본 발명은 CRISPR/Cas 시스템을 이용한OsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2) 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a rice plant in whichthe OsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2 ) gene is corrected using the CRISPR/Cas system.
세계 인구의 거의 절반이 소비하는 주요 식량 작물 중 하나인 쌀은 매년 약 450만 헥타르에서 재배되고 있다(Food and Agriculture Organization (FAO), 2004). 경제 및 생활 수준의 향상과 함께 수확량 뿐만 아니라 곡물 품질 향상을 위한 방법을 탐색하고 있으며, 쌀 품종의 높은 수확량과 고품질의 개발은 필수적이다. 곡물 품질 특성은 제분, 외관, 요리 및 식생활, 영양가 특성을 평가하고 시장 가치를 결정한다. 제분 품질 평가 기준은 주로 현미 비율, 정미 비율 및 완전미 비율을 포함하며, 외관 품질은 주로 입자 크기, 반투명도, 백악질 입자 비율, 백악질 영역 및 백악도에 의해 결정된다. 곡물의 백악질 영역에 있는 전분 과립은 곡물의 반투명 영역에 있는 더 크고 조밀하게 포장 된 과립보다 작고 밀도가 낮다. 요리 및 식사 품질은 대부분 곡물 전분의 아밀로스 함량, 호화 온도 및 젤 농도에 의해 결정된다. 쌀은 대부분의 쌀 재배 국가에서 식이 단백질과 미량 영양소의 주요 공급원이기 때문에 영양가가 필수적이다. 수확량과 함께 품질 특성을 개선하기 위해서는 중요한 품질 특성을 이해하고, 육종 프로그램을 선택하고, 적절한 비배관리가 필요하다.Rice, one of the major food crops consumed by nearly half of the world's population, is cultivated on about 4.5 million hectares annually (Food and Agriculture Organization (FAO), 2004). With the improvement of economy and living standards, methods to improve grain quality as well as yield are being explored, and the development of high-yield and high-quality rice varieties is essential. Grain quality characteristics evaluate milling, appearance, cooking and eating, and nutritional properties, and determine market value. Milling quality evaluation criteria mainly include brown rice ratio, polished rice ratio, and whole rice ratio, and appearance quality is mainly determined by particle size, translucency, chalky particle ratio, chalky area, and chalkiness. Starch granules in the chalky area of the grain are smaller and less dense than the larger, more densely packed granules in the translucent area of the grain. Cooking and eating quality are largely determined by the amylose content of grain starch, gelatinization temperature, and gel concentration. Rice is a major source of dietary protein and micronutrients in most rice-growing countries, so its nutritional value is essential. To improve quality characteristics along with yield, it is necessary to understand important quality characteristics, select breeding programs, and implement appropriate fertilization management.
질소(nitrogen)는 식물 성장과 작물 수확을 위한 주요 영양소 중 하나로, 콩과 식물이 아닌 대부분의 식물은 질산염과 암모늄을 포함한 무기 질소를 흡수하여 아미노산 합성에 활용한다. 전달된 유기질소의 주요 형태인 아미노산은 뿌리와 잎의 목부와 체관을 통해 꽃, 과실 및 씨앗으로 재분배된다. 또한 식물은 토양에서 직접 아미노산을 흡수한다. 최근 연구에 따르면 체관과 배아의 아미노산 부하가 증가하면 완두콩의 바이오매스와 종자 생산량이 향상 될 수 있음이 보고되었다.Nitrogen is one of the major nutrients for plant growth and crop yield, and most plants other than legumes absorb inorganic nitrogen, including nitrate and ammonium, and use it to synthesize amino acids. Amino acids, the main form of organic nitrogen transferred, are redistributed to flowers, fruits, and seeds through the xylem and sieve of roots and leaves. Plants also absorb amino acids directly from the soil. Recent studies have reported that increasing the amino acid load in the sieve and embryo can improve biomass and seed production in peas.
식물은 아미노산을 흡수하고 이동시키기 위해 막-통합 아미노산 수송 단백질(AAT)을 필요로 하며, 그 중에서도 기질 특이성이 넓은 양성자 결합 아미노산 수송체 역할을 하는 amino acid permease (AAP) 서브 패밀리가 집중적으로 연구되고 있다. 벼에서 OsAAP1, OsAAP4, OsAAP7 및 OsAAP16은 생물학적 기능이 명확하지 않지만 중성 아미노산의 흡수 및 재분배를 통해 생산량을 조절하는 역할을 하며(Fang et al., 2021; Taylor et al., 2015), OsAAP3는 리신(Lys) 및 아르기닌(Arg)을 포함한 염기성 아미노산을 수송한다. 또한 OsAAP3 또는 OsAAP5의 발현 저해는 Lys 및 Arg의 농도를 조절하여 수확량을 증가시키는 것으로 보고되었다(Lu et al., 2018; Wang et al., 2019). OsAAP6는 식물에서 다양한 아미노산 분포에 관여하며, 곡물 단백질 함량과 곡물 품질의 양성 조절자 역할을 하는 것으로 보고되었다(Peng et al. 2014).Plants require membrane-integrated amino acid transport proteins (AATs) to uptake and transport amino acids, among which the amino acid permease (AAP) subfamily, which acts as a proton-coupled amino acid transporter with broad substrate specificity, has been intensively studied. In rice, OsAAP1, OsAAP4, OsAAP7, and OsAAP16 have unclear biological functions, but they play a role in regulating yield through the uptake and redistribution of neutral amino acids (Fang et al., 2021; Taylor et al., 2015), and OsAAP3 transports basic amino acids including lysine (Lys) and arginine (Arg). In addition, inhibition of the expression of OsAAP3 or OsAAP5 has been reported to increase yield by regulating the concentration of Lys and Arg (Lu et al., 2018; Wang et al., 2019). OsAAP6 is involved in the distribution of various amino acids in plants and has been reported to act as a positive regulator of grain protein content and grain quality (Peng et al. 2014).
