본 발명은 활막을 특이적으로 표적화하는 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to compounds that specifically target the synovium and their uses.
관절염은 관절 및 주변 조직에 영향을 미치는 상태에 대한 일반적인 용어이다. 관절은 무릎, 손목, 손가락, 발가락, 및 엉덩이와 같이, 뼈들이 함께 있는 신체 내에 위치한다. 관절염의 2가지 가장 일반적인 유형은 골관절염 및 류마티스 관절염이다. 골관절염(Osteoarthritis, OA)은 미국에서만 2천만명 이상의 개인에게 영향을 미치는 가장 일반적인 유형의 관절 질환이다. 이는 70세 이상의 노인에게서 만성 장애의 주된 원인이며, 미국에서 매년 1,850억 달러 이상을 소비한다. 이는 엉덩이, 무릎, 목, 등 아래, 또는 손의 작은 관절을 흔히 포함하는 고통스러운, 퇴행성 관절 질환이다. 골관절염은 특수한 업무를 수행하거나 좋아하는 운동을 하거나 과도한 체중를 지니고 다님으로써 반복된 과다사용으로 인해 손상되는 관절에서 일반적으로 진행된다. 골관절염은 활막 관절내 관절(유리질) 연골의 생화학적 파괴를 유발하는 퇴행성 장애로 고려될 수 있다. 그러나, 현재의 관점은 관절염이 관절 연골 뿐만 아니라 연하골 및 활막을 포함하는 전체 관절 기관을 포함하는 것도 유지하고 있다. 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 손가락, 엄지손가락, 손목, 팔꿈치, 어깨, 무릎, 발, 및 발목에서 다양한 관절을 일반적으로 포함하는 자가염증성 질환으로, 관절 주위를 둘러싸고 있는 활막이라는 조직의 염증 때문에 일어나며, 전체 인구의 약 1~2% 가량에서 발병하는 것으로 알려진 질환이다 (Alamanosa and Drosos, Autoimmun. Rev., 4:130-136 (2005)). 류마티스 관절염의 발병은 유전적-환경적 인자가 작용하며, 유전적인 요인이 대략 60% 정도 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 관절 내 부위 또는 관절 주변 부위에만 영향을 미치는 다른 관절염 상태들과는 달리, 류마티스 관절염은 피부, 혈관, 심장, 폐 및 근육을 포함하는 신체에 걸쳐 관절 외 조직에서 염증을 야기할 수 있는 전신성 질환이다. 통풍은 활액 및 다른 조직 속에서 요산일나트륨 결정의 침착 및 신장에서 뇨산 결석의 형성으로부터 생성되는 질환이다. 통풍은 전형적으로 중년기 동안에 일어나며 30세 이전에는 일반적이지 않다. 여성은 폐경기 전에는 통풍 관절염 공격을 거의 받지 않는다.Arthritis is a general term for conditions affecting joints and surrounding tissues. Joints are located within the body where bones come together, such as the knees, wrists, fingers, toes, and hips. The two most common types of arthritis are osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Osteoarthritis (OA) is the most common type of joint disease, affecting more than 20 million people in the United States alone. It is the leading cause of chronic disability in people over 70 years of age and costs the United States more than $185 billion annually. It is a painful, degenerative joint disease that commonly affects the small joints of the hips, knees, neck, lower back, or hands. OA typically develops in joints damaged by repetitive overuse, such as performing specific tasks, engaging in favorite sports, or carrying excess weight. Osteoarthritis can be considered a degenerative disorder that causes biochemical destruction of the synovial (hyaline) articular cartilage. However, current thinking maintains that arthritis involves the entire joint system, including not only the articular cartilage but also the subchondral bone and synovium. Rheumatoid arthritis (RA) is an autoinflammatory disease that commonly involves various joints in the fingers, thumbs, wrists, elbows, shoulders, knees, feet, and ankles. It is caused by inflammation of the tissue called synovium that surrounds the joints, and is known to affect approximately 1-2% of the general population (Alamanosa and Drosos, Autoimmun. Rev., 4:130-136 (2005)). The development of RA is thought to be influenced by genetic and environmental factors, with genetic factors contributing approximately 60%. Furthermore, unlike other arthritic conditions that only affect the areas within or around the joints, RA is a systemic disease that can cause inflammation in extra-articular tissues throughout the body, including the skin, blood vessels, heart, lungs, and muscles. Gout is a disease that results from the deposition of monosodium urate crystals in synovial fluid and other tissues, and the formation of uric acid stones in the kidneys. Gout typically occurs during middle age and is uncommon before age 30. Women rarely experience gouty arthritis attacks before menopause.
활막 (활액 또는 활액막)(synovium)은 관절연골에 가장 근접해 있는 조직으로서 활막 연골종증 및 골연골 스퍼스와 같은 악성 상태에서 유리연골을 생성할 수 있는 유일한 조직이며, 연골손상 복구를 위하여 활막으로부터 세포들이 리크루팅된다는 보고가 있었다.Synovium (synovium or synovial membrane) is the tissue closest to articular cartilage and is the only tissue that can produce hyaline cartilage in malignant conditions such as synovial chondromatosis and osteochondral spurs, and it has been reported that cells are recruited from the synovium to repair cartilage damage.
한편, 특정 부위를 표적화하는 방법에 대한 연구는 여러 질병의 정밀 치료 및 정밀 진단과 같은 의료 기술 개발과 함께 지속적으로 관심 받아온 분야이다. 특정 부위의 표적화하는 방법으로는 유전자 및 폴리에틸렌글리콜, 펩타이드 등과 같은 특정 물질을 이용하여 연구 개발되어지고 있다. 그 중에서 펩타이드를 이용한 표적화 방법은 낮은 면역원성, 저비용, 장기 보관 및 쉬운 취급과 같은 장점을 가지고 있어서 많은 각광을 받아온 분야이다 (Accardo, A., Tesauro, D., & Morelli, G. Polymer journal, 2013, 45(5), 481-493.).Meanwhile, research on methods for targeting specific sites has been a field of continuous interest, alongside the development of medical technologies such as precision treatment and diagnosis of various diseases. Methods for targeting specific sites are being researched and developed using specific substances such as genes, polyethylene glycol, and peptides. Among these, peptide-based targeting methods have received significant attention due to their advantages such as low immunogenicity, low cost, long-term storage, and easy handling (Accardo, A., Tesauro, D., & Morelli, G. Polymer journal, 2013, 45(5), 481-493).
활막 부위내에 약제학적으로 활성인 유효성분을 보유함으로써 약물이 장기간에 걸쳐 전달되도록 하는, 포유동물내 관절에 약제학적으로 활성인 유효성분을 전달하는 것이 당해 기술에서 여전히 요구되고 있다.There is still a need in the art to deliver pharmaceutically active ingredients to joints in mammals, such that the pharmaceutically active ingredients are retained within the synovial region, thereby enabling long-term drug delivery.
본 발명의 목적은 활막을 표적화하는 물질을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a material that targets the synovial membrane.
또한, 본 발명의 목적은 활막 표적화 약물 전달체를 제공하는 것이다.In addition, it is an object of the present invention to provide a synovial membrane-targeting drug delivery system.
또한, 본 발명의 목적은 관절염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.In addition, it is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis disease.
아울러, 본 발명의 목적은 활막 조영제 조성물을 제공하는 것이다.In addition, an object of the present invention is to provide a synovial contrast agent composition.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 활막을 표적화하는 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.To achieve the above purpose, the present invention provides a compound targeting the synovial membrane, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
또한, 본 발명은 상기 물질에 약제학적 활성 성분이 접합된, 활막 표적화 약물 전달체를 제공한다.In addition, the present invention provides a synovial membrane-targeting drug delivery system in which a pharmaceutically active ingredient is conjugated to the above material.
또한, 본 발명은 상기 약물 전달체를 포함하는 관절염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritic disease, comprising the drug delivery system.
아울러, 본 발명은 활막 조영제 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a synovial contrast agent composition.
본 발명에 따라 제조된 화합물은in vitro 및in vivo에서 독성을 나타내지 않고, 생물학적 환경에서 안정적이었으며, 활막 세포 및 생체 내 활막 부위를 특이적으로 표적화할 수 있으므로, 이를 약물 개발 및 의료 분야에 이용할 수 있으며, 활막 관련 질환의 진단 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다.The compound manufactured according to the present invention does not exhibit toxicityin vitro andin vivo , is stable in a biological environment, and can specifically target synovial cells and synovial areas in vivo, and therefore can be utilized in drug development and medical fields, and can be usefully utilized in the diagnosis and treatment of synovial-related diseases.
도 1은 다양한 용매 조건 (증류수, 생리 식염수 및 세포 배양액)에서 본 발명의 DRL-TAM의 흡광 및 형광 방출 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 다양한 pH 조건 (pH 3, 5, 7 및 9)에서 본 발명의 DRL-TAM의 흡광 및 형광 방출 특성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 DRL-TAM의 광안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 3 종류의 세포에서 1 내지 100 μM 농도의 DRL-TAM의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다:
b.End3: 마우스 뇌조직 유래 내피 세포;
HEK293: 인간 배아 신장 유래 상피 세포; 및
RSPC; 마우스 활막 유래 일차 세포.
