KR102829113B1 - Pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative disc disease comprising extract of Raphanus sativus seed as an active ingredient - Google Patents
Pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative disc disease comprising extract of Raphanus sativus seed as an active ingredientDownload PDFInfo
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Abstract
Translated fromKoreanDescription
Translated fromKorean본 발명은 내복자 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative disc disease, comprising an extract of the plant as an effective ingredient.
추간판(椎間板, intervertebral disc, IV)은 척추의 추골 사이에서 척추골간의 압축, 비틀림, 및 굽힘 등을 전달하거나 감쇠시키는 일종의 복합재료로, 수핵 (nucleus pulposus), 섬유륜 (annulus fibrosus), 및 종판 (end-plate) 등으로 구성되어 있다. 나이가 들면서 정상적인 노화 과정, 반복적인 외상, 흡연 등으로 인해 척추뼈와 척추뼈 사이에 존재하는 추간판(디스크)의 퇴행성 변화가 진행될 경우 디스크 내 수분 함량이 감소하고 탄력성과 충격흡수능력을 잃고 척추뼈 사이의 간격이 좁아지면서 만성적인 허리 통증을 유발하는 퇴행성 디스크 질환(degenerative disc disease)이 발생하게 된다.The intervertebral disc (IV) is a type of composite material that transmits or damps compression, twisting, and bending between the vertebrae of the spine, and is composed of the nucleus pulposus, annulus fibrosus, and end plates. As we age, degenerative changes in the intervertebral disc (disk) located between the vertebrae progress due to the normal aging process, repetitive trauma, smoking, etc., the moisture content inside the disc decreases, its elasticity and shock absorption ability are lost, and the space between the vertebrae narrows, causing degenerative disc disease that causes chronic back pain.
수핵은 추간판 중앙에 있는 젤리 같은 물질로, 콜라겐, 피브릴, 프로테오글리칸응집체 및 수핵세포로 구성되어 압축 하중 하에서 각 디스크 내 유압을 모든 방향으로 분배하는 기능을 하는데, 추간판 퇴행의 과정은 추간판 내부의 수핵세포에서 시작된다. 수핵세포는 혈관 공급이 제한된 환경에 존재하면서 혐기성 해당작용을 통해 에너지를 생성하며, 나이가 들어감에 따라 수핵세포도 노화되면서 세포고사(Apoptosis)와 세포괴사(Necrosis)로 인한 손실세포를 대체하고 증식하는 능력을 상실하게 된다. 그리고 노화된 수핵세포의 감소된 동화 작용 또는 증가된 이화 작용은 디스크 변성을 촉진하게 된다.The nucleus pulposus is a jelly-like substance in the center of the intervertebral disc, composed of collagen, fibrils, proteoglycan aggregates, and nucleus pulposus cells. It functions to distribute hydraulic pressure in all directions within each disc under compressive load, and the process of intervertebral disc degeneration begins in the nucleus pulposus cells inside the intervertebral disc. Nucleus pulposus cells exist in an environment with limited vascular supply and generate energy through anaerobic glycolysis, and as they age, nucleus pulposus cells also age, losing the ability to replace and proliferate cells lost due to apoptosis and necrosis. And the decreased anabolic action or increased catabolic action of aged nucleus pulposus cells promotes disc degeneration.
최근 퇴행성 디스크 질환의 치료를 위하여 수술적 치료 또는 증상을 유발하는 신경이나 그 주변 부위에 항염 및 부종 억제를 위한 약물을 투여하거나, 하이드로겔 등의 보형물을 섬유륜 위치에 삽입하여 수핵을 보충하는 등의 방법이 개발되고 있다. 그러나, 보다 근본적으로 추간판 수핵세포의 사멸을 억제하거나 증식유도를 통한 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 치료에 대한 연구는 미진한 실정이다.Recently, for the treatment of degenerative disc disease, surgical treatment or administering anti-inflammatory and anti-edema drugs to the nerves or surrounding areas causing symptoms, or inserting prosthetics such as hydrogels into the annulus fibrosus to supplement the nucleus pulposus, etc., have been developed. However, research on the prevention or treatment of degenerative disc disease through more fundamental inhibition of death of intervertebral disc nucleus pulposus cells or induction of proliferation is insufficient.
한편, 내복자는 십자화과에 속하는 일년생 초본으로 인도가 원산지인 무(Raphanus sativus L.) 또는 동속식물의 씨를 사용해 만든 약재이다. 한방에서는 냄새가 없고 맛은 맵고 달며 성질은 어느 한쪽으로 치우치지 않고 평하며, 음식을 소화시키고, 배가 불러오르는 창(脹)을 제거하고(소식제창(消食除脹)), 기(氣)를 내려 담(痰)을 삭이는(강기화담(降氣化痰)) 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 내복자 추출물의 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 치료 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.Meanwhile, Naebokija is an annual herb belonging to the cruciferous family, a medicinal herb made from the seeds of Raphanus sativus L., a native of India, or plants of the same genus. In oriental medicine, it is known to be odorless, have a spicy and sweet taste, and have a neutral nature without leaning to one side. It is known to have the effects of digesting food, eliminating bloating (소식제창), and lowering energy (氣) and eliminating phlegm (강기화담). However, nothing is known about the preventive or therapeutic effects of Naebokija extract on degenerative disc disease.
본 연구에서는 내복자 추출물을 과산화수소로 인간수핵세포의 사멸 및 퇴행이 유도된 체외 모델에서 세포사멸 및 퇴행관련인자들의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며 특히 세포자멸사와 관련된 인자인 lactate dehydrogenase (LDH) 효소, ,cleaved caspase-3 및 BAX의 발현이 감소한 것을 확인하였고 세포 생존과 죽음 사이의 균형을 유지하는 중요한 역할을 수행하는 단백질의 집합으로 BCL-2의 발현은 증가하였다. 또한, 대표적으로 디스크 퇴행과 관련된 인자인 Aggrecan, Col2a1, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP3 및 MMP13의 mRNA 발현조절을 확인하였으며, 특히 퇴행성 디스크 환자의 수핵 조직에서 발현이 크게 증가하여 디스크 퇴행을 유도하는 주요 단백질로 알려진 TREM2의 발현이 감소하는 것을 확인하여 본 발명의 내복자 추출물이 퇴행성 디스크 예방 및 치료에 효과가 있는 것을 확인하였다.In this study, it was confirmed that the extract of Naebaekja inhibited the expression of apoptosis and degeneration-related factors in an in vitro model in which human nucleus pulposus cells were killed and degenerated by hydrogen peroxide. In particular, it was confirmed that the expression of lactate dehydrogenase (LDH) enzyme, cleaved caspase-3 and BAX, which are factors related to apoptosis, was reduced, and the expression of BCL-2, a group of proteins that play an important role in maintaining the balance between cell survival and death, was increased. In addition, the regulation of mRNA expression of Aggrecan, Col2a1, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP3 and MMP13, which are representative factors related to disc degeneration, was confirmed. In particular, it was confirmed that the expression of TREM2, known as a major protein that significantly increases in the nucleus pulposus tissue of degenerative disc patients and induces disc degeneration, was reduced. Therefore, it was confirmed that the extract of Naebaekja of the present invention is effective in the prevention and treatment of degenerative disc.
