딩하고, 질량을 분배하였다. 질량 스펙트럼 데이타의 통합을 시저 (Caesar) 7.0 데이타 분석 소프트웨어 패키지 (SciBridge Software)를 사용하여 달성하였다.For MALDI-TOF mass spectral analysis of the sample in positive mode, the desalted oligosaccharide (0.5 μL aliquot) was added to 2,5-
천연natural킬러killer ( (NKNK) 세포 항체 의존 세포독성 분석) Cell Antibody-Dependent Cytotoxicity
ADCC 분석을 실시예 9에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표적 세포 (WIL2-S)에 대한 NK 비율은 4 내지 1이고, 분석을 4 시간 동안 수행하였으며, 독성을 락토즈 데히드로게나제 분석을 사용하여 사전에 측정하였다. 표적 세포를 30 분 동안 지시된 항체의 농도로 식균하고, NK 세포를 첨가하였다. 제넨테크 S. (San Francisco, CA)로부터의 리툭산® 항체를 사용하였다. 도 12는 대표적인 ADCC 분석의 결과를 나타낸다.ADCC analysis was performed as described in Example 9. The NK ratio for target cells (WIL2-S) is 4 to 1, the assay was performed for 4 hours, and toxicity was previously determined using lactose dehydrogenase assay. Target cells were seeded for 30 min at the concentration of antibody indicated and NK cells were added. Rituxan® antibody from Genentech S. (San Francisco, CA) was used. 12 shows the results of a representative ADCC analysis.
결과는 저-푸코실화 항체가 푸코스의 완전 보체를 갖는 항체보다 더욱 효과적으로 NK 세포 표적 세포 사멸을 매개한다는 것을 나타낸다. 저-푸코실화 항체인 2H7v.31이 표적 세포 사멸을 매개하는데 가장 효과적이다. 이 항체는 낮은 농도에서 효과적이며, 다른 항체보다 높은 농도에서 표적 세포의 보다 높은 비율(%)로 사멸을 매개할 수 있다. 항체의 활성은 다음과 같다: Lec13-유도된 2H7v.31 > Lec13-유도된 2H7v.16 > Dp12-유도된 2H7v.31 > Dp12-유도된 2H7v.16 > 또는 = 리툭산®. 단백질 및 카르보히드레이트 변형이 추가된다. Lec13-생성된 IgG 및 CHO- 생성된 IgG로부터의 천연 IgG상에서 발견되는 카르보히드레이트의 비교에서 갈락토실화의 정도에 감지할 수 있을 정도의 차이점이 나타나지 않았으며, 따라서 결과는 푸코스의 존재/부재에 단독으로 귀착시킬 수 있다.The results indicate that low-fucosylated antibodies mediate NK cell target cell death more effectively than antibodies with full complement of fucose. The low fucosylated antibody 2H7v.31 is most effective at mediating target cell death. This antibody is effective at low concentrations and can mediate death at a higher percentage of target cells at higher concentrations than other antibodies. The activity of the antibody is as follows: Lec13-derived 2H7v.31> Lec13-derived 2H7v.16> Dp12-derived 2H7v.31> Dp12-derived 2H7v.16> or = Rituxan® . Protein and carbohydrate modifications are added. Comparison of carbohydrates found on native IgG from Lec13-produced IgG and CHO-produced IgG showed no appreciable difference in the degree of galactosylation, so the result is the presence of fucose. It can result in a member alone.
실시예Example 12 12
생체내에서In vivo 향상된 EnhancedADCCADCC를 갖는Having푸코스
이 실시예는 인간 CD16 [FcRγIII] 및 인간 CD20을 발현하는 마우스 중 DP12에서 생성되는 정상 푸코실화 대조물과 비교하여 Lec13에서 생성되는 v.16 및 v.31을 비롯한 푸코스-결핍 인간화 2H7 변이체의 생체내 ADCC 활성을 기재한다.This example demonstrates the use of fucose-deficient humanized 2H7 variants including v.16 and v.31 produced in Lec13 as compared to the normal fucosylated control produced in DP12 among mice expressing human CD16 [FcRγIII] and human CD20. In vivo ADCC activity is described.
huCD20TghuCD20Tg++huCD16TghuCD16Tg++mCD16mCD16-/--/- 마우스의 생성 Generation of mouse
인간 CD20 트랜스제닉 마우스를 인간 CD20 BAC DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 생성하였다. 마우스를 인간 CD20 발현의 FACS 분석을 기초로 스크리닝하였다. 그 다음, huCD20Tg+ 마우스를 huCD16Tg+mCD16-/-마우스와 교차시켜 huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/- 마우스를 생성하였다.Human CD20 transgenic mice were generated from human CD20 BAC DNA (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Mice were screened based on FACS analysis of human CD20 expression. Then, the huCD20Tg+ mouse huCD16Tg+ mCD16- by crossing a mouse huCD20Tg+ huCD16Tg+ mCD16-- / mice were generated- /.
생체내In vivo 치료 cure
huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16-/- 마우스에 2H7 변이체 또는 리툭산® 각각을 10 내지 100 ㎍을 복막내 주사로 투여하였다. 동형-매치된 항체의 등량을 동물의 음성 대조군과 유사하게 적용할 것이다.huCD20Tg+ huCD16Tg+ mCD16− / − mice were administered with intraperitoneal injection of 10-100 μg of 2H7 variant or Rituxan®, respectively. Equivalences of homo-matched antibodies will be applied similarly to the negative control of the animals.
마우스 림프구 제조Mouse lymphocyte manufacture
전체 혈액, 비장, 림프절 및 골수로부터의 마우스 림프구를 문헌 [Current Protocols in Immunology, edited by John Coligan, Ada Kruisbeek David Margulies, Ethan Shevach and Warren Strober, 1994]에 기재된 표준 프로토콜에 따라 제조하였다.Mouse lymphocytes from whole blood, spleen, lymph nodes and bone marrow were prepared according to standard protocols described in Current Protocols in Immunology, edited by John Coligan, Ada Kruisbeek David Margulies, Ethan Shevach and Warren Strober, 1994.
FACSFACS 분석 analysis
50만 개의 세포를 세척하고, 염색 항체 또는 대조군 항체 5 ㎕를 함유하는 1% BSA와의 인산염 완충 염수인 FACS 완충액 100 ㎕ 중에 현탁하였다. 동형 대조군을 비롯한 모든 염색 항체는 파르민겐 (PharMingen, San Diego, CA) 사로부터 수득하였다. 인간 CD20 발현을 FITC-접합된 항-인간 IgG1 2차 항체와 함께 리툭산®을 염색하여 평가하였다. FACS 분석은 FACScan 및 셀 퀘스트 (Cell Quest, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)을 사용하여 수행하였다. 모든 림프구를 정면광 산란 및 측면광 산란으로 한정된 반면, 모든 B 림프구는 세포 표면 상에 B220을 발현하는 것으로 한정된다.Half a million cells were washed and suspended in 100 μl FACS buffer, a phosphate buffered saline with 1% BSA containing 5 μl stained antibody or control antibody. All stained antibodies, including isotype controls, were obtained from PharMingen, San Diego, Calif. Human CD20 expression was assessed by staining Rituxan® with FITC-conjugated anti-human IgG1 secondary antibody. FACS analysis was performed using FACScan and Cell Quest (Cell Quest, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Calif.). All lymphocytes are limited to frontal light scattering and side light scattering, while all B lymphocytes are limited to expressing B220 on the cell surface.