본 발명에서는 eating cooking quality 및 바이오매스 향상을 위해OsAAP2 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 편집하여 표적 돌연변이를 유발하였다.In the present invention,the OsAAP2 gene was edited using the CRISPR/Cas9 system to induce targeted mutations in order to improve eating cooking quality and biomass.
한편, 한국공개특허 제2019-0052553호에는 'OsNAC64 및 OsNAC69 유전자를 동시 인식하기 위한 가이드 RNA 및 이를 이용한 OsNAC64 및 OsNAC69 넉아웃 벼 돌연변이체의 제조 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'CRISPR/Cas 시스템을 이용한OsAAP2 유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법'에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent Publication No. 2019-0052553 discloses 'Guide RNA for simultaneously recognizing OsNAC64 and OsNAC69 genes and a method for producing OsNAC64 and OsNAC69 knockout rice mutants using the same', but does not describe 'a method for producing rice plants in whichthe OsAAP2 gene is corrected using the CRISPR/Cas system' of the present invention.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래OsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2) 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9 벡터를 구축하여 유전자 교정 벼 식물체를 개발하였고 야생형 벼와 비교한 결과,OsAAP2유전자 교정 식물체는 전분의 이화학적 특성에 변화가 일어났음을 확인함으로써，본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above-mentioned needs, and the inventors of the present invention developed a gene-edited rice plant by constructing a CRISPR/Cas9 vector targeting the rice-derivedOsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2 ) gene, and as a result of comparison with wild-type rice, it was confirmed thatthe OsAAP2 gene-edited plant had changes in the physicochemical properties of starch, thereby completing the present invention.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래OsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 벼 유래OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는,OsAAP2유전자 교정 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공한다.In order to solve the above problem, the present invention provides a composition for producing an OsAAP2 gene-corrected plant, comprising a recombinant vector including a DNA encoding a guide RNA specific for the target base sequence of a rice-derivedOsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2) gene and a nucleic acid sequence encoding an endonuclease protein; or a complex (ribonucleoprotein) of a guide RNA specific for the target base sequenceof a rice-derivedOsAAP2 gene and an endonuclease protein; as an active ingredient.
또한, 본 발명은 (a) 벼 유래OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는,OsAAP2유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing a rice plant in whichthe OsAAP2 gene has been corrected, comprising: (a) a step of introducing a guide RNA and an endonuclease protein specific for a target base sequence of theOsAAP2 gene derived from rice into a rice plant cell to correct the genome; and (b) a step of re-differentiating a rice plant from the rice plant cell in which the genome has been corrected.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된OsAAP2유전자가 교정된 벼 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides a rice plant having a correctedOsAAP2 gene and a seed having a corrected genome thereof, produced by the above method.
본 발명에서 제시한OsAAP2 유전자 편집을 통한 돌연변이 유도는 종자 내 전분 변화를 야기하였으므로, 벼의 식미와 관련된 연구에 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 자연적 변이와 구별할 수 없는 변이를 유도하므로, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO(Genetically Modified Organism) 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다.Since the mutation induction throughOsAAP2 gene editing suggested in the present invention causes starch changes in seeds, it can be usefully utilized in research related to the palatability of rice. In addition, since the method according to the present invention induces mutations that cannot be distinguished from natural mutations, it is expected that it will be possible to save costs and time, unlike GMO (Genetically Modified Organism) crops that require enormous costs and time to evaluate safety and environmental hazards.
도 1은OsAAP2 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 매개 표적 돌연변이 과정을 도식화한 것으로, A는 Cas9::OsU3::OsAAP2 sgRNA 벡터의 T-DNA 부위 구조이고, B는 벼 캘러스에서 아그로박테리움 매개 형질전환의 과정을 보여준다.
도 2는 OsAAP2 유전자의 교정을 위한 sgRNA 표적 위치 및 서열 정보(A)와, NGS 분석에 의한 sgRNA 표적 위치의 돌연변이 양상을 보여주는 결과(B)이다.
도 3은 야생형(WT) 및 T1 세대osaap2 돌연변이체의 표현형을 관찰한 것으로, A는 종자와 현미의 사진이고, B는 낟알 길이, 낟알 너비, 낟알 두께 및 천립중 분석 결과이다.
도 4는 야생형(WT) 및 T1 세대osaap2 돌연변이체 종자의 전자현미경 이미지로, A는 야생형 식물체의 성숙 배유의 이미지이고, B 및 C는 각각osaap2 sg1-3 및osaap2 sg2-12 식물체의 성숙 배유의 이미지이며, D는 야생형 식물체의 성숙 배유의 중앙 부분 이미지이고, E와 F는 각각osaap2 sg1-3 및osaap2 sg2-12 식물체의 성숙 배유의 중앙 부분 이미지이다.
도 5는 T1 세대osaap2 돌연변이체에서 전분의 물리화학적 특성을 분석한 것으로, A는 아밀로스 함량, B는 점성(gel consistency)을 분석한 결과이다.Figure 1 is a schematic representation of the CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis process forthe OsAAP2 gene, where A is the T-DNA region structure of the Cas9::OsU3::OsAAP2 sgRNA vector and B shows the process of Agrobacterium-mediated transformation in rice callus.
Figure 2 shows the sgRNA target location and sequence information (A) for correction of the OsAAP2 gene, and the results showing the mutation pattern of the sgRNA target location by NGS analysis (B).
Figure 3 shows the phenotypes of wild type (WT) and T1 generationosaap2 mutants. A is a photograph of seeds and brown rice, and B is the results of analysis of grain length, grain width, grain thickness, and thousand-grain weight.