본 발명의 목적은 내복자(Raphanussativus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데 있다.The purpose of the present invention is to provide a method for treating an underlying disease (RaphanusThe present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative disc disease, which contains an extract ofSativus sativus as an active ingredient.
본 발명은 내복자(Raphanussativus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for treating a patientwith a disease, such as an infection, a disease, or condition, comprising administering to theThe present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative disc disease, comprising an extract ofSativus sativus as an active ingredient.
본 발명에서 퇴행성 디스크 질환은 노화나 외상 등으로 인해 척추뼈와 척추뼈 사이에 존재하는 디스크(추간판)의 수핵이 사멸하고 퇴행 되어 나타나는 증상을 말하며 퇴행성 추간판, 또는 퇴행성 추간판 질환으로 지칭하며, 퇴행성 디스크 상태에서 수핵이 탈출되면 주변을 지나는 척추신경을 압박하여 흔히 허리디스크라고 불리는 요추 추간판 탈출증으로 발전되는 점에서 넓게는 허리디스크, 목디스크를 포함한다.In the present invention, degenerative disc disease refers to a symptom that occurs when the nucleus of the disc (intervertebral disc) existing between the vertebrae dies and degenerates due to aging or trauma, and is referred to as a degenerative intervertebral disc or degenerative intervertebral disc disease. In a degenerative disc condition, when the nucleus pulposus is herniated, it compresses the spinal nerves passing through the vicinity, developing into a herniated lumbar intervertebral disc, commonly called a lumbar disc, and thus broadly includes a lumbar disc and a cervical disc.
본 발명에서 내복자는 십자화과(十字花科, Cruciferae)에 속한 무(Raphanus sativus Linn
본 발명에서 내복자 추출물은 내복자를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출한 추출물일 수 있다.In the present invention, the extract of the plant may be an extract obtained by extracting the plant using water, C1 to C4 alcohol, or a mixed solution thereof as a solvent.
본 발명에서 내복자 추출물은 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~99.9중량%, 더 바람직하게는 0.001~70중량%, 가장 바람직하게는 0.001~50중량%로 하여 첨가될 수 있다.In the present invention, the extract of the internal organs may be added preferably in an amount of 0.001 to 99.9 wt%, more preferably in an amount of 0.001 to 70 wt%, and most preferably in an amount of 0.001 to 50 wt% based on the total weight of the pharmaceutical composition.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 내복자 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 산미제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The above pharmaceutical composition can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, solutions, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions, respectively, according to conventional methods. Carriers, excipients, and diluents that can be included in the above pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, sweeteners, and acidulants. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules, and these solid preparations are prepared by mixing the oral extract of the present invention with at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups, and in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, and acidulants can be included. Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories. Non-aqueous solutions and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. Suppository bases may include witepsol, macrogol, tween-61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 500㎎/㎏/일의 범위이다. 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이며, 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 200㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, sex, and body weight of the subject to be treated, the specific disease or pathological condition to be treated, the severity of the disease or pathological condition, the route of administration, and the judgment of the prescriber. The determination of the dosage based on these factors is within the level of those skilled in the art, and generally the dosage ranges from 0.01 mg/kg/day to about 500 mg/kg/day. A preferred dosage is from 0.1 mg/kg/day to 200 mg/kg/day, and a more preferred dosage is from 1 mg/kg/day to 200 mg/kg/day. The administration may be administered once a day or divided into several times. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 내복자 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, livestock, and humans by various routes. All modes of administration can be expected, and for example, it can be administered by oral, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine, intradural or intracerebrovascular injection, and skin application. The extract of the present invention has almost no toxicity and side effects, so it is a drug that can be used safely even for long-term use for preventive purposes.
본 발명은 내복자 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.The present invention provides a health functional food for preventing or improving degenerative disc disease, containing an extract of Naebaekja as an effective ingredient.
상기 건강기능식품은 내복자 추출물이 전체 식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001~99.9중량%, 더 바람직하게는 0.001~70중량%, 가장 바람직하게는 0.001~50중량%로 하여 첨가될 수 있다.The above health functional food may be added with the extract of the internal organs in an amount of preferably 0.001 to 99.9 wt%, more preferably 0.001 to 70 wt%, and most preferably 0.001 to 50 wt% relative to the total weight of the entire food.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.The above health functional food includes forms such as tablets, capsules, pills or liquids, and foods to which the extract of the present invention can be added include, for example, various foods, beverages, gum, tea, vitamin complexes, health functional foods, etc.
본 발명은 내복자 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 내복자 추출물이 퇴행성 디스크 시험관 모델에서 인간수핵세포의 사멸 및 퇴행을 억제하는 것을 확인하였으며, 이를 통해, 퇴행성 디스크 질환의 예방 및/또는 치료에 기여할 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition containing an extract of Naebaekja as an effective ingredient for preventing or treating degenerative disc disease. Specifically, it has been confirmed that an extract of Naebaekja inhibits the death and degeneration of human nucleus pulposus cells in a degenerative disc test tube model, and thereby can contribute to the prevention and/or treatment of degenerative disc disease.
도 1은 본 발명에 따른 내복자 추출물이 인간 수핵 세포를 대상으로 세포 독성 및 최적의 농도 설정을 위한 CCK-8 분석 그래프이다.
도 2은 본 발명에 따른 내복자 추출물이 과산화수소(H2O2) 유도 인간 수핵 세포사멸 억제를 통한 세포생존력에 미치는 효과를 나타낸 CCK-8 및 LDH 효소 활성 분석 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 내복자 추출물의 과산화수소(H2O2) 유도 인간 수핵 세포 사멸에 미치는 억제 효과를 보여주는 유세포 분석 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 내복자 추출물의 과산화수소(H2O2) 유도 인간 수핵 세포에서 활성형 Cleaved 카스파제-3(caspase-3), BAX 및 BCL-2의 발현에 미치는 효과를 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 내복자 추출물의 과산화수소(H2O2) 유도 인간 수핵 세포에서 디스크 퇴행과 관련된 대표적 인자 (MMP3, MMP13, ADAMTS4, ADAMTS5, Aggrecan 및 Col2a1)들의 mRNA 발현에 미치는 효과를 나타낸 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qPCR) 결과이다.
도 6는 본 발명에 따른 내복자 추출물의 과산화수소(H2O2) 유도 인간 수핵 세포에서 디스크 퇴행과 관련된 TREM2의 발현에 미치는 효과를 mRNA 및 단백질 수준에서 분석한 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(qPCR) 및 웨스턴 블롯 결과이다.Figure 1 is a graph showing the CCK-8 analysis for cytotoxicity and optimal concentration setting of the extract of the present invention targeting human nucleus cells.