B 세포 고갈 및 회복을 주사 후 첫주 동안은 매일, 그 이후에는 매주 말초 B 세포 수의 분석 및 비장, 림프절 및 골수에서의 FACS에 의한 hCD20+ B 세포의 분석으로 평가하였다. 주사된 2H7 변이체 항체의 혈청 수준을 모니터링하였다.B cell depletion and recovery were assessed by analysis of peripheral B cell numbers daily for the first week after injection and weekly thereafter and analysis of hCD20 + B cells by FACS in the spleen, lymph nodes and bone marrow. Serum levels of the injected 2H7 variant antibody were monitored.
이 생체내 분석의 결과는 증가된 ADCC 활성에 대한 시험관내 발견 및 (푸코실화에 대해) 야생형인 글리코실화 대조물에 비해 푸코스-결핍 2H7 변이체의 보다 큰 B 세포 고갈을 확인한다.The results of this in vivo assay confirm in vitro findings for increased ADCC activity and greater B cell depletion of the fucose-deficient 2H7 variant compared to the wild type glycosylation control (for fucosylation).
실시예Example 13 13
아폽토시스Apoptosis 활성 activation
리툭산®을 비롯한 항-CD20 항체는 2차 항체에 의해 또는 화학적 방법에 의해 가교되는 경우 시험관내 아폽토시스를 유도하는 것으로 보여진다 (Shan et al., Blood 9: 1644-1652 (1998); Byrd et al., Blood 99: 1038-43 (2002); Pederson et al., Blood 99: 1314-19 (2002)). 화학적으로 가교되는 경우, 뮤린 2H7 이량체는 다우디 (Daudi) 세포의 아폽토시스를 유도하였다 (Ghetie et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 7509-14 (1997)). 또한, 제2 항체와의 가교는 뮤린 2H7 항체로의 아폽토시스를 유도하였다 (Shan et al., 1998). 다양한 메카니즘이 생체내에서 세포-표면 CD20과 결합된 항-CD20 항체의 가교를 유도할 수 있기 때문에 이들 활성은 생리학적으로 관련되는 것으로 여겨진다.Anti-CD20 antibodies, including Rituxan® , have been shown to induce apoptosis in vitro when crosslinked by secondary antibodies or by chemical methods (Shan et al., Blood 9: 1644-1652 (1998); Byrd et al) Blood 99: 1038-43 (2002); Pederson et al., Blood 99: 1314-19 (2002)). When chemically crosslinked, the murine 2H7 dimer induced apoptosis of Daudi cells (Ghetie et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 7509-14 (1997)). In addition, crosslinking with the second antibody induced apoptosis with murine 2H7 antibody (Shan et al., 1998). These activities are believed to be physiologically related because various mechanisms can induce cross-linking of anti-CD20 antibodies bound to cell-surface CD20 in vivo.
2차 가교 항체를 사용하여 시험관내 아폽토시스 분석에 rhuMAb 2H7.v16 [인간화 2H7.v16; rhuMAb는 재조합 인간 모노클로날 항체를 의미함] 및 리툭산®을 비교하였다. CD20을 발현하는 인간 B 림프구 세포주인 라모스 세포 (CRL-1596, ATCC, Manassas, VA)를 사용하여 항-CD20 모노클로날 항체 rhuMAb 2H7.v16 및 리툭시맵, 및 음성-대조군 항체인 트라스투주맵 (허셉틴®, Genentech, South San Francisco, CA)의 아폽토시스를 유도하는 능력을 측정하였다 (아넥신 V 염색 및 프로피듐 요오다이드 염료 배출 (Vybrant® Apoptosis Assay Kit, Molecular Probe, Seattle, WA)을 통해 측정하였음). 라모스 세포를 10% 소태아 혈청 (Biosource International, Camarillo, CA) 및 2 mM L-글루타민 (Gibco)을 함유하는 RPMI-1640 배지 중에 배양하였다. 분석하기 전에, 세포를 신선한 배지 중에 2회 세척한 다음, 세포 농도를 ml 당 2 × 106로 조정하였다. 예정된 양의 대조군 IgG1, rhuMAb 2H7.v16, 또는 리툭시맵 150 ㎕를 F(ab)'2 염소 항-인간 Fc (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)와 함께 함유하는 96-웰 분석 플레이트 (Becton Dickinson, Palo Alto, CA)에 세포 (150 ㎕)를 첨가하였다. 최종 IgG 농도는 100, 10, 1.0, 0.1, 0.01 및 0.001 nM이고, F(ab)'2 염소 항-인간 Fc 항체 농도는 각각의 샘플 항체의 농도에 2배였다. 각각의 희석액은 3배로 설정하였다. 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 제조자의 권장에 따라 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드로 염색하였다. 라모스 세포의 염색 패턴을 FACscan 유세포기 (FACscan Flow Cytometer, Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 유세포 분석을 수행하고, 데이타를 10초-기간 동안 수집하였다. 데이타를 셀퀘스트 프로 소프트웨어 (Cellquest Pro software, Becton Dickinson)를 사용하여 정리하였다. (1) 아넥신 V 염색, (2) 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 이중-염색, 및 (3) 염색되지 않은 살아있는 세포 수에 대해 양성인 라모스 세포를 계수하고, 칼라이다그래프 소프트웨어 (Synergy Software, Reading, PA)를 사용하여 플롯하였다.RhuMAb 2H7.v16 [humanized 2H7.v16; in vitro apoptosis assay using secondary crosslinked antibody; rhuMAb means recombinant human monoclonal antibody] and Rituxan® . Anti-CD20 monoclonal antibody rhuMAb 2H7.v16 and rituximab, and trastuzumab, a negative-control antibody, using Ramos cells (CRL-1596, ATCC, Manassas, VA), a human B lymphocyte cell line expressing CD20 through (Herceptin®, Genentech, South San Francisco, CA) to measure the ability of inducing apoptosis (annexin V staining and propidium iodide dye emission(Vybrant ® apoptosis Assay Kit, Molecular Probe, Seattle, WA) of Measured). Ramos cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (Biosource International, Camarillo, Calif.) And 2 mM L-glutamine (Gibco). Prior to analysis, cells were washed twice in fresh medium and then the cell concentration was adjusted to 2 × 106 per ml. 96-well assay plate (Becton Dickinson, containing 150 μl of predetermined amount of control IgG1, rhuMAb 2H7.v16, or rituximab with F (ab) '2 goat anti-human Fc (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) Cells (150 μl) were added to Palo Alto, CA). Final IgG concentrations were 100, 10, 1.0, 0.1, 0.01 and 0.001 nM, and the F (ab) '2 goat anti-human Fc antibody concentration was doubled the concentration of each sample antibody. Each dilution was set to three times. After incubation at 37 ° C. for 24 hours, cells were washed twice with PBS and then stained with Annexin V and propidium iodide as recommended by the manufacturer. Staining patterns of Ramos cells were performed flow cytometry using a FACscan flow cytometer (FACscan Flow Cytometer, Becton Dickinson, San Jose, Calif.), And data was collected for a 10 second-period. Data was compiled using Cellquest Pro software, Becton Dickinson. (1) Annexin V staining, (2) Annexin V and propidium iodide double-staining, and (3) Ramos cells positive for unstained viable cell counts and counted with coloridagraph software (Synergy Software , Reading, PA).
