본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아스코르브산-2 글루코시드를 유효 성분으로 포함하는 티로시나아제 활성 저해용 조성물을 제공한다.
아스코르브산-2 글루코시드 (AA-2G)는 L-아스코르브산의 2번 탄소 위치의 히드록시기를 글루코오스로 치환한 화합물이다. L-아스코르브산의 2번 탄소 위치의 히드록시기에 치환되는 글루코오스는 α-D-글루코오스 또는 β-D-글루코오스일 수 있으며, 상기 L-아스코르브산과 글루코오스 사이의 결합은 상기 글루코오스의 1번, 2번, 3번, 4번, 5번 또는 6번 탄소의 히드록시기와 상기 L-아스코르브산의 2번 탄소의 히드록시기 사이의 탈수 반응에 의한 결합일 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 아스코르브산-2 글루코시드는 α-D-글루코오스의 1번 탄소의 히드록시기와 L-아스코르브산의 2번 탄소의 히드록시기 사이에 결합이 형성된 하기 화학식 1의 아스코르브산-2 글루코시드이다.
아스코르브산-2 글루코시드는 2번 탄소 위치의 히드록시기가 글루코오스로 치환되어 있으므로 자동 산화가 일어나지 않아 L-아스코르브산에 비하여 안정성이 높다. AA-2G는 L-아스코르브산에 글루코오스 한 분자가 결합되어 합성되며, 이 과정에 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제 (CGTase) 당 전이 효소가 작용한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아스코르브산-2 글루코시드를 유효 성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "미백"은 멜라닌 색소의 침착으로 야기되는 피부의 흑화를 방지하거나 기미, 주근깨 등의 피부 트러블을 개선하는 작용을 의미한다.
본 발명자들은 종래의 L-아스코르브산을 포함하는 미백 화장료 조성물의 문제점, 즉, 안정성의 저하, 피부 자극 유발, 성분 함량의 변화 등의 문제점을 극복하기 위하여, L-아스코르브산의 유도체 중에서 AA-2G가 수용액 상에서도 안정하고 피부 자극을 거의 유발하지 않으며, 시간에 따른 성분 함량의 변화도 거의 없음을발견하였다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기 아스코르브산-2 글루코시드의 함량은 상기 조성물의 총 건조 중량에 대해서 0.0001-10.0 중량%이 바람직하며, 0.0001 중량% 미만인 경우에는 실질적인 미백 효과를 기대하기 어렵고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 제형상 문제점 및 제품의 안정성이 감소되는 문제점이 있다. 보다 바람직하게는, 상기 아스코르브산-2 글루코시드의 함량은 상기 조성물의 총 건조 중량에 대해서 0.01-3.0 중량%이다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 아스코르브산-2 글루코시드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 미백용 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 미백 화장료 조성물에서, 아스코르브산-2 글루코시드는 멜라노사이트에서 티로시나아제 활성을 억제하여 미백 효과를 나타내며, 안정성이 높고, 시간 경과에 따른 성분 함량의 변화가 거의 없으며 피부 자극 유발 등의 부작용이 거의 없다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: AA-2G의 제조
본 발명의 AA-2G는 L-아스코르브산에 글루코오스 한 분자를 결합시켜 제조되며, 전체적으로 효소 반응을 이용한다. 덱스트린이나 전분의 존재 하에서 사이클로텍스트린 글루카노트랜스퍼라아제 당 전이 효소를 작용시켜 제조하였다 (Aga, H. et al.,Agric. Biol. Chem.55:1751-1756(1991)).
실험예 1: 티로시나아제 활성 저해도 측정
티로시나아제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질로서 L-티로신 (L-tyrosine, Sigma)은 0.05 M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)에 용해하여 0.1 ㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 아스코르브산 및 AA-2G는 0.05 M 인산나트륨 완충용액 (pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5 ㎖을 시험관에 넣고 여기에 아스코르브산 또는 AA-2G 시료액 0.5 ㎖을 각각 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후 각 시료액에 200 unit/㎖ 티로시나아제 0.5 ㎖을 넣고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후 분광 광도계로 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 각 비타민 시료 대신 완충용액을 0.5 ㎖ 넣은 것을 대조군으로 사용하였다.