Figure 2 is a graph showing the CCK-8 and LDH enzyme activity analysis effect of the extract of the present invention on cell viability through inhibition of hydrogen peroxide (H2 O2 )-induced human nucleus pulposus cell apoptosis.
Figure 3 is a flow cytometry analysis result showing the inhibitory effect of the extract of the present invention on hydrogen peroxide (H2 O2 )-induced human nucleus pulposus cell death.
Figure 4 is a Western blot result showing the effect of the extract of the present invention on the expression of active cleaved caspase-3, BAX, and BCL-2 in human nucleus pulposus cells induced by hydrogen peroxide (H2 O2 ).
Figure 5 is a real-time reverse transcription polymerasechain reaction (qPCR ) result showing the effect of the extract of the present invention on the mRNA expression of representative factors (MMP3, MMP13, ADAMTS4, ADAMTS5, Aggrecan, and Col2a1) related to disc degeneration in human nucleus pulposus cells induced by hydrogen peroxide (H 2 O 2 ).
Figure 6 showsthe results of real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qPCR)and Western blot analyzing the effect of the extract of the present invention on the expression of TREM2, which is related to disc degeneration in human nucleus pulposus cells induced by hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), at the mRNA and protein levels.
본 발명자는 퇴행성 디스크 질환과 관련된 시험관 내 모델을 확립하고 퇴행성 디스크 질환 치료를 연구하는 과정에서 내복자 추출물이 인간 추간판 수핵세포의 사멸을 억제하고 증식을 유도하고 퇴행을 억제함으로써 퇴행성 디스크 질환을 예방 및/또는 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention established an in vitro model related to degenerative disc disease and, in the process of studying the treatment of degenerative disc disease, confirmed that an extract of Naebaekja can prevent and/or treat degenerative disc disease by inhibiting the death of human intervertebral disc nucleus pulposus cells, inducing proliferation, and inhibiting degeneration, thereby completing the present invention.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있으며, 여기서 소개되는 내용은 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein and may be embodied in other forms, and the contents introduced herein are provided to sufficiently convey the idea of the present invention.
<시험예 1. 내복자 추출물 제조><Experimental Example 1. Preparation of extract of internal organs>
(주)그린명품에서 구입한 내복자 100g을 무게의 약 10배의 증류수에 3시간 동안 100℃에서 가열 추출한 후 얼음에 식힌 다음, 상온에서 여과지 (HA-030, 현대 마이크로)로 1회 여과를 시행한 후 -70℃에서 냉각시켰다. 상기 여과액을 동결건조기 (Ilshin BioBase)로 동결 건조하여 분말 형태의 내복자 열수 추출물(RSL)을 제조하였다. 건조된 분말의 무게를 재고 수율을 계산하여 -20℃ 냉동 보관하여 이후 실험에 사용 시, 멸균인산완충용액(PBS) 에 50 mg/mL 농도로 녹인 후 처리 당일 사용하였다.100 g of Naebaekja purchased from Green Myungpum Co., Ltd. was extracted by heating at 100℃ for 3 hours in distilled water about 10 times its weight, cooling on ice, filtering once through filter paper (HA-030, Hyundai Micro) at room temperature, and then cooling at -70℃. The filtrate was freeze-dried using a freeze-dryer (Ilshin BioBase) to produce a powdered Naebaekja hot water extract (RSL). The dried powder was weighed, the yield was calculated, and stored frozen at -20℃. When used in subsequent experiments, it was dissolved in sterile phosphate buffer solution (PBS) at a concentration of 50 mg/mL and used on the day of treatment.
<시험예 2. 인간 수핵세포 배양><Experimental example 2. Human nucleus cell culture>
퇴행성 추간판의 수핵에서는 정상 추간판에 비해 IL-1β, IL-6, IL-8, nitric oxide (NO), 프로스타글란딘 E2 (prostaglandin-E2), 종양괴사인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 기질 금속 단백분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)와 같은 염증 유발 인자를 많이 분비하며, 이러한 물질들이 추간판성 통증을 일으킨다. 인간 추간판 수핵세포에 과산화수소를 처리할 경우 세포 사멸 인자들의 활성을 유도하고, 염증성 사이토카인 또는 염증성 케모카인, 디스크 퇴행과 관련된 인자들의 발현을 증가시킬 수 있다.The nucleus pulposus of degenerative intervertebral discs secretes more inflammatory factors, such as IL-1β, IL-6, IL-8, nitric oxide (NO), prostaglandin E2, tumor necrosis factor-α (TNF-α), and matrix metalloproteinases (MMPs), than the normal intervertebral discs, and these substances cause discogenic pain. Treatment of human intervertebral disc nucleus pulposus cells with hydrogen peroxide can induce the activation of apoptotic factors and increase the expression of inflammatory cytokines, inflammatory chemokines, and factors related to disc degeneration.
인간 수핵세포는 인간 추간판으로 분리된 수핵 (Human Nucleus Pulposus Cell, HNPC) 세포(#4800, ScienCell, USA)를 동결 보존된 상태로 구매하였다. 우선, 인간 수핵세포를 배양하기 위해 Poly-L-lysine(1 mg/ml, #0403, ScienCell)을 인산완충액(PBS) 1 ml당 15 μl의 비율로 100 mm 배양접시에 넣어 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 코팅한 후 인산완충액(PBS)으로 2회 세척하였다. 상기와 같이 동결된 인간 수핵세포를 37℃ 워터 배스에서 해동한 후, 상기 해동된 세포를 2% 태아 소 혈청(FBS, Fetal bovin serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 포함한 수핵세포 전용 배양액(#4801, ScienCell)에 현탁시켰다. 현탁액은 Poly-L-lysine로 코팅된 배양접시에 옮긴 후, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 24시간 후 새로운 수핵세포 전용 배양액으로 교체하고, 2~3일 주기로 배양액을 교체하였다. 계대배양 전, Poly-L-lysine으로 코팅된 배양접시를 준비하고, 0.25% 트립신-EDTA 용액(T/E, #0103, Sciencell)을 인산완충액(PBS)으로 0.025% 트립신-EDTA 농도로 희석하였다. 계대배양은 배양액을 제거하고 인산완충액(PBS)으로 2회 세척한 후, 0.025% 트립신-EDTA을 2 mL 처리하여 부착된 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포는 1000 rpm으로 5분간 원심분리한 후, 준비된 코팅 배양접시에 파지하였다. 본 발명의 내복자 추출물의 디스크 세포사멸 및 퇴행 억제 효과 확인을 위해 사용된 인간 수핵세포는 계대횟수 5 ~ 6번에서 분석을 진행하였다.Human nucleus pulposus cells (HNPC) isolated from human intervertebral disc were purchased in a cryopreserved state (#4800, ScienCell, USA). First, to culture human nucleus pulposus cells, Poly-L-lysine (1 mg/ml, #0403, ScienCell) was added to a 100 mm culture dish at a ratio of 15 μl per 1 ml of phosphate buffered saline (PBS), and the dish was coated in an incubator at 37°C for 4 hours, and then washed twice with PBS. The frozen human nucleus pulposus cells were thawed in a 37°C water bath, and the thawed cells were suspended in a nucleus pulposus cell-specific culture medium (#4801, ScienCell) containing 2% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin solution. The suspension was transferred to a culture dish coated with Poly-L-lysine and cultured in an incubator at 37°C and 5% CO2. After 24 hours of culture, the culture was replaced with a new culture medium exclusively for nucleated cells, and the culture medium was replaced every 2–3 days. Before subculture, a culture dish coated with Poly-L-lysine was prepared, and 0.25% trypsin-EDTA solution (T/E, #0103, Sciencell) was diluted with phosphate buffered saline (PBS) to a concentration of 0.025% trypsin-EDTA. For subculture, the culture medium was removed, washed twice with phosphate buffered saline (PBS), and the attached cells were harvested by treating with 2 mL of 0.025% trypsin-EDTA. The harvested cells were centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes and then plated on the prepared coated culture dish. To confirm the inhibitory effect of the extract of the present invention on disc cell death and degeneration, human nucleus pulposus cells were analyzed at passage numbers 5 to 6.