rhuMAb 2H7.v16 및 리툭시맵은 모두 무관한 IgG1 대조군 항체와 비교하여 항 -인간 Fc와 가교되는 경우 라모스 세포에서 아폽토시스를 유도하였다 (도 13 내지 15). (rhuMAb 2H7)의 아폽토시스 활성은 리툭시맵의 활성보다 약간 낮았다. 가교된 rhuMAb 2H7, 리툭시맵 및 대조군 IgG1 항체의 10 nM 농도에서, 아넥신 V로 염색된 세포의 분획은 각각 18.5, 16.5 및 2.5%였고, 이중 표지된 세포의 분획은 29, 38 및 16%였으며, 10 초 당 계수된 살아있는 세포의 수는 5200, 3100 및 8600이었다.rhuMAb 2H7.v16 and rituximab both induced apoptosis in Ramos cells when crosslinked with anti-human Fc compared to the irrelevant IgG1 control antibody (FIGS. 13-15). Apoptotic activity of (rhuMAb 2H7) was slightly lower than that of rituximab. At 10 nM concentrations of crosslinked rhuMAb 2H7, rituximab and control IgG1 antibodies, fractions of cells stained with Annexin V were 18.5, 16.5 and 2.5%, respectively, and fractions of double labeled cells were 29, 38 and 16%. The number of viable cells counted per 10 seconds was 5200, 3100 and 8600.
이들 시험관내 데이타는 생체내 B 세포 고갈을 위한 하나의 잠재적인 메카니즘이라는 것을 입증한다. 생체내에서 세포-표면 CD20에 결합된 rhuMAb 2H7 또는 리툭시맵은 면역 이펙터 세포의 표면상에 FcγR를 통해 발생할 수 있다.These in vitro data demonstrate that this is one potential mechanism for B cell depletion in vivo. RhuMAb 2H7 or rituximab bound to cell-surface CD20 in vivo can occur via FcγR on the surface of immune effector cells.
실시예Example 14 14
생체내In vivo 종양 성장의 억제 Suppression of tumor growth
rhuMAb 2H7.v16의 림프종 세포주 (ATCC CCL 86)인 라지 인간 B-세포의 성장을 억제하는 능력을 Balb/c 누드 (무흉선) 마우스에서 평가하였다. 라지 세포는 CD20을 발현하고, 누드 마우스에서 성장하며, 전이성 질환을 발생시키고, 리툭산®에 의해 종양 성장이 억제되는 것으로 보고되어 있다 (Clynes et al., Nature Medicine 6, 443-446 (2000)). 56 마리의 8 내지 10 주령인 Balb/c 누드 마우스를 각각의 군이 8마리로 이루어지는 7개 군 (A-G)으로 나누었다. 제0일에, 각각의 마우스에 플랭크 중 5 × 106 라지 B-림프종 세포를 피하 주사하였다. 제0일에 시작하여, 각각의 마우스를 음성-대조군 용액 (PBS; 인산염 완충 염수), 리툭산® 또는 2H7.v16 100 ㎕를 투여하였다. 투여량은 체중 및 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하는 약물 전달에 따른다. A군 마우스는 PBS를 투여하였다. B 내지 D군은 각각 5.0 mg/kg, 0.5 mg/kg 및 0.05 mg/kg으로 리툭산®을 투여하였다. E 내지 G군 마우스는 각각 5.0, mg/kg, 0.5 mg/kg 및 0.05 mg/kg으로 2H7 v.16을 투여하였다. 이 주사를 4 주 동안 매주 반복하였다. 치료 중 매주 간격으로 각각의 마우스를 주사의 부위에서 만질 수 있는 종양의 존재에 대해 조사하고, 존재하는 경우 종양의 부피를 측정하고 기록하였다. 최종 조사는 제8주에 수행하였다 (치료하지 않은 2 주의 간격 후).The ability to inhibit the growth of large human B-cells, the lymphoma cell line of rhuMAb 2H7.v16 (ATCC CCL 86), was evaluated in Balb / c nude (thymus) mice. Large cells express CD20, grow in nude mice, develop metastatic disease and inhibit tumor growth by Rituxan® (Clynes et al.,
본 연구의 결과는 rhuMAb 2H7.v16 및 리툭산® 모두가 누드 마우스에서 피하 라지-세포 종양 성장을 억제하는데 효과적이라는 것을 나타내었다 (도 16 내지 18). 종양 성장이 PBS 대조군 군에서 시작한지 4주에 관찰되었다. 그러나, 5 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 리툭산® 또는 2H7.v16으로 치료한 군에서는 본 연구의 8주 기간 동안 어떠한 종양 성장도 관찰되지 않았다. 낮은 투여량인 0.05 mg/kg으로 치료한 군 중 2H7으로는 1마리의 동물에서, 리툭산®으로는 1마리 동물에서 종양이 관찰되었다 (도 18).The results of this study showed that both rhuMAb 2H7.v16 and Rituxan® were effective at inhibiting subcutaneous large-cell tumor growth in nude mice (FIGS. 16-18). Tumor growth was observed 4 weeks after starting in the PBS control group. However, no tumor growth was observed during the 8 week period of this study in the groups treated with 5 mg / kg or 0.5 mg / kg of Rituxan® or 2H7.v16. Tumors were observed in one animal with 2H7 and one animal with Rituxan® in the group treated with the low dose of 0.05 mg / kg (FIG. 18).