도 5는 본 발명의 DRL-TAM (1 내지 100 μM)의 용혈 반응을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 DRL-TAM의in vitro 활막 표적화 효과 및 시각과 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다:
b.End3: 마우스 뇌조직 유래 내피 세포;
HEK293: 인간 배아 신장 유래 상피 세포;
RSPC; 마우스 활막 유래 일차 세포;
a: 공초점 현미경 이미지;
b: DRL-TAM의 형광 세기; 및
c: CellMask Green 세포막 염색(CellMask Green plasma membrane stain)과 동일한 위치에서의 DRL-TAM의 형광 세기.
도 7은 DRL-TAM의 생체 내에서의 분포 과정을 확인한 이미지를 나타낸 도이다.
도 8은 DRL-TAM의 신체 장기 및 부위에서의 분포 과정을 확인한 이미지 및 그래프를 나타낸 도이다.
도 9는 활막을 특이적으로 시각화시킬 수 있는 본 발명의 DRL-TAM의 화학식을 나타낸 도이다.Figure 1 is a diagram showing the results of confirming the absorption and fluorescence emission characteristics of the DRL-TAM of the present invention under various solvent conditions (distilled water, saline solution, and cell culture medium).
Figure 2 is a diagram showing the results of confirming the absorption and fluorescence emission characteristics of the DRL-TAM of the present invention under various pH conditions (pH 3, 5, 7, and 9).
Figure 3 is a diagram showing the results of confirming the photostability of the DRL-TAM of the present invention.
Figure 4 is a diagram showing the results of confirming the cytotoxicity of DRL-TAM at concentrations of 1 to 100 μM in three types of cells:
b.End3: mouse brain tissue-derived endothelial cells;
HEK293: human embryonic kidney-derived epithelial cells; and
RSPC; mouse synovial-derived primary cells.
Figure 5 is a diagram showing the results of analyzing the hemolytic reaction of DRL-TAM (1 to 100 μM) of the present invention.
Figure 6 is a diagram showing the results of confirming thein vitro synovial membrane targeting effect and visual effect of the DRL-TAM of the present invention:
b.End3: mouse brain tissue-derived endothelial cells;
HEK293: human embryonic kidney-derived epithelial cells;
RSPC; mouse synovial-derived primary cells;
a: Confocal microscopy image;
b: Fluorescence intensity of DRL-TAM; and
c: Fluorescence intensity of DRL-TAM at the same location as CellMask Green plasma membrane stain.
Figure 7 is a diagram showing an image confirming the distribution process of DRL-TAM in vivo.
Figure 8 is a diagram showing images and graphs confirming the distribution process of DRL-TAM in body organs and parts.
Figure 9 is a diagram showing the chemical formula of DRL-TAM of the present invention, which can specifically visualize the synovial membrane.
이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.Hereinafter, the present invention will be described in detail using exemplary embodiments. However, the following exemplary embodiments are provided as illustrative examples of the present invention and are not intended to limit the present invention. The present invention is capable of various modifications and applications within the scope of the following claims and equivalents construed therefrom.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice of testing the present invention, the preferred materials and methods are described herein.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:Throughout this specification, the conventional one-letter and three-letter codes for naturally occurring amino acids are used, as well as generally accepted three-letter codes for other amino acids, such as Aib (α-aminoisobutyric acid) and Sar (N-methylglycine). Furthermore, amino acids referred to herein by abbreviations are described according to the IUPAC-IUB nomenclature as follows:
알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V.Alanine: A, arginine: R, asparagine: N, aspartic acid: D, cysteine: C, glutamic acid: E, glutamine: Q, glycine: G, histidine: H, isoleucine: I, leucine: L, lysine: K, methionine: M, phenylalanine: F, proline: P, serine: S, threonine: T, tryptophan: W, tyrosine: Y, and valine: V.
일 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:In one aspect, the present invention relates to a compound represented by the following chemical formula 1, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
[화학식 1][Chemical Formula 1]
..
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 활막 표적화용일 수 있다.In one embodiment, the compound of the present invention, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be used for synovial targeting.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 다양한 용매 조건 및 pH 조건, 및 빛 조사 조건에서 안정성이 높으며, 상기와 같은 다양한 조건에서도 농도에 비례하여 효능을 안정적으로 나타낼 수 있다.In one embodiment, the compound of the present invention, its hydrate, its solvate, or its pharmaceutically acceptable salt has high stability under various solvent conditions, pH conditions, and light irradiation conditions, and can stably exhibit efficacy in proportion to the concentration even under such various conditions.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 세포 독성이 없고 생체 내에서 용혈 반응을 나타내지 않아 안전할 수 있다.In one embodiment, the compound of the present invention, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be safe as it is non-cytotoxic and does not exhibit a hemolytic reaction in vivo.
일 구현예에서, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디아이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.In one embodiment, the compound represented by Chemical Formula 1 of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as a salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. The acid addition salt is obtained from inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid, and non-toxic organic acids such as aliphatic mono- and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxyalkanoates and alkanedioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids. These pharmaceutically non-toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, iodide, fluoride, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suberate, sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, hydroxybenzoate, methoxybenzoate, Contains phthalate, terephthalate, benzenesulfonate, toluenesulfonate, chlorobenzenesulfonate, xylenesulfonate, phenylacetate, phenylpropionate, phenylbutyrate, citrate, lactate, hydroxybutyrate, glycolate, malate, tartrate, methanesulfonate, propanesulfonate, naphthalene-1-sulfonate, naphthalene-2-sulfonate or mandelate.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다. 또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로는 나트륨, 칼륜 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.The acid addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method, for example, by dissolving the compound in an excess of an aqueous acid solution and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Alternatively, the salt can be prepared by evaporating the solvent or excess acid from the mixture and drying it, or by suction filtration of the precipitated salt. In addition, a pharmaceutically acceptable metal salt can be prepared using a base. An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained, for example, by dissolving the compound in an excess of an alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and evaporating and drying the filtrate. In this case, it is pharmaceutically suitable to prepare a sodium, potassium or calcium salt as the metal salt. In addition, the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (e.g., silver nitrate).
일 구현예에서, 본 발명의 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 표지 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 표지 물질은 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발색 물질, 발광 물질, 형광 물질(fluorescer), 상자성 입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.In one embodiment, the compound of the present invention, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof may further comprise a labeling substance, and the labeling substance may be at least one selected from the group consisting of a chromogenic enzyme, a radioisotope, a chromophore, a chromogenic substance, a luminescent substance, a fluorescent substance, a superparamagnetic particle, and an ultrasuper paramagnetic particle.
일 구현예에서, 발색효소는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 결합된 홀스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase; AP), β-갈락토시다아제(galactosidase), 루시페라아제(luciferase), 아세틸콜린스테라제, 유레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 아스파르기나아제(asparginase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 말레이트 데하이드로지나아제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phosphate isomerase), 글루코오스산화효소, 사이토크롬 P450 및 퍼옥시다아제 화합물일 수 있다.In one embodiment, the chromogenic enzyme can be a streptavidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), β-galactosidase, luciferase, acetylcholinesterase, urease, catalase, asparginase, ribonuclease, malate dehydrogenase, staphylococcal nuclease, triose phosphate isomerase, glucose oxidase, cytochrome P450, and peroxidase compound.
일 구현예에서, 형광 물질은 형광 단백질(fluorescent protein), 발광 단백질(photoprotein), 루시퍼라제(luciferase), 형광염료(fluorescent dye) 또는 시분해 형광입자 (Time-resolved Fluorescence, TRF)일 수 있으며, 형광 물질은 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(5(6)-Carboxytetramethylrhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 더욱 바람직하고, TAMRA인 것이 가장 바람직하다.In one embodiment, the fluorescent material may be a fluorescent protein, a photoprotein, luciferase, a fluorescent dye or a time-resolved fluorescence (TRF), and the fluorescent material may be Alexa Fluor 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, Ruby (tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)), FITC (fluoresein isothiocyanate), rhodamine 6G, rhodamine B, TAMRA (5(6)-Carboxytetramethylrhodamine), Texas Red, It is more preferable that it is at least one selected from the group consisting of DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) and coumarin, and it is most preferable that it is TAMRA.
일 구현예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 활막 표적화 조성물로 사용될 수 있으며, 표적화 조성물은 용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 표적화 조성물은 용매, 버퍼 용액 또는 이들의 혼합물에 전술한 화합물을 첨가하고, 여기에 산 또는 염기를 첨가하여 준비될 수 있다. 또한 상기 표적화 조성물은 당해 기술분야에서 사용할 수 있는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 조성물이 포함하는 용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액의 함량은 요구되는 성능에 따라 적절히 조절될 수 있다. 상기 용매는 물, 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 메탄올, 에탄올, HI 수용액, N,N-디메틸포름아미드 (N, N-dimethylformamide, DMF), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또는 상기 조성물은 다른 약물 및 화학 분자와의 조합을 포함할 수 있다. 해당 약물은 특정 부위에 효능을 가지는 약물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 약물, 조영제 영양제, 형광체 등 화학 시료로 사용할 수 있는 것이라면 모두 가능하다.In one embodiment, the compound represented by the above formula 1, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used as a synovial targeting composition, and the targeting composition can further include one or more selected from a solvent, an acid, a base, and a buffer solution. The targeting composition can be prepared by adding the above-mentioned compound to a solvent, a buffer solution, or a mixture thereof, and adding an acid or a base thereto. In addition, the targeting composition can additionally include other additives that can be used in the art. The contents of the solvent, acid, base, and buffer solution included in the composition can be appropriately adjusted depending on the required performance. The solvent can include water, tetrahydrofuran (THF), methanol, ethanol, HI aqueous solution, N,N-dimethylformamide (DMF), or a combination thereof. Alternatively, the composition can include a combination with other drugs and chemical molecules. The drug may include, but is not limited to, a drug having an effect on a specific area, and may include any chemical sample that can be used in the relevant technical field, such as a drug, contrast medium, nutritional supplement, or fluorescent substance.