아스코르브산 및 AA-2G 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
효소 활성 저해율(%)= 100 - [(비교군 흡광도/대조군 흡광도) ×100]
실험 결과는 하기 표 1에 나타나 있다.
| 농도 (%) | 효소 활성 저해율 (%) |
| 아스코르브산 | AA-2G |
| 0.01 | 71.9 | 73.2 |
| 0.05 | 91.0 | 91.8 |
| 0.1 | 96.2 | 96.7 |
| 0.5 | 97.1 | 97.1 |
| 1 | 97.4 | 97.6 |
상기 결과에서 확인할 수 있듯이, 아스코르브산 및 AA-2G는 비교적 높은 티로시나아제 활성 저해 효과를 나타내며, 효소활성 저해율 또한 유사함을 알 수있다.
실험예 2: 아스코르브산 및 AA-2G의 멜라노사이트에서의 멜라닌 생성 저해도 비교
멜라노사이트는 마우스 유래 B-16 멜라노마 (melanoma) 세포주 (ATCC CRL 6323)를 사용하였다. 멜라노마 세포주를 포도당 4.5 g/ℓ, 10% 소태아 혈청 및 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지에 접종하여 50 ㎖ T-플라스크에서 37℃ 5% CO2조건 하에서 24시간 배양하였다. 그 후, 0.02% EDTA가 포함된 0.05% 트립신을 처리하여 세포를 분리한 후 50 ㎖ T-플라스크에 접종하여 48시간 배양하였다. 이때 세포 수는 5.76 ×106세포/플라스크였다. 여기에 적당 농도의 AA-2G 및 아스코르브산을 DMEM 배지에 희석시켜 배양된 멜라노마 세포에 처리하여 37℃에서 5일간 배양하였다. 그 후 상기 배지를 모두 제거하고, 0.02% EDTA 및 0.05% 트립신을 포함한 PBS 1 ㎖를 처리하여 세포를 분리시킨 후 5분간 원심 분리하여 세포만을 수집하였다. 이것에 5% 트리클로로아세테이트 (TCA)를 처리하여 교반하고, 원심 분리하여 침전된 멜라닌을 PBS로 세척하였다. 침전된 멜라닌에 1N NaOH를 처리하여 용해시킨 후, 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 농도는 합성 멜라닌 (Sigma)의 표준 농도 곡선으로부터 결정하였다.
실험 결과는 표 2에 나타나 있다.
| 농도 (㎍/㎖) | 멜라닌 합성 저해율 (%) |
| 아스코르브산 | AA-2G |
| 5 | 19.3 | 38.1 |
| 10 | 32.8 | 62.4 |
| 50 | 50.5 | 91.3 |
| 100 | 67.2 | 94.7 |
상기 결과에서 확인할 수 있듯이, AA-2G의 멜라노사이트 내에서의 멜라닌 생성 억제 효과는 아스코르브산에 비하여 약 41-98% 증가하였으며, 따라서 AA-2G의 멜라닌 생성 억제 효과는 아스코르브산에 비하여 더 우수함을 알 수 있다.