Figure 4 shows electron microscope images of wild-type (WT) and T1 generationosaap2 mutant seeds, where A is an image of mature endosperm from a wild-type plant, B and C are images of mature endosperm fromosaap2 sg1-3 andosaap2 sg2-12 plants, respectively, D is an image of the central part of mature endosperm from a wild-type plant, and E and F are images of the central part of mature endosperm fromosaap2 sg1-3 andosaap2 sg2-12 plants, respectively.
Figure 5 shows the results of analyzing the physicochemical properties of starch in the T1 generationosaap2 mutant. A shows the results of analyzing amylose content and B shows the results of analyzing viscosity (gel consistency).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래OsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 벼 유래OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 유효성분으로 함유하는,OsAAP2유전자 교정 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a composition for producingan OsAAP2 gene- edited plant,comprising as an active ingredient a recombinant vector including a DNA encoding a guide RNA specific for the target base sequence of a rice-derivedOsAAP2 (Oryza sativa Amino acid permease 2) gene and a nucleic acid sequence encoding an endonuclease protein; or a complex (ribonucleoprotein) of a guide RNA specific for the target base sequence of a rice-derivedOsAAP2 gene and an endonuclease protein.
본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9 (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.The term "genome/gene editing" used herein refers to a technology capable of introducing a targeted mutation into the genome sequence of plant and animal cells, including human cells, by knocking out or knocking in a specific gene through deletion, insertion, substitution, etc. of one or more nucleic acid molecules by DNA cleavage, or introducing a mutation into a non-coding DNA sequence that does not produce a protein. For the purpose of the present invention, the genome editing may specifically be introducing a mutation into a plant using an endonuclease, for example, Cas9 (CRISPR associated protein 9) protein and a guide RNA. In addition, 'gene editing' may be used interchangeably with 'gene editing'.
또한, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.In addition, the term "target gene" means a portion of DNA within the genome of a plant to be corrected through the present invention, and is not limited to the type of the gene, and may include both a coding region and a non-coding region. A person skilled in the art can select the target gene according to the desired mutation for the genome-corrected plant to be produced, depending on the purpose.
또한, 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 엔도뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다.In addition, the term "guide RNA" refers to a short single-stranded RNA, which is specific to a target DNA among the base sequences encoding a target gene, and refers to ribonucleic acid that complementarily binds to all or part of the target DNA base sequence and guides an endonuclease protein to the target DNA base sequence. The guide RNA is a dual RNA comprising two RNAs, namely crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA), as components; Or, it refers to a single-stranded guide RNA (sgRNA) form including a first portion including a sequence that is completely or partially complementary to a base sequence in a target gene and a second portion including a sequence that interacts with an endonuclease (particularly, an RNA-guided nuclease). However, if the endonuclease is in a form that can be active in the target base sequence, it can be included in the scope of the present invention without limitation, and can be manufactured and used according to a technique known in the art, taking into consideration the type of endonuclease used together or the microorganism originating from the endonuclease.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the guide RNA may be, but is not limited to, a guide RNA transcribed from a plasmid template, a guide RNA transcribedin vitro (e.g., an oligonucleotide double-strand), or a synthetic guide RNA.
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1 (also known as Cas12a), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 RNA-가이드 뉴클레아제인 Cas9 또는 Cpf1 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, in the genome correction composition according to the present invention, the endonuclease protein may be at least one selected from the group consisting of Cas9, Cpf1 (also known as Cas12a), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) or a functional analog thereof, preferably, it may be an RNA-guided nuclease such as Cas9 or Cpf1, and more preferably, it may be a Cas9 protein, but is not limited thereto.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기Cas9 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the Cas9 protein may be at least one selected from the group consisting of a Cas9 protein derived fromStreptococcus pyogenes , a Cas9 protein derived fromCampylobacter jejuni , a Cas9 protein derived fromStreptococcus thermophilus orStreptococcus aureus, a Cas9 protein derived fromNeisseria meningitidis , a Cas9 protein derived fromPasteurella multocida , a Cas9 protein derived fromFrancisella novicida , and the like, but is not limited thereto. The Cas9 protein or its genetic information can be obtained from a known database such as GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The aboveCas9 genetic information may use a known sequence as is, or may use a sequence optimized for the codon of the subject (organism) to be transduced, but is not limited thereto.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.The Cas9 protein is an RNA-guided DNA endonuclease enzyme that induces double-stranded DNA breaks. In order for the Cas9 protein to precisely bind to the target sequence and cut the DNA strand, a short sequence of three bases known as the Protospacer Adjacent Motif (PAM) must be present next to the target sequence, and the Cas9 protein cuts between the third and fourth base pairs from the PAM sequence (NGG).
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.In the composition for genome correction according to the present invention, the guide RNA and the endonuclease protein can form a ribonucleoprotein complex and function as RNA-Guided Engineered Nuclease (RGEN).
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 벼 유래OsAAP2 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a composition for genome correction according to one embodiment of the present invention, the rice-derivedOsAAP2 gene may be composed of a base sequence of sequence number 1, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.In the genome correction composition according to the present invention, the CRISPR/Cas9 system used is a genome correction method by the NHEJ (non-homologous end joining) mechanism that introduces a double-strand break at a specific location of a specific gene to be corrected and induces an insertion-deletion (InDel) mutation due to incomplete repair induced during the DNA repair process.