일 구현예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 관절염 질환의 진단용 조성물로 사용될 수 있다.In one embodiment, the compound represented by the above chemical formula 1, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used as a composition for diagnosing arthritis disease.
본 발명의 일 실시예에서, 신체 내 특정 부분을 특이적으로 표적화할 수 있는 새로운 펩타이드를 개발하였으며 (실시예 1 참조), 이 신규 펩타이드는 DRL은in vitro 및in vivo에서 독성을 나타내지 않았으며, 생물학적 조성인 수용액(pH 7.4)과 세포 배양액에서 안정적으로 사용 가능하고, 약물 동태학적으로 마우스의 체내에서 짧은 시간 안에 분포되었으며 (10분 내지 20분), 특이적으로 활막 세포 또는 생체 내 활막 부위 (활막이 많이 존재하는 흉골, 척수, 다리뼈, 발 등)를 표적화할 수 있어, 세포 단위와 생체 단위 모두에서 작용 가능할 수 있음을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, a novel peptide capable of specifically targeting a specific part in the body was developed (see Example 1), and this novel peptide DRL did not exhibit toxicityin vitro andin vivo , could be stably used in a biological composition, an aqueous solution (pH 7.4) and a cell culture medium, was pharmacodynamically distributed in the body of a mouse within a short period of time (10 to 20 minutes), and could specifically target synovial cells or synovial parts in vivo (such as the sternum, spinal cord, leg bones, and feet where synovium is abundant), and thus it was confirmed that it could act at both the cellular level and the biological level.
본 발명에서 용어, "표적화"는 특정 세포 또는 생체 내 부위를 표적화하는 능력을 말하며, 물질의 체내 분포 시 특이적으로 해당 부분으로 전달되는 특성을 의미한다. 표적화 특성은 특정 생체 부분에 한하여 나타나는 특성으로 해당 부분을 제외한 나머지 부분과 비교하여 유의적으로 많은 양이 전달되는 특성을 의미할 수 있다.As used herein, the term "targeting" refers to the ability to target a specific cell or site within a living organism, and refers to the property of a substance being specifically delivered to that site when distributed within the body. Targeting is a property that appears only within a specific biological site, and can refer to the property of delivering a significantly greater amount of a substance to other sites.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화학식 1의 화합물 (DRL 펩타이드)을 암호화하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a nucleic acid encoding a compound of formula 1 of the present invention (DRL peptide), a vector comprising the nucleic acid, or a host cell comprising the vector.
일 구현예에서, 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 박테리아인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.) 박테리아인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 예를 들어, 상기 벡터는 "플라스미드"이며, 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 것으로서, 여기에 예컨대, 표준 분자 클로닝 기법에 의해 추가적인 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다.In one embodiment, the vector includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, a viral vector, and the like. Suitable vectors include, in addition to expression control elements such as a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and an enhancer, a signal sequence or a leader sequence for membrane targeting or secretion, and can be manufactured in various ways depending on the purpose. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. The signal sequence may include, but is not limited to, a PhoA signal sequence, an OmpA signal sequence, etc. when the host is an Escherichia sp. bacterium; an α-amylase signal sequence, a subtilisin signal sequence, etc. when the host is a Bacillus sp. bacterium; an MFα signal sequence, a SUC2 signal sequence, etc. when the host is a yeast; and an insulin signal sequence, an α-interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, etc. when the host is an animal cell. Additionally, the vector may include a selection marker for selecting host cells containing the vector, and, if replicable, an origin of replication. For example, the vector may be a "plasmid," which refers to a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be inserted, for example, using standard molecular cloning techniques.
상기 벡터는 각각 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.The above vectors can be delivered in vivo or into cells via electroporation, lipofection, viral vectors, nanoparticles, and PTD (Protein translocation domain) fusion protein methods, respectively.
본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).As used herein, the term "vector" refers to a carrier into which a nucleic acid sequence can be inserted for introduction into a cell capable of replicating the nucleic acid sequence. The nucleic acid sequence may be exogenous or heterologous. Vectors include, but are not limited to, plasmids, cosmids, and viruses (e.g., bacteriophages). Those skilled in the art can construct vectors by standard recombinant techniques (see, e.g., Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; and Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc., NY, 1994).
일 구현예에서, 상기 벡터의 제작 시, 상기 화학식 1의 화합물 (DRL 펩타이드)을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.In one embodiment, when producing the vector, expression control sequences such as a promoter, terminator, enhancer, etc., sequences for membrane targeting or secretion, etc. may be appropriately selected and combined in various ways according to the purpose, depending on the type of host cell to be produced to produce the compound of the chemical formula 1 (DRL peptide).
일 구현예에서, 숙주세포는 에스케리치아 속(Escehreichia sp.), 살모넬라 속(Salmonellae sp.), 예르시니아 속(Yersinia sp.), 쉬겔라 속(Shigella sp.), 엔테로박터 속(Enterobactersp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 속(Proteus sp.) 또는 클레브시엘라 속(Klebsiella sp.)의 박테리아일 수 있으며, 에스케리치아 속의Escherichia coli인 것이 융합 단백질의 대량 생산에 더욱 바람직하다.In one embodiment, the host cell can be a bacterium of the genusEscherichia sp.,Salmonellae sp., Yersinia sp.,Shigella sp.,Enterobacter sp.,Pseudomonas sp.,Proteus sp. orKlebsiella sp., withEscherichiacoli of the genus Escherichia being more preferred for mass production of the fusion protein.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화학식 1의 화합물 (DRL 펩타이드), 이의 유사체 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 이를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a fusion protein comprising a compound of formula 1 of the present invention (DRL peptide), an analog thereof, or a variant thereof, or a nucleic acid encoding the same.
본 발명에서 사용되는 용어 "융합단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 통상적으로 유연한 구조를 갖는 링커 펩타이드(linker peptide)가 삽입될 수 있다.The term "fusion protein" as used in the present invention refers to a recombinant protein in which two or more proteins or domains responsible for specific functions within a protein are linked so that each protein or domain performs its original function. A linker peptide, typically having a flexible structure, may be inserted between the two or more proteins or domains.
본 발명에서 사용된 용어 "펩타이드"는 아미노산 중합체로서, 천연 아미노산 뿐 아니라, 비단백질성 아미노산도 구성요소로 포함할 수 있다.The term "peptide" used in the present invention refers to an amino acid polymer, which may include not only natural amino acids but also non-protein amino acids as components.
본 발명에서 사용된, 용어 "변이체"는 기준 물질과 비교하였을 때 최소한 한개의 아미노산 차이(치환, 삽입 또는 결손)를 포함하는 대응하는 아미노산 서열을 말한다. 특정 구체예들에 있어서 "변이체"는 기준 서열과 비교하였을 때 높은 아미노산 서열 상동성(homology) 및/또는 보존적 아미노산 치환, 결손 및/또는 삽입을 가진다.As used herein, the term "variant" refers to a corresponding amino acid sequence that contains at least one amino acid difference (substitution, insertion, or deletion) compared to a reference sequence. In certain embodiments, a "variant" has high amino acid sequence homology and/or conservative amino acid substitutions, deletions, and/or insertions compared to a reference sequence.
본 발명에서 사용된, 용어 "유사체"는 아미노산의 측쇄 또는 알파-아미노산 백본에 대하여 하나 이상의 다른 기능기로 치환된 유사체를 포함할 수 있다. 측쇄 또는 백본 개질화 펩타이드 유사체의 예로는 피롤리딘 고리가 하이드록시기로 치환된 하이드록시프롤린이나, N-메틸 글리신 "펩토이드"를 들 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 단백질 유사체의 종류에 대해서는 당업계에 공지되어 있다.As used herein, the term "analog" may include analogs in which the side chain or alpha-amino acid backbone of an amino acid is substituted with one or more other functional groups. Examples of side chain or backbone-modified peptide analogs include, but are not limited to, hydroxyproline, in which the pyrrolidine ring is substituted with a hydroxy group, or N-methyl glycine "peptoids." The types of protein analogs are well known in the art.
본 발명에 따른 펩타이드 변이체는 특정 아미노산 잔기 위치에서 아미노산 잔기가 보존적으로 치환된 변이체도 포함하는 의미로 해석된다.The peptide variant according to the present invention is interpreted to also include a variant in which an amino acid residue is conservatively substituted at a specific amino acid residue position.