<시험예 3. 내복자 추출물의 인간 수핵세포에 대한 세포 독성 측정><Test Example 3. Measurement of cytotoxicity of the extract of the internal organs on human nucleus cells>
내복자 추출물(RSL)의 인간 수핵세포에 대한 세포 독성 여부를 알아보기 위해 내복자 추출물의 농도별 처리에 따른 세포 생존율을 측정하였다. 상기 배양된 인간 추간판 수핵세포를 5×103 cells/100 μL/well의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 배양액에 인산완충액(PBS) 또는 내복자 추출물(RSL) 0, 25, 100 및 400 μg/ml 농도로 각각 처리한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 이후, 각 플레이트에 배양액의 10% 용량으로 CCK-8 용액(CK04, dojindo)을 첨가하여 4시간 동안 배양한 후, 마이크로 플레이트 리더(Epoch 2 Microplate Spectrophotometer; biotek)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 blank 그룹을 100%로 하고 다른 그룹들의 세포생존율을 하기 수학식 1의 방법으로 비교하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.To determine whether RSL has cytotoxicity on human nucleus pulposus cells, the cell viability was measured according to the concentration of RSL treated. The cultured human intervertebral disc nucleus pulposus cells were plated in 96-well plates at a density of 5 × 103 cells/100 μL/well, and treated with phosphate buffered saline (PBS) or RSL at concentrations of 0, 25, 100, and 400 μg/mL, respectively, and cultured at 37°C and 5% CO2 for 24 h. Then, CCK-8 solution (CK04, dojindo) was added to each plate at 10% of the culture medium, and cultured for 4 h. Then, the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Epoch 2 Microplate Spectrophotometer; biotek). The cell viability of the blank group was set to 100%, and the cell viability of the other groups was compared using the following mathematical formula 1, and the results are shown in Figure 1.
[수학식 1][Mathematical formula 1]
세포생존율 (%) = 각 샘플의 흡광도값 × (100/Blank 그룹의 흡광도 평균값)Cell viability (%) = Absorbance value of each sample × (100/Average absorbance value of the Blank group)
도 1에서 보는 바와 같이, 상기 배양된 인간 수핵세포에 내복자 추출물을 단독으로 처리하는 경우, 내복자 추출물 10 ~ 400 μg/ml의 농도 범위에서 인간 수핵세포는 blank 그룹 (비 처리군)과 비교하여 세포생존율에 유의한 감소를 나타내지 않았으며, 50 ~ 400 μg/ml의 농도 범위에서는 유의한 농도의존적 증가를 나타내었다. 따라서 인간 수핵세포에 내복자 추출물의 처리는 10 ~ 400 μg/ml의 농도 범위에서 세포 독성을 나타내지 않고, 50 ~ 400 μg/ml의 농도 범위에서 유의하게 농도의존적으로 세포생존율을 증가시키는 것을 확인하였다.As shown in Fig. 1, when the cultured human nucleus cells were treated with the extract of Naebaekja alone, the human nucleus cells did not show a significant decrease in cell viability compared to the blank group (untreated group) in the concentration range of 10 to 400 μg/ml of the extract of Naebaekja, and showed a significant concentration-dependent increase in the concentration range of 50 to 400 μg/ml. Therefore, it was confirmed that the treatment of human nucleus cells with the extract of Naebaekja did not show cytotoxicity in the concentration range of 10 to 400 μg/ml, and significantly increased cell viability in a concentration-dependent manner in the concentration range of 50 to 400 μg/ml.
도 1 및 이하 모든 결과는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표시하였다. 두 그룹 간의 단일 비교는 Student 's t-test를 사용하여 이루어졌으며, 3 개 이상의 그룹 간의 다중 비교는 Tukey의 post-hoc 테스트와 일원 분산 분석 (ANOVA)을 통해 분석하였다. 로그 순위 (Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 생존 곡선 간의 유의 한 차이를 분석하였다. 차이는 P <0.05 인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.All results in Figure 1 and below are expressed as the mean ± standard error of the mean (SEM). Single comparisons between two groups were performed using Student's t-test, and multiple comparisons between three or more groups were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey's post-hoc test. Significant differences between survival curves were analyzed using the log-rank (Mantel-Cox) test. Differences were considered statistically significant if P < 0.05.
<<시험예Exam example 4. 과산화수소 유도된 인간4. Humans induced by hydrogen peroxide수핵세포Nucleus cell 사멸 및 퇴행 체외 모델에서In vitro models of death and regression내복자Underwear 추출물의 세포생존율 및 젖산 탈수소효소(LDH) 활성 억제 효과>> Cell viability and lactate dehydrogenase (LDH) activity inhibition effects of the extract
과산화수소로 유도된 인간 수핵세포 사멸 및 퇴행 체외 모델에서 내복자 추출물의 세포생존율 증가 및 젖산 탈수소효소(LDH) 활성 억제 효과를 확인하였다.In an in vitro model of human nucleus pulposus cell death and degeneration induced by hydrogen peroxide, the extract of Naebaekja was confirmed to increase cell viability and inhibit lactate dehydrogenase (LDH) activity.
