본 발명은 베타아밀로이드를 포함하는 만성통증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신경병증성 통증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating a chronic pain disease containing beta-amyloid, and more particularly, to a pharmaceutical composition for preventing or treating neuropathic pain.
통증은 부상이나 수술 후의 수백만의 사람들 및 관절염, 암 및 당뇨병과 같은 질환을 겪는 사람들에게 영향을 미친다. 통각수용(Nociception)(유해 자극 또는 위해 자극의 검출)은 중대한 생물학적 목적을 제공한다. 통증은 발생부위, 원인, 성질 및 발생기전 등을 고려하여 구분할 수 있다. 예를 들면, 통각 수용성 통증은 병태 생리학 기전에 의한 분류로서 조직 손상에 따라 발생하고, 유해한 자극에 비례하여 통증이 증가하는 경향을 보인다.Pain affects millions of people after injury or surgery, as well as those suffering from conditions such as arthritis, cancer, and diabetes. Nociception (the detection of noxious or harmful stimuli) serves a crucial biological purpose. Pain can be categorized based on its location, cause, nature, and mechanism of action. For example, nociceptive pain, a classification based on pathophysiological mechanisms, is triggered by tissue damage and tends to increase in proportion to noxious stimuli.
통증은 그 지속기간에 따라서는 급성과 만성통증으로 나눌 수 있다. 대표적인 만성통증 질환으로는 신경병증성 통증, 복합부위 통증 증후군, 대상포진 후 신경통, 척추 수술 후 통증 증후군 등이 있다. 만성통증은 단순히 급성통증의 연장선이 아니며, 통증의 정도는 원래의 손상 정도와 비례하지 않고 자극이 없이도 자발적으로 일어날 수 있다. 통증의 기간과 강도가 환자의 기능이나 생활에 유해한 효과를 일으키거나 또는 정상적인 조직 치유기간, 보통 3개월을 넘어서서 지속되는 경우는 만성통증으로 정의하며 증상이 아닌 하나의 질병으로 간주한다. 만성통증은 무자비하고 자기-제어적이지 않으며 초기 부상 후 수년 및 수십 년 까지도 지속될 수 있다. 만성통증은 성질에 있어서 주로 신경병성이며 말초 또는 중추신경계 손상을 포함할 수 있다.Pain can be divided into acute and chronic pain based on its duration. Common chronic pain conditions include neuropathic pain, complex regional pain syndrome, postherpetic neuralgia, and post-spine surgery pain syndrome. Chronic pain is not simply an extension of acute pain; its severity is not proportional to the extent of the original injury, and it can occur spontaneously without any stimulation. Pain that persists beyond the normal tissue healing period (usually three months) or has a detrimental effect on the patient's function or quality of life is defined as chronic pain and is considered a disease, not a symptom. Chronic pain is relentless and non-self-limiting, and can persist for years or even decades after the initial injury. Chronic pain is primarily neuropathic in nature and may involve damage to the peripheral or central nervous system.
다양한 통증의 종류 중, 외견상으로는 상처나 동통의 원인이 없는데도 발생하는 통증이 바로 신경성 동통, 신경병증성 통증(neuropathic pain)이다. 신경병증성 통증은 암, 자가면역 질환 또는 대상포진 감염에 의한 신경 압박(nerve compression), 신경 외상(nerve trauma)과 같은 신경세포의 손상이나 신경계의 이상으로 생기는 통증을 총칭하며, 이는 정상적인 상태에서는 통증을 유발하지 않는 자극에도 통증반응을 보이는 이질통(allodynia)과 통증자극에 대해 더욱 민감한 반응을 보이는 통각과민(hyperalgesia), 또한, 자극이 없는 상태에서도 화끈거리거나 타는듯한 감각(spontaneous burning sensation)을 느끼는 등의 임상적 특성을 보이는 만성통증이다. 이와 같은 신경병증성 통증은 이로움을 주는 급성 통증과는 달리 통증을 전달하는 신경계의 변형으로 인해 질병 이상의 통증을 가져오게 된다.Among the various types of pain, neuropathic pain occurs without any apparent cause, such as injury or pain. Neuropathic pain is a general term for pain caused by nerve cell damage or abnormalities in the nervous system, such as nerve compression due to cancer, autoimmune disease, or shingles infection, or nerve trauma. It is chronic pain with clinical characteristics such as allodynia, a painful response to stimuli that normally do not cause pain; hyperalgesia, an increased sensitivity to painful stimuli; and a spontaneous burning sensation even in the absence of stimulation. Unlike acute pain, which is beneficial, neuropathic pain causes pain beyond the disease itself due to alterations in the nervous system that transmits pain.
전통적으로 이러한 신경병증성 통증은 신경세포의 변성에 의해 야기되는 감각뉴런(sensory neuron)의 과흥분성(hyperexcitability)에 기인한다고 생각되어져 왔으며, 이러한 감각뉴런의 과흥분성의 원인으로는, 1) 신경세포 손상에 의한 세포주변 환경의 항상성 (extraneuronal homeostasis)의 변화, 2) 신경세포 손상에 따른 감각뉴런 세포막 이온통로 발현 및 이온통로 조절 단백질 활성의 변화, 3) 중추 시냅스 재조정 (synaptic reorganization)에 의한 새로운 통증전달 회로의 형성, 4) 억제성 인터뉴런의 사멸에 의한 감각신경세포의 과흥분과 같은 몇 가지 원인들이 가설로 제기되었다.Traditionally, neuropathic pain has been thought to be due to hyperexcitability of sensory neurons caused by degeneration of nerve cells. Several hypotheses have been proposed as causes of this hyperexcitability of sensory neurons, including 1) changes in extraneuronal homeostasis due to nerve cell damage, 2) changes in the expression of sensory neuron membrane ion channels and the activity of ion channel regulatory proteins due to nerve cell damage, 3) formation of new pain transmission circuits due to central synaptic reorganization, and 4) hyperexcitability of sensory neurons due to death of inhibitory interneurons.
현재 임상에서는 통증 증상 경감을 위하여 항경련제(카바마제핀, 가바펜틴), 아편계 진통제(opioid analgesics) 등을 사용하고 있으나, 효과적으로 조절되지 않을 뿐만 아니라 약효가 유지되는 일정 시간 내에서만 작용하여 통증이 지속되는 한 반복투여하여야 하고 반복투여에 의한 부작용 등이 발생한다. 특히 몰핀의 경우 모르핀 내성에 의한 통증관리의 어려움, 사망 등이 지속적으로 발생하고 있다.Currently, anticonvulsants (carbamazepine, gabapentin) and opioid analgesics are used clinically to alleviate pain symptoms. However, they are not only ineffective, but also work only for a certain period of time while the drug is effective. Therefore, repeated administration is necessary as long as the pain persists, and side effects such as repeated administration occur. In particular, in the case of morphine, difficulties in pain management and death due to morphine tolerance continue to occur.
한편, 베타아밀로이드는 치매의 원인물질로 알려졌으나 최근 임상실험에서 베타아밀로이드의 제거가 치매증상완화에 중요한 역할을 하지 않는 것으로 판정되고 있다. 베타아밀로이드는 정상적으로 체내에서 합성되며 신경활동도에 의존적으로 신경에서 유리되는 펩타이드로 생체내에서 제거기전도 동시에 가지고 있다.Meanwhile, beta-amyloid is known to be a causative agent of dementia, but recent clinical trials have determined that its removal does not play a significant role in alleviating dementia symptoms. Beta-amyloid is a peptide that is normally synthesized in the body and released from neurons in a neuronal activity-dependent manner, and it also possesses a mechanism for clearing it within the body.
베타아밀로이드의 생리학적 기능은 잘 알려져 있지 않으며, 베타아밀로이드를 이용하여 말초신경병증 관련 질환 및 만성통증 질환의 치료 효과를 확인한 연구는 아직 이루어진 바가 없어, 연구에 대한 필요성이 대두되고 있다.The physiological function of beta-amyloid is not well known, and there has been no research to confirm the therapeutic effect of beta-amyloid on peripheral neuropathy-related diseases and chronic pain diseases, so the need for such research is emerging.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 만성통증성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 물질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 베타아밀로이드가 신경활동도 조절에 관여할 것으로 가설을 세우고, 신경손상 후 신경활동도 증가와 이에 따른 신경병증성 통증에서 베타아밀로이드의 투여로 인한 통증 조절 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.The present invention was conceived to solve the above problems, and as a result of the inventors' diligent efforts to develop a substance for preventing or treating chronic pain diseases, they hypothesized that beta-amyloid would be involved in regulating neural activity, and confirmed the pain control effect of administering beta-amyloid in increased neural activity after nerve damage and the resulting neuropathic pain, and completed the present invention based on this.
이에, 본 발명의 목적은 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 만성통증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating chronic pain disease, which comprises a beta-amyloid peptide, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector comprising the polynucleotide as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 만성통증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving chronic pain disease, comprising a beta-amyloid peptide, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector comprising the polynucleotide as an active ingredient.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problems to be solved by the present invention are not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 만성통증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.1. A pharmaceutical composition for preventing or treating chronic pain disease, comprising as an active ingredient a beta-amyloid peptide having an amino acid sequence of sequence number 1, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector including the polynucleotide.