본 발명에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 펩타이드 변이체의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 변이체의 변형을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.As used herein, "conservative substitution" refers to a modification of a variant that involves replacing one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties without causing a loss of the biological or biochemical function of the peptide variant. A "conservative amino acid substitution" is a substitution that replaces an amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Classes of amino acid residues having similar side chains are well known and defined in the art. These classes include amino acids with basic side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), amino acids with uncharged polar side chains (e.g., glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), amino acids with beta-branched side chains (e.g., threonine, valine, isoleucine), and amino acids with aromatic side chains (e.g., tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합단백질은 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 화학식 1의 DRL 펩타이드는 아스파틱산 및 아르기닌, 류신을 순차적으로 반응시켜 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합단백질은, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:The peptide according to the present invention or a fusion protein comprising the same can be prepared by standard synthetic methods, recombinant expression systems, or any other method known in the art. For example, the DRL peptide of Chemical Formula 1 of the present invention can be prepared by sequentially reacting aspartic acid, arginine, and leucine. The peptide according to the present invention or a fusion protein comprising the same can be synthesized by a number of methods, including, for example, the following methods:
(a) 단백질을 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 단백질 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는(a) a method of synthesizing a protein stepwise or by fragment assembly by means of solid-phase or liquid-phase methods, and isolating and purifying the final protein product; or
(b) 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는(b) a method of expressing a nucleic acid construct encoding a protein in a host cell and recovering the expression product from the host cell culture; or
(c) 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는(c) a method for performing cell-free in vitro expression of a nucleic acid construct encoding a protein and recovering the expression product; or
(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 단백질 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 단백질을 수득하고, 당해 단백질을 회수하는 방법.A method for obtaining protein fragments by any combination of (a), (b) and (c), then linking the fragments to obtain a protein, and recovering the protein.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a nucleic acid encoding a peptide of the present invention or a fusion protein comprising the same, or a plasmid vector comprising the nucleic acid.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 약제학적 활성 성분이 접합(conjugate)된, 활막 표적화 약물 전달체에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a synovial membrane-targeting drug delivery system in which a pharmaceutically active ingredient is conjugated to a compound of the present invention, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
일 구현예에서, 약제학적 활성 성분은 RNA, DNA, 항체, 이펙터, 약물, 전구약물, 독소, 펩타이드 또는 전달 분자일 수 있다.In one embodiment, the pharmaceutically active ingredient can be RNA, DNA, an antibody, an effector, a drug, a prodrug, a toxin, a peptide, or a delivery molecule.
일 구현예에서, 약물은 펩타이드 약물, 단백질 약물, 탈감작화제, 항원, 비-스테로이드성 소염제, 소염 약물, 마취제, 항산화제, 항감염제, 화학치료제, 항-통각반응제, DMOAD, 동화작용제, 항-이화작용제, 자가소화작용 조절제, 항-파골세포-매개된 골 손실제, 기능식품제(nutraceutical agent), 진통제, 생물제제(biologics) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.In one embodiment, the drug can be a peptide drug, a protein drug, a desensitizer, an antigen, a non-steroidal anti-inflammatory drug, an anti-inflammatory drug, an anesthetic, an antioxidant, an anti-infective agent, a chemotherapeutic agent, an anti-nociceptive agent, a DMOAD, an anabolic agent, an anti-catabolic agent, an autophagy modulator, an anti-osteoclast-mediated bone loss agent, a nutraceutical agent, an analgesic, a biologic, or a mixture thereof.
일 구현예에서, 상기 비-스테로이드성 소염제는 에토페나메이트, 셀레콕시브, 아프리콕시브, 로페콕시브, 나부메톤, 베노릴레이트, 에토리콕시브, 암피록시캄, 아미노페마존, 발데콕시브, 아세토미노펜, 부펙사막, 니메술리드, 파레콕시브, 메페남산, 덱시부프로펜, 이부프로펜, 플루르비프로펜, 아스피린, 덱스데토프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 피로콕시브, 플루르비프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토록락, 로르녹시캄, 록소프로펜, 록소막, 루미라콕시브, 메클로페남산, 멜록시캄, 나프록센, 나프로신, 니말록스, 옥사포로진, 피록시캄, 살살레이트, 술린닥, 테녹시캄, 톨페남산, 로피비카인 또는 이의 혼합물일 수 있다.In one embodiment, the non-steroidal anti-inflammatory agent is etofenamate, celecoxib, apricoxib, rofecoxib, nabumetone, benorylate, etoricoxib, ampiroxicam, aminopemazone, valdecoxib, acetominophen, bupexamac, nimesulide, parecoxib, mefenamic acid, dexibuprofen, ibuprofen, flurbiprofen, aspirin, dexdetoprofen, diclofenac, diflunisal, etodolac, fenoprofen, pirocoxib, flurbiprofen, indomethacin, ketoprofen, ketorolac, lornoxicam, loxoprofen, loxomac, lumiracoxib, meclofenamic acid, meloxicam, naproxen, naprosyn, nimalox, oxaporozin, piroxicam, It may be salsalate, sulindac, tenoxicam, tolfenamic acid, ropivicaine or a mixture thereof.
일 구현예에서, 화학식 1의 DRL 펩타이드와 약제학적 활성 성분은 링커를 매개로 연결/결합될 수 있으며, 링커는 펩타이드나 리간드, 항체, 항체 단편 등의 단백질의 아민기(amine group), 카르복시기(carboxyl group) 또는 설프히드릴기(sulfhydryl group)나 압타머 등의 핵산의 인산기(phosphate group, 히드록시기(hydroxyl group)를 통해 결합할 수 있는 작용기를 가진 임의의 링커를 사용할 수 있다.In one embodiment, the DRL peptide of Chemical Formula 1 and the pharmaceutically active ingredient may be linked/combined via a linker, and the linker may be any linker having a functional group capable of binding via an amine group, carboxyl group, or sulfhydryl group of a protein such as a peptide, ligand, antibody, or antibody fragment, or a phosphate group or hydroxyl group of a nucleic acid such as an aptamer.
일 구현예에서, 상기 링커는 약물에 따라 적절한 것을 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대 약물에, 알데하이드 반응기를 가지는 링커를 연결하고 화학식 1의 DRL 펩타이드의 N 말단의 아미노기에 결합시킬 수 있다.In one embodiment, the linker may be selected and used appropriately depending on the drug. For example, a linker having an aldehyde reactive group may be connected to the drug and bonded to the amino group at the N-terminus of the DRL peptide of Chemical Formula 1.
이러한 링커의 작용기는 아이소티오시아네이트(isothiocyanate), 아이소시아네이트(isocyanates), 아실 아자이드(acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride), 알데하이드(aldehyde), 글리옥살(glyoxal), 에폭사이드(epoxide), 옥시레인(oxirane), 칼보네이트(carbonate), 아릴 할라이드(arylhalide), 이미도에스터(imidoester), 카보이미드(carbodiimide), 안하이드라이드(anhydride), 플루오로페닐 에스터(fluorophenyl ester), 히드록시메틸포스핀(hydroxymethyl phosphine), 말레이미드(maleimide), 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜디설파이드(pyridyldisulfide), 티오술포네이트(thiosulfonate), 또는 비닐술폰(vinylsulfone) 등일 수 있다. 링커는 프로테아제에 의해서 절단 가능하거나, 산이나 염기 조건에서 절단 가능하거나, 고온이나 광조사에 의해서 절단 가능하거나 또는 환원 또는 산화 조건에서 절단 가능한 링커일 수 있고, 또는 이러한 조건들에서 절단 가능하지 않은 링커일 수도 있다. 절단 가능한 링커로서는 예컨대 산성 조건에서 절단되는 히드라존(hydrazone) 링커, 프로테아제에 의해 절단되는 펩타이드 링커, 환원 조건에서 절단되는 디설파이드(disulfide) 작용기를 갖는 링커 등을 들 수 있고, 절단 가능하지 않은 링커로서는 MCC(Maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate) 링커, MC(maleimidocaproyl) 링커, 또는 그 유도체로서 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sMCC) 링커나 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(sulfo-sMCC)를 들 수 있다. 또한 링커는 자가 희생 링커(self-immolative linker) 또는 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커(traceless linker)일 수 있다. 자가 희생 링커는 예컨대 발명의 명칭이 "Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof "인 미국 특허 제9,089,614호에 개시된 링커, 명칭이 "SELF-IMMOLATIVE LINKERS CONTAINING MANDELIC ACID DERIVATIVES, DRUG-LIGAND CONJUGATES FOR TARGETED THERAPIES AND USES THEREOF"인 국제공개 제WO2015038426호에 개시된 링커를 들 수 있으며, 절단 후 흔적을 남기지 않는 링커로서는 페닐하이드라지드 링커, 아릴-트리아젠 링커, 문헌[Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem Rev. 102: 2607-2024 (2002)]에 개시된 링커 등일 수 있다.The functional group of such linkers may be isothiocyanate, isocyanate, acyl azide, NHS ester, sulfonyl chloride, aldehyde, glyoxal, epoxide, oxirane, carbonate, arylhalide, imidoester, carbodiimide, anhydride, fluorophenyl ester, hydroxymethyl phosphine, maleimide, haloacetyl, pyridyldisulfide, thiosulfonate, or vinylsulfone. The linker may be a linker that is cleavable by a protease, a linker that is cleavable under acidic or basic conditions, a linker that is cleavable by high temperature or light irradiation, a linker that is cleavable under reducing or oxidizing conditions, or a linker that is not cleavable under these conditions. Cleavable linkers include, for example, a hydrazone linker that is cleavable under acidic conditions, a peptide linker that is cleavable by a protease, and a linker having a disulfide functional group that is cleavable under reducing conditions. Non-cleavable linkers include a maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate (MCC) linker, a maleimidocaproyl (MC) linker, or a derivative thereof, such as a succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sMCC) linker or a sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-sMCC). Additionally, the linker may be a self-immolative linker or a traceless linker. Self-immolative linkers include, for example, the linkers disclosed in U.S. Pat. No. 9,089,614 entitled "Hydrophilic self-immolative linkers and conjugates thereof," and the linkers disclosed in International Publication No. WO2015038426 entitled "SELF-IMMOLATIVE LINKERS CONTAINING MANDELIC ACID DERIVATIVES, DRUG-LIGAND CONJUGATES FOR TARGETED THERAPIES AND USES THEREOF," and traceless linkers include, for example, phenylhydrazide linkers, aryl-triazene linkers, and linkers disclosed in Blaney, et al., "Traceless solid-phase organic synthesis," Chem Rev. 102: 2607-2024 (2002)] may be a linker, etc.