과산화수소(Hydrogen peroxide, H2O2)를 상기 배양한 인간 수핵세포에 400 μM 농도로 처리하여 사멸 및 퇴행을 유도하였다. 구체적으로 5×103 cells/100 μL/well의 밀도로 96-웰 플레이트에 24시간 배양 후, 배양액에 인산완충액(PBS), 400 μM 과산화수소 (H2O2) 또는 400 μM 과산화수소 (H2O2)와 함께 0, 10, 25, 50, 100, 200 및 400 μg/ml 농도의 내복자 추출물(RSL)을 각각 처리한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 이후, 각 플레이트에 배양액의 10% 용량의 CCK-8 용액(CK04, dojindo)을 첨가하여 4시간 동안 배양한 후, 마이크로 플레이트 리더(Epoch 2 Microplate Spectrophotometer; biotek)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 blank 그룹(비처리군)을 100%로 하고 다른 그룹들의 세포생존율을 하기 수학식 1의 방법으로 비교하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.Hydrogen peroxide (H2O2 ) was treated at a concentration of 400 μM to induce death and degeneration in the cultured human nucleusaccumbens . Specifically, after culturing for 24 h in a 96-well plate at a density of 5×103 cells/100 μL/well, the culture medium was treated with phosphate buffered saline (PBS), 400 μM hydrogen peroxide (H2O2 ), or 0, 10, 25, 50, 100, 200, and 400 μg/mLofRSL together with 400 μM hydrogen peroxide (H2O2 ), and then cultured for 24 h under conditions of 37°C and 5%CO2 . Afterwards, CCK-8 solution (CK04, dojindo) at 10% of the culture medium was added to each plate, and cultured for 4 hours. Then, the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Epoch 2 Microplate Spectrophotometer; biotek). The cell viability of the blank group (untreated group) was set to 100%, and the cell viability of the other groups was compared using the following mathematical formula 1, and the results are shown in Fig. 2.
[수학식 1][Mathematical formula 1]
세포생존율 (%) = 각 샘플의 흡광도값 × (100/Blank 그룹의 흡광도 평균값)Cell viability (%) = Absorbance value of each sample × (100/Average absorbance value of the Blank group)
도 2에서 보는 바와 같이, 400 μM 과산화수소(H2O2)를 인간 수핵세포에 적용했을 때 세포생존율이 유의하게 감소하였으며, 상기 400 μM 과산화수소(H2O2)에 의하여 감소한 인간 수핵세포 세포생존율은 내복자 추출물(10 ~ 400 μg/ml)을 24시간 동안 함께 첨가했을 때, 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 특히, 25 ~ 400 μg/ml의 농도 범위에서는 유의한 농도 의존적 증가를 나타내었다. 이러한 결과는 내복자 추출물이 과산화수소(H2O2)로 인한 인간 수핵세포 사멸 억제 및 보호 효과가 있음을 보여주었다.As shown in Fig. 2, when 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ) was applied to human nucleus pulposus cells, cell viability significantly decreased, and the human nucleus pulposus cell viability decreased by the 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ) was confirmed to increase in a concentration-dependent manner when the Naebaekja extract (10 to 400 μg/ml) was added together for 24 hours. In particular, a significant concentration-dependent increase was observed in the concentration range of 25 to 400 μg/ml. These results showed that the Naebaekja extract has an inhibitory effect on and protective effect against human nucleus pulposus cell death caused by hydrogen peroxide (H2 O2 ).
상기 400 μM 과산화수소(H2O2) 또는/및 내복자 추출물로 처리된 인간 수핵세포의 손상에 관한 구체적 상태를 확인하기 위하여 젖산 탈수소 효소(lactate dehdrogenase, LDH)의 효소 활성을 분석하고 그래프를 도 2에 나타내었다. 구체적으로 2×104 cells/500 μL/well의 밀도로 24-웰 플레이트에 24시간 배양 후, 배양액에 인산완충액(PBS) 또는 400 μM 과산화수소 (H2O2)와 함께 0, 25, 100 및 400 μg/ml 농도의 내복자 추출물(RSL)을 각각 처리한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 배양한 다음, 배양액만 따로 분리하였다. LDH 활성측정은 LDH 분석키트 제조업체 (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, U.K)의 프로토콜에 따라서 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 nmol/ml NADH 표준곡선 용액, 양성대조군으로 2, 3, 4, 또는 5 μL의 LDH가 포함된 용액 및 수집한 내복자 처리 배양액을 96-웰 플레이트에 50 μL/well로 처리하였다. 반응 버퍼(reaction buffer)를 각 50 μL/well로 시료에 추가한 다음 NADH로부터 NAD+로 산화되는 정도를 마이크로 플레이트 리더(Epoch 2 Microplate Spectrophotometer; biotek)를 사용하여 37도 및 450 nm 조건에서 30 ~ 60 분 동안 2분 간격으로 광도값을 측정하였다. LDH 활성은 하기 수학식 2의 방법으로 비교하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.In order to confirm the specific status of damage to human nucleus pulposus cells treated with the above 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ) or/and the Naebaekja extract, the enzyme activity of lactate dehydrogenase (LDH) was analyzed and the graph is shown in Fig. 2. Specifically, after culturing for 24 hours in a 24-well plate at a density of 2 × 104 cells/500 μL/well, the culture medium was treated with 0, 25, 100, and 400 μg/mL of Naebaekja extract (RSL) together with phosphate buffered saline (PBS) or 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ), and then cultured for 24 hours under conditions of 37°C and 5% CO2 , and then only the culture medium was separated. LDH activity was measured according to the protocol of the LDH assay kit manufacturer (Abcam, Cambridge, Cambridgeshire, UK). 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 nmol/mL NADH standard curve solution, 2, 3, 4, or 5 μL of LDH as a positive control, and the collected culture medium treated with the internal host were treated in a 96-well plate at 50 μL/well. The reaction buffer was added to each sample at 50 μL/well, and the degree of oxidation of NADH to NAD+ was measured at 2-minute intervals for 30 to 60 minutes at 37°C and 450 nm using a microplate reader (Epoch 2 Microplate Spectrophotometer; biotek). The LDH activity was compared using the method of Mathematical Formula 2 below, and the results are shown in Fig. 2.
[수학식 2][Mathematical formula 2]
LDH 활성 (mU/mL) = (NADH 표준곡선으로부터 계산된 내복자 배양액 내에 포함되어져 있는 NADH 양/반응시간(분) × 반응 웰에 추가된 원래 내복자 배양액의 부피) × 내복자 배양액의 희석배수LDH activity (mU/mL) = (NADH amount contained in the culture medium calculated from the NADH standard curve / reaction time (minutes) × volume of the original culture medium added to the reaction well) × dilution factor of the culture medium
도 2에서 보는 바와 같이, 400μM 과산화수소(H2O2)을 인간 수핵세포에 처리하는 경우, 세포 손상의 지표인 LDH 활성이 유의적으로 증가하였으며, 내복자 추출물을 처리하였을 때 내복자 추출물 농도의존적으로 LDH 활성이 유의적으로 감소하였다. 이러한 결과를 통하여 내복자 추출물이 과산화수소(H2O2)로 유도된 인간수핵세포 손상으로부터 보호 효과가 있음을 확인하였다.As shown in Fig. 2, when human nucleus pulposus cells were treated with 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ), LDH activity, an indicator of cell damage, significantly increased, and when the Naebaekja extract was treated, LDH activity significantly decreased in a concentration-dependent manner of the Naebaekja extract. Through these results, it was confirmed that the Naebaekja extract has a protective effect against human nucleus pulposus cell damage induced by hydrogen peroxide (H2 O2 ).