2. 위 1에 있어서, 상기 만성통증 질환은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 당뇨병성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 관절통(arthalgia) 및 류마티스 관절염 통증(rhematoid arthritis pain) 또는 골관절염(osteoarthritis)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약학적 조성물.2. A pharmaceutical composition according to the above 1, wherein the chronic pain disease is at least one selected from the group consisting of neuropathic pain, cancer pain, diabetic neuropathic pain, arthalgia, and rheumatoid arthritis pain or osteoarthritis.
3. 위 2에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 말초 신경 손상 또는 중추 신경 손상에 의해 유도된 것인, 약학적 조성물.3. A pharmaceutical composition according to the above 2, wherein the neuropathic pain is induced by peripheral nerve damage or central nerve damage.
4. 위 2에 있어서, 상기 신경병증성 통증은 말초신경계 이상 또는 손상, 척수신경 손상을 포함한 다발성경화증, 척수부상, 통각과민, 감각과민, 신경병증, 당뇨성 신경장애, 신경염, 신경통, 작열통, 이질통, 포진후신경통, 요추 신경근압박, 암과 관련된 통증, 알코올 중독, 비정형 안면통증, 포진성 신경통, 중풍후통증, HIV 연관 신경병증, 골관절염 및 환상사지통증으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 질환인, 약학적 조성물.4. In the above 2, the neuropathic pain is at least one disease selected from the group consisting of peripheral nervous system abnormality or damage, multiple sclerosis including spinal nerve damage, spinal cord injury, hyperalgesia, hyperesthesia, neuropathy, diabetic neuropathy, neuritis, neuralgia, burning pain, allodynia, postherpetic neuralgia, lumbar nerve root compression, pain associated with cancer, alcoholism, atypical facial pain, herpetic neuralgia, poststroke pain, HIV-associated neuropathy, osteoarthritis, and phantom limb pain, a pharmaceutical composition.
5. 위 1에 있어서, 상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터인, 약학적 조성물.5. A pharmaceutical composition according to the above 1, wherein the expression vector is a viral vector or a non-viral vector.
6. 위위 5에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노부속바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인, 약학적 조성물.6. A pharmaceutical composition according to claim 5, wherein the viral vector is an adeno-associated virus (AAV) vector, an adenovirus vector, an alphavirus vector, a herpes simplex virus vector, a vaccinia vector, a Sendai virus vector, a flavivirus vector, a radobovirus vector, a retrovirus vector, or a lentivirus vector.
7. 위 6에 있어서, 상기 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 혈청형(serotype)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 또는 AAV16인, 약학적 조성물.7. A pharmaceutical composition according to 6 above, wherein the serotype of the adeno-associated virus (AAV) vector is AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 or AAV16.
8. 위 5에 있어서, 상기 비바이러스성 벡터는 DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜인, 약학적 조성물.8. A pharmaceutical composition according to 5 above, wherein the non-viral vector is a DNA vector, nanoparticle, cationic polymer, exosome, extracellular vesicle or liposome.
9. 위 8에 있어서, 상기 DNA 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터 또는 인공 인간 염색체인, 약학적 조성물.9. A pharmaceutical composition according to the above 8, wherein the DNA vector is a plasmid vector, a cosmid vector, a phagemid vector, or an artificial human chromosome.
10. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 만성통증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.10. A health functional food composition for preventing or improving chronic pain disease, comprising as an active ingredient a beta-amyloid peptide having an amino acid sequence of sequence number 1, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector including the polynucleotide.
본 발명의 만성통증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 베타아밀로이드 또는 이의 단편 펩타이드를 유효성분으로 포함하여, 신경병증성 통증을 유의적으로 억제할 수 있다. 또한, 종래에는 신경전도의 특정 단백질, 예를 들어 칼슘이온통로, TRPV1, TRPA1 등, 조절을 통해 일시적으로 통증을 경감시키고 있었으나 베타아밀로이드 또는 이의 단편 펩타이드는 신경시냅스의 가소성을 정상화시켜 과민한 통증정보처리를 조절할 수 있는바, 새로운 만성통증성 질환의 치료제로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.The pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating chronic pain diseases comprises beta-amyloid or a fragment peptide thereof as an active ingredient, and can significantly suppress neuropathic pain. Furthermore, while pain has been temporarily alleviated by modulating specific proteins involved in nerve conduction, such as calcium ion channels, TRPV1, and TRPA1, beta-amyloid or a fragment peptide thereof can normalize the plasticity of neural synapses and regulate hypersensitive pain information processing, it is expected that it can be usefully utilized as a new treatment for chronic pain diseases.
도 1은 신경병증성 통증모델을 제조하여 본 발명의 베타아밀로이드(1-42)를 척수강내로 투여한 후 시간에 따른 기계적 통증반응 억제 평가 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 베타아밀로이드를 척수강내로 투여하기 전에 14일에 생리식염주에 따른 통증반응 양상을 확인한 후 16일차에 베타아밀로이드를 척수강 내로 투여한 후 측정한 통증반응 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 베타아밀로이드 또는 이의 단편 펩타이드를 척수강내로 투여한 후 통증반응 양상을 나타낸 것이다.
도 4는 기계적 통증에 대한 베타아밀로이드의 급성 효과를 검증한 것이다.
도 5는 척수 후각, 전각, 그리고 척수후근 신경절에서 베타아밀로이드 수용체로 알려진 FCgammaR(1, 2b1, 2b2, 3)의 발현여부를 확인한 것이다.
도 6은 척수 후각에서 베타아밀로이드 수용체로 알려진 FCgammaR2b2가 신경병증성 통증모델에서 유의하게 증가함을 제시한 것이다. 이와 유사한 아형인 FCgammaR들의 척수 후각에서의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 마우스 척수후각에서 FCgammaR2b2를 SiRNA를 활용하여 유전자적으로 제거(knock down) 후 베타아밀로이드의 진통효과를 확인한 것이다.
도 8는 척수 후각의 또다른 구성세포인 신경교세포인 성상세포(astrocyte)와 미교세포(microglia)의 변화를 공초점이미지를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 베타아밀로이드를 발현하는 아데노부속 바이러스 벡터 AAV-베타아밀로이드를 신경병증성 통증 마우스모델에 투여한 후 기계적 통증의 양상 변화를 확인한 것이다.Figure 1 shows the evaluation pattern of mechanical pain response inhibition over time after intrathecal administration of the beta-amyloid (1-42) of the present invention in a neuropathic pain model.
Figure 2 shows the pain response pattern measured on the 16th day after intrathecal administration of beta-amyloid, after checking the pain response pattern according to saline solution 14 days before intrathecal administration of beta-amyloid.
Figure 3 shows the pain response pattern after intrathecal administration of beta-amyloid or its fragment peptide.
Figure 4 demonstrates the acute effect of beta-amyloid on mechanical pain.
Figure 5 shows the expression of FCgammaR (1, 2b1, 2b2, 3), known as a beta-amyloid receptor, in the dorsal horn, anterior horn, and dorsal root ganglion of the spinal cord.
Figure 6 shows that FCgammaR2b2, a beta-amyloid receptor known to be present in the dorsal horn of the spinal cord, is significantly increased in a neuropathic pain model. The expression of similar subtypes of FCgammaRs was also confirmed in the dorsal horn of the spinal cord.
Figure 7 shows the analgesic effect of beta-amyloid after genetically knocking down FCgammaR2b2 using SiRNA in the mouse spinal cord dorsal horn.
Figure 8 shows the results of confirming changes in astrocytes and microglia, which are other constituent cells of the spinal dorsal horn, through confocal images.
Figure 9 shows changes in the mechanical pain pattern after administering AAV-beta-amyloid, an adeno-associated virus vector expressing beta-amyloid, to a neuropathic pain mouse model.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 만성통증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating chronic pain disease, comprising a beta-amyloid peptide, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector comprising the polynucleotide as an active ingredient.
본 발명에서 신경병증성 모델 (말초신경 손상에 따른 신경병증)은 통상적으로 신경 손상 3일 후부터 발생하여 30일 이상 지속되는 양상을 보이며, 신경손상 2주후 통증반응이 최대치에 달하는 시점에서 베타아밀로이드를 척수강 내로 1회 투여하면 3시간 이후부터 통증이 감소하기 시작하여 1일 후부터는 통증반응이 정상수준의 80%까지 회복되고 이러한 진통작용이 30일까지 지속됨을 확인하였다.In the present invention, the neuropathic model (neuropathy due to peripheral nerve damage) typically occurs 3 days after nerve damage and lasts for more than 30 days. When beta-amyloid was administered intrathecally once at a time when the pain response reached its maximum 2 weeks after nerve damage, the pain began to decrease after 3 hours, and after 1 day, the pain response recovered to 80% of the normal level, and it was confirmed that this analgesic effect lasted for up to 30 days.
본 발명의 용어, "베타 아밀로이드 (Beta amyloid)"는 알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되는아밀로이드 베타 플라크(amyloid beta plaque)의 주요 성분으로서, 36 내지 43의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이고, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)로부터 만들어진다고 알려져 있다.The term "beta amyloid" of the present invention is a major component of amyloid beta plaques found in the brains of Alzheimer's disease patients, and is a peptide composed of 36 to 43 amino acids, and is known to be made from amyloid precursor protein (APP).