실시예Example 15 15
시노몰거스Sinomolgus 원숭이 monkeyCD20CD20의of클로닝Cloning 및 항체 결합 And antibody binding
시노몰거스 원숭이 (Macaca fascicularis)에 대한 CD20 DNA 서열을 시노몰거 스 비장 cDNA 라이브러리로부터 CD20을 코딩하는 cDNA를 단리하여 결정하였다. cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 SUPERSCRIPTTM 플라스미드 시스템 (Cat#18248-013, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 라이브러리를 작제하기 위해 약간 수정하여 사용하였다. cDNA 라이브러리를 제한 부위 Xho I- 및 Not I을 사용하여 pRK5E 벡터 내로 라이게이션하였다. mRNA를 비장 조직 (California Regional Research Primate Center, Davis, CA)으로부터 단리하였다. CD20을 코딩하는 cDNA를 증폭하기 위한 프라이머를 인간 CD20의 비-코딩 서열을 기초로 디자인하였다. N-말단 영역 프라이머 5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3' 및 C-말단 영역 프라이머 5'-AAGCCD20GAACACTAATG-3'를 사용하여 시노몰거스 원숭이 CD20을 코딩하는 cDNA를 중합 연쇄 반응 (PCR)으로 클로닝하였다. PCR 반응을 제조자 (Gibco, Rockville, MD)의 권장에 따라 백금 Taq DNA 중합효소 하이-피델리티 (Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity)를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 pCR®2.1-TOPO®벡터 (Invitrogen) 내로 서브클로닝하고, XL-1 블루 이. 콜라이 (Stratagene. La Jolla, CA) 내로 형질전환시켰다. 라이게이션된 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드 DNA를 개별 클론으로부터 단리하고, 서열분석하였다.The CD20 DNA sequence for the cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) was determined by isolating the cDNA encoding CD20 from the cynomolgus spleen cDNA library. Slight modifications were used to construct the library using the SUPERSCRIPT™ plasmid system (Cat # 18248-013, Invitrogen, Carlsbad, Calif.) for cDNA synthesis and plasmid cloning. cDNA libraries were ligated into pRK5E vectors using restriction sites Xho I- and Not I. mRNA was isolated from spleen tissue (California Regional Research Primate Center, Davis, Calif.). Primers for amplifying cDNA encoding CD20 were designed based on the non-coding sequence of human CD20. The cDNA encoding cynomolgus monkey CD20 was cloned by polymerase chain reaction (PCR) using N-terminal region primer 5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3 'and C-terminal region primer 5'-AAGCCD20GAACACTAATG-3'. PCR reactions were performed using Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity as recommended by the manufacturer (Gibco, Rockville, MD). PCR products were subcloned into pCR® 2.1-TOPO® vector (Invitrogen) and XL-1 Blue E. Transformed into E. coli (Stratagene. La Jolla, CA). Plasmid DNA containing the ligated PCR product was isolated from individual clones and sequenced.
시노몰거스 원숭이 CD20에 대한 아미노산 서열을 도 19에 나타내었다. 도 20은 시노몰거스 및 인간 CD20의 비교를 나타낸다. 시노몰거스 원숭이 CD20은 인간 CD20과 8개의 차이를 가지며 97.3% 유사하다. 세포외 도메인은 V157A에서 하나의 변화를 함유하나, 나머지 7개의 잔기는 세포질 또는 횡막 영역에서 발견될 수 있다.The amino acid sequence for cynomolgus monkey CD20 is shown in FIG. 19. 20 shows a comparison of cynomolgus and human CD20. Cynomolgus monkey CD20 has 8 differences from human CD20 and is 97.3% similar. The extracellular domain contains one change in V157A, but the remaining seven residues can be found in the cytoplasmic or diaphragm region.
인간 CD20에 대해 지시된 항체를 CD20을 발현하는 시노몰거스 원숭이 세포와 결합하는 FITC-접합된 뮤린 2H7의 결합 및 대체 능력에 대해 분석하였다. 2마리의 시노몰거스 원숭이 (California Regional Research Primate Center, Davis, CA)로부터 혈액 20 mL를 나트륨 헤파린 중으로 채취하여 제넨테크 인크.로 직접 운반하였다. 당일에, 혈액 샘플을 풀링하고, 인산염 완충 염수 (PBS) 40 ml를 첨가하여 1:1로 희석하였다. 희석된 혈액 20 ml를 50 ml 코니칼 튜브 (Cat#352098, Falcon, Franklin Lakes, NJ) 중 피콜-파크TM플러스 (Ficoll-PaqueTMPlus, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 4 × 20 ml 상에 층으로 만들고, 소르발 7 원심분리기 (Sorval 7, Dupont, Newtown, CT)에서 실온으로 30 분 동안 1300 rpm에서 원심분리하였다. PBMC 층을 단리하고, PBS로 세척하였다. 적색 혈액 세포를 0.2% NaCl 용액으로 세척하고, 1.6% NaCl 용액의 동등한 부피로 등장력으로 저장하고, 10 분 동안 1000 RPM으로 원심분리하였다. PBMC 펠렛을 5% 소태아 혈청 (FBS)을 함유하는 RPMI 1640 (Gibco, Rockville, MD) 중에 재현탁하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 10 cm 조직 배양 디쉬 내에 시여하였다. 부착되지 않은 B 및 T 세포 집단을 흡인하여 제거하고, 원심분리하고 계수하였다. 총 2.4 × 107 세포가 회수되었다. 재현탁된 PBMC를 각각의 튜브가 0.25 ml의 부피 중 1 × 106 세포를 함유하도록 12개의 12 × 75 mm 배양 튜브 (Cat#352053, Falcon) 내로 분배하였다. 튜브를 5개의 튜브 씩 4개의 세트로 나누었다. 각각의 세트에 배지 (RPMI1640, 5% FBS) 및 적정된 양의 대조군 인간 IgG1 항체, 리툭산®, 2H7.v16 또는 2H7.v31 모두를 첨가하였다. 각각의 항체의 최종 농도는 30, 10, 3.3 및 1.1 nM이었다. 추가로, 각각의 튜브는 또한 플루오레세인-이소티오시아네이트 (FITC)-접합된 항-인간 CD20 (Cat#555622, BD Biosciences, San Diego, CA) 20 ㎕를 포함하였다. 세포를 온건하게 혼합하고, 얼음 상에서 1 시간 동안 인큐베이션한 다음, 냉각된 PBS 중에서 2회 세척하였다. 세포 표면 염색을 Epic XL-MCL (Coulter, Miami, FL) 상에서 분석하였고, 항체 농도에 대해 플롯된 기하학적 평균을 유도하였다 (KaleidaGraphTM, Synergy Software, Reading, PA).Antibodies directed against human CD20 were analyzed for the binding and replacement capacity of FITC-conjugated murine 2H7 to bind cynomolgus monkey cells expressing CD20. 20 mL of blood from two cynomolgus monkeys (California Regional Research Primate Center, Davis, Calif.) Was taken in sodium heparin and transferred directly to Genentech Inc. On the day, blood samples were pooled and diluted 1: 1 by the addition of 40 ml of phosphate buffered saline (PBS). The diluted
도 21에서의 데이타는 2H7 v.16 및 2H7 v.31이 시노몰거스 원숭이 세포에 결합하는 FITC-뮤린 2H7을 경쟁적으로 대체한다는 것을 나타낸다. 또한 리툭산®은 FITC-뮤린 2H7 결합을 대체하고, 따라서 2H7 및 리툭산® 모두가 CD20 상의 중첩된 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다. 추가로, 데이타는 2H7v.16, 2H7v.31 및 리툭산®에 대한 IC50 값이 4 내지 6 nM 범위에서 유사하게 감소한다는 것을 나타낸다.The data in FIG. 21 show that 2H7 v.16 and 2H7 v.31 competitively replace FITC-murine 2H7 binding to cynomolgus monkey cells. Rituxan® also replaces FITC-murine 2H7 binding, thus demonstrating that both 2H7 and Rituxan® bind to overlapping epitopes on CD20. In addition, the data show that IC50 values for 2H7v.16, 2H7v.31 and Rituxan® similarly decreased in the 4-6 nM range.