통상의 기술분야에서는 상기 예시한 바의 링커 이외에도 본 발명에 적용 가능한 수많은 링커가 상당한 수의 문헌을 통해 공지되어 있다. 그러한 문헌으로서 구체적으로 문헌[Castaneda, et al, "Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibodydrug conjugation," Chem Commun. 49: 8187-8189 (2013)], 문헌[Lyon, et al, "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)], 문헌[Dawson, et al "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779], 문헌[Dawson, et al "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J Am Chem Soc. 1997, 119, 4325-4329] 문헌[Hackeng, et al "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology," Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 10068-10073], 문헌[Wu, et al "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew Chem Int Ed 2006, 45, 4116-4125], 문헌[Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R Liss, Inc, 1988, pp 199-218], 문헌[Fields, G and Noble, R (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int J Peptide Protein Res 35:161-214] 등이나, 미국 특허 제6,884,869호, 미국 특허 제7,498,298호, 미국 특허 제8,288,352호, 미국 특허 제8,609,105호, 미국 특허 제8,697,688호, 미국 특허공개 제2014/0127239호, 미국 특허공개 제2013/028919호, 미국 특허공개 제2014/286970호, 미국 특허공개 제2013/0309256호, 미국 특허공개 제2015/037360호, 미국 특허공개 제2014/0294851호, 국제 특허공개 WO2015057699, 국제 특허공개 WO2014080251, 국제 특허공개 제WO2014197854, 국제 특허공개 WO2014145090, 국제 특허공개 WO2014177042 등을 참조할 수 있다.In addition to the linkers exemplified above, numerous linkers applicable to the present invention are known in the art through a considerable number of references. Specifically, such references include [Castaneda, et al., "Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibody-drug conjugation," Chem Commun. 49: 8187-8189 (2013)] and [Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat Biotechnol. 49: 8187-8189 (2013)]. 32(10):1059-1062 (2014), Dawson, et al "Synthesis of proteins by native chemical ligation," Science 1994, 266, 776-779, Dawson, et al "Modulation of Reactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives," J Am Chem Soc. 1997, 119, 4325-4329] Hackeng, et al "Protein synthesis by native chemical ligation: Expanded scope by using straightforward methodology," Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96, 10068-10073], Wu, et al "Building complex glycopeptides: Development of a cysteine-free native chemical ligation protocol," Angew Chem Int Ed 2006, 45, 4116-4125], Geiser et al "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R Liss, Inc, 1988, pp 199-218], Fields, G and Noble, R (1990) "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int J Peptide Protein Res 35:161-214], etc., U.S. Patent No. 6,884,869, U.S. Patent No. 7,498,298, U.S. Patent No. 8,288,352, U.S. Patent No. 8,609,105, U.S. Patent No. 8,697,688, U.S. Patent Publication No. 2014/0127239, U.S. Patent Publication No. 2013/028919, U.S. Patent Publication No. 2014/286970, U.S. Patent Publication No. 2013/0309256, U.S. Patent Publication No. 2015/037360, U.S. Patent Publication No. 2014/0294851, International Patent Publication No. WO2015057699, International Patent Publication No. WO2014080251, International Patent Publication No. Reference may be made to WO2014197854, International Patent Publication WO2014145090, International Patent Publication WO2014177042, etc.
본 발명의 약물 전달체의 DRL 펩타이드와 약제학적 활성 성분은 생체 적합성 고분자를 매개로 또는 캐리어로 하여 결합될 수도 있다. 생체적합성 고분자는 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성(tissue compatibility) 및 항응혈성(blood compatibility)을 가지고 있는 고분자를 의미한다. 상기 생체적합성 고분자로서의 합성 중합체는 폴리에스테르, 폴리하이드 록시알카노에이트(PHAs), 폴리(α-하이드록시액시드), 폴리(β-하이드록시액시드), 폴리(3-하이드로식부티레이트-co-발러레이트; PHBV), 폴리(3-하이드록시프로프리오네이트; PHP), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트; PHH), 폴리(4-하이드록시액시드), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(4-하이드록시발러레이트), 폴리(4-하이드록시헥사노에이트), 폴리(에스테르아마이드), 폴리카프로락톤, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리(락타이드-co-글리코라이드; PLGA), 폴리디옥사논, 폴리오르토에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리(글리콜산-co-트리메틸렌카보네이트), 폴리포스포에스테르, 폴리포스포에스테르 우레탄, 폴리(아미노산), 폴리사이아노아크릴레이트, 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(이미노카보네이트), 폴리(타이로신 카보네이트), 폴리카보네이트, 폴리(타이로신 아릴레이트), 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리포스파젠스, PHA-PEG, 에틸렌 비닐 알코올 코폴리머(EVOH), 폴리우레탄, 실리콘, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리이소부틸렌과 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 스틸렌-이소브틸렌-스틸렌 트리블록 공중합체, 아크릴 중합체 및 공중합체, 비닐 할라이드 중합체 및 공중합체, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 메틸에테르, 폴리비닐리덴 할라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리플루오로알켄, 폴리퍼플루오로알켄, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐 케톤, 폴리비닐 아로마틱스, 폴리스틸렌, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 아세테이트, 에틸렌-메틸 메타크릴레이트 공중합체, 아크릴로니트릴-스틸렌 공중합체, ABS 수지와 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체, 폴리아마이드, 알키드 수지, 폴리옥시메틸렌, 폴리이미드, 폴리에테르, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴산-co-말레산 또는 폴리아미노아민이며, 천연 중합체는 키토산, 덱스트란, 셀룰로오스, 헤파린, 히알루론산, 알기네이트, 이눌린, 녹말 또는 글리코겐이다.The DRL peptide and pharmaceutically active ingredient of the drug delivery system of the present invention may be combined via a biocompatible polymer or carrier. A biocompatible polymer refers to a polymer that has tissue compatibility and blood compatibility, which means that it does not cause tissue necrosis or blood coagulation upon contact with living tissue or blood. Synthetic polymers as the biocompatible polymers include polyesters, polyhydroxyalkanoates (PHAs), poly(α-hydroxyacid), poly(β-hydroxyacid), poly(3-hydroxybutyrate-co-valerate; PHBV), poly(3-hydroxyproprionate; PHP), poly(3-hydroxyhexanoate; PHH), poly(4-hydroxyacid), poly(4-hydroxybutyrate), poly(4-hydroxyvalerate), poly(4-hydroxyhexanoate), poly(esteramide), polycaprolactone, polylactide, polyglycolide, poly(lactide-co-glycolide; PLGA), polydioxanone, polyorthoester, polyanhydride, poly(glycolic acid-co-trimethylene carbonate), polyphosphoester, polyphosphoester urethane, poly(amino acid), Polycyanoacrylates, poly(trimethylene carbonate), poly(iminocarbonate), poly(tyrosine carbonate), polycarbonates, poly(tyrosine arylate), polyalkylene oxalates, polyphosphazenes, PHA-PEG, ethylene vinyl alcohol copolymers (EVOH), polyurethanes, silicones, polyesters, polyolefins, polyisobutylene and ethylene-alphaolefin copolymers, styrene-isobutylene-styrene triblock copolymers, acrylic polymers and copolymers, vinyl halide polymers and copolymers, polyvinyl chloride, polyvinyl ether, polyvinyl methyl ether, polyvinylidene halides, polyvinylidene fluoride, polyvinylidene chloride, polyfluoroalkenes, polyperfluoroalkenes, polyacrylonitrile, polyvinyl ketones, polyvinyl aromatics, polystyrene, polyvinyl esters, polyvinyl acetate, Ethylene-methyl methacrylate copolymer, acrylonitrile-styrene copolymer, ABS resin and ethylene-vinyl acetate copolymer, polyamide, alkyd resin, polyoxymethylene, polyimide, polyether, polyacrylate, polymethacrylate, polyacrylic acid-co-maleic acid or polyaminoamine, and natural polymers are chitosan, dextran, cellulose, heparin, hyaluronic acid, alginate, inulin, starch or glycogen.
본 발명의 활막 표적화 약물 전달체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형의 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.The synovial drug delivery system of the present invention can be prepared as a pharmaceutical composition in the form of an oral dosage form or a parenteral dosage form depending on the route of administration by a conventional method known in the art, including a pharmaceutically acceptable carrier. Here, "pharmaceutically acceptable carrier" refers to a carrier or diluent that does not stimulate a living organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound. In the composition formulated as a liquid solution, acceptable pharmaceutical carriers are sterile and biocompatible, and include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and a mixture of one or more of these components. If necessary, other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents can be added.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 활막 표적화 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 관절염 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis disease, comprising the synovial membrane-targeting drug delivery system of the present invention as an active ingredient.