본 발명의 일 실시예에서, 상기 베타 아밀로이드는 서열번호 1 내지 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 베타아밀로이드는 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 베타아밀로이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the beta amyloid may be composed of any one amino acid selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3. In one specific example, the beta amyloid may be composed of any one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and 2, and more specifically, the beta amyloid may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 용어, "베타 아밀로이드 단편 펩타이드"는 베타아밀로이드로부터 유래하는 10개 내지 25개의 아미노산으로 구성된 짧은 길이를 갖는 펩타이드를 말한다.The term "beta amyloid fragment peptide" of the present invention refers to a short peptide composed of 10 to 25 amino acids derived from beta amyloid.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 단편 펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the fragment peptide may be composed of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
상기 서열번호 1로 기재되는 인간 베타아밀로이드(1-42) 및 이와 적어도 96% 이상의 상동성을 갖는 다른 포유류 유래의 베타아밀로이드도 사용할 수 있다. 상기 다른 포유류 유래의 베타아밀로이드는 마우스(Mus musculu), 침팬지(Pan troglodytes), 고릴라(Gorilla beringei graueri) 또는 돼지(Sus scrofa domesticus)일 수 있다.Human beta-amyloid (1-42) as described in the above sequence number 1 and other mammalian beta-amyloids having at least 96% homology thereto may also be used. The other mammalian beta-amyloids may be mouse (Mus musculu), chimpanzee (Pan troglodytes), gorilla (Gorilla beringei graueri), or pig (Sus scrofa domesticus).
본 발명은 단백질 또는 펩타이드 대신 유전자를 활용한 유전자 요법에 의해 구현될 수 있다. 이러한 유전자 요법을 위해, 유전자의 증폭 및 조작을 용이하게 하기 위해서 베타아밀로이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트가 다양한 발현벡터에 삽입이 된 재조합 벡터가 사용될 수 있다. 다만, 이 경우에는 신호서열과 절단에 의해 제거되는 부분까지 포함한 형태로 유전자 컨스트럭트를 제조하여 체내에서 번역 후 가공에 의해 성숙형 펩타이드가 생성되도록 할 수 있기 때문에, 전장 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드도 사용이 될 수 있다.The present invention can be implemented through gene therapy utilizing genes instead of proteins or peptides. For such gene therapy, a recombinant vector can be used, in which a gene construct containing a polynucleotide encoding beta-amyloid operably linked to regulatory sequences is inserted into various expression vectors to facilitate gene amplification and manipulation. However, in this case, since the gene construct can be manufactured in a form that includes the signal sequence and the portion removed by cleavage, allowing the mature peptide to be produced through post-translational processing in the body, a polynucleotide encoding a full-length protein can also be used.
본 발명의 용어, "벡터"는 유전자의 전달을 위해 사용되는 도구를 지칭한다. 약물의 담체에 대응되는 개념으로 일반적인 플라스미드 벡터와 같이 도입하고자 하는 형질도입 유전자와 동일한 핵산 분자로 구성된 DNA 벡터뿐만 아니라, 실리카나 금으로 이루어진 나노입자, 리포좀, 세포외 소포, 및 엑소좀과 같은 인지질막 구조체, 키토산, 폴리에틸렌 이민 및 폴리라이신과 같은 양이온성 폴리머, 인산칼슘과 같이 DNA 형질감염에 사용되는 시약 역시 광의의 벡터에 포함이 된다.The term "vector" in the present invention refers to a tool used for gene transfer. In a broad sense, vectors include not only DNA vectors composed of nucleic acid molecules identical to the transgene to be introduced, such as general plasmid vectors, corresponding to drug carriers, but also phospholipid membrane structures such as nanoparticles made of silica or gold, liposomes, extracellular vesicles, and exosomes, cationic polymers such as chitosan, polyethyleneimine, and polylysine, and reagents used in DNA transfection, such as calcium phosphate.
본 문서에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이란 목적으로 하는 핵산서열이 형질도입 유전자를 도입하고자 하는 생체 내에서 발현이 이루어질 수 있도록 하는 방식으로 상기 조절서열에 연결되어 있다는 것을 의미한다.The term "operably linked to" as used herein means that the target nucleic acid sequence is linked to the regulatory sequence in such a way that expression of the transgene can occur in the organism into which it is intended to be introduced.
상기 "조절서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 의미이다. 조절서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절서열)이 포함된다. 유전자 요법에 사용되는 발현벡터의 설계는 형질도입 유전자가 도입될 숙주의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것은 당업자라면 이해할 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 숙주에 도입되어 베타아밀로이드 단백질을 발현할 수 있다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 발현벡터는 진핵세포 특히 포유동물에서 외래 유전자를 발현시킬 수 있는 진핵세포의 조절서열을 가지고 있어야 한다. 이러한 진핵세포에서 외래 유전자의 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상술한 바와 같이, 이들은 보통 전사개시를 담당하는 조절서열들 및, 선택적으로 전사물의 전사종결 및 안정화를 담당하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절서열들은 전사조절인자 외에도 번역 증진인자 및/또는 천연-조합 또는 이종성 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어 포유류 내의 세포에서 발현을 가능하게 하는 조절서열들은 CMV-HSV 티미딘 키나아제 프로모터, SV40, RSV-프로모터(로우스 육종 바이러스), 인간 신장 요소 1α-프로모터, 글루코코르티코이드-유도성 MMTV-프로모터(몰로니 마우스 종양 바이러스), 메탈로티오네인-유도성 또는 테트라사이클린-유도성 프로모터 또는, CMV 증폭제 또는 SV40-증폭제와 같은 증폭제를 포함한다. 신경 세포 내 발현을 위해, 신경미세섬유-프로모터(neurofilamentpromoter), PGDF-프로모터, NSE-프로모터, PrP-프로모터 또는 thy-1-프로모터들이 사용될 수 있다는 것이 고려되고 있다. 상기 프로모터들은 당 분야에 알려져 있으며, 문헌(Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995)에 기술되어 있다. 상기 조절서열들은 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 하류(downstream)에 SV40-폴리-A 부위 또는 TK-폴리-A 부위와 같은 전사 종결 신호를 포함할 수도 있다. 본 문서에서, 적당한 발현벡터들은 당 분야에 알려져 있으며, 그 예로는 오카야마-베르그(Okayama-Berg) cDNA 발현 벡터 pcDV1(Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL), pGX-27(특허 제1442254호), pX(Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), 효모 2-혼성(two-hybrid) 벡터, 가령 pEG202 및 dpJG4-5(Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995) 등이 존재한다. 본 발명의 핵산분자들 외에, 벡터는 분비신호를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분비신호들은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그리고, 사용된 발현 시스템에 따라, 베타아밀로이드를 세포 구획으로 이끌 수 있는 리더서열(leader sequence)이 본 발명의 일 실시예에 따른 폴리뉴클레오타이드의 암호화 서열에 조합될 수 있고, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 이의 단백질을 세포질 주변 또는 세포외 매질로 직접 분비할 수 있는 리더서열이다.The term "regulatory sequence" above includes promoters, enhancers, and other regulatory elements (e.g., polyadenylation signals). Regulatory sequences include those that direct the constant expression of a target nucleic acid in many host cells, those that direct the expression of a target nucleic acid only in specific tissue cells (e.g., tissue-specific regulatory sequences), and those that direct expression to be induced by a specific signal (e.g., inducible regulatory sequences). Those skilled in the art will understand that the design of an expression vector used in gene therapy may vary depending on factors such as the selection of the host into which the transgene will be introduced and the level of desired protein expression. The expression vector of the present invention can be introduced into a host to express beta-amyloid protein. Therefore, the expression vector according to one embodiment of the present invention must have a eukaryotic regulatory sequence capable of expressing a foreign gene in a eukaryotic cell, particularly a mammal. Regulatory sequences that enable the expression of a foreign gene in such eukaryotic cells are well known to those skilled in the art. As mentioned above, these usually include regulatory sequences responsible for transcription initiation and, optionally, a poly-A signal responsible for transcription termination and stabilization of the transcript. Additional regulatory sequences may include, in addition to transcriptional regulators, translational enhancers and/or native or heterologous promoter regions. For example, regulatory sequences that enable expression in cells within a mammal include the CMV-HSV thymidine kinase promoter, SV40, RSV-promoter (Rowe's sarcoma virus), human elongation factor 1α-promoter, glucocorticoid-inducible MMTV-promoter (Moloney mouse tumor virus), metallothionein-inducible or tetracycline-inducible promoters, or enhancers such as the CMV enhancer or the SV40 enhancer. For expression in neural cells, it is contemplated that the neurofilament promoter, PGDF promoter, NSE promoter, PrP promoter, or thy-1 promoter may be used. These promoters are known in the art and are described in the literature (Charron, J. Biol. Chem. 270: 25739-25745, 1995). The regulatory sequences may also include a transcription termination signal, such as an SV40-poly-A site or a TK-poly-A site, downstream of the polynucleotide according to one embodiment of the present invention. Suitable expression vectors in this document are known in the art, such as Okayama-Berg cDNA expression vector pcDV1 (Parmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pGX-27 (Patent No. 1442254), pX (Pagano et al., Science 255: 1144-1147, 1992), yeast two-hybrid vectors such as pEG202 and dpJG4-5 (Gyuris et al., Cell 75: 791-803, 1995). In addition to the nucleic acid molecules of the present invention, the vector may further comprise a polynucleotide encoding a secretion signal. Such secretion signals are well known to those skilled in the art. And, depending on the expression system used, a leader sequence capable of directing beta-amyloid to a cellular compartment can be combined with the coding sequence of the polynucleotide according to one embodiment of the present invention, preferably a leader sequence capable of directly secreting the translated protein or its protein into the cytoplasmic periphery or extracellular medium.