실시예Example 16 16
중등증 내지 중증류마티스성 관절염에서의rhuMAb 2H7 (2H7.v16)의 I/II 기연구Moderate to severeIn
프로토콜 개요Protocol Overview
안정한 투여량으로 수반되는 메토트렉세이트를 받고 있는 중등증 내지 중증 류마티스성 관절염을 앓는 대상체에서 증량된 투여량의 PR070769 (rhuMAb 2H7)의 안정성의 랜덤화, 위약-조절된 다중심-맹 I/II 기 연구.Randomized, placebo-modulated multi-cardiac I / II phase study of the stability of increased doses of PR070769 (rhuMAb 2H7) in subjects with moderate to severe rheumatoid arthritis who are receiving methotrexate accompanied by stable doses .
목적purpose
본 연구의 1차 목적은 중등증 내지 중증 류마티스성 관절염 (RA)을 앓는 대상체에서 증량된 투여량의 PR070769 (rhuMAb 2H7)의 안정성 및 내성을 평가하는 것이다.The primary purpose of this study is to assess the stability and tolerability of increased doses of PR070769 (rhuMAb 2H7) in subjects with moderate to severe rheumatoid arthritis (RA).
연구 디자인Study design
이는 MTX와 함께 중등증 내지 중증 류마티스성 관절염을 앓는 대상체에서 증량된 투여량의 PR070769 (rhuMAb 2H7)의 안정성의 랜덤화, 위약-조절된 다중심-맹 I/II 기 조사자- 및 대상체-맹검 연구이다. 연구는 투여량 증량기 및 더욱 많은 수의 대상체의 등록을 포함하는 제2 기로 구성된다. 후원자는 치료 할당에 자각된 상태일 것이다.This is a randomized, placebo-controlled multicenter-blind I / II phase investigator- and subject-blind study of the stability of an increased dose of PR070769 (rhuMAb 2H7) in subjects with moderate to severe rheumatoid arthritis with MTX to be. The study consisted of a second phase that included a dose extender and enrollment of a larger number of subjects. The sponsor will be aware of the assignment.
1 내지 5개의 질환-개질 항류마티스제에 실패한 중등증 내지 중증 RA를 앓고 있는 대상체 또는 MTX로의 치료에 대한 불만족스러운 임상적인 반응을 일반적으로 가지는 생물체가 등록될 것이다.Subjects with moderate to severe RA who have failed one to five disease-modified antirheumatic agents or organisms generally having an unsatisfactory clinical response to treatment with MTX will be registered.
대상체는 연구 도입 전 12 주 이상 매주 10 내지 25 mg의 범위의 MTX를 받아 연구 (PR070769 또는 위약) 약물의 초기 투여량을 받기 전 4 주 이상 동안 안정한 투여량을 받을 것이다. 또한, 대상체는 경구 코르티코스테로이드 (매일 10 mg 이하 또는 동량의 프레드니손)의 안정한 투여량 및 비-스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID)의 안정한 투여량을 받을 수 있다. 대상체는 하기 투여량 증량 계획 (도 22 참고)에 따라 제1일 및 제15일에 지적한 투여량으로 PR070769 또는 동량의 위약을 정맥내 주입으로 2회 받을 것이다.Subjects will receive a stable dose for at least 4 weeks before receiving the initial dose of study (PR070769 or placebo) drug, receiving MTX in the range of 10-25 mg each week for at least 12 weeks prior to study entry. In addition, subjects can receive stable doses of oral corticosteroids (up to 10 mg daily or equivalent prednisone) and stable doses of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). Subjects will receive two times by intravenous infusion of PR070769 or equivalent placebo at the indicated doses on
투여량 증량은 구체적인 기준 (투여량 증량 규칙 참고)에 따라 내부 안전성 데이타 재고 위원회의 안전성 데이타의 재고 및 각각의 코호트에서 치료받는 최후 대상체에서 제2 주입한지 72 시간 후의 급성 독성의 평가 후 발생할 것이다. 투여량 증량 기 이후, 40명의 추가 대상체 (32명은 활성이고 8명은 위약임)를 각각의 하기 투여량 수준으로 램덤화하였다: 2 × 50 mg, 2 × 200 mg, 2 × 500 mg 및 2 × 1000 mg (투여량 수준은 투여량 증량 기 동안 내성인 것으로 입증된 경우임). 대략 205명의 대상체가 본 연구에 등록할 것이다.Dose escalation will occur following the assessment of the acute toxicity 72 hours after the second infusion in the final subjects treated in each cohort and the inventory of safety data of the Internal Safety Data Inventory Committee according to specific criteria (see Dose Escalation Rules). After the dose escalation phase, 40 additional subjects (32 active and 8 placebo) were randomized to each of the following dosage levels: 2 × 50 mg, 2 × 200 mg, 2 × 500 mg and 2 × 1000 mg (dosage level if proven to be resistant during the dose escalation phase). Approximately 205 subjects will enroll in this study.
B-세포 수를 수득하고, 기록할 것이다 (연구 평가를 위해 4.5 절 및 부록 A-1 참고). B-세포 수를 6-개월 효능 평가를 지나 48주 지난 기간 동안 유세포기를 사용하여 평가할 것이다. B-세포 고갈은 투여량-제한 독성 (DLC)을 고려하지 않았으나 이는 예기되는 PR070769 치료의 약동리학적 결과로 고려될 것이다.B-cell numbers will be obtained and recorded (see Section 4.5 and Appendix A-1 for study evaluation). B-cell numbers will be assessed using flow cytometry for a period of 48 weeks past the 6-month efficacy assessment. B-cell depletion did not take into account dose-limiting toxicity (DLC) but this would be considered as a pharmacokinetic result of the expected PR070769 treatment.
임의의 하위연구에서, 혈청 및 RNA 분석을 위한 혈액 및 소변 샘플을 다양한 시간점 (3.3.3 절 참고)에서 대상체로부터 수득할 것이다. 이들 샘플을 사용하여 중등증 내지 중증 RA를 앓고 있는 대상체에서 PR070769 치료에의 반응을 예상할 수 있는 생물마커를 확인할 수 있다.In any substudy, blood and urine samples for serum and RNA analysis will be obtained from the subject at various time points (see section 3.3.3). These samples can be used to identify biomarkers that can predict response to PR070769 treatment in subjects with moderate to severe RA.
결과 척도Outcome scale
본 연구의 1차 결과 척도는 중등증 내지 중증 RA를 앓고 있는 대상체에서 PR070769의 안전성 및 관용성이다.The primary outcome measure of this study is the safety and tolerability of PR070769 in subjects with moderate to severe RA.