일 구현예에서, 관절염 질환은 활막염, 류마티스 관절염 (RA), 청소년 류마티스 관절염, 골관절염 (OA), 통풍, 가통풍(pseudogout), 척추관절염 (SpA), 건선성 관절염, 강직성 척추염, 폐혈성 관절염, 관절염, 청소년 특발성 관절염, 둔상(blunt trauma), 관절 교체 또는 스틸(Still) 질환일 수 있다.In one embodiment, the arthritic disease can be synovitis, rheumatoid arthritis (RA), juvenile rheumatoid arthritis, osteoarthritis (OA), gout, pseudogout, spondyloarthritis (SpA), psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, septic arthritis, arthritis, juvenile idiopathic arthritis, blunt trauma, joint replacement, or Still's disease.
일 구현예에서, 상기 조성물은 표지 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우 관절염 질환을 진단과 동시에 치료할 수 있다.In one embodiment, the composition may further comprise a labeling agent, in which case the arthritic disease may be diagnosed and treated simultaneously.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 토르세미드 및/또는 크로몰린, 또는 이의 염 외에 공지된 관절염 질환 치료제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may additionally include a known treatment agent for arthritis disease in addition to torsemide and/or cromolyn, or a salt thereof, as an active ingredient, and may be used in combination with other known treatments for the treatment of these diseases.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 관절염 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 관절염 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.In the present invention, the term "prevention" means any action that inhibits or delays the occurrence, spread, and recurrence of an arthritis disease by administering a pharmaceutical composition according to the present invention, and "treatment" means any action that improves or beneficially changes the symptoms of an arthritis disease by administering a composition of the present invention. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to refer to materials presented by the Korean Medical Association, etc. to know the exact criteria for diseases to which the composition of the present invention is effective, and to determine the degree of improvement, enhancement, and treatment.
본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.The term "therapeutically effective amount" used in combination with the active ingredient in the present invention means an amount effective in preventing or treating the target disease, and the therapeutically effective amount of the composition of the present invention may vary depending on various factors, such as the administration method, target site, patient's condition, etc. Therefore, the dosage when used in humans should be determined as an appropriate amount by taking both safety and efficacy into consideration. It is also possible to estimate the amount used in humans from the effective amount determined through animal testing. Such considerations when determining the effective amount are described in, for example, Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; and E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 관절염 질환의 종류, 관절염 질환의 발병 원인, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount" as used herein means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and not causing side effects. The effective dosage level may be determined based on factors including the patient's health condition, type of arthritis, cause of arthritis, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, method of administration, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, combination or concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may include a carrier, diluent, excipient, or a combination of two or more thereof commonly used in biological preparations. The term "pharmaceutically acceptable" as used herein means that the composition exhibits a property of not being toxic to cells or humans exposed to the composition. The carrier is not particularly limited as long as it is suitable for delivering the composition in vivo, and for example, compounds described in Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc., saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components may be mixed and used. If necessary, other common additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate the composition into a main use form such as an aqueous solution, suspension, or emulsion, pills, capsules, granules, or tablets. Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using an appropriate method in the field or the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으며, 경구형 또는 주사 제형이 더욱 바람직하다.In one embodiment, the pharmaceutical composition may be in one or more dosage forms selected from the group consisting of oral dosage forms, topical preparations, suppositories, sterile injectable solutions and sprays, with oral or injectable dosage forms being more preferred.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 개체 또는 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.The term "administration" used in the present invention means providing a predetermined substance to an individual or patient by any appropriate method, and may be administered parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or locally in the form of an injection) or orally depending on the intended method, and the dosage range varies depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of the disease. Liquid preparations for oral administration of the composition of the present invention include suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, etc., and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, etc. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered by any device that allows the active substance to move to target cells. Preferred administration methods and formulations include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and drip injection. Injections can be manufactured using aqueous solvents such as saline solution and Ringer's solution, non-aqueous solvents such as vegetable oil, higher fatty acid ester (e.g., ethyl oleate, etc.), alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.), and pharmaceutical carriers such as stabilizers to prevent deterioration (e.g., ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, etc.), emulsifiers, buffers to adjust pH, and preservatives to inhibit microbial growth (e.g., phenylmercuric nitrate, thimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.).
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 상기 관절염 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.The term "subject" as used in the present invention refers to any animal, including humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits, or guinea pigs, that has developed or may develop the above-described arthritis disease, and by administering the pharmaceutical composition of the present invention to the subject, the above-described diseases can be effectively prevented or treated. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in combination with existing therapeutic agents.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable additive. At this time, the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, lactose, mannitol, maltose, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, carnauba wax, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, sucrose, dextrose, sorbitol, and talc. The pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in the composition in an amount of 0.1 to 90 parts by weight, but is not limited thereto.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 이의 수화물, 이의 용매화물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 본 발명의 활막 표적화 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 활막 조영제 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a synovial contrast agent composition comprising a compound of the present invention, a hydrate thereof, a solvate thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a synovial targeting drug delivery system of the present invention as an active ingredient.
일 구현예에서, 상기 조성물은 표지 물질을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the composition may further comprise a labeling agent.
일 구현예에서, 상기 조영제 조성물은 관절염 질환의 진단용으로 사용될 수 있다.In one embodiment, the contrast agent composition can be used for diagnosing arthritic diseases.
일 측면에서, 본 발명은 아스파틱산 및 아르기닌, 류신을 순차적으로 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법에 관한 것이다:In one aspect, the present invention relates to a method for preparing a compound represented by the following chemical formula 1, comprising the step of sequentially reacting aspartic acid, arginine, and leucine:
[화학식 1][Chemical Formula 1]
..
일 구현예에서, 상기 제조방법은 N,N-디메틸포름아미드에 아스파틱산과 아르기닌을 첨가하여 1차 반응시키는 단계; 및 N,N-디메틸포름아미드를 추가하여 류신을 2차 반응시켜 펩타이드를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다.In one embodiment, the manufacturing method may include a step of adding aspartic acid and arginine to N,N-dimethylformamide to cause a first reaction; and a step of adding N,N-dimethylformamide to cause a second reaction with leucine to form a peptide.
일 구현예에서, 상기 펩타이드를 형성시키는 단계 이후에 반응시킨 물질을 회수하여 건조 및 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the step of forming the peptide may further include a step of recovering the reacted material and drying and concentrating it.
일 구현예에서, 상기 건조 및 농축하는 단계 이후에 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment, the drying and concentrating step may further include a purification step using high performance liquid chromatography.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention is described in more detail through the following examples. However, the following examples are intended only to concretize the content of the present invention and are not intended to limit the present invention.
실시예 1. 표적화 기능을 가진 화합물의 합성 및 정제Example 1. Synthesis and purification of compounds with targeting function
활막(synovium) 표적능을 가지는 화합물을 개발하기 위해, N,N-디메틸포름아미드에 Fmoc로 아민기를 보호한 아스파틱산, 아르기닌 및 염 (HOBT, HBTU 및 DIPEA)을 2시간 동안 반응시켜 1차 반응물을 형성하고, 1차 반응으로 합성된 물질에 동일한 방법으로 류신을 첨가하여 2차 반응으로 화합물을 형성하였다. 형성된 화합물에서 Fmoc를 제거하기 위해 20 % 피페리딘(piperidine)을 N,N-디메틸포름아미드에서 10분간 반응시켜 활막을 표적화하는 화합물로서 DRL(D; aspartic acid, R; arginine, L; leucine)의 아미노산 서열 (서열번호 1)로 이루어진 화학식 1의 디알엘 트리펩타이드 (DRL tripeptide) (표 1)를 형성하였다. 본 발명의 화합물 (DRL 펩타이드)의 효능을 확인하기 위해, 상기 화합물 (DRL 펩타이드), 라이신이 접합된 탐라(5-Carboxytetramethylrhodamine, TAMRA) 및 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine)을 N,N-디메틸포름아미드에 넣고 하룻밤 동안 반응시켜 DRL 펩타이드에 표지 물질로서 탐라를 접합한 DRL-TAM (화학식 2)을 제조하였다. 형성된 물질을 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였다.To develop a compound having synovium targeting ability, aspartic acid, arginine and salts (HOBT, HBTU and DIPEA) whose amine groups were protected with Fmoc in N,N-dimethylformamide were reacted for 2 hours to form a first reactant, and leucine was added to the material synthesized in the first reaction in the same manner to form a second reaction compound. To remove Fmoc from the formed compound, 20% piperidine was reacted in N,N-dimethylformamide for 10 minutes to form a DRL tripeptide (Table 1) consisting of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of DRL (D; aspartic acid, R; arginine, L; leucine) as a compound targeting the synovium. In order to confirm the efficacy of the compound of the present invention (DRL peptide), the compound (DRL peptide), lysine-conjugated Tamra (5-Carboxytetramethylrhodamine, TAMRA), and diisopropylethylamine were added to N,N-dimethylformamide and reacted overnight to prepare DRL-TAM (chemical formula 2) in which Tamra was conjugated as a labeling substance to the DRL peptide. The formed material was separated and purified using high-performance liquid chromatography.