또한, 본 발명의 발현벡터는 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는 예를 들면, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다. 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 신호 펩타이드를 코딩하는 DNA, 본 발명의 이중 특이성 융합단백질을 암호화하는 DNA를 적절한 조절서열이 포함되어 있는 벡터에 재조합함으로써 본 발명의 벡터가 제조될 수 있다. 상기 조절 서열이 포함되어 있는 벡터는 상업적으로 구입 또는 제조할 수 있다.In addition, the expression vector of the present invention can be produced by, for example, standard recombinant DNA techniques, which include, for example, blunt-end and sticky-end ligation, restriction enzyme treatment to provide appropriate termini, removal of phosphate groups by alkaline phosphate treatment to prevent inappropriate joining, and enzymatic ligation by T4 DNA ligase. The vector of the present invention can be produced by recombining DNA encoding a signal peptide obtained by chemical synthesis or genetic recombination technology and DNA encoding a bispecific fusion protein of the present invention into a vector containing an appropriate regulatory sequence. The vector containing the above regulatory sequence can be purchased or produced commercially.
본 발명에 있어서, “만성통증 질환”은 몸의 한 곳 또는 여러 곳에 영향을 주고 3개월 이상 지속되는 다소 심한 고통을 의미하며, 시간이 지남에 따라 그 강도가 달라질 수 있는 통증 증후군을 포함한다.In the present invention, “chronic pain disease” means a rather severe pain that affects one or more parts of the body and lasts for more than three months, and includes a pain syndrome whose intensity may change over time.
본 발명의 구체예에서, 상기 만성통증 질환은 신경병증성 통증(neuropathic pain), 암성 통증(cancer pain), 당뇨병성 신경병증성 통증(diabetic neuropathic pain), 관절통(arthalgia) 및 류마티스 관절염 통증(rhematoid arthritis pain) 또는 골관절염(osteoarthritis)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In a specific embodiment of the present invention, the chronic pain disease may be at least one selected from the group consisting of neuropathic pain, cancer pain, diabetic neuropathic pain, arthalgia, and rheumatoid arthritis pain or osteoarthritis, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, “신경병증성 통증(neuropathic pain)”은 외상(trauma)이나 염증, 허혈성 손상, 또는 대사산물 등 다양한 원인에 의해 신경계가 손상될 때 유발되는 만성적 신경질환을 의미한다.In the present invention, “neuropathic pain” refers to a chronic neurological disease caused when the nervous system is damaged by various causes such as trauma, inflammation, ischemic damage, or metabolic products.
본 발명의 구체예에서, 상기 신경병증성 통증은 말초 신경 손상 또는 중추 신경 손상에 의해 유도된 것일 수 있다. 또한 상기 신경병증성 통증은 말초신경계 이상 또는 손상, 척수신경 손상을 포함한 다발성경화증, 척수부상, 통각과민, 감각과민, 신경병증, 당뇨성 신경장애, 신경염, 신경통, 작열통, 이질통, 포진후신경통, 요추 신경근압박, 암과 관련된 통증, 알코올 중독, 비정형 안면통증, 포진성 신경통, 중풍후통증, HIV 연관 신경병증, 골관절염 및 환상사지통증으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 질환을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a specific embodiment of the present invention, the neuropathic pain may be induced by peripheral nerve damage or central nerve damage. In addition, the neuropathic pain may include, but is not limited to, one or more diseases selected from the group consisting of peripheral nervous system abnormalities or damage, multiple sclerosis including spinal nerve damage, spinal cord injury, hyperalgesia, hyperesthesia, neuropathy, diabetic neuropathy, neuritis, neuralgia, causalgia, allodynia, postherpetic neuralgia, lumbar nerve root compression, pain associated with cancer, alcoholism, atypical facial pain, herpetic neuralgia, post-stroke pain, HIV-associated neuropathy, osteoarthritis, and phantom limb pain.
본 발명의 용어 "예방"이란, 만성통증성 질환의 발병이 예상되는 개체에게 본 발명에서 제공하는 베타아밀로이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 투여하여 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.The term "prevention" of the present invention means any act of inhibiting or delaying the onset of a chronic painful disease by administering a pharmaceutical composition containing the beta-amyloid provided in the present invention as an active ingredient to a subject expected to develop the disease.
본 발명의 용어 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 만성통증성 질환환이 발병된 환자에게 베타아밀로이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 투여하여 상기 만성 통증성 질병의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The term "treatment" in the present invention refers to any act of clinical intervention to alter the natural process of an individual or cell to be treated, which may be performed during the progression of a clinical pathological condition or to prevent it. The desired therapeutic effect includes preventing the occurrence or recurrence of a disease, alleviating symptoms, reducing all direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, alleviating or temporarily alleviating the disease state, and causing remission or improving the prognosis. For the purpose of the present invention, the treatment may be interpreted to include, but is not limited to, all acts of improving the course of a chronic painful disease by administering to a patient suffering from a chronic painful disease a pharmaceutical composition containing beta-amyloid as an active ingredient.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 발현벡터는 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터일 수 있다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터에 대하여는 문헌(K. Lundstrom, Diseases, 6(2): 42, 2018)에 잘 정리가 되어 있다. 상기 문헌은 본 발명에 참조로 삽입이 된다. 그러나, 이들 바이러스성 벡터 중 레트로바이러스나 렌티바이러스의 경우 숙주의 게놈에 형질도입 유전자(transgene)가 삽입이 되는데, 무작위적으로 삽입이 되기 때문에, 암의 발생과 같은 예기치 못한 부작용이 염려가 되고 있다. 이에, 숙주세포의 게놈 상에 일정한 위치에서만 삽입이 일어나는 아데노부속바이러스가 주목을 받고 있다.In one embodiment of the present invention, the expression vector may be a viral vector or a non-viral vector. Viral vectors used in gene therapy are well summarized in the literature (K. Lundstrom, Diseases, 6(2): 42, 2018). The literature is incorporated herein by reference. However, among these viral vectors, in the case of retroviruses or lentiviruses, the transgene is inserted into the host genome. Since the insertion is random, there is concern about unexpected side effects such as the occurrence of cancer. Accordingly, adeno-associated viruses, which insert only into a specific location in the genome of a host cell, are attracting attention.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 바이러스성 벡터는 아데노부속 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 센다이바이러스 벡터, 플라비바이러스 벡터, 라도보바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the viral vector may be an adeno-associated virus vector, an adenovirus vector, an alphavirus vector, a herpes simplex virus vector, a vaccinia vector, a Sendai virus vector, a flavivirus vector, a radobovirus vector, a retrovirus vector, or a lentivirus vector.
상기 아데노부속바이러스(AAV; adeno-associated virus)는 단일사슬 DNA 바이러스로서 헬퍼 벡터 의존적 사람 파보바이러스(Helper-dependent human parvovirus)이다. 게놈크기는 약 4.7 kbp이며, 게놈의 N-말단 부분은 바이러스 복제와 바이러스 유전자의 발현에 관여하는 rep 유전자를 코딩하고, C-말단 부분은 바이러스의 캡시드(capsid) 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 코딩하고 있으며, 양 말단부위에 약 145 염기가 삽입된 반복영역(ITR)으로 구성되어 있다. rep 영역으로부터는 4개의 단백질이 번역되는데, 이들은 그 분자량에 따라 rep78, rep68, rep52, rep40으로 구분되며, AAV DNA복제에 중요한 기능을 수행한다. cap 영역으로부터는 3개의 단백질 즉, VP1, VP2, VP3이 번역되며 이들은 AAV 입자형성(virus assembly)에 필요한 구조단백질들이다(Muzyczka N. Curr. Top Microbiol. Immunol. 158: 97-129, 1992).The above adeno-associated virus (AAV) is a single-stranded DNA virus and a helper-dependent human parvovirus. The genome size is approximately 4.7 kbp, and the N-terminal portion of the genome encodes the rep gene involved in viral replication and viral gene expression, and the C-terminal portion encodes the cap gene encoding the viral capsid protein, and it consists of an inter-translational repeat region (ITR) with approximately 145 bases inserted at both ends. Four proteins are translated from the rep region, which are classified as rep78, rep68, rep52, and rep40 according to their molecular weights, and perform important functions in AAV DNA replication. Three proteins, VP1, VP2, and VP3, are translated from the cap region and are structural proteins required for AAV particle formation (virus assembly) (Muzyczka N. Curr. Top Microbiol. Immunol. 158: 97-129, 1992).