본 발명은 또한,The present invention also comprises:
(a) 벼 유래OsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 벼 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및(a) a step of correcting the genome by introducing guide RNA and endonuclease protein specific to the target base sequence of the rice-derivedOsAAP2 (Oryza sativaAmino acid permease 2 ) gene into rice plant cells; and
(b) 상기 유전체가 교정된 벼 식물세포로부터 벼 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는,OsAAP2유전자가 교정된 벼 식물체의 제조방법을 제공한다.(b) a step of re-differentiating a rice plant from a rice plant cell in which the genome has been corrected; a method for producing a rice plant in which theOsAAP2 gene has been corrected is provided.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 벼 식물세포에 도입하는 것은, 벼 유래OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터; 또는 벼 유래OsAAP2 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein);를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the manufacturing method according to the present invention, the introduction of the guide RNA and endonuclease protein of step (a) into rice plant cells may be performed using, but is not limited to, a recombinant vector including a DNA encoding a guide RNA specific for the target base sequence of a rice-derivedOsAAP2 gene and a nucleic acid sequence encoding anendonuclease protein; or a complex (ribonucleoprotein) of a guide RNA specific for the target base sequence of a rice-derived OsAAP2 gene and an endonuclease protein.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기OsAAP2 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In a manufacturing method according to one embodiment of the present invention, the target base sequence ofthe OsAAP2 gene may be composed of the base sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 박테리아에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.In the manufacturing method according to the present invention, the method for transducing the complex of the guide RNA and the endonuclease protein into plant cells includes the calcium/polyethylene glycol method for protoplasts (Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), electroporation of protoplasts (Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3:1099-1102), microinjection into plant elements (Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), particle bombardment of various plant elements (DNA or RNA-coated) (Klein et al., 1987, Nature 327:70), Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens ) mediated gene transfer, can be suitably selected from (incomplete) bacterial infections, etc.
또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.In addition, introducing a recombinant vector comprising a DNA encoding a guide RNA specific for the target base sequence and a nucleic acid sequence encoding an endonuclease protein into a plant cell refers to a transformation method. Transformation of plant species is now common for plant species including both dicotyledonous and monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce a recombinant vector according to the present invention into a suitable progenitor cell.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터가 식물 세포에 형질전환되면, DNA 결합 및 절단 활성이 있는 엔도뉴클레아제 단백질과 상기 엔도뉴클레아제 단백질에 결합되며 표적 서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 sgRNA가 함께 발현되게 된다.In a manufacturing method according to one embodiment of the present invention, when the recombinant vector is transformed into a plant cell, an endonuclease protein having DNA binding and cleavage activity and an sgRNA that binds to the endonuclease protein and guides the endonuclease protein to a target sequence are expressed together.
본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term "recombinant" as used herein refers to a cell that replicates a heterologous nucleic acid, expresses said nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid. A recombinant cell may express a gene or gene fragment that is not found in the native form of said cell, either in sense or antisense form. A recombinant cell may also express a gene that is found in the native form of the cell, but which is modified and has been reintroduced into the cell by artificial means.
또한, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.Also, the term "vector" is used to refer to a DNA fragment(s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. A vector replicates DNA and can reproduce independently in a host cell. The term "vector" is often used interchangeably with "vector." The term "expression vector" refers to a recombinant DNA molecule containing a desired coding sequence and the appropriate nucleic acid sequences necessary to express the coding sequence operably linked to it in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals, and polyadenylation signals that are available for use in eukaryotic cells are well known.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 소포자, 난세포, 종자 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.In the manufacturing method according to the present invention, the "plant cell" into which the guide RNA and endonuclease protein specific for the target base sequence are introduced may be any plant cell. The plant cell is a cultured cell, a cultured tissue, a cultured organ, or a whole plant. The "plant tissue" includes differentiated or undifferentiated plant tissues, for example, but not limited to, roots, stems, leaves, pollen, microspores, egg cells, seeds, and various forms of cells used for culture, i.e., single cells, protoplasts, shoots, and callus tissues. The plant tissue may be in planta or in an organ culture, tissue culture, or cell culture state.
본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).In the production method of the present invention, any method known in the art can be used to regenerate a genome-corrected plant from a genome-corrected plant cell. The genome-corrected plant cell must be regenerated into a whole plant. Techniques for regenerative maturation of plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species (Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1-5, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된OsAAP2유전자가 교정된 벼 식물체 및 이의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.The present invention also provides a rice plant having a correctedOsAAP2 gene and a seed having a corrected genome thereof, produced by the above method.
본 발명에 따른 벼 식물체는OsAAP2 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로,OsAAP2 유전자가 녹-아웃된 식물체이다.The rice plant according to the present invention is a plant in whichthe OsAAP2 gene is knocked out by correctingthe OsAAP2 gene using the CRISPR/Cas9 system.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only intended to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and Methods
1. 식물 재료 및 생장 조건1. Plant materials and growing conditions
본 발명에서는 벼 품종 '동진' (Oryza sativa L., ssp. Japonica)을 사용하였다. 식물은 한경대학교 온실과 논에서 재배하였으며, 수확한 종자는 수분 함량이 약 14%가 되도록 건조하고 4℃에서 보관하였다.In the present invention, the rice variety 'Dongjin' (Oryza sativa L., ssp. Japonica) was used. The plant was grown in a greenhouse and rice paddy of Hankyung National University, and the harvested seeds were dried to a moisture content of approximately 14% and stored at 4℃.