연구 치료Study treatment
대상체의 코호트는 다음의 증량 계획에 따라 제1일 및 제15일에 지시된 투여량으로 PR070769 또는 위약 동량을 정맥내 2회 주입을 받을 것이다:The subject's cohort will receive two intravenous infusions of PR070769 or a placebo equivalent at the indicated doses on
- 10 mg PR070769 또는 위약 동량: 활성 약물-4명의 대상체, 1개 대조군10 mg PR070769 or placebo equivalent: active drug-4 subjects, 1 control
- 50 mg PR070769 또는 위약 동량: 활성 약물-8명 대상체, 2개 대조군50 mg PR070769 or placebo equivalent: active drug-8 subjects, 2 controls
- 200 mg PR070769 또는 위약 동량: 활성 약물-8명 대상체, 2개 대조군200 mg PR070769 or placebo equivalent: active drug-8 subjects, 2 controls
- 500 mg PR070769 또는 위약 동량: 활성 약물-8명 대상체, 2개 대조군500 mg PR070769 or placebo equivalent: active drug-8 subjects, 2 controls
- 1000 mg PR070769 또는 위약 동량: 활성 약물-8명 대상체, 2개 대조군1000 mg PR070769 or placebo equivalent: active drug-8 subjects, 2 controls
효능efficacy
PR070769의 효능은 ACR 반응에 의해 측정할 것이다. ACR20, ACR50 및 ACR70 반응을 달성한 대상체의 백분율(%)을 치료 군으로 요약하고, 95% 신뢰 구간이 각각의 군에 대해 발생할 것이다. 이들 반응의 성분 및 기준선으로부터의 이들의 변화를 치료 및 방문으로 요약할 것이다.The efficacy of PR070769 will be measured by the ACR response. The percentage of subjects who achieved ACR20, ACR50, and ACR70 responses are summarized in the treatment group, and a 95% confidence interval will occur for each group. The components of these responses and their changes from baseline will be summarized as treatments and visits.
결론conclusion
상기 데이타는 인간화 CD20 결합 항체, 특히 이들의 생물학적 특징이 유지되고 심지어는 향상되는 인간화 2H7 항체 변이체를 제조하는데 성공하였음을 입증한다. 뮤린 공여자 및 키메라 2H7 항체와 유사한 친화성으로 CD20과 결합되는 본 발명의 인간화 2H7 항체는 영장류에서 B 세포 사멸에 효과적이고, B 세포 고갈을 유도한다. 특정 변이체는 환자에서 보다 낮은 투여량의 치료적 항체의 사용에 유리하도록, 일반적으로 NHL을 치료하는데 사용되는 키메라 항-CD20 항체 보다 향상된 ADCC를 보인다. 추가로, 뮤린 FR 잔기를 함유하는 키메라 항체가 B 세포에 대한 항체 반응을 제거하는 완전 B 세포 고갈을 달성하는데 유효한 투여량으로 투여될 것을 필요로 하는 반면, 본 발명의 인간화 항체는 특정 질환 및 환자에 대해 바람직하도록, 상이한 시간의 기간 동안 부분 또는 완전 B 세포 고갈을 달성하는 투여량으로 투여할 수 있다. 또한, 이들 항체는 용액 중에 안정성이 입증되었다. 인간화 2H7 항체의 이러한 특성은 CD20 양성 암 및 자가면역 질환의 치료에서 면역치료제로서 사용하는데 본 항체를 이상적으로 만들며; 이들 항체는 인간 환자에서 비면역반응성이거나, 적어도 완전 뮤린 또는 키메라 항-CD20 항체보다 덜 면역반응성일 것으로 예상된다.The data demonstrates the success of producing humanized CD20 binding antibodies, particularly humanized 2H7 antibody variants in which their biological characteristics are maintained and even enhanced. The humanized 2H7 antibodies of the invention, which bind to CD20 with similar affinity to murine donor and chimeric 2H7 antibodies, are effective at killing B cells in primates and induce B cell depletion. Certain variants show improved ADCC over chimeric anti-CD20 antibodies generally used to treat NHL, to favor the use of lower dose therapeutic antibodies in patients. In addition, while chimeric antibodies containing murine FR residues are required to be administered at a dosage effective to achieve complete B cell depletion that eliminates antibody responses to B cells, the humanized antibodies of the present invention may be used for certain diseases and patients. To be desirable for, administration may be at dosages that achieve partial or complete B cell depletion for different periods of time. In addition, these antibodies have demonstrated stability in solution. This property of the humanized 2H7 antibody makes this antibody ideal for use as an immunotherapeutic agent in the treatment of CD20 positive cancers and autoimmune diseases; These antibodies are expected to be non-immunoreactive in human patients or at least less immunoreactive than fully murine or chimeric anti-CD20 antibodies.
참고문헌references
특허, 공개 출원 및 기타 공개문헌을 비롯한 본원에 인용된 참고문헌은 참고문헌으로 본원에 인용된다.References cited herein, including patents, publications, and other publications, are incorporated herein by reference.
본 발명의 실시는 달리 지시하지 않는 한 당업계에 속한 분자 생물학 등의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 참고문헌에 모두 설명되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참고.The practice of the present invention will employ conventional techniques, such as molecular biology, in the art unless otherwise indicated. These techniques are all described in the references. See, for example, the following references.
본원발명은 인간화 CD20 결합 항체, 특히 이들의 생물학적 특징이 유지되고 심지어는 향상된 인간화 2H7 항체 변이체를 제공한다.The present invention provides humanized CD20 binding antibodies, in particular humanized 2H7 antibody variants whose biological characteristics are retained and even improved.
<110> GENENTECH, INC. 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Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 215 220 acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 1146 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 225 230 235 aac agg gga gag tgt t aagctgat cctctacgcc ggacgcatcg 1190 Asn Arg Gly Glu Cys 240 241 tggccctagt acgcaagttc acgtaaaaag ggtatctaga ggttgaggtg 1240 atttt atg aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct 1278 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser 1 5 10 atg ttc gtt ttt tct att gct aca aac gcg tac gct gag 1317 Met Phe Val Phe Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu 15 20 gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca 1356 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 25 30 35 ggg ggc tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc tac 1395 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 40 45 50 acc ttc acc gaa tat atc atc cac tgg gtc cgt cag gcc 1434 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala 55 60 ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt gca tcg att aat cct 1473 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Asn Pro 65 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ggcgtatcac gaggcccttt 5670 cgtcttcaa 5679<210> 14<211> 241<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 14 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met 50 55 60 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 65 70 75 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 80 85 90 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 95 100 105 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp Gly 110 115 120 Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 125 130 135 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 140 145 150 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 155 160 165 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 170 175 180 Leu Gln Ser Gly Asn 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atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc 2270 atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct 2320 gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga 2370 atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg 2420 tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta 2470 aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg ttccggatct 2520 gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta 2570 acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat 2620 ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt 2670 catcatcagt aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc 2720 attaccccca tgaacagaaa ttccccctta cacggaggca tcaagtgacc 2770 aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac 2820 attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag 2870 acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcagcatc 2920 cggaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt 2970 taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 3020 taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga 3070 acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 3120 accgtctatc agggctatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag 3170 ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 3220 gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 3270 gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 3320 ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 3370 agggcgcgtc cgcatcctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 3420 ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 3470 tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 3520 gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 3570 ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 3620 cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 3670 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3720 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 3770 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3820 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 3870 cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 3920 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 3970 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 4020 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 4070 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 4120 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 4170 acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 4220 attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 4270 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 4320 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 4370 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4420 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 4470 ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 4520 ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 4570 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 4620 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 4670 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt 4720 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agaaaaataa acaaataggg 5570 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat 5620 tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 5670 gtcttcaa 5678<210> 17<211> 236<212> PRT<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is chimeric<400> 17 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser 20 25 30 Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn 65 70 75 Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 80 85 90 Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala 95 100 105 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe 110 115 120 Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 125 130 135 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 140 145 150 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 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150 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 155 160 165 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 170 175 180 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 185 190 195 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 200 205 210 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 215 220 225 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 230 235 240 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 305 310 315 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 320 325 330 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 335 340 345 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile 350 355 360 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 365 370 375 