본 발명의 AAV 벡터는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 외래 유전자 서열을 세포 내로 운반하는데 이용될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다. 한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 요법용 발현벡터는 베타아밀로이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 조절서열에 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 비바이러스성 발현벡터 특히 플라스미드 벡터 등 DNA 벡터에 삽입이 되어 사용이 될 수 있다.The AAV vector of the present invention can be used to deliver a foreign gene sequence into a cell according to various viral infection methods known in the art, and the method is not particularly limited. Meanwhile, the expression vector for gene therapy according to one embodiment of the present invention can be used by inserting it into a non-viral expression vector, particularly a DNA vector such as a plasmid vector, which includes a gene construct in which a polynucleotide encoding beta-amyloid is operably linked to a regulatory sequence.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 유전자 요법용 비바이러스성 발현벡터는 숙주세포에서 상기 베타아밀로이드를 발현하도록 할 수 있는 DNA 벡터일 수 있으며, 상기 DNA 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터, 인공 인간 염색체 등 그 어떠한 형태를 나타내더라도 무방하다.The non-viral expression vector for gene therapy according to one embodiment of the present invention may be a DNA vector capable of expressing the beta-amyloid in a host cell, and the DNA vector may take any form, such as a plasmid vector, a cosmid vector, a phagemid vector, or an artificial human chromosome.
아울러, 상기와 같은 DNA 발현벡터를 이용한 유전자 요법에 사용되는 유전자 전달법으로는 전기천공법, 유전자 총(gene gun), 초음파 마이크로 버블 요법, 자성형질감염(magnetofection), 금이나 실리카 나노입자, 양이온성 폴리머, 리포좀, 및 엑소좀 등의 벡터를 이용하여 형질감염시키는 방법을 사용될 수 있다. 이들 유전자 전달법은 업계에 잘 알려져 있다(Ramamoorth and Narvekar, J. Clin. Diagn. Res., 9(1): GE01-GE106, 2015). 상기 비바이러스성 발현벡터들 중 나노입자, 양이온성 폴리머, 리포좀 및 엑소좀 등의 나노크기의 입자들은 통상적인 투여방법인 근육내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여 등의 방법을 사용하여 투여될 수 있고, 전기천공법이나 유전자총, 초음파 마이크로 버블 요법은 근육내로 국소투여될 수 있다. 특히 리포좀은 널리 사용되는 비바이러스성 벡터로 주로 양이온성 지질로 이루어진 100~400 nm 크기의 인-지질 이중막 구조의 나노입자로서, 양전하를 띄도록 개질된 지질을 이용하여 음하전인 유전자 또는 RNA 핵산 물질과 복합체를 형성한다. 유전자와 복합체를 형성한 리포좀은 통상적인 정맥내 투여나 근육내 투여를 통해 체내로 투여되고, 리포좀-유전자 복합체는 탐식작용에 의해 세포내로 전달되며 엔도솜에서 리소좀으로 1차 전달된 다음 세포질로 빠져나온다. 리소좀에서 핵산물질이 분해되기 전에 엔도솜에서 세포질로의 방출(endosomal escape)을 유도하면 세포질로 전달되는 유전자의 전달 효율을 증가시킬 수 있다. 최근에는 DNA 백신 조성물을 소형 전기천공장치를 이용하여 비가역적 전기천공법을 적용하여 인체의 근육에 직접 주입하는 방법이 사용되고 있다.In addition, gene delivery methods used in gene therapy using the above-described DNA expression vectors may include electroporation, a gene gun, ultrasound microbubble therapy, magnetofection, and transfection using vectors such as gold or silica nanoparticles, cationic polymers, liposomes, and exosomes. These gene delivery methods are well known in the industry (Ramamoorth and Narvekar, J. Clin. Diagn. Res., 9(1): GE01-GE106, 2015). Among the above-described non-viral expression vectors, nano-sized particles such as nanoparticles, cationic polymers, liposomes, and exosomes can be administered using conventional administration methods such as intramuscular administration, intravenous administration, and subcutaneous administration, and electroporation, gene gun, and ultrasound microbubble therapy can be administered locally into the muscle. Liposomes, in particular, are widely used non-viral vectors. They are nanoparticles with a phospho-lipid bilayer structure, 100–400 nm in size, mainly composed of cationic lipids. These lipids are modified to be positively charged, forming a complex with negatively charged genes or RNA nucleic acids. Liposomes complexed with genes are administered intravenously or intramuscularly. The liposome-gene complex is then transported into cells by phagocytosis, first from endosomes to lysosomes, and then released into the cytoplasm. Inducing endosomal escape from endosomes before the nucleic acid is degraded in the lysosomes can increase the delivery efficiency of the genes delivered into the cytoplasm. Recently, a method has been used to directly inject DNA vaccine compositions into human muscles using irreversible electroporation using a miniature electroporation device.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 아데노부속바이러스(AAV) 벡터의 혈청형(serotype)은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 또는 AAV16일 수 있다.Additionally, in one embodiment of the present invention, the serotype of the adeno-associated virus (AAV) vector may be AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, or AAV16.
또한, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 비바이러스성 벡터는 DNA 벡터, 나노입자, 양이온성 폴리머, 엑소좀, 세포외 소포 또는 리포솜일 수 있고 상기 DNA 벡터는, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 파지미드 벡터 또는 인공 인간 염색체일 수 있다.Additionally, in one embodiment of the present invention, the non-viral vector may be a DNA vector, a nanoparticle, a cationic polymer, an exosome, an extracellular vesicle or a liposome, and the DNA vector may be a plasmid vector, a cosmid vector, a phagemid vector or an artificial human chromosome.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용 부위, 처리횟수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 1 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.In one embodiment of the present invention, the effective amount of the beta-amyloid peptide, the polynucleotide encoding the peptide, or the expression vector comprising the polynucleotide may vary depending on the type of the patient's affected area, the application site, the number of treatments, the treatment time, the formulation, the patient's condition, the type of supplement, etc. The amount used is not particularly limited, but may be 0.01 μg/kg/day to 1 mg/kg/day. The daily amount may be administered once a day, or divided into 2 to 3 times a day at appropriate intervals, or intermittently at intervals of several days.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터는 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 100 중량%로 함유될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the beta-amyloid peptide, the polynucleotide encoding the peptide, or the expression vector including the polynucleotide may be contained in an amount of 0.1 to 100 wt% based on the total weight of the composition.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth), 젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients, and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. In addition, solid or liquid formulation additives may be used in the manufacture of the pharmaceutical composition. The formulation additives may be either organic or inorganic. Examples of excipients include lactose, sucrose, sucrose, glucose, cornstarch, starch, talc, sorbitol, crystalline cellulose, dextrin, kaolin, calcium carbonate, and silicon dioxide. Examples of binders include polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, ethyl cellulose, methyl cellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, shellac, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, calcium citrate, dextrin, and pectin. Examples of lubricants include magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, and hydrogenated vegetable oils. Any colorant approved for use in pharmaceuticals may be used. Tablets and granules of these may be coated with sugar, gelatin, or other appropriate coatings as needed. Furthermore, preservatives and antioxidants may be added as needed.
본 발명의 약학적 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in any formulation commonly manufactured in the art, and the form of the preparation is not particularly limited.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.When formulating, it can be prepared using diluents or excipients such as fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants that are commonly used. Solid preparations for oral administration can include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations can be prepared by mixing one or more compounds with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여할 수 있으며, 신속한 효과를 위하여 비경구 투여하는 것이 바람직하며, 척수강에 척수관 주사되는 것이 더 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두 개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 상기 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally, and parenterally administration is preferred for rapid effect, and spinal injection into the spinal canal is more preferred. In case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, intramuscular injection, intra-articular injection, intra-synovial injection, intrathecal injection, intrahepatic injection, intralesional injection, or intracranial injection. The appropriate dosage of the pharmaceutical composition may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 만성통증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving chronic pain disease, comprising as an active ingredient a beta-amyloid peptide having an amino acid sequence of sequence number 1, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector including the polynucleotide.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "improvement" means any action that at least reduces a parameter related to the condition being treated, for example, the severity of a symptom.
이때, 상기 건강기능식품 조성물은 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.At this time, the health functional food composition may be used simultaneously with or separately from a drug for treatment before or after the onset of the disease in order to prevent or improve the disease.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적 (예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 바람직하게 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.In the health functional food composition of the present invention, the active ingredient may be added directly to a food or used in combination with other foods or food ingredients, and may be used appropriately according to a conventional method. The amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the intended use (prevention or improvement). Generally, when manufacturing a food or beverage, the composition of the present invention may be added in an amount of preferably 15% by weight or less, and preferably 10% by weight or less, relative to the raw material. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be below the above range.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들면, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.The health functional food composition of the present invention, in addition to containing the above-described effective ingredient, may contain other ingredients as essential ingredients without particular limitation. For example, it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, as in conventional beverages. Examples of the above-described natural carbohydrates include conventional sugars such as monosaccharides, such as glucose, fructose, etc.; disaccharides, such as maltose, sucrose, etc.; and polysaccharides, such as dextrin, cyclodextrin, etc.; and sugar alcohols, such as xylitol, sorbitol, erythritol, etc. In addition to the above-described flavoring agents, natural flavoring agents (thaumatin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of the above-described natural carbohydrates can be appropriately determined by those skilled in the art.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.In addition to the above, the health functional food composition of the present invention may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc. These ingredients may be used independently or in combination, and the ratio of these additives may also be appropriately selected by those skilled in the art.
“베타아밀로이드”, “만성통증성 질환”, “예방” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.“Beta-amyloid,” “chronic pain disease,” and “prevention” may fall within the aforementioned scope.