<시험예 5. 퇴행성 인간 수핵세포 모델에서 내복자 추출물의 세포 사멸 억제 효과><Experimental Example 5. Inhibitory effect of the extract of the internal organs on cell death in a degenerative human nucleus cell model>
상기 과산화수소에 의해 손상된 인간 수핵세포에 대한 내복자 추출물의 세포사멸 억제 효과를 유세포 분석을 통해 확인하였다. 세포 사멸 기전으로는 세포자살, 세포자멸사, 또는 아폽토시스(Apoptosis)로 세포 내 발현되는 자살 신호전달기전이 활성화되면서 세포가 스스로 죽어가는 과정과 세포괴사(necrosis) 또는 병적으로 세포가 죽는 과정이 있으며, 세포자멸사 (apoptosis)의 바이오 마커인 Annexin V과 세포괴사 (necrosis)의 바이오 마커인 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI) 키트를 이용하여 확인하였다. 구체적으로, 상기 배양된 인간 추간판 수핵세포를 1×105/2 ml/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 인산완충액(PBS), 400 μM 과산화수소(H2O2), 또는 내복자 추출물(RSL) 0, 25, 100 및 400 μg/ml 농도 각각 400 μM 과산화수소(H2O2)와 함께 처리한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 이후, 각 플레이트의 배양액을 제거한 후 인산완충액(PBS)를 이용하여 2회 세척 하였다. 부착된 세포를 0.5 mL의 0.025% 트립신-EDTA(TE) 용액 처리 후 37℃ 및 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 2분 동안 반응하였다. 원심분리하여 배양액 및 트립신 용액을 제거하고 APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI (Biolegend, 640932)의 구성품인 세포염색버퍼를 사용하여 세포 펫릿(pellet)을 단일 세포로 분리하였다. 세포가 포함된 100 μl 용액을 새로운 5 ml test tube로 옮긴 후 APC Annexin V 5 ul와 Propidium Iodide Solution 10 ul를 넣고 빛이 없는 환경의 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 15분 후 Annexin V Binding Buffer 400 ul를 넣고 유세포 분석기 (BD Bioscience, Accuri C6 plus)를 통해 그룹 간 Annexin V/PI의 비율을 측정한 결과와 이를 정량화한 그래프를 도 3에 나타내었다.The inhibitory effect of the extract of Naebaekja on human nucleus cells damaged by the hydrogen peroxide was confirmed through flow cytometry. The cell death mechanism includes apoptosis, apoptosis, or a process in which cells die on their own by activating the suicide signal transduction mechanism expressed within the cell, and necrosis, or a process in which cells die pathologically. This was confirmed using Annexin V, a biomarker of apoptosis, and propidium iodide (PI) kits, a biomarker of necrosis. Specifically, the cultured human intervertebral disc nucleus pulposus cells were plated in a 6-well plate at a density of 1 × 105 /2 ml/well and treated with phosphate buffered saline (PBS), 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2) , or 400 μg/ml of RSL (0, 25, 100, and 400 μg/ml), respectively, and then cultured at 37°C and 5% CO2 for 24 h. Afterwards, the culture medium in each plate was removed and washed twice using phosphate buffered saline (PBS). The attached cells were treated with 0.5 mL of 0.025% trypsin-EDTA (TE) solution and reacted for 2 minutes in an incubator at 37°C and 5% CO2 conditions. The culture medium and trypsin solution were removed by centrifugation, and the cell pellet was dissociated into single cells using the cell staining buffer, a component of the APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI (Biolegend, 640932). 100 μl of the solution containing the cells was transferred to a new 5 ml test tube, and 5 μl of APC Annexin V and 10 μl of Propidium Iodide Solution were added and reacted for 15 minutes at room temperature in a dark environment. After 15 minutes of reaction, 400 μl of Annexin V Binding Buffer was added, and the ratio of Annexin V/PI between the groups was measured using a flow cytometer (BD Bioscience, Accuri C6 plus). The results and the quantification graph are shown in Fig. 3.
도 3 에서 보는 바와 같이, 400 μM 과산화수소를 처리한 경우 세포자멸사(apoptosis)의 바이오마커인 AnnexinV의 양성율이 blank(비 처리군)과 비교하여 유의적으로 증가하였으며, 내복자 추출물을 처리한 경우, 농도의존적으로 AnnexinV의 양성율이 감소한 것을 확인하였다. 따라서 내복자 추출물이 과산화수소(H2O2)로 유도된 인간 수핵세포 사멸 억제 효과를 확인하였다.As shown in Fig. 3, when treated with 400 μM hydrogen peroxide, the positivity rate of AnnexinV, a biomarker of apoptosis, significantly increased compared tothe blank (untreated group), and when treated with the extract of Naebaekja, the positivity rate of AnnexinV decreased in a concentration-dependent manner. Therefore, it was confirmed that the extract of Naebaekja inhibited human nucleus pulposus cell apoptosis induced by hydrogen peroxide (H2O2 ).
<<시험예Exam example 6. 과산화수소 유도된 인간6. Humans induced by hydrogen peroxide수핵세포Nucleus cell 사멸에 대한About death내복자Underwear 추출물의 세포사멸 억제 효과 관련 단백질 영향 분석>Analysis of the effect of proteins related to the cell death inhibition effect of the extract>
상기 과산화수소(H2O2)에 의해 손상된 인간 수핵세포에 대한 내복자 추출물의 세포사멸 억제 효과 관련 단백질의 발현 차이를 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 세포자멸사(apotosis)와 관련된 유전자들 중에서도 특히 원발암유전자인 Bcl-2 유전자군은 다양한 생리학적, 병리학적 상태에서 예정된 세포의 죽음을 조절하는 특별한 단백질들을 전사한다고 알려져 있다. 이들 중 Bax는 세포자멸사를 활성화시켜 세포의 사멸을 촉진시키며, Bcl-2는 이를 방해하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 세포자멸사의 최종실행은 카스파제-3 (caspase-3) 활성화로 인하여 핵의 DNA를 분해되거나 많은 구조 단백질의 분해를 유도하는 것으로 알려져 있다.The difference in the expression of proteins related to the apoptosis inhibitory effect of the extract of Naebaekja on human nucleus cells damaged by the above hydrogen peroxide (H2O2 ) was confirmed through Western blot. Among the genes related to apoptosis, the Bcl-2 gene family, a proto-oncogene in particular, is known to transcribe special proteins that regulate scheduled cell death in various physiological and pathological conditions. Among these, Bax is known to promote cell death by activating apoptosis, and Bcl-2 is known to play a role in interfering with it. The final execution of apoptosis is known to induce the decomposition of nuclear DNA or the decomposition of many structural proteins due to the activation of caspase-3.