실시예 2. DRL 펩타이드의 안정성 확인Example 2. Confirmation of the stability of DRL peptide
본 발명의 화합물 (DRL 펩타이드)의 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 제조한 DRL-TAM이 다양한 용매 조건, 다양한 pH 조건에서 안정적으로 여러 조건에서 유지되는지를 흡광 및 형광 방출 그래프를 측정함으로써 형광 안정성을 확인하였다. 구체적으로, 세포 및 생체의 사용시 안정적인지 확인하기 위해, 증류수 (DI.H2O), 생리 식염수 (pH 7.4) 및 세포 배양액 (DMEM media)의 조건하에서 DRL-TAM (10μM)의 흡광 및 형광 방출을 확인하였다. 또한, 다양한 pH에서의 안정성을 확인하기 위해, pH 3, 5, 7, 9 조건하에서 DRL-TAM (10μM)의 흡광 및 형광 방출을 확인하였다. 아울러, 빛 조사에 따른 DRL-TAM (10 μM)의 광안정성을 확인하기 위해, 530 nm 파장의 빛(50 mW/cm2)을 60분 동안 조사하였고, 10분 간격으로 형광 세기를 확인하였다. 이 때, 흡광 스펙트럼(UV/Vis absorption spectra) 분석을 위해서는 UV/Vis 분광광도계(Agilent Technologies Cary 8454, USA)을 사용하였으며, 형광 스펙트럼(fluorescence spectra) 분석을 위해서는 형광 광도계(SHIMADZU CORP. RF-6000, Japan)을 사용하였고, 각 기기에 본 화합물을 넣어주는 셀(cell)은 1 cm 두께의 표준 석영 셀(standard quartz cell, internal volume=0.1 cm)을 이용하였다.In order to confirm the stability of the compound (DRL peptide) of the present invention, the fluorescence stability was confirmed by measuring the absorbance and fluorescence emission graphs to see whether the DRL-TAM prepared in Example 1 was stably maintained under various solvent conditions and various pH conditions. Specifically, in order to confirm whether it was stable when used in cells and living organisms, the absorbance and fluorescence emission of DRL-TAM (10 μM) were confirmed under the conditions of distilled water (DI.H2 O), physiological saline solution (pH 7.4), and cell culture medium (DMEM media). In addition, in order to confirm the stability at various pHs, the absorbance and fluorescence emission of DRL-TAM (10 μM) were confirmed under pH 3, 5, 7, and 9 conditions. In addition, in order to confirm the photostability of DRL-TAM (10 μM) according to light irradiation, light of 530 nm wavelength (50 mW/cm2) was irradiated for 60 minutes, and the fluorescence intensity was confirmed at 10-minute intervals. At this time, a UV/Vis spectrophotometer (Agilent Technologies Cary 8454, USA) was used to analyze the absorption spectrum (UV/Vis absorption spectra), and a fluorescence spectra meter (SHIMADZU CORP. RF-6000, Japan) was used to analyze the fluorescence spectra. A standard quartz cell (standard quartz cell, internal volume = 0.1 cm) with a thickness of 1 cm was used as the cell for putting the compound into each device.
그 결과, 세포 및 생체 조건에서, 흡광 스펙트럼은 모든 용액에서 554 nm에서 증가하고, 형광 방출 스펙트럼은 580 nm에서 600 nm 사이에서 증가하는 것으로 나타나 (도 1), 세포 및 생체의 사용에 있어 충분히 강한 형광 세기를 보이는 것이 확인되었다. 또한, 다양한 pH 조건에서, 흡광 스펙트럼은 모든 용액에서 550 nm에서 560 nm 사이에서 증가하고, 형광 방출 스펙트럼은 583 nm에서 증가하는 것으로 나타나 (도 2), 여러 생체 내의 조건에서 활용 가능한 강한 형광 세기를 보이는 것이 확인되었다. 아울러, 빛 조사시 60분 동안 거의 형광 세기가 거의 변화하지 않는 것으로 나타나 (도 3), 높은 광안정성을 보이는 것이 확인되었다.As a result, in cellular and biological conditions, the absorbance spectrum increased at 554 nm in all solutions, and the fluorescence emission spectrum increased between 580 nm and 600 nm (Fig. 1), confirming that it exhibits a fluorescence intensity strong enough for use in cells and biological systems. In addition, under various pH conditions, the absorbance spectrum increased between 550 nm and 560 nm in all solutions, and the fluorescence emission spectrum increased at 583 nm (Fig. 2), confirming that it exhibits a strong fluorescence intensity that can be utilized under various biological conditions. In addition, it was confirmed that it exhibits high photostability, as it was shown that the fluorescence intensity hardly changed for 60 minutes upon light irradiation (Fig. 3).
실시예 3. DRL 펩타이드의 독성 분석Example 3. Toxicity analysis of DRL peptide
3-1. 세포 독성 확인3-1. Confirmation of cytotoxicity
본 발명의 화합물 (DRL 펩타이드)이 세포에 적용하기에 안전한지 확인하기 위해 DRL-TAM을 이용하여 세포 독성 반응을 확인하였다. 구체적으로, 마우스 활막 유래 일차 세포와 대조군으로 마우스 뇌조직 유래 내피 세포 및 인간 배아 신장 유래 상피 세포에 DRL-TAM을 1 내지 100 μM 농도로 24시간 동안 처리하고, Cell Counting Kit-8 (Dojindo)를 이용하여 흡광값으로 세포 생존률을 측정하였다.To determine whether the compound of the present invention (DRL peptide) is safe for application to cells, cytotoxicity was assessed using DRL-TAM. Specifically, mouse synovial primary cells, mouse brain tissue-derived endothelial cells as controls, and human embryonic kidney-derived epithelial cells were treated with DRL-TAM at concentrations of 1 to 100 μM for 24 hours, and cell viability was measured by absorbance value using Cell Counting Kit-8 (Dojindo).
그 결과, 마우스 활막 유래 일차 세포 및 마우스의 뇌조직 유래 내피 세포, 인간 배아 신장 유래 상피 세포 모두에서 DRL-TAM (1-100 μM)가 유의미한 독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다 (도 4).As a result, DRL-TAM (1-100 μM) was found to have no significant toxicity in mouse synovial primary cells, mouse brain tissue-derived endothelial cells, and human embryonic kidney-derived epithelial cells (Fig. 4).
3-2. 생체 내 독성 확인3-2. Confirmation of in vivo toxicity
본 발명의 화합물 (DRL 펩타이드)이 생체 내 사용에 있어 독성 반응을 나타내는지 확인하기 위해, DRL-TAM을 이용하여 마우스의 혈액에서의 용혈 반응을 확인하였다. 구체적으로, 마취된 마우스의 심장으로부터 바로 채혈한 혈액을 항응고 처리를 한 후 원심분리기 (4 ℃, 1300rpm, 3분)를 이용하여 생리 식염수로 2번 혈장을 세척하여 적혈구만을 순수하게 분리하였다. 정제된 적혈구 (8 %)에 DRL-TAM을 1-100 μM 농도로 1시간 동안 처리하였으며, 용혈 반응이 외부 요소에 의한 것이 아님을 입증하기 위하여 대조군으로써 생리 식염수 및 계면 활성제인 Triton X-100을 사용하였다. 이후 원심분리기 (4 ℃, 3000 rpm, 3분)를 이용하여 상층액을 분리하였고, 각 군에서 DRL-TAM과 대조군 처리 후 원심분리 전 및 후의 450 nm 여기파장에서 흡광도를 측정하여 용혈 반응을 그래프화하였다.To confirm whether the compound of the present invention (DRL peptide) exhibits a toxic reaction when used in vivo, a hemolytic reaction in the blood of mice was confirmed using DRL-TAM. Specifically, blood collected directly from the heart of anesthetized mice was subjected to anticoagulation treatment, and then the plasma was washed twice with physiological saline using a centrifuge (4°C, 1300 rpm, 3 minutes) to purely separate only red blood cells. The purified red blood cells (8%) were treated with DRL-TAM at a concentration of 1-100 μM for 1 hour, and physiological saline and the surfactant Triton X-100 were used as controls to verify that the hemolytic reaction was not caused by external factors. Afterwards, the supernatant was separated using a centrifuge (4 ℃, 3000 rpm, 3 minutes), and the absorbance at an excitation wavelength of 450 nm before and after centrifugation after treatment with DRL-TAM and the control group in each group was measured to graph the hemolysis reaction.
그 결과, 생리 식염수를 처리한 군과 DRL-TAM을 처리한 군 사이에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았으며, 계면 활성제를 처리한 군과 대비하여 나머지 모든 군에서 유의미한 차이가 관찰되었다 (도 5). 이를 통해, DRL 펩타이드가 생체 내에서 용혈 반응을 일으키지 않는 것을 확인하였다.As a result, no significant differences were observed between the saline-treated group and the DRL-TAM-treated group, and significant differences were observed in all remaining groups compared to the surfactant-treated group (Fig. 5). This confirmed that the DRL peptide does not cause hemolysis in vivo.
실시예 4. DRL 펩타이드의 활막 표적화 효능 및 시각화 특성 확인Example 4. Confirmation of the synovial targeting efficacy and visualization characteristics of DRL peptides.