또한, 본 발명은 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 조성물의 약학적으로 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 만성통증성 질환의 치료 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for treating a chronic pain disease, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a composition comprising a beta-amyloid peptide, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector comprising the polynucleotide as an active ingredient.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 말초신경병증 또는 만성통증을 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The term "pharmaceutically effective amount" in the present invention means an amount sufficient to suppress or alleviate peripheral neuropathy or chronic pain at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical use, and the effective dosage level can be determined according to factors including the type and severity of the individual, age, sex, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, concurrently used drugs, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered singly or in multiple doses. It is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with the minimum amount without side effects by taking all of the above factors into consideration, and it can be easily determined by a person skilled in the art.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 말초신경병증 관련 질환 또는 만성통증이 발병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 말초신경병증 관련 질환 또는 만성통증을 완화 또는 치료할 수 있다.The term "subject" in the present invention refers to any animal, including humans, that is susceptible to, or has developed, a peripheral neuropathy-related disease or chronic pain. By administering the composition of the present invention to a subject, peripheral neuropathy-related disease or chronic pain can be alleviated or treated.
본 발명에서 용어, "완화"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 말초신경병증 관련 질환 또는 만성통증이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.In the present invention, the term “alleviation” refers to any action that improves or benefits peripheral neuropathy-related diseases or chronic pain by administering a composition according to the present invention.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.In the present invention, the term "administration" refers to introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a subject by any appropriate method, and the route of administration may be through various routes, such as oral or parenteral, as long as it can reach the target tissue.
또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.In addition, an appropriate dosage and frequency of administration can be selected according to a method known in the art, and the amount and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention actually administered can be appropriately determined by various factors such as the type of symptom to be treated, administration route, gender, health condition, diet, age and weight of the subject, and severity of the disease.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 방법은 투여하는 단계 전에 상기 환자를 통증의 완화 및/또는 치료가 필요한 환자로 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the method may further comprise, prior to the administering step, a step of identifying the patient as a patient in need of pain relief and/or treatment.
“베타아밀로이드”, “만성통증성 질환”, “예방”, “치료” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.“Beta-amyloid”, “chronic pain disease”, “prevention”, “treatment”, etc. may fall within the scope mentioned above.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 만성통증성 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of the pharmaceutical composition for preventing or treating chronic painful diseases.
또한, 본 발명은 만성통증성 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터의 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of a beta-amyloid peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 for producing a drug for treating a chronic pain disease, a polynucleotide encoding the peptide, or an expression vector comprising the polynucleotide.
또한, 본 발명은 만성통증성 질환 치료용 약제를 제조하기 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 베타아밀로이드(beta-amyloid) 펩타이드, 상기 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리 뉴클레오타이드를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of a beta-amyloid peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a polynucleotide encoding the peptide, or a composition comprising the polynucleotide for manufacturing a drug for treating a chronic pain disease.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to aid in understanding the present invention. However, the following examples are provided solely to facilitate a better understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
[실시예][Example]
본 발명의 모든 행동 실험에서 사용한 동물의 개체수는 각 군당 5마리를 실험에 사용하였다.In all behavioral experiments of the present invention, five animals were used per group.
실시예 1. 만성 신경결찰 신경병증(Chronic Constriction Injury, CCI) 마우스 모델의 제조Example 1. Preparation of a mouse model of chronic constriction injury (CCI) neuropathy.
본 발명에서 만성 신경결찰(Chronic Constriction Injury, CCI)동물모델을 제조하였다. 구체적으로 7주령의 C57BL6 수컷 마우스를 ㈜오리엔트바이오사로부터 구입하여 동물 실험실 사육환경에서 1주간 적응기간을 거친 후, 1회에 거쳐 기계적 자극(von-Frey test) 장비를 이용하여 오른쪽 뒷발바닥 자극반응에 대한 역치를 결정하였다. 그 후, 실험군을 분리하였고(N=5 마우스/그룹), 척수신경 손상 수술을 진행하였다. 먼저, 식약처에서 허가 받은 마취제인 이소플루레인(isoflurane 0.5% 3분)을 흡입마취시킨 상태에서 마우스 등의 피부를 절개하여 다섯번째 척수신경(L4 spinal nerve)에 실크실 2가닥으로 신경을 결찰하였고 상기 절개된 근육 및 피부는 외과용 실로(surgical silk)로 봉합하였다.In the present invention, a chronic constriction injury (CCI) animal model was prepared. Specifically, 7-week-old C57BL6 male mice were purchased from Orient Bio Co., Ltd. and acclimated to an animal laboratory environment for one week. After that, the threshold for the stimulation response to the right hind paw was determined once using a mechanical stimulus (von-Frey test) device. Thereafter, the experimental group was separated (N=5 mice/group), and spinal nerve injury surgery was performed. First, under inhalation anesthesia with isoflurane (isoflurane 0.5% for 3 minutes), an anesthetic approved by the Ministry of Food and Drug Safety, the skin on the back of the mouse was incised, and the L4 spinal nerve was ligated with two strands of silk thread. The incised muscles and skin were then sutured with surgical silk.
실시예 2. 기계적 통각 과민화 측정Example 2. Measurement of mechanical hyperalgesia
마우스를 3일 동안 2시간씩 밑이 뚫려 있는 챔버 안에 넣어두어 안정화 과정을 거친다. 척수신경 손상 마우스 모델을 만들기 전 기계적 통각 측정 장비(von-Frey filament)를 기계적 자극에 대한 기본통증 반응 역치값을 측정한다. 마우스의 오른쪽 뒷발바닥에 기계적 자극을 개체 당 최소 1분 이상의 간격으로 3번씩 가하고 회피반응을 보인 필라멘트의 값을 측정하여 그 평균값을 기계적 자극에 대한 통각 역치반응 값으로 제시하였다. 기본 통증반응 값을 측정한 후, 전체 개체의 평균값을 기준으로 각 개체의 반응값 변화율을 계산하여 전체 평균값 50% 범위 안에 속한 개체들을 선별하였다. 선별된 개체들만을 이용하여 신경병증성 통증모델을 제작하고 신경손상 후 매일 위와 같은 조건으로 기계적 통각 과민반응을 측정하였다. 이후, 신경병증성 통증 동물모델을 임의적으로 두 그룹으로 나누고 인간 또는 마우스 조합 베타아밀로이드 또는 생리식염수를 척수강 내로 투여한 후, 기계적 통각 반응의 진통효과를 평가하였다. 실험그룹에 대해 암맹상태인 연구자가 기계적 통각 반응을 측정했으며, 계획된 통각 반응평가시험이 종료된 후, 약물 투여군의 정보를 이용하여 결과를 분석하고 통계처리를 수행하였다.Mice were placed in a chamber with an open bottom for 2 hours each day for 3 days to stabilize. Before establishing a mouse model of spinal cord injury, a mechanical nociceptive device (von-Frey filament) was used to measure the baseline pain threshold to mechanical stimulation. Mechanical stimulation was applied to the right hind paw of each mouse three times at intervals of at least 1 minute. The value of the filament that elicited an avoidance response was measured, and the average value was presented as the pain threshold response to mechanical stimulation. After measuring the baseline pain response, the percentage change in response for each individual was calculated based on the average of all individuals, and individuals within 50% of the overall average were selected. A neuropathic pain model was created using only these individuals, and mechanical hyperalgesia was measured daily under the same conditions after nerve injury. The neuropathic pain animal models were then randomly divided into two groups and administered intrathecally human or mouse combination beta-amyloid or saline, and the analgesic effect of mechanical nociceptive responses was evaluated. A researcher blinded to the experimental group measured the mechanical pain response, and after the planned pain response evaluation test was completed, the results were analyzed and statistically processed using information from the drug administration group.
실시예 3. 척수강내 약물투여Example 3. Intrathecal drug administration
척수강 내 약물 투여를 위해서 이소플루레인(Isoflurane) 흡입마취 하에 주사기를 이용하여 약물을 직접 척수 강 내로 투여하였다. Hamilton 주사기에 30 게이지의 바늘을 연결하고 베타아밀로이드 또는 saline을 채운 다음 5번과 6번 척추 뼈 사이 공간으로 베타아밀로이드를 투여하였다.For intrathecal drug administration, the drug was administered directly into the spinal canal using a syringe under isoflurane inhalation anesthesia. A 30-gauge needle was attached to a Hamilton syringe, filled with beta-amyloid or saline, and beta-amyloid was injected into the space between the fifth and sixth vertebrae.
척수강 내 투여하는 베타아밀로이드는 1% NH4OH의 증류수 스톡(stock) 용액을 제작하고 최종 0.1% NH4OH 생리 식염수용액이 되도록 희석시킨 후 최종 척수강 투여 용액은 2μg/10μl의 농도로 주사하였다.Beta-amyloid for intrathecal administration was prepared as a 1% NH4OH distilled water stock solution, diluted to a final 0.1% NH4OH saline solution, and the final intrathecal administration solution was injected at a concentration of 2 μg/10 μl.