이들 단백질의 발현을 확인하기 위하여 구체적으로, 상기에서 배양된 인간 추간판 수핵세포를 1×105cells/2 mL/well의 밀도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 인산완충액(PBS), 400 μM 과산화수소 (H2O2) 또는 400 μM 과산화수소 (H2O2)와 함께 0, 25, 100 및 400 μg/ml 농도의 내복자 추출물(RSL)을 각각 처리한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 수득한 수핵세포는 얼음 위에서 30분 동안 RIPA 용해 완충액(Beyotime Institute of Biotechnology)으로 용해 후, 세포 사멸 관련 단백질로 활성형 cleaved 카스파제-3(Caspase-3), Bcl-2 관련 X 단백질(Bcl-2-associated X protein, Bax) 및 B-세포 림포마 2(B-cell lymphoma 2, BCL-2)의 웨스턴 블롯팅을 수행한 후 그 결과를 도 4에 나타내었다.Specifically, to confirm the expression of these proteins, the human intervertebral disc nucleus pulposus cells cultured above were plated in 6-well plates at a density of 1×105 cells/2 mL/well and treated with phosphate buffered saline (PBS ), 400 μM hydrogen peroxide (H2O2 ), or 400 μM hydrogen peroxide (H2O2 ) together with 0, 25, 100, and 400 μg/mLof RSL, respectively, and then cultured for 24 hours under conditions of 37°Cand 5% CO2. The obtained nucleus cells were lysed on ice for 30 minutes with RIPA lysis buffer (Beyotime Institute of Biotechnology), and Western blotting of apoptosis-related proteins such as active cleaved caspase-3 (Caspase-3), Bcl-2-associated X protein (Bax), and B-cell lymphoma 2 (BCL-2) was performed. The results are shown in Figure 4.
도 4에서 보는 바와 같이, 400 μM 과산화수소(H2O2)는 활성형 Cleaved caspase-3 및 BAX의 발현을 증가시켰으며, Bcl-2의 발현을 억제하였다. 본 발명에 따른 내복자 추출물을 처리하는 경우, 활성형 Cleaved 카스파제-3(caspase-3) 및 BAX 발현이 내복자 추출물 400 μg/mL에서 유의하게 억제되었으며, Bcl-2의 발현은 내복자 추출물 농도 의존적으로 증가하였다.As shown in Fig. 4, 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ) increased the expression of active cleaved caspase-3 and BAX, and inhibited the expression of Bcl-2. When treated with the extract of the present invention, the expression of active cleaved caspase-3 and BAX was significantly inhibited at 400 μg/mL of the extract of the present invention, and the expression of Bcl-2 increased in a dose-dependent manner of the extract of the present invention.
<시험예 7. 내복자 추출물의 인간 디스크 퇴행 관련 유전자 발현 조절 효과><Experimental Example 7. Effect of Naebaekja Extract on Regulating Gene Expression Related to Human Disc Degeneration>
퇴행성 디스크 발병과정에서 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 분해효소인 MMP(Matrix metalloproteinase) 및 ADAMTS의 발현이 증가하고 세포외기질(ECM) 합성 관련 Aggrecan 및 Col2a1의 발현은 감소하는 것으로 알려졌다. 이에 따라, 본 발명의 내복자 추출물은 과산화수소(H2O2)가 처리된 인간 수핵세포에서 퇴행 관련 유전자인 Aggrecan, Col2a1, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP3 및 MMP13의 mRNA 발현에 미치는 조절 효과를 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)을 통해 확인하였다. 구체적으로, 상기에 배양된 인간 추간판 수핵세포를 1×105/2 ml/well의 밀도로 6-웰플레이트에 플레이팅하고, 인산완충액(PBS), 400 μM 과산화수소(H2O2), 또는 400 μM 과산화수소(H2O2) 및 내복자 추출물(RSL) 0, 25, 100 및 400 μg/ml 농도 각각 400 μM 과산화수소(H2O2)와 함께 처리한 후 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. 이후, 각 플레이트의 배양액을 제거한 후 인산완충액(PBS)를 이용하여 2회 세척하였다. 이후 세포 스크레이퍼(scraper)를 활용하여 세포를 회수한 후 3000 rpm 및 5분 조건으로 원심분리한다. 상층액을 제거한 후 RNA 분리를 위해 트리졸 외용액 (TRIzol) (invitrgen)을 400 ul 처리하고 20분 동안 반응시켰다. 층 분리를 통한 RNA 정제를 위해 클로로포름(Chloroform) 80 μl를 처리하고 5분 동안 반응한 후 4℃ 12000 × g 및 15분 조건으로 원심분리하였다. 가장 상부에 위치한 RNA가 포함된 용액만을 새로운 tube에 옮긴 후 이소프로필 알코올(isopropanol)을 동일한 양으로 넣고 10분 동안 침전시켰다. 이후, 4℃ 12000 × g, 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거한 후 75% 에탄올 1 ml을 넣고 4℃ 및 7500 × g 조건으로 10분 동안 원심분리하였다. 다시 상층액을 제거하고 상온에서 10분 동안 건조 시킨 후 전체 RNA (total RNA)을 회수하였다. 전체 RNA의 수율은 RNA분해효소가 없는 물(RNAse-free water)를 20 μl 넣고 RNA의 양을 마이크로플레이트 리더(Biotek, Epoch2)를 사용하여 정량하였다. 상보적DNA(Complementary DNA, cDNA) (Accupower RT premix (바이오니아)는 50 pmole/ul oligo dT primer를 이용하여 기존의 표준화된 역전사 방법을 통해 전체 RNA 1 ug/ul로부터 T100 thermal cycler (Bio-rad)를 통해 합성하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)은 SYBR green supermix (Bio-rad) 10 μl와 forward 및 reverse 프라이머 각 1 μl, cDNA 1 μl, RNA분해효소가 없는 물 7 μl의 비율로 혼합하여 CFX Connect (Bio-rad)를 사용하여 분석한 후 그 결과를 도 5에 나타내었다.It is known that the expression of MMP (Matrix metalloproteinase) and ADAMTS, which are extracellular matrix (ECM) degrading enzymes, increases during the course of degenerative disc disease, and the expression of Aggrecan and Col2a1, which are related to extracellular matrix (ECM) synthesis, decreases. Accordingly, the extract of the present invention was confirmed to have a regulatory effect onthe mRNA expression of Aggrecan, Col2a1, ADAMTS4, ADAMTS5, MMP3, and MMP13, which are degeneration-related genes, in human nucleus pulposus cells treated with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) through real-time polymerase chain reaction (qPCR). Specifically, the human intervertebral disc nucleus pulposus cells cultured above were plated in a 6-well plate at a density of 1×105 /2 ml/well and treated with phosphate buffered saline (PBS), 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ), or 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ) and 0,25 , 100, and 400 μg/ml of RSL, respectively, and then cultured at 37°C and 5% CO2 for 24 hours. Afterwards, the culture medium in each plate was removed and washed twice using phosphate buffered saline (PBS). Afterwards, the cells were recovered using a cell scraper and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. After removing the supernatant, 400 ul of TRIzol (invitrgen) was treated for RNA isolation and reacted for 20 minutes. For RNA purification through layer separation, 80 μl of chloroform was treated, reacted for 5 minutes, and centrifuged at 4℃, 12,000 × g, and 15 minutes. Only the solution containing the RNA at the very top was transferred to a new tube, and isopropyl alcohol (isopropanol) was added in the same amount and precipitated for 10 minutes. After that, centrifuged at 4℃, 12,000 × g, and 10 minutes, the supernatant was removed, 1 ml of 75% ethanol was added, and centrifuged at 4℃, 7,500 × g, and 10 minutes. The supernatant was removed again, dried at room temperature for 10 minutes, and total RNA was recovered. The yield of total RNA was quantified using 20 μl of RNAse-free water and a microplate reader (Biotek, Epoch2). Complementary DNA (cDNA) (Accupower RT premix (Bionea) was synthesized from 1 ug/ul of total RNA by a conventional standardized reverse transcription method using 50 pmole/ul oligo dT primer in a T100 thermal cycler (Bio-rad). Real-time polymerase chain reaction (qPCR) was performed using CFX Connect (Bio-rad) with a mixture of 10 μl of SYBR green supermix (Bio-rad), 1 μl each of forward and reverse primers, 1 μl cDNA, and 7 μl of RNAse-free water. The results are shown in Fig. 5.