2. CRISPR/Cas9 벡터 구축 및 벼 형질전환2. Construction of CRISPR/Cas9 vector and rice transformation
표적 유전자의 서열은 https://www.gramene.org/로 부터 확인 된 엑손 서열 기반으로 CRISPR RGEN tools 프로그램 (https://www.rgenome.net/)을 사용하여OsAAP2 게노믹 서열에서 두 개의 sgRNA (single-guide RNA)를 선정하였다(도 2A). pBOsC 벡터에서 Cas9 단백질은 35S 프로모터에 의해 발현되며, sgRNA는 OsU3 프로모터에 의해 발현된다(Jung et al., Plant Biotechnol Rep 2009, 13:521-531). 선정된 sgRNA는 정 등(2019)에 의해 보고된 방법을 이용하여 CRISPR/Cas9 벡터에 클로닝하였다. 간단하게,AarI 어댑터 부위가 있는 sgRNA를 ㈜바이오니아(Korea)에 의뢰하여 제작한 뒤AarI으로 소화된 pBOsC 벡터에 클로닝하였다. pBOsC::sgRNA Ti-plasmid 벡터는 전기천공법에 의해 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA105에 도입하였다. 이 후 Lee 등(Plant Biotech J. 2011, 38:251-257)에서 설명된 프로토콜에 따라 동진 벼의 종자에서 유도된 캘러스 조직에 감염시키고, 재분화 개체를 유도하였다. T-DNA 도입 여부를 확인하기 위해bar 유전자 영역을 PCR로 증폭하여 확인하였다. 형질전환 식물체는 화분에서 먼저 순화 과정을 거친 뒤 유리 온실 및 논에서 재배되었다.The sequence of the target gene was selected from theOsAAP2 genomic sequence using the CRISPR RGEN tools program (https://www.rgenome.net/) based on the exon sequence identified from https://www.gramene.org/ (Fig. 2A). In the pBOsC vector, the Cas9 protein is expressed by the 35S promoter, and the sgRNA is expressed by the OsU3 promoter (Jung et al., Plant Biotechnol Rep 2009, 13:521-531). The selected sgRNA was cloned into the CRISPR/Cas9 vector using the method reported by Jung et al. (2019). Briefly, sgRNA withan Aar I adapter site was produced by Bioneer Co., Ltd. (Korea) and then cloned into the pBOsC vector digested withAar I. The pBOsC::sgRNA Ti-plasmid vector was introduced intoAgrobacterium tumefaciens strain EHA105 by electroporation. The transformed plants were infected with callus tissues derived from Dongjin rice seeds, and redifferentiated plants were induced according to the protocol described by Lee et al. (Plant Biotech J. 2011, 38:251-257).The bar gene region was amplified by PCR to confirm the introduction of T-DNA. The transformed plants were first acclimatized in pots and then grown in a glasshouse and paddy field.
3. Targeted Deep Sequencing 및 돌연변이 분석3. Targeted Deep Sequencing and Mutation Analysis
DNA Quick Plant Kit (Inclone, Korea)를 사용하여 식물 조직에서 게노믹 DNA 추출을 수행하였다. Targeted Deep Sequencing 분석은 정 등(2019)에 의해 설명된 방법을 통해 수행하였으며, 표적 심층 시퀀싱에 사용되는 모든 프라이머는 표 1과 같다.Genomic DNA extraction from plant tissues was performed using the DNA Quick Plant Kit (Inclone, Korea). Targeted deep sequencing analysis was performed using the method described by Jeong et al. (2019), and all primers used for targeted deep sequencing are listed in Table 1.
MiniSeq (Illumina, USA)를 사용하여 PCR 앰플리콘(amplicons)에 의한 paired-end read sequencing을 생성했으며, MiniSeq에서 파생된 모든 데이터는 Park 등(Bioinformatics 2017, 33:286-288)에서 보고된 것과 같이 Cas-Analyzer (http://www.rgenome.net/casanalyzer)에 의해 분석되었다.Paired-end read sequencing by PCR amplicons was generated using MiniSeq (Illumina, USA), and all data derived from MiniSeq were analyzed by Cas-Analyzer (http://www.rgenome.net/casanalyzer) as reported by Park et al. (Bioinformatics 2017, 33:286-288).
4. 현미경 분석4. Microscopic analysis
전분의 입상 형태는 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 조사하였다. 야생형 및aap2 돌연변이체 종자를 날카로운 칼날로 가로로 자르고 종자의 표면에 금을 코팅하여 시료를 준비하였다.The granular morphology of starch was examined using a scanning electron microscope (SEM). Wild-type andaap2 mutant seeds were cut transversely with a sharp blade, and the surface of the seeds was coated with gold to prepare samples.
5. 아밀로스 함량 분석을 위한 요오드-아밀로스 색도 측정법5. Iodine-amylose colorimetric method for amylose content analysis
100 ㎎의 쌀가루에 1.0 ㎖의 95% 에탄올을 첨가하여 호화 과정이 분말이 생기는 것을 방지하였으며, 9.0 ㎖의 1N 수산화나트륨을 첨가한 뒤 10분 동안 끓이는 과정을 통해 호화시켰다. 그 다음, 상기 용액에 증류수를 첨가하여 100 ㎖로 만들고 균질화한 뒤 5 ㎖ 분취량을 93 ㎖의 증류수와 함께 100 ㎖ 부피 플라스크에 넣고, 1 N 아세트산 1.0 ㎖를 넣고 0.2% 의 요오드 용액 2 ㎖를 첨가하였다. 0.2%의 요오드 용액은 100 ㎖ 탈-이온수에 2 g의 요오드화 칼륨(KI)과 0.2 g의 요오드(I2)를 혼합하여 제조되었다 증류수로 부피를 만들어 최소한의 간섭없이 안정된 짙은 청색을 획득하였다. 20~60분 내에 620 nm에서 색상을 판독하였다.To 100 mg of rice flour, 1.0 ml of 95% ethanol was added to prevent the gelatinization process from forming powder, and 9.0 ml of 1 N sodium hydroxide was added and the mixture was gelatinized by boiling for 10 minutes. Then, distilled water was added to the solution to make 100 ml, homogenized, and a 5 ml aliquot was placed in a 100 ml volumetric flask together with 93 ml of distilled water, 1.0 ml of 1 N acetic acid was added, and 2 ml of a 0.2% iodine solution was added. The 0.2% iodine solution was prepared by mixing 2 g of potassium iodide (KI) and 0.2 g of iodine (I2 ) in 100 ml of deionized water. The volume was made up with distilled water and a stable dark blue color was obtained without minimal interference. The color was read at 620 nm within 20 to 60 minutes.