실시예 4. 마우스 감각신경세포의 배양Example 4. Culturing of mouse sensory neurons
본 발명자들은 마우스에서 척수 후근신경절(dorsal root ganglion, DRG)로부터 감각신경세포를 1차 배양하였다. 구체적으로, 생후 6~8주 C57BL/6 마우스를 3분 동안 이소플루레인으로 마취시키고, 70% 에탄올로 소독한 뒤, 등 부위를 절개하였다. 그 후 모든 부위의 척수 DRG를 해부하였고, 10X HBSS와 10 mM HEPES가 혼합된 용액에 넣었다(Wood et al., J. Neurosi. 8: pp3208-3220, 1988).We performed a primary culture of sensory neurons from the dorsal root ganglion (DRG) of the mouse spinal cord. Specifically, 6-8 week-old C57BL/6 mice were anesthetized with isoflurane for 3 minutes, disinfected with 70% ethanol, and the dorsal region was incised. Spinal DRGs from all regions were dissected and placed in a solution containing 10X HBSS and 10 mM HEPES (Wood et al., J. Neurosi. 8: pp. 3208-3220, 1988).
그 후 상기 후근신경절을 200 U/ml 콜라게네이즈(collagenase A) 및 0.25 mg/ml 디스페이즈(dispase Ⅱ)를 혼합한 용액에서 배양하였고 10% 우태아혈청을 첨가한 고 포도당 DMEM 배지로 1회 이상 세정하였으며, 파이어 폴리쉬 파스테르 파이펫을 이용하여 분쇄하였다. 이어서 폴리-디-라이신(poly-D-lyrine)이 코팅되어있는 커버슬립에 평균 100-300개의 세포를 분주하였고 1시간 배양 후, 세포 배양 배지와 동일한 10% 소 혈청, 1% 페니실린 스트렙토마이신(penicillin streptomycin), 1X B27서플리먼트를 첨가한 뉴로바잘(Neurobasal)의 조건으로 최대 2-3일까지 배양하였다.Afterwards, the dorsal root ganglia were cultured in a solution containing 200 U/ml collagenase A and 0.25 mg/ml dispase II, washed at least once with high-glucose DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum, and triturated using a fire-polish Pasteur pipette. Then, an average of 100-300 cells were seeded on poly-D-lyrine-coated coverslips, and after 1 hour of culture, they were cultured for up to 2-3 days under the same conditions as the cell culture medium, Neurobasal supplemented with 10% bovine calf serum, 1% penicillin streptomycin, and 1X B27 supplement.
실시예 5. 바이러스 벡터의 제조Example 5. Preparation of viral vectors
본 발명자들은 베타아밀로이드 유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 제조하고자 하였다. 구체적으로, 신경세포로의 감염 및 감염된 세포에서 베타아밀로이드의 상시 발현을 유도하기 위해 AAV5 serotype과 CMV 프로모터를 선택했다. AAV5 벡터에 베타아밀로이드 유전자를 실어서 바이러스 벡터를 생산한 후 뉴클레오타이드 시퀀싱을 통해 정상적인 베타아밀로이드 유전자의 삽입을 검증했으며 그리고 테스트한 베타아밀로이드 발현 바이러스의 titer는 1.22 × 1013GC/㎖ 이었다.The present inventors aimed to produce a viral vector containing the beta-amyloid gene. Specifically, the AAV5 serotype and the CMV promoter were selected to induce infection of neurons and constitutive expression of beta-amyloid in infected cells. After producing a viral vector by carrying the beta-amyloid gene into the AAV5 vector, insertion of the normal beta-amyloid gene was verified through nucleotide sequencing, and the titer of the tested beta-amyloid-expressing virus was 1.22 × 1013 GC/㎖.
실시예 6. SiRNA를 이용한 FCgammaR2b2 결핍 실험Example 6. FCgammaR2b2 depletion experiment using siRNA
신경병증성 통증모델에서 베타아밀로이드의 수용체로 고려되는 FCgammaR2b2를 유전자적으로 결핍시키기 위해서 SiRNA를 활용하였다. 구체적으로 SiRNA를 이용한 Knockdown 행동 실험을 위해 FCgammaR2b small-interfering RNA(siRNA, BIONEER)를 주문 제작하여 구입하였다.To genetically induce deficiency of FCgammaR2b2, a receptor for beta-amyloid, in a neuropathic pain model, siRNA was used. Specifically, FCgammaR2b small-interfering RNA (siRNA, BIONEER) was custom-manufactured and purchased for behavioral knockdown experiments using siRNA.
마우스 FCgammaR2b-siRNA(표적서열: sense-CUAGUAUCCUUGGUCUAUC, antisense-GAUAGACCAAGGAUACUAG)의 in-vivo 형질감염을 위해 7μg Lipofectamine 2000(Invitrogen)에 3μg siRNA와 5% D-glucose를 혼합하여 반응하도록 5분 동안 실온에 보관 후 쥐의 척수의 요추 L5번 L6번에 31게이지 주사기로 10μl 주입하였다. 형질 감염을 위해 3일간 주입하였고 하루 공백을 두고 휴식 이후 베타아밀로이드 척수강 내 투여 후 행동실험을 진행하였다.For in vivo transfection of mouse FCgammaR2b-siRNA (target sequence: sense-CUAGUAUCCUUGGUCUAUC, antisense-GAUAGACCAAGGAUACUAG), 7 μg Lipofectamine 2000 (Invitrogen) was mixed with 3 μg siRNA and 5% D-glucose. The mixture was allowed to react for 5 minutes at room temperature, and then 10 μl was injected into lumbar vertebrae L5 and L6 of the spinal cord of mice using a 31-gauge syringe. Transfection was performed for 3 days, followed by a 1-day rest period. After intrathecal administration of beta-amyloid, behavioral tests were conducted.
실시예 7. 조직면역학적 염색Example 7. Histoimmunological staining
본 발명자들은 척수에서 신경교세포의 활성화 정도를 신경병증성 통증그룹과 베타아밀로이드 처리한 신경병증성 통증그룹과 비교하기위해 조직면역염색을 수행하였다. 구체적으로, 실험동물에 펜토바르비탈 소듐(60㎎/㎏)을 복강으로 주사하여 마취하였다. 30㎖ 주사기에 0.9% NaCl 용액 30㎖을 채운 다음, 심장의 우심방 쪽을 절개하고 주사기를 좌심실에 찔러서 혈액을 제거하였다. 이어서 10% 포르말린 용액 30㎖을 좌심실로 투여하여 고정작업을 수행한 후 척수조직을 샘플링 하였다. 떼어낸 척수조직을 10% 포르말린 용액에 16시간 동안 담가 추가 고정작업을 진행하였고, 이후 30% sucrose 용액으로 조직을 옮겨서 이틀 동안 탈수과정을 진행하였다. 이후, 척수조직을 -20℃에서 얼린 다음 12㎛ 두께로 절편조직을 만들었다. Tubulin 항체(Santa Cruz, USA)를 0.1 M PBS 용액에 1/100으로 희석하여 척수조직 절편에 24시간 동안 처리하였고, 0.1 M PBS로 세척작업 후 공초점 현미경을 이용하여 형광이미지를 캡처하였다.To compare the degree of glial cell activation in the spinal cord between neuropathic pain groups and beta-amyloid-treated neuropathic pain groups, we performed tissue immunostaining. Specifically, experimental animals were anesthetized with an intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (60 mg/kg). A 30-mL syringe was filled with 30 mL of 0.9% NaCl solution. The right atrium of the heart was incised, and the left ventricle was punctured to remove blood. Subsequently, 30 mL of 10% formalin solution was injected into the left ventricle for fixation, and spinal cord tissue was sampled. The isolated spinal cord tissue was further fixed in 10% formalin for 16 hours, and then transferred to a 30% sucrose solution for dehydration for two days. The spinal cord tissue was then frozen at -20°C and sectioned into 12-μm-thick sections. Tubulin antibody (Santa Cruz, USA) was diluted 1/100 in 0.1 M PBS solution and treated on spinal cord tissue sections for 24 hours. After washing with 0.1 M PBS, fluorescence images were captured using a confocal microscope.
실험예 1. 베타아밀로이드 또는 이의 단편 펩타이드 처리에 따른 말초신경병증 또는 통증 경감 효과 확인Experimental Example 1. Confirmation of the effect of peripheral neuropathy or pain relief following treatment with beta-amyloid or its fragment peptide.
먼저, 신경병증 통증모델을 제작 11일 후 통증에 대한 민감도가 증가하여 통증역치가 0.5g 이하로 감소한 것을 확인한 후 본 발명에 따른 베타아밀로이드를 척수강내로 1회 투여하고 기계적 통증반응 양상을 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 그 결과 대조군, 베타아밀로이드 1-40과 비교하여 본 발명의 베타아밀로이드 1-42 처리한 군에서 기계적 통증을 억제하여 통증역치가 대조군의 80%까지 증가하는 것으로 나타났으며 그 효과는 베타아밀로이드 투여 10일까지 통증역치를 증가시켰다(도 1).First, after 11 days of producing a neuropathic pain model, it was confirmed that the sensitivity to pain increased and the pain threshold decreased to 0.5 g or less. Then, the beta-amyloid according to the present invention was administered intrathecally once and the mechanical pain response pattern was confirmed, and the result is shown in Fig. 1. As a result, compared to the control group and beta-amyloid 1-40, the group treated with beta-amyloid 1-42 of the present invention was found to suppress mechanical pain and increase the pain threshold to 80% of the control group, and the effect increased the pain threshold for up to 10 days of beta-amyloid administration (Fig. 1).