도 5에서 보는 바와 같이, 400 μM 과산화수소(H2O2)는 세포외기질(ECM) 분해효소인 MMP(Matrix metalloproteinase)3 및 13 과 ADAMTS4 및 5의 발현이 유의적으로 증가하였고 세포외기질(ECM) 합성 관련 Aggrecan 및 Col2a1의 발현은 유의적으로 감소하였다. 본 발명의 내복자 추출물은 농도의존적으로 세포외기질(ECM) 분해효소인 MMP3 및 13 과 ADAMTS4 및 5의 발현이 유의하게 감소하였고 세포외기질(ECM) 합성 관련 Aggrecan 및 Col2a1의 발현은 유의적으로 증가하였다.As shown in Fig. 5, 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ) significantly increased the expression of matrix metalloproteinase (MMP) 3 and 13 and ADAMTS4 and 5, which are extracellular matrix (ECM) decomposing enzymes, and significantly decreased the expression of Aggrecan and Col2a1, which are related to extracellular matrix (ECM) synthesis. The extract of the present invention significantly decreased the expression of MMP3 and 13 and ADAMTS4 and 5, which are extracellular matrix (ECM) decomposing enzymes, in a concentration-dependent manner, and significantly increased the expression of Aggrecan and Col2a1, which are related to extracellular matrix (ECM) synthesis.
<시험예 8. 내복자 추출물의 인간디스크 퇴행 관련 TREM2 발현 조절 효과><Experimental Example 8. Effect of Naebaekja Extract on TREM2 Expression Regulatory Related to Human Disc Degeneration>
퇴행성 디스크와 관련된 또 다른 유전자인 미엘로이드 세포-2(TREM2, triggering receptor expressed on myeloid cells 2)는 최근 연구들에서 퇴행성 디스크 질환을 가지고 있는 환자의 수핵 조직과 조직으로부터 일차 배양된 인간 수핵세포에서 TREM2의 비정상적인 발현 증가를 확인하였다. 따라서 인간 정상 수핵세포 내에서 TREM2의 비정상적인 상향 조절이 인간 정상 수핵세포의 퇴화에 기여하며 nuclear factor-κB (NF-κB) 신호 전달 경로와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려졌다. 이에 따라, 본 발명의 내복자 추출물은 과산화수소(H2O2)가 처리된 인간 수핵세포에서 TREM2 mRNA 및 단백질 발현을 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR) 및 웨스턴 블롯을 통해 확인하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다.Another gene associated with degenerative disc disease, triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2), has recently been shown to have an abnormal increase in TREM2 expression in the nucleus pulposus tissue of patients with degenerative disc disease and in human nucleus pulposus cells cultured primarily from the tissue. Therefore, it is known that the abnormal up-regulation of TREM2 in normal human nucleus pulposus cells contributes to the degeneration of normal human nucleus pulposus cells and is closely related to the nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway. Accordingly, the extract of Naebaekja of the present invention confirmed TREM2 mRNA and protein expression in human nucleus pulposus cells treated with hydrogen peroxide (H2 O2 ) through real-time polymerase chain reaction (qPCR) and Western blot, and the results are shown in Fig. 6.
도 6에서 보는 바와 같이, 400 μM 과산화수소(H2O2)는 인간 수핵세포에서 TREM2의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 발현을 유의적으로 증가시켰고 본 발명의 내복자 추출물은 농도의존적으로 TREM2의 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 발현을 유의하게 감소시켰다.As shown in Fig. 6, 400 μM hydrogen peroxide (H2 O2 ) significantly increased the expression of TREM2 at both mRNA and protein levels in human nucleus pulposus cells, and the extract of the present invention significantly decreased the expression of TREM2 at both mRNA and protein levels in a concentration-dependent manner.
상기와 같이 본 발명에 따른 내복자 추출물은 퇴행성 디스크 수핵세포의 사멸을 억제하고 디스크 퇴행을 억제함으로써 퇴행성 디스크 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다.As described above, it was confirmed that the extract of the present invention inhibits the death of degenerative disc nucleus cells and inhibits disc degeneration, thereby being effective in the prevention and treatment of degenerative disc disease.
Claims (5)
Translated fromKorean상기 내복자 추출물은 증류수에 3시간 동안 100℃에서 가열 추출한 추출물이며,
상기 약학조성물은 산화 스트레스에 의한 수핵세포의 세포자멸사를 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.In a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative disc disease containing an extract of the plant as an active ingredient,
The above extract is an extract extracted by heating in distilled water at 100℃ for 3 hours.
The above pharmaceutical composition is a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative disc disease, characterized in that it inhibits apoptosis of nucleus pulposus cells due to oxidative stress.
상기 내복자 추출물은 증류수에 3시간 동안 100℃에서 가열 추출한 추출물이며,
상기 건강기능식품은 산화 스트레스에 의한 수핵세포의 세포자멸사를 억제하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 디스크 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.In a health functional food containing an extract of the plant as an effective ingredient for preventing or improving degenerative disc disease,
The above extract is an extract extracted by heating in distilled water at 100℃ for 3 hours.
The above health functional food is a health functional food for preventing or improving degenerative disc disease, characterized by inhibiting apoptosis of nucleus pulposus cells due to oxidative stress.
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