6. 점성(gel consistency, GC) 측정6. Measurement of viscosity (gel consistency, GC)
벼의 점성은 Cagampang 등(J. Sci. Food Agric. 1973, 24(12): 1589-1594)의 방법에 따라 측정되었다. 간단하게, 100 ㎎ 쌀가루를 10 mm x 110 mm 배양 튜브에서 칭량하고, 여기에 0.025% 티몰 블루(thymol blue)를 함유하는 0.2 ㎖의 95% 에탄올을 첨가하여 젤라틴화 과정에서 분말이 뭉치는 것을 방지하였다. 0.2N 수산화칼륨 1 ㎖를 첨가하고 볼텍싱하였다. 튜브 뚜껑을 닫고 수조에서 8분 동안 끓인 후, 상온에서 5분 동안 방치하고, 그 후 튜브를 얼음 위에 20분 동안 두었다가 테이블 표면에 수평으로 눕혔두었다. 겔 길이는 튜브 바닥에서 겔 이동 전면까지의 거리로 1시간 후에 측정하였으며, 이렇게 얻은 겔 길이는 겔 농도 측정의 정보를 제공한다.The viscosity of rice was measured according to the method of Cagampang et al. (J. Sci. Food Agric. 1973, 24(12): 1589-1594). Briefly, 100 mg of rice flour was weighed in a 10 mm x 110 mm culture tube, and 0.2 ml of 95% ethanol containing 0.025% thymol blue was added to prevent the powder from clumping during the gelatinization process. 1 ml of 0.2 N potassium hydroxide was added and vortexed. The tube was capped and boiled in a water bath for 8 min, allowed to stand at room temperature for 5 min, and then the tube was placed on ice for 20 min and then laid horizontally on a table surface. The gel length was measured after 1 h as the distance from the bottom of the tube to the front of the gel migration, and the gel length thus obtained provides information for the measurement of gel concentration.
7. 아미노산 분석7. Amino acid analysis
10 nmol L-(+)- norleucine (Wako Pure Chemicals, Japan)을 대조군으로 사용하였으며, 각 샘플에 1 ㎖의 6 mol·L-1 염산을 첨가하여 2 ㎖ 스크류 캡 튜브 내에서 10 ㎎ 쌀가루를 가수분해시켰다. 용액을 110℃ 오븐에서 24시간 동안 유지하여 가수분해를 완료하였다. 샘플은 완전히 건조될 때까지 60℃ 수조에서 증발시키고 500 ㎕ 나트륨 완충액 (80-2037-67, Biochrom, England)에 용해시켰다. 완전히 용해된 후 샘플을 1,600xg에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 0.45 nm 나일론 막으로 여과하였다. 자동 아미노산 분석기(Biochrom, England)를 사용하여 아미노산 함량을 측정하였다.10 nmol L-(+)- norleucine (Wako Pure Chemicals, Japan) was used as a control, and 10 mg of rice flour was hydrolyzed in a 2-mL screw-cap tube by adding 1 mL of 6 mol L-1 hydrochloric acid to each sample. The solution was maintained in an oven at 110 °C for 24 h to complete the hydrolysis. The sample was evaporated in a 60 °C water bath until completely dry and dissolved in 500 μL of sodium buffer (80-2037-67, Biochrom, England). After complete dissolution, the sample was centrifuged at 1,600 ×g for 10 min, and the supernatant was filtered through a 0.45 nm nylon membrane. The amino acid content was measured using an automatic amino acid analyzer (Biochrom, England).
8. 전분 특성 분석 및 배유(endosperm)의 물리화학적 특성8. Analysis of starch properties and physicochemical properties of endosperm
쌀 호화 특성을 결정하기 위해 쌀가루 3 g과 물 25g을 혼합하였다. Rapid Visco analyser (Model 3-D, Newport Scientific, Australia)를 사용하여 최고 점도, 최저 점도, 최종 점도, 강하 점도(최고 점도 - 최저 점도), 치반 점도(최종 점도 - 최고 점도) 및 호화 온도를 측정하였다. RVA 분석 사이클의 조건은 다음과 같다: 1분 동안 50℃, 2.5분 동안 95℃, 1.4분 동안 50℃. 가열 및 냉각 시간은 3.8분으로 설정하였다. RVA 패들 속도는 처음 10초 동안 960 r·min-1으로 작동되었으며 이후 160 ·min-1의 일정한 속도로 회전시켰다.To determine the gelatinization characteristics of rice, 3 g of rice flour and 25 g of water were mixed. Peak viscosity, lowest viscosity, ultimate viscosity, drop viscosity (peak viscosity - lowest viscosity), settling viscosity (final viscosity - highest viscosity), and gelatinization temperature were measured using a Rapid Visco analyser (Model 3-D, Newport Scientific, Australia). The conditions of the RVA analysis cycle were as follows: 50 °C for 1 min, 95 °C for 2.5 min, and 50 °C for 1.4 min. The heating and cooling times were set to 3.8 min. The RVA paddle speed was operated at 960 r·min-1 for the first 10 s and then at a constant speed of 160 ·min-1 .
실시예 1. CRISPR/Cas9 시스템을 이용한Example 1. Using the CRISPR/Cas9 systemOsAAP2OsAAP2의 녹아웃Knockout of
유전자 편집된 식물을 육성하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여OsAAP2 녹아웃 라인을 제조하였다. OsAAP2-sg1 및 OsAAP2-sg2에 대해 각각 총 30개 및 19개의 형질전환 식물이 각각 T0 세대에서 획득되었다(도 1 및 표 2).To breed gene-edited plants,OsAAP2 knockout lines were generated using the CRISPR/Cas9 system. A total of 30 and 19 transgenic plants for OsAAP2-sg1 and OsAAP2-sg2, respectively, were obtained in the T0 generation (Fig. 1 and Table 2).