4-1. 세포 수준에서의 활막 표적화 효능 및 시각화 특성4-1. Synovial targeting efficacy and visualization characteristics at the cellular level
본 발명의 화합물 (DRL 펩타이드)의 세포 내에서의 표적화 효능 및 시각화 특성을 확인하기 위해, 활막 유래 일차 세포와 대조군으로써 마우스의 뇌조직 유래 내피 세포 및 인간 배아 신장 유래 상피 세포에 DRL-TAM (10 μM)을 24시간 동안 처리한 뒤 제거하고, 세포 소기관인 핵과 세포막을 구별하기 위하여 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 및 CellMask Green plasma membrane stain를 각각 2 μL씩 20 분 동안 처리하였다. 이 후, 4 % 포름알데하이드(formaldehyde)를 6 분 동안 처리하여 공초점 현미경 (LSM-800, Carl Zeiss, Germany)으로 세포의 이미지를 확인하고, DRL-TAM의 형광 세기를 각 세포에서 비교 분석하였다.To confirm the targeting efficacy and visualization properties of the compound (DRL peptide) of the present invention in cells, primary cells derived from synovium and endothelial cells derived from mouse brain tissue and epithelial cells derived from human embryonic kidney as controls were treated with DRL-TAM (10 μM) for 24 hours, then removed, and in order to distinguish the nucleus and cell membrane, which are cell organelles, 2 μL each of DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and CellMask Green plasma membrane stain were treated for 20 minutes. Thereafter, the cells were treated with 4% formaldehyde for 6 minutes, and images of the cells were confirmed using a confocal microscope (LSM-800, Carl Zeiss, Germany), and the fluorescence intensity of DRL-TAM was compared and analyzed in each cell.
그 결과, 대조군으로 사용한 두 세포에서보다 활막 유래 일차 세포에서 DRL-TAM이 현저히 높은 형광 세기를 나타냈으며, DRL-TAM이 세포막을 염색하는 CellMask Green plasma membrane stain과 동일한 위치에서 형광 세기를 나타내, 마우스의 활막 유래 세포의 세포막에 존재하는 것을 명확히 나타냈으므로 (도 6), DRL-TAM이 활막 표적화 효과를 가지고 이를 시각화할 수 있음을 확인하였다.As a result, DRL-TAM showed a significantly higher fluorescence intensity in the synovial membrane-derived primary cells than in the two cells used as controls, and DRL-TAM showed fluorescence intensity at the same location as the CellMask Green plasma membrane stain that stains the cell membrane, clearly indicating that it exists in the cell membrane of mouse synovial membrane-derived cells (Fig. 6), confirming that DRL-TAM has a synovial membrane-targeting effect and can be visualized.
4-2. 생체 내 활막 표적화 효능 및 시각화 특성4-2. In vivo synovial targeting efficacy and visualization characteristics
본 발명의 화합물 (DRL 펩타이드)의 생체 내에서의 표적화 효능 및 시각화 특성을 확인하기 위해, DRM-TAM과 대조군으로써 탐라와 구조적 유사체인 로다민 B(rhodamine B)를 6주령의 마우스에 각각 5 mg/kg 농도로 미주 정맥 투여하고, 시간에 따른 물질의 생체 분포 과정을 형광 추적을 통하여 확인하였다. 또한, DRL-TAM의 생체 내 형광 세기가 가장 높은 시간인 투여 10분 후에 마우스를 희생시켜 신체 장기 및 부위를 적출하여 각각의 형광 세기를 대조군인 로다민 B와 비교 분석하였다.To confirm the targeting efficacy and visualization characteristics of the compound of the present invention (DRL peptide) in vivo, DRM-TAM and rhodamine B, a structural analog of Tamra as a control, were administered intravenously to 6-week-old mice at a concentration of 5 mg/kg each, and the biodistribution process of the substances over time was confirmed through fluorescence tracking. In addition, 10 minutes after administration, when the in vivo fluorescence intensity of DRL-TAM was the highest, the mice were sacrificed, and the organs and parts of the body were removed and the fluorescence intensity of each was compared and analyzed with that of the control, rhodamine B.
시간에 따른 물질의 생체 분포 과정을 추적한 결과, 미주 정맥 투여 10분 후, DRL-TAM을 투여한 군에서 가장 높은 형광 세기를 보이는 것으로 나타났으며 (도 7), 이는 생체 내에서 DRL-TAM이 10분 동안 가장 많이 분포하는 것을 의미한다. 또한, 적출한 마우스의 신체 장기 및 부위에서 활막이 존재한다고 알려져 있는 부위와 활막이 존재하지 않는 부위를 나누어 형광 이미지를 확인한 결과, 활막이 존재하는 부위에 대조군인 로다민 B에 대비하여 DRL-TAM이 유의적으로 높은 복사 효율을 가지는 것으로 나타났으며. 반면에 활막이 존재하지 않는 부위의 복사 효율은 대조군인 로다민 B가 DRL-TAM보다 높게 나타났다 (도 8).As a result of tracking the biodistribution process of the substance over time, the group administered DRL-TAM showed the highest fluorescence intensity 10 minutes after intravenous administration (Fig. 7), which means that DRL-TAM is distributed the most in vivo for 10 minutes. In addition, as a result of checking the fluorescence images by dividing the organs and parts of the body of the extracted mouse into areas known to have synovium and areas without synovium, it was found that DRL-TAM had a significantly higher radiation efficiency in areas with synovium compared to the control group, rhodamine B. On the other hand, the radiation efficiency in areas without synovium was higher for the control group, rhodamine B, than for DRL-TAM (Fig. 8).
이를 통해, 본 발명의 화합물 (DRL 펩타이드)이 생체 내 특정 부위에 대해 특이적인 표적화 효능을 보이며, 이를 이용한 신체 특정 부위들을 시각화할 수 있음을 확인하였다.Through this, it was confirmed that the compound of the present invention (DRL peptide) exhibits specific targeting efficacy for a specific site in a living body, and that specific sites in the body can be visualized using this.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is provided for illustrative purposes only, and those skilled in the art will readily appreciate that modifications to other specific embodiments can be made without altering the technical spirit or essential characteristics of the present invention. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not restrictive.
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220107613AKR102870168B1 (en) | 2022-08-26 | synovium targeting compound and uses thereof | |
| PCT/KR2023/009907WO2024043523A1 (en) | 2022-08-26 | 2023-07-12 | Synovium-targeting compound and uses thereof |
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220107613AKR102870168B1 (en) | 2022-08-26 | synovium targeting compound and uses thereof |
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240029316A KR20240029316A (en) | 2024-03-05 |
| KR102870168B1true KR102870168B1 (en) | 2025-10-13 |
| Title |
|---|
| International Journal of Pharmaceutics. Vol.617 (2022.03.01.)* |
| 일본 공표특허공보 특표2005-511017호(2005.04.28.)* |
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU715632B2 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| US6391305B1 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| US20060148718A1 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| US20170267727A1 (en) | Conjugates of pH Low Insertion Peptide and Monomethyl Auristatins in the Treatment of Solid Tumors | |
| US5998362A (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| AU726434B2 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| JPH10512588A (en) | New peptide | |
| JP2007501866A (en) | Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal diseases | |
| EP1009420B1 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| US6174858B1 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| US20070244055A1 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| JP7668355B2 (en) | Urate oxidase preparations and their applications | |
| KR102870168B1 (en) | synovium targeting compound and uses thereof | |
| US7078485B2 (en) | N-terminal modified recombinant human endostatin and its production | |
| CN110121340B (en) | Formulation of pegylated arginine deiminase | |
| US6127333A (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| WO2021156504A1 (en) | Treatment of panx1 associates diseases | |
| US20040081659A1 (en) | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer | |
| KR20240029316A (en) | synovium targeting compound and uses thereof | |
| EP2894161B1 (en) | Peptide for inhibiting vascular endothelial growth factor receptor | |
| KR101936559B1 (en) | Photosensitizer-peptide conjugates with cleavable linkers, and a composition for photodynamic diagnosis and therapy comprising the same | |
| CA3222510A1 (en) | Ghr-binding pending peptide and composition comprising same |
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application | St.27 status event code:A-0-1-A10-A12-nap-PA0109 | |
| PA0201 | Request for examination | St.27 status event code:A-1-2-D10-D11-exm-PA0201 | |
| PG1501 | Laying open of application | St.27 status event code:A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501 | |
| R18-X000 | Changes to party contact information recorded | St.27 status event code:A-3-3-R10-R18-oth-X000 | |
| D13-X000 | Search requested | St.27 status event code:A-1-2-D10-D13-srh-X000 | |
| D14-X000 | Search report completed | St.27 status event code:A-1-2-D10-D14-srh-X000 | |
| PE0902 | Notice of grounds for rejection | St.27 status event code:A-1-2-D10-D21-exm-PE0902 | |
| PN2301 | Change of applicant | St.27 status event code:A-3-3-R10-R11-asn-PN2301 | |
| E13-X000 | Pre-grant limitation requested | St.27 status event code:A-2-3-E10-E13-lim-X000 | |
| P11-X000 | Amendment of application requested | St.27 status event code:A-2-2-P10-P11-nap-X000 | |
| P13-X000 | Application amended | St.27 status event code:A-2-2-P10-P13-nap-X000 | |
| PE0701 | Decision of registration | St.27 status event code:A-1-2-D10-D22-exm-PE0701 | |
| PR0701 | Registration of establishment | St.27 status event code:A-2-4-F10-F11-exm-PR0701 | |
| PR1002 | Payment of registration fee | St.27 status event code:A-2-2-U10-U11-oth-PR1002 Fee payment year number:1 |