실험예 3 : 아스코르브산 및 AA-2G 함유 화장료 조성물의 시간에 따른 함량 변화 비교
AA-2G 0.5중량%, 글리세린 6.0중량%, 1,3-부틸렌글리콜 3.0중량%, PEG 1500 1.0중량%, 알란토인 0.1중량%, DL-판테놀 0.3중량%, EDTA-2NA 0.02중량%, 벤조페논-9 0.04중량%, 소듐 히아루로네이트 5.0중량%, 에탄올 10.0중량%, 옥틱도데세스-16 0.2중량%, 폴리솔베이트-20 0.2중량%, 향, 방부제, 미량의 색소 및 정제수 잔량을 함유하는 화장료 조성물 (#1)을 준비하였다. 상기 화장료 조성물 (#1)에서 AA-2G를 대신하여 아스코르브산 0.5중량% 함유하는 화장료 조성물 (#2)을 준비하였다. 상기 화장료 조성물 중의 아스코르브산 및 AA-2G의 함량 변화 분석을 위해 이소프로필알코올 10 ㎖에 각각의 화장료 조성물 (#1 및 #2)의 샘플 5 g을 현탁시켜 10분 동안 초음파 분쇄한 후 메탄올 60 ㎖에 적용하였다. 초음파 처리 후 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 각각의 시료를 HPLC (C18, U.V. 325nm, 30)으로 정량 분석하였다.
실험 결과는 표 3에 나타나 있다.
| 구분 | 1주 | 2주 | 3주 | 4주 | 5주 | 6주 | 7주 | 8주 | 9주 | 10주 | 11주 | 12주 |
| #1 | 97.3 | 97.3 | 97.1 | 96.7 | 96.6 | 96.4 | 96.4 | 96.2 | 96.0 | 95.9 | 95.7 | 95.7 |
| #2 | 97.1 | 95.5 | 91.7 | 85.3 | 82.4 | 75.3 | 70.8 | 66.8 | 63.2 | 57.5 | 55.7 | 52.4 |
상기 결과에서 확인할 수 있듯이, 화장료 조성물 중의 함량 변화 분석 결과 3개월 경과 후, 아스코르브산의 함량은 약 50% 감소한 반면, AA-2G의 함량은 거의 변화가 없음을 알 수 있다.
상기의 결과들은 본 발명의 조성물이 높은 티로시나아제 활성 억제 효과를 나타내어 멜라닌 합성을 효과적으로 저해하면서도 화장료 조성물 내에서 안정성이 높아 기미나 주근깨 개선 및 피부 미백에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 입증한다.
이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하고 있으나, 본 발명의 조성물을 포함하는 화장료의 제형은 이에 제한되는 것은 아니다.
제형예 1: 유연 화장수
| 성분 | 함량 (중량%) |
| AA-2G | 0.5 |
| 글리세린 | 6.0 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 3.0 |
| PEG 1500 | 1.0 |
| 알란토인 | 0.1 |
| DL-판테놀 | 0.3 |
| EDTA-2Na | 0.02 |
| 벤조페논-9 | 0.04 |
| 소듐 히아루로네이트 | 5.0 |
| 에탄올 | 10.0 |
| 옥틱도데세스-16 | 0.2 |
| 폴리솔베이트 20 | 0.2 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제형예 2: 수렴화장수
| 성분 | 함량 (중량%) |
| AA-2G | 0.5 |
| 글리세린 | 2.0 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 2.0 |
| 알란토인 | 0.2 |
| DL-판테놀 | 0.2 |
| EDTA-2Na | 0.02 |
| 벤조페논-9 | 0.04 |
| 소듐 히아루로네이트 | 3.0 |
| 에탄올 | 15.0 |
| 폴리솔베이트 20 | 0.3 |
| 위치하젤 추출물 | 2.0 |
| 구연산 | 미량 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제형예 3: 영양화장수
| 성분 | 함량 (중량%) |
| AA-2G | 1.0 |
| 글리세릴 스테아레이트 SE | 1.5 |
| 스테아릴 알코올 | 1.5 |
| 라놀린 | 1.5 |
| 폴리솔베이트 | 1.3 |
| 소르비탄스테아레이트 | 0.5 |
| 경화식물유 | 1.0 |
| 광물유 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 3.0 |
| 트리옥타노인 | 2.0 |
| 디메치콘 | 0.8 |
| 초산 토코페롤 | 0.5 |
| 카르복시비닐 폴리머 | 0.12 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 1,3-부틸렌글리콜 | 3.0 |