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 380 385 390 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 395 400 405 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 410 415 420 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 425 430 435 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 440 445 450 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 455 460 465 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 470<210> 24<211> 891<212> DNA<213> Macaca fascicularis<400> 24 atg aca aca ccc aga aat tca gta aat ggg act ttc 36 Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe 1 5 10 cca gca gag cca atg aaa ggc cct att gct atg caa cct 75 Pro Ala Glu Pro Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Pro 15 20 25 ggt cca aaa cca ctc ctc agg agg atg tct tca ctg gtg 114 Gly Pro Lys Pro Leu Leu Arg Arg Met Ser Ser Leu Val 30 35 ggt ccc acg caa agc ttc ttc atg agg gaa tct aag gct 153 Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu Ser Lys Ala 40 45 50 ttg ggg gct gtc cag att atg aat ggg ctc ttc cac att 192 Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile 55 60 gcc ctg ggg ggt ctt ctg atg atc cca gca ggg atc tat 231 Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr 65 70 75 gca ccc atc tgt gtg act gtg tgg tac cct ctg tgg gga 270 Ala Pro Ile Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly 80 85 90 ggc att atg tat att att tcc gga tca ctc ctg gca gca 309 Gly Ile Met Tyr Ile Ile Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala 95 100 acg gag aaa aac tcc agg aag tgt ttg gtc aaa gga aaa 348 Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu Val Lys Gly Lys 105 110 115 atg ata atg aat tca ttg agc ctc ttt gct gcc att tct 387 Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser 120 125 gga atg att ctt tca atc atg gac ata ctt aat att aaa 426 Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys 130 135 140 att tcc cat ttt tta aaa atg gag agt ctg aat ttt atc 465 Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile 145 150 155 aga gtt cac aca cca tat att aac ata tac aac tgt gaa 504 Arg Val His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu 160 165 cca gct aat ccc tct gag aaa aac tct cca tct act caa 543 Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln 170 175 180 tac tgt tac agc ata caa tct ctg ttc ctg ggc att ttg 582 Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu 185 190 tca gtg atg ctg atc ttt gcc ttc ttc cag gaa ctt gta 621 Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val 195 200 205 ata gct ggc atc gtt gag aat gaa tgg aga aga aca tgc 660 Ile Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Arg Arg Thr Cys 210 215 220 tcc aga ccc aaa tct agc gta gtt ctc ctg tca gct gaa 699 Ser Arg Pro Lys Ser Ser Val Val Leu Leu Ser Ala Glu 225 230 gaa aaa aaa gaa caa gtc att gaa ata aaa gaa gaa gtg 738 Glu Lys Lys Glu Gln Val Ile Glu Ile Lys Glu Glu Val 235 240 245 gtt ggg cta act gaa aca tct tcc caa cca aag aat gaa 777 Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro Lys Asn Glu 250 255 gaa gcc att gaa att att cca atc caa gaa gag gaa gaa 816 Glu 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Ile Lys Ile Ser His Phe Leu Lys Met Glu 140 145 150 Ser Leu Asn Phe Ile Arg Val His Thr Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr 155 160 165 Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr 170 175 180 Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser 185 190 195 Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile Ala Gly 200 205 210 Ile Val Glu Asn Glu Trp Arg Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys Ser 215 220 225 Ser Val Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Val Ile 230 235 240 Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln 245 250 255 Pro Lys Asn Glu Glu Ala Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu 260 265 270 Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp 275 280 285 Gln Glu Ser Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro 290 295<210> 26<211> 297<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 26 Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu 1 5 10 15 Pro Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu 20 25 30 Phe Arg Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser 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Gln 245 250 255 Pro Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu 260 265 270 Glu Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp 275 280 285 Gln Glu Ser Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro 290 295<210> 27<211> 36<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 27 ctacaccttc acgagctata acatgcactg ggtccg 36<210> 28<211> 51<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 28 gattaatcct gacaacggcg acacgagcta taaccagaag ttcaagggcc 50 g 51<210> 29<211> 38<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 29 gaatgggttg cagcgatcta tcctggcaac ggcgacac 38<210> 30<211> 65<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 30 attattgtgc tcgagtggtc tactatagca acagctactg gtacttcgac 50 gtctggggtc aagga 65<210> 31<211> 36<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 31 ctgcacagcc agctcttctg tcagctatat gcattg 36<210> 32<211> 42<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 32 aactactgat ttacgctcca tcgaacctcg cgtctggagt cc 42<210> 33<211> 45<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 33 tattactgtc aacagtggag cttcaatccg cccacatttg gacag 45<210> 34<211> 37<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 34 gtttcactat aagtgtcgac aagtccaaaa acacatt 37<210> 35<211> 33<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 35 gccaggatag atggcgccaa cccattccag gcc 33<210> 36<211> 26<212> DNA<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 36 aagctccgaa accactgatt tacgct 26<210> 37<211> 18<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 37 agttttgaga gcaaaatg 18<210> 38<211> 18<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 38 aagctatgaa cactaatg 18<110> GENENTECH, INC. ET AL.<120> Immunoglobulin Variants and Uses Thereof<130> P1990R3<140> PCT / US03 / 40426<141> 2003-12-16<150> US 60 / 434,115<151> 2002-12-16<150> US 60 / 526,163<151> 2003-12-01<160> 38<210> 1<211> 107<212> PRT<213> Mus musculus<400> 1 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro 35 40 45 Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 95 100 105 Lys arg<210> 2<211> 107<212> PRT<213> Artificial sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 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gggatcctct agaggttgag gtgatttt atg aaa 444 Met lys One aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt 483 Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 5 10 15 tct att gct aca aac gcg tac gct gat atc cag atg acc 522 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr 20 25 cag tcc ccg agc tcc ctg tcc gcc tct gtg ggc gat agg 561 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 30 35 40 gtc acc atc acc tgc aga gcc agt cag agc gtg tcg act 600 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr 45 50 agc tct tat agc tat atg cac tgg tat caa cag aaa cca 639 Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 55 60 65 gga aaa gct ccg aaa cta ctg att tac tat gct agc aac 678 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn 70 75 80 ctc gag tct gga gtc cct tct cgc ttc tct gga tcc ggt 717 Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 85 90 tct ggg acg gat ttc act ctg acc atc agc agt ctg cag 756 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 95 100 105 cca gaa gac ttc gca act tat tac tgt caa cac tct tgg 795 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 110 115 ggt att ccg cgc aca ttt gga cag ggt acc aag gtg gag 834 Gly Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 120 125 130 atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc 873 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 135 140 145 ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gct tct 912 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 150 155 gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc 951 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 160 165 170 aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt 990 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 175 180 aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac 1029 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 185 190 195 agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa 1068 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 200 205 210 gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc 1107 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 215 220 acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 1146 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 225 230 235 aac agg gga gag tgt t aagctgat cctctacgcc ggacgcatcg 1190 Asn Arg Gly Glu Cys 240 241 tggccctagt acgcaagttc acgtaaaaag ggtatctaga ggttgaggtg 1240 atttt atg aaa aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct 1278 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser 1 5 10 atg ttc gtt ttt tct att gct aca aac gcg tac gct gag 1317 Met Phe Val Phe Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Glu 15 20 gtt cag ctg gtg gag tct ggc ggt ggc ctg gtg cag cca 1356 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 25 30 35 ggg ggc tca ctc cgt ttg tcc tgt gca gct tct ggc tac 1395 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr 40 45 50 acc ttc acc gaa tat atc atc cac tgg gtc cgt cag gcc 1434 Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His Trp Val Arg Gln Ala 55 60 ccg ggt aag ggc ctg gaa tgg gtt gca tcg att aat cct 1473 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Asn Pro 65 70 75 gac tac gac atc acg aac tat aac cag cgc ttc aag ggc 1512 Asp Tyr Asp Ile Thr Asn Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly 80 85 cgt ttc act ata agt cgc gac gat tcc aaa aac aca tta 1551 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu 90 95 100 tac ctg cag atg aac agc ctg cgt gct gag gac act gcc 1590 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 105 110 115 gtc tat tat tgt gct cga tgg atc agc gat ttc ttc gac 1629 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ile Ser Asp Phe Phe Asp 120 125 tac tgg ggt caa gga acc ctg gtc acc gtc tcc tcg gcc 1668 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc 1707 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150 tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc 1746 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 155 160 165 ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg 1785 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 170 175 180 tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc 1824 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 185 190 ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc 1863 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag 1902 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 210 215 acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc 1941 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 220 225 230 aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa 1980 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 235 240 245 act cac aca t gaccaccgca tgcaccagta tcgtccattc 2020 Thr His Thr 248 cgacagcatc gccagtcact atggcgtgct gctagcgccg ccctatacct 2070 tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 2120 cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc actccaagaa 2170 ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca aaccaaccct 2220 tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg 2270 catctcgggc agcgttgggt cctggccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2320 tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag 2370 aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac 2420 gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt 2470 aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 2520 tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt 2570 aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2620 tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt 2670 tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat 2720 cattaccccc atgaacagaa attccccctt acacggaggc atcaagtgac 2770 caaacaggaa aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga 2820 cattaacgct tctggagaaa ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca 2870 gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct gatgagcttt accgcagcat 2920 ccggaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg 2970 ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt 3020 ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg 3070 aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa 3120 aaccgtctat cagggctatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa 3170 gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 3220 agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa 3270 ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag 3320 cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta 3370 cagggcgcgt ccgcatcctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa 3420 cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 3470 atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 3520 tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac 3570 tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat 3620 gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 3670 gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 3720 cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 3770 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 3820 ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3870 ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 3920 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 3970 tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 4020 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 4070 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 4120 ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 4170 aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 4220 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 4270 ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 4320 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 4370 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 4420 cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 4470 tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 4520 attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 4570 ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 4620 tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 4670 catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 4720 taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 4770 gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 4820 aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 4870 gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 4920 gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 4970 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 5020 tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 5070 aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 5120 tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 5170 caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 5220 ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 5270 gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 5320 cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 5370 tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 5420 gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 5470 tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 5520 ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 5570 ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 5620 ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 5670 cgtcttcaa 5679<210> 14<211> 241<212> PRT<213> Artificial Sequence<220><223> Sequence is synthesized<400> 14 Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 1 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met 50 55 60 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 65 70 75 Tyr Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 80 85 90 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 95 100 105 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp Gly 110 115 120 Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 125 130 135 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 140 145 150 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 155 160 165 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 170 175 180 Leu Gln Ser Gly Asn 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cttttcaaca gctgtcataa agttgtcacg gccgagactt 350 atagtcgctt tgtttttatt ttttaatgta tttgtaacta gaattcgagc 400 tcggtacccg gggatcctct agaggttgag gtgattt atg aaa 443 Met lys One aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt 482 Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 5 10 15 tct att gct aca aac gcg tac gct cag ata gta ctg tcc 521 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Gln Ile Val Leu Ser 20 25 cag tcc ccg gct atc ctg tcc gcc tct cct ggc gag aag 560 Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys 30 35 40 gtc act atg acc tgc aga gcc agc tct tct gtg agc tat 599 Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr 45 50 atg cat tgg tat caa cag aaa cca gga agc tct ccg aaa 638 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 55 60 65 cca tgg att tac gct cca tcg aac ctc gcg tct gga gtc 677 Pro Trp Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val 70 75 80 cct gcg cgc ttc tct gga tcc ggt tct ggg act agt tac 716 Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr 85 90 tct ctg acc atc agc aga gtg gag gca gaa gac gcc gca 755 Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala 95 100 105 act tat tac tgt caa cag tgg agc ttc aat ccg ccc aca 794 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 110 115 ttt gga gcc ggc acc aag ctg gag ctc aaa cga act gtg 833 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val 120 125 130 gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 872 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 135 140 145 cag ttg aaa tct gga act gct tct gtt gtg tgc ctg ctg 911 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 150 155 aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag 950 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 160 165 170 gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt 989 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 175 180 gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc 1028 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 185 190 195 agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 1067 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 200 205 210 cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg 1106 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 215 220 agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 1145 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 236 t aagc tgatcctcta cgccggacgc atcgtggccc tagtacgcaa 1190 gttcacgtaa aaagggtatc tagaggttga ggtgatttt atg aaa 1235 Met lys One aag aat atc gca ttt ctt ctt gca tct atg ttc gtt ttt 1274 Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe 5 10 15 tct att gct aca aac gcg tac gct cag gct tat ctg cag 1313 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Gln Ala Tyr Leu Gln 20 25 cag tct ggc gcc gag ctg gtg cgg cca gga gct agc gtc 1352 Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val 30 35 40 aag atg tcc tgt aaa gct tct ggc tac acc ttc acc agc 1391 Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 45 50 tat aac atg cat tgg gtc aag cag aca ccg agg caa ggc 1430 Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly 55 60 65 ctg 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1781 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 175 180 tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc 1820 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 185 190 195 ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc 1859 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 200 205 210 agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc 1898 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 215 220 cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac 1937 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 225 230 235 acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac 1976 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 240 245 aaa act cac aca t g accaccgcat gcaccagtat cgtccattcc 2020 Lys Thr His Thr 250 253 gacagcatcg ccagtcacta tggcgtgctg ctagcgccgc cctatacctt 2070 gtctgcctcc ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgac 2120 ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat 2170 tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt 2220 ggcagaacat 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ccagtttgga 3070 acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 3120 accgtctatc agggctatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag 3170 ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 3220 gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 3270 gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 3320 ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac 3370 agggcgcgtc cgcatcctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 3420 ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 3470 tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 3520 gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 3570 ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg 3620 cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg 3670 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 3720 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 3770 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3820 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 3870 cccctgacga gcatcacaaa 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