본 발명자는 표적 부위에서 돌연변이를 분석하기 위해 모든 형질전환 식물을 사용하여 표적 부위 시퀀싱 분석을 수행하였다. 돌연변이율은 OsAAP2-sg1 및 OsAAP2-sg2에서 각각 56.6%와 89.4% 였다(표 2). 돌연변이 영역의 염기서열 결과는 다른 뉴클레오티드의 삽입(1 bp) 및 삭제(1-48 bp)를 포함하여 다양한 돌연변이가 발생했음을 보여주었다(도 2). 이들 돌연변이는 동종(homo), 이종(hetero) 및 이중(bi) 대립유전자를 갖는 편집 유형으로 분류할 수 있었으며, 선택 마커 및 T-DNA 서열로서 비알라포스(bialaphos) 저항성 유전자(bar)를 제거하기 위해 NGS 분석으로 식별된 T0 편집 식물체를 자가 수분하여 T1 종자를 생성하였다. 동종 대립 유전자이면서 T-DNA가 없는 식물인 T1 자손 식물은 Bar-strip 테스트, 표현형 및 유전형 분석에 의해 분석되었다.The present inventors performed target region sequencing analysis using all transgenic plants to analyze mutations at the target site. The mutation rates were 56.6% and 89.4% in OsAAP2-sg1 and OsAAP2-sg2, respectively (Table 2). The base sequence results of the mutant region showed that various mutations occurred, including insertions (1 bp) and deletions (1-48 bp) of different nucleotides (Fig. 2). These mutations could be classified into editing types with homo-, hetero-, and bi-allelic genes. The T0 edited plants identified by NGS analysis were self-pollinated to generate T1 seeds to remove the bialaphos resistance gene (bar ) as a selection marker and T-DNA sequence. The T1 progeny plants, which are homozygous alleles but lack T-DNA, were analyzed by Bar-strip test, phenotypic and genotypic analyses.
실시예 2. 편집 식물체의 농경학적 특성Example 2. Agronomic characteristics of the edited plant
편집된 계통의 몇 가지 농경학적 특성을 야생형과 비교해 보았다.osaap2-sg1-3 및osaap2-sg2-12 계통은 야생형과 비교하여 초장, 원추화 길이 및 천립중에 있어서는 차이가 없었으나, 분얼 수, 임실률 및 종자생산량에 유의적인 감소가 확인되었다(표 3).Several agronomic characteristics of the edited lines were compared with those of the wild type.The osaap2-sg1-3 andosaap2-sg2-12 lines showed no differences in plant height, panicle length, and thousand-grain weight compared with the wild type, but significant decreases in the number of tillers, germination rate, and seed production were confirmed (Table 3).
또한 야생형과osaap2-sg1-3 및osaap2-sg2-12의 종자 표현형을 비교한 결과, 종자의 길이, 너비, 두께 및 천립중에 있어서 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다(도 3).In addition, when comparing the seed phenotypes of the wild type andosaap2-sg1-3 andosaap2-sg2-12 , it was confirmed that there was no significant difference in seed length, width, thickness, and grain weight (Fig. 3).
또한, 성숙한 종자로부터 전분 과립을 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 결과 야생형 종자는 배유의 중앙 영역에 있는 전분 과립이 육각형 모양으로 빽빽히 밀집되어 있었지만,osaap2-sg1-3 및osaap2-sg2-12의 전분 과립은 과립 형성이 제대로 이루어지지 않아 부정형의 형태가 나타났으며 느슨하게 채워져 있음이 관찰되었다(도 4).In addition, when observing starch granules from mature seeds using a scanning electron microscope (SEM), the starch granules in the central region of the endosperm of the wild-type seeds were densely packed in a hexagonal shape, but the starch granules ofosaap2-sg1-3 andosaap2-sg2-12 were observed to have an irregular shape due to improper granule formation and to be loosely packed (Fig. 4).
실시예3.Example 3.osaap2osaap2 돌연변이체의 전분 특성 변화Changes in starch properties of mutants
유전자 편집 계통 및 야생형의 아밀로스 함량(AC), 젤라틴화 온도(GT) 및 점성(GC)를 포함한 곡물 품질을 추가로 조사하였다.osaap2-sg1-3 및osaap2-sg2-12 계통의 GT, GC 및 AC는 야생형보다 낮았다(도 5 및 표 4). 이를 통해osaap2-sg1-3 및osaap2-sg2-12 계통에서는 아미노산 수송에 따른 종자 내 단백질 축적으로 인한 곡물 수율 및 곡물 품질이 감소한 것으로 유추되었다.We further investigated the grain quality, including amylose content (AC), gelatinization temperature (GT), and viscosity (GC), of the gene-edited lines and the wild type. The GT, GC, and AC of theosaap2-sg1-3 andosaap2-sg2-12 lines were lower than those of the wild type (Fig. 5 and Table 4). This suggested that the grain yield and grain quality were reduced inthe osaap2-sg1-3 andosaap2-sg2-12 lines due to protein accumulation in the seeds following amino acid transport.