| 소듐 히아루로네이트 | 5.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.12 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제형예 4: 영양크림
| 성분 | 함량 (중량%) |
| AA-2G | 1.0 |
| 친유형 모노스테아린산글리세린 | 2.0 |
| 세테아릴알코올 | 2.2 |
| 스테아린산 | 1.5 |
| 밀납 | 1.0 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄스테아레이트 | 0.6 |
| 경화식물유 | 1.0 |
| 스쿠알란 | 3.0 |
| 광물유 | 5.0 |
| 트리옥타노인 | 5.0 |
| 디메치콘 | 1.0 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 베타인 | 3.0 |
| 트리에탄올아민 | 1.0 |
| 소듐 히아루로네이트 | 4.0 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제형예 5: 마사지 크림
| 성분 | 함량 (중량%) |
| AA-2G | 1.0 |
| 친유형 모노스테아린산 글리세린 | 1.5 |
| 스테아릴 알코올 | 1.5 |
| 스테아린산 | 1.0 |
| 폴리솔베이트 60 | 1.5 |
| 소르비탄스테아레이트 | 0.6 |
| 이소스테아릴이소스테레이트 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 광물유 | 35.0 |
| 디메치콘 | 0.5 |
| 히드록시에틸셀룰로오스 | 0.12 |
| 글리세린 | 6.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.7 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제형예 6: 에센스
| 성분 | 함량 (중량%) |
| AA-2G | 1.0 |
| 글리세린 | 10.0 |
| 베타인 | 5.0 |
| PEG 1500 | 2.0 |
| 알란토인 | 0.1 |
| DL-판테놀 | 0.3 |
| EDTA-2Na | 0.02 |
| 벤조페논-9 | 0.04 |
| 히드록시에틸셀룰로오스 | 0.1 |
| 소듐 히아루로네이트 | 8.0 |
| 카르복시비닐 폴리머 | 0.2 |
| 트리에탄올아민 | 0.18 |
| 옥틸도데칸올 | 0.3 |
| 옥틸도데세스-16 | 0.4 |
| 에탄올 | 6.0 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
제형예 7: 팩
| 성분 | 함량 (중량%) |
| AA-2G | 1.0 |
| 폴리비닐알코올 | 15.0 |
| 셀룰로오스 검 | 0.15 |
| 글리세린 | 3.0 |
| PEG 1500 | 2.0 |
| 시이크데스트린 | 0.15 |
| DL-판테놀 | 0.4 |
| 알란토인 | 0.1 |
| 글리시리진산모노암모늄 | 0.3 |
| 니코틴아미드 | 0.5 |
| 에탄올 | 6.0 |
| PEG 40 경화피마자유 | 0.3 |
| 방부제, 향, 색소 | 미량 |
| 증류수 | 잔량 |
| 합계 | 100 |
실험예 4 : 미백 효과 측정
건강한 30-40세 한국 여성 실험 대상자 60명을 대상으로 미백 효과를 측정하였다. 이들을 무작위로 2개 군으로 나누어 각각의 군에 제형예 4의 AA-2G를 1.0% 포함하고 있는 영양 크림 및 비교예로서 제형예 4의 AA-2G를 정제수로 대체한 영양 크림을 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 안면 좌측 부위와 안면 우측 부위에 적당량을 2개월간 연속적으로 도포하게 하였다. 미백 효과는 시험 종료 후 안면의 개선 정도를 관찰하여 효과가 나타난 실험 대상자의 인원 수로써 개선 효과를 평가하였다.
실험 결과는 표 11에 나타나 있다.
| 구분 | 유효 (명) | 약간 유효 (명) | 무효 (명) | 유효율(%) |
| 제형예 4의 크림 | 24 | 5 | 1 | 88.3 |
| 비교예의 크림 | 1 | 4 | 25 | 10.0 |
상기 결과에 의하면 AA-2G를 포함한 본 발명의 조성물은 비교예의 조성물에 비하여 높은 미백 효과를 보임을 알 수 있으며, 또한, 본 발명의 조성물을 피부에 도포한 피검자들에게서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.