다음으로, 본 발명에 따른 베타아밀로이드 1-40과 1-42를 척수강내로 투여하기 전에 수술 14일 후에 생리식염수에 의한 통증반응 양상을 확인하였고 16일차에 베타아밀로이드를 척수강 내로 투여한 후 측정한 통증반응 양상을 확인하였다. 그 결과 생리식염수에 대한 통증반응 변화는 관찰되지 않았으며, 이후 투여한 베타아밀로이드 1-42 그룹에서만 통증이 억제되는 현상을 확인하였다(도 2).Next, before intrathecal administration of beta-amyloid 1-40 and 1-42 according to the present invention, the pain response pattern to saline was confirmed 14 days after surgery, and the pain response pattern measured after intrathecal administration of beta-amyloid on the 16th day was confirmed. As a result, no change in the pain response to saline was observed, and it was confirmed that pain was suppressed only in the beta-amyloid 1-42 group administered thereafter (Fig. 2).
다음으로, 본 발명에 따른 베타아밀로이드(1-42) 또는 이의 단편 펩타이드(베타아밀로이드17-42)를 척수강내로 투여한 후 통증반응 양상을 확인하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과 베타아밀로이드 17-42를 투여한 그룹에서는 통증의 변화가 관찰되지 않았다(도 3).Next, the pain response pattern was confirmed after intrathecal administration of beta-amyloid (1-42) or a fragment peptide thereof (beta-amyloid 17-42) according to the present invention, and the results are shown in Fig. 3. As a result, no change in pain was observed in the group administered beta-amyloid 17-42 (Fig. 3).
다음으로, 본 발명에 따른 정상 마우스에서 베타아밀로이드1-42의 급성 통증에 대한 효과를 확인한 결과 급성 기계적 통증에 대한 영향은 통계적으로 유의한 차이가 없음을 확인하였다(도 4).Next, the effect of beta-amyloid 1-42 on acute pain in normal mice according to the present invention was confirmed, and it was confirmed that there was no statistically significant difference in the effect on acute mechanical pain (Fig. 4).
이상의 결과를 종합하면, 베타아밀로이드 1-42 또는 이의 단편 펩타이드가 척수후각에 작용하여 신경병증성 통증을 오랜 기간(10일 이상) 억제하고 정상 개체의 통증에는 유의미한 변화를 주지 않음을 확인하였고, 이는 말초신경병증 또는 만성통증을 치료 효과가 있음을 나타낸다.In summary, the above results show that beta-amyloid 1-42 or its fragment peptide acts on the dorsal horn of the spinal cord to suppress neuropathic pain for a long period of time (more than 10 days) and does not cause significant changes in pain in normal individuals, indicating that it is effective in treating peripheral neuropathy or chronic pain.
실험예 2. 신경병증성 통증모델에서 베타아밀로이드 수용체 FCgammaR2b2의 증가Experimental Example 2. Increase in the beta-amyloid receptor FCgammaR2b2 in a neuropathic pain model.
척수 후각, 전각, 그리고 척수후근 신경절에서 베타아밀로이드 수용체로 알려진 FCgammaR(1, 2b1, 2b2, 3)의 발현여부를 확인하고, 신경병증성 모델에서 이들 수용체의 발현변화 결과를 도 5와 도 6에 나타내었다. FCgammaR1은 검사한 조직에서 없었으며, FCgammaR2b1, 2b2, 3는 모두 관찰되었다(도 5). 신경병증성 통증모델에서 이들 수용체 중 FCgammaR2b2와 3가 증가하였으며(도 6), 이들 중 FCgammaR2b2는 베타아밀로이드의 수용체로 알려져 있다(Kam et al., J Clin Invest. 123(7):2791-802, 2013).The expression of FCgammaR (1, 2b1, 2b2, 3), known as beta-amyloid receptor, was confirmed in the dorsal horn, anterior horn, and dorsal root ganglion of the spinal cord, and the results of changes in the expression of these receptors in a neuropathic model are shown in Figs. 5 and 6. FCgammaR1 was absent in the examined tissues, while FCgammaR2b1, 2b2, and 3 were all observed (Fig. 5). Among these receptors, FCgammaR2b2 and 3 were increased in the neuropathic pain model (Fig. 6), and among them, FCgammaR2b2 is known as a receptor for beta-amyloid (Kam et al., J Clin Invest. 123(7):2791-802, 2013).
다음으로 베타아밀로이드 수용체로 고려되는 FCgammaR2b2를 일시적으로 유전자 조작(SiRNA knock down)을 통해 결핍시킨 후 베타아밀로이드 1-42의 효과를 확인하였다(도 6). FCgammaR2b2를 유전자적으로 결핍시킨 마우스를 제작하기 위해서 신경결찰 9일, 10일, 11일차에 FCgammaR2b2에 대한 SiRNA를 척수강 내로 투여하였으며, 비교군에는 비히클(vehicle)만 척수강 내로 투여하였다. 13일차에 척수강 내로 투여된 베타아밀로이드1-42는 FCgammaR2b2가 유전자 결핍된 신경병증성 통증모델에서 기계적 통증을 억제시키는 현상이 관찰되지 않았으며 비히클만 투여된 그룹에서는 통증이 억제되었다.Next, FCgammaR2b2, which is considered a beta-amyloid receptor, was temporarily genetically engineered (siRNA knock down) to be deficient, and the effect of beta-amyloid 1-42 was confirmed (Fig. 6). To create mice genetically deficient in FCgammaR2b2, SiRNA against FCgammaR2b2 was administered intrathecally on days 9, 10, and 11 after nerve ligation, and only the vehicle was intrathecally administered to the control group. On day 13, beta-amyloid 1-42 intrathecally administered did not suppress mechanical pain in the FCgammaR2b2-deficient neuropathic pain model, while pain was suppressed in the group administered only the vehicle.
실험예 3. 신경병증성 통증모델에서 신경교세포 활성화에 대한 베타아밀로이드의 영향Experimental Example 3. Effect of beta-amyloid on glial cell activation in a neuropathic pain model.
신경병증성 통증은 척수내 신경교세포의 활성화에 의하여 나타나므로 베타아밀로이도가 신경교세포의 활성화를 억제하여 진통작용을 나타낼 수 있다.Since neuropathic pain is caused by the activation of glial cells in the spinal cord, beta-amyloid can exert an analgesic effect by inhibiting the activation of glial cells.
본 발명에서는 신경병증성 통증모델의 성상교세포와 미교세포 활성화 정도를 평가하고 베타아밀로이드가 이들 신경교세포 활성화 정도를 확인하였다. 신경손상 받은 측의 신경교세포 발현양상은 GFAP로 신경교세포의 발현정도를 Iba으로 미교세포의 발현정도를 파악하였다.In the present invention, the degree of astrocyte and microglia activation in a neuropathic pain model was assessed, and the degree of glial cell activation was confirmed by beta-amyloid. The expression pattern of glial cells on the nerve-injured side was determined using GFAP for glial cells and Iba for microglia.
그 결과, 신경손상 받은 측은 신경손상 받지 않은 측에 비해 신경교세포와 미교세포의 발현이 증가되었으며, 신경병증성 모델과 베타아밀로이드로 척수강내로 투여한 그룹간에서 이들의 발현양상은 차이가 없었다. 따라서 베타아밀로이드는 척수 신경교세포의 활성화 억제를 통한 진통 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다.As a result, the nerve-damaged side showed increased expression of glial cells and microglia compared to the undamaged side, and there was no difference in the expression patterns of these cells between the neuropathic model and the group intrathecally administered beta-amyloid. Therefore, it can be seen that beta-amyloid can exert an analgesic effect by inhibiting the activation of spinal glial cells.
실험예 4. 신경병증성 통증모델에서 바이러스벡터를 이용한 베타아밀로이드의 영향Experimental Example 4. Effects of beta-amyloid using a viral vector in a neuropathic pain model.
본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 바이러스 벡터 AAV5-베타아밀로이드가 신경병증성 통증 동물모델에서 진통 효과를 나타내는지 여부를 확인하고자 하였다. 신경병증성 통증모델을 제작 3일 전 1.22×1011GC/㎖ 농도의 베타아밀로이드 바이러스 벡터 5㎕를 척수 강 내 주사하고, 30일까지 기계적 통증에 대한 역치를 평가하였다.In accordance with one embodiment of the present invention, we sought to determine whether the viral vector AAV5-beta-amyloid produced exhibits an analgesic effect in a neuropathic pain animal model. Three days before the creation of the neuropathic pain model, 5 μl of the beta-amyloid viral vector at a concentration of 1.22×1011 GC/㎖ was injected intrathecally, and the threshold for mechanical pain was evaluated for up to 30 days.
그 결과, 본 발명의 AAV5-베타아밀로이드를 투여함에 따라 기계적 통증 과민화 현상이 억제되는 것을 확인하였다(도 8).As a result, it was confirmed that the phenomenon of mechanical pain hypersensitivity was suppressed by administering the AAV5-beta amyloid of the present invention (Fig. 8).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only. Those skilled in the art will readily appreciate that modifications to other specific embodiments can be made without altering the technical spirit or essential characteristics of the present invention. Therefore, the embodiments described above should be understood as illustrative in all respects and not restrictive.
[염기서열 프리텍스트][Base sequence pretext]
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University)<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University)
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chronic pain comprising beta amyloid or peptide fragment thereof chronic pain comprising beta amyloid or peptide fragment thereof
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