(P-H)
강하점도Breakdown
(PH)
Drop point
(C-P)
치반점도Setback
(CP)
Chibanjeomdo
최고점도Peak (P)
Highest point
최저점도Hold (H)
Lowest point
최종점도Final V (C)
Final point
RVA는 일반적으로 쌀의 감각 평가에서 품질을 예측하는 간접 지표 중 하나로 사용되며, 각 점도는 쌀 품종의 특정 특성을 식별하는 데 사용된다. 강하점도는 조리 중 안정성 정도를 나타내며, 팽창된 전분의 파괴 정도를 파악한다. 최고점도와 최저점도의 차이에 의해 나타나며 GC와 관련되어 있다. 치반점도는 냉각 시 전분의 노화정도를 나타내며 최종점도와 최고점도의 차이에 의해 나타난다. 보통 낮은 침반점도 값이 부드러운 식미를 갖는다.osaap2 변이체의 경우 낮은 강하점도 및 최고점도 값을 갖으며, 높은 치반점도 값을 나타내어, 식미에서 부정적인 변화가 나타날 것으로 예상되었다.RVA is generally used as one of the indirect indicators to predict quality in the sensory evaluation of rice, and each viscosity is used to identify specific characteristics of rice varieties. Drop viscosity indicates the degree of stability during cooking and determines the degree of destruction of expanded starch. It is expressed by the difference between the peak and bottom viscosity and is related to GC. Spot viscosity indicates the degree of starch retrogradation during cooling and is expressed by the difference between the final viscosity and the peak viscosity. Usually, a low spot viscosity value indicates a soft taste. In the case ofthe osaap2 mutant, it had low drop and peak viscosity values and high spot viscosity value, so it was expected that negative changes in taste would occur.
<110> Hankyong Industry Academic Cooperation Center<120> Method for producing rice plant having edited OsAAP2 gene using CRISPR/Cas system<130> PN21211<160> 9<170> KoPatentIn 3.0<210> 1<211> 1455<212> DNA<213> Oryza sativa<400> 1atggcgtcgg tcgacttgga gctggggcga cctctgtcgg cggcggcggc ggcgtaccct 60cctccgctgc ggcggagcat caacgacgac gacgttgacg acgacgggaa gcccaagcga 120acaggaacgg agtggacggc gagcgcgcac atcgtcacgg cggtggtcgg ctccggcgtg 180ctgtcgctgg catggtccac ggcgcagctc ggctgggtcg ccggcccggc caccctcgtc 240gtgttcgcgg tcatcaccta ctacacctcc gtgctcctcg ccgactgcta ccgcgccggc 300ggcgatcagg tctccgggaa gaggaactac acatacatgg acgccgtcga gtcctatcta 360ggtggtcggc aagtgtggtt ctgtggtctc tgtcagtacg ttaacctggt tggaactgca 420atcgggtaca ccatcacagc atccatcagt gccgcggcgg tgtacaagtc caactgcttc 480cacaagaacg gccactccgc cgactgcagc gtcttcacca cctcgtacat ggtggtgttc 540ggcgttgtcc aggtcttctt ctcccagctg cagagcctcc acgaggtggc gtggctgtcc 600gtgctcgccg ccgtcatgtc cttctcctac tcggccatcg ccgtcggcct ctccttggca 660caaaccatat caggtcctac tggtatgacg actatgtctg ggactgtaat cggaatagat 720gttgatttgt cgcacaagat atggcaggca ctgcaagccc tcggaaacat cgcgttcgca 780tattcctact ccctggttct cattgaaatc caggacacga tcaggtcgcc gccggcggag 840agcaagacga tgaggaaggc gaacgcgctg gccatgccgg tgatcacggc gttctacacg 900ctctgcggct gcctcggcta cgcggcgttc gggaacgcgg cgccggggaa catgctcacg 960ggcttcggct tctacgaccc ctactggctc gtcggcctcg ccaacgcctg catcgtcgtg 1020cacctcgtcg gcgcctacca ggtgatgtcc cagcccgtct tcaccgccgt cgagtcctgg 1080gcgtcctccc ggtggccccg gtgcggcttc ttcgtcaccg gcggcggcgg aacgaggctg 1140atcagcgtga acgcgttcag gctcgcgtgg cgcacggcgt acgtcgtggc gtgcaccgcg 1200gtcgccgccg tggtgccgtt cttcaacgac gtgctcggcc tcctcggcgc cgtcgggttc 1260tggccgctca ccgtgtactt ccccgtggag atgtacatcc ggcggcggaa gctggagagg 1320tcgtccaaga ggtgggtggc gctgcagagc ctcaacgccg tgtgcttcgt ggtgacgctc 1380gcctcagcgg tcgcgtccgt gcaggggatc gccgaatcga tggcgcacta tgtaccgttc 1440aagtcaaagt tgtaa 1455<210> 2<211> 23<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> sgRNA1<400> 2gctgtcgctg 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PN21211<160> 9<170> KoPatentIn 3.0<210> 1<211> 1455<212> DNA<213> Oryza sativa<400> 1atggcgtcgg tcgacttgga gctggggcga cctctgtcgg cggcggcggc ggcgtaccct 60cctccgctgc ggcggagcat caacgacgac gacgttgacg acgacgggaa gcccaagcga 120acaggaacgg agtggacggc gagcgcgcac atcgtcacgg cggtggtcgg ctccggcgtg 180ctgtcgctgg catggtccac ggcgcagctc ggctgggtcg ccggcccggc caccctcgtc 240gtgttcgcgg tcatcaccta ctacacctcc gtgctcctcg ccgactgcta ccgcgccggc 300ggcgatcagg tctccgggaa gaggaactac acatacatgg acgccgtcga gtcctatcta 360ggtggtcggc aagtgtggtt ctgtggtctc tgtcagtacg ttaacctggt tggaactgca 420atcgggtaca ccatcacagc atccatcagt gccgcggcgg tgtacaagtc caactgcttc 480cacaagaacg gccactccgc cgactgcagc gtcttcacca cctcgtacat ggtggtgttc 540ggcgttgtcc aggtcttctt ctcccagctg cagagcctcc acgaggtggc gtggctgtcc 600gtgctcgccg ccgtcatgtc cttctcctac tcggccatcg ccgtcggcct ctccttggca 660caaaccatat caggtcctac tggtatgacg actatgtctg ggactgtaat cggaatagat 720gttgatttgt cgcacaagat atggcaggca ctgcaagccc tcggaaaacat cgcgttcgca 780tattcctact 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